CN110812480B - 一种抗菌肽和线粒体dna复合物及其多克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽和线粒体DNA复合物及其多克隆抗体和应用，属于生物医药技术领域，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物，包括抗菌肽和线粒体DNA；所述抗菌肽和线粒体DNA的质量比为(3～5)：1；所述抗菌肽包括LL‑37或Cramp。本发明还提供了所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物的多克隆抗体，通过将所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物免疫动物获得。本发明利用所述抗菌肽与线粒体DNA复合物制备的多克隆抗体得率高，特异性好，效价高；对复合物的靶向效果好，对类风湿性关节炎具有非常好的治疗效果。

Description

一种抗菌肽和线粒体DNA复合物及其多克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种抗菌肽和线粒体DNA复合物及其多克隆抗体和应用。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是一种主要侵袭掌指关节、近端指间关节、腕关节等小关节的对称性多发关节炎，长期的骨侵蚀和骨变形会导致患者的行动受限，如病情得不到良好控制会导致患者终生残疾。早于数千年前，美洲印第安人即发现RA相关病例，欧洲于十七世纪中叶已经有相关病症的报道，并且上流社会中为主要发病群体(Firestein,G.S.,Evolving concepts of rheumatoid arthritis.Nature,2003.423(6937):p.356-61.)。在我国，对RA的研究属于中医学中“痹证”的范畴，汉代张仲景在《金匮要略》中设立专篇，将RA与其他关节炎相区分。以“诸肢节疼痛，身体尪羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之”；“病历节不可屈伸、疼痛、乌头汤主之”等形象描述了RA的病症及治疗方案(许泽琼，姬.，从《金匮要略》探讨类风湿性关节炎的治疗.全国第八届中西医结合风湿病学术会议论文汇编，2010.)。

然而这些详尽的记录和治疗方案并没有阻止这一疾病的发生和发展。据调研公司统计，时至2015年全球RA患者总数已超过700万，至2023年这一数字将突破850万。每年用于相关医疗费用高达156亿美元，并以2.1％的年增长率稳步增长。这一逐年增长的患者人数和治疗费用源于：RA的致病原因尚未明确，现有治疗手段只能抑制病情恶化无法彻底治愈。这一现况使RA被世界卫生组织列为世界五大绝症之一。

因涉及的病理特征复杂，对RA疾病机理的研究已发展为多理论并立的局面。其复杂的分子机制可归于几大理论：自身免疫理论认为RA病患通过Toll样受体(TLRs)识别细菌、病毒等外援入侵物，呈递给树突状细胞，肥大细胞，成纤维样滑膜细胞启动免疫反应，产生大量的免疫复合物及RF；获得免疫理论认为关节内抗原物质(II型胶原，软骨连接蛋白，蛋白聚糖，抗环瓜氨酸肽(CCP)，热休克蛋白等)被作为抗原呈递至T细胞，促使Th细胞和Treg细胞产生白介素-17(IL-17)、干扰素-γ(IFN-γ)，诱发滑膜细胞、巨噬细胞产生炎症，最终导致了RA的产生。炎症过程中产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)，白介素-1(IL-1)作为高分泌丰度的炎症因子而备受疾病治疗关注(McInnes,I.B.,C.D.Buckley,and J.D.Isaacs,Cytokines in rheumatoid arthritis-shaping theimmunological landscape.Nat Rev Rheumatol,2016.12(1):p.63-8.)。

