CN107841570A - 一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法，设计特异性引物及探针，序列如SEQ ID NO.1‑6所示，并利用所述引物和探针建立双重实时荧光定量PCR方法。本发明所述方法在检测鉴定饲料中沙门菌和居泉沙雷菌方面具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，为进境饲料原料中沙门菌与居泉沙雷菌的快速高效鉴别检测提供了新的技术手段，对保障我国饲料卫生安全、有效防范外来致病菌具有重要理论意义和实际应用价值。

Description

一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种快速检测进境饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
沙门菌是沙门菌病的病原体，在分类上属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、革兰阴性肠道杆菌。沙门菌属现有肠道沙门菌（Salmonella enterica）和邦戈尔沙门菌（Salmonella bongori）2个种，肠道沙门菌可进一步分为六个亚种，超过2500个血清型。肠道沙门菌亚种广泛分布于环境以及所有恒温动物，而邦戈尔沙门菌仅感染冷血动物，特别是爬行类动物。沙门菌是一类危害人和动物健康的重要细胞内致病菌，其菌属型别繁多，抗原复杂，是引起食源性腹泻的主要病原菌之一，中毒现象全年都可发生且夏季为高发期。在我国由沙门菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位，细菌性食物中毒事件中超过50%都是由沙门菌引起的。欧美等国家细菌性食源性疾病的主要病原菌也是沙门菌。在世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物疫病诊断和疫苗手册》中，沙门菌病被列为动物及其产品国际贸易中有重要影响的疾病之一，同时，沙门菌也是我国进口动物源性饲料（鱼粉、肉粉、骨粉、肉骨粉、饲用血制品、配合饲料等）安全风险监控的高风险监控物质。居泉沙雷菌（Serratia fonticola）广泛分布于水、土壤、植物、人类以及动物的肠道和呼吸道中，是空气中的条件致病菌，能引起人的脓毒性关节炎，皮肤及组织损伤，腹泻、泌尿道感染、败血症和外科手术感染等，是引起医院内感染的重要条件致病菌。
目前，在出入境检验检疫部门所属实验室开展进境饲料尤其是动物源性饲料沙门菌检测工作时，主要采用国家标准GB/T13091-2002，进行常规的沙门菌分离鉴定，即根据沙门菌的生化特性和血清学特征进行检测，步骤包括非选择性增菌、选择性增菌、选择性平板分离培养、疑似沙门菌菌落的生化培养（三糖铁试验等）、全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定、血清学分型、结果判断。然而经选择性平板分离培养时常常出现非沙门菌的紫色或浅紫色疑似菌落，最终生化鉴定结果为居泉沙雷菌。目前，虽然已经有基于改善沙门菌检测中存在的上述问题的研究，即在现有沙门菌检测步骤的选择性增菌和选择性平板之间采用沙雷菌多克隆抗血清或多价抗血清的方法，抑制沙雷菌等细菌对沙门菌检测的干扰，但这些方法无法实现快速鉴别诊断沙门菌和居泉沙雷菌的目的。因此，如果能采用分子生物学的实时荧光PCR方法对这些疑似沙门菌的紫色或浅紫色菌落进行快速鉴别诊断，无疑可以大大减少因后续系列生化和血清学鉴定增加的额外时间，大幅度节省人力和物力，这对于提高进境饲料中沙门菌的检测工作效率并进而提高货物通关效率具有重要理论意义和实际应用价值，同时，也符合当前我国对提高进口货物通关速度的整体要求。
发明内容
目前依据《GB/T 13091-2002饲料中沙门氏菌的检测方法》对进口动物源性饲料（鱼粉和鸡肉粉）开展沙门菌检测的传统分离鉴定方法由于耗时且工作量大已经很能满足大量进境饲料的检疫工作。此外，传统分离鉴定方法并不能十分有效将同属肠杆菌科的居泉沙雷菌快速鉴别出来。本发明针对传统分离鉴定方法存在的不足开展研究，旨在提供一种高效、灵敏度高、特异性强的检测方法对进境饲料中沙门菌和居泉沙雷菌进行快速鉴别诊断。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速检测进境饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法，所述方法是以编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因和编码细菌Ⅱ型拓扑异构酶的gyrB基因为靶基因设计引物和Taqman水解探针对沙门菌和居泉沙雷菌的分子生物学特征进行识别；根据GenBank公布的基因序列设计的引物和水解探针分别为：
