CN1964990B - 糖蛋白ⅵ特异的抗体以及生产这些抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了针对血小板膜糖蛋白VI(GPVI)产生的抗体、产生抗GPVI抗体的方法和这些抗体作为研究和免疫治疗剂(特别是抗血栓治疗剂)的用途。

Description

糖蛋白Ⅵ特异的抗体以及生产这些抗体的方法

本申请要求本文引为参考的于2004年4月29日提交的U.S.临时申请No.60/566,171的权益。

技术领域

本发明涉及针对血小板膜糖蛋白VI(GPVI)产生的抗体、其片段或其天然存在的变体、产生抗GPVI抗体的方法以及这些抗体作为研究和免疫治疗剂(特别是作为治疗血栓形成和其他血管疾病的治疗剂)的用途。

背景技术

血小板是止血控制和伤口愈合所必需的小型无核血细胞。在正常条件下循环血小板是相当静息的。然而，当血管被撕裂或损伤时，血小板与多种因子接触，启动引起凝血和血块形成的复杂并互连的细胞程序，综述于《Mechanisms of Platelet Activation and Control》，K.S.Authi，S.P.Watson和V.V.Kakar编辑，Plenum Press，1993。这些细胞程序的激活引起膜粘着特性的显著提高、血小板聚集并释放血管收缩和溶纤维蛋白因子。结果在创伤位点形成血块，堵住血管壁的任何缺口并提供成纤维细胞侵入和修复的基质。

凝血过程的早期事件可以功能性地分为两个基本部分：粘着和活化。粘着是将血小板“粘”在受伤的管壁上的过程，而活化起始细胞内复杂的生理变化。总之，这两个过程引起血小板聚集、凝块形成，并最终形成成熟的血块。尽管这些事件对于限制损伤位点的血液损失至关重要，但是血小板粘着和活化也可能促进疾病状态的恶化。例如，血块可能堵塞患病血管，引起缺血并导致重要组织如心和脑的损伤。血小板在止血和血栓形成中的双重作用综述于Ruggeri，Nature Medicine，8：1227-1234(2002)。

这些过程中的多数步骤依赖于胞外配体与嵌入血小板细胞膜中的特异性受体之间的相互作用。在体内，首先可见的血小板行为变化是上皮损伤引起血小板粘着于裸露的上皮。在裸露上皮暴露的小分子组分中，胶原认为是与血小板最具反应性的。胶原通过直接和间接途径支持血小板粘着，并通过起始血小板聚集和产生凝块形成所必需的促凝剂活性来活化血小板。Baumgartner，Thromb Haemost.37：1-16(1977)。

血小板和内皮下膜的最初接触涉及血小板糖蛋白复合物GPIb-V-IX与裸露的内皮下膜结合的血管假性血友病因子(vWf)之间的相互作用。此相互作用似乎是可逆过程，而且对于稳定粘着而言是不够的(如血小板沿血管壁的“滚动”所证明)。Ruggeri，Nature Medicine，8：1227-1234(2002)。尽管vWf相互作用并不完全固定循环血小板，但它对高血流量条件下的血小板粘着是必要的。接着，血小板与内皮下膜胶原通过糖蛋白GPIa-IIa(也称为整合素α₂β₁)的不可逆结合稳定了vWf相互作用事件，将血小板牢固的锚定在血管壁上。与vWf不同，胶原粘着似乎是较慢的过程，且仅在低流量条件下或在血小板通过vWf相互作用已部分停止之后有效。此外，GPIa-IIa结合诱导血小板沿血管壁展平(伸展)。伸展促进与其他内皮下粘着因子(包括纤连蛋白、玻璃体连接蛋白和凝血酶敏感素)的结合。这些伸展后相互作用进一步稳定血小板对血管壁的粘着。

GPIa-IIa是含有α和β亚基的整合素。在其正常构象中，整合素对其天然配体具有低亲和力，但可通过其他细胞受体产生的信号转变成高亲和力受体。Nieswandt B和Watson SP.Blood 102：449-461(2003)。刺激GPIa-IIa和其他胶原受体诱导许多生理变化。其中包括引起血小板-血小板聚集的细胞表面粘着特性的改变和分泌多种生物活性化合物。这些化合物包括血管收缩剂、肾上腺素和前凝血因子，它们活化凝血酶并引起纤维蛋白原聚合为成熟血块的纤维蛋白丝。此外，活化的血小板释放ADP和血栓烷A₂(TXA₂)。这些强血栓形成因子扩增最初的活化信号，募集其他血小板进入活化态。

除了GPIa-IIa以外，在血小板细胞表面至少表达两种其他胶原受体，即GPIV(CD36)和GPVI(综述于Farndale RW等，J Thromb.Haemost2：561-573，2004)。这些血小板胶原受体功能的线索来自对人患者变体的研究。人患者变体的研究提示GPVI在血小板-胶原相互作用中发挥主要作用，而GPIV的贡献较小。这些研究还显示相当多缺乏GPIa-IIa或GPVI的个体表现出比表达GPIa-IIa或GPVI的个体稍微延长的出血时间。此外，GPIa-IIa缺乏通常导致比缺乏GPVI的人更严重的出血障碍。尽管如此，这些患者很少像患伯-苏综合征(由GPIb缺乏引起)或格兰茨曼血小板无力症(由GPIIb-IIIa缺乏引起)的个体那样表现严重的出血趋势。

对人变体的观察和最近的体外数据提示，三个胶原受体协调作用介导胶原-血小板相互作用。例如，在体外，现在可以用胶原受体位点特异性的抗体阻断每种胶原受体的活性。每种抗体各自部分抑制血小板与胶原的粘着，抗体配对组合的抑制性明显更强，特别是同时抑制GPIa-IIa和GPVI时。此外，这些研究证明GPIV、GPIa-IIa和GPVI通过两条不同途径促进血栓形成，在机制上可通过对二价金属阳离子的需要进行区分。

生物化学和序列信息表明，GPIa-IIa是阳离子依赖性整合素类型的受体。相反，生物化学研究显示GPIV和GPVI不需要二价金属阳离子，因此是非整合素类型。就非整合素类别而言，对人受试者的观察明确提示在初期粘着过程中，GPVI比GPIV更为重要。事实上，在通过螯合二价阳离子阻断GPIa-IIa功能的体外实验中，针对GPVI的抗体完全消除了胶原-血小板相互作用。Nakamura等J.Biol.Chem.273：4338-4344，(1998)。

GPVI最初在约30年前通过等电聚焦和电泳鉴定。直到最近，其功能仍完全未知，只知道是还原条件下分子量约为62kDa的血小板糖蛋白。然而，约从1987年开始，Minoru Okuma博士及其同事检查了若干患一种血小板减少性紫癜(出血/瘀伤综合征，其特征在于血小板破坏加快和循环血小板数降低)的患者。Okuma博士的一些患者的血小板应答于多数激动剂(包括ADP、凝血酶、瑞斯托菌素和钙离子载体(A23187))而正常聚集，但对胶原明显无应答。此外，发现这些血小板62kDa糖蛋白的量减少或甚至完全缺失。Sugiyama等，Blood 69：1712-20(1987)；Moroi等，J.Clin.Invest.84：1440-45(1989)；Ryo等，Am.J.Hematol.39：25-31(1992)和Aral等，Brit.J.Haematol.89：124-130(1995)。

GPVI功能早期研究的关键试剂来自Okuma博士的一个血小板减少性紫癜患者。此患者表现为原因不明的大量出血，可通过输入HLA匹配的血小板进行治疗。接着对患者血的详细检查显示完全缺失GPVI。最让人吃惊的是，由于此患者完全缺失GPVI，她的免疫系统将输入的血小板上的GPVI分子鉴定为外来抗原，并产生针对GPVI的多克隆抗体。Sugiyama等，Blood 69：1712-20(1987)。

天然存在的抗体由对单个抗原表位具有特异性的两个相同的结合位点组成。通过共有柄或Fc结构域连接两个抗原特异性部分，形成能与两个相同的抗原分子结合的复合物。此外，抗体的二价特性与Fc结构域的聚集特性结合使许多特异性抗原分子交联并聚集。Okuma博士发现来自患者血清的二价抗体与正常血小板混合时引起大量聚集的反应。相反，当通过酶去除连接的Fc结构域而使抗原特异性结构域表现为一价时，得到的Fab片段完全消除了正常血小板胶原诱导的聚集并抑制血小板-胶原粘着。

Okuma博士慷慨地将这种稀有的血清提供给科学界。不幸的是，来源非常有限，并且发现它的周围环境事实上是不可重现的。尽管Okuma血清使对GPVI功能的研究成为可能并长期提供了鉴定蛋白质为GPVI的惟一方法，但是最近已发现C型凝集素惊厥素(convulxin)以高亲和力与GPVI特异性结合，并可标记为探针用于鉴定GPVI蛋白。Francishetti等，Toxicon 35：1217-28(1997)；Polgaret等，J.Biol.Chem.272(24)：13576-83(1997)；Jandrot-Perrus等，J.Biol.Chem.272(2)：27035-41(1997)。惊厥素是来自热带响尾蛇Crotalus durissus terrificus的毒液组分。在其天然二价形式下，惊厥素是血小板聚集和前聚集及前凝血因子分泌的潜在诱导物。惊厥素的二价性质对其聚集效应是至关重要的。尽管该反应的生理学机制尚不清楚，单个惊厥素亚单位仍与GPVI结合，但是抑制而不是诱导聚集。已经提出，一价惊厥素阻断胶原诱导信号传入细胞内部。

最近测定了GPVI全序列。Clemetson等，J.Biol.Chem.274：29019-24(1999)；WO 00/68377；Jandrot-Perrus等，Blood 96：1798-807(2000)；Ezumi等，Biochem Biophys Res Commun.277：27-36(2000)。GPVI属于免疫球蛋白超家族，并与Fc受体γ链(FcRγ)链非共价结合。Gibbins等，FEBS Lett.413：255-259(1997)；Tsuji等，J.Biol.Chem.272：23528-23531(1997)。目前认为与GPVI结合的胶原诱导FcRγ的酪氨酸磷酸化。其后磷酸化的FcRγ募集Syk激酶，最终引起胞内事件的级联，包括磷酸激活Syk和磷脂酶C-γ2。这些事件最终引起胞内钙水平升高并分泌前聚集和前凝血因子。因此，在人和小鼠血小板中，FcRγ链作为受体的信号转导部分。Clemetson等，J.Biol.Chem.274：29019-290(1999)；Jandrot-Perrus等，Blood 96：1798-1807(2000)；Gibbins等，FEBS Lett.413：255-259(1997)；Tsuji等，J.Biol.Chem.272：23528-23531(1997)。

GPVI缺乏的患者患有轻微出血素质，并且其血小板对胶原的应答很弱。Sugiyama等，Blood 69：1712-1720(1987)；Moroi等，J.Clin.Invest.84：1140-1445(1989)；Arai等，Br.J.Haemtol.89：124-130(1995)。对GPVI缺陷型患者的血小板或用(得自患者血清的)抗GPVI Fab片段阻断的血小板的研究清楚地证明了高和低剪切率下血小板与固定抗原间相互作用的缺乏和高剪切率下对固定vWf的粘着强度的降低。Goto等，Circulation106：266-272(2002)。

用缺乏FcRγ链(也导致GPVI缺陷型表型)的敲除小鼠或GPVI衰竭的小鼠进行的研究也证实了这些观察，但这些动物表现出稍微延长的尾出血时间。Nieswandt等，The EMBO Journal 20：2120-2130(2001)。GPVI缺陷型、FcRγ阳性小鼠显示与野生型和GPVI杂合小鼠相似的出血时间。来自GPVI缺陷型小鼠的血小板不能应答于胶原和惊厥素而发生聚集，并显示在流动条件下与固定胶原粘着的显著降低，从而证实GPVI在胶原诱导的血小板功能和血栓形成中发挥重要作用。Kato等，Blood 102：1701-1707(2003)。

现在已经接受GPVI为胶原诱导的血小板活化的主要受体，并且是信号转导的关键渠道。Lchinohe等，J.Biol Chem.270(47)：28029-28036(1995)；Tsuji等，J.Biol Chem.272(28)：23528-31(1997)。相反，血小板中的另一主要胶原受体GPIa-IIa主要与得到稳定粘着和伸展、引起血栓生长的阳离子依赖性过程相关。Blood 102：449-461(2003)。

