CN102432682A - 耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 - Google Patents
耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102432682A CN102432682A CN2011104277113A CN201110427711A CN102432682A CN 102432682 A CN102432682 A CN 102432682A CN 2011104277113 A CN2011104277113 A CN 2011104277113A CN 201110427711 A CN201110427711 A CN 201110427711A CN 102432682 A CN102432682 A CN 102432682A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacteria
- thermoduric bacteria
- polyclonal antibody
- mouse source
- thermoduric
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 127
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 241001529936 Murinae Species 0.000 title abstract 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 46
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 22
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 14
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 12
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 8
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 5
- 101100192365 Rattus norvegicus Ptpn5 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003452 antibody preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 abstract 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 abstract 1
- 238000003453 ammonium sulfate precipitation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 9
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 241000193412 Alicyclobacillus acidoterrestris Species 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 241000191070 Escherichia coli ATCC 8739 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021559 Fruit Juice Concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 241000772413 Lutrogale perspicillata Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000005622 photoelectricity Effects 0.000 description 1
- 238000000247 postprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法，将耐热菌标准菌株通过培养基培养，制成1.4×108～4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液，然后将耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫63～91天摘除眼球采血，制成耐热菌的鼠源多克隆抗血清，再采用饱和硫酸铵沉淀法和G蛋白亲和层析对耐热菌的鼠源多克隆抗血清分别进行分离、纯化，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗体。本发明方法简单，成本低，所制备的耐热菌的鼠源多克隆抗体效价可达到12800，特异性良好，与常见食源性微生物无交叉反应，经电泳鉴定有较高纯度，可用于建立耐热菌免疫化学检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及到耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备及纯化鉴定。
背景技术
耐热菌，学名酸土环脂芽孢杆菌(Aliyclobacillua acidoterrestris)，是果汁生产中的常见危害菌，由于其耐热耐酸特性，能够经受酸性果汁加工中的巴氏杀菌过程而存活，在产品贮藏期，当处于休眠状态的芽孢在适宜温度条件下，就会迅速增殖引起果汁败坏，严重影响果汁的质量安全。因此，耐热菌是浓缩果汁生产中最重要的目标控制微生物之一。关于果汁中耐热菌的检测，目前主要分为以下三类：传统的平板培养计数法、基于遗传物质检测的PCR法和基于免疫学的快速检测方法。目前，生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌，平板培养计数法最大的缺点是耗时长，一般检测周期为4～5天。PCR法具有快速、特异的优点，但对设备、实验室条件以及操作人员要求高，步骤较繁锁，推广应用有一定困难。基于免疫分析原理的酶联免疫快速检测技术，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测设备及实验条件易达到等优点，而建立该检测方法的关键在于获得高效价、高特异性的抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、特异性强、成本低廉的耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是它由下述步骤组成：
