CN109329310A

CN109329310A - 一种合欢内生细菌h6发酵物悬浮种衣剂及其制备方法

Info

Publication number: CN109329310A
Application number: CN201811430812.4A
Authority: CN
Inventors: 曲田丽; 徐晓庆; 徐谦; 王晓; 丁金鹏
Original assignee: RUSHAN HANWEI BIO-TECHNICAL & SCIENCE Co Ltd
Current assignee: RUSHAN HANWEI BIO-TECHNICAL & SCIENCE Co Ltd
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明涉及一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂及其制备方法，其解决了现有生物制剂存在成本高、污染环境，不易贮藏的技术问题，由以下重量百分比的组分组成，合欢内生细菌H6发酵物喷雾干燥粉10～25％，润湿剂3～10％，增稠剂0.1～5％，成膜剂1～5％，防冻剂1～5％，稳定剂1～10％，增稠剂0.1～8％，着色剂0.1～3％，消泡剂0.1～2％，余量为水。本发明同时提供了其制备方法。本发明可广泛应用于防治生物药剂领域。

Description

一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物药剂领域，具体地说是一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂及其制备方法。

背景技术

合欢内生菌H6(该菌种记载在2014年2月5日公布的申请号201310365784.3、名称为一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用的中国发明专利申请说明书中，该菌种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名H6解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号：CGMCC No.：7990)自山东省青岛市城阳区青岛农业大学校园内种植的合欢(Albizzia julibrissin Durazz.)叶片中筛选出的具有抑菌活性的内生细菌，经过大量室内实验研究结果表明该菌及发酵液中的活性成分对玉米小斑病菌、小麦根腐病菌、玉米弯孢病菌、辣椒早疫病菌和黄瓜枯萎病菌有抑菌作用，尤其对黄瓜枯萎病菌具有显著的抑菌活性，可制备成生物农药，用于田间病害的防治。该生物药剂用于玉米小斑病菌、小麦根腐病菌、玉米弯孢病菌、辣椒早疫病菌和黄瓜枯萎病菌的防控具有防效高、对种植地的生态环境影响小、无残留毒性等特点。

常见的芽孢杆菌剂型有片剂、粉剂、可湿性粉剂等剂型，其中可湿性粉剂虽然活性成分较高，但在加工，包装、使用过程中存在粉尘漂移问题，且在贮藏过程中活性成分受载体表面酸性或碱性影响而降解。近几年来一些新型环保的新剂型受到广泛的关注，如悬浮剂、微胶囊悬浮剂、油悬浮剂、水乳剂和种子处理剂等。种子处理剂被认为是把靶标农药使用到作物上最有成效且环境上安全的一种方法。

发明内容

本发明就是为了解决现有生物制剂存在成本高、污染环境，不易贮藏的技术问题，提供了一种减少粉尘污染，提高药效，对环境友好，贮藏稳定性好的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂。

为此，本发明提供了一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，是由以下重量百分比的组分组成，合欢内生细菌H6发酵物喷雾干燥粉10-25％，润湿剂3～10％，增稠剂0.1～5％，成膜剂1～5％，防冻剂1～5％，稳定剂1～10％，着色剂0.1～3％，消泡剂0.1～2％，余量为水。

优选地，润湿剂为磷酸酯、木质素型、聚羧酸盐、司盘80、十二烷基硫酸钠、农乳600#、吐温80、萘磺酸中的一种或几种；增稠剂为黄原胶、硅酸镁铝中的一种或几种。

优选地，成膜剂为甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙二醇和聚丙烯酰胺中的一种或几种；防冻剂包括聚乙二醇、尿素、海藻酸、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或几种。

优选地，稳定剂为山梨酸钠、环氧大豆油、皂土、丁基缩水甘油醚、苯甲酸钠、亚麻油、丁香酚中的一种或几种混合物；消泡剂为硅油、正辛醇和脂肪酸类中的一种或几种混合物。

优选地，着色剂为碱性玫瑰精油。

本发明同时提供了一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)纯化的H6新鲜菌落的制备：物喷雾干燥粉的制备：无菌条件下，将合欢内生菌H6菌种以划线法接种于LB培养基平板上，倒置于恒温培养箱中培养，再次划线接种于新鲜LB培养基平板上，重复上述操作培养，制得纯化的H6新鲜菌落；