不恰当的血小板聚集和血块形成是一系列人类疾病(最普遍的是血管疾病)的主要病原学因素，这一不幸事实突出了本领域对GPVI拮抗剂(如针对GPVI的抗体)的需要。在动脉和静脉内壁积累过多的血小板会促进动脉粥样硬化和动脉粥样斑块，它们降低到达敏感组织的血流量。这种血小板依赖性的累积最终可能表现为急性心肌梗塞、慢性不稳定心绞痛、短暂性局部缺血、中风、外周血管疾病、动脉血栓形成、肺栓塞、再狭窄和多种其他症状。

这些表现一般开始于血管内形成的称为血栓的异常血块。一旦形成血块，流过血块的持续血流可能将其从粘着中冲下。这些自由流动的血块称为栓子。栓子一般通过循环流动，直至被阻塞在循环系统中的窄点。这种阻塞可能发生在脑、肺或冠状动脉中，引起疼痛、残疾或死亡。

血管内的血块可能来自天然发生的硬化、败血症休克或血管的物理损伤。事实上，用于诊断和治疗血管疾病的高度有侵入性方法(如血管移植物、探查和留置导管、支架、分流器和其他装置)本身就损伤血管壁。这可能活化血小板、刺激聚集并最终导致形成血栓和栓子，进一步危害患者的生命和健康。因此，控制或降低血小板聚集和血块形成的方法是这些疾病的控制中长期寻求的目标。

发明概述

本发明提供GPVI特异性抗体，所述抗体是比本领域已报道的胶原诱导血小板功能抑制剂更有效的抑制剂。因此，本发明的GPVI特异性抗体可能是有用的抗血栓剂，并且可能具有降低的(经常与施用其他抗血栓剂相关的)副作用。

本发明的一个方面提供对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的单克隆抗体，所述抗体以小于约7、4、3、2、1、0.6μg/ml或此范围内包含的任何值的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板聚集。对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的单克隆抗体还可以以小于约1、0.5、0.2、0.1μg/ml或此范围内包含的任何值的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板粘着。

本发明的另一方面提供对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的单克隆抗体，所述抗体以等于或低于10^-8M的Kd与GPVI多肽、肽或其天然存在变体特异性结合。在另一实施方案中，本发明的抗GPVI抗体以等于或低于10^-9M的Kd与GPVI多肽、肽或其天然存在变体特异性结合。

本发明的单克隆抗体还抑制胶原诱导的ATP分泌和/或胶原诱导的血栓烷A₂形成。单克隆抗体包括活性抗体片段。活性抗体片段可以包括化学、酶或重组产生的Fab片段、F(ab)₂片段或含有至少一个对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的互补性决定区(CDR)的肽。在本发明的实施方案中，CDR包括SEQ ID NO：1-24中任一序列或其变体，其中CDR变体与GPVI多肽、肽或其天然存在变体特异性结合。示例抗体包括OM1、OM2、OM3和OM4。

本发明还提供通过使血小板接触对GPVI多肽、肽或其天然存在的变体具有特异性的单克隆抗体来抑制血小板聚集、胶原诱导的ATP分泌、胶原诱导的血栓烷A₂形成和/或血小板粘着的方法。

本发明还提供产生对GPVI多肽、肽或其天然存在的变体具有特异性的单克隆抗体的方法。方法包括用GPVI抗原免疫GPVI缺陷型宿主并获得抗体。GPVI缺陷型宿主包括如GPVI杂合宿主和纯合GPVI敲除宿主。本发明的另一方面提供通过所述方法产生的对GPVI多肽、肽或其天然存在的变体具有特异性的单克隆抗体。

本发明还提供含有药物有效量的本发明GPVI特异性单克隆抗体的抗血栓组合物。抗血栓剂可用于治疗患者。因此，本发明的一个方面提供治疗例如需要血管疾病治疗的患者的方法。

本发明还提供鉴定抗血栓剂的方法，所述鉴定通过使GPVI抗原接触本发明的GPVI特异性单克隆抗体和测试化合物，并测量对单克隆抗体与GPVI抗原结合的抑制。可以按任意顺序加入GPVI抗原、GPVI特异性单克隆抗体和测试化合物。例如，可以在接触GPVI特异性单克隆抗体之前先使GPVI抗原与测试化合物接触。在另一实例中，GPVI抗原可以同时与GPVI特异性单克隆抗体和测试化合物接触。

应该理解，上述一般性描述和下文的详细描述仅用于示例和解释，并不限制本发明。

附带的图表(引入并构成本说明书的部分)与描述一起说明本发明的若干实施方案，用于解释本发明的原理。

附图简述

图1为产生GPVI敲除小鼠的示意图。图1A显示GPVI野生型等位基因、用于在外显子2和3处同源重组的靶载体和得到的突变体等位基因。图1B显示野生型和突变的基因组中用限制性内切酶切割得到的5’和3’片段的大小差异。

图2为显示静止条件下0.1-100μg/ml的OM1、OM2、OM3和OM4的Fab片段对血小板(人)与纤维胶原的粘着的影响的条形图。

图3是显示静止条件下0.001-1μg/ml的OM1、OM2、OM3和OM4的Fab片段对人血小板与纤维胶原的非Mg²⁺依赖性(GPVI依赖性)粘着的影响的条形图。

图4展示高剪应力(2600秒^-1)条件下OM1、OM2、OM3、OM4和ReoPro

的Fab片段对血小板(人)与酸不溶性胶原的粘着的影响。

图5是与人血小板裂解液中GPVI反应的OM系列抗体(OM1、OM2、OM3和OM4)和惊厥素(CVX)的Western印迹。

图6展示在GPVI敲除动物中胶原和惊厥素诱导的血小板聚集的完全缺失。

图7展示高剪应力条件下来自GPVI敲除小鼠的血小板与酸不溶性胶原之间相互作用的完全缺失。

图8为显示短尾猴中OM2Fab片段和ReoPro对离体胶原诱导的血小板聚集的影响的图示。

图9为显示短尾猴中OM2Fab片段和ReoPro对皮肤出血时间的影响的图示。

图10为显示短尾猴中OM2Fab片段和ReoPro

在静脉团注(bolusinjection)(0.4mg/kg)后随时间变化的抗聚集效应的图示。

图11为显示短尾猴中OM2Fab片段和ReoPro在静脉团注(0.4mg/kg)后对皮肤出血时间的时程影响的图示。

图12展示大鼠中OM4Fab和7E3F(ab′)₂片段对离体胶原诱导的血小板聚集的影响。

图13展示大鼠中OM4Fab和7E3F(ab′)₂片段对皮肤出血时间上的影响。图13A显示对趾甲出血时间的影响，图13B显示对尾出血时间的影响。

图14展示大鼠中OM4Fab和7E3F(ab′)₂片段对血小板计数的影响。

图15是显示内皮损伤之前(图15A)和之后(图15B)施用时，OM4Fab片段对大鼠中动脉血栓形成的影响的条形图。

图16是显示生物素化的OM2 Fab片段在体外与人血小板的浓度依赖性结合。

实施方案描述

本发明描述新GPVI特异性抗体，所述抗体为胶原诱导的血小板应答(包括但不仅限于血小板聚集、粘着、胶原诱导的ATP释放和血栓烷A2(TXA₂)形成)的有效抑制剂。本发明还描述产生抗GPVI抗体的方法。本发明的抗GPVI抗体可用于抑制血栓形成和用于治疗需要抗血栓形成治疗的患者。

术语“抗体”包括单克隆抗体。本发明的单克隆抗体包括活性抗体片段，如F(ab′)₂和Fab片段以及任何重组产生的结合配偶体。如果抗体以等于或低于10^-7M的解离常数(Kd)与GPVI多肽、肽或其天然存在的变体结合，则将其定义为“特异性结合”。在本发明的实施方案中，抗GPVI抗体以等于或低于10^-8M的Kd与GPVI多肽、肽或其天然存在的变体特异性结合。在另一实施方案中，本发明的抗GPVI抗体以等于或低于10^-9M的Kd与GPVI多肽、肽或其天然存在的变体特异性结合。可以使用常规技术便利地测定结合配偶体或抗体的亲和力，如通过测量¹²⁵I标记的IgG或其片段的饱和结合等温线，或如Motulsky在《Analyzing Data withGraphPad Prism》(1999)，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA中所述通过使用非线性回归分析，用未标记IgG同源取代¹²⁵I标记的IgG。其他技术为本领域所公知，如Scatchard等，Ann.NY Acad.Sci.，51：660(1949)所述。U.S.Publication No.2003/0186885描述了GPVI多肽、肽或其天然存在变体，其整体引入本文为参考。

可以使用本领域熟知的方法从多种来源(如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、仓鼠或大鼠)容易地产生抗体。在本发明的一个实施方案中，宿主动物为亚美尼亚仓鼠。在另一实施方案中，宿主动物为GPVI缺陷型动物。本文所使用的“GPVI缺陷型”指与野生型动物相比，动物的内源性GPVI产生降低约50％或更高。内源性GPVI产生的降低可以是GPVI产生被完全抑制。可以通过本领域已知的多种方法产生GPVI缺陷型动物。这些方法可以包括在核酸(DNA或RNA)水平操纵动物中GPVI产生。可以通过包括但不仅限于以下的方法产生GPVI缺陷型动物：敲除(参阅如Galli-Taliadoros等，J.Immunol.Methods 181：1-15，1995；Robbins，Circ.Res.73：3-9，1993；Hergueux等.，Transplant Proc.25：30-32，1993)、敲入(Colucci-Guyon等，Cell 79：679-694，1994；LeMovellic等，PNAS 87：4712-4716，1990；Hanks等，Science 269：679-682，1995；Wang等，Nature 379：823-825，1996)、突变(Askew等，Mol.Cell.Biol.13：4115-4124，1993；Stacey等，Mol.Cell.Biol.14：1009-1016，1995；Hasty等，Nature 350：243-246，1991；Valancius等，Mol.Cell.Biol.11：1402-1408，1991；Wu等，PNAS 91：2819-2823，1994；Hone等，Gene166：197-204，1995；Toth等，Gene 178：161-168，1996)、缺失(You等，Nature Genet.，15：285-288，1997；Holdener-Kenny等，Bioessays14：831-839，1992)、反义寡核苷酸技术(Wagner等，Nature Biotechnol.14：840-844，1996；Kitajima等，Science 258：1792-1795，1992；Urban等，Farmaco.58：243-58，2003；Orum等，Curr Opin Mol Ther.3：239-43，2001；Sohail等，Curr Opin Mol Ther.2：264-71，2000；Smith等，Eur J PharmSci.11：191-8，2000)、干扰RNA(RNAi)技术(Scherr等，Curr Med Chem.10：245-56，2003；Nishikura，Cell 107：415-418，2001；Hannon，Nature4418：244-251，2002；U.S.专利No.5,506,559)或通过使用任何其他化学品、天然存在的、重组的或合成的肽、多肽、蛋白质、多糖、小分子和设计用于降低或抑制宿主中GPVI产生的任何其他化合物。

不限于任何理论，不产生或产生低于正常量的内源性GPVI的宿主可能得到比产生正常水平的GPVI宿主更强的免疫应答。因此，与从产生GPVI的正常宿主获得的抗体相比，可能产生在较低剂量下更有效的抑制胶原诱导的血小板应答(如血小板聚集、血栓形成和/或血小板活化)的GPVI抗体。在敲除动物中产生抗体的方法已描述于Pass等，Scand.J.Immunol.58：298-305(2003)；Zlot等，J.Lipid Res.40：76-84(1999)；Declerck等，J.Biol.Chem.270：8397-8400(1995)和Castrop等，lmmunobiology 193：281-287(1995)。

可以如整体引入本文为参考的US专利出版物No.US 2003/0186885A1所述免疫宿主。简言之，用“GPVI抗原”免疫宿主，所述“GPVI抗原”包括但不仅限于分离自血小板或其他表达GPVI的细胞的天然GPVI多肽、肽或其天然存在的变体；由原核或真核细胞表达的重组GPVI多肽、肽或其天然存在变体的重组形式；得自多种物种(包括人)的血小板；表达GPVI多肽、肽或其天然存在变体的细胞；编码GPVI多肽、肽或其天然存在变体的核酸；或它们的任一组合。