1、制备耐热菌菌悬液
将耐热菌标准菌株(A.acidoterrestris DSM 3922)转接至250mL的402培养基，置于45℃气浴中振荡培养8小时，转接至凯氏培养基，41℃培养24小时，用无菌生理盐水冲洗凯氏培养基上培养的耐热菌，将冲洗下的耐热菌移至无菌三角锥瓶中充分混匀，3500～5000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，向沉淀中加入无菌生理盐水，稀释成浓度为1.4×108～4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液。
2、耐热菌免疫SD大鼠
将步骤1中制备的耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫原体积为0.5～1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63～91天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。
3、饱和硫酸铵沉淀法分离抗体
向步骤2制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清中加入无菌生理盐水，逐滴加入pH值为8.0的饱和硫酸铵水溶液，耐热菌的鼠源多克隆抗血清与无菌生理盐水、饱和硫酸铵水溶液的体积比为1∶1∶2，充分摇匀，4℃静置12小时，12000～20000转/分钟离心20分钟，弃去上清液，所得沉淀用生理盐水溶解，装入透析袋中透析除盐。
4、G蛋白亲和层析纯化抗体
向透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体中加入0.1mol/L pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液，调节耐热菌的鼠源多克隆抗体的pH值至8.0，用G蛋白亲和层析柱分离，上样量与柱体积之比为2∶1，流速为1mL/分钟，上样完成后用0.1mol/L pH值为8.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白至基线稳定，用0.1mol/L pH值为3.0的柠檬酸缓冲液洗脱结合的耐热菌的鼠源多克隆抗体，分别收集杂蛋白和耐热菌的鼠源多克隆抗体，收集的耐热菌的鼠源多克隆抗体装入透析袋中透析除柠檬酸根离子，透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体用平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩至与上样量体积相同。
本发明的耐热菌免疫SD大鼠步骤2中，优选将步骤1中制备的浓度为2×109CFU/mL的耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，注射体积为1mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行4次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。
本发明制备的耐热菌的鼠源多克隆抗体效价可达到12800，特异性良好，与常见食源性微生物无交叉反应，经电泳鉴定有较高纯度。本发明方法简单，成本低，可用于建立耐热菌免疫化学检测方法。
附图说明
图1是纯化前后耐热菌鼠源多克隆抗体的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、制备耐热菌菌悬液
将耐热菌标准菌株(A.acidoterrestris DSM 3922)转接至250mL的402培养基，置于45℃气浴中振荡培养8小时，转接至凯氏培养基，41℃培养24小时，用无菌生理盐水冲洗凯氏培养基上培养的耐热菌，将冲洗下的耐热菌移至无菌三角锥瓶中充分混匀，3500转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，向沉淀中加入无菌生理盐水，稀释成浓度为2×109CFU/mL的耐热菌菌悬液。
2、耐热菌免疫SD大鼠
将2mL耐热菌菌悬液、2mL免疫佐剂混合均匀，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫原体积为1mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行4次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。
3、饱和硫酸铵沉淀法分离抗体
取步骤2制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清2mL，加入2mL无菌生理盐水，逐滴加入pH值为8.0的饱和硫酸铵水溶液4mL，耐热菌的鼠源多克隆抗血清与无菌生理盐水、饱和硫酸铵水溶液的体积比为1∶1∶2，充分摇匀，4℃静置12小时，12000转/分钟离心20分钟，弃去上清液，所得沉淀用生理盐水溶解，装入透析袋中透析除盐。
4、G蛋白亲和层析纯化抗体
向2mL透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体中加入0.1mol/L pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液，调节耐热菌的鼠源多克隆抗体的pH值至8.0，用体积为1mL的G蛋白亲和层析柱分离，上样量为2mL、流速为1mL/分钟，上样完成后用0.1mol/L pH值为8.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白至基线稳定，用0.1mol/L pH值为3.0的柠檬酸缓冲液洗脱结合的耐热菌的鼠源多克隆抗体，分别收集杂蛋白和耐热菌的鼠源多克隆抗体，收集的耐热菌的鼠源多克隆抗体装入透析袋中透析除柠檬酸根离子，透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体用平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩至2mL。