invA基因上游引物invA-F: 5'-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3'，
invA基因下游引物invA -R: 5'-GGCTGAGGAAGGTACTGCCA-3'，
invA基因水解探针invA -P: 5'-JOE-TGCTCGTAATCCGCCGCCATTGGCG-BHQ1-3'；
gyrB基因上游引物gyrB-F: 5'-TCGGTGAAACCGATCAGAC-3',
gyrB基因下游引物gyrB -R: 5'-GCCAGGATGTCGTACTCAAA-3'，
gyrB基因水解探针gyrB -P: 5'-6 FAM-CTGCGCTTCTGGCCGAGCTT-BHQ1-3'。
本发明的荧光定量PCR总反应体系为20μL，其中2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）(宝生物工程（大连）有限公司产）10μL、10μM invA基因上、下游引物各0.4μL和10μM 探针0.4μL、10μM gyrB基因上、下游引物各0.4μL和10μM 探针0.4μL、50×ROX Reference DyeⅡ (宝生物工程（大连）有限公司产）0.2μL、RNase Free ddH2O 5.4μL、沙门菌DNA和居泉沙雷菌DNA各1 μL。
本发明的PCR反应循环参数设置为：95℃ 30S，1个循环；95℃ 5S，64℃ 30S，读取荧光数据，39个循环；反应结束。
本发明与传统的分离鉴定的方法相比具有的优势：
本发明方法可以实现在一次PCR反应中达到同时鉴别沙门菌和居泉沙雷菌的目的，在对两种病原菌进行检测鉴定中具有高效、灵敏度高、特异性强等特点。本发明为我国进境饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的同时检测和鉴定提供高效的技术手段，对保障我国饲料生产安全和有效防范外来致病菌具重要理论意义和实际应用价值。
本发明具有如下有益效果：
1、特异性强：以编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因为靶基因设计的特异性引物和Taqman水解探针，在荧光定量PCR试验中仅可扩增出沙门菌，而包括居泉沙雷菌标准菌株、深红沙雷菌标准菌株、无花果沙雷菌标准菌株、普利茅斯沙雷菌标准菌株、黏质沙雷菌标准菌株、液化沙雷菌标准菌株、变形斑沙雷菌标准菌株、气味沙雷菌标准菌株、格氏沙雷菌标准菌株、大肠杆菌标准菌株、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株、宋氏志贺菌标准菌株、产酸克雷伯氏菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、产气肠杆菌标准菌株、肺炎克雷伯氏菌分离株等在内的16种非沙门菌和空白对照均没有扩增曲线，显示了invA基因引物和探针良好的特异性。以编码细菌Ⅱ型拓扑异构酶的gyrB基因为靶基因设计引物和Taqman水解探针，在荧光定量PCR试验中仅可扩增出居泉沙雷菌，而包括深红沙雷菌标准菌株、无花果沙雷菌标准菌株、普利茅斯沙雷菌标准菌株、黏质沙雷菌标准菌株、液化沙雷菌标准菌株、变形斑沙雷菌标准菌株、气味沙雷菌标准菌株、格氏沙雷菌标准菌株、鼠伤寒沙门菌标准菌株、肠炎沙门菌标准菌株、蒙得维的亚沙门菌分离株、韦太夫雷灯沙门菌分离株、鲁姆弗尔德沙门菌分离株、伯肯海德沙门菌分离株、鸭沙门菌分离株、山夫登堡沙门菌分离株、罗米他沙门菌分离株、圣保罗沙门菌分离株、大肠杆菌标准菌株、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株、宋氏志贺菌标准菌株、产酸克雷伯氏菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、产气肠杆菌标准菌株、肺炎克雷伯氏菌分离株等在内的25种非居泉沙雷菌和空白对照均不产生扩增曲线，显示了gyrB基因引物和探针良好的特异性。
2、灵敏度高：将invA基因和gyrB基因的扩增产物回收纯化后构建pUCm-invA重组质粒和pUCm-gyrB重组质粒，质粒标准品10倍梯度稀释后作为模板进行荧光定量PCR反应，对沙门菌和居泉沙雷菌的检测灵敏度分别为197拷贝数/μL和145拷贝数/μL。
3、重复性好：以五个不同稀释度的pUCm-invA和pUCm-gyrB重组质粒（108、107、106、105、104copies/μL）同时作为模板进行实时荧光定量PCR反应，每个稀释度做3组重复。所有反应结果的标准偏差不超过0.153，变异系数不超过0.73%（见表1）。因此，本发明建立的荧光定量PCR方法均具有良好的重现性。
表 1 双重实时荧光定量PCR重现性试验
备注：SD：标准偏差; MN：平均值; CV (变异系数) = (SD / MN) × 100%
