CN109266771A - 植物乳杆菌菌株的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物乳杆菌菌株的鉴定方法。该方法包括以下步骤：(1)提取待测菌株基因组DNA，双酶切基因组DNA，得到酶切后的基因片段；(2)选取pMD18‑T质粒载体，双酶切后，得到酶切后的质粒；(3)将酶切后的基因片段与酶切后的质粒连接，转化，克隆，测序，获得至少7条序列；(4)将获得的序列进行BLAST比对分析，每条序列对应多个同源性高的菌株，如果任意7条序列对应的共有菌株仅为植物乳杆菌，就鉴定待测菌株为植物乳杆菌菌株。本发明提供了一种全新的鉴定植物乳杆菌菌株的方法。本发明的方法操作简单、特异性强，费用低，时间短，具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌菌株的鉴定方法。
背景技术
微生物研究中经常要进行菌种鉴定，而自然界大部分微生物都难以纯化培养，因此非培养的测序鉴定方法有很大优势。常用的测序鉴定方法难以区分菌株。全基因组测序可以鉴定区分特定菌株，但周期长，费用高。因此需要发展一种特异的菌株测序鉴定方法，提高鉴定分辨率，降低检测费用。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp)具有调节人体肠道菌群、降血脂、降胆固醇等益生功能，但不是所用菌株都有益生功能。植物乳杆菌ST-III是乳杆菌中一种典型的菌株，自身具有降低胆固醇、降血脂、提高人体免疫力等多种益生功能。植物乳杆菌ST-III的基因组已于2010年测定并公布，同时该菌株已经作为发酵剂应用于工业生产，但目前市场相对混乱，存在大量以假乱真、以次充好的现象。
因此，研究一种简单、快速鉴定植物乳杆菌菌株的方法，具有重要的意义。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种简单、快速鉴定植物乳杆菌菌株的方法，该方法仅使用几条序列就能鉴定出植物乳杆菌菌株。
具体的，一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌菌株的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测菌株基因组DNA，双酶切基因组DNA，得到酶切后的基因片段；
(2)选取pMD18-T质粒载体，双酶切后，得到酶切后的质粒；
(3)将酶切后的基因片段与酶切后的质粒连接，转化，克隆，测序，获得至少7条序列；
(4)将获得的序列进行BLAST比对分析，每条序列对应多个同源性高的菌株，如果任意7条序列对应的共有菌株仅为植物乳杆菌，就鉴定待测菌株为植物乳杆菌菌株。
本发明通过双酶切待测菌株的基因组和载体质粒，连接，转化，克隆测序后进行比对分析，如果7条序列对应的共有菌株为植物乳杆菌菌株，就鉴定为植物乳杆菌菌株。本发明可以仅利用任意7条常用序列，就能将植物乳杆菌菌株鉴定出，操作简单，费用低。
进一步的，步骤(1)中，将待测菌株划线培养后获得单菌落，挑取单菌落经纯培养离心收集菌体，液氮粉碎菌体后提取基因组DNA。
进一步的，步骤(1)中，双酶切所用的酶为Pst I内切酶和BamH内切酶。
进一步的，步骤(1)中，双酶切后，将酶灭活，然后过柱纯化。
进一步的，步骤(2)中，在氨苄抗性LB平板上，挑取载体pMD18-T自连质粒，然后进行液体扩培。
进一步的，步骤(2)中，使用依赖于ATP的线性DNA分解酶纯化质粒。
进一步的，步骤(3)中，酶切后的基因片段与酶切后的质粒使用T4 DNA连接酶进行连接。
进一步的，步骤(3)中，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，使用氨苄青霉素进行抗性筛选。
进一步的，步骤(3)中，将转化子抽提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性的转化子送样测序。
进一步的，步骤(4)中，将获得的序列在NCBI网站上进行比对分析。
本发明的有益效果为：本发明通过双酶切待测菌株的基因组和载体质粒，连接，转化，克隆测序后进行比对分析，任意7条序列对应的共有菌株为植物乳杆菌菌株，就鉴定为植物乳杆菌菌株。本发明提供了一种全新的鉴定植物乳杆菌菌株的方法。本发明的方法操作简单、特异性强，费用低，时间短，具有十分广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III)鉴定
植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III)鉴定方法包括以下步骤：
(1)将保存的植物乳杆菌ST-Ⅲ在MRS平板上划线培养，获得植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌落，纯培养离心收集菌体。液氮粉碎菌体，使用N96 Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA；
双酶切提取的DNA，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer5μL，Pst I5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(2)在氨苄抗性LB平板上，挑取载体pMD18-T Vector(购自Takara BiomedicalTechnology(Beijing)Co.,Ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(DP103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于ATP的线性DNA分解酶(ATPDependent DNase，Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)水解线性双链DNA，去除宿主基因组DNA，纯化质粒。
双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer 5μL,Pst I 5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(3)将上述双酶切纯化物用T4DNA连接酶(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)连接，连接参考说明书。
取连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子经克隆扩培后，送样测序。使用通用引物BcaBEST Sequencing Primer RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行测序，获得7条序列，如表1所示。
(4)将获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析，结果见表2。每条序列同源性最高对应的菌株有多株，但7条序列最高同源性共有的菌株仅为植物乳杆菌ST-Ⅲ。因此鉴定所测菌株为Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III。
表1
表2