实施例2
在实施例1的制备耐热菌菌悬液步骤1中，将沉淀用无菌生理盐水稀释成浓度为1.4×108CFU/mL的耐热菌菌悬液；在耐热菌免疫SD大鼠步骤2中，将2mL浓度为1.4×108CFU/mL的耐热菌菌悬液与2mL免疫佐剂混合均匀，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫原体积为1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行5次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫77天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。其他步骤与实施例1相同。
实施例3
在实施例1的制备耐热菌菌悬液步骤1中，将沉淀用无菌生理盐水稀释成浓度为4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液；在耐热菌免疫SD大鼠步骤2中，将2mL浓度为4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液与2mL免疫佐剂混合均匀，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫原体积为0.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行6次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫91天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。其他步骤与实施例1相同。
为了确定本发明的最佳工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，每种实验重复三次，实验结果为三次重复试验的平均值，各种试验情况如下：
试验材料与试剂：耐热菌标准菌株(A.acidoterrestris DSM 3922)，购自德国菌种保藏中心；大肠杆菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis ATCC6633)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 11778)、黑曲霉(Bacillus subtilis ATCC16404)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC6538)，由陕西师范大学生命科学学院微生物实验室提供；辣根过氧化物酶标山羊抗大鼠抗体(Jackson ImmunoResearch)进口分装；TMB(3，3’5，5’-四甲基联苯胺)，由广州沃凯化工厂提供；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，均购自Sigma公司。
试验仪器：Hitrap Protain G HP由GE Healthcare生产；恒流泵由上海沪西分析仪器厂有限公司生产；电泳仪由北京君意东方电泳设备有限公司生产；垂直平板凝胶电泳槽由北京六一仪器厂生产；BX41-12P02奥林巴斯显微镜，由泽仕光电科技(上海)有限公司生产；UNICO WFJ2000型可见分光光度计，由上海龙尼柯仪器有限公司生产；U-3010型紫外可见分光光度计，由日本HITACHI公司生产；GSP-9080-MBE型隔水式恒温培养箱，由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；TGL-16G型台式离心机，由上海安亭科学仪器厂生产；SW-CJ-1F型超净操作台，由苏净集团安泰公司生产；HHW-21CU-600型电热恒温水槽，由上海福玛实验设备有限公司生产；XW-80A漩涡混合仪，由海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；KQ3200B型超声波清洗机，由昆山市超声仪器有限公司生产；TDL-4型离心机，由上海医用分析仪器厂生产；伯乐680型酶标仪，由美国伯乐公司生产；微孔板振荡器，由杭州奥盛仪器有限公司生产；D25mm透析袋，由北京鼎国生物技术有限公司；德国Eppendorf精密微量移液器(10～100μL，0.1～10μL，30～300μL)。
1、确定免疫体积
分别将浓度为2×1010CFU/mL、8×109CFU/mL、4×109CFU/mL、2×109CFU/mL、1.4×108CFU/mL的耐热菌菌悬液与免疫佐剂等体积混合均匀，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，注射体积分别为0.1mL/只、0.25mL/只、0.5mL/只、1.0mL/只、1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行4次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，每次免疫1周后眼眶采血。采用ELISA法测定效价，具体测定方法如下：
(1)将耐热菌标准菌株转接至250mL的402培养基，置于45℃气浴中振荡培养8小时，转接至凯氏培养基，41℃培养24小时，用无菌生理盐水冲洗凯氏培养基上培养的耐热菌，将冲洗下的耐热菌移至无菌三角锥瓶中充分混匀，离心分离，弃去上清液，沉淀用0.05mol/L pH值为9.6的碳酸缓冲液稀释成浓度为107CFU/mL的耐热菌菌悬液，向酶标板孔内加耐热菌菌悬液，每孔加入100μL，置于烘箱中60℃包被2小时，用吐温-20的质量分数为0.05％的0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗酶标板3次，每次5分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。
