BRPI0708042A2 - método de prevenção ligação de células imunes a outras células, "decoy" de bst2, constructo quimérico, anticorpo monoclonal, método para isolar um ligante para bst2, camundongo transgênico cujas células do somatoplasma e células germinativas compreendem um gene bst2 ou damp funcionalmente prejudicado, camundongo transgênico cujas células do somatoplasma e células germinativas compreendem um gene damp que é totalmente ou parcialmente substituìdo por um gene bst2, método para redução de inflamação em um paciente, método para tratamento de um paciente quanto a sintomas de uma doença associada com inflamação, e método de teste para determinação de um composto quìmico eficaz para inibir ligação célula-célula mediada por bst2 - Google Patents

Abstract

MéTODO DE PREVENçãO LIGAçãO DE CéLULAS IMUNES A OUTRAS CéLULAS, "DECOY" DE BST2, CONSTRUCTO QUIMéRICO, ANTICORPO MONOCLONAL, MéTODO PARA ISOLAR UM LIGANTE PARA BST2, CAMUNDONGO TRANSGêNICO CUJAS CéLULAS DO SOMATOPLASMA E CéLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE BST2 OU DAMP FUNCIONALMENTE PREJUDICADO, CAMUNDONGO TRANSGêNICO CUJAS CéLULAS DO SOMATOPLASMA E CéLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE DAMP QUE é TOTALMENTE OU PARCIALMENTE SUBSTITUìDO POR UM GENE BST2, MéTODO PARA REDUçãO DE INFLAMAçãO EM UM PACIENTE, MéTODO PARA TRATAMENTO DE UM PACIENTE QUANTO A SINTOMAS DE UMA DOENçA ASSOCIADA COM INFLAMAçãO, E MéTODO DE TESTE PARA DETERMINAçãO DE UM COMPOSTO QUìMICO EFICAZ PARA INIBIR LIGAçãO CéLULA-CéLULA MEDIADA POR BST2. O pedido divulga um método para prevenção a ligação de células imunes a outras células, que inclui a promoção de contato das células imunes e das outras células com uma composição compreendendo um antagonista de Bst2.

Description

MÉTODO DE PREVENÇÃO LIGAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES A OUTRASCÉLULAS, "DECOY" DE BST2, CONSTRUCTO QUIMÉRICO, ANTICORPOMONOCLONAL, MÉTODO PARA ISOLAR UM LIGANTE PARA BST2,CAMUNDONGO TRANSGÉNICO CUJAS CÉLULAS DO SOMATOPLASMA ECÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE BST2 OU DAMPFUNCIONALMENTE PREJUDICADO, CAMUNDONGO TRANSGÉNICO CUJASCÉLULAS DO SOMATOPLASMA E CÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEMUM GENE DAMP QUE É TOTALMENTE OU PARCIALMENTE SUBSTITUÍDOPOR UM GENE BST2, MÉTODO PARA REDUÇÃO DE INFLAMAÇÃO EM UMPACIENTE, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UM PACIENTE QUANTO ASINTOMAS DE UMA DOENÇA ASSOCIADA COM INFLAMAÇÃO, E MÉTODODE TESTE PARA DETERMINAÇÃO DE UM COMPOSTO QUÍMICO EFICAZPARA INIBIR LIGAÇÃO CÉLULA-CÉLULA MEDIADA POR BST2

Antecedentes da Invenção

1. Campo da Invenção:

A presente invenção refere-se a moléculas queinibem adesão intercelular durante inflamações, e refere-seao uso das mesmas. A presente invenção também se refere aouso de uma proteína Bst2 ou fragmentos da mesma comoequivocador ("decoy") ou anticorpo de ligação de Bst2 parainibição de adesão intercelular e ativação de células queparticipam em inflamações, bem como pequenas moléculas. Apresente invenção também se refere a métodos paradescoberta de ligante de Bst2 e inibidor de ligante deBst2. A presente invenção refere-se igualmente a umacomposição compreendendo os mesmos, e um método paraprevenção ou tratamento de doenças associadas cominflamações.

2. Antecedentes Gerais e Estado da Técnica :

Uma inflamação é uma resposta normal do corpo paraproteger tecidos contra infecções, lesões ou doenças. Aresposta inflamatória começa com a produção e liberaçãode agentes químicos por células nos tecidos afetados. Osagentes químicos causam vermelhidão, inchaço, dor e perdade função. As células notes tecidos inflamados geramsinais que recrutam leucócitos para o sítio dainflamação. Os leucócitos precisam aderir a célulasendoteliais para migrarem da corrente sangüínea para osítio da inflamação. Além disso, os leucócitos devemaderir a células que apresentam antígenos para permitiremrespostas imunes específicas normais, e devem finalmenteaderir a células alvo adequadas para Usarem célulasinfectadas por patógenos, células cancerosas, ousimilares. Os leucócitos recrutados eliminam qualqueragente infeccioso ou prejudicial e removem detritos dascélulas danificadas do tecido lesado.