在临床中应用甲氨蝶呤(MTX)、羟化氯喹、磺铵匹林、地塞米松等消炎药物治疗RA，治疗过程中正常的免疫反应也可能被抑制，增加了微生物感染的风险，并会产生一系列的副反应。针对滑膜炎症的最新的免疫治疗方法靶向定位于引起滑膜炎的细胞因子，但这类药品由于不确定是否具有长期的免疫源性而存在着安全隐患(Siebert,S.,et al.,Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and otherinflammatory diseases.Pharmacol Rev,2015.67(2):p.280-309.)。即便是FDA批准的，已占据免疫疾病治疗榜首的新药HUMIRA(adalimumab)也具有此类问题。HUMIRA是通过靶向识别炎症反应中的TNF-α，而作为自身免疫疾病的“特效药”用来阻止关节损伤，降低炎症反应，控制RA的病程发展。但由于导致RA患者自身免疫反应发生的促因并没有消除，患者停止用药后，自身免疫反应并未消除，依然有极大复发可能。而且，以HUMIRA炎症因子抑制剂来治疗，也会造成急性肺损伤等副反应(Kohli,R.and K.Namek,Adalimumab(Humira)inducedacute lung injury.Am J Case Rep,2013.14:p.173-5.)。IL-1β作为治疗关节炎阻断炎症的靶点之一的原理是类风湿性关节炎患者滑膜和滑液中天然表达IL-1Ra水平不足，不足以对抗拒局部产生的IL-1β的量的增加。IL-1β受体的拮抗剂-阿那白滞素(Anakinra)能够缓解类风湿性关节炎症状，却增加患者甲型链球菌感染几率和罹患败血症的风险(Turesson,C.and K.Riesbeck,Septicemia with Staphylococcus aureus,beta-hemolytic streptococci group B and G,and Escherichia coli in apatient withrheumatoidarthritis treated with a recombinant human interleukin 1receptorantagonist(Anakinra).J Rheumatol,2004.31(9):p.1876.)。同时，HUMIRA的制药公司发布了Adalimumab联合Anakinra用药会导致这一风险加剧，这使通过联合用药来降低免疫抑制剂抗体产生的计划化为泡影。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗菌肽和线粒体DNA复合物及其多克隆抗体和应用；本发明中所述抗菌肽包括LL-37或Cramp，利用所述抗菌肽与线粒体DNA复合物制备的多克隆抗体质量好，效价高；对复合物的靶向效果好，对类风湿性关节炎具有非常好的治疗效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种抗菌肽和线粒体DNA复合物，包括抗菌肽和线粒体DNA；所述抗菌肽和线粒体DNA的质量比为(3～5)：1；所述抗菌肽包括LL-37或Cramp。

优选的，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物为液体制剂，溶剂为磷酸盐缓冲液。

优选的，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物在液体制剂中的浓度为1.0～1.5mg/mL。

优选的，所述液体制剂的制备方法包括以下步骤：将所述抗菌肽和线粒体DNA复合物溶解于磷酸盐缓冲液，35～38℃孵育20～40min。

本发明提供了所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物的多克隆抗体。

优选的，通过将所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物免疫动物获得。

优选的，所述动物为兔子。

优选的，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与免疫佐剂混合后进行免疫。

优选的，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与免疫佐剂的体积比为1:1；所述免疫佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

本发明提供了所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物、所述的多克隆抗体在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的抗菌肽和线粒体DNA复合物，包括抗菌肽和线粒体DNA；所述抗菌肽包括LL-37或Cramp；本发明采用所述抗菌肽和线粒体DNA复合物为抗原免疫动物获得的多克隆抗体，多克隆抗体的得率高，抗体质量好，效价高；抗体对复合物的靶向效果好，对类风湿性关节炎具有非常好的治疗效果。根据实施例的记载，LL-37-mtDNA复合物的多克隆抗体与Cramp-mtDNA复合物的多克隆抗体的有效效价分别为51200和25600，并且所述多克隆抗体与复合物中的单一组分LL-37、Cramp或mtDNA结合力非常低，具有高度的特异性。利用所述多克隆抗体给药CIA动物模型，经过流式细胞因子检测分析，发现多克隆抗体给药组与CIA模型相比IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ都有明显上调，在给予所述多克隆抗体治疗后，IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β细胞因子的表达水平明显下调，IL-6、IL-1β恢复了正常水平，IFN-γ在CIA治疗组中的水平也恢复正常。在给予Cramp-37-mtDNA复合物后再经抗体治疗组中，IL-6细胞因子下调最为显著，与对照组已不具有显著性差异，IFN-γ、IL-β的含量通过抗体治疗也明显降低。可见，本发明提供的抗菌肽和线粒体DNA复合物制备获得的多克隆抗体对于类风湿性关节炎具有显著的治疗效果。

