CN110461356A - 用于调节肺中炎性体活性和炎症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于减少受导致肺部炎症的病症折磨的哺乳动物的肺部炎症的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括抑制哺乳动物中炎性体信号传导的药剂，诸如单独或与一种或多种细胞外囊泡摄取抑制剂组合使用的针对炎性体组分的抗体。

Description

用于调节肺中炎性体活性和炎症的方法

本申请要求2016年12月29日提交的美国临时申请序列号62/440,180的优先权，出于所有目的将其通过引用以其全文并入本文。

关于联邦赞助研究的声明

本发明是以由国家神经障碍和中风研究所(NINDS)授权的授权号4R42BS086274-02由美国政府支持完成的。美国政府对本发明拥有一定的权利。

电子提交文本文件的说明

以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：UNMI_010_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2017年12月28日，文件大小2千字节)。

技术领域

本发明总体上涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及用于调节哺乳动物肺中ASC(含有半胱天冬酶激活招募结构域(CARD)的细胞凋亡相关Speck样蛋白)活性和黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)炎性体活性的组合物和方法，作为响应于在肺中产生炎症的病症减少炎症的治疗。

背景技术

重型颅脑损伤(TBI)是一个主要的公共卫生问题，并且是全世界死亡率和发病率的主要原因(3)。除了对脑的直接损伤之外，TBI还可导致其他器官(诸如肺)中的并发症。急性肺损伤(ALI；2)是创伤后常见的心肺问题，并且与高达40％的住院死亡率相关(4)。TBI患者特别易于发展ALI，同时一些研究报告发病率高达30％(5)。最近的研究表明全身炎症因子可能导致TBI后肺功能障碍和肺损伤(6)，但TBI诱导的肺损伤的确切分子机制仍然定义不明确。

大量分泌的炎症介质(包括细胞因子、趋化因子和由损伤细胞释放的损伤相关分子模式(DAMP))导致脑部炎症并影响远端器官(诸如肺)(5)。最广泛研究的DAMP中的一种是高迁移率族蛋白-1(high mobility group box-1，HMGB1)，其可作为炎症在各种致病状态(包括TBI)中的早期介质(7)。最近的一项研究表明，HMGB1可能参与TBI诱导的肺功能障碍的机制(8)。HMGB1释放可由炎性体(9)调节，其是参与TBI后半胱天冬酶-1的激活以及IL-1β和IL-18的加工的多蛋白复合物(10)。

已提出了各种解释来解释TBI后肺部并发症的病理机制，包括血管通透性增加导致毛细血管渗漏和蛋白质碎片的浸润(11)。细胞外囊泡(EV)是膜包含的囊泡，其在细胞间通信中发挥作用(12)，并且已涉及在LPS诱导的鼠模型中在发展ALI方面起作用。此外，已表明EV可携带生物活性细胞因子(诸如IL-1β)和炎性体蛋白(13)(14)，并且可触发免疫应答并通过其货物(cargo)将炎症扩增至邻近和周围的细胞。然而，尚不清楚EV介导的炎性体信号传导是否可促成TBI诱导的ALI的病理机制。此外，还不知道TBI诱导的ALI的病理机制是否是产生肺炎症的其他病症共有的。此外，缺少用于治疗肺炎症的联邦药品管理局(FDA)批准的药物。

因此，迫切需要不仅阐明由TBI以及其他病症引起的肺炎症的病理机制，而且还需要开发治疗组合物及其用于治疗和/或预防肺炎症的用途。

发明内容

一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的肺部炎症的方法，所述方法包括：向患者给予一种包含抑制炎性体信号传导的药剂的组合物，由此治疗患者的肺部炎症。在一些情况下，肺部炎症是由选自以下的病症导致的：中枢神经系统(CNS)损伤、神经变性疾病、自身免疫疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺病和急性呼吸窘迫综合征。在一些情况下，CNS损伤选自创伤性脑损伤(TBI)、中风和脊髓损伤(SCI)。在一些情况下，神经变性疾病选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症(MS)和帕金森病(PD)。在一些情况下，所述组合物的给予导致抑制患者肺细胞中的炎性体激活。在一些情况下，与对照相比，所述组合物的给予导致患者肺细胞中半胱天冬酶-1、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白1(nucleotide-binding leucine-rich repeat pyrin domain containingprotein 1，NLRP1)、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白2(NLRP2)、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白3(NLRP3)、含NLR家族CARD结构域的蛋白4(NLRC4)、半胱天冬酶-11、X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)、pannexin-1、含有半胱天冬酶激活招募结构域的细胞凋亡相关Spec样蛋白(ASC)、白细胞介素-18(IL-18)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)或黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)水平的减少，其中对照是未治疗的患者。在一些情况下，肺细胞是II型肺泡细胞。在一些情况下，与对照相比，所述组合物的给予导致急性肺损伤(ALI)的减少，其中对照是未治疗的患者。在一些情况下，ALI的减少通过嗜中性粒细胞到肺泡和/或间质空间中的浸润减少、肺泡间隔增厚减少或不存在、或其组合来证明。在一些情况下，所述药剂是细胞外囊泡(EV)摄取抑制剂、结合炎性体组分的抗体或其组合。在一些情况下，EV摄取抑制剂是化合物或抗体，其中所述抗体选自表1。在一些情况下，所述药剂是EV摄取抑制剂，其与结合炎性体组分的抗体组合。在一些情况下，EV摄取抑制剂是肝素。在一些情况下，肝素是依诺肝素。在一些情况下，结合炎性体组分的抗体是特异性地结合哺乳动物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3或NLRC4炎性体组分的抗体。在一些情况下，炎性体组分是半胱天冬酶-1、ASC或AIM2。在一些情况下，炎性体组分是ASC。在一些情况下，所述抗体结合N末端PYRIN-PAAD-DAPIN结构域(PYD)、C末端半胱天冬酶-招募结构域(CARD)结构域、或衍生自ASC蛋白的PYD或CARD结构域的表位。在一些情况下，所述抗体结合与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的蛋白质。在一些情况下，所述抗体抑制患者肺中的ASC活性。在一些情况下，将所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。在一些情况下，将所述组合物通过脑室内、腹膜内、静脉内或通过吸入给予。

另一方面，本文提供了一种治疗已经经受中枢神经系统(CNS)损伤的患者的肺部炎症的方法，所述方法包括：向患者给予一种包含抑制炎性体信号传导的药剂的组合物，由此治疗患者的肺部炎症。在一些情况下，CNS损伤选自创伤性脑损伤(TBI)、中风和脊髓损伤(SCI)。在一些情况下，所述组合物的给予导致抑制患者肺细胞中的炎性体激活。在一些情况下，与对照相比，所述组合物的给予导致患者肺细胞中半胱天冬酶-1、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4、半胱天冬酶-11、XIAP、pannexin-1、含有半胱天冬酶激活招募结构域的细胞凋亡相关Spec样蛋白(ASC)、白细胞介素-18(IL-18)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)或黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)水平的减少，其中所述对照是未治疗的患者。在一些情况下，肺细胞是II型肺泡细胞。在一些情况下，与对照相比，所述组合物的给予导致急性肺损伤(ALI)的减少，其中对照是未治疗的患者。在一些情况下，ALI的减少通过嗜中性粒细胞到肺泡和/或间质空间中的浸润减少、肺泡间隔增厚减少或不存在、或其组合来证明。在一些情况下，所述药剂是细胞外囊泡(EV)摄取抑制剂、结合炎性体组分的抗体或其组合。在一些情况下，EV摄取抑制剂是化合物或抗体，其中所述抗体选自表1。在一些情况下，所述药剂是EV摄取抑制剂，其与结合炎性体组分的抗体组合。在一些情况下，EV摄取抑制剂是肝素。在一些情况下，肝素是依诺肝素。在一些情况下，结合炎性体组分的抗体是特异性地结合哺乳动物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3或NLRC4炎性体组分的抗体。在一些情况下，炎性体组分是半胱天冬酶-1、ASC或AIM2。在一些情况下，炎性体组分是ASC。在一些情况下，所述抗体结合PYD、CARD结构域或衍生自ASC蛋白的PYD或CARD结构域的表位。在一些情况下，所述抗体结合与选自SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的蛋白质。在一些情况下，所述抗体抑制患者肺中的ASC活性。在一些情况下，将所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。在一些情况下，将所述组合物通过脑室内、腹膜内、静脉内或通过吸入给予。

附图说明

图1A-1N示出了TBI后C57/BL6小鼠皮质和肺组织中的炎性体激活。图1A示出了TBI后活性半胱天冬酶-1、ASC、IL-18、IL-β、HMGB1和AIM2的代表性免疫印迹。在TBI后4h和24h时，活性半胱天冬酶-1(图1B)、ASC(图1C)、IL-18(图1D)、HMGB1(图1E)、AIM 2(图1F)和IL-β(图1G)在皮质组织中显著升高。数据表示为平均值+/-SEM；与假手术相比，****p<0.001，***p<0.01，p<0.05。N＝4-5/组。图1H示出了肺组织中活性半胱天冬酶-1、ASC、IL-18、IL-β、HMGB1和AIM2的代表性免疫印迹。I、J、K、L、M、N)在TBI后4h和24h时，活性半胱天冬酶-1(图1I)、ASC(图1J)、IL-18(图1K)、HMGB1(图1L)、AIM 2(图1M)和IL-β(图1N)在肺组织中显著升高。数据表示为平均值+/-SEM。N＝4-5/组，与假手术相比，**p<0.01.，*p<0.05。