(2)H6种子液的制备：将步骤(1)中制得的H6新鲜菌落用接菌环接取至LB培养液体中，于气浴恒温振荡箱中振荡培养制备H6种子液；

(3)H6发酵液的制备：将步骤(2)制备的H6种子液接种于LB培养液中，于气浴恒温振荡箱中振荡培养，制得H6发酵液；

(4)H6发酵物喷雾干燥粉末的制备：采用实验型喷雾干燥机，将步骤(3)制得的H6发酵液进行喷雾干燥处理，制备H6发酵物喷雾干燥粉末；

(5)按照各自重量配比，将步骤(4)制得的合欢内生细菌H6发酵物喷雾干燥粉、润湿剂、增稠剂、成膜剂、防冻剂、稳定剂、着色剂、消泡剂和水混匀、加工成粒，制得合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂。

优选地，加工方式为砂磨、胶体磨、球磨、高速搅拌剪切、均质匀浆中的一种或几种。

本发明还提供了合欢内生菌H6发酵物的抑菌用途，合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂对黄瓜枯萎病菌的的防治作用。

优选地，合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂在防治黄瓜枯萎病菌的的应用，合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的重量百分比浓度为25％。

本发明的有益性：

1.本发明中的合欢内生菌H6发酵物对玉米小斑病菌、小麦根腐病菌、玉米弯孢病菌、辣椒早疫病菌和黄瓜枯萎病菌有防治作用，尤其对尤其对黄瓜枯萎病菌具有显著的抑菌活性。

2.本发明主要成分为内生细菌及其代谢产物，具有对人畜无毒、对非靶标生物安全、不污染环境等特点。

3.本发明的合欢内生菌H6发酵物悬浮种衣剂生产、加工、制备和使用过程中具有用量少、利用率高、低污染等优点。

4.本发明的合欢内生菌H6发酵物悬浮种衣剂按优化后的配方制备生产，其产品具有悬浮率高、成膜性好、包衣均匀、耐雨水冲刷、持效期长、耐贮藏、对作物安全等特点，在使用中具有促进作物根系生长，提高作物抗病性的特点。

5.经过室内和温室试验证明，本发明制备的生物悬浮种衣剂，以内生细菌H6及其发酵产物作为有效成分，可用于种子包衣，保障种子的发芽率，兼具苗期和成株期枯萎病的预防与控制，安全、杀菌谱广，一次用药可以控制整个生长期的病害，提供了一种生物杀菌剂新剂型品种，贮藏期内稳定，对环境友好、防病效果明显。

附图说明

图1(a)为本发明实施例2中CK对照组；图1(b)本发明实施例2中H6发酵产物浓度为250μg/ml处理组；图1(c)为本发明实施例2中H6发酵产物浓度为500μg/ml处理组；图1(d)为本发明实施例2中H6发酵产物浓度为1000μg/ml处理组；图1(e)为本发明实施例3中H6发酵产物浓度为2000μg/ml处理组；

图2为本发明实施例6中H6发酵产物悬浮种衣剂包衣处理后的黄瓜种子；

图3a为本发明实施例6中10％H6悬浮种衣剂对黄瓜苗生长的影响；图3b为本发明实施例6中15％H6悬浮种衣剂对黄瓜苗生长的影响；图3c为本发明实施例6中25％H6悬浮种衣剂对黄瓜苗生长的影响；图3d为本发明实施例6中枯草芽孢杆菌菌剂对黄瓜苗生长的影响；图3e为本发明实施例6中CK对黄瓜苗生长的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所描述的本发明。

本发明所涉及的合欢内生细菌H6菌，该菌种记载在2014年2月5日公布的申请号201310365784.3、名称为一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用的中国发明专利申请说明书中，该菌种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名H6解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号：CGMCC No.：7990。

实施例1合欢内生细菌H6发酵物干燥粉的制备

无菌条件下，将合欢内生菌H6菌种以划线法接种于LB培养基平板上，倒置于恒温培养箱中(30℃)，培养24～48h后，再次划线接种于新鲜LB培养基平板上，重复上述操作培养，纯化的H6新鲜菌落待用。自H6新鲜菌落用接菌环接取2～3环至150ml LB培养液体中，于转速180r/min，30℃气浴恒温振荡箱中振荡培养24h制备种子液。按5～10％的接种量，将新鲜的H6种子液接种于1000ml的LB培养液中，于转速180r/min，30℃的气浴恒温振荡箱中振荡培养3～4d。采用实验型喷雾干燥机，设定温度180℃，风机速度80％，蠕动泵速度5％，通针3％，进行H6发酵液进行喷雾干燥处理，制备H6发酵物的干燥粉末，称重后密封备用。