附图说明

图1为LL-37-mtDNA复合物的多克隆抗体的效价及特异性分析；其中A和B为LL-37-mtDNA抗体效价及特异性分析；C和D为Cramp-mtDNA抗体效价及特异性分析；

图2为CIA模型中细胞因子的分泌情况，依次为IL-6、IL-17A、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-1β；**p<0.01，n＝5；

图3为不同处理组小鼠关节炎发生严重程度的对比；

图4为不同处理组小鼠平均关节炎评分对比。

具体实施方式

一种抗菌肽和线粒体DNA复合物，包括抗菌肽和线粒体DNA；所述抗菌肽和线粒体DNA的质量比为(4～6)：1；所述抗菌肽包括LL-37或Cramp。

在本发明中，所述抗菌肽LL-37的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；所述抗菌肽Cramp的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE。在本发明中，所述线粒体DNA为环状或线性线粒体DNA；所述线粒体DNA优选为动物细胞中的线粒体DNA；更优选为从人胚胎肾细胞HEK293中提取获得的线粒体DNA。在本发明中，所述线粒体DNA优选的采用动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒进行提取。在本发明中，所述抗菌肽和线粒体DNA的质量比为(3～5)：1，优选的为5:1。

在本发明中，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物优选为液体制剂，所述液体制剂的溶剂优选为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.4；在本发明中，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物在液体制剂中的浓度为1.0～1.5mg/mL，更优选为1.2mg/mL。在本发明中，所述液体制剂的制备方法优选的包括以下步骤：将所述抗菌肽和线粒体DNA复合物溶解于磷酸盐缓冲液，35～38℃孵育20～40min。在本发明具体实施过程中，优选的分别取抗菌肽和线粒体DNA溶解于磷酸盐缓冲液中孵育，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为25～35min，更优选为30min。

本发明提供了所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物的多克隆抗体，通过将所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物免疫动物获得。在本发明中，所述抗菌肽和线粒体DNA复合物优选的与免疫佐剂混合后进行免疫；所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与免疫佐剂的体积比优选为1:1；在本发明中，所述免疫佐剂优选为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。在本发明中，所述免疫包括首次免疫、第一次加强免疫、第二次加强免疫和第三次加强免疫。在本发明中，所述首次免疫采用所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与弗氏完全佐剂混合后充分乳化的溶液进行；所述第一次加强免疫、第二次加强免疫和第三次加强免疫采用所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与弗氏不完全佐剂混合后充分乳化的溶液进行。在本发明中，所述第一次加强免疫、第二次加强免疫和第三次加强免疫分别在首次免疫后的第14、28、42天进行；本发明在所述第三次加强免疫后，分离抗血清、纯化后得到所述多克隆抗体。在本发明中，所述纯化优选的采用HiTrap ProteinA抗体纯化柱进行。在本发明中，所述动物优选为兔子，更优选为新西兰大白兔；本发明对所述新西兰大白兔的来源没有特殊限定，采用常规的符合要求的市售新西兰大白兔即可。

本发明提供了所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物、所述多克隆抗体在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。本发明对所述的药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用常规的剂型和辅料即可。在本发明中，所述多克隆抗体对于胶原诱导类风湿性关节炎模型小鼠具有显著的治疗作用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

线粒体DNA(mtDNA)提取：

应用动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒(GMS20023.3v.A,GENMED)从人胚胎肾细胞(HEK293)中提取mtDNA，具体方法详见试剂盒说明书。得到的mtDNA以分光光度计(Nano，MestroGen)检测浓度，确定没有蛋白质、DNA交叉污染后进行下一步实验。(纯度要求：A260/A280>1.8，A260/A280>2.0)。

多肽合成：

固相合成多肽(委托生物技术公司进行)：

LL-37：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES

多肽Cramp：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE

合成仪为433A型(ABI，美国)，合成序列的正确性通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)双重验证，纯度>95％。

LL-37-mtDNA复合物、Cramp-mtDNA复合物制备：

取2mg的LL-37与0.4mg的mtDNA混合，溶于2mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温孵育30min得到复合物。