Os leucócitos que se infiltram desempenham papéiscríticos na regeneração de tecidos e na resposta imune eminflamação normal ao absorverem microorganismos invasoresou células mortas. Entretanto, os leucócitos infiltradoscausam uma situação grave ou letal em inflamação crônicapatológica. O reconhecimento anormal de células homólogasou não homólogas (de tipo diferente) ou o excesso deinflamação por respostas inflamatórias continuas causa umavariedade de doenças inflamatórias incluindo diabetesmellitus, aterosclerose:, catarata, lesão de reper fusão.,meningite infecciosa, artrite reumatóide, asma, sepsia,doença inflamatória do intestino e esclerose múltipla.

A interação entre leucócitos e células endoteliaisocorre da seguinte forma.

Os leucócitos possuem funções duais para ação emuma forma que circula na corrente sangüínea ou adere acélulas especificas. Em particular, os leucócitos aderentesinteragem com células endoteliais, estabilizam a adesãointercelular com células que apresentam antigenos ou atuamcomo células promotoras para migrarem para sítios deinflamação ou infectados. Para resposta imune específicanormal, os leucócitos devem aderir a células que apresentamantigenos e devem finalmente aderir a células alvoadequadas para lisarem células infectadas por patógenos,células cancerosas, ou similares. Oma invasão maciça deleucócitos ocorre em uma rejeição de aloenxerto, umainfecção de pele ou uma área lesada, e é igualmenteobservada em diversas doenças incluindo doençasdegenerativas das articulações, tais como osteoartrite,psoríase, esclerose múltipla, asma, artrite reumatóide,dermatite de contato e doença inflamatória dos intestinos.Nessas doenças, mais de 95% de células mielóidesdeslocam-se para o sitio de inflamação e acumulam-se nomesmo. Os leucócitos são agentes cruciais da respostainflamatória, que exercem atividade antimicrobiana,secretora e fagocitica. eles acumulam-se era tecidos era queestá ocorrendo uma inflamação ou precisa ocorrer umainflamação mediante produção de um mediador solúvel em águaou através de adesão especifica a diversas células. Narealidade, os agentes antiinflamatórios tais como drogasantiinflamatórias não-esteroidais ("Nonsteroidal Anti-inf lammatory Drugs" - NSAIDs) ou glicocorticóidesapresentam eficácia terapêutica mediante prevenção da0 adesão e influxo de leucócitos. Em modelos animais, ainibição e adesão intercelular melhora ou impede doenças ourejeição de aloenxertos em modelos animais de doençasautoimunes. Estudos clínicos recentes revelaram queanticorpos monoclonais humanizados que inibem interação deLFA-I/ICAM-I ou VLA-4/VCAM-I possuem uma eficáciasignificativa e um bom nível de segurança em doençasautoimunes incluindo psoríase, esclerose múltipla e doençainflamatória do intestino.

A invasão descontrolada de leucócitos era célulasendoteliais, que é uma característica preponderante napatogênese de doenças associadas a inflamações, ocorre emum processo de múltiplas etapas, que tem início com aadesão de leucócitos e acoplamento dos mesmos à superfíciede células endoteliais. O acoplamento de leucócitos àsuperfície de células endoteliais é mediado por moléculassuperficiais da célula, presentes na superfície deleucócitos e células endoteliais (Bevilacqua, J. Clin.Invest. 11:767-804, 1993). As moléculas da superfície dacélula são sobreexpressadas como resultado da migração deleucócitos da corrente sangüínea.A interação entre leucócitos e células endoteliaisé um fator critico em muitas doenças inflamatórias. Porexemplo, um aumento de interação leucócitos-célulasendoteliais causador de distúrbios de microperfusãohepática é proposto como um agente de contribuiçãosignificativa para a falência hepática (Croner e outros,Microvasc. Res. 67:182-191, 2004). Por exemplo, aaterosclerose é uma doença inflamatória típica em que umnúmero de células inflamatórias incluindo linfócitos T emacrófagos ativados se concentram no sítio deaterosclerose. A acumulação e adesão de monócitos emsegmentos distintos do endotélio arterial constitui um dosprimeiros eventos detectáveis em aterogênese e é umacaracterística central da patogênese da aterosclerose(Ross, Nature 362:801-809, 1993). Nesta região abundamcitocinas proinflamatórias, que incluem gama-interferon efator alfa de necrose tumoral, regulando a respostainflamatória regional. Um grande número de moléculas deadesão são expressadas na superfície de monócitos (Valentee outros, Circulation 86:11120-25, 1992), e célulasendoteliais sobrejacentes a lesões ateroscleróticasexpressam um número, de ligantes vasculares :(Poston eoutros, Am. J. Pathol, 140:665-673, 1992).

O extravasamento de leucócitos através da barreiraendotelial constituem um evento crítico na patogênese dedoenças inflamatórias tais como artrite reumatóide. Ascélulas endoteliais participam no mecanismo básico daartrite, mediante o qual diversos mediadores de inflamação,tais como fator alfa de necrose tumoral e citocinasindutores de inflamação tais como interleucina-1 beta,ativam células endoteliais. Isto causa uma expressãoelevada de moléculas de adesão a células endoteliais naartrite reumatóide, resultando em uma interação aumentadaentre leucócitos e células endoteliais. O recrutamento deleucócitos para células endoteliais vasculares constituiigualmente uma etapa importante da asma.

Nas vias aéreas de pacientes com asma, existemquantidades aumentadas de eosinófilos ativados, linfócitosT CD25-posit ivos e macrófagos imaturos com ascaracterísticas fenotípicas de monócitos do sangue. Aexpressão de HLA classe II aumenta em células epiteliais,macrófagos, e outras células de infiltração (Arm e outros,Adv. Immunol. 51:323-382, 1992).

