CN114088861A - 一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素c的方法 - Google Patents

一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素c的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，包括以下步骤：步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；步骤S2：牛奶通过所述二维液相色谱平台分离得到馏分，所述馏分完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C。本发明提供的多维液相色谱质谱联用检测牛奶中肠毒素C的方法，具有鉴定准确、快速有效、灵敏度高等优势。解决了现有ELISA方法准确性低的弊端，自动化程度高，提高了检测通量，降低了试验成本，结果判定方便准确，更加具有实用性。

Description

一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法
技术领域
本发明涉及食品安全微生物检测技术领域，具体涉及一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素C的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素C是由金黄色葡萄球菌分泌的一种毒素，也是最常见的导致金黄色葡萄球菌食物中毒的五种经典肠毒素之一，因此对肠毒素C进行检测有利于保障食品安全健康，预防食物中毒事件发生。国家标准GB4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中采用酶联免疫吸附试验法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测肠毒素，但该方法易受食品基质干扰，存在不同肠毒素间存在交叉反应，易导致假阳性、假阴性结果。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种肠毒素C的新型检测方法，基于多维液相色谱联用质谱技术实现对肠毒素C特异性检测。
发明内容
本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，包括以下步骤：
步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；
步骤S2：牛奶通过所述二维液相色谱平台分离得到馏分，所述馏分完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C。
优选地，第一维离子交换液相色谱中，色谱柱为阳离子交换色谱柱。
优选地，第一维离子交换液相色谱中，流动相pH为4.5～5.5。
优选地，第一维离子交换液相色谱中，肠毒素C在第一维色谱柱的洗脱位置为35～40min。
优选地，第一维离子交换液相色谱中，洗脱条件为：
流动相：A相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN；B相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN+1M NaCl；
洗脱条件：0～10min 0％B相，20～30min 8％～9％B相，30.1～50min 25％～26％B相，70～100min 100％B相，100～120min 0％B相；
流速：1mL/min；
检测波长：215nm。
优选地，第二维反相液相色谱中，色谱柱为C8色谱柱。
优选地，第二维反相液相色谱中，肠毒素C在第二维色谱柱的洗脱位置为24～26min。
优选地，第二维反相液相色谱中，洗脱条件为：
流动相：A相：乙腈-水(5％+95％，0.1％TFA)；B相：乙腈(0.1％TFA)；
洗脱条件：0～2min 5％B相，5～60min 33％～38％B相，60.1～90min 95％B相，90～120min 0％B相；
流速：0.2mL/min；
检测波长：215nm。
优选地，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：
二维分离得到的馏分冻干后重悬于10μL纯水中，吸取2μL等比例加入2％TFA溶液、2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)基质溶液，反复吹打至出现沉淀结晶，吸取2μL点于MALDI靶板上，自然风干后进行质谱图谱采集，依据分子量可初步鉴定是否为肠毒素C。
优选地，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：