(2)向酶标板孔内每孔加入200μL质量分数为5％的脱脂乳，置于恒温箱中37℃保温封闭2小时，用吐温-20的质量分数为0.05％的0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗酶标板3次，每次5分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。
(3)将待测抗体以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800梯度稀释，每个样品按照以上稀释度各加入酶标板的一行，同时设定阴性对照和空白对照，阴性对照为正常的大鼠血清，空白对照为0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，37℃孵育1小时，保证抗体与包被抗原充分反应，甩干酶标板，用吐温-20的质量分数为0.05％的0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗酶标板3次，每次5分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。
(4)将辣根过氧化物酶标山羊抗大鼠抗体1∶3000稀释，向酶标板孔内每孔加入100μL，37℃孵育1小时，甩干酶标板，用吐温-20的质量分数为0.05％的0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗酶标板3次，每次5分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100μL底物工作液，在恒温箱中37℃反应20分钟，加入50μL 2mol/L的硫酸溶液，终止反应。
上述的底物工作液的配制方法为：称取7.16g Na2HPO4加蒸馏水定容至100mL，配制成物质的量浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液；称取2.1g柠檬酸加蒸馏水定容至100mL，配制成物质的量浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液；取25.7mL物质的量浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液和24.3mL物质的量浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液，加蒸馏水定容至100mL，摇匀，配制成底物缓冲液；将0.1g 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺用100mL无水乙醇溶解，加入100mL底物缓冲液中，再加入400μL质量分数为30％的H2O2溶液，摇匀，配制成底物工作液，底物工作液现配现用。
(5)用酶标仪在波长为450nm下测定样品孔、阴性对照孔、空白对照孔的OD值，按下式计算P/N值：
P/N＝(样品孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白对照孔OD值)式中P/N≥2.1检出结果判定为阳性，表明抗体效价大于或等于该孔的稀释度，在同一行阳性结果中对应的最大稀释度即为该抗体效价，P/N＜2.1检测结果判定为阴性，表明抗体效价小于或等于该孔的稀释度。
试验结果见表1。
表1免疫体积的选择
由表1可知，大鼠免疫前耐热菌的鼠源多克隆抗血清效价低于ELISA法检测抗体效价的最低稀释度1∶100，表明其为阴性血清。免疫体积不同的个体血清的效价都有不同程度的上升；随着免疫次数的增加，耐热菌的鼠源多克隆抗体的效价逐渐上升。免疫体积为0.1mL/只和0.25mL/只时，耐热菌的鼠源多克隆抗体的效价分别为1∶400和1∶800；免疫体积为0.5mL/只、1.0mL/只和1.5mL/只时，五次免疫后，大鼠耐热菌的鼠源多克隆抗体效价均达到1∶12800。考虑到免疫过程对SD大鼠的影响，每次的免疫量不宜大于1.5mL/只，因此本发明确定免疫体积为0.5～1.5mL/只。
2、确定免疫SD大鼠次数
将2mL浓度为2×109CFU/mL的耐热菌菌悬液与2mL免疫佐剂混合均匀，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫原体积为1.0mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行6次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，每次免疫1周后眼眶采血，采用ELISA法测定效价，结果见表2。
表2耐热菌的鼠源多克隆抗体免疫过程中效价变化
| 免疫时间/天 | 0 | 7 | 21 | 35 | 49 | 63 | 77 | 91 |
| SD大鼠1 | - | 1∶400 | 1∶1600 | 1∶6400 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 |
| SD大鼠2 | - | 1∶200 | 1∶1600 | 1∶6400 | 1∶6400 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 |
| SD大鼠3 | - | 1∶200 | 1∶800 | 1∶3200 | 1∶6400 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 |
| SD大鼠4 | - | 1∶200 | 1∶400 | 1∶1600 | 1∶3200 | 1∶6400 | 1∶6400 | 1∶6400 |
| SD大鼠5 | - | 1∶400 | 1∶800 | 1∶6400 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 | 1∶12800 |
由表2可知，大鼠免疫前耐热菌的鼠源多克隆抗血清效价低于ELISA法检测抗体效价的最低稀释度1∶100，表明其为阴性血清。初次免疫后不同个体血清的效价有不同程度的上升；随着免疫次数的增加，耐热菌的鼠源多克隆抗体的效价逐渐上升。前三次追加免疫后，耐热菌的鼠源多克隆抗体效价有较快增长。五次免疫后，4/5的免疫大鼠多克隆抗体效价达到1∶12800，但第六次和第七次免疫后，多克隆抗体效价不再上升。因此，本发明选择采用弗氏完全佐剂免疫1次后，再用弗氏不完全佐剂追加免疫4次。