由表2可知，7条序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析后，得到每条序列对应的菌株序列的覆盖率(Query cover)和相似度(Ident)，同源性的数值为两者相乘。每条序列同源性最高对应的菌株有多株。7条序列最高同源性共有的菌株仅为植物乳杆菌ST-Ⅲ，因此鉴定所测菌株为Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III。
实施例2
植物乳杆菌菌株鉴定方法包括以下步骤：
(1)将待测植物乳杆菌菌株在MRS平板上划线培养，获得植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌落，纯培养离心收集菌体。液氮粉碎菌体，使用N96 Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA；
双酶切提取的DNA，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer5μL，Pst I5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(2)在氨苄抗性LB平板上，挑取载体pMD18-T Vector(购自Takara BiomedicalTechnology(Beijing)Co.,Ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(DP103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于ATP的线性DNA分解酶(ATPDependent DNase，Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)水解线性双链DNA，去除宿主基因组DNA，纯化质粒。
双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer 5μL,Pst I 5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(3)将上述双酶切纯化物用T4 DNA连接酶(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)连接，连接参考说明书。
取连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子经克隆扩培后，送样测序。使用通用引物BcaBEST Sequencing Primer RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行测序，获得10条序列。
(5)将获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析。每条序列同源性最高对应的菌株有多株，但10条序列最高同源性共有的菌株仅为植物乳杆菌ST-Ⅲ，由此鉴定为待测菌株为Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III。
实施例3
植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株鉴定方法包括以下步骤：
(1)将待测植物乳杆菌菌株在MRS平板上划线培养，获得植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌落，纯培养离心收集菌体。液氮粉碎菌体，使用N96 Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA；
双酶切提取的DNA，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer 5μL，Pst I5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(2)在氨苄抗性LB平板上，挑取载体pMD18-T Vector(购自Takara BiomedicalTechnology(Beijing)Co.,Ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(DP103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于ATP的线性DNA分解酶(ATPDependent DNase，Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)水解线性双链DNA，去除宿主基因组DNA，纯化质粒。
双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：DNA 200ng，10×K Buffer 5μL,Pst I 5U，BamH I 5U。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，天根生化科技(北京)有限公司)。
(3)将上述双酶切纯化物用T4 DNA连接酶(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.)连接，连接参考说明书。
取连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子经克隆扩培后，送样测序。使用通用引物BcaBEST Sequencing Primer RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行测序，获得12条序列。
(4)将获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析。每条序列同源性最高对应的菌株有多株，但12条序列最高同源性共有的菌株仅为植物乳杆菌ST-Ⅲ，由此鉴定为待测菌株为Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 光明乳业股份有限公司
<120> 植物乳杆菌菌株的鉴定方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
cacctcaata gcaaggcttt gaagtttttg cagtaccagc aacggtgggg cctgtttcta 60
ctttttttgg acactcaaag tactagtgtt cgtttattgc atcacgtctt gacattggat 120
acggaaccgc tgacctatca aacgattcga ctggatacgc gcagccagtc ggtgttacgt 180
tttcgccaat tggctcctaa aattaacacc ccaactttgc cggacacgca tttacggcat 240
tattatcaac agttaatgtt ggcacggctt cgacatcaac gtggttttga tgcgttacaa 300
gtggcttgct atcaacgcgg aggaacgatt gtccagttac cgacgtggac gatgcccact 360
gtgccgcaac taccgctgtt atcggtacca tatctggtct ggcacgccca cgtctttttt 420
