CN101760531A - TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它：一，TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；二，门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A，三，Real-time PCR反应体系的建立；四，对粪便样品进行处理，五，对核酸进行；六，进行DNA灵敏性分析；七，特异性分析；八，多重Real-time PCR方法的建立；九，进行PCR结果判断；十，引物浓度选择：十一，特异性分析；十二，进行灵敏性分析；十三，进行多重荧光PCR。
Description
技术领域
本发明涉及一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法
背景技术
沙门菌和副溶血性弧菌是常见的重要食源性致病菌，通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒危害人体健康。针对这2种致病菌的检验，GB/T4789标准和ws行业标准都需要3～5天时间，远远不能食物中毒应急检测的需要。本研究旨在建立一种快速、准确、特异、灵敏、经济的沙门菌和副溶血性弧菌双重荧光PCR检测方法，以应用于食物中毒的快速检验，有效地解决传统分离鉴定法中存在的费时、费力等问题及其他快速检测方法中存在的试剂成本高的问题
发明内容
本发明提供了一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它简便、快速、成本低，能适应沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测。
本发明采用了以下技术方案：一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它包括以下步骤：一，TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；首先选择实验菌种，菌株：沙门菌21株，副溶血性弧菌26株，大肠杆菌3株，李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，创伤弧菌、志贺氏菌、变形杆菌和假单胞菌各1株、溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌各1株，共58株标准菌株和参考菌株；二，门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A(invA)，根据Genbank公布的invA序列20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成，副溶血性弧菌荧光PCR的引物设计选取副溶血TLH(invA)。根据Genbank公布的TLH序列各个国家各个时期20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成。引物使用前12000rpm离心1分钟后，小心打开盖子，使用DEPC处理的蒸馏水进行稀释，稀释浓度为20Pmol毫升。稀释后涡旋1分钟，3000转离心30s后，-20℃储存备用，
三，Real-time PCR反应体系的建立
PCR反应体系采用大连宝生物公司的荧光PCR检测试剂盒，由于试剂盒中的MgCl2浓度和荧光信号检测温度都以做过优化，本研究将不做优化，引物浓度的优化采用矩阵法，引物体积优化范围在0.3-1.0μl，探针的优化范围也在0.3-1.0μl。体系将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可放入-20℃冰箱中保存，配制PCR反应液，PCR反应条件：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。
四，对粪便样品进行处理，
五，对核酸进行；
六，进行DNA灵敏性分析，DNA灵敏度分析：按常规DNA提取方法提取模板DNA。用Bio-rad紫外可见光蛋白核酸分析仪测DNA的浓度。然后进行10倍稀释，每个稀释度取2ul用于实时PCR反应，根据检测的最低值检测出最低DNA浓度；
七，特异性分析：将各种沙门氏菌属菌株和非沙门氏菌属菌株用TSB增菌液过夜增菌，取1mL增菌液提取DNA，取2μl作为模板，用建立的荧光PCR方法进行检测，以是否出现Ct值为判断阳性或阴性的标准。副溶血型弧菌特异性检测方法同沙门菌一致。PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)。
八，多重Real-time PCR方法的建立：使用矩阵法优化得出最佳引物浓度进行双重荧光PCR方法的建立，将副溶血弧菌和沙门菌引物和探针放入一个管子中进行扩增，对反应结果反应体积为25μl，。反应程序为：95℃3min变性后，以94℃15s、58℃45s进行45个循环。于58℃检测FAM、VIC通道的荧光信号。
九，进行PCR结果判断：1，Ct≤37的样品，按照参比曲线计算浓度报告；2，37≤Ct＜40的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，故建议重复测定一次结果仍在此范围则定为阴性，反之按照参比曲线计算浓度报告；3，.当Ct＝40或Ct＝0时，报告为阴性；
