CN102010895A - 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 - Google Patents

动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102010895A
CN102010895A CN 201010160378 CN201010160378A CN102010895A CN 102010895 A CN102010895 A CN 102010895A CN 201010160378 CN201010160378 CN 201010160378 CN 201010160378 A CN201010160378 A CN 201010160378A CN 102010895 A CN102010895 A CN 102010895A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rdna
bacilli
pcr
rflp
kinds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201010160378
Other languages
English (en)
Inventor
肖西志
高宏伟
邓明俊
朱来华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority to CN 201010160378 priority Critical patent/CN102010895A/zh
Publication of CN102010895A publication Critical patent/CN102010895A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明为动物饲料中4种细菌的PCR-RFLP检测技术，具体地说是用14种内切酶对存在于动物饲料中的4种芽孢杆菌的16s rDNA进行酶切，每种菌形成一个16s rDNA的内切酶指纹图谱，从而建立4种菌的检测方法。方法包括PCR扩增16s rDNA，然后以14种内切酶分别对4种菌的16s rDNA扩增产物进行酶切，再经琼脂糖凝胶电泳。4种细菌分别是：阪崎肠杆菌、戴氏西地西菌、金黄色葡萄球菌、居泉沙雷菌。具体检测方法包括4种菌DNA的提取、PCR扩增16s rDNA、内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR-RFLP指纹图谱的建立。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

Description

动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 
技术领域
本发明属于进出境动物饲料中4种细菌的指纹分析方法。 
背景技术
随着我国对外贸易的扩大，动物饲料的进口量也与日俱增。目前，我国进口的动物饲料包括白鱼粉、红鱼粉、牛肉骨粉、牛羊肉骨粉、鱼饲料等。沙门氏菌和志贺氏菌为当前进出境动物饲料的法检项目，而其他食品上的法检项目并未被列入其中，如阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙雷菌等。随着动物福利的日益提高，这些菌在将来也许会成为法检项目。 
基于DNA的检测方法已越来越多的被当前检验检疫行业标准所采纳，成为对大宗货物进行筛查的方法之一。细菌的16s rDNA是非常保守的一段序列，通过对其序列的分析，可将细菌鉴定到属，甚至是种。同时，对其序列的分析发现，各个细菌的16s rDNA具有限制性片段多态性。基于细菌16s rDNA的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)可以建立各种细菌的指纹图谱，因此可以通过对动物饲料中的细菌进行16s rDNA的PCR-RFLP分析，与所建立的指纹图谱进行比对，即可得出是哪种细菌，从而进行鉴别。 
该方法操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好等优点。目前国内外还没有建立针对动物饲料中的细菌16s rDNA的PCR-RFLP指纹图谱，本发明可弥补目前方法的缺陷。 
发明内容
本发明主要是应用14种内切酶对动物饲料中的4种细菌16s rDNA进行切割，从而16s rDNA的指纹图谱。 
本发明的主要原理为：针对4种细菌的16s rDNA，利用通用引物27f和1492r进行扩增，扩增产物用17种内切酶分别进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，显示出各个芽孢杆菌的特异性指纹谱图。 
本发明涉及过程如下： 
(1)常规方法分离鉴定动物饲料中常见的4种细菌。 
(2)细菌总DNA的提取 
利用细菌DNA提取试剂盒，分别提取4种菌的总DNA，步骤按照试剂盒操作说明。 
(3)PCR 
利用细菌16s rDNA通用引物对提取的细菌DNA进行16s rDNA扩增。 
(4)RFLP 
用14种内切酶对PCR产物进行切割。14种内切酶及其排布顺序如下： 
AvaI，BamHI，BgII，DraI，EcoRI，EcoRII，HindIII，Hinf，HpaI，PstI，SmaI，TaqI，XbaI，XmaI。 
(5)琼脂糖凝胶电泳 
对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳胶为2％的琼脂糖凝胶。 
(6)PCR-RFLP指纹图谱的建立 
具体实施方式
对所得图谱进行分析，显示各个菌的谱图能相互区分，表明各个菌的指纹图谱具有特异性，可作为其他菌株PCR-RFLP比对的基础。 
图1是从饲料中分离的一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图2是从饲料中分离的另外一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图3是阪崎肠杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图4是戴氏西地西菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图5是金黄色葡萄球菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图6是居泉沙雷菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱。 
经比对，所分离的2种菌与其中的戴氏西地西菌和居泉沙雷菌完全吻合，因此鉴定为戴氏西地西菌和居泉沙雷菌。 

Claims (1)

1.存在于动物饲料中4种细菌鉴定的快速检测方法，其特征在于所使用的内切酶种类及酶切后形成的指纹图谱：
共用14种内切酶4种细菌进行酶切鉴定，14种内切酶为：Ava I，BamH I，BgII，Dra I，EcoR I，EcoRII，HindIII，Hinf，Hpa I，Pst I，Sma I，Taq I，Xba I，Xma I，并按照这样的顺序进行酶切。指纹图谱为这14种内切酶切割后形成14道的电泳图谱，而且每种菌均具有特异而且唯一的指纹。
CN 201010160378 2010-04-23 2010-04-23 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 Pending CN102010895A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010160378 CN102010895A (zh) 2010-04-23 2010-04-23 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010160378 CN102010895A (zh) 2010-04-23 2010-04-23 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102010895A true CN102010895A (zh) 2011-04-13