一般对宿主动物腹膜内施用与佐剂或载体缀合的纯化的GPVI多肽或基于GPVI多肽氨基酸序列的肽。可以通过使用佐剂(如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂)增强GPVI多肽的免疫原性。加强免疫之后，收集血清小样并测试对GPVI多肽的反应性。用于这些测定的多种测定法的实例包括《Antibodies：A Laboratory Manual》，Harlow和Lane(编)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988中所述以及如对流免疫电泳(CIEP)、放射性免疫测定、放射性免疫沉淀(RIP)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹测定和夹层测定和FACS等方法。参阅U.S.专利No.4,376,110和4,486,530。

可以使用熟知的方法便利地制备单克隆抗体，参阅如U.S.专利No.RE32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993、《Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses》，Plenum Press，Kennett、McKearn和Bechtol编，1980中所述的方法。简言之，以约一周间隔(任选在佐剂存在下)对宿主动物腹膜内注射GPVI抗原。进行免疫直至得到所需的抗体效价。

然后通过使用转染了GPVI-FcRγ链的CHO细胞的FACS分析或本领域已知的任何其他方法测定小鼠血清的抗体效价。对选择的小鼠给予加强剂量的GPVI抗体。三天后，处死小鼠并按已建立的方法将其脾细胞与市售的骨髓瘤细胞P3U1(ATCC)融合。将骨髓瘤细胞在无血清培养基中洗涤若干次并与小鼠脾细胞融合。融合剂为50％PEG(Roche)。将融合物置于含有补充了HAT的DMEM培养基的96孔平底平板(Corning)中，接着培养1-2周。收集来自所得杂交瘤的上清液并通过使用表达GPVI和FcRγ的野生型CHO细胞的FACS分析来分析抗GPVI抗体的存在。还使用野生型CHO细胞进行FACS分析以消除产生针对CHO细胞抗原的抗体的克隆。可以在大量培养基中培养阳性克隆，接着通过A蛋白或G蛋白琼脂糖柱(Phamacia)纯化上清液。应该理解，可以使用许多技术产生针对GPVI多肽和肽的抗体，此实施方案绝不限制本发明的范围。

可以使用备选技术产生本发明的单克隆抗体，如Alting-Mees等在整体引入本文为参考的《Molecular Biology》的Strategies中的″MonoclonalAntibody Expression Libraries：A Rapid Alternative to Hybridomas″，3：1-9(1990)所述。类似的，本发明的单克隆抗体包括(如使用重组DNA技术)构建以整合入编码特异性结合抗体的基因可变区的结合配偶体。这些技术描述于Larrick等，《Biotechnology》，7：394(1989)。

可以结合本领域的认识程度产生其他类型的抗体。例如，可以如Knight等，Mol.Immunol 32：1271-81(1995)所述，通过用含有纯化的单克隆抗GPVI抗体抗原结合位点的抗原来免疫宿主并测试所得血清或单克隆上清液的活性来获得抗独特型抗体。在本发明的实施方案中，可以通过用含有本发明抗GPVI抗体的互补性决定区(CDR)的肽免疫宿主来获得抗独特型抗体。本发明的抗独特型抗体包括活性抗独特型抗体片段，其指化学、酶或重组产生的抗独特型抗体片段，包括Fab、F(ab)₂或含有至少一个特异性结合GPVI抗体的互补性决定区的肽。此外，本发明包括生物合成的GPVI抗体结合位点(如Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879(1988)所述)、含有分离的重链可变结构域的单结构域抗体(如Ward等，Nature 341：544(1989)所述)和含有改造为含有(能特异性结合GPVI多肽的)人抗体元件的抗体。还可以使用噬菌体展示技术产生抗GPVI抗体，如Ventor等，Ann Rev.Immunol.12：43355(1994)及其引用的参考文献(全部引入本文为参考)中所述。

本发明的抗体还包括活性抗体片段，其指化学、酶或重组产生的抗体片段，包括Fab、F(ab)₂或含有至少一个特异性结合GPVI多肽、肽或其天然存在变体的互补性决定区(CDR)的肽。利用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的普通酶方法去除Fc抗体结构域以产生二价F(ab)₂和一价Fab片段。这些方法在Gorini等，J.Immunol.103：1132(1969)；《Handbook ofExperimental Immunology》第1卷：DM Wier编辑，Blackwell AldenPress，Oxford，UK，1997和《Antibodies：A Laboratory Manual》，Harlow和Lane编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；和U.S.专利No.4,470,925(Auditore-Hargreaves)(全部引入本文为参考)中有基本描述。

可以将完整的GPVI特异性抗体和抗体片段如Fab和F(ab)₂片段与药物或载体分子共价偶联。此外，可以直接交联或通过合适的载体分子交联本发明的GPVI特异性抗体以形成多价体复合物。在一个实施方案中，如Reno等(U.S.专利No.5,506,342)(引入本文为参考)所述，通过共价交联使F(ab)₂代谢稳定。

可以通过配体(胶原)依赖的结合测试对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的单克隆抗体阻断血小板活化的能力。阻断血小板功能的单克隆抗体可能是有用的抗血栓剂。

还可以人源化本发明的抗体。因此在临床应用中优选人抗体和人源化抗体。参阅如LoBuglio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4220-24(1989)；Meredith等，J.Nucl.Med.33，23-29(1992)；Salah等，Hum.Antibod.Hybridomas 3：19-24(1992)；Knight等，Mol.Immunol 32：1271-81(1995)和Lockwood等，Q.J.Med.89：903-12，(1996)。

开发全人抗体一般需要合适的人免疫B淋巴细胞源。产生人抗体的一种方法包括从置于体外培养的得自非免疫个体的幼稚B细胞库中免疫和扩大具有适当特异性的B淋巴细胞。Ohlin和Borrebaeck，《Methods ofImmunological Analysis》，第II卷，Masseyeff等编辑，VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim，298-325页(1992)；Borrebaeck和Ohlin，《Protocols in Cell and Tissue Culture》，Doyle等编辑，J.Wiley &Sons Ltd.，Chichester 25E：1.1-7(1993)。已经通过此方法开发了针对HIV-1糖蛋白的人抗体。Ohlin等，Immunology 68：325-331(1989)；Ohlin等，Clin.Exp.Immunol.89：290-295(1992)；Duenas等，Immunology89：1-7(1996)。更最近的，已经开发了利用植入人免疫细胞或引入完整的人免疫球蛋白基因座的动物的体内技术。llan等，Curr.Opin.Mol.Ther.4：102-109(2002)；lshida等，Cloning Stem Cells 4：91-102(2002)。已经通过用多种人抗原免疫这些动物产生了全人抗体。

可以通过用相应的人抗体序列替换单克隆抗体的大部分或全部结构部分来产生人源化抗体。从而产生仅抗原特异性可变区或互补性决定区(CDR)由非人序列组成的杂合分子。设计人源化抗体的多种策略综述于Winter和Milstein，Nature 349：293-99(1991)；Harris，BCSTBS523(4)：1035-38(1995)；Morrison和Schlom，《Important Advances inOncology》，J.B.Lippincott Co.(1990)；L.Presta，″HumanizedMonoclonal Antibodies，″《Annual Reports in Medicinal Chemistry》，Academic Press，(1994)和A.Lewis和J.Crowe，″Generation ofHumanized Monoclonal Antibodies by Eest Fit″Framework Selectionand Recombinant Polymerase Chain Reaction″Generation of Antibodiesby Cell and Gene Immortalization.Year Immunol.1993，第7卷，110-118页，(C.Terhorst、F.Malvasi和A.Albertini编Basel，Karger，以上各文献均全文引入本文作为参考。

还可以通过Ig特异性吸附(如A蛋白层析)或通过使用固定GPVI肽的亲和层析来选择和纯化抗GPVI抗体，以人源化对GPVI多肽、肽或其天然存在变体具有特异性的抗体。可以通过标准方法解离重链和轻链，并纯化单链。可以测定单链的局部氨基酸序列并根据Lathe等，J.Mol.Biol.183：1-12(1985)的方法产生每个链的简并寡核苷酸。接着可以通过PCR或其他标准方法从产生抗GPVI抗体的细胞克隆编码这些抗体链的DNA并测序。

可以分析抗体DNA和氨基酸序列并与已知的人重链和轻链序列进行比较。基于序列比较，可以通过用人序列取代非人DNA部分从而形成具有GPVI特异性的嵌合抗体来使GPVI特异性抗体链人源化。在一个实施方案中，使用Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218(1987)所述的表达载体用人J1和K恒定区使GPVI特异性抗体人源化。制备非人-人杂合体的方法为本领域所熟知，并详细描述于如Knight等，Mol.Immunol32：1271-81(1995)；U.S.专利No.5,705,154(Dalie等)；5,693,322(Creekmore等)；5,677,180(Robinson等)；5,646,253(Wallace等)；5,585,097(Bolt等)；5,631,349(Diamantstein等)和5,580,774(Beavers等)(全部引入本文为参考)。为使高亲和力嵌合抗体的产生最大化，可以使用Queen等，(U.S.专利No.5,585,089)和Queen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，86：10029-33(1989)的方法。

还可以使用噬菌体展示方法产生人源化抗体，如Rader等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，95：8910-8915(1998)和Steinberger等，J.Biol.Chem.275：36073-36078(2000)所教导以及如Son等，J Immunol Methods.286：187-201(2004)，Lee等，J Immunother.27：201-210(2004)和其他本领域技术人员所教导。

抗体分子与抗原结合的部分仅由重链(VH)和轻链(VL)可变(V)区中的少数氨基酸组成。通过V区折叠使这些氨基酸紧密靠近。IgG可变区氨基酸序列的比较显示多数变异性存在于三个称为互补性决定区(CDR)的区域内。每个链(H和L)含有三个CDR。特异性不同的抗体具有不同的CDR，而具有完全相同特异性的抗体一般具有相同或高度保守的CDR。本发明包括含有本发明GPVI抗体的至少一个互补性决定区(CDR)或其变体的单克隆抗体或肽。本发明包括含有SEQ ID NO：1-24中至少一个氨基酸序列或其变体的单克隆抗体或肽。

本文中含有CDR的抗体或肽的“变体”指含有与SEQ ID NO：1-24基本相同的氨基酸序列，但由于一个或多个删除、插入或替换而具有与SEQ ID NO：1-24不同的氨基酸序列的抗体或肽。变体与含有相应CDR的抗体或肽相比还保留了与GPVI多肽、肽或其天然存在变体的至少70％、80％、90％或100％的结合亲和力。可以根据本领域已知的任何方法测定结合亲和力，如Fujimura等，Thromb.Haemost.87：728-734(2002)所教导和下文实施例4所示例的。变体优选含有与SEQ ID NO：1-24至少60％、65％、70％、80％、85％或90％相同的CDR。可以通过如使用GAP计算机程序6.0版(Devereux等(Nucl.Acids Res.12：387，1984)所述，可得自the University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))比较序列信息来测定同一性百分比。GAP程序利用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math 2：482，1981)修订的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)比对方法。GAP程序优选的默认参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵(包括相同时为1不同时为0的值)和Gribskov和Burgess(Nucl.Acids Res.14：6745，1986)的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编辑，《Atlas of Protein Sequence and Structure》，NationalBiomedical Research Foundation，353-358页，1979所述；(2)每个缺口罚分为3.0，每个缺口中的每个符号额外罚分0.10；和(3)末端缺口无罚分。

变体可以包括保守性替换的序列。保守性替换指用具有相似生理化学特征的残基取代给定的氨基酸残基。保守性替换的实例包括脂肪残基彼此替换，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸彼此替换，或极性残基彼此替换，如赖氨酸和精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸或谷氨酰胺和天冬酰胺之间。其他这种保守性替换(如具有相似的疏水性特征的整个区域的替换)是众所周知的。

