CN103555607A - 一种合欢叶片中的内生菌h6菌株分离方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用，该分离方法包括：采用75%（体积分数）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗2-3次，可达到合欢叶片表面最佳的消毒效果和内生菌H6分离的最适条件。本发明经试验证明H6菌株、发酵液、无菌株发酵液及其从H6发酵液中分得的活性组分对供试的植物病原菌苹果腐烂病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌等均具有较强的抑制作用。本发明采用液-液萃取法对内生菌H6的代谢液提取，得10个组分，其中活性高的组分1、2和8样品硅烷化衍生后进行GC-MS检测，鉴定出其中脂肪酸、芳香酸、环二肽、甾醇类等25种具抗菌活性的物质。

Description

一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新筛选的合欢内生细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏号：CGMCC No.：7990；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间：2013年8月13日。该菌及发酵液中的活性成分对可引起植物病害的病原真菌具有显著的抑菌活性，可制备成生物农药，用于田间病害的防治。 

技术背景

合欢内生菌H6（保藏编号CGMGG No.：7990）自山东省青岛市城阳区青岛农业大学校园内种植的合欢（Albizzia julibrissin Durazz.）叶片中筛选出的具有抑菌活性的内生细菌，经过大量室内实验研究结果表明它对苹果腐烂病菌、葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有较高的生物活性，可用于相应田间病害的防治。 

长期以来，我国农药生产以仿制为主，知识产权的保护和市场竞争的形势迫使我国必须将创制新药的研究放在重要位置。我国天然药物资源丰富、经济基础相对比较薄弱，从天然产物中寻找创新药物适合现阶段国情。随着分离分析技术的进步，许多结构复杂及微量成分获得纯品并确定其化学结构成为可能，极大地丰富了天然药物的来源。近几年，药用植物新资源的寻找集中在其内生菌方面。传统药用植物中都存在很多内生菌，其在进化过程中发生了基因重组，获得了宿主的某些基因，能够产生与宿主植物相同或更新颖的代谢产物，有研究显示，5l％的从植物内生真菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，其化学结构种类远远高于植物本身及土壤微生物。已有报道其代谢产物具有抑菌、抗氧化及抗肿瘤等多种活性，这一特点使药用植物内生菌成为人们寻找天然药物和生物活性物质的新方向，同时在保护珍稀濒危植物方面也具有重要价值。 

合欢（Albizzia julibrissin Durazz.）系豆科合欢属植物，产于我国黄河流域及以南各地，朝鲜、日本、越南、印度等地也有分布，资源非常丰富。合欢花的干燥花序，是常用中药。现代研究表明，由于合欢本身含有机酸、甾醇及其苷、黄酮类化合物、神经酰胺及神经鞘苷等多种活性物质，具有抗过敏、抗肿瘤、抗炎抗菌、免疫增强、镇静安神、抗抑郁、抗氧化等多种药理活性作用，越来越引起国内外相关学者的关注。赵杰等研究表明合欢叶提取物对黄瓜霜霉病有很好的预防作用。杨秀娟等研究表明，合欢叶提取物在24h内对南方根结线虫的抑制率在50％以上，且其杀卵率达到81.41%。刘峰等初步研究了合欢叶提取物对油菜茵核病菌的抑制作用，金玉兰与贾福丽研究表明，合欢茎叶正丁醇萃取物对油菜菌核、苹果腐烂病、辣椒炭疽病等病菌均有一定的防治效果，说明合欢茎叶提取物中确实存在抑菌物质，而 且具有一定的抑菌谱。对于合欢中内生菌的研究，至今仅见国内有零星报道，缪莉等自合欢树皮中分离出7株内生菌用于抗肿瘤活性的筛选。杨嘉等从不同地区的合欢组织中分离到268株内生真菌菌株，进行了总抗氧化活性的筛选。郑志斌从采集到的合欢组织中分离、纯化得到5株内生真菌，通过产孢形态进行菌种鉴定。鉴于合欢叶的提取物具有良好的杀菌、抗肿瘤、抗氧化活性，从其中分离出的内生菌也具有多种生物活性，具有进行深入研究的必要，本发明基于前期近三年的自合欢叶中进行具抗菌活性的内生菌分离筛选，经试验研究发现，合欢内生细菌H6菌体，发酵液、无菌代谢产物、发酵液中活性组分均具有较强的抑菌活性。 