Family

ID=43841225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010160378 Pending CN102010895A (zh) 2010-04-23 2010-04-23 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102010895A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104483409A (zh) * 2014-12-12 2015-04-01 河北农业大学 一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法
CN106434916A (zh) * 2016-09-24 2017-02-22 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种阪崎肠杆菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法
CN107841570A (zh) * 2017-12-29 2018-03-27 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量pcr方法
CN109234373A (zh) * 2018-11-27 2019-01-18 光明乳业股份有限公司 一种米曲霉的鉴定方法
CN109266771A (zh) * 2018-11-27 2019-01-25 光明乳业股份有限公司 植物乳杆菌菌株的鉴定方法
CN110699474A (zh) * 2019-12-09 2020-01-17 合肥工业大学 一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101130815A (zh) * 2007-09-18 2008-02-27 中国科学院南海海洋研究所 华南沿海七种巨蛎属牡蛎的pcr-rflp鉴别方法
CN101260434A (zh) * 2008-02-20 2008-09-10 中国科学院水生生物研究所 一种城市污水中浮游生物群落dna指纹的分析方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101130815A (zh) * 2007-09-18 2008-02-27 中国科学院南海海洋研究所 华南沿海七种巨蛎属牡蛎的pcr-rflp鉴别方法
CN101260434A (zh) * 2008-02-20 2008-09-10 中国科学院水生生物研究所 一种城市污水中浮游生物群落dna指纹的分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《家畜生态学报》 20061115 马广强等 通过16S rDNA全序列分析及鉴定牛沙门氏菌 , 第06期 2 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104483409A (zh) * 2014-12-12 2015-04-01 河北农业大学 一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法
CN104483409B (zh) * 2014-12-12 2017-01-11 河北农业大学 一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法
CN106434916A (zh) * 2016-09-24 2017-02-22 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种阪崎肠杆菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法
CN107841570A (zh) * 2017-12-29 2018-03-27 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量pcr方法
CN109234373A (zh) * 2018-11-27 2019-01-18 光明乳业股份有限公司 一种米曲霉的鉴定方法
CN109266771A (zh) * 2018-11-27 2019-01-25 光明乳业股份有限公司 植物乳杆菌菌株的鉴定方法
CN110699474A (zh) * 2019-12-09 2020-01-17 合肥工业大学 一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102010895A (zh) 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法
Vitullo et al. Real-time PCRs assay for serogrouping Listeria monocytogenes and differentiation from other Listeria spp.
Zinno et al. Characterization of Streptococcus thermophilus lytic bacteriophages from mozzarella cheese plants
CN106868167A (zh) 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
Gattuso et al. Optimization of a Real Time PCR based method for the detection of Listeria monocytogenes in pork meat
Heo et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes by real-time PCR in processed meat and dairy products
Yang et al. A novel developed method based on single primer isothermal amplification for rapid detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice
Kelly et al. Genome sequence of the phage clP1, which infects the beer spoilage bacterium Pediococcus damnosus
Yu et al. Rapid identification of lactic acid bacteria isolated from home-made fermented milk in Tibet
CN104263845B (zh) 一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr方法
Guenther et al. Detection of Trichinella spiralis, T. britovi and T. pseudospiralis in muscle tissue with real-time PCR
CN103614484A (zh) 一种蝙蝠蛾拟青霉菌粉的特异pcr鉴真方法
Yu et al. Analysis of the bacterial diversity existing on animal hide and wool: Development of a preliminary PCR-restriction fragment length polymorphism fingerprint database for identifying isolates
Lorusso et al. A real‐time PCR assay for detection and quantification of Mycoplasma agalactiae DNA
CN104946638A (zh) 一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重dpo-pcr检测试剂盒及其应用
Selim et al. Duplex real-time PCR assay targeting insertion elements IS1081 and IS6110 for detection of Mycobacterium bovis in lymph nodes of cattle
Ye et al. Detection of C ronobacter on glu B Gene and Differentiation of Four C ronobacter Species by Polymerase Chain Reaction‐Restriction Fragment Length Polymorphism Typing
Nguyen et al. Molecular diagnostics and ITS-based phylogenic analysis of Streptococcus suis serotype 2 in central Vietnam
MX348307B (es) Composiciones y métodos para identificar y diferenciar componentes virales de vacunas multivalentes de fiebre del embarque.
Ningrum et al. Phenotypic and genotypic analysis of an Arcanobacterium pluranimalium isolated from a muskox (Ovibos moschatus)
CN101993953A (zh) 动物皮毛中9种芽孢杆菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法
CN102851361B (zh) 沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌pcr-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法
Mannering et al. Pulsed-field gel electrophoresis typing of Campylobacter fetus subsp. fetus from sheep abortions in the Hawke's Bay region of New Zealand
Pillidge et al. Intragenomic 16S rRNA gene heterogeneity in Lactococcus lactis subsp. cremoris
Gan et al. Molecular typing of Salmonella enterica serovar Sofia in Australia by pulsed‐field gel electrophoresis and repetitive element PCR typing

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110413