可以使用本领域已知的多种方法筛选候选抗GPVI抗体对血小板粘着和活化的影响。这些方法包括如U.S.专利No.5,686,571所述的血小板粘着抑制剂测定法、可以使用较少体积的血和较少抗体的Diaz-Ricart等的改良恒流测定法(Blood 82：491-496，1993)，如Brown和Larson(BMCImmunology 2：9-15，2001)所述、Matsuno等(British J.Haematology92：960-967，1996)和Nakamura等(J.Biol.Chem.273(8)：4338-44，1998)(“Nakamura方法”)所述的平板测定法(均特别引入本文为参考)。对于每种情况，都可以在存在或不存在Mg²⁺的情况下将候选GPVI激动剂或拮抗剂与反应组分预孵育或共孵育。不存在Mg²⁺情况下的孵育阻断GPIa/IIa的功能，从而残留的胶原依赖性活性主要由GPVI受体介导。

修改的Nakamura方法可以用于测定静止条件下血小板对固定的酸不溶性纤维胶原的粘着。修改的Nakamura测定概述于下文。对原始方法的主要修改包括用未标记的血小板代替⁵¹Cr标记的血小板，并通过用市售的试剂盒定量粘着血小板释放的LDH活性来测量粘着。本领域技术人员了解如何根据测试的特定抗GPVI抗体对测定条件进行其他修改。

粘着测定——用I型酸不溶性马腱纤维胶原包被微量滴定板的孔。将4×10⁸/ml浓度的血小板悬于Tyrode-HEPES缓冲液或补充了Mg²⁺(1ml)的Tyrode-HEPES缓冲液中，并如前述(Tandon等，Br.J.Haematol.89：124-30，1995)进行粘着测定。简言之，在加入到用胶原包被的孔之前，先在室温下将血小板和样品(如抗体溶液)孵育30分钟。在存在或不存在Mg²⁺的情况下在室温粘着60分钟。重复洗涤孔以去除未粘着的血小板，将粘着的血小板溶于Triton X-100中。使用基于比色测定的市售LDH测定试剂盒(CytoTox 96，Promega，Madison，Wl，USA)测定释放的LDH活性。

ATP释放和血栓烷A ₂ (TXA ₂ )生成的测定——在双通道生物发光凝集测定仪(650CA型-Chronolog Corporation Havertown PA，USA)中测量胶原诱导的ATP释放。简言之，将富含血小板血浆(用贫血小板血浆将血小板计数调整至3×10⁸/ml)与萤光素酶-萤光素试剂(ChronologCorporation)混合。接触胶原之前，先在存在或不存在测试抗体溶液(如Fab片段)的情况下于37℃孵育5分钟。同时测量聚集和ATP释放。在所需时间通过加入抑制TXA₂合成的抑制剂的混合物终止反应。将血小板悬液的上清液转移到小管中并冻存于-20℃至测量胶原诱导的TXA₂形成。以TXB₂(TXA₂的稳定代谢物)测量TXA₂。

血小板聚集测定——Sun等，J Cardivascular Pharmcol.40：557-585(2002)所述的血小板聚集测定提供了检测或测定抗凝血活性的简单方法。将抗GPVI抗体(如完整IgG、F(ab′)₂或Fab片段)或对照缓冲液(0.15M NaCl、0.01M Tris.HCl，pH 7.4)加入含有富含血小板血浆(200μl)的试管中。在用胶原诱导聚集之前，先将混合物在聚集测定仪的加热管中在37℃孵育3到5分钟。将试管置于四通道聚集测定仪(AG10 Kowa，Japan)中，所述测定仪通过激光散射测定微粒形成动力学，并通过光透过的变化测定聚集。用0.5-4μg/ml的胶原起始聚集。胶原的最佳浓度为给出至少70％的光透过变化的浓度，并对每个实验进行测定。在加入胶原后至少监测8-10分钟的聚集。

体外测定——还可以使用Diaz-Ricart及其同事(Arteriosclerosis，Thromb.Vase.Biol.16：883-888，1996)开发的系统进一步测定GPVI特异性抗体或抗体片段。此测定用去内皮的兔主动脉和人内皮细胞基质测定流动条件下GPVI抗体对血小板的影响。

体内测定——可以用血小板功能的标准模型测定GPVI抗体或抗体片段的体内活性，如Coller和Scudder，Blood 66：1456-59(1985)；Coller等，Blood 68：783-86(1986)；Coller等，Circulation 80：1766-74(1989)；Coller等，Ann.Intern.Med.109：635-38(1988)；Gold等，Circulation 77，670-77(1988)和Mickelson等，J.Molec.Cell Cardiol.21：393-405(1989)所述。

以上测试证明本发明的GPVI特异性抗体比其他人已经报道的更为有效。具体的，本发明的GPVI特异性抗体以比本领域抗体更低的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板聚集。术语“IC₅₀”在本领域中是观察到50％抑制时的浓度，并且是任何大于0的正值。用接触血小板后在5分钟内诱导70％-90％血小板聚集的浓度测定诱导抑制胶原诱导的血小板聚集的IC₅₀。术语“抑制”指任何表型特征的减弱或消失，或该特征的发生率、程度或可能性的降低或消失。就血小板聚集而言，“抑制”指血小板聚集可测量的降低或消失。可以通过上述测试或本领域已知的任何其他方法来测试这种抑制。类似的，就血小板粘着而言，“抑制”指血小板对表面的粘着的可测量的降低或消失。可以通过上述测试或本领域已知的任何其他方法来测试这种抑制。

本发明的GPVI特异性抗体以低于约7、4、3、2、1、0.6μg/ml或此范围内的任何值的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板聚集。本发明的GPVI特异性抗体还以低于或等于约1、0.5、0.2、0.1μg/ml抑制胶原诱导的血小板粘着。本发明的GPVI特异性抗体还抑制胶原诱导的ATP分泌和/或胶原诱导的血栓烷A₂形成。本发明的GPVI特异性抗体包括活性抗体片段。活性抗体片段包括化学、酶或重组产生的Fab片段、F(ab)₂片段和含有至少一个对GPVI多肽、肽或其天然存变体具有特异性的互补性决定区(CDR)的肽。

可以根据已知方法将本发明的GPVI特异性抗体配制进药物组合物。本发明的药物组合物含有至少一种GPVI特异性抗体，包括但不仅限于完整单克隆抗体、Fab片段、F(ab)₂片段和含有至少一个CDR序列的肽或其变体。GPVI特异性抗体可以与其他已知的活性物质组合。

本发明的组合物含有与可药用赋形剂混合的至少一种GPVI特异性抗体，所述可药用赋形剂包括但不仅限于溶剂(如Tris-盐酸、乙酸、磷酸、水)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、盐、聚合物、缓冲液、增溶剂、佐剂和/或载体。合适的赋形剂及其制剂方描述于Remington：《The Science and Practice of Pharmacy》，第20版，Mack Publishing Co.(2000)。此外，这些组合物可以含有与聚乙二醇(PEG)、金属离子复合的GPVI特异性抗体，所述抗体掺入多聚体化合物如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶等或掺入脂质体、微乳、微团、单层、多层或共层载体、红细胞血影或球芽中。

本发明还包含(如通过抑制血小板聚集或血小板粘着)抑制血栓形成的方法，所述方法包括使活化或静息血小板接触针对GPVI的抗体。“抑制血栓形成”指患者、患者群或体外测试系统中血栓形成事件的降低或消失或血栓形成事件的发生率、程度或可能性的降低。本发明还涉及使患者(定义为需要抗血栓形成治疗的任何人或非人动物)降低血栓形成或血小板聚集或血小板活化的发生率、可能性或程度的治疗，或涉及血管疾病的治疗可能对其有益的受试者(包括人和非人动物)。这些待治疗的非人动物包括驯养或野生的脊椎动物，包括但不仅限于小鼠、大鼠、兔、鱼、禽、仓鼠、狗、猫、猪、绵羊、马、牛和非人灵长类。

对患者的治疗包括施用药物有效量的本发明含有抗GPVI抗体的组合物。本领域的普通技术人员可以经验性地确定施用这些组合物的最佳剂量和给药计划。尽管如此，药物有效剂量是提供可测量的抗血栓形成效应(如体内或体外测定中血栓形成、血小板聚集或血小板活化的发生率、程度或可能性的降低)或提供患者中血管疾病、血块或栓子形成或缺血事件性的可能性、发生率或程度的可测量的降低的剂量。

可以以单次给药或在疗程中以多次给药施用药物有效量。本发明范围内的试剂盒包括容器，所述容器中含有一剂或多剂药物有效剂量的本发明含有抗GPVI抗体的组合物。这些试剂盒包括单独的、混合或悬于适当可药用溶剂和/或其他赋形剂的抗GPVI抗体或在施用前配制成混合或悬于适当可药用溶剂和/或其他赋形剂的抗GPVI抗体。

可以通过本领域普通技术人员所熟悉的任何方法施用本发明的组合物，如通过静脉团注、连续或间歇输注静脉给药。在备选的实施方案中，可以腹膜内、体内、关节内、心室内、鞘膜内、肌内、皮下、局部、扁桃体、粘膜、鼻内、经皮肤、阴道内、经口或吸入施用组合物。

本发明的GPVI特异性抗体还可用于筛选可用作抗血栓剂的化合物。筛选方法包括使GPVI抗原接触测试化合物和GPVI特异性抗体，并测量对GPVI特异性抗体与GPVI多肽、肽或其天然存在变体的结合的抑制。可以以任意顺序加入GPVI抗原、GPVI特异性抗体和测试化合物。例如，可以在接触GPVI特异性单克隆抗体之前先使GPVI抗原与测试化合物接触。在另一实例中，GPVI抗原可以同时与GPVI特异性单克隆抗体和测试化合物接触。

对结合的抑制提示测试化合物竞争(或干扰)与GPVI特异性抗体相同的GPVI结合位点。就筛选抗血栓剂而言，“GPVI抗原”指(但不仅限于)从血小板或其他表达GPVI的细胞分离的天然GPVI多肽、肽或其天然存在变体、由原核或真核细胞表达的重组GPVI多肽、肽或其天然存在变体或表达GPVI多肽、肽或其天然存在变体的细胞。测试化合物可以是任何化学品、蛋白质、肽、多肽或核酸(DNA或RNA)。测试化合物可以是天然存在的或通过本领域已知方法进行合成。本发明的筛选方法可以利用高通量筛选(HTS)方法。高通量筛选方法综述于Khandurina等，Curr Opin Chem Biol.6：359-66(2002)；Kumble，Anal Bioanal Chem.377：812-819(2003)和Bleicher等，Nature Rev Drug Disc 2：369-378(2003)。

对于鉴定为抑制GPVI特异性抗体或其抗体片段与GPVI抗原结合的化合物，可以通过本文公开的任何方法或本领域已知的其他方法进一步测试其对血小板功能的影响。这些血小板功能包括胶原诱导的血小板聚集、胶原诱导的血小板粘着、胶原诱导的ATP分泌和胶原诱导的血栓烷A₂形成。

通过以下实施例说明本发明，所述实施例毫无限制本发明的意图。

实施例1

单克隆GPVI抗体的制备

如下文所述免疫正常小鼠(Balb/c、雌性)、亚美尼亚仓鼠(雄性)和GPVI敲除小鼠(产生于Otsuka GEN institute)以产生单克隆抗体。

如前述产生GPVI敲除小鼠(Mori等Neurosci.Res.43：251-7，2002)。如图1A所示，通过用pMC1-neo-聚腺苷酸(Stratagene)盒替换129/Sv小鼠基因组λ克隆(Clalsite)的GPVI基因基因组片段来构建靶载体(Ezumi Y.等，Biochem Biophys Res Comm 277：27-36，2000)，被替换的基因组片段含有外显子2的最后5个碱基和外显子3的前一半。电穿孔使线性化的构建体进入来自129/Sv小鼠的AB2.2ES细胞(LexiconGenetics Inc.，The Woodlands，TX)并在G-418中选择细胞。通过分别用5’和3’外部探针探查Sphl或Kpnl消化的基因组DNA来筛选G-418抗性ES细胞克隆中在外显子2和3处成功进行的同源重组(图1B，Southern印迹数据未显示)。使来自同源重组ES细胞的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配以获得杂合突变体(F1)。使获得的杂合突变体进行交配并通过Southern印迹进行确认来产生纯合突变体(F2)。用提取自尾尖的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)测定小鼠的基因型。在纯合突变体中未观察到出生率、出生体重、生长发育、孟德尔分配或出血障碍的异常。用背景匹配的野生型杂合小鼠作为对照。亚美尼亚仓鼠得自CytogenResearch and Development Inc.Boston，MA。在Otsuka MarylandMedicinal Laboratories按照Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)方案保持和繁殖所有动物。