发明内容

本发明提供了一株新用途的合欢内生细菌（解淀粉芽孢杆菌）H6菌株，它对多种植物病原真菌的菌丝生长具有明显的抑制作用。合欢叶片表面消毒的最佳组合为，叶片用75%（体积分数）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min左右即可达到合欢叶片表面的彻底消毒。所分得的菌株H6在LB固体培养基和LB液体培养基中的培养温度为30-32℃，转速180rpm/min，培养时间为24-48h，培养24h的种子液，按5%的接种量接种于发酵培养基，发酵液pH为6.8-7.2。该菌株的菌落在LB培养基上类似圆形，有隆起，不透明，干燥，菌落边缘为锯齿状，表面褶皱，正反面颜色一致呈浅黄色。经革兰氏染色观察，为G+性，杆状细菌，长度为1.17-1.43um，形成芽孢，中生。经17项生理生化指标测定，结合16SrRNA序列比对与系统发育树归属，结果表明，其与已知Bacillus amyloliquefaciens序列同源性≥99%，初步鉴定其为是解淀粉芽孢杆菌。 

本发明优化了合欢叶片表面消毒和其内生菌H6分离的方法，采用75%（体积分数）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗2-3次，即可达到合欢叶片表面最佳的消毒效果和内生菌H6分离的最适条件。 

本发明经试验证明H6菌株、发酵液、无菌株发酵液及其从H6发酵液中分得的活性组分对供试的植物病原菌苹果腐烂病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌等均具有较强的抑制作用，目的在于从药用植物合欢中寻找具有生防效果的内生菌，并发现具有抗菌活性的新颖结构物质，为新生物农药的开发提供模板。 

本发明采用液-液萃取法对内生菌H6的代谢液（30L）分别以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将具有抑菌活性的乙酸乙酯层进行柱层析，得10个组分，其中活性高的组分1、2和8样品硅烷化衍生后进行GC-MS检测，经GC-MS联用仪标准质谱数据库NIST2005的检索，鉴定出其中脂肪酸、芳香酸、环二肽、甾醇类等25种具抗菌活性的物质。 

本发明具有以下特点： 

1、H6菌株分离自于药用植物，在与植物长期共生的条件下，其基因发生变化，可以 代谢出药用植物本身具有的一些独特的活性成份，为新农药的创制提供结构新颖的模板。 

2、H6菌株为解淀粉芽孢杆菌，其适应性强，易培养，抗菌活性物质产率高。其分离自植物，为内生菌，对作物无致病性，而对靶标病原菌具有良好的生防效果。满足开发成生物农药的要求，具有安全、与环境相容性好的特性。 

3、内生菌H6菌体本身、发酵液、无菌代谢产物及代谢物中活性组分均具有抑菌作用。经过室内试验证明，本发明中申请保护的合欢内生细菌H6对苹果腐烂病、葡萄黑痘病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病等的具有潜在的防治作用，对作物安全、杀菌谱较广。 