十，引物浓度选择：对副溶血性弧菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是22.67，最高为24.65，相差1.92.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.4μl；对沙门菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是17.26，最高为18.34，相差1.08.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.5μl。
十一，特异性分析对所有的沙门菌和副溶血性弧菌都分别用优化后的反应条件对本实验室保存的21株沙门菌、1株枸缘酸杆菌、2株产LT和ST的ETEC、2株产LT的ETEC、4株不产毒ETEC、3株EIEC、2株EIEC血清型大肠埃希菌、3株福氏2a志贺菌、11株福氏4a志贺菌、1株福氏1b志贺菌、7株福氏2b志贺菌、12株福氏4c志贺菌、6株宋内氏志贺菌，进行了Real-time PCR检测，阳性和阴性符合率为100％；十二，进行灵敏性分析；十三，进行多重荧光PCR；本发明步骤三中配制PCR反应液：Premix Ex Tag(2×)为12μl，DNA模板为2.0μl，上游引物为优化体积，下游引物为优化体积探针溶液，优化体积为dH2O，8.5，Total为25μl。本发明步骤四中方法包括直接煮沸法、Chelex树脂吸附提取法处理和直接提取核酸法。
本发明具有以下有益效果：本发明针对沙门氏菌属特异基因invA基因和副溶血性弧菌属特异型基因TLH基因设计引物和探针，探针发光集团分别采用FAM和HEX标记，淬灭集团采用ECLIPSE进行标记。采用矩阵法确定了最佳引物和探针浓度。用建立的双重荧光PCR方法对58株目标菌和非目标菌进行扩增，没有假阴性和假阳性出现。方法灵敏度达到56-65fg/PCR体系或9-11CFU/mL。两种目标菌阳性核酸同时进行扩增互不干扰，表现了良好的均一性，扩增效率达95％以上。本研究还对四种常用的核酸提取方法进行比较，确定Chelex树脂提取法最为适合。此方法建立后，每个PCR反应成本在10元左右。该技术简便、快速、成本低，能适应沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测。
附图说明
图1为副溶血性弧菌的引物和探针进行矩阵分析的示意图
图2为对沙门菌的引物和探针进行矩阵分析的示意图
图3为菌株检测曲线图
图4为副溶血性弧菌曲线图
图5为灵敏性分析的曲线图
具体实施方式
(一)、TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立
1试验菌种
菌株：沙门菌21株，副溶血性弧菌26株，大肠杆菌3株，李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，创伤弧菌、志贺氏菌、变形杆菌和假单胞菌各1株、溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌各1株，共58株标准菌株和参考菌株。
2仪式和试剂
ABI 7000荧光PCR仪 美国应用技术公司
高速低温离心机 德国贺立式公司
金属浴 杭州博日
DNA提取试剂盒 美国Axygen公司
dNTP引物和FAM-VIC探针 大连宝生物公司合成
PCR反应试剂 大连宝生物公司(货号：DRR024A)
生物安全柜 上海力康公司
PCR反应八连管 美国Axygen公司
枪头1.5毫升离心管 美国Axygen公司
3实验方法
3.1引物和探针的设计和合成
沙门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A(invA)。根据Genbank公布的invA序列20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成。
副溶血性弧菌荧光PCR的引物设计选取副溶血TLH(invA)。根据Genbank公布的TLH序列各个国家各个时期20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成。引物使用前12000rpm离心1分钟后，小心打开盖子，使用DEPC处理的蒸馏水进行稀释，稀释浓度为20Pmol毫升。稀释后涡旋1分钟，3000转离心30s后，-20℃储存备用。
3.2Real-time PCR反应体系的建立
PCR反应体系采用大连宝生物公司(货号：DRR024A)的荧光PCR检测试剂盒。由于试剂盒中的MgCl2浓度和荧光信号检测温度都以做过优化，本研究将不做优化。引物浓度的优化采用矩阵法。引物体积优化范围在0.3-1.0μl，探针的优化范围也在0.3-1.0μl。体系将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可放入-20℃冰箱中保存。按下列组成配制PCR反应液：
PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)。
3.3DNA模板的制备本实验对四种处理粪便样品的方法进行了比较：直接煮沸法、直接提取核酸法(采用Axygen公司试剂盒和罗氏核酸提取试剂盒)和Celex树脂吸附提取的方法，罗。
3.3.1直接煮沸法：取增菌液1mL，放置于1.5离心管中，振荡均匀，13000rpm离心2分钟。去尽上清，沉淀中直接加入100μl DEPC处理过的去离子水，充分混合均匀，沸水浴10分钟。13000rpm离心5分钟，取上清2μl进行PCR反应。
3.3.2和Chelex树脂吸附提取法处理同3.3.1，知识去离子水换成1％的Chelex树脂溶液。
3.3.3直接提取核酸法
取增菌液1mL，放置于1.5离心管中，振荡均匀，12000g离心30s，弃尽上清。
用150μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀。
加入20μl溶菌酶储存液，混合均匀，室温静置5min。
加入30μl 0.25M EDTA，冰浴5min.