4、结果可靠：针对检测沙门菌的荧光定量PCR方法，包括肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌在内的10种沙门菌血清型均能产生特异性的S型扩增曲线，而9种沙雷菌以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生S型扩增曲线。针对检测居泉沙雷菌的荧光定量PCR方法，仅居泉沙雷菌能产生特异性的S型扩增曲线，而其他8种沙雷菌、10个肠道沙门菌血清型以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生扩增曲线。因此可以充分保证结果的可靠性。
5、实用性好：根据细菌的生化特性和血清学的传统分离鉴定方法已不能满足目前大量的检测工作，传统检测方法由于步骤繁琐需进行多种处理才可得出最终结果，很容易产生假阳性的结果。本发明方法利用分子生物学特异性强、灵敏度高、结果可靠等特点弥补传统方法的不足以此达到快速准确鉴定病原菌的目的，很大程度的减少检测工作量提高检测效率。
附图说明
图1 为沙门菌荧光定量PCR引物最佳退火温度实验结果。其中，1～8的退火温度依次为65.0℃、64.5℃、63.3℃、61.4℃、59.0℃、57.0℃、55.7℃、55.0℃；NC为阴性对照。
图2 为居泉沙雷菌荧光定量PCR引物最佳退火温度实验结果。其中，1～8的退火温度依次为65.0℃、64.5℃、63.3℃、61.4℃、59.0℃、57.0℃、55.7℃、55.0℃；NC为阴性对照。
图3 为沙门菌荧光定量PCR引物特异性实验结果。其中，10条S型扩增曲线代表了10个肠道沙门菌血清型，分别为鼠伤寒沙门菌标准菌株、肠炎沙门菌标准菌株、蒙得维的亚沙门菌分离株、韦太夫雷灯沙门菌分离株、鲁姆弗尔德沙门菌分离株、伯肯海德沙门菌分离株、鸭沙门菌分离株、山夫登堡沙门菌分离株、罗米他沙门菌分离株、圣保罗沙门菌分离株；非沙门菌包括居泉沙雷菌标准菌株、深红沙雷菌标准菌株、无花果沙雷菌标准菌株、普利茅斯沙雷菌标准菌株、黏质沙雷菌标准菌株、液化沙雷菌标准菌株、变形斑沙雷菌标准菌株、气味沙雷菌标准菌株、格氏沙雷菌标准菌株、大肠杆菌标准菌株、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株、宋氏志贺菌标准菌株、产酸克雷伯氏菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、产气肠杆菌标准菌株、肺炎克雷伯氏菌分离株。
图4为居泉沙雷菌荧光定量PCR引物特异性实验结果。非居泉沙雷菌包括深红沙雷菌标准菌株、无花果沙雷菌标准菌株、普利茅斯沙雷菌标准菌株、黏质沙雷菌标准菌株、液化沙雷菌标准菌株、变形斑沙雷菌标准菌株、气味沙雷菌标准菌株、格氏沙雷菌标准菌株、鼠伤寒沙门菌标准菌株、肠炎沙门菌标准菌株、蒙得维的亚沙门菌分离株、韦太夫雷灯沙门菌分离株、鲁姆弗尔德沙门菌分离株、伯肯海德沙门菌分离株、鸭沙门菌分离株、山夫登堡沙门菌分离株、罗米他沙门菌分离株、圣保罗沙门菌分离株、大肠杆菌标准菌株、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株、宋氏志贺菌标准菌株、产酸克雷伯氏菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、产气肠杆菌标准菌株、肺炎克雷伯氏菌分离株等肠道菌。
图5 为沙门菌荧光定量PCR灵敏度实验结果，pUCm-invA质粒标准品浓度从左往右依次为：1. 97×1010 copies/μL、1. 97×109 copies/μL、1. 97×108 copies/μL、1. 97×107 copies/μL、1. 97×106 copies/μL、1. 97×105 copies/μL、1. 97×104 copies/μL、1. 97×103 copies/μL、1. 97×102 copies/μL。图6 为居泉沙雷菌荧光定量PCR灵敏度实验结果，pUCm-gyrB质粒标准品浓度从左往右依次为：1.45×1010 copies/μL、1.45×109copies/μL、1.45×108 copies/μL、1.45×107 copies/μL、1.45×106 copies/μL、1.45×105 copies/μL、1.45×104 copies/μL、1.45×103 copies/μL、1.45×102 copies/μL。
图7为双重荧光定量PCR稳定性实验结果。其中扩增曲线1～5表示5个不同浓度的pUCm-gyrB质粒标准品，其拷贝数依次为1.45×1010 copies/μL、1.45×109 copies/μL、1.45×108 copies/μL、1.45×107 copies/μL、1.45×106 copies/μL；扩增曲线6～10表示5个不同浓度的pUCm-invA质粒标准品，其拷贝数依次为1. 97×1010 copies/μL、1. 97×109copies/μL、1. 97×108 copies/μL、1. 97×107 copies/μL、1. 97×106 copies/μL。