用含有GPVI cDNA的质粒(“p-target”)、表达GPVI-FcRγ链的CHO细胞系(“CGP6”，其中用Invitrogen的Lipofectamine^TM 2000进行转染)、从表达GPVI-FcRγ链的CHO细胞纯化的GPVI(“PGP6”)、从人血小板纯化的天然GPVI(“nGP6”)和大肠杆菌中表达的重组局部GPVI(“PGAP6”)(缺乏第一个Ig结构域)免疫正常小鼠。通过组合U.S.Publication No.2003/0186885所述的凝集素亲和、离子交换层析和惊厥素亲和方法纯化来自人血小板的天然GPVI和来自用GPVI-FcRγ转化的细胞的PGP6。

通过用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染含有全长人GPVIcDNA的pTarget载体(Promega)(“p-target”)和含有全长FcRγcDNA的pcDNA3.1(+)zeocin载体(Invitrogen)来建立稳定表达GPVI和FcRγ的CHO细胞(“CGP6”)。在补充了G418和zeocin的培养基中选择表达两种受体的细胞。用多克隆人抗GPVI抗体(前述Okuma博士的血清)或FITC标记的惊厥素通过使用Epic Altra FACS分析仪(BeckmanCoulter)的FACS分析检测GPVI表达。通过使用市售的抗FcRγ多克隆抗体(Upstate Biotechnology)的免疫印迹进行FcRγ表达的检测。

通过将编码缺少人GPVI整个第一个Ig结构域的GPVI多肽的cDNA插入pET21载体(Novagen)来制备重组局部GPVI。在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达此局部蛋白质。如生产商所述从包涵体中纯化表达的蛋白质(“PAGP6”)。

用CGP6和人血小板免疫亚美尼亚仓鼠。GPVI敲除小鼠也用CGP6和人血小板进行免疫。

腹膜内注射除p-target以外的免疫原。皮内注射p-target。以含佐剂(Titermax Gold，Cytrx Corporation)的乳剂注射重组或纯化的蛋白质。一些抗原与小鼠IL-6(500U/次注射)一起免疫以增强免疫系统。免疫动物直至获得10-50000之间的血清效价。

通过常规杂交瘤技术产生单克隆抗体。使用P3U1细胞作为融合配偶体。为筛选阳性杂交瘤克隆，使用表达GPVI-FcRγ的CHO细胞在Beckman Coulter的Epic Altra FACS分析仪中进行FACS分析。对于用CGP6免疫的动物，用转染GPVI-FcRγ的CHO细胞和未转染的野生型CHO细胞进行FACS分析以区分产生非GPVI抗体(如CHO细胞相关抗原的抗体)的克隆。

接着在含有10％胎牛血清(含有＜1μg/ml血清的可忽略量的牛IgG)(Invitrogen Corporation，CA)的培养基中培养产生抗GPVI抗体的杂交瘤细胞。通过Waters 650系统(Waters Corporation，MA)上的G蛋白-琼脂糖(Amersham Biosciences，NJ)或A蛋白-琼脂糖(AmershamBiosciences，NJ)亲和层析从无细胞的培养基上清液中纯化IgG。通过G蛋白-琼脂糖的亲和层析纯化小鼠IgG。用A蛋白-琼脂糖纯化仓鼠IgG。用低pH甘氨酸(pH 2.75)从亲和基质上洗脱与G蛋白结合的IgG，收集到碱性溶液中以中和酸并在盐水中透析以用于功能测定。以pH梯度7.5-3.0洗脱与A蛋白结合的仓鼠IgG。抗体在pH 4.5洗脱。在大多数情况下，用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technology)分析时抗体纯度＞90％。

使用标准方法，通过木瓜蛋白酶消化从完整IgG制备二价F(ab′)₂片段。在100mM柠檬酸、pH 6.5、5.0mM EDTA中制备IgG溶液(5mg/ml)并按酶与IgG比例1∶50(重量/重量)用预活化的木瓜蛋白酶(无半胱氨酸)在37℃消化15小时。用新制备的碘乙酰胺结束反应，并通过MonoQ柱(Amersham Biosciences，NJ)的离子交换层析将F(ab′)₂片段从未消化的IgG和Fc中分开。混合含F(ab′)₂的级分、浓缩并按照Parham等，J.Immunol.Meth.53：133-173(1982)的方法还原/烷基化以获得一价Fab片段。最后，通过Superdex 75(Amersham Biosciences，NJ)的分子排阻层析纯化Fab片段至均一。避免在半胱氨酸存在下用木瓜蛋白酶将IgG直接转换为一价Fab，因为在一些情况下，木瓜蛋白酶过度消化IgG，产生不稳定且大小较小的Fab片段。

首先，如上文所述用免疫原(包括从人血小板纯化的GPVI(“nGP6”)、含有GPVI cDNA的质粒(“p-target”)和表达GPVI-FcRγ链复合物的CHO细胞(“CGP6”))免疫野生型Balb/c小鼠。参阅表1。筛选超过8500个克隆之后，鉴定了三个对GPVI具有显著但适度的亲和力的克隆(两个来自CGP6，一个来自PGP6)。令人吃惊地，来自p-target、nGPVI和PAGP6免疫的超过5500个克隆中未得到一个具有生物活性的GPVI阳性克隆。在获得具有增强的亲和力和生物活性的抗体的尝试中免疫了不同物种的动物。用CGP6免疫了亚美尼亚仓鼠，因为此抗原在野生型小鼠中产生了两个阳性克隆。由于人血小板在其表面表达天然GPVI，还使用经洗涤的人血小板作为免疫原。从CGP6免疫中获得了七个GPVI阳性克隆，从人血小板免疫中获得了一个克隆。参阅表2。

其后用GPVI敲除(GPVI-KO)小鼠作为免疫宿主。GPVI-KO小鼠缺乏GPVI，不应答于高剂量的胶原和惊厥素(GPVI特异性激动剂)。因此，理论上注射的GPVI在GPVI缺陷型小鼠中可能免疫原性更高，并因而产生对GPVI肽具有高亲和力的GPVI抗体。GPVI-KO小鼠的免疫结果示于表3。用经洗涤的人血小板悬液免疫GPVI-KO小鼠未产生阳性克隆。然而，用CGP6免疫GPVI-KO小鼠得到了八个克隆，通过FACS分析中荧光强度的大量右侧偏移判断其对GPVI具有高亲和力。

接着从GPVI阳性克隆中获得IgG免疫球蛋白：来自野生型小鼠的3个克隆、来自仓鼠融合物的8个克隆和来自GPVI-KO小鼠融合物的8个克隆。如上述通过使用G蛋白(野生型和GPVI-KO小鼠)或A蛋白(仓鼠)的亲和层析纯化IgG。从所有克隆纯化的抗体以相对低的IgG浓度(0.1-7μg/ml(17个克隆)，10-30μg/ml(2个克隆))诱导完全的血小板聚集，提示这些抗体与GPVI和FcR IIA交联，或与GPVI分子交联。为排除GPVI-FcRIIA的可能性，制备了F(ab′)₂片段。在初步研究中，从两种抗体制备的F(ab′)₂片段活化人血小板(尽管与完整IgG相比需要高若干倍的浓度)。这证实了二价抗体引起的GPVI交联可能是所观察到血小板活化的原因。为避免GPVI交联，通过还原/烷基化将所有的F(ab′)₂片段转变为Fab片段。以比完整IgG活化人血小板的浓度高若干倍的浓度进行测试时，得到的Fab片段未活化人血小板。

实施例2

GPVI特异性抗体是胶原诱导的血小板聚集和粘着的有效抑制剂

在静止和流动条件下测试按照实施例1制备的Fab片段对胶原诱导的血小板功能(包括胶原诱导的血小板聚集和血小板对固定胶原的粘着)的抑制潜力。

如下测试抗体的体外血小板聚集。由于胶原应答在个体间存在差异，首先进行胶原剂量实验以确定在加入后5分钟内给出70％-90％血小板聚集的胶原量。此外，测定中使用的胶原类型可能显著影响应答。从经验看，酸不溶性马腱胶原(Nycomed，Germany)提供最强的血小板聚集应答。Nieswandt(J.Biol.Chem.275：23998-24002，2000和U.S.专利出版物No.2002/0141992)、Lecut等(J.Thrombosis and Haemostasis 1：2653-2662，2003)和Moroi等(Thromb.Haemost.89：996-1003，2003)也使用酸不溶性马腱胶原，而其他人使用应答较弱的胶原形式，如牛胶原I型纤维(Smethurst等，Blood 103：903-911，2004和WO 03/054020)。在下文示例的测定中，用1-4μg/ml酸不溶性马腱胶原(Nycomed，Germany)检测特定的Fab制剂对血小板聚集的影响。使用的胶原类型与Qian等(Human Antibodies 11：97-105，2002)、WO 01/00810、WO 02/080968及其相关应用中所使用的相同，但如下文所讨论的，与Qian，WO 01/00810和WO 02/080968公开的GPVI抗体相比，本发明的GPVI抗体显示明显更强的抑制效果。

在1/10体积的3.8％柠檬酸钠(作为抗凝血剂)中收集血液进行血小板聚集测定(Nakamura等，J.Biol.Chem.273(8)：4338-44，1998)。通过室温下以180xg离心全血15-20分钟获得富含血小板血浆(PRP)。在进行血小板聚集研究之前，计数血小板并用贫血小板血浆调整至3-4×10⁸个血小板/ml。所有实验都在采血后3-4小时内进行，且全程将PRP保持在室温下。在四通道聚集测定仪AG10(Kowa，Japan)中进行聚集研究，其通过激光散射测量微粒形成动力学，通过光谱可见区650nm处的光透过测量聚集。加入酸不溶性马腱胶原(Nycomed，Germany)之前，将PRP与不同量的Fab片段在37℃孵育10分钟(静置5分钟接着搅拌5分钟)，并再监测聚集5-10分钟。

使用Nakamura等，J.Biol.Chem.273：4338-4334(1998)先前描述的改良方法检查静止条件下血小板对胶原的粘着。简言之，在加入用胶原包被的孔(酸不溶性马腱胶原，2μg/孔)中之前，先将经洗涤的血小板与所需量的Fab片段在存在和不存在Mg²⁺的条件下于室温孵育30分钟。室温孵育60-90分钟后，用缓冲盐水温和洗涤去除未粘着的血小板，通过用市售的LDH试剂盒(Promega，MA)测定粘着血小板的LDH含量来量化粘着。

在Glycotech(Rockville，MD)开发的流式小室中测定流动条件下血小板对固定胶原的粘着。在以高剪应力(2600秒^-1，2分钟)通过胶原(5μg/孔的酸不溶性马腱胶原)(Nycomed，Germany)包被的流式小室之前，先将用重组水蛭素(50单位/ml)抗凝的全血与含有Fab片段的溶液在37℃孵育15分钟。用磷酸缓冲盐水洗涤未粘着的血小板，用戊二醛固定粘着的血小板(0.5％，重量/体积，1小时)并用甲苯胺蓝/硼酸钠染色(0.05％，5分钟)。通过数字影像分析估计血小板表面覆盖。用来自10个非重叠影像的平均值测定表面面积覆盖百分比。

在选择的抗体中，来自四种IgG的Fab片段OM1、OM2、OM3和OM4抑制人血小板由胶原诱导的血小板聚集。参阅表2、3和4。Fab片段对胶原诱导的血小板聚集的抑制效能的顺序为OM1＞OM2＞OM3＞OM4。每种抗体抑制胶原诱导的血小板聚集的平均IC₅₀和SD值示于表4。

还测试了每种抗体对大鼠、狗和猴血小板的交叉反应性。猴血和狗血购自Covance Research Inc，Vienna，VA。Sprague Dowley大鼠得自Charles River Laboratories，Willmington，MA。所有四种Fab片段均抑制猴血小板由胶原诱导的聚集。有趣的是，OM4与大鼠血小板交叉反应。这些GPVI特异性抗体是测试GPVI特异性抗体在动物模型中的效应的有用工具。2004年4月29日将产生OM1、OM2、OM3和OM4抗体的杂交瘤分别以ATCC No.PTA-5938、PTA-5939、PTA-5940和PTA-5941保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。