附图说明

图1H6系统发育树构建 

图2、形态学实验 

图3、革兰氏染色实验 

图4乙酸乙酯层对苹果轮纹病菌抑制作用 

图5乙酸乙酯层对小麦全蚀病菌抑制作用 

图6乙酸乙酯层对棉花枯萎病菌抑制作用 

图7乙酸乙酯层对苹果腐烂病菌抑制作用 

图8组分F1、F2、F6对苹果腐烂病菌的抑制作用效果 

图9组分F1、F2、F8对苹果轮纹病菌的抑制作用效果 

图10组分F2、F3、F8、F9对小麦全蚀病菌病菌的抑制作用效果 

图11组分F1的总离子流图 

图12组分F2的总离子流图 

图13组分F8的总离子流图 

图14组分F1、F2、F8中24种化合物质谱图与组分F1、F2、F8中25种化合物质谱图 

具体实施方式

实施例1.合欢内生细菌（Bacillus amyloliquefaciens）H6分离纯化方法 

（1）合欢叶片表面最佳消毒方法与时间的筛选 

采用组织印记法对消毒时间进行筛选。具体操作为：选取新鲜无病斑的合欢叶，用流水冲净叶片的表面10min，然后用无菌水冲洗3-4次，再用75％（体积分数）酒精消毒，消毒时间设定为2min、3min、5min，再用10％次氯酸钠溶液再次消毒，消毒时间分别设定为2min、3min、5min、10min，将不同处理时间的组织小块用无菌水冲洗3-5次，吸取最后一次的无菌水冲洗液100μL涂布于培养基表面作为对照1；另外，将消毒后的叶片表面接触LB培养基 2-3min后取出作为对照2。用解剖刀将消毒后叶片剪成5mm×5mm小块，然后接种在LB平板培养基（9cm）上，每皿接3块，每处理3次重复，于30℃恒温培养箱避光培养2-3d。若各对照培养皿中没有菌落出现，并且相对应的消毒叶片有菌落出现，则证明表面消毒方法合适，选取这一组合方法作为最佳消毒方法。经组织印记法检验消毒效果，确定较为合适的合欢叶片组织表面消毒方法为：75%（体积分数）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min左右即可达到合欢叶片表面的彻底消毒。 

（2）合欢内生细菌H6的分离纯化 

采用组织块法，无菌条件下，取表面消毒处理后的合欢叶片表面接触LB培养基2-3min后取出，作为对照。用解剖刀将消毒后叶片剪成5mm×5mm小块，然后接种在LB平板培养基上，于30℃恒温培养箱黑暗培养2-3d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，采用平板划线分离培养法纯化，直至获得纯培养，命名为H6。 

实施例2.H6菌株的鉴定特征 

（1）菌体形态观察和染色反应 

将H6接种于LB培养基上，2-3d后观察，菌落为圆形，干燥，菌落边缘为锯齿状，菌落扁平，不透明，正反面颜色一致为淡黄色。经革兰氏染色观察，为G+性，杆状细菌，长度为1.17-1.43um，形成芽孢，中生。 

（2）H6的生理生化特性 

触酶实验、淀粉水解、卵磷脂酶、V-P测定、柠檬酸盐的利用、酪酛水解、吲哚、硝酸盐还原、丙二酸盐的利用等实验项目均为阳性，而明胶液化、运动性、甲基红实验、脲酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、纤维素分解等实验项目均显阴性。 

表1H6菌株生理生化特性 

注：＋：阳性，—：阴性 

（3）16S rRNA序列比较分析与系统发育树的构建 

提取H6的基因组16S rRNA进行PCR扩增，16S rRNA基因PCR扩增，两个通用性引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反应结束后，取25μL产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后，于凝胶成像仪检测，并将1.5kb左右的产物切胶回收。基因序列测定由北京博迈德科技发展有限公司服务有限公司完成。H6的16S rRNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，使用Lasergene软件与从GenBank数据库中获得的16S rRNA序列进行多序列匹配排列（Multiple Alignments），使用Mega5.1软件，采用相邻连接方法（Neighbor joining method）获得系统进化树。其与Bacillus amyloliquefaciens同源性≥99%，结合生理生化指标，推测H6为解淀粉芽孢杆菌属。 