3、确定纯化方法
将制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清通过一次饱和硫酸铵沉淀法分离、两次饱和硫酸铵沉淀法分离以及两次饱和硫酸铵沉淀法分离后再采用G蛋白亲和层析纯化，按实验1的方法测定效价，并按照下述方法分别测定未纯化血清以及分离、纯化后血清中的蛋白含量：
将待测样品稀释至其在260nm和280nm的吸光度值为0.2～0.8，按照下述公式计算血清纯化前后的蛋白含量：
[Pr]＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数
式中Pr表示蛋白含量，OD260、OD280分别表示260nm和280nm下稀释的待测样品的吸光度值。
试验结果见表3。
表3抗体纯化过程中蛋白含量和效价
由表3可知，抗体纯化过程中，蛋白含量急剧减少，纯化前后蛋白含量减少了近50倍，但纯化的抗体的效价并没有降低。
4、SDS-PAGE电泳鉴定抗体
将制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清通过一次饱和硫酸铵沉淀法分离、两次饱和硫酸铵沉淀法分离以及两次饱和硫酸铵沉淀法分离后再采用G蛋白亲和层析纯化，然后对未纯化的血清(稀释10倍)以及分离、纯化后的血清分别进行SDS-PAGE电泳鉴定，SDS-PAGE鉴定采用王峰，李建科等报道的《苹果浓缩汁中嗜酸耐热菌多克隆抗体的制备及纯化》(食品与发酵工业，2009年第35卷第4期，33-36页)的方法。实验结果见图1，图1中1泳道是G蛋白亲和层析后耐热菌的鼠源多克隆抗体(经平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩)的SDS-PAGE电泳图谱，2泳道是G蛋白亲和层析杂蛋白洗脱液(经平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩)的SDS-PAGE电泳图谱，3泳道是未纯化的血清，4泳道是一次饱和硫酸铵沉淀法分离后耐热菌的鼠源多克隆抗体的SDS-PAGE电泳图谱，5泳道是两次饱和硫酸铵沉淀法分离后耐热菌的鼠源多克隆抗体的SDS-PAGE电泳图谱，M泳道是低分子量标准蛋白Marker。
由图1中3泳道与4泳道比较可见，经过一次饱和硫酸铵沉淀法分离后蛋白条带明显变少而且部分高含量的蛋白条带变淡。再与泳道5比较可见，经过两次饱和硫酸铵沉淀法分离后，各种蛋白含量有所减少，包括目的蛋白耐热菌的鼠源多克隆抗体。经G蛋白亲和层析纯化后，耐热菌的鼠源多克隆抗体与饱和硫酸铵沉淀法未能除去的杂蛋白很好的区分开，纯化后的耐热菌的鼠源多克隆抗体电泳后得到3条条带自上而下分子量分别为58kD、53kD和23kD，其中23kD为耐热菌的鼠源多克隆抗体的轻链亚基，58kD和53kD两个条带为耐热菌的鼠源多克隆抗体不同亚型的重链，其他条带几乎不可见，说明该纯化方法具有很好的特异性，得到了纯度较高的耐热菌的鼠源多克隆抗体。多次饱和硫酸铵沉淀法粗分级的纯化被普遍采用，但在本试验中一次沉淀和两次沉淀后蛋白含量差距不大。另外，结合SDS-PAGE图谱可以发现，两次沉淀相比一次沉淀目的蛋白的条带明显变淡，可能是目的蛋白在第二次沉淀中有一定的损失，其原因可能是分级沉淀过程中目的蛋白与杂蛋白发生了共沉淀。综上所述，本发明选择采用饱和硫酸铵沉淀法沉淀一次，再进行G蛋白亲和层析可以最大程度的得到目的蛋白耐热菌的鼠源多克隆抗体。
5、耐热菌的鼠源多克隆抗体特异性评价
分别以耐热菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、黑曲霉及金黄色葡萄球菌包被酶标板，加入抗体时以1∶3200稀释，按照试验1的方法测定抗体的特异性，其中P/N≥2.1检出结果判定为阳性，表明抗体与该微生物存在交叉反应，P/N＜2.1检测结果判定为阴性，表明抗体与该微生物不存在交叉反应。试验结果见表4。
表4耐热菌的鼠源多克隆抗体的特异性实验结果
| 耐热菌 | 黑曲霉 | 金黄色葡萄球菌 | 蜡状杆菌 | 大肠杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | |
| 阳性OD值 | 0.534 | 0.032 | 0.031 | 0.031 | 0.026 | 0.039 |
| 阴性OD值 | 0.033 | 0.032 | 0.032 | 0.036 | 0.045 | 0.036 |
| 空白OD值 | 0.006 | 0.007 | 0.007 | 0.005 | 0.006 | 0.008 |
| P/N | 19.559 | 1.010 | 0.950 | 0.839 | 0.506 | 1.107 |
由表4可见，按照本发明方法制备的耐热菌的鼠源多克隆抗体与黑曲霉、金黄色葡萄球菌、蜡状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌五种常见食品污染菌均无交叉反应，抗体具有特异性；耐热菌在实验中所得P/N值远高于其他微生物，说明与耐热菌反应灵敏度很高，表明所制备抗体对耐热菌特异性良好。
Claims (2)
1.耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)制备耐热菌菌悬液
将耐热菌标准菌株转接至250mL的402培养基，置于45℃气浴中振荡培养8小时，转接至凯氏培养基，41℃培养24小时，用无菌生理盐水冲洗凯氏培养基上培养的耐热菌，将冲洗下的耐热菌移至无菌三角锥瓶中充分混匀，离心分离，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤，向沉淀中加入无菌生理盐水，稀释成浓度为1.4×108～4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液；
(2)耐热菌免疫SD大鼠
将步骤(1)中制备的耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，注射体积为0.5～1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63～91天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清；
(3)饱和硫酸铵沉淀法分离抗体