表4：抗GPVI Fab片段对人血小板由胶原诱导的聚集的影响和与非人血小板的交叉反应性

^*使用来自3个不同受试者的血小板获得剂量应答曲线。通过非回归分析计算IC₅₀值。值为3个实验的平均值±SD。

^**与动物血小板的交叉反应性基于各个Fab片段抑制胶原诱导的血小板聚集的能力和FACS分析中的正向右移。(+)符号代表Fab片段抑制胶原诱导的聚集和正向右移，而(-)符号代表两个测试均无反应。

^***未测定。

为进行比较，在与测试GPVI特异性抗体相同的条件下对若干相同供者用ReoPro(Centocor，Inc.)(广泛使用的人-小鼠嵌合抗GPIIb-IIIaFab片段)和抗GPIIb-IIIb单克隆抗体7E3(Colter和Scudder，Blood66：1456-1459，1985)的F(ab′)₂片段进行测试。ReoPro

以1.71μg/ml的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板聚集。因此OM1具有比ReoPro更强的抑制潜力，而OM2与ReoPro等效。在此测定中ReoPro

比OM3和OM4有效2-4倍。7E3F(ab′)₂与大鼠血小板交叉反应，而ReoPro

则不然(见表4)。

还测试了静止条件下Fab片段对血小板粘着的影响。在存在(GPIa-IIa及GPVI依赖性)及不存在Mg²⁺(GPVI依赖性)的情况下下进行粘着。非Mg²⁺依赖性粘着仅依赖于GPVI的存在，并被相对低浓度(IC₅₀范围0.1-1μg/ml)的全部四种Fab抑制，如图2所示。OM1、OM2和OM3具有相似的抑制活性(IC₅₀范围0.1-0.2μg/ml)而OM4达到相似的抑制则需要稍高的剂量(IC₅₀范围0.2-1μg/ml)。与非Mg²⁺依赖性粘着过程所需的Fab片段相比，Mg²⁺依赖性粘着需要相对较高剂量的Fab片段(见图2)。然而，Fab均不能完全阻断血小板对胶原的Mg²⁺依赖性粘着。

使用更低的剂量(0.001-1μg Fab/ml)重复静止条件下Fab片段对非Mg²⁺依赖性血小板粘着的影响。如图3所示，0.1μg Fab/ml的OM2和OM4Fab片段抑制40％-60％的血小板粘着，而相同浓度的OM1和OM3Fab片段抑制10％-20％的血小板粘着。这一偏差可能是由于批次差异和供体的差别。总之，OM系列Fab片段以低于0.5μg/ml的浓度有效抑制GPVI依赖性(非Mg²⁺依赖性)粘着。

还在接近体内情况的条件下如上述测试了抗GPVI Fab片段对血小板粘着的抑制效应。在高剪应力条件下(2600秒^-1)，OM1、OM2、OM3、OM4的Fab片段显著抑制血小板对固定胶原的粘着。与对照样品相比，抗GPVI Fab诱导聚集物大小和形态的显著改变(图4)。作为比较，ReoPro(Centocor，Inc.)也阻止聚集物形成，但在胶原纤维上观察到了单个血小板的均一层(图4)。

聚集物的形态是两个事件的结果：(1)血小板原始单层覆盖的区域和(2)其后的聚集物形成(从而给总体情况加入体积量纲)。聚集物形成的显著减少与抗GPVI Fab的表面覆盖一起提示GPVI不仅涉及原始粘着过程，而且在粘着后事件(包括血小板活化和其后的血栓生长)中发挥重要作用。

聚集和粘着测定证明本发明GPVI特异性抗体的Fab片段如OM1、OM2、OM3和OM4是血小板功能的有效抑制剂。它们在抑制胶原诱导的血小板聚集上比小鼠单克隆抗体9O12.2更有效，后者产生自用编码重组可溶性GPVI-Fc(rsGPVI-Fc)融合蛋白的cDNA免疫的小鼠，如Lucet等(J.Thrombosis and Haemostasis 1：2653-2662，2003)、WO 02/80968和US专利出版物2004/0253236所述。另外，OM抗体在抑制对胶原的非Mg²⁺依赖性粘着上比9O12.2Fab片段更有效。

Nieswandt(J.Biol.Chem.275：23998-24002，2000和U.S.专利出版物No.2002/0141992)报道了针对小鼠GPVI的大鼠单克隆抗体JAQ1。然而饱和浓度的JAQ1(20μg/ml)仅对胶原诱导的血小板聚集显示有限的抑制效应(参阅U.S.专利出版物2002/0141992，第29段)。此外，在我们或其他人的实验中，在FACS分析或Western印迹中JAQ1不识别人GPVI(参阅Takayama等，J.Thrombosis and Hemostasis 14：75-81，2003)。

其他人已经产生了单链Fv(ScFv)。例如，Qian等(Human Antibodies11：97-105，2002)报道了GPVI的单链Fv(ScFv)抗体，其在使用2μg/ml与本发明所使用的相同胶原进行的胶原诱导血小板聚集研究中IC₅₀为80-90μg/ml。因此与Qian等相比，本发明的GPVI特异性抗体在抑制胶原诱导的血小板聚集上显著地更有效。与本发明的GPVI特异性抗体相比，还报道于WO 01/00810、WO 02/80968及其相关出版物的ScFv需要显著更高的浓度(110-150μg/ml ScFv)来抑制胶原诱导的血小板聚集。

类似的，Smethurst等(Blood 103：903-911，2004和WO 03/054020)报道了在胶原诱导的血小板聚集中IC₅₀为12-16μg/ml的GPVI ScFv抗体。比较而言，OM1、OM2、OM3和OM4比Smethurt的ScFv更有效。另外，尽管U.S.专利No.6,245,527和6,383,779公开了抗GPVI抗体，但他们未提供在抑制胶原诱导的血小板聚集上与本发明的抗体同样有效的抗GPVI抗体的任何实例。

实施例3

GPVI特异性抗体抑制胶原诱导的分泌和血栓烷A₂形成

还测试了本发明GPVI特异性抗体Fab片段对胶原诱导的分泌和血栓烷A₂(TXA₂)形成的影响。分泌指由激动剂诱导的从血小板的α和致密颗粒释放生物活性内含物。

量化由激动剂诱导的释放的一种方法是使用化学发光方法通过萤光素酶测定来测量培养基中的ATP含量。使用生物发光聚集测定仪(Chronolog Corporation，PA)和萤光素酶-萤光素试剂对富含血小板血浆(PRP)测试胶原诱导的ATP分泌。生物发光聚集测定仪同时测定激动剂诱导的血小板聚集和ATP分泌。简言之，用注射器将人血直接抽到3.8％柠檬酸钠中(9∶1体积的血∶柠檬酸盐)。通过在180xg离心15分钟制备富含血小板血浆(PRP)。将PRP(360μl)与40μl萤光素酶-萤光素试剂(Chrono-lume；Chronolog Corporation，PA)混合并将混合物与不同量的测试Fab、ReoPro

或对照在37℃孵育5分钟。5分钟时加入1-4μg/ml胶原(酸不溶性马腱胶原)(Nycomed，Germany)并监测聚集和ATP分泌，持续8分钟。反应的最后(10-11分钟)加入已知量的ATP溶液以获得偏转量(deflection)，其用于计算激动剂激发后血小板分泌的ATP量。

在上文使用的平行样品中测定血栓烷A₂形成。上文加入胶原步骤10分钟后，在200μL PRP中加入500μL终止液(130mM NaCl中的50mMEDTA，2mM Indomethacin)以终止血栓烷A₂形成。将悬液在4℃以1000xg离心10分钟。保留上清液并冻于-20℃至进行血栓烷B₂测试，血栓烷B₂为血栓烷A₂的稳定代谢物。使用市售的试剂盒(血栓烷B₂Biotrak测定，Amersham)定量血栓烷B₂。

OM1、OM2、OM3和OM4抗体的全部Fab片段均有效抑制胶原诱导的人血小板ATP释放(表5)。1μg/mL的OM1显示高于90％的抑制，3μg/mL OM2、OM3和OM4也得到高于90％的抑制。ReoPro

在抑制ATP分泌上比抗GPVI抗体效率低，提示抗GPVI Fab是胶原诱导的ATP释放的更好的抑制剂。已知血小板释放的次级激动剂协同血栓生长。因此，胶原诱导分泌的抑制剂(如本发明的GPVI特异性抗体)是血栓生长的有效抑制剂。

表5：抗GPVI Fab片段对人血小板受胶原诱导的ATP释放的影响^*

^*结果得自四个不同的血小板供者

胶原诱导的血栓烷A₂产生也被OM1、OM2、OM3和OM4Fab片段(表6)强烈抑制。在测试的四种Fab片段中，1μg/mL的OM1显示高于90％的抑制。3μg/mL的OM2和OM3也得到高于90％的抑制。3μg/mL的OM4抑制血栓烷A₂形成的约86％。相反，1μg/mL和3μg/mL的ReoPro

对血栓烷A₂形成的抑制效应很低或无抑制效应。还显示阻断GPVI抑制TXA₂的产生和粘着于胶原的血小板上活化的IIb-IIIa复合物的表达(Nakamura等，J.Biol.Chem.273：4338，1998；Nakamura等，J.Biol.Chem.274：11879，1999)。因此，抗GPVI Fab片段抑制TXA₂产生提示本发明的GPVI特异性抗体抑制引起活化的IIb-IIIa复合物表达的上游信号事件，并最终减弱血栓生长。

表6-抗GPVI抗体Fab片段对人血小板中胶原诱导的血栓烷A₂形成的影响^*

^*使用来自四个不同供者的血小板得到结果

实施例4

抗GPVI抗体Fab片段与GPVI的结合亲和力和反应性

按照Fujimura等Thromb Haemost 87：728-34(2002)的方法测定结合亲和力。按照lodo珠方法(Pierce，IL)由未标记的IgG制备结合亲和力测定中使用的¹²⁵I标记抗体。简言之，将一个lodo珠在含有0.5mCi无载体Na¹²⁵I(Amersham)碘化缓冲液中浸泡5分钟，接着加入候选IgG(100μg)。室温孵育5分钟后，将反应混合物应用于PD10柱(Amersham)以将与¹²⁵I结合的IgG从游离碘中分开。从柱上洗脱含有¹²⁵I-IgG的级分，用小体积(1μl)进行TCA沉淀。在γ计数器中对沉淀物和得到的上清液计数，以定量IgG中掺入的¹²⁵I。混合沉淀中具有最高计数的级分(＜95％)并在分光光度计中在280nm处读数以测定蛋白质浓度。在γ计数器中对已知体积进行重新计数，以获得标记IgG的比活性。多种抗体的比活性范围在0.33-0.97μCi/ug IgG。

通过将经洗涤的人血小板(5×10⁸/ml)与1nM ¹²⁵I-IgG在存在和不存在多种浓度的未标记同源IgG(0-500nM)的情况下孵育1小时来测定结合亲和力。通过将混合物在BSA(盐水中的10％溶液)溶液上分层和在15000×g离心10分钟将游离和结合的放射性分开。小心去除上清液和BSA层后，切去管子的尖头并在γ计数器中计数沉淀物的放射性。产生八到十个三次重复点的竞争结合等温线以评估单个IgG的结合。使用非线性回归分析软件Prism(GraphPad Software Inc.CA)分析数据。

结合亲和力实验显示全部四种抗体都易于与血小板结合，亲和力范围0.7-1.7nM(表7)。将本发明抗体与本领域已报道抗体的结合亲和力进行比较：ReoPro(Kd＝6.25±2.6×10^-9M)(来自Sassoli等ThrombHaemost 85：868-902，2001)，scFv-10B12(Kd＝7.9×10^-7M)(来自Smethurst等，Blood 103：903-91，2004)和9O12.2-IgG(Kd＝18×10^-9M)(来自WO02/080968)。ReoPro

和scFv-10B12为一价片段，而此实施例中使用的OM系列和9O12.2为IgG。全部四种OM抗体以比ReoPro、scFv-10B12和9O12.2-IgG已报道更高的亲和力与人血小板结合(表7)。一价片段一般具有比其相应完整IgG多少有所降低的亲和力，然而，该降低预计并不显著。