实施例3 

（1）合欢内生细菌H6对植物病原真菌抑菌作用 

将H6按5%接种于LB培养液中，180rpm/min，30℃摇床培养24h。无菌条件下，用打孔器打取供试植物病原真菌菌饼（5mm）接种在PDA平板培养基中央，吸取50μLH6的发酵液滴加于滤纸片（5mm）上，晾干。将晾干的滤纸片距菌饼20mm周围摆放，置于，28℃培养箱中培养3-4d，测量抑菌带宽度。 

表2合欢叶片内生细菌H6对病原真菌的抑菌活性 

（2）合欢内生细菌H6无菌发酵液对植物病原真菌抑菌作用 

将H6按5%接种于LB培养液中，180rpm/min，30℃摇床分别培养2、4、6、8d，然后将所得发酵液于10000rpm离心机中离心10min去除菌体，得上清液，将上清液过细菌滤膜(0.22μm)。将所得上清液的分成两份，一份于100℃水域下加热15min后备用。 

采用环柱法测定内生菌H6不同发酵时间的无菌发酵培养液对苹果腐烂病菌抑制作用，无菌条件下，用打孔器打取供试植物病原真菌菌饼（5mm）接种在PDA平板培养基中央，距菌饼20mm处用打孔器打取孔洞（5mm），吸取50μLH6的无菌发酵液加于的孔洞内，无菌水做对照。置于28℃培养箱中培养3-4d，测量抑菌带宽度。 

表3内生细菌H6无菌发酵液对苹果腐烂病病原菌的抑制作用 

（3）合欢内生菌H6发酵液中萃取相抑菌活性的测定 

按上述方法，H6经大量发酵培养后，共获得发酵液30L，离心取上清液，经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取分别得到淡黄色有结晶颗粒的石油醚层浸膏0.94g，深褐色粘稠状的乙酸乙酯层浸膏2.91g和棕黄色有结晶颗粒的正丁醇层浸膏8.53g。对石油醚，乙酸乙酯层，正丁醇层，水层提取物分别采用抑菌圈法对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、小麦全蚀病菌和棉花枯萎病菌4种病原菌进行生物测定，每个处理设3次重复，其结果如下： 

表4发酵液各萃取层对4种病原菌的抑菌活性 

注：‘-’表示无抑制作用。 

从实验结果可以看出，合欢内生菌H6代谢产物发酵浓缩液乙酸乙酯层和正丁醇层提取物对4种病原菌都有一定的抑制作用。 

（4）合欢内生菌H6抑菌活性组分分离 

经初步生测，确定乙酸乙酯层提取物对4种病原菌有较好的抑制效果。所以对乙酸乙酯层萃取物采用薄层层析和硅胶柱层析进一步分离。采用氯仿-甲醇(V:V)100:1、50:1、25:1、10:1、1:1进行洗脱，每10mL接一馏份，每一馏份经薄层点样展开后，分别在紫外仪和硫酸显色后观察，确定乙酸乙酯萃取层经硅胶柱分离共得10个组分，在40℃减压旋转蒸干，各组分用75%乙醇溶解分别进行抑菌活性测定，结果如下： 

表5合欢内生菌H6乙酸乙酯层柱层析后各组分抑菌活性 

（5）合欢内生菌H6抑菌活性组分GC-MS检测 

组分F1、F2和F8中一些物质含有活性氢，不易挥发，在GC-MS中无法检测，进行其硅烷化处理。硅烷化作用可以将硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氢（如：羟基-OH，羧基-COOH，氨基-NH2，巯基-SH，磷酸盐）。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，减少了氢键束缚，因此所形成的硅烷化衍生物更容易挥发；同时，由于含活性氢的反应位点数目减少，化合物的稳定性也得以加强。在GC-MS中无法检测，进行各组分的衍生化，方法如下：甲氧胺盐酸盐以20mg/mL的含量溶解于吡啶溶液。超声帮助溶解。吸取100μl溶剂加入已离心干燥好的样品管中，封口。超声15min，涡旋1min，帮助溶解。稍微离心，30℃培养2h。加入100μl BSTFA至样品管中，封口。超声20min溶解。稍微离心，37℃培养6h。离心15min，转速12000r/min。吸取160μl至GC样品玻璃管中。 