gcactgcggc aacagtccgg acggcttgct gggtcacaat tagaggcatt gatctgggcc 480
caattacggc cattacttgc ccggcgtgcc tgcctgcaag cacgaggcac gttaatacaa 540
caactgataa cgaccatgat tacgatgctt agcgagcagc aagtgataaa ctggcagaaa 600
actgagtggc aggtgaattc cgaccagctt cgatggcgca aacattgatt ccggaacaga 660
tgctaccgcg ataggcgtaa tctgtggtaa tctagtgcta 700
<210> 2
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
cggcttagac gtcgtatttc cggtagcggc attaccacta atcgctacgt aatgttgggc 60
gcccgaataa gacaaatacc gtaaccaagt ctggccgtta gccgttacct tagcgttgta 120
gtagactgta tcaccagcac tataggtacc gacacttggg gcatttccgg ccggtgtatt 180
cttaatcgcc gttgtttgcg taaagcgata actaccactt tgaggcgtta cttgcggttt 240
atcaacattg gtcgacgtac tctcaccact aatttgcaca taatgctggg cacctgagta 300
agacatgtaa cgtaaccaag tctgaccatt tgtcgtcacc ttaccattgt aatagaccgt 360
atcgccagca ttataagacc caaccgttgt cgcactagtt gcaggtgaac tcttgattgc 420
tgtcgttttc gtgaaacgat acgacccact ggttgcaacc acgtccggtt tagccacaga 480
accaacctca tcaccactca tagccacgta atgctgagcg cctgaatagg ataaataccg 540
taaccaagtt gtcccacccg tggtaatctt gccattatag taaaccgtct caccagcatt 600
ataagtgccg accacttgag ccgttttgct tgcagctgat cgaatgttgg tctttgcggt 660
aaacttatac gacccactag ctggcgtaac tgtcgcctgg 700
<210> 3
<211> 391
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
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tatttaccgc ttggatttca cagattggta tttatgaaat tatgtggttt gacgtattaa 180
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ataatgcatg ttgcaaaccc gagagttttt tgtcctaaat taaacgttcc tgttgtgtgt 360
aatgttgcca acagtaactg cgactgaatt c 391
<210> 4
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
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cgtttgccat taattgtagc aagtcagctt gatccatgcc ggttttagcc tcataagcgc 180
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tgtgatcgcc agccatagca accacactgg ccgcactagc ggctaagcct tgaatattaa 360
ctgttacatc gccagcataa ttttttagca tagtgtaaat ctcactagcc gcaaaaacat 420
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ttagcttcag gcatttcatc cggaaaataa ccagtctgct gta 703
<210> 5
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
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ttcctcccat ttattaaact gattgttctt aacataaacc gcaatgaagt cactattaaa 120
agcttgagcc atttgtgcag cagaacgaat gacacgttca ttactcttag atccggataa 180
acagactagt agccgatcag tacctacctt tgagttggta gccaatctta aagtcatttt 240
cctcaatgca agttctctta acgtagtaag attttcagat ttaaaaaaat tagctaatgc 300
ttgccttata tgatttctag catatatttt tccaatttta agtctattga tcagatcatt 360
gggttcgata tcaattaact tgacctgatt tgccatatca aatatataat ctggtactcg 420
ttcttgaata tcaacgttta attgttcaaa aattatatcg tgcaggcttt ctagatgttg 480
aacatttagc gttgtataca cattgatacc agcagtaagt aattcctgaa tgtcttgata 540
acgtttcaaa tggcgacttt ttttcgtatt tgtatgtgct aactcatcaa ctaaaattgt 600
ctgtggatgt cgttccagtg caccatcgag attgaattc 639
<210> 6
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
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tagcggatat tagcaaacgg acccatgata aagggatgcg gttcggactt tggttcgagc 180
cagaaaatat ttcagccgat tccgatcttt atcgggccca tcctgattgg gtgttaggcg 240
taccagatcg tggccgaacg ttatcgcgga acgaatacgt gcttgatttc agccagccgg 300