加入450μl Buffer G-A，斡旋振荡15s，65℃水浴10min.
加入400μl Buffer G-B和1mL Buffer DV，用力混合，12000g离心2min.尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1mL浴冷Buffer DV，用力混合，12000g离心2min.
丢弃上相，将下相转移至滤器。12000g离心1min.
弃滤器，在滤液中加入400μl Buffer DV，，混合均匀。
将制备管置于2mL离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12000g离心1min.
弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入500μl Buffer W1，12000g离心1min.
弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μl Buffer W2，12000g离心1min.
以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，，12000g离心1min.
将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加100ul去离子水，静置1min。12000g离心1min洗脱DNA.
3.3.4核酸提取过程：
加入200ul样本，加入200ul工作液(现配)，加入50ul蛋白激K酶溶液，
彻底混合，72度孵育10分钟。
加入100ul结合缓冲液(瓶1)，然后混合。
将混合液转到柱子中，8000×g离心一分钟。
弃去有液体的套管，加入新的套管，加入500ul抑制因子去除缓冲液(4a)，8000×g离心一分钟。
加入450ul洗脱缓冲液(瓶4)，8000×g离心一分钟。
再加入450ul洗脱缓冲液(瓶4)，8000×g离心一分钟。
130000×g离心10秒。
套上1.5ml离心管，加入50ul溶解缓冲液(瓶5)，8000×g离心一分钟，收集核酸，零下70度保存。
4灵敏性分析
取培养好的沙门菌标准菌株(CMCC50115)和副溶血性弧菌(ATCC17802)纯菌液，用TSB液体培养基调整菌液浓度至0.5McFarland。以此浓度菌液为母液，继续用TSB按10倍比例依次稀释直至菌液浓度为母液的10-8。取10-5、10-6稀释物100μL做营养琼脂表面接种，每个梯度接种两块平板，37℃培养过夜后计数。母液浓度可通过下面的公式计算得出。C＝M×B/VC：母液浓度(cfu/mL)；M：相同稀释度的所有平板克隆形成单位的平均数(cfu)；B：相应稀释倍数；V：用于铺板的菌液体积(mL)。同时将10-5、10-6稀释物取100μL提取DNA模板分别进行荧光PCR检测，根据检测的最低值和对应的涂布试验中的细菌量，推算出方法的灵敏度。
DNA灵敏度分析：按常规DNA提取方法提取模板DNA。用Bio-rad紫外可见光蛋白核酸分析仪测DNA的浓度。然后进行10倍稀释，每个稀释度取2ul用于实时PCR反应。根据检测的最低值检测出最低DNA浓度。
5特异性分析
将各种沙门氏菌属菌株和非沙门氏菌属菌株用TSB增菌液过夜增菌，取1mL增菌液提取DNA，取2μl作为模板，用建立的荧光PCR方法进行检测，以是否出现Ct值为判断阳性或阴性的标准。副溶血型弧菌特异性检测方法同沙门菌一致。PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)。
6多重Real-time PCR方法的建立：使用矩阵法优化得出最佳引物浓度进行双重荧光PCR方法的建立，将副溶血弧菌和沙门菌引物和探针放入一个管子中进行扩增，对反应结果反应体积为25μl，。反应程序为：95℃3min变性后，以94℃15s、58℃45s进行45个循环。于58℃检测FAM、VIC通道的荧光信号。
7仪器使用和结果判断
7.1ABI7000型荧光PCR检测仪使用：
1)在File菜单中选择save，将出现save对话框，指定保存文件的名字，单击save保存文件。
2)使用ABI7000荧光PCR检测仪进行结果分析时，基线取3-10或3-15个循环的荧光信号；阈值设定原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝50为准(其它仪器基线和阈值设定根据仪器可作相应调整)。
3)在Setup页面选中不同浓度标准品对应的孔，双击图标，出现对话框，标注标准值，然后选中所有标准品检测孔，在Analysis菜单中选取Analyze，软件将对实验结果进行分析，在Results页面点击Standard Curve即可得出标准曲线及相关信息。