Um aumento de taxa de transmigração de leucócitoatravés da barreira hematocerebral constitui um sintomapreponderante na esclerose múltipla. A interação entreproteínas de junção estreita em leucócitos e em célulasendoteliais contribui para o extravasamento de leucócitospara o sistema nervoso central em condições fisiológicas, ea expressão alterada de proteínas de junção estreita é umpré-requisito patológico para a esclerose múltipla(Worthylake e outros, Curr. Opin. Cell Biol. 13:569-577, 2001).

Conforme foi descrito acima, na medida em que aadesão de leucócitos a células endoteliais é importanteera uma variedade de doenças, a inibição de adesãointercelular poderá proporcionar como resultado umaestratégia terapêutica para diversas doençasinflamatórias e imunes.

Relativamente à biologia molecular, é conhecida aparticipação das seguintes moléculas em inflamações.

Citocinas: a inflamação sistêmica, que é umaresposta geral a infecções bacterianas graves ou lesõestraumáticas, pode afetar sistemas de tecidos distais comrelação ao dano inicial (Lush e Kvietys, Microcirculation7:83-101, 2000). Produtos bacterianos e outros mediadoresindutores de inflamações, liberados de tecidos afetados,induzem a formação de mediadores indutores de inflamaçãoincluindo fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa) ,interleucina-1 beta, gama-interferon e interleucina-6. Emsepsia, o dano endotelial vascular promove a produção deTNF-alfa e interleucina-1 beta. Estas citocinas atuamdiretamente nas células endoteliais e aumentam a adesão deleucócitos (Pober e outros, J. Immunol. 137:1893-1896,1986; Dustin e Springer, J. Cell Biol. 107:321-331, 1988;Cotran e Pober, J. Am. Soe. Nephrol. 1:225-235, 1988).

Estas citocinas também ativam neutrófilos no sangue eendotélio vascular (Arai e outros, Annu Rev Biochemf59:783-836, 1990). Por exemplo, o TNF-alfa induz uma sériede citocinas, guimiocinas e proteases através de uma viaautócrina ou parácrina (Ghezzi e Cerami, Methods Mol. Med.98:1-8.. 2004) . A interleucina-6 induz interação célulaendotelial-mononuclear e dano inflamatório medianteexpressão de moléculas de adesão, iniciando assim oprocesso de aterosclerose. Um aumento de concentração deinterleucina-6 no sangue envolve inflamação vascular edesenvolvimento de aterosclerose (Rader, N. Engl. J. Med.343:1179-1182, 2000). A interleucina-17 induz a expressãode muitos mediadores de inflamação, e está envolvida nadiferenciação., maturação e guimiotaxia de neutrófilos(Witowski e outros, Cell Mol Life Sei. 61:567-579, 2004).

Niveis aumentados de interleucina-17 foram associados comcondições patológicas graves, incluindo inflamação das viasaéreas, artrite reumatóide, abeessos e adesõesintraperitoneais, doença inflamatória do intestino,rejeição de aloenxertos, psoriase, câncer e esclerosemúltipla.

Moléculas de adesão a superfície celular: umapluralidade de citocinas inflamatórias induzem a expressãode moléculas de adesão de célula endotelial-linfócito("Endotheliai Cell-Lymphocyte Adhesion Molecules" - ELAMs)sobre a superfície da célula (Nortamo e outros, Eur. J.Immunol. 21:2629-2632, 1991). As mesmas são divididas emduas classes: molécula-1 de adesão intercelular("Intercellular Adhesion Molecule-1" - ICAM-I) e molécula-1de adesão de célula endotelial-linfócito ("EndothelialCell-Lymphocyte Adhesion Molecule-1" - ELAM-I) (Staunton eoutros, Cell 52:925-933, 1988). Em resposta a diversosmediadores, o endotélio vascular expressa glicoproteinas desuperfície celular de tipo específico. O acoplamento eextravasamento de leucócitos do sangue são obtidos porinteração com um ligante específico ou contra-receptor(Bevilacqua e outros, 1993, .1994) . As moléculas gueparticipam neste processo incluem a molécula-1 de adesãointercelular (ICAM-I) como ligante para CD18, selectinasgue reconhecem glicoonjugados na superfície do leucócito, emembros da super-família de imunoglobulinas que interagemcom outros membros da mesma família, moléculas de integrinade leucócitos (Panes e outros, J. Physiol. 269:H1955-1964,1995; Khan e outros, Microcirculation 10:351-358, 2003;Nelson e outros, Blood 82:3253-3258, 1993; Bevilacqua eNelson, J. Clin. Invest. 91:379-387, 1993). A rolagem deleucócitos é regulada por selectinas e a transmigração eadesão de leucócitos a células endoteliais são ativadaspela beta 2 integrina, Mac-I (CDllb/CD18, aMb2, CR3), eLFA-I. As Mac-I e LFA-I interagem com um contra-receptorexpressado na superfície de células endoteliais, ICAM-I.

A técnica anterior relativa a terapia deinflamações inclui o seguinte.

