CN102010895A - 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 - Google Patents

动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 Download PDF

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肖西志
高宏伟
邓明俊
朱来华
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Abstract

本发明为动物饲料中4种细菌的PCR-RFLP检测技术，具体地说是用14种内切酶对存在于动物饲料中的4种芽孢杆菌的16s rDNA进行酶切，每种菌形成一个16s rDNA的内切酶指纹图谱，从而建立4种菌的检测方法。方法包括PCR扩增16s rDNA，然后以14种内切酶分别对4种菌的16s rDNA扩增产物进行酶切，再经琼脂糖凝胶电泳。4种细菌分别是：阪崎肠杆菌、戴氏西地西菌、金黄色葡萄球菌、居泉沙雷菌。具体检测方法包括4种菌DNA的提取、PCR扩增16s rDNA、内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR-RFLP指纹图谱的建立。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

Description

动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 
技术领域
本发明属于进出境动物饲料中4种细菌的指纹分析方法。 
背景技术
随着我国对外贸易的扩大，动物饲料的进口量也与日俱增。目前，我国进口的动物饲料包括白鱼粉、红鱼粉、牛肉骨粉、牛羊肉骨粉、鱼饲料等。沙门氏菌和志贺氏菌为当前进出境动物饲料的法检项目，而其他食品上的法检项目并未被列入其中，如阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙雷菌等。随着动物福利的日益提高，这些菌在将来也许会成为法检项目。 
基于DNA的检测方法已越来越多的被当前检验检疫行业标准所采纳，成为对大宗货物进行筛查的方法之一。细菌的16s rDNA是非常保守的一段序列，通过对其序列的分析，可将细菌鉴定到属，甚至是种。同时，对其序列的分析发现，各个细菌的16s rDNA具有限制性片段多态性。基于细菌16s rDNA的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)可以建立各种细菌的指纹图谱，因此可以通过对动物饲料中的细菌进行16s rDNA的PCR-RFLP分析，与所建立的指纹图谱进行比对，即可得出是哪种细菌，从而进行鉴别。 
该方法操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好等优点。目前国内外还没有建立针对动物饲料中的细菌16s rDNA的PCR-RFLP指纹图谱，本发明可弥补目前方法的缺陷。 
发明内容
本发明主要是应用14种内切酶对动物饲料中的4种细菌16s rDNA进行切割，从而16s rDNA的指纹图谱。 
本发明的主要原理为：针对4种细菌的16s rDNA，利用通用引物27f和1492r进行扩增，扩增产物用17种内切酶分别进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，显示出各个芽孢杆菌的特异性指纹谱图。 
本发明涉及过程如下： 
(1)常规方法分离鉴定动物饲料中常见的4种细菌。 
(2)细菌总DNA的提取 
利用细菌DNA提取试剂盒，分别提取4种菌的总DNA，步骤按照试剂盒操作说明。 
(3)PCR 
利用细菌16s rDNA通用引物对提取的细菌DNA进行16s rDNA扩增。 
(4)RFLP 
用14种内切酶对PCR产物进行切割。14种内切酶及其排布顺序如下： 
AvaI，BamHI，BgII，DraI，EcoRI，EcoRII，HindIII，Hinf，HpaI，PstI，SmaI，TaqI，XbaI，XmaI。 
(5)琼脂糖凝胶电泳 
对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳胶为2％的琼脂糖凝胶。 
(6)PCR-RFLP指纹图谱的建立 
具体实施方式
对所得图谱进行分析，显示各个菌的谱图能相互区分，表明各个菌的指纹图谱具有特异性，可作为其他菌株PCR-RFLP比对的基础。 
图1是从饲料中分离的一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图2是从饲料中分离的另外一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图3是阪崎肠杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图4是戴氏西地西菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图5是金黄色葡萄球菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 
图6是居泉沙雷菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱。 
经比对，所分离的2种菌与其中的戴氏西地西菌和居泉沙雷菌完全吻合，因此鉴定为戴氏西地西菌和居泉沙雷菌。 

Claims (1)

1.存在于动物饲料中4种细菌鉴定的快速检测方法，其特征在于所使用的内切酶种类及酶切后形成的指纹图谱：
共用14种内切酶4种细菌进行酶切鉴定，14种内切酶为：Ava I，BamH I，BgII，Dra I，EcoR I，EcoRII，HindIII，Hinf，Hpa I，Pst I，Sma I，Taq I，Xba I，Xma I，并按照这样的顺序进行酶切。指纹图谱为这14种内切酶切割后形成14道的电泳图谱，而且每种菌均具有特异而且唯一的指纹。
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