图2A-2C示出了炎性体蛋白在II型肺泡上皮细胞中的表达。当与小鼠相比时，图2A示出了AIM2，图2B示出了活性半胱天冬酶-1并且图2C示出了ASC免疫反应性在CCI(4h、24h)后在肺组织中增加。AIM2、半胱天冬酶-1和ASC(绿色)以及II型上皮细胞(表面活性蛋白C，红色)的共聚焦图像。

图3A-3E示出了TBI增加小鼠肺中的细胞核和细胞质HMGB1表达。图3A示出了TBI后细胞核HMGB1的代表性免疫印迹。图3B示出了与假手术相比，细胞核HMGB1在4小时受损伤动物中显著升高。图3C示出了TBI后细胞质HMGB1的代表性免疫印迹。图3D示出了与假手术相比，细胞质HMGB1在4小时受损伤动物中显著升高。数据表示为平均值+/-SEM；与假手术相比，****p<0.001，***p<0.01，*p<0.05。N＝4-5/组。图3E示出了当与假手术小鼠相比时，CCI后肺组织中HMGB1免疫反应性增加。HMGB1和II型上皮细胞(表面活性蛋白C，红色)的共聚焦图像。

图4A-4C示出了TBI后4小时小鼠肺中的焦亡小体(Pyroptosome)形成。图4A示出了TBI诱导肺组织中的ASC阶梯，表明形成了焦亡小体(导致半胱天冬酶-1激活和细胞焦亡的ASC二聚体的寡聚)。图4B示出了消皮素(gasdermin)的代表性免疫印迹并且图4C示出了消皮素的量化。在TBI后，消皮素-D在肺组织中显著升高。数据表示为平均值+/-SEM。N＝4-5/组，与假手术相比，**p<0.01.，*p<0.05。

图5A-5B示出了TBI诱导小鼠的肺泡形态学变化和急性肺损伤。图5A示出了在4h和24h时来自假手术和受损伤动物的肺切片的H&E染色。切片示出了中性粒细胞浸润(箭头)、肺泡毛细血管膜形态学变化(星号，*)、间质水肿(短箭头)的证据以及间质和肺泡间隔增厚(镑，#)的证据。图5B示出了在4h和24h时，当与假手术相比时，受损伤动物的急性肺损伤得分显著增加。数据表示为平均值+/-SEM。N＝4-5/组，与假手术相比，**p<0.01.，*p<0.05。

图6示出了来自对照和TBI损伤小鼠的血清来源的EV中CD81的表达。来自假手术对照和TBI损伤小鼠的血清来源的EV中CD81的代表性免疫印迹。

图7A-7H示出了来自TBI动物的EV的过继转移在未受损伤小鼠的肺中诱导半胱天冬酶-1和ASC。图7A示出了代表性免疫印迹，其示出当与来自假手术动物相比时，半胱天冬酶-1(图7B)、ASC(图7C)、IL-18(图7D)、AIM2(图7E)、HMGB1(图7F)在接受从TBI小鼠分离的EV的动物肺中升高。数据表示为平均值+/-SEM；与假手术相比，*p<.0.05。N＝3/组。来自TBI小鼠的EV诱导肺泡形态学变化(肺泡大小减小)和炎症细胞的浸润，如通过H&E染色所确定(图7G)。与未受损伤小鼠相比，从受损伤小鼠递送的EV的ALI得分显著增加(图7H)。数据表示为平均值+/-SEM；与未受损伤组相比，*p<.0.05。

图8A-8F示出了用依诺肝素(3mg/kg)和IC 100(5mg/kg)治疗减少了递送来自受损伤小鼠的EV的动物肺中的炎性体表达。图8A示出了代表性免疫印迹，其示出当与未治疗的阳性对照动物相比时，半胱天冬酶-1(图8B)、ASC(图8C)、IL-1β(图8D)、AIM2(图8E)、HMGB1(图8F)在用依诺肝素和IC 100治疗的动物肺中减少。数据表示为平均值+/-SEM；与假手术相比，*p<.0.05。N＝4/组。

图9A-9E示出了用依诺肝素(3mg/kg)和IC 100(5mg/kg)治疗减少了递送来自受损伤小鼠的EV的动物肺中的ALI得分。图9A-9D示出了来自以下的肺切片的H&E染色：盐水(图9A)、未治疗(图9B)、依诺肝素(图9C)和IC 100(抗ASC；图9D)治疗的递送来自受损伤动物的EV的小鼠肺。切片示出了中性粒细胞浸润、肺泡毛细血管膜形态学变化、间质水肿的证据，以及间质和肺泡间隔增厚的证据。图9E示出了当与未治疗的动物相比时，用依诺肝素、IC100治疗的动物的急性肺损伤得分显著降低。数据表示为平均值+/-SEM。N＝4/组，**p<0.01.，*p<0.05。

图10A-10F示出了递送来自TBI患者的血清来源的EV增加肺内皮细胞中的炎性体蛋白表达。图10A示出了在与TBI-EV和对照EV孵育4小时后，PMVEC中半胱天冬酶-1、ASC、AIM2、HMGB1的蛋白质印迹表示。图10B-10E示出了蛋白质印迹的量化，n＝3个过滤器/组，n＝6位患者，t检验，p<0.05。图10F示出了使用Ella简单plex测定(n＝3个过滤器/组，n＝6位患者，t检验，p<0.05)，IL-1β表达的显著增加的免疫测定结果。

图11A-11C示出了向肺内皮细胞递送TBI-EV增加了活性半胱天冬酶-1的免疫反应性和细胞死亡。图11A示出了半胱天冬酶-1FLICA和PI染色以及与TBI-EV孵育4小时的PMVEC的共定位。图11B示出了与对照EV孵育4小时的PMVEC中的半胱天冬酶-1FLICA和PI染色。图11C示出了与TBI和对照EV孵育4小时的PMVEC的荧光板读取器分析。N＝6，p<0.05。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本文所用，“蛋白质”和“多肽”同义地用于意指任何肽连接的氨基酸链，而不管长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。

如本文所用，术语“抗体”通常和广泛地指免疫球蛋白、单克隆抗体和多克隆抗体，以及其活性片段。所述片段可以是活性的，因为其结合了同源抗原(例如，ASC、NLRP1、AIM2等)，或者其可以是活性的，因为其具有生物学功能。使用本领域已知的技术，用于本文的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中将非人抗体的最小部分引入原本的人抗体中的抗体。

如本文所用，术语“人抗体”是指一种这样的抗体，其中蛋白质的基本上每个部分在人体中基本上是非免疫原性的，其中仅很少的序列有改变或变化。

抗原结合位点通常可由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)免疫球蛋白结构域形成，其中抗原结合界面由称为互补决定区(CDR)的六个表面多肽环形成。VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中各有三个CDR，以及框架区(FR)。

术语“CDR区”或“CDR”可意指由Kabat等人,1991(Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版US Department of Healthand Human Services,Public Service,NIH,Washington)和后来的版本定义的免疫球蛋白重链或轻链的高变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。

已表明，完整抗体的片段也可结合抗原。结合片段的例子包括：(i)由VL、VH、CL和Ch1结构域组成的Fab片段(Ward,E.S.等人,(1989)Nature 341,544-546)；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段(McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554)；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段(Holt等人,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)；(iv)dAb片段(Ward,E.S.等人,Nature 341,544-546(1989)，McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554,Holt等人,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490]，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')₂片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等人,(1988)Science,242,423-426，Huston等人,(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US 92109965)和(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804；Holliger,P.(1993)等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)。

Fv、scFv或双抗体分子可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Reiter,Y.等人,Nature Biotech,14,1239-1245,1996)。还可制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu,S.等人,(1996)Cancer Res.,56,3055-3061)。结合片段的其他例子可以是Fab'，其通过在重链CH1结构域的羧基末端处添加少量残基而不同于Fab片段，所述少量残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸；以及可以是Fab'-SH，其为其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'片段。

当在本文中使用时，“Fv”可指抗体的保留抗原识别和抗原结合位点两者的最小片段。当在本文中使用时，“Fab”可指抗体的包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的片段。术语“mAb”是指单克隆抗体。

术语“含有半胱天冬酶激活招募结构域(CARD)的细胞凋亡相关Speck样蛋白”和“ASC”意指ASC基因或其同种型的表达产物，或与ASC(例如，人体中的NP_037390(Q9ULZ3-1)、NP_660183(Q9ULZ3-2)或Q9ULZ3-3，鼠中的NP_075747或大鼠中的NP_758825(BAC43754))具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出ASC功能活性的蛋白质。蛋白质的“功能活性”是与蛋白质的生理功能相关的任何活性。ASC的功能活性包括例如招募蛋白质以激活半胱天冬酶-1和引发细胞死亡。

术语“ASC基因”或“ASC核酸”意指编码ASC的天然核酸序列(从其可转录ASC cDNA的基因组序列)，和/或前述的等位基因变体和同源物。所述术语包括双链DNA、单链DNA和RNA。