将二维分离得到的馏分进行酶解处理，经除盐后的样品吸取1μL点于MALDI靶板上，自然风干后再加入1μL基质溶液α-氰基-4-羟基肉桂酸共结晶，自然风干进行质谱图谱采集，经MASCOT数据库匹配，选择蛋白酶为胰蛋白酶，质量容忍值为100ppm，最多2个缺少裂解位点，选择烷基化修饰，最后根据匹配分值以及肠毒素的特征肽段鉴定肠毒素C。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明选择离子交换色谱与反相色谱的二维分离模式，借助于第一维离子交换色谱的快速分离，对牛奶基质进行一次预分离，通过中心切割法收集含有肠毒素目标分子的馏分，再经第二维反相色谱分析，可大大降低被分析组分在反相柱中的复杂性，从而提高其分离效率和灵敏度。
本发明所述的多维液相色谱质谱联用检测牛奶中肠毒素C的方法，具有鉴定准确、快速有效、灵敏度高等优势。解决了现有ELISA方法准确性低的弊端，自动化程度高，提高了检测通量，降低了试验成本，结果判定方便准确，更加具有实用性。
由于，大部分牛奶基质在第一维分离时已经去除，中心切割后牛奶馏分的保留行为与肠毒素C存在较大差异，二者能够进行区分，对肠毒素C在第二维色谱分离洗脱过程中不存在明显干扰，有利于后续质谱的鉴定分析。
附图说明
图1二维液相色谱分析平台的搭建；
图2肠毒素C第一维阳离子交换色谱图；
图3肠毒素C第一维不同馏分SDS-PAGE电泳图；
图4优化前牛奶第一维离子交换色谱图；
图5优化后牛奶第一维离子交换色谱图；
图6肠毒素C第二维反相色谱图；
图7肠毒素C第二维不同馏分SDS-PAGE电泳图；
图8优化前牛奶第二维反相色谱图；
图9优化后牛奶第二维反相色谱图；
图10二维色谱图；
图11加标牛奶二维色谱图；
图12肠毒素C线性质谱图；
图13肠毒素C酶解肽质量指纹图谱。
具体实施方式
食品基质复杂多样，肠毒素含量通常较低，需要经过一定的样品前处理技术才能实现对低丰度蛋白的检测。传统的一维液相色谱对复杂样品分离能力有限，存在目标物与干扰物质共同流出的问题，导致定性定量结果不准确。二维色谱相较于一维色谱分离技术具有更强的分离能力，峰容量高、灵敏度高等优势。二维色谱分离模式具有多种选择，包括离子交换-反相色谱、体积排阻-反相色谱、反相-反相色谱等。二维色谱依据第一维馏分切割方式不同可分为全二维色谱与中心切割二维色谱。全二维色谱是将第一维所有馏分全部进行第二维分离，适用于对复杂样品的广泛深度分离；中心切割二维色谱是将第一维的一个或几个馏分进行第二维分离，适用于对特定目标物的高效检测。本发明针对肠毒素C特定目标分子进行检测，因此本发明采用中心切割二维色谱方法。
质谱作为一种常用的蛋白质鉴定方法，可对蛋白质相对分子量与一级结构氨基酸序列进行鉴定，具有快速、微量、高特异性、高灵敏等优势。目前比较常用的有基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)，这两种方法各有其优点及适用的领域。其中MALDI-TOF MS离子化效率高能对极微量的样品进行分析，适用于生物大分子的检测，且不受分子量的限制，具有高通量、分辨率高、耗时短等优势。因此，本发明选择MALDI TOF MS与多维液相色谱结合的液质方法将实现对复杂基质中肠毒素C特异性高灵敏检测。
因此，本发明提供一种多维液相色谱质谱联用技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素C的方法，包括以下步骤：
步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；
步骤S2：牛奶通过所述二维液相色谱平台分离得到馏分，所述馏分完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C。
其中，离子交换色谱-反相色谱是二维液相色谱中最常见的一种分离模式，二者具有良好的正交性，兼容性强，第一维采用内径较大的离子交换色谱可以增大上样量，进一步提高灵敏度，第二维采用反相色谱柱，能够与质谱兼容。因此，本发明选择离子交换色谱与反相色谱的二维分离模式，借助于第一维离子交换色谱的快速分离，对牛奶基质进行一次预分离，通过中心切割法收集含有肠毒素目标分子的馏分，再经第二维反相色谱分析，可大大降低被分析组分在反相柱中的复杂性，从而提高其分离效率和灵敏度。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例提供二维液相色谱平台，该二维液相色谱平台包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、捕集柱和六通阀切换装置。其中的第一维液相色谱柱、捕集柱与第二维液相色谱柱通过六通阀切换装置连接。
采用两个六通阀搭建在线二维液相色谱分析平台，连接方式如图1所示，第一个六通阀接口1连接注射器，第一个六通阀接口2、5连接进样环，第一个六通阀接口3连接第一维离子交换色谱柱，第一个六通阀接口4连接第一维色谱泵，第一个六通阀接口6通废液。第一维色谱柱与紫外检测器相连，并与第二个六通阀的接口4相连，第二个六通阀的接口3通废液，第二个六通阀的接口2、5连接捕集柱，第二个六通阀的接口6与第二维反相色谱柱相连，第二个六通阀的接口1连接第二维色谱泵。