取2mgCramp与0.4mg的mtDNA混合，溶于2mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温孵育30min得到复合物。

试剂配制方法：

磷酸盐缓冲液(PBS)：以水为溶剂，包括以下浓度的祖分：0.15M的NaCl，2.7mM的Na₂HPO₄·7H₂O，1.5mM的KH₂PO₄；磷酸盐缓冲液(PBS)的pH值7.4。

包被液为0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液：

1.50g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，去离子水定容1L。

洗涤液为细胞用PBS+0.1％的Tween-20：

细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钾，0.2g；氯化钠0.2g；磷酸二氢钠，2.16g，磷酸氢二钾，0.2g，加入去离子水定容1L。

封闭液(抗体稀释液)为100mL洗涤液加入1％牛血清白蛋白(BSA)1g。

终止液为2M的硫酸：将21.7mL浓硫酸加入到178.3mL去离子水中缓慢混合均匀。

多克隆抗体制备：

抗原注射前取新西兰大白兔血清作为抗体检测阴性对照，LL-37-mtDNA复合物与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich Inc.)等比混合乳化，采用背部多点注射免疫法：选取白兔脊柱旁4～6点进行皮下注射。首次免疫后14、28、42天选取上述部位不同点注射加强免疫，加强免疫的LL-37-mtDNA复合物采用弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich Inc.)1:1等比混合乳化后注射。42天后以戊巴比妥钠麻醉白兔，心脏取血，获得的血液4℃静置过夜，200g离心30min分离抗血清。Cramp-mtDNA复合物多克隆抗体制备方法同上。得到的兔血清多抗以HiTrap Protein A抗体纯化柱(17040301,Amersham Biosciences，GE)进行抗体纯化，纯化方法见试剂盒，所得多克隆抗体依据以下方法进行效价检测。

(1)包被：Cramp-mtDNA(12μg/mL)、LL-37-mtDNA(12μg/mL)、LL-37和mtDNA用包被液稀释，在96孔板内每孔加入100μL样品，4℃包被过夜。

(2)洗涤：去除96孔板内液体，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3min，倒掉洗涤液，应用微孔板离心机离心10s至洗涤液完全除干。上述洗涤步骤重复三次，除干板内液体。

(3)封闭：每孔加入封闭液200μL，37℃孵育1h。

(4)洗涤：重复步骤(2)。

(5)加血清：用抗体稀释液(同封闭液)将制备的多克隆抗血清倍比稀释。(1:100,1:200,…,1:102400)，每孔加100μL，阴性对照孔内加入100μL免疫注射前采集的兔血清，空白对照孔内加入100μL抗体稀释液。37℃孵育1h。

(6)洗涤：重复步骤(2)。

(7)加二抗：每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔的二抗(1:2000倍稀释，KPL，USA)100μL，37℃避光温箱孵育1h。

(8)洗涤：重复步骤(2)。

(9)显色：每孔加入100μL的3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)单组份显色液(Solarbio，北京)，37℃避光孵育20min。

(10)终止：每孔加入100μL终止液，酶标仪450/630nm双波长读数。

450/630nm读数大于一的最低响应值即为该抗体有效效价。

结果如图1所示，LL-37-mtDNA复合物的多克隆抗体与Cramp-mtDNA复合物的多克隆抗体的有效效价分别为51200和25600；所述多克隆抗体与复合物中的单一组分LL-37、Cramp和mtDNA结合力非常低，具有高度的特异性。

Cramp-mtDNA复合物的多克隆复合物抗体在小鼠体内治疗RA的效果检测

构建胶原诱导小鼠类风湿性关节炎模型(CIA)：以牛II型胶原(MD，804001-lyo)溶于0.1M的乙酸，配制为终浓度1g/L的II型胶原溶液。将II型胶原溶液与等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合(初次免疫用弗氏完全佐剂，其后用弗氏不完全佐剂)、在漩涡震荡仪上乳化30min，制得Ⅱ型胶原乳剂。以5～15mg/kg乳剂量在小鼠背部和尾根部进行多点注射，免疫注射20天后，以1/5初次注射的II型胶原溶液量腹腔注射作为诱发注射。