如本文所用，术语“炎性体”意指激活半胱天冬酶-1的多蛋白(例如，至少两种蛋白)复合物。此外，术语“炎性体”可指激活半胱天冬酶-1活性进而调节IL-1β、IL-18和IL-33的加工和激活的多蛋白复合物。参见Arend等人2008；Li等人2008；和Martinon等人2002，其各自通过引用以其全文并入。术语“NLRP1炎性体”、“NALP1炎性体”、“NLRP2炎性体”、“NALP2炎性体”、“NLRP3炎性体”、“NALP3炎性体”、“NLRC4炎性体”、“IPAF炎性体”或“AIM2炎性体”意指至少半胱天冬酶-1和一种衔接蛋白(例如ASC)的蛋白质复合物。例如，术语“NLRP1炎性体”和“NALP1炎性体”可意指含有NLRP1、ASC、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-11、XIAP和pannexin-1的多蛋白复合物，用于激活半胱天冬酶-1以及加工白细胞介素-1β、白细胞介素-18和白细胞介素-33。术语“NLRP2炎性体”和“NALP2炎性体”可意指含有NLRP2(又名NALP2)、ASC和半胱天冬酶-1的多蛋白复合物，而术语“NLRP3炎性体”和“NALP3炎性体”可意指含有NLRP3(又名NALP3)、ASC的多蛋白复合物，并且术语“NLRC4炎性体”和“IPAF炎性体”可意指含有NLRC4(又名IPAF)、ASC和半胱天冬酶-1的多蛋白复合物。另外地，术语“AIM2炎性体”可意指包含AIM2、ASC和半胱天冬酶-1的多蛋白复合物。

如本文所用，短语“序列同一性”意指当两个序列被比对以最大化亚基匹配(即考虑缺口和插入)时，在两个序列(例如，核酸序列、氨基酸序列)中的相应位置处的相同亚基的百分比。序列同一性可使用序列分析软件(例如，来自Accelrys CGC,San Diego,CA的序列分析软件包)测量。

短语“治疗有效量”和“有效剂量”意指足以产生治疗(例如，临床)所希望结果的量；所述结果的确切性质将根据所治疗障碍的性质而变化。例如，在被治疗的疾障碍是SCI的情况下，所述结果可以是运动技能和运动功能的改善、脊髓损伤的减少等。可将本文所述的组合物每天一次或多次至每周一次或多次给予。本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和定时，这些因素包括但不限于，疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。

如本文所用，术语“治疗”定义为向患者应用或给予本文所述或由本文所述方法鉴定的治疗剂，或者向来自患者的分离组织或细胞系应用或给予所述治疗剂，所述患者具有疾病、疾病症状或疾病倾向，所述应用或给予治疗剂的目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、缓和或影响疾病、疾病的症状或疾病倾向。

术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且意指待治疗的哺乳动物受试者，优选人患者。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用和疾病动物模型的开发，所述动物模型包括但不限于啮齿动物(包括小鼠、大鼠和仓鼠)以及灵长类动物。

如本文可互换使用的，“黑色素瘤缺乏因子2”和“AIM2”可意指AIM2基因或同种型的表达产物；或与AIM2(例如，登录号NX_014862、NP004824、XP016858337、XP005245673、AAB81613、BAF84731、AAH10940)具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出AIM2功能活性的蛋白质。

如本文可互换使用的，“NALP1”和“NLRP1”意指NALP1或NLRP1基因或同种型的表达产物；或与NALP1(例如，登录号AAH51787、NP_001028225、NP_127500、NP_127499、NP_127497、NP055737)具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出NALP1功能活性的蛋白质。

如本文可互换使用的，“NALP2”和“NLRP2”意指NALP2或NLRP2基因或同种型的表达产物；或与NALP2(例如，登录号NP_001167552、NP_001167553、NP_001167554或NP_060322)具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出NALP2功能活性的蛋白质。

如本文可互换使用的，“NALP3”和“NLRP3”意指NALP3或NLRP3基因或同种型的表达产物；或与NALP3(例如，登录号NP_001073289、NP_001120933、NP_001120934、NP_001230062、NP_004886、NP_899632、XP_011542350、XP_016855670、XP_016855671、XP_016855672或XP_016855673)具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出NALP3功能活性的蛋白质。

如本文可互换使用的，“NLRC4”和“IPAF”意指NLRC4或IPAF基因或同种型的表达产物；或与NLRC4(例如，登录号NP_001186067、NP001186068、NP_001289433或NP_067032)具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并展示出NLRC4功能活性的蛋白质。

术语“中风”和“缺血性中风”意指血流被中断到脑或脊髓的一部分时的情况。

“CNS的创伤性损伤”意指来自外部机械力的任何CNS损伤，可能导致CNS功能的永久性或暂时性损害。

术语“抗体”旨在包括通过任何已知技术(诸如但不限于酶促切割、肽合成或重组技术)提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、人源化抗体、针对可以按可溶或结合形式被标记的抗体的抗独特型(抗Id)抗体，以及其片段、区域或衍生物。本发明的这种抗ASC和抗NLRP1抗体能够分别结合干扰半胱天冬酶-1激活的ASC和NLRP1部分。

本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。此类技术通常是本领域已知的，并且在方法学论文中详细描述，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,第1-3卷,ed.Sambrook等人,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001；和Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel等人,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)。免疫学技术通常是本领域已知的，并且在方法学论文中详细描述，诸如Advances in Immunology,第93卷,ed.Frederick W.Alt,Academic出版社,Burlington,MA,2007；Making and UsingAntibodies:A Practical Handbook,eds.Gary C.Howard and Matthew R.Kaser,CRC出版社,Boca Raton,FL,2006；Medical Immunology,第6版,由Gabriel Virella编辑,InformaHealthcare出版社,London,England,2007；和Harlow and Lane ANTIBODIES:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,NY,1988。

虽然与本文所述的那些组合物和方法类似或等同的组合物和方法可用于本发明的实践或测试，但以下描述合适的组合物和方法。本文提及的所有出版物、专利申请和专利均通过引用以其全文并入。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。以下讨论的特定实施方案仅是说明性而不旨在是限制性的。

概述

本文提供了用于减少已经经受导致或引起肺炎症的病症或受其折磨的哺乳动物的肺部炎症的组合物和方法。本文所述的组合物和方法可包括特异性地结合哺乳动物炎性体的至少一种组分(例如，ASC)的如本文提供的抗体或其活性片段，和/或调节(例如，抑制或减少)细胞外囊泡(EV)摄取的化合物；并可用作哺乳动物肺炎症的治疗。

本文描述了用于减少患有导致和/或引起肺炎症反应的病症的哺乳动物的肺部炎症的方法。在一个实施方案中，治疗哺乳动物肺部炎症的方法包括向哺乳动物给予一种包含抑制炎性体信号传导的药剂的组合物。哺乳动物可以是如本文提供的患者或受试者。可导致肺部炎症的病症的例子包括中枢神经系统(CNS)损伤(例如，脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)或中风)、神经变性疾病、自身免疫疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、间质性肺病或急性呼吸窘迫综合征。可以按治疗有效量给予所述组合物。治疗有效量可以是如本文提供的剂量。所述药剂可以是细胞外囊泡(EV)摄取抑制剂、结合炎性体组分的如本文提供的抗体或其活性片段、或其组合。可将所述组合物通过任何合适的途径给予，例如，通过吸入、静脉内、腹膜内或脑室内给予。所述组合物可进一步包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

在一个实施方案中，所述药剂的给予可导致受试者肺中哺乳动物炎性体组分的活性和/或表达水平降低。所述降低可在肺细胞(例如像II型肺泡细胞)中。所述降低可与对照相比。所述对照可以是给予所述药剂之前的受试者。所述对照可以是未给予所述药剂的受试者中一种或多种炎性体组分的活性和/或表达水平。在一个实施方案中，所述药剂的给予导致受试者至少肺或肺细胞中的半胱天冬酶-1激活的减少。在一个实施方案中，所述药剂的给予导致受试者至少肺或肺细胞中的一种或多种炎性体组分(例如，ASC、AIM2、NALP1、NALP2、NALP2、NALP3或NLRC4)的表达水平降低。

在另一个实施方案中，所述药剂的给予可导致急性肺损伤(ALI)的减少或消除。在一个实施方案中，ALI的减少通过嗜中性粒细胞到肺泡和/或间质空间中的浸润减少、肺泡间隔增厚减少或不存在、或其组合来证明。所述降低可与对照相比。所述对照可以是给予所述药剂之前的受试者的ALI。所述对照可以是未给予所述药剂的患有ALI的受试者的ALI。

在再另一个实施方案中，所述药剂的给予可导致受试者肺中细胞焦亡的减少或消除。细胞焦亡是促炎形式的细胞死亡，其涉及激活半胱天冬酶-1。细胞焦亡可由半胱天冬酶-1介导的对消皮素D(GSDMD)的切割触发。在一个实施方案中，细胞焦亡的减少通过在受试者肺或肺细胞(例如，II型肺泡细胞)中减少或缺乏GSDMD切割来证明。细胞焦亡的减少或消除可与对照相比。GSDMD切割的减少或缺乏可与对照相比。所述对照可以是给予所述药剂之前的受试者的细胞焦亡水平。所述对照可以是未给予所述药剂的患有细胞焦亡的受试者的细胞焦亡水平。

在一个实施方案中，待给予的药剂是EV摄取抑制剂。EV摄取抑制剂可以是如本文提供的化合物、反义RNA、siRNA、肽、抗体或其活性片段，或其组合。所述化合物或肽可以是一种或多种选自以下的化合物：肝素、α-二氟甲基甲基鸟氨酸(DFMO)、依诺肝素、去唾液酸胎球蛋白(Asialofetuin)、人受体相关蛋白(RAP)、RGD(Arg-Gly-Asp)肽、细胞松弛素D、细胞松弛素B、乙二胺四乙酸(EDTA)、拉春库林(Latrunculin)A、拉春库林B、NSC23766、Dynasore、氯丙嗪、5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、阿米洛利、巴弗洛霉素A莫能菌素和氯喹、膜联蛋白-V、渥曼青霉素、LY294002、甲基-β-环糊精(MβCD)、菲律宾菌素、辛伐他汀、伏马菌素B1和N-丁基脱氧野尻霉素盐酸盐、U0126或质子泵抑制剂。如本文提供的EV摄取抑制剂抗体或其活性片段可以是针对表1中列出的蛋白质靶标的一种或多种抗体或其活性片段。使用EV摄取抑制剂治疗和/或减少哺乳动物肺部炎症的组合物可进一步包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