表7.抗GPVI抗体的结合亲和力

OM系列抗体的结合研究来自使用不同个体血小板的单次实验。每个数据点以一式三份进行实验。

^*数据来自Sassoli等Thromb Haemost 85：868-902，2001。

^**数据来自Smethurst等，Blood 103：903-91，2004。10B12是由噬菌体展示方法得到的针对GPVI的人特异性scFv抗体。

^***数据来自WO 02/080968。9O12.2是单克隆抗GPVI抗体。

进行Western印迹分析以测定OM系列抗体对来自多个物种的GPVI的反应性。将来自多个物种的血小板(1×10⁸/ml)溶于含有EDTA、EGTA、PMSF和NEM(各1mM)的2％SDS中。在4-20％预制Tris-甘氨酸梯度小型凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分开蛋白质，并将分开的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad CA)上。切下单个泳道并用TBS-T(10mM Tris.HCl pH 7.4、150mM NaCl和0.5％Tween 20)中的5％脱脂乳封闭60分钟。将硝酸纤维素条与OM抗体(2μg/ml)或生物素化的惊厥素在4℃孵育过夜。用TBS-T粗洗膜，并用缀合HRP的山羊抗小鼠IgG(OM1、OM2和OM4)、缀合HRP的山羊抗仓鼠IgG(OM3)或链霉抗生物素-HRP(生物素化惊厥素)于室温标记探针1小时。用远过量的TBS-T洗膜三次。用增强化学发光检测系统(ECL-Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)使免疫反应性条带显像。

在免疫印迹中，全部四种OM抗体均与来自人血小板的变性GPVI反应(图5)。用猴血小板也观察到类似的反应性(印迹未显示)。抗体均不与小鼠、猪、狗、兔或豚鼠血小板反应。仅OM4与大鼠血小板裂解液阳性反应。这些数据显示全部四种OM系列抗体都识别来自人和猴的GPVI，而OM4另外还识别大鼠血小板的GPVI。

实施例5

互补性决定区(CDR)

测定了OM1、OM2、OM3和OM4的互补性决定区(CDR)序列。

使用TRIzol(Invitrogen)从OM1、OM2、OM3和OM4杂交瘤分离总RNA。使用随机引物用Superscript First-Strand System(Invitrogen)合成cDNA。接着使用Heavy Primers或Light Primers混合物(Amersham)通过用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的聚合酶链式反应扩增抗体可变区相应的DNA序列。将扩增的DNA连接进pCR4-TOPO载体(Invitrogen)，并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将得到的构建体转化进化学感受态细胞。在卡那霉素存在下培养转化细胞并用E.Z.N.A.Plasmid Miniprep Kit II(Omega Bio-tek)分离扩增质粒。使用ABI PRISMBigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)在ABIPRISM 310遗传分析仪上对插入DNA进行测序。使用OMIGA 2.0软件(Oxford Molecular)分析DNA序列并转换为氨基酸序列。

OM1、OM2、OM3和OM4的CDR示于表8。

表8：抗GPVI抗体的CDR序列

OM1

H1：SYWMN(SEQIDNO：1)

H2：MIHPSDSETTLNQKFKD(SEQ ID NO：2)

H3：DDYYDSSSHALDY(SEQ ID NO：3)

L1：RASQSVSTSTYSYIY(SEQ ID NO：4)

L2：FASYLES(SEQ ID NO：5)

L3：QHIWEIPWTF(SEQ ID NO：6)

OM2

H1：DHYIS(SEQ ID NO：7)

H2：WIYPGYGNIRYNEKFKG(SEQ ID NO：8)

H3：SADGYFRYFDV(SEQ ID NO：9)

L1：RASGNIHNYLA(SEQ ID NO：10)

L2：NSEILAD(SEQIDNO：11)

L3：QHFWTAPFTF(SEQ ID NO：12)

OM3

H1：DFYMN(SEQ ID NO：13)

H2：SISGGSSDIKYADVVKG(SEQ ID NO：14)

H3：WGDHWDLDY(SEQ ID NO：15)

L1：QASQNIGNELN(SEQIDNO：16)

L2：GASSLYP(SEQ ID NO：17)

L3：KQDLNYPITF(SEQ ID NO：18)

OM4

H1：SFGMH(SEQ ID NO：19)

H2：FISSGSSTIYYADIVKG(SEQ ID NO：20)

H3：SGYANAMDY(SEQ ID NO：21)

L1：KASQDVSPAVT(SEQ ID NO：22)

L2：WASTRHT(SEQ ID NO：23)

L3：QQHYSFPWTF(SEQ ID NO：24)

实施例6

GPVI和血栓形成

在先前的研究中使用GPVI缺失或FcRγ-KO/GPVI缺陷型小鼠显示了GPVI在血栓形成中的作用(Nieswandt等，The EMBO Journal20：2120-2130(2001))。GPVI缺失和FcRγ-KO/GPVI缺陷型小鼠均缺少FcRγ链。在此实施例中，使用不缺少FcRγ链的GPVI-KO小鼠证实了GPVI与血栓形成的关系。

如上文所述产生GPVI敲除小鼠。这些小鼠的血小板不能应答于高剂量的胶原(20μg/ml)和GPVI特异性激动剂——惊厥素(3μg/ml)，但正常应答于ADP(5μM)(图6)。杂合GPVI缺陷型小鼠产生与野生型相比一半量的GPVI，对胶原和惊厥素显示降低的应答，但提高激动剂剂量后观察到正常应答(图6)。这些观察证实了GPVI作为血小板表面主要胶原受体的作用。

首先通过共注射胶原-肾上腺素(一般诱导致死性肺血栓栓塞症)测试GPVI在血栓形成和体内稳态中的作用(见表9)。用氯胺酮/甲苯噻嗪(150/15mg/kg，IP)麻醉小鼠，在右颈静脉中注射胶原和肾上腺素混合物(800/60μg/kg)。然后观察动物15分钟并按如下归类：(a)动物在注射10分钟内死亡，和(b)存活动物显示暂时性呼吸困难，在10分钟内缓解。缝合存活动物的手术创伤并将动物归还动物实验室。约83％(18个中的15个)的GPVI野生型小鼠在注射后5分钟内死亡。所有的杂合GPVI缺陷型小鼠(18个中的18个)在注射后5分钟内死亡。与野生型和杂合动物相反，约55％的GPVI-KO小鼠(纯合)在胶原和肾上腺素的致死性注射后存活，提示GPVI在胶原注射诱导的肺血栓栓塞症中发挥重要作用。

表9.GPVI在肺血栓栓塞症中的作用

表型	存活动物数	存活百分比
			野生型(+/+)	3/18	～16
杂合(+/-)	0/18	0
			纯合(-/-)	10/18	～55

如表10所示，GPVI敲除小鼠与野生型和杂合小鼠具有基本相同的尾出血时间。将GPVI敲除小鼠的出血时间与敲除β3整合素的小鼠进行了比较，β3整合素也见于血小板上并于血小板聚集和血栓形成相关(Kairbaan等，J.Clin.Invest.103：229-238，1999)。与GPVI缺陷型小鼠相反，纯合β3敲除小鼠持续出血。因此，由于不明显影响出血时间(因为GPVI敲除小鼠的出血时间与野生型相似)，体内施用抗GPVI Fab片段可能更安全。

表10野生型、杂合和纯合小鼠的尾出血时间：与β3敲除小鼠比较

^*J Clin Invest 103：229，1999

^**与野生型和杂合小鼠差异显著。多数情况下不得不人工止血以防止死亡。

为进一步证实GPVI在血栓形成中的作用，以2600秒^-1的剪应力将来自野生型、杂合和GPVI-KO小鼠的全血灌注到包被I型胶原的盖玻片上。来自GPVI-KO小鼠的血小板不能粘着于胶原纤维，而来自野生型和GPVI杂合小鼠的血小板粘着于胶原纤维并形成大血栓。在野生型和GPVI杂合小鼠间在表面覆盖度和血栓形态上没有差异。

实施例7

短尾猴中OM2 Fab片段对离体胶原诱导的血小板聚集和皮肤出血时间的影响

剂量升级研究

由于在使用短尾猴血小板的体外胶原诱导的血小板聚集测定中在OM抗体中显示出最强的抑制效果，因此进一步评估了OM2Fab片段。使用提高的剂量通过静脉注射对短尾猴施用OM2Fab片段，并评估其对离体胶原诱导的血小板聚集和皮肤出血时间的影响。以类似方式测试ReoPro

。

吸入麻醉后，以1小时间隔将OM2 Fab片段或ReoPro

静脉注射到前臂头静脉中。在每次注射后30分钟，采血用于测定胶原诱导的血小板聚集。通过将用柠檬酸钠抗凝的血连续离心制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。采血后1小时通过比浊法测定血小板聚集。取决于来自每只猴的血小板的应答性，用于诱导血小板聚集的胶原浓度在5至20μg/mL之间。每次注射抗体后30分钟，通过用带子以40mmHg缚紧前臂肌肉并用Triplett出血时间设备(Helena Laboratory)割破皮肤测定皮肤出血时间。用滤纸吸收伤口流出的血并测定出血时间直至出血停止或1800秒后。使用累积剂量的抗体评估抗体的效应。

OM2 Fab片段对胶原诱导的血小板聚集显示剂量依赖性抑制效应(图8)。在0.2mg/kg或更高的累积剂量下，OM2Fab片段抑制超过80％的血小板聚集。

ReoPro在胶原诱导的血小板聚集上也显示出剂量依赖性抑制效应(图8)，但以0.35mg/kg或更高的累积剂量抑制超过80％的血小板聚集。

0.8mg/kg累积剂量的OM2Fab片段仅轻微延长皮肤出血时间(基线值的2.4倍)(图9)。尽管OM2Fab片段在18.8mg/kg累积剂量为时轻微延长出血时间，但出血时间没有超过0.8mg/kg时所观察到的出血时间。

相反，ReoPro

显著延长皮肤出血时间(图9)。在0.35mg/kg的累积剂量下，平均出血时间比基线值延长5倍。此外，ReoPro

造成的出血时间延长是剂量依赖性的。在1.55mg/kg累积剂量下，出血时间比基线水平延长9.5倍。

总之，OM2 Fab对离体胶原诱导的血小板聚集显示与ReoPro等效的抑制效应。然而，OM2 Fab片段对皮肤出血时间的影响比ReoPro轻微许多。这些结果提示与GPIIb/IIIa阻断相比，阻断GPVI具有更好的风险/收益比，因此可能更适于临床治疗。另外，以0.4和0.8mg/kg施用ReoPro

后，一只猴的注射位点出现红斑。尽管此斑在数天后消失，但是在施用OM2 Fab后却未观察到异常。

药物动力学研究

静脉团注后，在三只短尾猴中评估OM2 Fab片段对离体胶原诱导的血小板聚集和皮肤出血时间的影响随时间的变化。类似地评估了ReoPro

的影响的变化。

此研究选择的0.4mg/kg剂量，因为OM2 Fab片段和ReoPro

分别以0.2mg/kg和0.35mg/kg抑制离体胶原诱导的血小板聚集。将抗体静脉团注进前臂头静脉后，在1、2、3、6和24小时采血。如上文剂量升级研究中所述，在每次采血1小时后测定血小板聚集。取决于每只猴的血小板的应答性，此研究中用于诱导血小板聚集的胶原浓度为5或10μg/mL。出血时间的测定也如上文剂量升级研究中所述在每次施用抗体后1、2、3、6和24小时进行。

在每次给药后1、2、3和6小时，以0.4mg/kg注射的OM2Fab片段抑制离体胶原诱导的血小板聚集超过80％(图10)。注射24小时后，血小板聚集恢复到接近基线水平。

类似的，给药后1和2小时，以0.4mg/kg注射的ReoPro抑制离体胶原诱导的血小板聚集超过80％(图10)。然而，与OM2 Fab片段相反，血小板聚集以时间依赖性方式恢复：给药后3小时抑制73％、6小时抑制47％，24小时为6％。

如图11所示，OM2 Fab在给药后1至6小时之间轻微延长皮肤出血时间(比基线水平长1.7到2.0倍)。出血时间在注射24小时后回到接近基线水平，与血小板聚集的恢复一致。