向步骤(2)制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清中加入无菌生理盐水，逐滴加入pH值为8.0的饱和硫酸铵水溶液，耐热菌的鼠源多克隆抗血清与无菌生理盐水、饱、和硫酸铵水溶液的体积比为1∶1∶2，充分摇匀，4℃静置12小时，离心分离，弃去上清液，所得沉淀用生理盐水溶解，装入透析袋中透析；
(4)G蛋白亲和层析纯化抗体
向透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体中加入0.1mol/L pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液，调节耐热菌的鼠源多克隆抗体的pH值至8.0，用G蛋白亲和层析柱分离，上样量与柱体积之比为2∶1，流速为1mL/分钟，上样完成后用0.1mol/L pH值为8.0的磷酸盐缓冲液洗脱至基线稳定，用0.1mol/L pH值为3.0的柠檬酸缓冲液洗脱结合的耐热菌的鼠源多克隆抗体，收集耐热菌的鼠源多克隆抗体，装入透析袋中透析，用平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩至与上样量体积相同。
2.根据权利要求1所述的耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：在耐热菌免疫SD大鼠步骤(2)中，将步骤(1)中制备的浓度为2×109CFU/mL的耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，注射体积为1mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行4次追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104277113A CN102432682A (zh) | 2011-12-16 | 2011-12-16 | 耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104277113A CN102432682A (zh) | 2011-12-16 | 2011-12-16 | 耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102432682A true CN102432682A (zh) | 2012-05-02 |
Family
ID=45981066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011104277113A Pending CN102432682A (zh) | 2011-12-16 | 2011-12-16 | 耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102432682A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102854308A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-02 | 陕西师范大学 | 用于果汁中耐热菌双抗体夹心elisa检测试剂盒的制备方法及应用 |
| CN103145815A (zh) * | 2013-03-06 | 2013-06-12 | 中国农业大学 | 一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法 |
| CN109116036A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-01 | 安徽农业大学 | 一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心elisa方法 |
| CN110812480A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-21 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种抗菌肽和线粒体dna复合物及其多克隆抗体和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1900307A (zh) * | 2005-07-22 | 2007-01-24 | 陕西师范大学 | 耐热菌的qc－pcr快速定量检测所用竞争模板的制备方法 |
| CN1900708A (zh) * | 2005-07-22 | 2007-01-24 | 陕西师范大学 | 耐热菌的pcr快速检测方法 |
| CN101566632A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-10-28 | 陕西师范大学 | 耐热菌的elisa快速检测方法 |
-
2011
- 2011-12-16 CN CN2011104277113A patent/CN102432682A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1900307A (zh) * | 2005-07-22 | 2007-01-24 | 陕西师范大学 | 耐热菌的qc－pcr快速定量检测所用竞争模板的制备方法 |
| CN1900708A (zh) * | 2005-07-22 | 2007-01-24 | 陕西师范大学 | 耐热菌的pcr快速检测方法 |
| CN101566632A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-10-28 | 陕西师范大学 | 耐热菌的elisa快速检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王峰等: "苹果浓缩汁中嗜酸耐热菌多克隆抗体的制备及纯化", 《食品与发酵工业》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102854308A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-02 | 陕西师范大学 | 用于果汁中耐热菌双抗体夹心elisa检测试剂盒的制备方法及应用 |