表1.示例性靶标和用于阻断EV摄取的对应抗体。

在一个实施方案中，待给予的药剂是如本文提供的抗体或其活性片段，其针对哺乳动物炎性体组分或由其衍生的抗原或表位。在另一个实施方案中，待给予的药剂是针对哺乳动物炎性体组分的反义RNA或siRNA。炎性体组分可以是本领域已知的任何炎性体(例如像，NAPL1、NALP2、NALP3、NLRC4或AIM2炎性体)的组分。在典型的实施方案中，所述抗体特异性地结合ASC或由其衍生的抗原或表位。然而，可使用针对哺乳动物炎性体(例如，NALP1、NALP2、NALP3、NLRC4或AIM2炎性体)的任何其他组分的抗体。

如本文所述的抗体可以是单克隆或多克隆抗体或其活性片段。所述抗体或活性片段可以是如本文所述的嵌合的、人的或人源化的。

可使用特异性地结合ASC的如本文提供的任何合适的抗体或其活性片段，例如，抑制受试者肺细胞(例如，II型肺泡细胞)中ASC活性的抗体。在典型的实施方案中，所述抗体特异性地结合与氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。类似地，在另一个实施方案中，所述炎性体是NALP1炎性体，并且所述至少一种组分是NALP1(即，NLRP1)。在此实施方案中，如本文提供的抗体或其活性片段特异性地结合与氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在又另一个实施方案中，所述药剂是一种或多种EV摄取抑制剂与结合炎性体组分的如本文提供的一种或多种抗体或其活性片段的组合。EV摄取抑制剂可以是如本文提供的任何EV摄取抑制剂。结合炎性体组分的抗体可以是结合如本文提供的任何炎性体组分的任何抗体。在一个实施方案中，向患有肺炎症的受试者给予的药剂包含肝素(例如，依诺肝素)与结合AIM2炎性体组分(例如，ASC)的抗体的组合。

在一个实施方案中，所述方法包括：提供治疗有效量的组合物，其包括特异性地结合哺乳动物炎性体(例如，AIM2炎性体)的至少一种组分(例如，ASC)的如本文提供的抗体或其活性片段；并且向患有肺炎症的哺乳动物给予所述组合物，其中向所述哺乳动物给予所述组合物导致哺乳动物肺中半胱天冬酶-1激活的减少。在另一个实施方案中，所述方法包括：提供治疗有效量的组合物，其包括特异性地结合哺乳动物炎性体(例如，AIM2炎性体)的至少一种组分(例如，ASC)的抗体；并且向患有肺炎症的哺乳动物给予所述组合物，其中向所述哺乳动物给予所述组合物导致一种或多种炎性体组分(例如，ASC)的水平降低。在又另一个实施方案中，所述方法包括：提供治疗有效量的组合物，其包括特异性地结合哺乳动物炎性体(例如，AIM2炎性体)的至少一种组分(例如，ASC)的抗体；并且向患有肺炎症的哺乳动物给予所述组合物，其中向所述哺乳动物给予所述组合物导致ALI降低。肺炎症可以是CNS损伤(例如，SCI或TBI)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、神经变性疾病或具有炎症组分的自身免疫疾病的结果。在一个实施方案中，肺炎症由CNS损伤(诸如TBI或SCI)引起。

在一个实施方案中，本文提供的方法还需要检测来自怀疑患有肺炎症的受试者的样品中哺乳动物炎性体的一种或多种组分的水平或活性。检测水平或活性的方法需要测量从受试者获得的样品中至少一种炎性体蛋白(例如，ASC或AIM2)的水平；确定所述至少一种炎性体蛋白(例如，ASC或AIM2)的升高水平或活性的存在或不存在。所述至少一种炎性体蛋白的水平或活性可能相对于对照样品中所述至少一种炎性体蛋白的水平而增强。蛋白质特征中的所述至少一种炎性体蛋白的水平或活性可能相对于预定参考值或参考值范围而增强。所述至少一种炎性体蛋白可以是结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白1(NLRP1)、NLRP2、NLRP3、NLRC4、AIM2、含有半胱天冬酶激活招募结构域的细胞凋亡相关Spec样蛋白(ASC)、半胱天冬酶-1或其组合。所述样品可以是脑脊液(CSF)、唾液、血液、血清、血浆、尿液或肺吸出物。

特异性地结合哺乳动物炎性体的至少一种组分的抗体

本文所述的用于减少哺乳动物肺部炎症的方法包括组合物，所述组合物包括特异性地结合哺乳动物炎性体(例如，AIM2炎性体)的至少一种组分(例如，ASC、AIM2)的如本文提供的抗体或其活性片段。用于治疗和/或减少哺乳动物肺部炎症的组合物可进一步包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。针对用于本文方法的哺乳动物炎性体组分的示例性抗体可以是US 8685400中发现的那些，其内容通过引用以其全文并入本文。

在一个实施方案中，用于治疗和/或减少哺乳动物肺部炎症的组合物包括如本文提供的抗体或其活性片段，所述抗体或其活性片段特异性地结合哺乳动物ASC蛋白(例如像人小鼠、或大鼠ASC蛋白)的结构域或其部分。可使用任何合适的抗ASC抗体，并且几种是可商购获得的。用于本文方法的抗ASC抗体的例子可以是US 8685400中发现的那些，其内容通过引用以其全文并入本文。用于本文提供方法的可商购获得的抗ASC抗体的例子包括但不限于04-147抗ASC、来自MilliporeSigma的克隆2EI-7小鼠单克隆抗体、来自MilliporeSigma的AB3607-抗ASC抗体、来自Biorbyt的orb194021抗ASC、来自LifeSpan Biosciences的LS-C331318-50抗ASC、来自R&D Systems的AF3805抗ASC、来自Novus Biologicals的NBP1-78977抗ASC、来自RocklandImmunochemicals的600-401-Y67抗ASC、来自MBLInternational的D086-3抗ASC、来自Adipogen的AL177抗ASC、单克隆抗ASC(克隆o93E9)抗体、来自Santa Cruz Biotechnology的抗ASC抗体(F-9)、来自Santa Cruz Biotechnology的抗ASC抗体(B-3)、来自Enzo Life Sciences的ASC多克隆抗体-ADI-905-173或A161抗人ASC-Leinco Technologies。人ASC蛋白可以是登录号NP_037390.2(Q9ULZ3-1)、NP_660183(Q9ULZ3-2)或Q9ULZ3-3。大鼠ASC蛋白可以是登录号NP_758825(BAC43754)。小鼠ASC蛋白可以是登录号NP_075747.3。在一个实施方案中，所述抗体结合哺乳动物ASC蛋白(例如人、小鼠或大鼠ASC)的PYRIN-PAAD-DAPIN结构域(PYD)或其部分或片段。在此实施方案中，如本文所述的抗体特异性地结合与人、小鼠或大鼠ASC的PYD结构域或其片段具有至少65％(例如，65％、70％、75％、80％、85％)序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体结合哺乳动物ASC蛋白(例如人、小鼠或大鼠ASC)的C末端半胱天冬酶-招募结构域(CARD)或其部分或片段。在此实施方案中，如本文所述的抗体特异性地结合与人、小鼠或大鼠ASC的CARD结构域或其片段具有至少65％(例如，65％、70％、75％、80％、85％)序列同一性的氨基酸序列。在再另一个实施方案中，所述抗体结合哺乳动物ASC蛋白序列(例如人、小鼠或大鼠ASC)的位于PYD与CARD结构域之间的部分或其片段。在另一个实施方案中，用于治疗和/或减少哺乳动物肺部炎症的组合物包括特异性地结合大鼠ASC的区域(例如氨基酸序列ALRQTQPYLVTDLEQS(SEQ ID NO:1))(即，大鼠ASC的残基178-193，登录号BAC43754)的抗体。在此实施方案中，如本文所述的抗体特异性地结合与大鼠ASC的氨基酸序列ALRQTQPYLVTDLEQS(SEQ ID NO:1)具有至少65％(例如，65％、70％、75％、80％、85％)序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，用于治疗和/或减少哺乳动物CNS中炎症的组合物包括特异性地结合人ASC的区域(例如氨基酸序列RESQSYLVEDLERS(SEQ ID NO:2))的抗体。在一个实施方案中，如本文所述的结合ASC结构域或其片段的抗体抑制哺乳动物肺细胞(例如II型肺泡细胞)中的ASC活性。