4)在Setup页面选中所有样品检测孔，在Analysis菜单中选取Analyze，在Results页面点击Report即可得出待测样品的起始模板数(M)。根据此数可推算每克待测样品中RNA的拷贝数。
7.2PCR结果判断：
①.Ct≤37的样品，按照参比曲线计算浓度报告；
②.37≤Ct＜40的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，故建议重复测定一次结果仍在此范围则定为阴性，反之按照参比曲线计算浓度报告；
③.当Ct＝40或Ct＝0时，报告为阴性。
8结果和分析
8.1引物浓度选择
在图1中，对副溶血性弧菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是22.67，最高为24.65，相差1.92.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.4μl(图1)。
在图2中，对沙门菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是17.26，最高为18.34，相差1.08.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.5μl(图2)。
8.2特异性分析
在图3和图4中，对所有的沙门菌和副溶血性弧菌都分别用优化后的反应条件对本实验室保存的21株沙门菌、1株枸缘酸杆菌、2株产LT和ST的ETEC、2株产LT的ETEC、4株不产毒ETEC、3株EIEC、2株EIEC血清型大肠埃希菌、3株福氏2a志贺菌、11株福氏4a志贺菌、1株福氏1b志贺菌、7株福氏2b志贺菌、12株福氏4c志贺菌、6株宋内氏志贺菌，进行了Real-time PCR检测，阳性和阴性符合率为100％。部分菌株检测曲线见图3。
8.3灵敏性分析
在图5中，DNA：灵敏度的结果见表：
| 沙门菌 | 56ng | 5.6ng | 560pg | 56pg | 5.6pg | 560fg | 56fg | 5.6pg |
| CT值 | 20.6 | 23.5 | 26.8 | 29.2 | 31.1 | 33 | 36 | NA |
| 副溶血性弧菌 | 65ng | 6.5ng | 65pg | 650pg | 6.5pg | 650fg | 65fg | 6.5pg |
| 沙门菌 | 56ng | 5.6ng | 560pg | 56pg | 5.6pg | 560fg | 56fg | 5.6pg |
| CT值 | 18.3 | 21.5 | 24.5 | 27.2 | 30 | 33.1 | 36.2 |
菌落灵敏度分析结果见表
| 沙门菌CFU/mL | 9×107 | 9×106 | 9×105 | 9×104 | 9×103 | 9×102 | 9×101 | 9 |
| CT值 | 15.2 | 18.1 | 21.7 | 24.5 | 27.9 | 30 | 33 | 36.2 |
| 副溶血性弧菌CFU/mL | 11×107 | 11×106 | 11×105 | 11×104 | 11×103 | 11×102 | 11×101 | 11 |
| CT值 | 17.3 | 20.5 | 23.5 | 26.2 | 29 | 32.1 | 35.2 | 37 |
6多重荧光PCR方法的建立
本研究表明，通过调整dNTPs和Mg+2浓度，优化多重Real-time PCR反应条件，多重和单重Real-time PCR Ct值差别较小。invA、TLH在单一Real-time PCR中的3个重复反应平均Ct值分别为23.47、22.56，而在同等条件的多重PCR中平均Ct值分别为23.67、22.43。双重和单重Real-time PCR扩增效率差别较小。反应效率为10-M 1，1/M＝3.322时，反应效率最高为1。
| TLH：s1：-3.383.r2：0.997492，intercept：41.10 | 多重：s1：-3.52.r2：0.9910，intercept：43.31 |
| Inv：s1：-3.149.r2：0.995734，intercept：35.10 | 多重：s1：-3.218.r2：0.997494，intercept：35.21 |
| 沙门菌稀释度 | 10-7 | 10-6 | 10-5 | 10-4 | 10-3 | 10-2 | 原液 |
| 单项荧光PCRct值 | 35.38 | 32.35 | 28.53 | 25.07 | 22.2 | 19.21 | 16.85 |
| 沙门菌稀释度 | 10-7 | 10-6 | 10-5 | 10-4 | 10-3 | 10-2 | 原液 |
| 双重ct值 | 35.91 | 32.43 | 29.21 | 25.38 | 22.73 | 19.28 | 16.80 |
| 沙门菌稀释度 | 10-7 | 10-6 | 10-5 | 10-4 | 10-3 | 10-2 | 原液 |