| CN103145815A (zh) * | 2013-03-06 | 2013-06-12 | 中国农业大学 | 一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法 |
| CN103145815B (zh) * | 2013-03-06 | 2014-12-31 | 中国农业大学 | 一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法 |
| CN109116036A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-01 | 安徽农业大学 | 一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心elisa方法 |
| CN110812480A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-21 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种抗菌肽和线粒体dna复合物及其多克隆抗体和应用 |
| CN110812480B (zh) * | 2019-11-28 | 2021-04-02 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种抗菌肽和线粒体dna复合物及其多克隆抗体和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wisseman Jr et al. | Metabolic studies of rickettsiae: I. The effects of antimicrobial substances and enzyme inhibitors on the oxidation of glutamate by purified rickettsiae | |
| JP6391579B2 (ja) | 植物病害を治療及び防除する方法及び組成物 | |
| CN101825633B (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒的竞争elisa试剂盒 | |
| CN102323416A (zh) | 一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法 | |
| CN102432682A (zh) | 耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法 | |
| CN110818778B (zh) | 一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法 | |
| Meng et al. | Antiserum to recombinant virus coat protein detects Rupestris stem pitting associated virus in grapevines | |
| CN110484467A (zh) | 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用 | |
| CN104991069B (zh) | 果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株 | |
| CN103641913B (zh) | 一种汉逊酵母hcp抗体制备方法，制得抗体及其应用 | |
| CN102477097A (zh) | 一种氯霉素单克隆抗体的制备方法 | |
| CN105542010A (zh) | 脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途 | |
| Vesenjak-Zmijanac et al. | Virus meningo-encephalitis in Slovenia: 3. Isolation of the causative agent | |
| CN104726413B (zh) | 一株牛支原体nadh氧化酶的单克隆抗体 | |
| CN105777900A (zh) | 果斑病菌单抗及其杂交瘤细胞株 | |
| McKinney | FACTORS AFFECTING CERTAIN PROPERTIES OF A MOSAIC VIRUS¹ | |
| CN106520704A (zh) | 一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用 | |
| CN102199207A (zh) | 多种支原体单克隆抗体的制备方法及多联免疫检测试剂 | |
| Mazzucchi et al. | Comparative immunological study of pectic lyases produced by soft rot coliform bacteria | |
| CN106879884A (zh) | 一种提高蜂王浆性能的方法 | |
| CN111830263A (zh) | 一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法 | |
| CN101900732B (zh) | 果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌a蛋白-酶联免疫吸附检测方法 | |
| CN102146138A (zh) | 一种抗氯霉素单克隆抗体及其应用 | |
| CN117417898B (zh) | 一种利用单克隆抗体检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体的方法 | |
| RU2768838C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus 365e11, продуцирующий моноклональные антитела к шигаподобному токсину ii типа |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120502 |