在另一个实施方案中，用于减少哺乳动物肺部炎症的组合物包括如本文提供的抗体或其活性片段，其特异性地结合NLRP1(例如，抗NLRP1鸡抗体)或其结构域。可使用任何合适的抗NLRP1抗体，并且几种是可商购获得的。用于本文方法的抗NLRP1抗体的例子可以是US 8685400中发现的那些，其内容通过引用以其全文并入本文。用于本文提供方法的可商购获得的抗NLRP1抗体的例子包括但不限于来自R&D Systems的人NLRP1多克隆抗体AF6788、EMD Millipore兔多克隆抗NLRP1ABF22、Novus Biologicals兔多克隆抗NLRP1NB100-56148、Sigma-Aldrich小鼠多克隆抗NLRP1SAB1407151、Abcam兔多克隆抗NLRP1ab3683、Biorbyt兔多克隆抗NLRP1orb325922mybiosource兔多克隆抗NLRP1MBS7001225、R&D systems sheep多克隆AF6788、Aviva Systems小鼠单克隆抗NLRP1oaed00344、Aviva Systems兔多克隆抗NLRP1ARO54478_P050、Origene兔多克隆抗NLRP1APO7775PU-N、Antibodies online兔多克隆抗NLRP1ABIN768983、Prosci兔多克隆抗NLRP13037、Proteintech兔多克隆抗NLRP1 12256-1-AP、Enzo小鼠单克隆抗NLRP1ALX-804-803-C100、Invitrogen小鼠单克隆抗NLRP1MA1-25842、GeneTex小鼠单克隆抗NLRP1GTX16091、Rockland兔多克隆抗NLRP1 200-401-CX5或Signaling Technology兔多克隆抗NLRP1 4990。人NLRP1蛋白可以是登录号AAH51787、NP_001028225、NP_055737、NP_127497、NP_127499或NP_127500。在一个实施方案中，所述抗体结合哺乳动物NLRP1蛋白(例如人NLRP1)的Pyrin、NACHT、LRR1-6、FIIND或CARD结构域、或其部分或片段。在此实施方案中，如本文所述的抗体特异性地结合与人NLRP1的特定结构域(例如，Pyrin、NACHT、LRR1-6、FIIND或CARD)或其片段具有至少65％(例如，65％、70％、75％、80％、85％)序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，将由Ayes Laboratories定制设计和生产的鸡抗NLRP1多克隆用于减少肺炎症。此抗体可针对人NLRP1中的以下氨基酸序列：CEYYTEIREREREKSEKGR(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，如本文所述的结合NLRP1结构域或其片段的抗体抑制哺乳动物肺细胞(例如II型肺泡细胞)中的NLRP1活性。

在又另一个实施方案中，用于减少哺乳动物肺部炎症的组合物包括如本文提供的抗体或其活性片段，所述抗体或其活性片段特异性地结合AIM2或其结构域。可使用任何合适的抗AIM2抗体，并且几种是可商购获得的。用于本文提供方法的可商购获得的抗AIM2抗体的例子包括但不限于来自Proteintech的兔多克隆抗AIM2目录号20590-1-AP、Abcam抗AIMS抗体(ab119791)、来自ECM biosciences的兔多克隆抗AIM2(N末端区域)目录号AP3851、来自Elabsciences的兔多克隆抗ASC目录号E-AB-30449、来自Santa CruzBiotechnology的具有目录号sc-293174的称为AIM2抗体(3C4G11)的抗AIM2小鼠单克隆抗体、来自Origene的具有目录号TA324972的小鼠单克隆AIM2抗体、来自ThermofisherScientific的AIM2单克隆抗体(10M2B3)、来自Antibodies-online的AIM2兔多克隆抗体ABIN928372或ABIN760766、具有目录号CAE02153的Biomatix coat抗AIM2多克隆抗体。来自viva Systems Biology的抗AIM2多克隆抗体(OABF01632)、来自LSBio-C354127的兔多克隆抗AIM2抗体LS-C354127、具有目录号MA5-16259的来自Signaling Technology的兔单克隆抗AIM2抗体。来自Fab Gennix International Incorporated的兔多克隆抗AIM2单克隆抗体目录号AIM2 201AP、MyBiosource兔多克隆抗AIM2目录号MBS855320、Signalway兔多克隆抗AIM2目录号36253、Novus Biological兔多克隆抗AIM2目录号43900002、GeneTex兔多克隆抗AIM2GTX54910、Prosci兔多克隆抗AIM2 26-540、Biorbyt小鼠单克隆抗AIM2orb333902、Abcam兔多克隆抗AIM2ab93015)、Abcam兔多克隆抗AIM2ab76423、SignmaAldrich小鼠多克隆抗AIM2SAB1406827或Biolegend抗AIM2 3B10。人AIM2蛋白可以是登录号NX_014862、NP004824、XP016858337、XP005245673、AAB81613、BAF84731或AAH10940。在一个实施方案中，所述抗体结合哺乳动物AIM2蛋白(例如人AIM2)的Pyrin或HIN-200结构域、或其部分或片段。在此实施方案中，如本文所述的抗体特异性地结合与人AIM2的特定结构域(例如，Pyrin或HIN-200)或其片段具有至少65％(例如，65％、70％、75％、80％、85％)序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，如本文所述的结合AIM2结构域或其片段的抗体抑制哺乳动物肺细胞(例如II型肺泡细胞)中的AIM2活性。

如本文所述的抗炎性体(例如，抗ASC、抗NLRP1或抗AIM2)抗体包括具有免疫球蛋白可变区的至少一个抗原结合区的多克隆和单克隆啮齿动物抗体、多克隆和单克隆人抗体或其任何部分，所述抗体特异性地结合哺乳动物炎性体(例如，AIM2炎性体)的组分(例如像ASC或AIM2)。在一些情况下，所述抗体对ASC具有特异性，使得如果抗体针对多肽的表位产生并且结合至少部分天然或重组蛋白，则所述抗体对ASC具有特异性。

用于通过竞争性抑制确定单克隆抗体特异性和亲和力的方法可发现于Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988，Colligan等人编辑,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601,1983中，所述参考文献通过引用以其全文并入本文。

本发明的抗炎性体(例如，抗ASC和抗AIM2)抗体可根据诸如但不限于以下的方法常规制备：用多肽或抗原片段接种适当的动物、体外刺激淋巴细胞群、合成方法、杂交瘤和/或表达编码此类抗ASC或抗NLR1抗体的核酸的重组细胞。使用纯化的重组ASC或其肽片段(例如，大鼠ASC(例如，登录号BAC43754)的残基178-193(SEQ ID NO:1)或人ASC的SEQ IDNO:2对动物进行免疫是一种制备抗ASC抗体的方法的例子。类似地，使用纯化的重组NLRP1或其肽片段(例如，大鼠NALP1的残基MEE SQS KEE SNTEG-cys(SEQ ID NO:4)或人NALP1的SEQ ID NO:3对动物进行免疫是一种制备抗NLRP1抗体的方法的例子。

特异性地结合ASC或NLRP1的单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler和Milstein,Nature 256:495-497,1975；美国专利号4,376,110；Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience,N.Y.,(1987,1992)；Harlow and Lane ANTIBODIES:A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,NY,1988；Colligan等人编辑,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，其内容通过引用以其全文并入本文。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可在体外、原位或体内培养。

组合物的给予

可以将本发明的组合物以任何合适的配制品向哺乳动物(例如，啮齿动物、人)给予。例如，抗ASC抗体可配制在药学上可接受的载体或稀释剂(诸如生理盐水或缓冲盐溶液)中。可基于给予模式和途径以及标准药学实践来选择合适的载体和稀释剂。示例性药学上可接受的载体和稀释剂以及药物配制品的描述可发现于Remington's PharmaceuticalSciences(此领域的标准文本)和USP/NF中。可向组合物中添加其他用以稳定和/或保存所述组合物的物质。

可通过任何常规技术向哺乳动物给予本发明的组合物。通常，这种给予将通过吸入或肠胃外(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、肌肉内、腹膜内或鞘内引入)。还可将所述组合物通过例如外科手术递送至内部或外部靶位点或通过导管递送至血管可接近的位点来直接给予至靶位点。可以将所述组合物通过单次推注、多次注射或通过连续输注(例如，静脉内、通过腹膜透析、泵输注)给予。对于肠胃外给予，所述组合物优选地被配制成无菌的无热原形式。

有效剂量

优选地将上述组合物以有效量(即，能够在经治疗的哺乳动物中产生所希望结果(例如，减少经受CNS的创伤性损伤或中风或患有自身免疫疾病或CNS疾病的哺乳动物CNS的炎症)的量)给予至哺乳动物(例如，大鼠、人)。可如下所述地确定有这种治疗有效量。

用于本发明方法的组合物的毒性和治疗功效可通过如下标准药学程序来确定：使用培养细胞或实验动物中的细胞来确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)。在毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可表示为LD₅₀/ED₅₀的比率。那些表现出大治疗指数的组合物是优选的。虽然可使用那些表现出毒副作用的组合物，但应注意可设计一种最小化此类副作用的潜在损害的递送系统。优选组合物的剂量优选地处于包括ED₅₀同时具有极小或无毒性的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的给予途径而在这个范围内变化。

如在医学和兽医领域中熟知的，用于任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括受试者的大小、体表面积、年龄、待给予的具体组合物、给予时间和途径、一般健康状况以及同时给予的其他药物。

实施例

本发明通过以下特定实施例进一步进行说明。提供所述实施例仅用于说明，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：EV介导的炎性体信号传导在TBI后ALI中的作用及其中和作用