样品经注射器进入进样环，进入第一维色谱柱预分离，此时，检测器出口连接废液，当目标物在第一维被洗脱时，通过阀切换，使检测器出口与捕集柱相连，捕集所需馏分后切回连接废液状态。捕集柱与第二维相连，进行第二维反相色谱分离，依据肠毒素C在第二维的洗脱时间，收集馏分进行后续质谱分析。
实施例2
本实施例中依据肠毒素C蛋白分子量为27.6KDa、等电点PI＝8.6等相关性质，进行了第一维离子交换液相色谱条件的优化。具体包括以下内容：
(1)色谱柱的选择
肠毒素C等电点为8.6，属于碱性蛋白，适用于阳离子交换色谱柱。优选地，色谱柱：强阳离子交换色谱柱(岛津Shim-pack PA-SP，5μm，8×100mm，
Figure BDA0003324742270000051
)，捕集柱(月旭WelchXtimate C8，5μm，2.1×10mm，
Figure BDA0003324742270000052
)
(2)流动相pH的优化
选择20mM的磷酸氢二钾作为缓冲盐体系，考察了pH＝6与pH＝5.3两个pH条件，当pH＝6时，肠毒素C在色谱分离过程无保留，当降低pH为5.3时，肠毒素C在色谱上具有保留，且峰型较好，该条件可用于肠毒素C的分离。
(3)洗脱位置验证
通过SDS-PAGE凝胶电泳法对肠毒素C第一维色谱不同分离时间的馏分进行验证，图3为银染后的凝胶图，凝胶图上所显示的条带位置与肠毒素C在第一维色谱图(参见图2)的出峰时间一致，可证实35～40min为肠毒素C在第一维色谱柱的洗脱位置，作为后续第一维馏分的中心切割时间依据。
(4)洗脱条件的优化
初始洗脱条件如下：0～10min 0％B相，60～78min 42％～100％B相，78～88min100％B相，88.1～108min 0％B相，如图4所示，当流动相洗脱梯度未进行优化时，牛奶样品各组分不能实现良好地分离，呈现连续流出的状态，进行梯度优化后，图5所示，牛奶各组分间的流出行为存在一定差异，在35～40min牛奶流出组分较少，有利于保证馏分切割的准确性。但牛奶在35～40min与肠毒素C共流出的部分，仍然对肠毒素C的检测存在干扰，需要进一步进行第二维反相色谱的分离，以获得纯化后的肠毒素C进行鉴定。综上，第一维离子交换色谱优化后的条件如下：
流动相：A相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN；B相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN+1M NaCl。
洗脱条件：0～10min 0％B相，20～30min 8％～9％B相，30.1～50min 25％～26％B相，70～100min 100％B相，100～120min 0％B相。
流速：1mL/min。
检测波长：215nm。
实施例3
本实施例进行了第二维反相液相色谱条件的优化。具体包括以下内容：
(1)色谱柱的选择
肠毒素C分子量为27.6kDa，为中等极性化合物，可选用C8色谱柱或者C4色谱柱进行分离，经探究，C8色谱柱的分离效果优于C4色谱柱，具有良好的峰型，如图6所示。优选地，色谱柱：C8色谱柱(月旭Welch Xtimate C8，5μm，2.1×250mm，
Figure BDA0003324742270000061
)。
(2)洗脱位置验证(结合SDS-PAGE凝胶电泳法验证了肠毒素在第二维的洗脱位置)
通过SDS-PAGE凝胶电泳法对肠毒素C第二维色谱不同分离时间的馏分进行验证，图7为银染后的凝胶图，凝胶图上所显示的条带位置与肠毒素C在第二维色谱图的出峰时间一致，可证实24～26min为肠毒素C在第二维色谱柱的洗脱位置。
(3)洗脱条件的优化
条件优化前色谱图如图8所示，洗脱方法如下；0～5min 5％B相，10～40min35％～40％B相，41～60min B相95％，60.1～80min 5％B相。条件优化后如图9所示，提高了色谱柱对牛奶的分离效果，但牛奶在反相色谱上的分离更为复杂，大多数物质保留行为强，较难洗脱，因此，只依靠一维的反相分离无法排除基质的干扰，并且对柱子易造成污染堵塞，降低柱效，影响柱子的使用寿命。综上，第二维反相色谱优化后的条件如下：
流动相：A相：乙腈-水(5％+95％，0.1％TFA)；B相：乙腈(0.1％TFA)。
洗脱条件：0～2min 5％B相，5～60min 33％～38％B相，60.1～90min 95％B相，90～120min 5％B相。
流速：0.2mL/min。
检测波长：215nm。
实施例4
将实施例1建立的二维液相色谱平台应用于牛奶中的肠毒素检测，进行牛奶加标实验，如图11所示，当添加高浓度肠毒素C时可见明显特征峰，与牛奶中的其它组分可进行区别，但低浓度时仅依靠紫外检测器难以检出，因此需要后续高灵敏的质谱鉴定。
本实施例，基于实施例1-3，提供一种多维液相色谱质谱联用技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素C的方法，包括以下步骤：
步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；