A patente n° US 5.367.056 descreve a inibição deligação de leucócitos polimorfonucleares("Polymorphonuclear Leukocytes" - PMNs) a célulasendoteliais mediante tratamento de moléculas ou fragmentosdas mesmas interrompendo a ligação a moléculas de adesão decélula endotelial-("Endothelial Cell-Leukocyte AdhesionMolecules" - ELAMs) como receptores ou ligantes. Estapatente também descreve ribozimas e nucleotideos"antisense" para supressão de expressão de ELAMs. Estapatente descreve adicionalmente um método paraidentificação de moléculas que inibem a ligação de ELAM aseu ligante, e anticorpos contra ELAM e seus ligantes.

A patente n° US 5.863.540 divulga um método desupressão de ativação de células T mediante administraçãode um peptideo de proteína CD44 ou um derivado do mesmo emurna quantidade suficiente para promover a supressão deativação de células T, Também é divulgado um método deinibição de adesão celular mediada por CD44 ou liberação demonócito ILl mediada por CD44 mediante administração dopeptideo de proteína CD44 ou derivado do mesmo em umaquantidade suficiente para inibir a adesão celular mediadapor CD44 ou a liberação de monócito ILl mediada por CD44. Éadicionalmente divulgado um método para transporte de umadroga ou um agente citotóxico para um sítio de inflamaçãomediante administração do peptideo de proteína CD4 4 ouderivados do mesmo em interligação com a droga ou agentecitotóxico.

A patente norte americana n° US 5.912.266 envolve ainibição de adesão intercelular mediada pela família debeta-2-integrina de moléculas de superfície de células. Apatente divulga uma composição farmacêutica útil parainibir ou tratar respostas inflamatórias ou outrasrespostas patológicas associadas com adesão celular. Estapatente também divulga um método para inibição aotratamento de condições patológicas em que leucócitos elinfócitos causam danos a células ou tecidos.

O documento de patente n° WO 03/02 6692 refere-se aouso terapêutico de um anticorpo contra complexos deantigeno CD3 em pacientes com inflamação articular crônicae artrite reumatóide.

A patente européia n° EP 1304379 refere-se a umanticorpo anti-CD18 humanizado compreendendo uma parte ou atotalidade de uma região determinadora de antigeno capaz dese acoplar a um antigeno CD18.

A patente norte americana n0 US 6.689.8 69 descreveo uso de um anticorpo anti-CD18 humanizado para inibição defluxo de entrada de leucócitos no pulmão e outros órgãosdurante sepsia, e outros traumas infecciosos ou nãoinfecciosos. O anticorpo anti-CD18 humanizado pode serutilizado para inibição de ingresso de leucócitos no pulmãoe outros órgãos em pacientes com choque endotóxico ousindrome de distúrbio respiratório de adulto. 0 anticorpopode ser administrado para tratamento de asma ou dano dereperfusão mediado por leucócitos em terapia pós-trombolitica. Além disso, o anticorpo pode ser utilizadopara redução ou eliminação de inflamação era um paciente aoqual está sendo administrado ura agente anti-infeccioso, oupara auxiliar na administração de uma droga terapêutica aum paciente durante quimioterapia anti-câncer.

A patente norte americana n° US 5.821.336 descrevepolipeptideos com um peso molecular de 160 kD, que sãomediadores ou precursores para mediadores de inflamação,derivados dos mesmos, tais como mutantes e fragmentos, eprocessos para a sua preparação. São igualmente divulgadosna patente seqüências de nucleotideos que codificam ospolipeptideos e derivados, vetores compreendem asseqüências de nucleotideos, anticorpos contra ospolipeptideos ou seus derivados e derivados de anticorpos.São igualmente descritos métodos de diagnóstico eterapêuticos para condições inflamatórias ou linfomas deHodgkin com utilização dos anticorpos e derivados deanticorpos.

Sumário da Invenção

Uma inflamação requer pelo menos três etapasseqüenciais para atrair células imunes que incluemleucócitos para o sitio de inflamação, conforme se descrevea seguir: (1) células imunes incluindo leucócitos tais comolinfócitos, leucócitos polimorfonuclèares, célulasassassinas naturais e macrófagos são ativados por citocinase/ou interação intercelular; (2) as células imunesagregadas migram e são recrutadas para o sitio dainflamação, onde realizam transdução de sinais associadospara células endoteliais mediante adesão às célulasendoteliais; (3) linfócitos T e macrófagos são ativados esecretam citocinas, tais como interleucina-2, paraificação da resposta inflamatória.Os presentes inventores descobriram que a proteínaBst2 media a adesão homotípica de células imunes ou aadesão heterotípica entre células imunes e célulasendoteliais, que desempenham papéis cruciais eminflamações, e descobriram adicionalmente que umantagonista da proteína atua nas três etapas principais dasinflamações e pode portanto ser utilizado na prevenção etratamento de doenças associadas a inflamações, dessa formaproduzindo como resultado a presente invenção.