肺功能障碍经常表现为严重创伤性脑损伤的并发症(1)。大约20％-25％的TBI受试者发展急性肺损伤(ALI)(2)，但介导TBI诱导的ALI病理的机制仍然定义不明确。先前的文献支持以下观点：TBI后肺功能障碍是由于对颅内压升高的交感神经反应导致心肺功能障碍(42)。然而，最近的研究表明，全身炎症反应在TBI诱导的肺损伤中也起着关键作用(43)。具体地，HMGB1-RAGE配体受体途径作为TBI后肺功能障碍的中枢转导机制(8)。此外，HMGB1诱导AIM2炎性体激活(37)。此外，先前的文献揭示病原体分泌携带DAMP(诸如HMGB1)的EV，并触发炎症(Buzas等人,2014)。各种研究表明，早在损伤后3-6小时，TBI后血脑屏障(BBB)是可渗透的，导致脑与血管内隔室之间的保护屏障受损，并导致蛋白质和流体渗漏(44)。损伤后BBB的破坏导致炎症介质(诸如DAMP)的分泌，这可能进一步导致脑部炎症并损伤远端器官(5)。几种炎症介质可作为脑损伤的明确标记物，然而其有效性尚未被广泛接受(45)。此外，目前还没有针对TBI诱导的ALI的临床批准的治疗或生物标记物。最近，EV已成为几种不同类型疾病(包括肺损伤(46)和TBI(47))的生物标记物研究中感兴趣的领域。先前已表明，在从患有TBI的患者的脑脊液分离的EV中，当与对照样品相比时，炎性体蛋白质增加(14)。在此实施例中，检查了EV介导的炎性体信号传导在TBI诱导的ALI的病因学中的贡献。

材料和方法

动物和创伤性脑损伤

所有动物程序均由迈阿密大学米勒医学院(University of Miami MillerSchool of Medicine)(动物福利保证A3224-01)的机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准，并根据实验动物护理及使用(Care and Use of Laboratory Animals)的NIH指南进行。在进行这项研究时遵循了ARRIVE指南。所有C57/BL6小鼠均为8-12周和24至32克。将小鼠前瞻性随机分组至用于TBI的实验组(假手术、4h、24h)、用于过继转移和治疗的实验组(原初、假手术-盐水、未治疗、依诺肝素、抗ASC)。对于TBI实验组，假手术动物接受外科手术但未受损伤。对于过继转移治疗研究，假手术-盐水组接受外科手术并接受盐水作为运载体治疗。原初动物不接受外科手术。基于功效分析(使用G*功效分析，其中效果大小F＝0.85，α设定为0.05)和历史数据^49,50，每组使用5至6个的样品大小。将所有小鼠圈养在迈阿密大学的Lois Pope生命中心的无病毒抗原(VAF)动物设施中，进行12小时光照/黑暗循环，并随意提供食物和水。所述设施每周两次进行饲养程序，并且每天检查动物的状况。在我们的手术室中在手术后观察动物，将它们保持在加热垫上，并用直肠探针控制体温，使其保持在37℃下，并且然后转移到动物宿舍。

在手术之前，用氯胺酮和甲苯噻嗪(腹膜内，i.p.)麻醉动物。然后将麻醉的动物置于加热垫上以确保体温为37℃。使用受控皮层撞击(CCI)模型进行TBI。在右侧皮质(后部-2.5mm、前囱侧部2.0mm)上进行5mm开颅术。使用ECCI-6.3装置(Custom Design&Fabrication,Richmond,VA,USA)诱导损伤，其中3mm的撞击承受器为6m/s的速度、0.8mm的深度和150ms的撞击持续时间(15)。在这些程序后，将动物放回笼中并给予食物和水。如上所述，在TBI后4小时和24小时处死动物。将假手术动物麻醉并使其经受与受损伤动物相同的手术前切口但未经历开颅术或挫伤。

组织收集

在灌注之前，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉所有动物。然后使动物接受气管灌注。使用气管导管在20cm H2O下对肺注入4％多聚甲醛(PFA)，并且然后在4℃下在4％PFA中固定过夜。将固定肺组织用石蜡包埋，并处理5μm切片(16)。收集右肺组织用于蛋白质分离和分子分析。然后使动物接受断头处死并收集右侧皮质组织用于蛋白质分离和分子分析。

焦亡小体分离测定

将小鼠肺组织裂解物通过5μm低结合聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)过滤。在过滤后，将上清液以2,700xg离心8分钟。将沉淀重悬于40μl 3[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-丙磺酸(CHAPS)缓冲液(20mmol/LHEPES-KOH，pH 7.5，5mmol/L MgCl2，0.5mmol/LEGTA，0.1mmol/L苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制剂混合物和0.1％CHAPS)中。通过以2,700xg离心8分钟来沉淀焦亡小体。然后将沉淀重悬浮并在27.8μl CHAPS缓冲液中与2.2μl二琥珀酰亚胺基底物(9)在室温下孵育30分钟以交联ASC二聚体。最后，添加等量的2x Laemmli缓冲液，并使用可商购的针对ASC和消皮素D(GSD)的抗体通过免疫印迹分析蛋白质。

细胞核和细胞质提取

根据制造商的说明，使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific)提取细胞核和细胞质级分。简而言之，将小鼠肺组织样品切成20-100mg碎片并以500x g离心5分钟。将组织碎片用细胞质提取试剂均化，并以16,000x g离心5分钟。然后除去上清液(细胞提取物)，并用细胞核提取试剂(Thermo Scientific)将沉淀以16,000x g离心10分钟。此上清液对应于细胞核级分，将其除去并储存在-80℃下。

免疫印迹

将肺和脑组织样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。将右下肺和右皮质组织的2mm切片在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma，St Louis，MO，USA)的提取缓冲液中均化，并如de Rivero Vaccari等人2015(13)所述，使用针对半胱天冬酶-1(NovusBiologicals)、ASC(Santa Cruz)、IL-1β(Cell Signaling)、IL-18(Abcam)、AIM2(SantaCruz)和HMGB1(Millipore)的抗体在4％-20％Tris-TGX Criterion预制凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中分解。使用Image Lab进行条带密度的量化，并将所有数据归一化为β-肌动蛋白。

免疫组织化学

将组织切片在二甲苯中脱石蜡，并且然后使用乙醇和Tris缓冲盐水再水化。然后如前所述进行免疫组织化学程序以进行双重染色(16)。将切片在4℃下与针对半胱天冬酶-1和ASC(Millipore)、AIM2(Santa Cruz)、HMGB1(Millipore)和SPC(Millipore)的抗体一起孵育过夜。用Zeiss激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss,Inc.,Thornwood,NY,USA)检查假手术、4小时和24小时小鼠的免疫染色肺切片。由对分组不知情的个体分析肺切片。

EV分离

根据制造商的说明书(Invitrogen)，使用总外泌体分离溶液从TBI损伤的小鼠和损伤小鼠的血清分离EV。简而言之，将100μl每种样品以2000x g离心30分钟。然后将上清液与20μl总外泌体分离(TEI)试剂在4℃下孵育30分钟，随后在室温下以10,000x g离心10分钟。弃去上清液，并且将沉淀重悬于100μl PBS中。EV由CD81的表达和Nanosight跟踪分析来表征(图6)。

EV的过继转移

将来自C57BL-6TBI和假手术小鼠的血清来源的EV通过颈静脉以1.0x10¹⁰个颗粒/克/体重⁴⁸的剂量注射到原初C57BL-6小鼠中。通过Nanosight跟踪分析测量颗粒计数，并相应地稀释样品。在手术之前，用氯胺酮和二甲苯麻醉动物。在颌骨与锁骨之间切开1-2cm的切口。将颈静脉抬高并系紧，随后放置导管。转移血清来源的EV并在注射后24小时收集肺和脑组织用于分析(n＝5)。

依诺肝素和抗ASC治疗

将来自TBI小鼠的血清来源的EV通过颈静脉注射注射到原初C57-BL6小鼠中。1小时后，将依诺肝素(3mg/kg)(n＝4)和抗ASC(5mg/kg)(n＝4)给予至受体动物。使用以下组：1)原初组未接受治疗，2)假手术盐水组用作阴性对照并且仅接受颈静脉注射盐水，3)未治疗组接受来自未经任何治疗的TBI小鼠的EV，并用作阳性对照，4)ENOX组接受来自TBI小鼠的EV和依诺肝素，和5)抗ASC组接受来自TBI小鼠的EV和抗ASC。治疗的顺序是随机化的。在注射后24小时收集肺和脑组织用于分析。应注意，在治疗实验中使用的抗ASC抗体是针对ASC的人源化单克隆抗体并且识别鼠、人和猪ASC。

组织学和肺损伤评分

通过标准苏木精和伊红方法对肺组织切片进行染色，用于组织学、形态测定和ALI评分。使用来自美国胸科协会研讨会报告的肺损伤评分系统，由不知情的病理学家对肺切片进行评分(17)。选择20个随机高倍视野进行评分。ALI评分的标准是基于肺泡腔中的中性粒细胞数、间质空间、透明膜、填充空气空间的蛋白质碎片和肺泡间隔增厚。基于这些标准，给出了0(无损伤)与1(严重损伤)之间的得分。

统计分析

使用针对两组的学生T检验和单向ANOVA以及针对两个或更多个组的Tukey多重比较检验(GraphPad Prism版本7.0)分析数据。将D'Agostino-Pearson检验用于检验正态性。数据表示为平均值+/-SEM。使用的显著性P值是*p<0.05。

结果

严重TBI增加小鼠脑中的AIM2炎性体蛋白和HMGB1表达

过量的促炎细胞因子IL-1β和IL-18以及炎性体蛋白与液压脑损伤后继发性损伤相关(18)。为了确定严重CCI是否诱导促炎细胞因子的加工和炎性体蛋白水平的改变，分析皮质裂解物，然而对严重TBI中的炎性体激活的研究有限。在此实施例中，在严重CCI后，检查损伤后4小时和24小时皮质裂解物的半胱天冬酶-1(图1A、B)(p<.001)、ASC(图1A、C)(p＝.003)、IL-18(图1A、D)(p＝.0042)、AIM2(图1A、F)(p＝0.0197)和IL-1β(图1A、G)(p＝0.0141)水平。半胱天冬酶-1、ASC、AIM2和IL-1β的水平在CCI后4小时达到峰值并在24小时降低。炎症细胞因子成熟的时间历程略有不同，其在TBI后24小时达到峰值。由于其他蛋白质已显示出炎性体DAMP HMGB1激活AIM2炎性体的作用，因此在皮质裂解物中也测定了这些蛋白质的水平。如图1A、1E所示，CCI在损伤后4小时和24小时诱导HMGB1水平的显著增加(图1A、1E)(p＝0.0121)。这些数据表明，在小鼠严重CCI后，AIM2炎性体蛋白的水平在损伤后皮质中显著升高。