相反，ReoPro

在给药1小时后显著延长出血时间(比基线水平长10.7倍)(图11)。出血时间的延长以时间依赖性方式减弱。

这些结果显示OM2 Fab片段在血小板聚集上的抑制半衰期比ReoPro

长。此外，这些结果再次提示OM2 Fab片段的风险/收益比优于ReoPro。

实施例8

OM4 Fab片段对大鼠中离体胶原诱导的血小板聚集、出血时间和血小板计数的影响

另外测试了OM4 Fab片段对离体胶原诱导的血小板聚集、尾和趾甲出血时间的影响。为进行比较，以类似的方式测试7E3F(ab′)₂片段，7E3F(ab′)₂来自已建立的针对人血小板糖蛋白复合物GPIIb/IIIa产生的小鼠抗体(Collar等J.Clin Invest.72：325-338，1983)。从使用得自ATCC的7E3杂交瘤的大量培养物获得7E3 IgG。如Collar等J.Clin Invest.72：325-338，1983所述制备F(ab′)₂片段。在使用大鼠进行的初步研究中，OM4Fab和7E3F(ab′)₂的最佳剂量分别测定为20mg/kg和10mg/kg。离体胶原诱导的血小板聚集被OM4 Fab保持抑制30分钟，其后抑制在60-90分钟消除，提示OM4 Fab在大鼠中的快速清除。所有的观察在施用载体、测试和参照抗体20分钟后进行。

用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉成年雄性Sprague-Dawley大鼠。将填充肝素的导管插入股静脉、股动脉和颈动脉用于给药，分别记录血压/心率并采血。平衡期后，从颈动脉抽出少量血样(～1.2mL，用10U/mL肝素抗凝)用于血小板计数测定。使用全血聚集测定仪(Chrono-log，Havertown，PA)测定1μg/mL胶原引发的血小板聚集程度。还通过以下方法测定趾甲出血时间：在分开趾甲腹的点切去一个后肢趾甲，并每15秒用将血吸收到一片滤纸上(不接触甲切口表面)。甲出血时间定义为切断趾甲和不再有血吸收到滤纸上的时间点之间所经过的时间。

将载体、OM4 Fab或7E3 F(ab′)₂施用于股静脉。20分钟后，如上述抽取第二个血样用于聚集测定仪和血小板计数测定。抽取最后的样品后立即测定趾甲和尾出血时间。通过用锋利的手术刀片去除尾末端的3mm并将尾末端的2-3cm浸入37℃盐水中来测定尾出血时间。尾出血时间定义为切断尾和尾切口表面不再流血的时间点之间所经过的时间。每组(载体、OM4 Fab片段和7E3 F(ab′)₂)使用六只大鼠。

与载体相比，OM4 Fab和7E3 F(ab′)₂片段都在施用抗体片段20分钟后对血小板聚集产生统计学显著程度的抑制(P＜0.05)(图12)。尽管OM4 Fab组的波动性稍高，抑制是高度可再现的。静脉施用载体、OM4Fab和7E3 F(ab′)₂片段化合物后，血压和体中心温度无变化。

施用7E3 F(ab′)₂片段显著延长趾甲出血时间，而施用OM4 Fab对六只测试动物中的四只无影响(图13A)。在两只动物中，施用OM4 Fab使趾甲出血时间延长到26和31分钟。相反，除了一只趾甲出血在18分钟停止以外，7E3 F(ab′)₂片段在所有情况下都使趾甲出血时间延长超过30分钟(图13A)。学生t检验指出，接受7E3 F(ab′)₂片段的动物的平均趾甲出血时间显著长于OM4 Fab和载体组。与载体相比，OM4 Fab未诱导任何趾甲出血时间的显著延长。

与趾甲出血时间相似，施用7E3 F(ab′)₂片段的所有动物的尾出血时间显著延长，而施用OM4 Fab对六只测试动物中的四只无影响(图13B)。在两只动物中，尾出血时间延长至26和＞30分钟。相反，7E3 F(ab′)₂片段在所有情况下都使尾出血时间延长超过30分钟(图13B)。静脉施用载体、OM4 Fab和7E3 F(ab′)₂片段对血小板聚集无显著影响(图14)。

从此研究中得到的数据清楚地显示OM4 Fab(20mg/kg)和7E3F(ab′)₂片段(10mg/kg)对胶原诱导的血小板聚集引发相似程度的抑制，但7E3 F(ab′)₂片段显著延长出血时间。OM4 Fab抑制血小板功能而不显著影响出血时间的能力提示其可能有益于治疗。OM4 Fab可以提供与目前可用的血小板抑制剂相似的正效益而没有其不利的出血副作用。

实施例9

OM4 Fab片段在大鼠动脉血栓形成模型中的效应

还在大鼠体内动脉血栓形成模型中研究了OM4 Fab片段的效应。尽管文献中已经报道了体内血栓形成的多种模型，但由Folts(参阅如Circulation 83(6Suppl)：IV 3-14，1991)开发的模型被广泛用于测试抗血栓剂的效力。此原始模型开发于犬冠状动脉，但为了此研究修改模型用于大鼠颈动脉测试。简言之，机械损伤颈动脉，其后使其狭窄。血管损伤和使血管变窄(模拟血栓形成的发病机制即动脉硬化和狭窄的两种条件)的组合引起血栓形成。可以分别通过去除和替换血管阻塞物机械去除和重新形成血栓。这引起下文更详细讨论的循环血流减少(CFR)。抗血栓剂可以减少CFR数或完全防止形成CFR。

用戊巴比妥(50mg/kg，腹膜内注射)麻醉大鼠并通过气管插管机械透气。切开股静脉的一段用于药物注射。通过腹侧颈正中切口并剥离结缔组织来暴露颈动脉。将小流量探测器(Transonic，1RB，Transonic SystemsInc.，Ithaca，NY)置于动脉远端测量血流量。使用两种条件诱导血栓形成。第一种用合上棘轮的持针钳在中央暴露的动脉上每次10秒的三个连续十字钳闭产生损伤。第二种通过吹起血管阻塞物(1.5mm内径，In VivoMetric，Healdsburg，CA)减少基线血流量的50％，所述阻塞物由置于损伤位点的C形气球组成。由于形成血栓，血流量在2-5分钟内逐渐降到0。通过给气球放气物理移除血栓，血流量立即恢复。当减少50％血流量后，血流量减少到0和血流量恢复时计为1个CFR。重新减少50％血流量后，血流量再次逐渐降低，由于形成新的血栓而引起下一次CFR。计数30分钟观察期内的CFR数。将数目转换为半周期。

在损伤前组中，在应用机械损伤之前2分钟静脉团注20mg/kg的盐水或OM4Fab片段。记录30分钟的CFR。

在损伤后组中，通过内皮损伤和减少50％流量引发CFR。观察CFR15分钟，接着静脉团注20mg/kg的载体或OM4Fab片段。记录30分钟的CFR。

用不成对t检验比较盐水和OM4损伤前和损伤后组中的CFR数。P＜0.05则认为是显著的。

损伤前组

机械损伤前注射的20mg/kg的OM4Fab片段使CFR数从10.5±4.1(平均值±SD)降低到4.1±5.2(图15A)。此降低具有统计学意义(p＜0.02，t检验)。

损伤后组

建立CFR后注射的20mg/kg OM4 Fab片段也使CFR从12.2±3.8降低到3.5±3.6(图15B)。这一降低也具有统计学意义(p＜0.003，t检验)。此结果证明OM4 Fab片段甚至在血小板和内皮下胶原间已开始相互作用之后仍能抑制血栓形成。此外，这些结果提示抗GPVI抗体能有效抑制由内皮损伤/血流量扰动(被提出是临床症状中血栓疾病的触发机制)诱导的体内动脉血栓形成。

实施例10

GPVI占据率与对胶原诱导的血小板聚集的抑制之间的关系

研究了体外人血小板中血小板表面GPVI占据率和生物素化OM4Fab片段对胶原诱导的血小板聚集的抑制效应之间的关系。

用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)将OM4Fab片段生物素化。将生物素溶液(150μL，10mg/mL，溶于蒸馏水)加入PBS中的OM4 Fab片段溶液(5mg，2mg/mL)中。将反应试管在冰上孵育2小时。为了去除游离的生物素，在冷室中将反应混合物用盐水透析过夜。

从三个健康供体采血(含1/10体积的3.8％柠檬酸钠抗凝血剂)，并通过室温180xg离心15分钟获得富含血小板血浆(PRP)。计数血小板并用贫血小板血浆调整至3×10⁸个血小板/mL。在采血4小时内进行聚集测量。在AG10聚集测定仪(Kowa，Japan)中进行聚集研究。在加入胶原前，将PRP与生物素化的OM4 Fab片段(0、0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、10和20μg/mL)在37℃孵育10分钟并再监测聚集5-10分钟。在评估抗体之前对每个供体测定诱导70％-90％聚集所需的胶原量。

将PRP(3×10⁸个血小板/mL，每份400μL)与生物素化OM4Fab片段(0、0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、10和20μg/mL)在室温下孵育10分钟。然后按以下制备经洗涤的血小板。在PRP中补充1μg/mL PGE₁、1mM EDTA和EGTA并以2000xg离心10分钟。弃去血浆后，将血小板沉淀物悬于血小板洗涤缓冲液(PWB：补充了1mM EDTA和EGTA、0.1％NaN₃、100ng/mL PGE₁和0.35％BSA的磷酸缓冲盐水，pH 7.4)。接着离心血小板并再次洗涤。将经洗涤的血小板悬于小体积PWB中并计数血小板。最后，通过与等体积含有1％Triton X-100的磷酸缓冲盐水混合来溶解经洗涤血小板(1×10⁸个血小板/mL)。

使用链霉抗生物素(Pierce，21125)作为俘获试剂、山羊抗小鼠IgG抗体-HRP(American Qualex，A106PU)作为检测试剂，通过ELISA方法定量生物素化的OM4 Fab片段。

在全部三个供体中，胶原诱导的血小板聚集被3μg/mL浓度的生物素化OM4 Fab片段抑制超过75％。

在占据率测定中，假定20μg/ml生物素化OM2 Fab片段(结合量：26.4±5.5ng/5×10⁷个血小板)下占据率为100％。如图16所示，结合OM2 Fab片段的量在3μg/mL时饱和(24.3±3.5ng/5×10⁷个血小板)。3μg/mL时生物素化OM2 Fab片段的占据率为92％。此结果提示发挥对胶原诱导的血小板聚集最大的抑制效果需要血小板表面GPVI超过90％的占据率。

总之，本发明的GPVI特异性抗体可能是有用的抗血栓剂。如上文所证明，GPVI特异性抗体是胶原诱导的血小板功能的有效抑制剂。

根据本说明书中所引用参考文献的教导可以最彻底的理解本说明书，所述参考文献全部以其整体引入本文为参考。参考本文公开的说明书和实践，本发明的其他实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。说明和实施例旨在仅作为示例，本发明的实际范围和精神由以下的权利要求书指出。

申请人或代理人卷号03459.043-304

国际申请TBA

与保藏的微生物或其它生物材料有关的声名

        (PCT细则第13条之2)

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Claims (5)

1.GPVI多肽、肽或其天然存在变体特异的单克隆抗体或其片段，其中单克隆抗体选自ATCC No.PTA-5938的OM1、ATCC No.PTA-5939的OM2、ATCC No.PTA-5940的OM3和ATCC No.PTA-5941的OM4，且其中单克隆抗体片段是Fab片段或F(ab′)₂片段。

2.权利要求1的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体或其片段以低于7μg/ml的IC₅₀抑制胶原诱导的血小板聚集，所述IC₅₀是在血小板聚集测定法中使用诱导70％-90％血小板聚集的胶原浓度确定的；并且其中所述单克隆抗体或其片段以低于10^-8M的Kd与GPVI多肽或肽特异性结合。

3.用于产生GPVI多肽、肽或其天然存在变体特异的单克隆抗体的杂交瘤，所述杂交瘤选自具有ATCC保藏号PTA-5938、PTA-5939、PTA-5940和PTA-5941的杂交瘤。

4.抗血栓组合物，所述组合物包含药物有效量的权利要求1或2所述的至少一种单克隆抗体或其片段和可药用赋形剂。

5.用于检测GPVI多肽、肽或其天然存在变体的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的至少一种单克隆抗体或其片段和缀合至可检测物质的探针。

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