Em um aspecto,, a presente invenção refere-se a ummétodo para prevenção de acoplamento de células imunes aoutras células, compreendendo o contato das células imunese/ou das outras células com uma composição compreendendo umantagonista de Bst2. As outras células podem ser célulasimunes, células endoteliais, células de músculos lisos,células do cérebro, células da espinha dorsal, células denervos periféricos, células do coração, células de músculosesqueletais, células dos pulmões, células do fígado,células dos rins, células de vasos sangüíneos, células dopâncreas, células de intestino delgado ou grosso, célulasdo estômago,, células do esôfago, células nasofaríngeas,células membranosas ou células de tecidos conjuntivos. 0antagonista de B-st.2 pode ser um equivocador ("decoy") deBst2. E o "decoy" de Bst2 pode ser um fragmento de B-st 2 ouuma variante da mesma, apresentando uma capacidade deacoplamento similar ou aperfeiçoada em comparação com a daproteína Bst2 relativamente a uma outra molécula ouproteína. 0 antagonista de Bst 2 pode adicionalmenteconsistir em um "decoy" de Bst2 fundido com uma proteínaestabilizadora, um constructo de fusão ou quimérico de"decoy" de Bst2-Fc, um constructo de fusão ou quimérico de"decoy" de Bst2-albumina, ou um "decoy" de Bst2 pegilado.Adicionalmente, o antagonista de Bst2 pode ser um anticorpomonoclonal ou um domínio de proteína semelhante a anticorpoque se acopla especificamente a proteína Bst2 e/ou proteínaDampl murina.

Em um outro aspecto da invenção, o antagonista deBst2 pode consistir em um composto químico.

Em um outro aspecto ainda, no método descritoacima, as células imunes e as outras células podem selocalizar alternativamente em um sítio de inflamação ou emum sítio distante de inflamação porém capaz de transmitircitocinas inflamatórias e imunes ou outros sinais deinflamação para o sítio da inflamação. Adicionalmente, acomposição pode incluir um composto inibidor de transmissãode sinais ou adesão celular ou um composto imunossupressor.Em uma configuração preferencial, o composto inibidor deadesão celular pode ser um antagonista de ICAMl ou umantagonista de LFA.

Em uma outra configuração ainda, a invenção refere-se a um constructo quimérico de "decoy" de Bst2-Fc.Preferencialmente, o "decoy" pode ser fundido com qualquerdomínio de uma imunoglobulina. Em particular, o "decoy" deBst2 pode ser fundido com a parte de articulação CH2CH3 deum Fc de cadeia pesada de IgG; proteína de fusão de Bst2que é estabilizada através de acoplamento de dissulfito decadeia pesada-cadeia kappa de IgG; ou "decoy" de Bst2-IgGFc sem outras contrapartidas de dimerização de Bst2.

Em uma outra configuração, a invenção refere-se aum anticorpo monoclonal específico para Bst2 e/ou umhomólogo de Bst2. 0 homólogo pode consistir em proteínaDamp 1 murina. Adicionalmente, o anticorpo monoclonal podecompreender duas ramificações, das quais uma contém umaregião que se acopla especificamente a uma proteína diversade Bst2 ou homólogo da mesma. Em particular, uma célulaexpressando Bst2 à qual o anticorpo monoclonal é acopladoimpede a interação ligante de Bst2-Bst2 ou a interaçãoBst2-Bst2.

Em uma configuração alternativa adicional, ainvenção refere-se a um método para isolar um ligante paraB s 12, compreendendo:

(i) obtenção de células que se acoplam a Bst2;(ii.) triagem para um ligante que se acopla a Bst2da célula que expressa o ligante, dessa forma isolando-se oligante para Bst2.

Em uma outra configuração, a invenção refere-se aum camundongo transgênico cujas células do somatoplasma ecélulas germinativas compreendem um gene Damp ou Bst2funcionalmente perturbado, em que o gene perturbado éintroduzido no camundongo ou um ancestral do camundongo emestágio embrionário, no qual se for homozigótico para ogene perturbado, apresenta um distúrbio associado a umainflamação.

Em uma outra configuração ainda, a invenção refere-se a um camundongo transgênico cujas células dosomatoplasma e células germinativas compreendem um geneDamp que é totalmente ou parcialmente substituído por umgene Bst2, em que o gene Bst2 é introduzido no camundongoou um ancestral do camundongo em um estágio embrionário.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a ummétodo para redução de inflamação em um pacientecompreendendo a administração de uma composiçãocompreendendo antagonista de Bst2 para um sitio dainflamação.