严重TBI增加小鼠肺上的AIM2炎性体蛋白和HMGB1表达

为了确定CCI是否在肺中诱导炎性体激活，进行肺裂解物的半胱天冬酶-1(图1H，I)(p＝.0026)、ASC(图1H、J)(p＝.0427)、IL-18(图1H、K)(p＝.0025)、IL-1β(图1H、N)(p＝.0012)和AIM2(p＝.0012)(p<.001)和NLRP3(p＝.0047)(补充图1)的印迹分析。与假手术对照相比，在损伤后4小时和24小时，半胱天冬酶-1、ASC、IL-18和AIM2的增加水平显著提高。然而，蛋白质表达增加的时间历程与在脑中观察到的时间历程略有不同，它们在CCI后24小时达到峰值。由于HMGB1-RAGE轴在TBI诱导肺功能障碍的机制中起作用(8)，因此分析肺裂解物的HMGB1蛋白表达水平。图1H、1L(p＝.0158)显示在TBI后4小时和24小时HMGB1表达增加，这表明AIM2炎性体和HMGB1在TBI后肺中的炎症反应中起作用。

TBI诱导小鼠肺中的细胞焦亡

如前所示，皮质神经元中AIM2炎性体的激活导致细胞凋亡性细胞死亡(19)。为了研究TBI是否导致小鼠肺组织中的细胞焦亡，在TBI后分离肺组织中的焦亡小体。在损伤后4小时处死的TBI动物显示出与假手术动物相比ASC寡聚化的证据(图4A)。在TBI动物中观察到ASC二聚体和三聚体(分别为50、75kDA)。这些结果表明了焦亡小体的形成，其可通过ASC寡聚物的超分子组装来表征。此外，与假手术相比，在激活半胱天冬酶-1后被切割并触发细胞焦亡和释放IL-1β(20)的消皮素D(GSDMD)在TBI动物的肺中显著增加(图4B和4C)(p＝0.0001)。这些发现表明，在TBI后，细胞焦亡有助于肺组织中的细胞死亡。

TBI增加II型肺泡上皮细胞中炎性体蛋白的免疫反应性

TBI可能导致毛细血管渗漏，从而导致血管通透性增加，并对专门的肺泡上皮细胞(称为II型肺细胞)造成损害(5)。为了检查TBI对损伤后肺中炎性体表达的细胞效应，在假手术、4小时和24小时受损伤动物的肺切片中进行免疫组织化学分析。已知II型肺泡上皮细胞是ALI中损伤的主要肺细胞类型(17)。用针对AIM2、半胱天冬酶-1和ASC(绿色)的抗体对肺切片进行染色，并用Pro-表面活性蛋白C(Pro-SPC，红色)(其为II型上皮细胞的标记物)和DAPI细胞核染色(蓝色)共染色。如图2A-2C所示，活性半胱天冬酶-1(图2A)、ASC(图2B)以及AIM2(图2C)存在于SPC阳性细胞(箭头)中。TBI后这些炎性体蛋白的免疫反应性增加。这些发现表明炎性体蛋白在II型肺泡上皮细胞中表达，并且TBI导致这些细胞中的免疫反应性增加。

TBI增加细胞核和细胞质HMGB1表达

为了确定TBI后肺细胞中HMGB1的细胞分布，分离来自肺匀浆的细胞核和细胞质级分(图3A、3C)(p＝.0337)。免疫印迹表明两种级分在TBI后4小时HMGB1表达显著增加(图3B、3D)(p＝.0345)。还进行了HMGB1的免疫组织化学分析以确定TBI后肺切片中免疫反应性的变化。针对HMGB1(绿色)和SPC(红色)以及DAPI细胞核染色(蓝色)对切片进行共染色。当与假手术相比时，HMGB1的免疫反应性在4小时和24小时增加。在SPC阳性细胞中观察到HMGB1的弱免疫反应性(箭头)(图3E)；因此，提示损伤肺组织中HMGB1的变化可能是细胞质的。

TBI诱导肺形态的变化并诱导ALI

ALI的特征可在于炎症过程，其导致肺泡和间质水肿以及炎性细胞浸润到肺泡腔中(23)。肺组织的组织病理学分析(图5A)表明严重TBI在损伤后4和24小时引起肺结构和形态学显著变化。假手术动物显示出正常的肺泡形态，而受损伤动物显示出肺泡水肿的急剧变化，但在受损伤后24小时略有下降(长箭头)。此外，存在两个时间点处中性粒细胞浸润(箭头)和肺泡毛细血管膜形态学变化(*)的证据。受损伤动物显示出间质水肿的迹象，其在损伤后4小时更明显，但在损伤后24小时仍然明显(短箭头)。最后，受损伤动物还显示出间质区域和肺泡间隔增厚(磅，#)的证据。

为了确认严重损伤诱导ALI，使用由美国胸科协会定义的ALI评分系统分析组织切片(17)。此系统基于以下证据：中性粒细胞浸润到肺泡和间质空间中、透明膜形成、填充空气空间的蛋白质碎片和肺泡间隔增厚(17)。与假手术相比，这些特征在受损伤动物中显著升高，并且TBI动物中的ALI得分总体上更高(图5B)(p＝0.0017)。

在过继转移来自TBI小鼠的EV后依诺肝素和抗ASC抗体治疗显著减少炎性体表达和ALI

为了提供在TBI后可释放到循环中的EV及其货物可在肺中诱导炎性体激活的证据，使用来自严重CCI小鼠的血清衍生的EV进行经典的过继转移实验。使用EV标记物CD81的蛋白质印迹验证EV制剂(图6)。对照接受从假手术或原初动物分离的EV。如图7A-7F所示，当与接受来自未受损伤或原初小鼠的EV的动物肺相比时，接受来自TBI受损伤动物的EV的动物肺中的活性半胱天冬酶-1(图7A、7B)、ASC(图7A、7C)、IL-18(图7A、7D)、AIM2(图7A、7E)和HMGB1(图7A、7F)显著升高。此外，在用来自TBI小鼠的EV处理的肺中，炎性细胞的浸润(箭头)是明显的(图7G)。最后，接受来自受损伤小鼠的EV的动物的ALI得分也显著更高(图7H)。这些研究为神经-呼吸-炎性体轴提供了证据，其中在TBI激活肺靶细胞中的炎性体后EV释放到循环中有助于ALI的发病机理。

接下来，在将EV从受损伤小鼠过继转移至原初小鼠后，通过用依诺肝素或针对ASC的单克隆抗体治疗来尝试外泌体摄取阻断。阴性对照动物接受盐水，并且阳性对照动物未接受治疗。如图8A-8F所示，在用依诺肝素或人源化单克隆抗ASC抗体(例如IC 100抗体)治疗后，半胱天冬酶-1(图8A、8B)、ASC(图8A、8C)、IL-1β(图8A、8D)、AIM2(图8A、8E)和HMGB1(图8A、8F)与未治疗(阳性对照)组相比显著降低(p＝<.0001)。此外，H&E染色的肺切片显示中性粒细胞浸润到肺泡和间质空间中的显著减少，以及没有间隔增厚的迹象(图9A-D)。与未治疗组相比，用依诺肝素和抗ASC抗体(IC 100)治疗的动物的ALI评分显著更低(图9E)(p＝<.0001)。因此，在TBI后EV释放到循环中在导致ALI的肺细胞中的炎性体激活中起作用。

结论

TBI可能与某些医学并发症尤其是肺和中枢神经系统功能障碍的发生率较高相关。在此实施例中，显示严重TBI增加皮质和肺组织中的HMGB1和炎性体表达(例如，AIM2、半胱天冬酶-1和ASC表达)并诱导与ALI一致的肺形态学变化(例如，中性粒细胞浸润到肺泡和间质空间中、肺泡间隔增厚、肺泡水肿和出血)，并介绍神经呼吸炎症轴(NeuralRespiratory Inflammatory Axis)的观点。重要的是，TBI导致肺组织中的细胞焦亡(例如，存在GSDMD切割)和II型肺泡上皮细胞中炎性体蛋白的表达增加。另外地，来自TBI小鼠的EV的过继转移激活炎性体并诱导ALI，表明脑损伤诱导含有一堆炎性体蛋白的EV的释放，然后进行到导致ALI。此外，结果表明通过抑制EV摄取(依诺肝素)和炎性体激活(抗ASC抗体(IC100)治疗)，炎性体蛋白表达和ALI的发展均降低。

总之，此实施例表明AIM2炎性体信号传导在TBI后肺损伤的病理机制中起核心作用，并证明TBI诱导的ALI涉及EV介导的炎性体信号传导的机制。这些数据提供了以下证据：EV介导的炎性体信号传导可发挥涉及神经元-呼吸-炎症轴的核心作用。因此，用针对炎性体蛋白的抗体或阻断EV摄取的药物靶向此轴可在重症监护医学的所有领域中提供神经创伤诱导的ALI的治疗方法。鉴于这些结果，所公开的治疗策略通常可用于治疗肺部炎性疾病。