具体实施方式
实施例1：荧光定量PCR引物最佳退火温度筛选
1.1材料的准备
供试菌株如下：鼠伤寒沙门菌标准菌株、肠炎沙门菌标准菌株、蒙得维的亚沙门菌分离株、韦太夫雷灯沙门菌分离株、鲁姆弗尔德沙门菌分离株、伯肯海德沙门菌分离株、鸭沙门菌分离株、山夫登堡沙门菌分离株、罗米他沙门菌分离株、圣保罗沙门菌分离株、居泉沙雷菌标准菌株、深红沙雷菌标准菌株、无花果沙雷菌标准菌株、普利茅斯沙雷菌标准菌株、黏质沙雷菌标准菌株、液化沙雷菌标准菌株、变形斑沙雷菌标准菌株、气味沙雷菌标准菌株、格氏沙雷菌标准菌株、大肠杆菌标准菌株、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株、宋氏志贺菌标准菌株、产酸克雷伯氏菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、产气肠杆菌标准菌株、肺炎克雷伯氏菌分离株。
以上所用标准菌株来自国内外权威微生物菌种保藏中心，包括美国ATCC、中国海洋微生物菌种保藏管理中心、中国工业微生物菌种保藏管理中心、广东省微生物菌种保藏中心；临床分离株来自福建省检验检疫技术研究重点实验室和国家质检总局动物源性饲料（鱼粉）检测检疫重点实验室（福州）。
1.2荧光定量PCR方法
1.2.1引物和水解探针的设计及合成：基于沙门菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因和居泉沙雷菌编码细菌Ⅱ型拓扑异构酶的gyrB基因序列，通过大量比对及筛选获得高度保守且特异性强的序列用于特异性引物的设计并在靶序列内选择合适的探针序列，经NCBI Blast比对验证引物和探针的特异性，所设计的引物和探针由上海生工生物技术服务有限公司合成。所设计的引物和探针序列如下，并针对所设计的引物设置不同温度梯度摸索其最佳退火温度。
invA基因上游引物invA-F: 5'-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3'，
invA基因下游引物invA -R: 5'-GGCTGAGGAAGGTACTGCCA-3'，
invA基因水解探针invA -P: 5'-JOE-TGCTCGTAATCCGCCGCCATTGGCG-BHQ1-3'，
扩增片段大小为199bp；
gyrB基因上游引物gyrB-F: 5'-TCGGTGAAACCGATCAGAC-3',
gyrB基因下游引物gyrB -R: 5'-GCCAGGATGTCGTACTCAAA-3'，
gyrB基因水解探针gyrB -P: 5'-6 FAM-CTGCGCTTCTGGCCGAGCTT-BHQ1-3'，
扩增片段大小为94 bp。
1.2.2基因组DNA提取
试剂盒提取法：按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明书操作提取DNA。将所提取的细菌DNA保存在RNase Free ddH2O中，用超微量核苷酸测定仪测定DNA浓度和质量（DNA 质量介于 1.7–1.9，浓度大于 20ng/μL可用于PCR反应），-20℃保存备用。
1.2.3荧光定量PCR扩增反应体系：总反应体系为20μL，包括：2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）(宝生物工程（大连）有限公司产，下同）10μL、10μM 上、下游引物各0.4μL和10μM 探针0.4μL、RNase Free ddH2O 7.8μL、DNA模板1μL。
1.2.4荧光定量PCR反应循环设置为：两步法扩增，95℃ 30S，1个循环；95℃ 5S，应用梯度PCR仪设置8个退火温度55.0℃～65℃，30S；39个循环，反应结束。此反应条件基于Applied Biosystems贸易有限公司产的Ⅶ A7 荧光PCR仪优化。
1.2.5荧光定量PCR扩增曲线分析：反应结束后由扩增曲线可知退火温度为64.5℃时invA基因扩增产物荧光强度最高(见图1)；同样地，退火温度为64.5℃时gyrB基因扩增产物荧光强度最高(见图2)。因此选择64℃作为后续实验的退火温度。
实施例2：沙门菌和居泉沙雷菌荧光定量PCR引物特异性实验
2.1材料准备
采用实施例1中1.2.2所提取的供试菌株DNA作为荧光定量PCR反应的模板。
2.2 荧光定量PCR方法
2.2.1荧光定量PCR扩增反应体系：总反应体系为20μL，包括：2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL、10μM 上、下游引物各0.4μL和10μM 探针0.4μL、50×ROX ReferenceDye Ⅱ(宝生物工程（大连）有限公司产，下同）0.2μL、RNase Free ddH2O 7.6μL、模板DNA１μL。