atgttgtcga caatattttt gaacaaatga ccgcagttct tgataaggtg cccattgatt 360
atatcaagtg ggatatgaac cgcaatttaa cggaagtcta ttcgccacat agcgattcaa 420
ctcatgaagg tgagactagc caccgcttta tcttaggtgt atatgacttg atggagcgtt 480
taacaaaacg ctatccacag atcttatttg aaggctgctc tggcggtggt ggccgctttg 540
atgctggttt aatgtattat atgccacaga gttggccatc agataataat gacccgattg 600
aacggctcaa aattcaatat gggacttcac tcgtttatcc aatttctgca attaccgccc 660
atgttgggac gagcccggat gaattgttag gac 693
<210> 7
<211> 716
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
ctgcagcaaa ttcaaggctt ctatcaacgt ttggttttct gaacaaaaat gtcggtagcc 60
ccgtcaagga ctaccgacat ttttactaac ctgcttattc tcttcttaac tgctttattc 120
agccgtaata taattcaaaa ttgcattcag aacttgttga ttctctcgtg gtaccggcgt 180
ttgtaaaatt tctgctgctg ttcggtttag gaccgacccc gcaatatacc gataatcatt 240
gacgaccatc tcacgaacat tgtccgcagc cggctcaaag tgaaattgta accccactac 300
ccgatgcttc catacgaagc cttgattggt cacacgatca ctagagaaca acagcgttgc 360
ttcggctgga acggtgaaca tctcctcgtg ccaatgcaag accgacagtt ttgctggaat 420
ccccggaatc acgggactct gtcggtaaat cggtgcccaa cctacttcct tagctggcgc 480
cttagtgact gggtatccta aggtcttcgc aatttgttgc gcgccgtaac acgcaccaaa 540
cattgggata tcgcggtcca ataattgttg aatcaagtct cgttcctgct tgatccatgg 600
cagcgtatcg ttgggactca tcggtccgcc gaggataaca agcatctccg tctcatccgc 660
cgttgggaga acaccgaatt gatacgggtg atagacatac atggtatgac catggg 716
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测菌株基因组DNA，双酶切基因组DNA，得到酶切后的基因片段；
(2)选取pMD18-T质粒载体，双酶切后，得到酶切后的质粒；
(3)将酶切后的基因片段与酶切后的质粒连接，转化，克隆，测序，获得至少7条序列；
(4)将获得的序列进行BLAST比对分析，每条序列对应多个同源性高的菌株，如果任意7条序列对应的共有菌株仅为植物乳杆菌，就鉴定待测菌株为植物乳杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，将待测菌株划线培养后获得单菌落，挑取单菌落经纯培养离心收集菌体，液氮粉碎菌体后提取基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，双酶切所用的酶为PstI内切酶和BamH内切酶。
4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，双酶切后，将酶灭活，然后过柱纯化。
5.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，在氨苄抗性LB平板上，挑取载体pMD18-T自连质粒，然后进行液体扩培。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，使用依赖于ATP的线性DNA分解酶纯化质粒。
7.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，酶切后的基因片段与酶切后的质粒使用T4DNA连接酶进行连接。
8.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，使用氨苄青霉素进行抗性筛选。
9.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，将转化子抽提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性的转化子送样测序。
10.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，将获得的序列在NCBI网站上进行比对分析。
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| CN (1) | CN109266771A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101250578A (zh) * | 2008-03-24 | 2008-08-27 | 中南大学 | 一种培养筛选微生物菌种的方法 |
| CN102010895A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-04-13 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法 |
| CN107630082A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-26 | 广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所 | 一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌ncfm的方法 |
| CN108192954A (zh) * | 2017-05-04 | 2018-06-22 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种rad测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法 |
-
2018
- 2018-11-27 CN CN201811427912.1A patent/CN109266771A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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