Em um outro aspecto ainda, a invenção refere-se aum método para tratamento de um paciente quanto a sintomasde uma doença associada com inflamação, compreendendo aadministração de uma composição compreendendo antagonistade Bst2 ao paciente necessitado da mesma. A composição podecompreender um outro composto antiinflamatório. A doençaindicada pode ser aterosclerose, artrite reumatóide, asma,sepsia, colite ulcerativa, diabetes tipo I, catarata,esclerose múltipla, infarto agudo do miocárdio, ataquecardíaco, psoríase, dermatite de contato, osteoartrite,rinite, doença de Crohn7 doenças autoimunes, caquexia,pancreatite aguda, vasculite autoimune, hepatite autoimunee viral, hipersensibilidade de tipo retardado, congestão,estenose coronária, glomerulonefrite, doença de rejeição deenxerto, uveite, doença inflamatória ocular associada comtransplante de c-órnea, lesão cerebral resultante de trauma,epilepsia, hemorragia, ataque, doença das célulasfalciformes, diabetes tipo II, obesidade, degeneraçãomacular relacionada com a idade ("Age-related MacularDegeneration" - AMD), eczema, dermatite, incapacidadecognitiva/de aprendizagem, doenças neurodegenerativas,doença de Parkinson, doença de Alzheimer, coliteulcerativa, lesões induzidas por radiação, lesões induzidaspor queimaduras ou eletricidade., envenenamento causador denecrose de tecidos e infiltração de células imunes, lesõesinduzidas por drogas, lesões induzidas por inalação,radiação, lesões dos pulmões induzidas por aspiração,inflamação resultante de quimioterapia ou terapia deradiação, doenças autoimunes, Lupus, doença de Schogren,doenças de desmielinização incluindo esclerose múltipla,miopatia inflamatória incluindo polimiosite, esclerodermia,poliarterite nodosa, sarcoidose, miosite ossificantelocalizada e generalizada, doenças de tipo amilóideincluindo doença de Alzheimer, hérnia de disco, danos namedula espinal e nos nervos, sindrome de Reye, meningite eencefalite bacteriana e viral, doença associada a Prions,síndrome de Guillain-Barre, hidrofobia, poliomielite,hemorragia cerebral, danos relacionados com hemorragiaintracraniana, síndrome de fadiga crônica, tromboflebite,gota, granulomatose, nefrite incluindo glomerulonefrite enefrite intersticial, alergia a picada de insetos, choqueanafilático, anemia aplásica, insuficiência da medulaóssea, insuficiência múltipla de órgãos, tiroidite,insulite, cirrose (hepatite crônica e aguda), emboliapulmonar, doenças hepáticas induzidas por toxinas e drogas,pancreatite, doenças intestinais isquêmicas, síndrome dedistúrbio respiratório agudo, ou pericardite.

Em um outro aspecto ainda, a invenção refere-se aum método para teste de um composto químico eficaz parainibição de acoplamento célula-célula mediado por Bs t.2,,compreendendo a determinação de um composto que se acopla aBst2. Adicionalmente, o "decoy" de Bst2 pode ser objeto deexpressão recombinante em uma célula hospedeira.

Estes e outros objetivos da invenção serão maisplenamente entendidos a partir da descrição da invenção quese encontra a seguir, dos desenhos referenciados aquianexados e das reivindicações aqui anexadas.

Breve Descrição dos Desenhos

A presente invenção será mais plenamente entendidacom base na descrição detalhada fornecida abaixo, e nosdesenhos em anexo que são dados a título meramenteilustrativo, não constituindo portanto limitações quanto àpresente invenção, e era que

A Fig. 1 é um alinhamento de seqüências deaminoácidos ilustrando a similaridade de seqüências entreBst2 humana e Dampl murina;

as Figs. 2A-2B ilustram as localizações de"primers" de PCR utilizados em um processo para clonagemde um "decoy" de Bst2 humana e um "decoy" de Dampl murinapara um vetor de expressão;

as Figs. 3A-3B ilustram os resultados de análisede eletroforese de um "decoy" de Bst2 humana e um "decoy"de Dampl murina;

a Fig. 4 ilustra um padrão de expressão de gene deBst2 durante a agregação homotípica de células U937;

a Fig. 5 ilustra o efeito promotor dasobreexpressão de Bst2 na agregação homotípica de célulasU937;

as Figs. 6A-6E ilustram o efeito de um "decoy" deBst2 na agregação homotípica de células U937;

as Figs. Th-IG ilustram o efeito de um "decoy" deBst2 na adesão intercelular entre células endoteliaisvasculares humanas ("Human Vascular Endothelial Cells" -HUVEC) e células U937;

as Figs. 8A-8F ilustram o efeito dependente dedosagem de um "decoy' de Bst2 na adesão intercelular entreHUVECs e células U937;

as Figs. 9A-9G ilustram o efeito de siRNA de Bst2na adesão intercelular entre HUVECs e células U937;

as Figs. 10A-10B ilustram o efeito dasobreexpressão de Bst2 na agregação de células Jurkat e naprodução de interleucina 2 (IL-2) em células Jurkat;

as Figs. 11A-IlI ilustram o efeito de um "decoy" deBst2 e siRNA de Bst2 na agregação de células Jurkat;

as Figs. 12A-12B são gráficos ilustrativos doefeito de um "decoy" de Bst2 na agregação de células Jurkate produção de IL-2;

a Fig. 13 ilustra a alteração do número de célulasimunes sedimentadas após tratamento de um "decoy" de Bst2;

a Fig. 14 ilustra a redução de níveis de citocinasapós tratamento de um "decoy" de Bst 2;

as Figs. 15A-15D ilustram a similaridade funcionalentre Bst2 humana e Dampl murina;

as Figs. 16A-16D ilustram o efeito inibidor de um"decoy" de Bst'2 e um "decoy" de Dampl murina em asmainduzida por ovaIbumina em camundongos;

a Fig. 17 ilustra frações PEG usadas na preparaçãode formas PEG-conjugadas de um "decoy" de Bst 2;

a Fig. 18 ilustra a degradação metabólicaaperfeiçoada do "decoy" de Bst2 PEG-conjugado;

a Fig. -19 ilustra a expressão e distribuição deBst2 em doenças associadas com inflamações;

as Figs. 20A-20D ilustram diagramas de "decoy" deBst2 fundido com região Fe. Em A, é ilustrado o "decoy" deBst2 propriamente dito; em B, é ilustrado o "decoy" de Bst2fundido com a parte de articulação CH2-CH3 de Fc de cadeiapesada de IgG; em C, é ilustrada a proteína de fusão Bst2que é estabilizada através do acoplamento de dissulfito decadeia pesada kappa de IgG de ocorrência natural; em D, o"decoy" de Bst2-IgG Fc é expressado sem outrascontrapartidas de dimerização de Bst2;