2.2.2、荧光定量PCR反应循环设置为：两步法扩增，95℃ 30S，1个循环；95℃ 5S，64℃ 30S；39个循环，反应结束。此反应条件基于Applied Biosystems贸易有限公司产的ⅦA7 荧光PCR仪优化。
2.2.3荧光定量PCR扩增曲线分析：针对检测沙门菌的荧光定量PCR方法，包括肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌在内的10种沙门菌均能产生特异性的S型扩增曲线，而9种沙雷菌以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生S型扩增曲线(见图3)。针对检测居泉沙雷菌的荧光定量PCR方法，仅居泉沙雷菌能产生特异性的S型扩增曲线，而其他8种沙雷菌、10种沙门菌以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生扩增曲线(见图4)。
实施例3：荧光定量PCR检测灵敏度实验
3.1质粒构建
3.1.1采用实施例1中1.2.1设计合成的引物，以实施例1中1.2.2所提取的肠炎沙门菌和居泉沙雷菌DNA作为PCR反应模板。
3.1.2 PCR扩增反应体系：总体积为25μL，2×GoTaq Green Master Mix （普洛麦格生物技术有限公司产）12.5μL，实施例1中10μM 上、下游引物各0.4μL，灭菌ddH2O 10.7μL，DNA模板 1μL。
3.1.2 PCR反应循环设置：95℃预变性2 min；95℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。
3.1.3PCR产物纯化：采用天根生化科技(北京)有限公司的TIANgel MiniPurification Kit对invA基因和gyrB基因特异性引物的扩增产物进行纯化回收。
3.1.4连接：取4.5μL3.1.3中纯化回收产物加入0.5μL pUCm-T 载体，冰浴条件下加入等量（5μL）Solution I连接液，瞬时离心后，于连接仪中22℃连接2小时，以构建pUCm-invA和pUCm-gyrB重组质粒。
3.1.5转化：取100μLDH5α感受态细胞加入3.1.4所述连接产物进行培养，将培养液接种于含有氨苄青霉素平板（用IPTG和X-gal处理过），平板倒置放入37℃ 恒温培养箱中培养8h。
3.1.6蓝白斑筛选：重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，用一次性接种棒挑取白色菌落至含氨苄青霉素的LB肉汤，置于37℃ 恒温培养箱中培养8h。
3.1.7pUCm-invA和pUCm-gyrB重组质粒提取：取3.1.6所述过夜培养的菌液，采用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒提取pUCm-invA和pUCm-gyrB重组质粒。
3.1.8荧光定量PCR模板制备：将pUCm-invA重组质粒和pUCm-gyrB重组质粒按10倍梯度分别稀释成终浓度为：1.97×1010、1. 97×109、1. 97×108、1. 97×107、1. 97×106、1. 97×105、1. 97×104、1. 97×103、1. 97×102、1. 97×101拷贝数/μL和1.45×1010、1.45×109、1.45×108、1.45×107、1.45×106、1.45×105、1.45×104、1.45×103、1.45×102、1.45×101拷贝数/μL的标准品作为模板进行荧光定量PCR并分析其敏感性。
3.2 荧光定量PCR方法
3.2.1荧光定量PCR扩增反应体系：总反应体系为20μL，包括：2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL、10μM 上、下游引物各0.4μL和10μM探针0.4μL、50×ROX Reference DyeⅡ0.2μL、RNase Free ddH2O 7.6μL、3.1.8质粒DNA模板１μL。
3.2.2、荧光定量PCR反应循环设置为：两步法扩增，95℃ 30S，1个循环；95℃ 5S，64℃ 30S，读取荧光数据，39个循环；反应结束。
3.2.3荧光定量PCR扩增曲线分析：针对检测沙门菌的荧光定量PCR扩增曲线(见图5)，质粒标准品浓度在1.97×102copies/μL仍可见扩增曲线，由此表明检测沙门菌的灵敏度为1.97×102copies/μL；针对检测居泉沙雷菌的荧光定量PCR扩增曲线(见图6)，质粒标准品浓度在1.45×102copies/μL仍可见扩增曲线，由此表明检测居泉沙雷菌的灵敏度为1.45×102copies/μL。
实施例4：双重荧光定量PCR稳定性实验
4.1材料准备