实施例2合欢内生细菌H6发酵物对五种植物病原真菌室内毒力测定

无菌条件下，以甲醇为溶剂，在抑菌率10％～90％之间，将H6发酵产物配制4个实验浓度，分别为浓度为250μg/ml处理组，浓度为500μg/ml处理组，浓度为1000μg/ml处理组，浓度为2000μg/ml处理组，制成相应量的带毒培养基平板，以添加等量甲醇的培养基为空白对照，每处理四次重复。将玉米小斑病菌、小麦根腐病菌、玉米弯孢病菌、辣椒早疫病菌和黄瓜枯萎病菌五种植物病原菌纯化扩繁后(28℃，培养3～4d)用打孔器(直径0.6cm)在菌落边缘打取菌饼，倒置接种于带毒平板中央，28℃恒温箱内中，培养4～6d后，测定各处理菌落直径，计算H6发酵物对供试病原菌的抑菌率。

抑制生长率％＝(对照组菌丝平均直径-含药组菌丝平均直径)/对照组菌丝平均直径×100％

Excel表格处理数据，X值为发酵物浓度的对数值，Y值为菌丝生长抑制率所对应的几率值，线性回归得出毒力回归方程后，计算H6发酵产物对病原菌的EC₅₀值。由表1可知，H6活性物质对5种供试植物病原菌均有一定的抑制作用，具有广谱的杀菌作用，EC₅₀在416.87μg/ml与995.41μg/ml之间，其中对黄瓜枯萎病菌的抑制效果最好，如图1(a)～(e)所示，EC₅₀可达416.87μg/ml。

表1H6活性物质对4种植物供试病原真菌的室内毒力测定

供试病原菌	回归方程	相关系R<sup>2</sup>	EC<sub>50</sub>(μg/ml)
				玉米小斑病菌	Y＝0.5122X+3.4646	0.9588	995.41
小麦根腐病菌	Y＝0.7912X+2.6997	0.8370	812.83
				玉米弯孢病菌	Y＝0.8037X+2.7417	0.9908	645.65
辣椒早疫病菌	Y＝0.3963X+3.9589	0.9383	426.58
				黄瓜枯萎病菌	Y＝0.3002X+4.2136	0.9746	416.87

实施例3 10％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的制备

各组分重量百分比为，合欢内生细菌H6发酵物干粉10％，十二烷基磺酸钠3％、羧甲基纤维素钠5％、黄原胶0.1％、皂土5％、正辛醇1％、乙二醇1％、碱性玫瑰精0.1％，加水补足至100％。混匀后于砂磨机中研磨5小时，使其平均粒径为4μm以下，即得悬浮种衣剂产品。按照FAO相关标准，测定各项理化性质指标，选择性状稳定的悬浮种衣剂配方，如表2。

实施例4 15％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的制备

各组分重量百分比为，合欢内生细菌H6发酵物干粉15％，十二烷基磺酸钠6％、羧甲基纤维素钠3％、黄原胶5％、皂土1％、硅油2％、乙二醇3％、碱性玫瑰精2％，加水补足至100％。混匀后于砂磨机中研磨5小时，使其平均粒径为4μm以下，即得悬浮种衣剂产品，按照FAO相关标准，测定各项理化性质指标，选择性状稳定的悬浮种衣剂配方，如表2。

实施例5 25％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的制备

各组分重量百分比为，合欢内生细菌H6发酵物干粉25％，十二烷基磺酸钠10％、羧甲基纤维素钠1％、黄原胶3％、皂土10％、硅油0.1％、尿素5％、碱性玫瑰精3％，加水补足至100％。混匀后于砂磨机中研磨5小时，使其平均粒径为4μm以下，即得悬浮种衣剂产品。实例3～5中产品，按照FAO相关标准，其各项理化性质指标与性状均稳定，如表2。

表2 H6悬浮种衣剂理化性质测定

配方号	1	2	3	4
					有效成分比例(％)	0	10	15	25
粒径/μm(D50)	2.79	2.87	2.88	2.86
					包衣均匀度(％)	92.36	92.42	94.16	94.32
悬浮率(％)	91.69	92.64	92.52	92.72
					脱落率(％)	4.22	4.11	3.83	3.92
PH值	7.53	7.53	7.53	7.53
					成膜时间/min	20	20	20	20
热储稳定性	良好	良好	良好	良好
					冷储稳定性	良好	良好	良好	良好

实施例6 10～25％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂对黄瓜枯萎病的防治效果测定

实验材料：10～25％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂(自配)，供试黄瓜品种为“优圣58”(青岛城阳农资公司购买)。