通过引用并入

出于所有目的，以下参考文献通过引用以其全文并入。

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实施例2：EV介导的炎性体信号传导在人患者TBI后ALI中的作用

作为实施例1中对小鼠的实验的后续，检查了从人TBI患者分离的EV对人肺内皮细胞中炎性体信号传导的作用。

在第一个实验中，使用总外泌体分离试剂盒(Thermofisher)从TBI和对照患者分离血清来源的EV。培养肺部人微血管内皮细胞(HMVEC-Lonza)并将其涂布在12孔板上。在达到汇合后，将来自TBI和对照患者的分离的EV(1.94x 108个颗粒/ml)递送至细胞，孵育期为4小时。在孵育后，用200ul裂解缓冲液收获细胞，并将细胞裂解物用于蛋白质印迹分析。

在第二个实验中，使用总外泌体分离试剂盒(Thermofisher)从TBI和对照患者分离血清来源的EV。培养肺部人微血管内皮细胞(HMVEC-Lonza)并将其涂布在96孔板上。在达到汇合后，将来自TBI和对照患者的分离EV(1.94x 108个颗粒/ml)递送至细胞，孵育期为3小时，并且然后以1:30体积比率与半胱天冬酶-1FAM FLICA(ImmunohistochemistryTechnologies)另外孵育1小时。在孵育后，除去培养基并用细胞凋亡洗涤缓冲液(Immunohistochemistry Technologies)洗涤细胞3次。然后将细胞共染色，其中采用Hoechst用于细胞核染色，并且采用碘化丙啶用于细胞死亡染色。使用EVOS显微镜拍摄图像，并且然后在荧光板读取器下以492nm的激发波长和520nm的发射波长对细胞进行读取。

结果

如图10A-10F所示，递送来自TBI患者的血清来源的EV增加了肺内皮细胞中的炎性体蛋白表达。图10A-10E显示，与用对照-EV孵育4小时的PMVEC相比，与TBI-EV孵育4小时的PMVEC中半胱天冬酶-1、ASC、AIM2和HMGB1升高。使用Ella简单plex测定法的免疫测定结果显示IL-1β表达显著增加(图10F)。

如图11A-11C所示，向肺内皮细胞递送TBI-EV增加了半胱天冬酶-1的免疫反应性和细胞死亡。

结论

这些研究为神经-呼吸-炎性体轴提供了进一步的证据，其中在TBI激活肺靶细胞中的炎性体后EV释放到循环中促成ALI的发病机理。

******

上述不同的实施方案可组合以提供另外的实施方案。本说明书中提到的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用以其全文并入本文。如果必要的话，可以修改实施方案的方面，以采用不同专利、申请和公开案的概念以提供又另外的实施方案。

根据上文详细说明，可对实施方案作出这些和其他改变。总体上，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解读为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应解读为包括所有可能的实施方案连同这些权利要求所享有的等效权利的全部范围。因此，权利要求书不受本公开文本的限制。

序列表

<110> Keane, Robert W

de Rivero Vaccari, Juan P

Dietrich, W. D

Kerr, Nadine

Wu, Shu

<120> 用于调节肺中炎性体活性和炎症的方法

<130> UNMI-010/01WO 316457-2040

<150> US 62/440,180

<151> 2016-12-29

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<400> 1

Ala Leu Arg Gln Thr Gln Pro Tyr Leu Val Thr Asp Leu Glu Gln Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(HOMO SAPIENS)

<400> 2

Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人(HOMO SAPIENS)

<400> 3

Cys Glu Tyr Tyr Thr Glu Ile Arg Glu Arg Glu Arg Glu Lys Ser Glu

1 5 10 15

Lys Gly Arg

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<400> 4

Met Glu Glu Ser Gln Ser Lys Glu Glu Ser Asn Thr Glu Gly Cys

1 5 10 15

Claims (42)

1.一种治疗有需要的患者的肺部炎症的方法，所述方法包括：向所述患者给予一种包含抑制炎性体信号传导的药剂的组合物，由此治疗所述患者的肺部炎症。

2.权利要求1的方法，其中所述肺部炎症是由选自以下的病症导致的：中枢神经系统(CNS)损伤、神经变性疾病、自身免疫疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺病和急性呼吸窘迫综合征。

3.权利要求2的方法，其中所述CNS损伤选自创伤性脑损伤(TBI)、中风和脊髓损伤(SCI)。

4.权利要求2的方法，其中所述神经变性疾病选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症(MS)和帕金森病(PD)。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述组合物的给予导致抑制所述患者肺细胞中的炎性体激活。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中与对照相比，所述组合物的给予导致所述患者肺细胞中半胱天冬酶-1、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白1(NLRP1)、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白2(NLRP2)、结合核苷酸的含富亮氨酸重复pyrin结构域的蛋白3(NLRP3)、含NLR家族CARD结构域的蛋白4(NLRC4)、半胱天冬酶-11、X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)、pannexin-1、含有半胱天冬酶激活招募结构域的细胞凋亡相关Spec样蛋白(ASC)、白细胞介素-18(IL-18)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)或黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)水平的减少，其中所述对照是未治疗的患者。

7.权利要求5或6的方法，其中所述肺细胞是II型肺泡细胞。

8.权利要求1-5中任一项的方法，其中与对照相比，所述组合物的给予导致急性肺损伤(ALI)的减少，其中所述对照是未治疗的患者。

9.权利要求8的方法，其中ALI的减少通过嗜中性粒细胞到肺泡和/或间质空间中的浸润减少、肺泡间隔增厚减少或不存在、或其组合来证明。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述药剂是细胞外囊泡(EV)摄取抑制剂、结合炎性体组分的抗体或其组合。

11.权利要求10的方法，其中所述EV摄取抑制剂是化合物或抗体，其中所述抗体选自表1。

12.权利要求10-11中任一项的方法，其中所述药剂是EV摄取抑制剂，其与结合炎性体组分的抗体组合。

13.权利要求12的方法，其中所述EV摄取抑制剂是肝素。

14.权利要求13的方法，其中所述肝素是依诺肝素。

15.权利要求10-14中任一项的方法，其中所述结合炎性体组分的抗体是特异性地结合哺乳动物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3或NLRC4炎性体组分的抗体。

16.权利要求10或15的方法，其中所述炎性体组分是半胱天冬酶-1、ASC或AIM2。

17.权利要求16的方法，其中所述炎性体组分是ASC。

18.权利要求17的方法，其中所述抗体结合N末端PYRIN-PAAD-DAPIN结构域(PYD)、C末端半胱天冬酶-招募结构域(CARD)结构域、或衍生自所述ASC蛋白的PYD或CARD结构域的表位。

19.权利要求17的方法，其中所述抗体结合与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸。

20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述抗体抑制所述患者肺中的ASC活性。

21.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。

22.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述组合物通过脑室内、腹膜内、静脉内或通过吸入给予。

23.一种治疗已经经受中枢神经系统(CNS)损伤的患者的肺部炎症的方法，所述方法包括：向所述患者给予一种包含抑制炎性体信号传导的药剂的组合物，由此治疗所述患者的肺部炎症。

24.权利要求23的方法，其中所述CNS损伤选自创伤性脑损伤(TBI)、中风和脊髓损伤(SCI)。

25.权利要求23-24中任一项的方法，其中所述组合物的给予导致抑制所述患者肺细胞中的炎性体激活。

26.权利要求23-24中任一项的方法，其中与对照相比，所述组合物的给予导致所述患者肺细胞中半胱天冬酶-1、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4、半胱天冬酶-11、XIAP、pannexin-1、含有半胱天冬酶激活招募结构域的细胞凋亡相关Spec样蛋白(ASC)、白细胞介素-18(IL-18)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)或黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)水平的减少，其中所述对照是未治疗的患者。

27.权利要求25或26的方法，其中所述肺细胞是II型肺泡细胞。

28.权利要求23-27中任一项的方法，其中与对照相比，所述组合物的给予导致急性肺损伤(ALI)的减少，其中所述对照是未治疗的患者。

29.权利要求28的方法，其中ALI的减少通过嗜中性粒细胞到肺泡和/或间质空间中的浸润减少、肺泡间隔增厚减少或不存在、或其组合来证明。

30.权利要求23-29中任一项的方法，其中所述药剂是细胞外囊泡(EV)摄取抑制剂、结合炎性体组分的抗体或其组合。

31.权利要求30的方法，其中所述EV摄取抑制剂是化合物或抗体，其中所述抗体选自表1。

32.权利要求30-31中任一项的方法，其中所述药剂是EV摄取抑制剂，其与结合炎性体组分的抗体组合。

33.权利要求32的方法，其中所述EV摄取抑制剂是肝素。

34.权利要求33的方法，其中所述肝素是依诺肝素。

35.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述结合炎性体组分的抗体是特异性地结合哺乳动物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3或NLRC4炎性体组分的抗体。

36.权利要求30或35的方法，其中所述炎性体组分是半胱天冬酶-1、ASC或AIM2。

37.权利要求36的方法，其中所述炎性体组分是ASC。

38.权利要求37的方法，其中所述抗体结合PYD、CARD结构域、或衍生自所述ASC蛋白的PYD或CARD结构域的表位。

39.权利要求37的方法，其中所述抗体结合与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸。

40.权利要求37-39中任一项的方法，其中所述抗体抑制所述患者肺中的ASC活性。

41.权利要求23-40中任一项的方法，其中将所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。

42.权利要求23-41中任一项的方法，其中将所述组合物通过脑室内、腹膜内、静脉内或通过吸入给予。