as Figs. 21A-21D ilustram mapas de vetoresrepresentativos de proteínas de fusão de "decoy" de Bst2-IgG Fc da Fig. 20;

a Figure 22 ilustra a estratégia de fusão eclonagem de PCR;

as Figs. 23A-23B ilustram PAGE de "decoy" de Bst2purificado e outras fusões Fe. Em A, um gel PAGErepresentativo (gel gradiente 4~12%, Invitrogen) marcadocom Coomassie ilustrando diversas proteínas de fusão Bst2após purificação de afinidade. Em B é ilustrado PAG apóscromatografia de exclusão de tamanho;

as Figs. 24A-24B ilustram o acoplamento direto de"decoy" de Bst2 a células imunes em A; e em B, uma placarevestida com BSA;

a Fig. 25 ilustra a meia-vida plasmática de "decoy"de Bst2 ou fusões Fe;

a Fig. 26 ilustra o efeito inibidor das fusões de"decoy" de Bst2-Fc no acoplamento entre "decoy" de Bst2 ecélulas.;as Figs. 27A-27D ilustram o efeito de fusões de"decoy' de Bst2-Fc em um modelo murino de asma;

as Figs. 28A-28B ilustram a criação de camundongosde Bst2 quimérico humano-murino. A. O local genômico paramurino (topo, negro) e humano (fundo, cinzento). Os éxonssão ilustrados na forma de caixas retangulares. O final dodomínio trans-membrana é indicado com uma seta e alocalização da metionina iniciadora (ATG) é indicada com umasterisco. As distâncias físicas aproximadas abrangendo oséxons de codificação são indicadas abaixo do localgenômico. O diagrama não se encontra desenhado em escala.

B. Estratégia para obtenção de B st.2 quimérico humano-murino;

as Figs. 29A-29E mostram que é requerido Bst2endógeno para agregação heterotipica entre célulasendoteliais (HUVEC) e células monocíticas (U937) apósestimulação com IFNy. A, Controle; B, estimulação por IFNyde inflamação; C, estimulação por IFNy de inflamação +siRNA de controle; D, estimulação por IFNy de inflamação +siRNA de Bst2; E, Análise quantitativa dos resultados desiRNA de Bst2 de A-D;

a Fig. 30 demonstra que o tratamento de siRNA deBst2 ou o tratamento de siRNA de ICAMl não afetam aexpressão de Bst2 em HUVEC tratado com IFNy,respectivamente. Foram realizadas análises RT-PCR;

as Figs. 31A-31G ilustram o tratamento decombinação de siRNA de Bst2 e siRNA de ICAMl, e ilustram osefeitos aditivos em ensaio de adesão heterotipica. A,Controle; B, estimulação por IFNy de inflamação; C,estimulação por IFNy de inflamação + siRNA de controle; D,estimulação por IFNy de inflamação + siRNA de Bst2; E,estimulação por IFNy de inflamação + siRNA de ICAMl; F,estimulação por IFNy de inflamação + siRNA de ICAMl + siRNAde Bst2; G, Resultados de análise quantitativa de siRNA deBst2 e siRNA de ICAMl de A-F;

as Figs 32A-32M ilustram a resposta dependente dedose de anti-ICAMl ou "decoy" de Bst2 em ensaio de adesãoheterotipica. A ilustra o Controle; B7 C, D, E, e Filustram estimulação por IFNy de inflamação + aumento dedosagem de Ab de ICAM-I; G ilustra estimulação por IFNy deinflamação + BSA de controle; H ilustra estimulação porIFNy de inflamação + IgG de controle; I, Jr Kr e L ilustramestimulação por IFNy de inflamação + aumento de dosagem de"decoy" de Bst2; M ilustra os resultados de análisequantitativa da resposta dependente de dose de anti-ICAMl e"decoy" de Bst2 de A-L;

as Figs. 33A-33C ilustram que o tratamento decombinação de "decoy" de Bst2 e anti-ICAM produz comoresultado efeitos aditivos em adesão celular. Foramutilizadas doses sub-ótimas de "decoy" de Bst2 (100 ng/ml)e anti-ICAMl (1 ug/ml). A adesão celular foi totalmenteinibida para o nível de controle quando foram utilizadosambos, "decoy" de Bst2 e anti-ICAMl;

a Fig.. 34 ilustra o nível de expressão relativa deraRNA de Bst2 após tratamento com citocina. 0 nível de mRNAde Bst2 (em razão logarítmica) é ilustrado após Jurkat,HUVEC (células endoteliais vasculares humanas), HeLa ouCASMC (células de músculos lisos de artéria coronária)serem tratados com soro, PMA (12 ou 18 horas), OKT (12 ou18 horas), TNF-alfa, gama-interferon ou PGJ2, conformeindicado. 0 nível de mRNA de Bst2 foi medido por PCR emtempo real;

a Fig. 35 ilustra um diagrama para um método paraforçar interação e sinalização entre uma célula A, queexpressa o ligante para Bst'2, e uma célula B,, que expressao receptor para proteína ou composto Υ. A proteína de fusãodivalente composta de "decoy" de Bst2 e proteína oucomposto Y pode funcionar como um adaptador para forçar ainteração entre as células Ae B. Com este processo, asinalização entre as células AeB pode ser aperfeiçoada;

a Fig. 36 ilustra o acoplamento de clones de fagosao "decoy" de Bst2/Dampl;

as Figs. 37A-37B ilustram (A) Regiões variáveis decadeia pesada; e (B) regiões variáveis de cadeia kappa doanticorpo monoclonal anti-Bst2/Dampl; e

as Figs. 38A-38B ilustram anticorpos monoclonaisanti-Bst2 transientemente expressados e purificados em umgel PAGE. (A) em condições não redutoras; (B) em condiçõesredutoras.