采用10倍梯度系列稀释法将实施例3中3.1.8所提取的pUCm-invA重组质粒和pUCm-gyrB重组质粒分别稀释成1.97×1010 copies/μL、1. 97×109、1. 97×108、1. 97×107、1.97×106和1.45×1010、1.45×109、1.45×108、1.45×107、1.45×106copies/μL各5个不同浓度梯度。将5个不同浓度的质粒标准品同时作为反应模板进行荧光定量PCR灵敏度试验。
4.2荧光定量PCR方法
4.2.1荧光定量PCR扩增反应体系：总反应体系为20μL，包括：2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL、invA基因 10μM正、反向引物各0.4μL和10μM探针0.4μL、gyrB基因10μM正、反向引物各0.4μL和10μM 探针0.4μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ0.2μL、RNase FreeddH2O 5.4μL、实施例3中3.1.8所述所述pUCm-invA重组质粒和pUCm-gyrB重组质粒各１μL。
4.2.2荧光定量PCR反应循环设置为：两步法扩增，95℃ 30S,1个循环;95℃ 5S,64℃ 30S，读取荧光数据;39个循环，反应结束。
4.2.3荧光定量PCR扩增曲线分析：将pUCm-invA重组质粒和pUCm-gyrB重组质粒作为模板同时加入反应体系进行荧光定量PCR。扩增曲线见图7，其中序号1～5代表5个不同浓度的pUCm-gyrB重组质粒标准品的扩增曲线，序号6～10代表5个不同浓度的pUCm-invA重组质粒标准品的扩增曲线。由此可见，在一个PCR反应体系里对沙门菌和居泉沙雷菌进行同时检测并不会出现交叉现象。
以上所述为本发明优化后较为理想的反应设置，凡是依照本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaagcgc tcgcattgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggctgaggaa ggtactgcca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctcgtaat ccgccgccat tggcg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcggtgaaac cgatcagac 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccaggatgt cgtactcaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgcgcttct ggccgagctt 20

Claims (3)

1.一种同时检测沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：invA基因上游引物为invA -F: 5'-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3'，下游引物为invA-R: 5'-GGCTGAGGAAGGTACTGCCA-3'，Taqman水解探针为invA-P: 5'-JOE-TGCTCGTAATCCGCCGCCATTGGCG-BHQ1-3'；gyrB基因上游引物为gyrB-F: 5'-TCGGTGAAACCGATCAGAC-3'，下游引物为gyrB-R: 5'-GCCAGGATGTCGTACTCAAA-3'，Taqman水解探针为gyrB-P: 5'-6 FAM-CTGCGCTTCTGGCCGAGCTT-BHQ1-3'。
2.一种检测饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物和水解探针进行荧光定量PCR反应，荧光定量PCR总反应体系为20μL，包括：Premix Ex TaqTM 2×10μL、10μM invA基因上、下游引物各0.4μL和10μM探针0.4μL、10μM gyrB基因上、下游引物各0.4μL和10μM探针0.4μL、ROX Reference Dye Ⅱ50× 0.2μL、RNase Free ddH2O 5.4μL、沙门菌DNA和居泉沙雷菌DNA各1μL。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测进境饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的双重实时荧光定量PCR方法，其特征在于：荧光定量PCR采用两步法进行扩增：95℃ 30S，1个循环；95℃5S，64℃ 30S，读取荧光数据，39个循环，反应结束。
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