| 单项荧光PCRct值 | - | 36.51 | 33.26 | 30.22 | 26.83 | 23.95 | 20.49 |
| 双重ct值 | - | 36.54 | 32.88 | 30.31 | 27.59 | 24.00 | 21.45 |
7，DNA模板制备的区别：
四种提取方法都能提取出DNA，沙门菌提取效率为爱思进＞罗氏＞chelex＞蒸馏水，最高和最低ct值差1.52，副溶血性提取效率为罗氏＞chelex＞蒸馏水＞爱思进，最高和最低差2.2.均以性比较爱思进最为稳定。但成品试剂盒提取时间比较长，考虑到成本和使用的便捷性，本课题使用的chelex100进行DNA提取。
(二)双重荧光PCR的应用
1双重荧光PCR在食物中毒中的应用
在课题实施期间，共对发生的4起食物中毒中采集的45份肛拭荧光双重荧光PCR技术进行检测。肛拭采集后分别用碱性蛋白胨水、SF、GN三种增菌液进行增菌，增菌后在用国家标准方法进行培养的同时，对碱性蛋白胨水、SF增菌液使用chelex树脂进行DNA提取，然后应用双重荧光PCR检测沙门菌和副溶血性弧菌。SF增菌液同时应用vadas免疫荧光技术进行沙门菌定性检测。
2.荧光PCR检测沙门菌在从业人员体检中的应用
肛拭子：来自集中式食品从业人员，共2000份，放入SF增菌液中，37℃培养过夜。每份增菌液轻微震荡后吸取100微升到1.5ml离心管中，每十分样品合成一份PCR增加液，应用chelex树脂进行DNA提取，然后应用荧光PCR检测沙门菌。
3双重荧光PCR在食品检测中的应用
沙门菌食物采集了鸡肉20份，沙门菌检测样品监测样品20份。增菌：样品25g+225mL缓冲蛋白胨水，37℃培养6-8h或过夜，取10mL接种100mL的TTB，37℃培养18-24h。选择性培养：增菌液接种DHL、SS 2种选择性平板，37℃培养24h。鉴定：在选择性平板上挑疑似菌落做生化和血清鉴定。在进行传统培养的同时使用荧光PCR进行沙门菌检测。
副溶血性弧菌检测采样海中各种贝类20份，甲鱼背部涂抹物10份，淡水中水产品10，增菌：样品25g(ml)+225m碱性胨水，37℃增菌培养8-16h；
分离：增菌液接种TCBS平板，置37℃培养24h；在TCBS培养基上典型的副溶血性弧菌菌落为圆形、湿润、带黏性，呈篮绿色，直径2～3mm。
鉴定：挑取可疑菌落进行三糖铁和生化鉴定。在进行传统培养的同时使用荧光PCR进行副溶血性弧菌检测。
3结果与分析
3.1四起食物中毒被正式为一起由沙门菌，其余由副溶血性弧菌。沙门菌食物中毒中，12份肛拭荧光PCR均为阳性，11份vadas阳性，10份肛拭中经传统方法检测被正式为沙门菌感染。3起副溶血性弧菌引起食物中毒中，33份肛拭中，有21份经荧光PCR检测副溶血性弧菌阳性，有15份样品经传统方法检测被正式为副溶血性弧菌感染。
3.22000份食品从业人员的肛拭子用荧光PCR方法均有11份样品阳性，最后分离出沙门菌8株。
3.1食品污染调查情况
沙门菌食品的检测：40份样品经TaqMan-MGB方法检出3份沙门氏菌阳性，经国标方法检出2份。副溶血性弧菌：19份海中贝类海产品经荧光PCR检测阳性，甲鱼背部涂抹物10份，淡水中水产品10没有副溶血性弧菌检测。经国标方法检出16份在中贝类海产品。
(三)、结论：
本研究针对沙门氏菌属特异基因invA基因和副溶血性弧菌属特异型基因TLH基因设计引物和探针，探针发光集团分别采用FAM和HEX标记，淬灭集团采用ECLIPSE进行标记。采用矩阵法确定了最佳引物和探针浓度。用建立的双重荧光PCR方法对58株目标菌和非目标菌进行扩增，没有假阴性和假阳性出现。方法灵敏度达到56-65fg/PCR体系或9-11CFU/mL。两种目标菌阳性核酸同时进行扩增互不干扰，表现了良好的均一性，扩增效率达95％以上。本研究还对四种常用的核酸提取方法进行比较，确定Chelex树脂提取法最为适合。此方法建立后，每个PCR反应成本在10元左右。该技术简便、快速、成本低，能适应沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测。
Claims (3)
1.一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它包括以下步骤：
一、TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；
首先选择实验菌种，菌株：沙门菌21株，副溶血性弧菌26株，大肠杆菌3株，李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，创伤弧菌、志贺氏菌、变形杆菌和假单胞菌各1株、溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌各1株，共58株标准菌株和参考菌株；