GC-MS检测条件：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样口温度为65℃，进样体积1μL，流速1mL/min。柱箱程序：初始温度65℃保持2min；以5℃/min升至185℃；以1℃/min升温至200℃；再以15℃升温至280℃，保持5min。氦气为载气，恒压模式，进样口压力58.7kPa，离子源和传输线温度分别为230和280℃。电子能量70eV。全扫描扫描范围m/z20～650。溶剂延迟时间5.5min。 

检测的样品中，环（PHE-PRO）具有抗菌活性，二异辛基邻苯二甲酸脂与合欢植物提取物中已报道的化合物类似，其特性与用途需进一步验证。 

表6内生细菌H6活性组分单体的结构解析 

Claims (7)

1.一种合欢内生菌H6，分离自山东省青岛市城阳区种植的合欢叶片中，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏号：CGMCC No.：7990。 

2.根据权利要求1所述的一种合欢内生菌H6，其特征在于，H6在LB固体培养基和LB液体培养基中培养，培养条件：温度30-32，培养时间24-48h，该菌的鉴定特征为：H6为杆状细菌，G⁺性，芽孢中生。

3.一种合欢内生菌H6的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）选取新鲜无病斑的合欢叶，用流水冲净叶片的表面，然后用无菌水冲洗3-4次，再用75％（体积分数）酒精消毒，消毒时间为2min，再用10％次氯酸钠溶液再次消毒，消毒时间为3min左右，即可达到合欢叶片表面的彻底消毒；

（2）采用组织块法，无菌条件下，取表面消毒处理后的合欢叶片表面接触LB培养基2-3min后取出，作为对照，用解剖刀将消毒后叶片剪成5 mm×5 mm小块，然后接种在LB平板培养基上，于30℃恒温培养箱黑暗培养2-3d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，采用平板划线分离培养法纯化，直至获得纯培养，命名为H6。

4.一种合欢内生菌H6的抑菌用途，其特征在于：内生菌H6菌体本身、发酵液、无菌代谢产物及代谢物中活性组分均具有抑菌作用。

5.根据权利要求4所述的抑菌用途，其特征在于：所属的菌为苹果腐烂病菌，葡萄黑痘病菌，西瓜枯萎病菌，小麦赤霉病菌，辣椒炭疽病菌，辣椒炭疽病菌。

6.根据权利要求5所述的抑菌用途，其特征在于：合欢内生细菌H6对苹果腐烂病、葡萄黑痘病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病，辣椒炭疽病，辣椒炭疽病的具有潜在的防治作用。

7.一种合欢内生菌H6抑菌活性组分的分离和检测方法，其特征在于：在GC-MS中无法检测，进行各组分的衍生化，方法如下：甲氧胺盐酸盐以20mg/mL的含量溶解于吡啶溶液，超声帮助溶解，吸取100μl溶剂加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min，帮助溶解，稍微离心，30℃培养2h，加入100μL BSTFA至样品管中，封口，超声20min溶解，稍微离心，37℃培养6h，离心15min，转速12000r/min，吸取160μL至GC样品玻璃管中。GC-MS检测条件：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样口温度为65℃，进样体积1μL，流速1mL/min，柱箱程序：初始温度65℃保持2min；以5℃/min升至185℃；以1℃/min升温至200℃；再以15℃升温至280℃，保持5min，氦气为载气，恒压模式，进样口压力58.7kPa，离子源和传输线温度分别为230和280℃，电子能量70eV，全扫描扫描范围m/z20～650，溶剂延迟时间5.5min，检测的样品中，环（PHE-PRO）具有 抗菌活性，其保留时间为19.91min。该化合物的结构式为：

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