步骤S2：肠毒素C与牛奶分别经过实施例2中的第一维离子交换柱分离，通过阀切换收集35～40min馏分至捕集柱，馏分再经过实施例3中的第二维反相色谱的分离，所得结果如图10所示；二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C；
步骤S21、完整蛋白的质谱鉴定：二维分离得到的馏分冻干后重悬于10μL纯水中，吸取2μL等比例加入2％TFA溶液、2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)基质溶液，反复吹打至出现沉淀结晶，吸取2μL点于MALDI靶板上，自然风干后进行质谱图谱采集，结果通过分子量进行鉴定，如图12所示，肠毒素的单电荷峰为27.6KDa，双电荷峰为13.8KDa；
步骤S22、酶解肽质量图谱鉴定：将二维分离得到的馏分进行酶解处理，经除盐后的样品吸取1μL点于MALDI靶板上，自然风干后再加入1μL基质溶液α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)共结晶，自然风干进行质谱图谱采集，所得酶解肽质量指纹图谱如图13所示，经MASCOT数据库匹配，选择蛋白酶为胰蛋白酶，质量容忍值为100ppm，最多2个缺少裂解位点，选择烷基化修饰，最后根据匹配分值以及肠毒素的特征肽段可鉴定肠毒素C。
实施例5
本实施例中对上述二维液相色谱分离方法进行了方法学验证。
具体地，对二维液相色谱的重复性，回收率，检出限进行了考察，发现该方法具有良好的重复性，二维反相的检测限为10ng/mL，加标回收率为75.4％。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；
步骤S2：牛奶通过所述二维液相色谱平台分离得到馏分，所述馏分完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C。
2.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，色谱柱为阳离子交换色谱柱。
3.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，流动相pH为4.5～5.5。
4.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，肠毒素C在第一维色谱柱的洗脱位置为35～40min。
5.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，洗脱条件为：
流动相：A相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN；B相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN+1M NaCl；
洗脱条件：0～10min 0％B相，20～30min 8％～9％B相，30.1～50min 25％～26％B相，70～100min 100％B相，100～120min 0％B相；
流速：1mL/min；
检测波长：215nm。
6.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，色谱柱为C8色谱柱。
7.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，肠毒素C在第二维色谱柱的洗脱位置为24～26min。
8.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，洗脱条件为：
流动相：A相：乙腈-水(5％+95％，0.1％TFA)；B相：乙腈(0.1％TFA)；
洗脱条件：0～2min 5％B相，5～60min 33％～38％B相，60.1～90min 95％B相，90～120min 0％B相；
流速：0.2mL/min；
检测波长：215nm。
9.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：
二维分离得到的馏分冻干后重悬于10μL纯水中，吸取2μL等比例加入2％TFA溶液、2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)基质溶液，反复吹打至出现沉淀结晶，吸取2μL点于MALDI靶板上，自然风干后进行质谱图谱采集，依据分子量可初步鉴定是否为肠毒素C。
10.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：
将二维分离得到的馏分进行酶解处理，经除盐后的样品吸取1μL点于MALDI靶板上，自然风干后再加入1μL基质溶液α-氰基-4-羟基肉桂酸共结晶，自然风干进行质谱图谱采集，经MASCOT数据库匹配，选择蛋白酶为胰蛋白酶，质量容忍值为100ppm，最多2个缺少裂解位点，选择烷基化修饰，最后根据匹配分值以及肠毒素的特征肽段鉴定肠毒素C。
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