二、门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A(invA)，根据Genbank公布的invA序列20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成，副溶血性弧菌荧光PCR的引物设计选取副溶血TLH(invA)；根据Genbank公布的TLH序列各个国家各个时期20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成；引物使用前12000rpm离心1分钟后，小心打开盖子，使用DEPC处理的蒸馏水进行稀释，稀释浓度为20Pmol毫升；稀释后涡旋1分钟，3000转离心30s后，-20℃储存备用，
三、Real-time PCR反应体系的建立
PCR反应体系采用大连宝生物公司的荧光PCR检测试剂盒，由于试剂盒中的MgCl2浓度和荧光信号检测温度都以做过优化，本研究将不做优化，引物浓度的优化采用矩阵法，引物体积优化范围在0.3-1.0μl，探针的优化范围也在0.3-1.0μl；体系将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可放入-20℃冰箱中保存，配制PCR反应液，PCR反应条件：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。
四，对粪便样品进行处理，
五，对核酸进行；
六，进行DNA灵敏性分析，DNA灵敏度分析：按常规DNA提取方法提取模板DNA；用Bio-rad紫外可见光蛋白核酸分析仪测DNA的浓度。然后进行10倍稀释，每个稀释度取2ul用于实时PCR反应，根据检测的最低值检测出最低DNA浓度；
七，特异性分析：将各种沙门氏菌属菌株和非沙门氏菌属菌株用TSB增菌液过夜增菌，取1mL增菌液提取DNA，取2μl作为模板，用建立的荧光PCR方法进行检测，以是否出现Ct值为判断阳性或阴性的标准；副溶血型弧菌特异性检测方法同沙门菌一致。PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)；
八，多重Real-time PCR方法的建立：使用矩阵法优化得出最佳引物浓度进行双重荧光PCR方法的建立，将副溶血弧菌和沙门菌引物和探针放入一个管子中进行扩增，对反应结果反应体积为25μl，反应程序为：95℃3min变性后，以94℃15s、58℃45s进行45个循环。于58℃检测FAM、VIC通道的荧光信号；
九，进行PCR结果判断：1，Ct≤37的样品，按照参比曲线计算浓度报告；2，37≤Ct＜40的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，故建议重复测定一次结果仍在此范围则定为阴性，反之按照参比曲线计算浓度报告；3，当Ct＝40或Ct＝0时，报告为阴性；
十，引物浓度选择：对副溶血性弧菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是22.67，最高为24.65，相差1.92.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.4μl；对沙门菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是17.26，最高为18.34，相差1.08.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.5μl；
十一，特异性分析
对所有的沙门菌和副溶血性弧菌都分别用优化后的反应条件对本实验室保存的21株沙门菌、1株枸缘酸杆菌、2株产LT和ST的ETEC、2株产LT的ETEC、4株不产毒ETEC、3株EIEC、2株EIEC血清型大肠埃希菌、3株福氏2a志贺菌、11株福氏4a志贺菌、1株福氏1b志贺菌、7株福氏2b志贺菌、12株福氏4c志贺菌、6株宋内氏志贺菌，进行了Real-time PCR检测，阳性和阴性符合率为100％；
十二，进行灵敏性分析；
十三，进行多重荧光PCR；
2.根据权利要求1所述的TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，其特征是步骤三中配制PCR反应液：Premix Ex Tag(2×)为12μl，DNA模板为2.0μl，上游引物为优化体积，下游引物为优化体积探针溶液，优化体积为dH20，8.5，Total为25μl。
3.根据权利要求1所述的TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，其特征是步骤四中方法包括直接煮沸法、Chelex树脂吸附提取法处理和直接提取核酸法。
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