随机选取DBA1/J近交系小鼠分为5组(每组5只)，分别构建模型以下模型：

处理1.CIA模型组；

处理2.Cramp-mtDNA抗体对CIA进行治疗组(CIA+Ab)；

处理3.CIA模型Cramp-mtDNA给药组(CIA+Cramp-mtDNA)；

处理4.CIA模型Cramp-mtDNA给药同时抗体治疗组(CIA+Cramp-mtDNA+Ab)；

处理5.DBA1/J近交系小鼠仅注射生理盐水的阴性对照组。

对各组关节炎模型遵照以下评价标准进行评价：

体重称量、小鼠关节炎的发生时间、发生率、测量足掌厚度、获得肿胀程度同时对小鼠进行炎症指数评分。

关节炎指数评分标准：0分：无红肿；1分：踝或足趾轻度红肿；2分：关节或足趾严重红肿；3分：关节僵硬或强直。对每只小鼠的四肢分别记录其累积分数，每只小鼠的最高分数为12分。

依据评价标准，确定Cramp-mtDNA复合物和抗体对CIA动物模型关节炎发生严重程度的影响，确定在动物体内Cramp-mtDNA与RA的相关性。结果如图3和图4所示，由此可见，添加Cramp-mtDNA复合物的处理组，关节炎评分升高，说明Cramp-mtDNA复合物能够加重关节炎的严重程度，Cramp-mtDNA复合物和抗体能够减缓关节炎的发生。

通过流式细胞因子检测分析，CIA动物模型中细胞因子的含量变化发现处理3复合物给药组与CIA模型相比IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ都有明显上调，处理4在给予抗体治疗后，IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β细胞因子的表达水平都有了明显下调，IL-6、IL-1β恢复了正常水平，IFN-γ在CIA治疗组中的水平也恢复了正常。在给予Cramp-37-mtDNA复合物后再经抗体治疗组中，IL-6细胞因子下调最为显著与对照组已不具有显著性差异，IFN-γ、IL-β的含量通过抗体治疗也明显降低。

由图2结果可知，处理3Cramp-mtDNA复合物给药组的促炎细胞因子、和趋化因子水平(IL-1β、IL-6、IL-17A、IFN-γ、TNF-α)较CIA组有明显升高，Th2分泌的细胞因子IL-10的水平被显著抑制，经复合物多克隆抗体治疗后CIA组和CIA+Cramp-mtDNA给药组(处理2和处理4)的促炎细胞因子、趋化因子水平(IL-1β、IL-6、IL-17A、IFN-γ、TNF-α)有明显降低，Th2分泌的细胞因子IL-10的水平明显增高。**p<0.01，n＝5。

由此可见，本发明提供的抗菌肽和线粒体DNA复合物的多克隆抗体对于胶原诱导类风湿性关节炎模型小鼠具有显著的治疗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 一种抗菌肽和线粒体DNA复合物及其多克隆抗体和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser

35

<210> 2

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys

1 5 10 15

Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln Pro

20 25 30

Glu

Claims (5)

1.一种加重关节炎严重程度的抗菌肽和线粒体DNA复合物，其特征在于，包括抗菌肽和线粒体DNA；所述抗菌肽和线粒体DNA的质量比为5：1；所述抗菌肽包括LL-37或Cramp；所述抗菌肽和线粒体DNA复合物为液体制剂，溶剂为磷酸盐缓冲液；所述抗菌肽和线粒体DNA复合物在液体制剂中的浓度为1.2mg/mL。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物，其特征在于，所述液体制剂的制备方法包括以下步骤：将所述抗菌肽和线粒体DNA复合物溶解于磷酸盐缓冲液，27~37℃孵育20~40min。

3.权利要求1或2所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物作为药物靶标和/或治疗靶标在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物的多克隆抗体在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体通过将所述的抗菌肽和线粒体DNA复合物与免疫佐剂混合后免疫兔子获得；所述抗菌肽和线粒体DNA复合物与免疫佐剂的体积比为1:1；所述免疫佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

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