防治病害：黄瓜枯萎病菌。

实验条件：温室盆栽实验在青岛农业大学化学与药学院人工气候室进行。

实验方法：精选饱满的黄瓜种子，无菌条件下，用0.3％的次氯酸钠溶液充分浸泡3min黄瓜种子进行消毒处理，吸干种子表面，放于塑料自封袋中，按药种比1:50(重量比)分别用10％、15％和25％合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂分别进行种子包衣处理，充分震荡自封袋中的种子，使种子均匀着药，于通风处摊开，稍晾干后播种，并设置不包衣的黄瓜种子作为其空白对照，设置枯草芽孢杆菌粉剂处理的种子为药剂对照，每处理5粒种子，4次重复。将培养6d左右黄瓜枯萎病菌以无菌水配制成1×10⁶个·ml^-1的孢子悬浮液，与营养土混合均匀，制成带菌营养土，装于苗钵中(直径8～10cm)。各处理种子播于苗钵中，放置于人工气候室内培养(温度白天25℃，夜晚20℃；土壤湿度为85％～95％；空气湿度白天80％，夜间90％)。于播种后7d、15d和30d进行病情指数调查。黄瓜枯萎病病情分级标准：0级，无病症；1级，茎叶萎焉黄化面积达到25％；2级，茎叶萎焉黄化面积为26％～50％；3级，茎叶萎焉黄化面积为51％～75％；4级，植株严重萎焉，倒伏而死。

病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×4)×100％

防治效果＝(对照平均病情指数-处理病情指数)/对照平均病情指数×100％

另外，每处理单独选取100粒黄瓜种子播种于无菌营养土中，播种后7d和15d分别调查一次种子出苗情况，检测出苗率。

实验结果：如图3(a)～(e)所示，各实验处理中，黄瓜出苗率均在94％以上，25％H6悬浮种衣剂处理组对黄瓜根部生长有明显的促进作用，各处理组对株高生长无显著的抑制或促进作用，如表3。25％H6悬浮种衣剂处理组对黄瓜枯萎病的防效达83.30％，显著优于其他处理组。表3 H6悬浮种衣剂对黄瓜苗生长的影响及对黄瓜枯萎病的防效测定

注：同列中标注为相同字母的说明无显著性差异。

Claims

1.一种合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，其特征是，由以下重量百分比的组分组成，合欢内生细菌H6发酵物喷雾干燥粉10～25％，润湿剂3～10％，增稠剂0.1～5％，成膜剂1～5％，防冻剂1～5％，稳定剂1～10％，着色剂0.1～3％，消泡剂0.1～2％，余量为水。

2.根据权利要求1所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，其特征在于，所述润湿剂为磷酸酯、木质素型、聚羧酸盐、司盘80、十二烷基硫酸钠、农乳600#、吐温80、萘磺酸中的一种或几种；所述增稠剂为黄原胶、硅酸镁铝中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，其特征在于，所述成膜剂为甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙二醇和聚丙烯酰胺中的一种或几种；所述防冻剂包括聚乙二醇、尿素、海藻酸、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，其特征在于，所述稳定剂为山梨酸钠、环氧大豆油、皂土、丁基缩水甘油醚、苯甲酸钠、亚麻油、丁香酚中的一种或几种混合物；所述消泡剂为硅油、正辛醇和脂肪酸类中的一种或几种混合物。

5.根据权利要求1所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，其特征在于，所述着色剂为碱性玫瑰精油。

6.根据权利要求1所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)H6种子液的制备：将所述步骤(1)中制得的H6新鲜菌落用接菌环接取至LB培养液体中，于气浴恒温振荡箱中振荡培养制备H6种子液；

(3)H6发酵液的制备：将所述步骤(2)制备的H6种子液接种于LB培养液中，于气浴恒温振荡箱中振荡培养，制得H6发酵液；

(4)H6发酵物喷雾干燥粉末的制备：采用实验型喷雾干燥机，将所述步骤(3)制得的H6发酵液进行喷雾干燥处理，制备H6发酵物喷雾干燥粉末；

(5)按照各自重量配比，将所述步骤(4)制得的合欢内生细菌H6发酵物喷雾干燥粉、润湿剂、增稠剂、成膜剂、防冻剂、稳定剂、着色剂、消泡剂和水混匀、加工成粒，制得合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂。

7.根据权利要求所述的合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂，步骤(5)中，所述加工方式为砂磨、胶体磨、球磨、高速搅拌剪切、均质匀浆中的一种或几种。

8.一种合欢内生菌H6发酵物的抑菌用途，其特征在于，合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂对黄瓜枯萎病菌的的防治作用。

9.根据权利要求8所述的合欢内生菌H6发酵物的抑菌用途，其特征在于，所述合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂在防治黄瓜枯萎病菌的的应用，所述合欢内生细菌H6发酵物悬浮种衣剂的重量百分比浓度为25％。