A Fig. 39 ilustra a alteração do número de célulasimunes sedimentadas após tratamento com anticorpomonoclonal anti-Bst2/Dampl em asma induzida com ovalbuminaem camundongos.

Descrição Detalhada das Configurações Preferenciais

No presente pedido de patente, "um" ou "uma" sãoutilizados para referência tanto de ura único objeto quantode uma pluralidade de objetos.

Conforme é aqui utilizado, o termo "antagonista" ouo termo "bloqueador" refere-se a uma substância que inibe,bloqueia ou reduz a atividade de uma proteína que induzinflamação. O mecanismo de ação do antagonista não éespecificamente limitado. Exemplos do antagonista incluemcompostos orgânicos ou inorgânicos, composto poliméricos,tais como proteínas, carboidratos e lipídeos, e compósitosde múltiplos compostos. Por exemplo, um "antagonista deBst2" ou "bloqueador de Bst2" pode incluir uma substânciaque inibe, bloqueia, ou reduz a atividade de proteína Bst2em sua atividade indutora de inflamação.

Conforme é aqui utilizada, a expressão "ligante deBst2" ou "L de Bst" refere-se â molécula que se ligaespecificamente a Bst2.

Conforme é aqui utilizado., um "homólogo" de umaproteína é um elemento considerado como possuindo umaatividade similar ou uma atividade específica similar a daproteína de referência, independentemente de seu nível desimilaridade geral de seqüência relativamente à proteína dereferência.

A expressão "doenças inflamatórias", conforme éaqui utilizada, refere-se a todas as doenças resultantesdas respostas de defesa do corpo ou respostas infecciosascontra influências prejudiciais, resultando era estados(físicos., químicos e biológicos) apresentando sintomas taiscomo vermelhidão, inchaço, sensibilidade de contato:, dor,febre e disfunção.

0 termo "modificação", conforme é aqui utilizado,indica um processo em que um polímero não-peptídico éligado a uma proteína Bst2, ou a um fragmento da mesma.

A expressão "polímero não peptídico", conforme éaqui utilizado, refere—se a ura polímero biocompatível noqual duas ou mais unidades repetidas são ligadas entre si.Exemplos do polímero não-peptídico incluem polietileno-glicol, polipropileno glicol (PPG), co-poli(etileno/propileno) glicol, polioxietileno (POE),poliuretano, polifosfaseno, polissacarídeo, dextran, álcoolpolivinílico, polivinil pirrolidona, polivinil etil éter,poliacrilamida, poliacrilato, policianoacrilato, polímerolipídico, quitinas, ácido hialurônico, e heparina. Umpolímero não peptídico preferencial é o polietileno glicol.

0 termo "ligado operacionalmente", conforme é aquiutilizado, refere-se a uma ligação funcional entre umaseqüência de controle de expressão de ácido nucléico e umasegunda seqüência de ácido nucléico codificando umaproteína alvo de forma a permitir a ocorrência de função emgeral. Por exemplo., um promotor pode ser ligadooperacionalmente a uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma proteína e afetar a expressão da seqüênciade codificação. A ligação operacional a um vetor pode serpreparada mediante a utilização de urna técnica derecombinação genética bem conhecida na técnica, e podem serrealizadas ligação e clivagem de DNA específica de sítiocom utilização de enzimas geralmente conhecidas na técnica.

O termo "prevenção", conforme é aqui utilizado,significa todas as atividades que inibem doençasinflamatórias ou retardam a incidência de doençasinflamatórias mediante administração da composição. Ostermos "tratamento", "tratando" e "terapia", conforme sãoaqui utilizados, referem-se a todas as atividades (terapiacurativa, terapia profilática e terapia preventiva) quealiviam e afetam beneficamente seres humanos que sofrem dedoenças inflamatórias.

O termo "siRNA", conforme é aqui utilizado, refere-se a uma molécula de RNA de trança dupla curta capaz deinduzir interferência de RNA (RNAi) mediante clivagem domRNA alvo. O termo "específico" ou a expressão "específicode", conforme aqui utilizados., significam uma capacidade desupressão somente de um gene alvo sem afetar entretantooutros genes em células. Na presente invenção são providasmoléculas de siRNA específicas para Bst2.

Conforme é aqui utilizada, uma atividade "similar"a uma atividade de referência é considerada como sendo decerca de 80% de acordo com a medição utilizando parâmetrosdefinidos objetivamente da atividade indicada.

Conforme são aqui utilizadas, as expressões"modulador ou composto de baixo peso molecular" ou"composto químico" referem-se a um composto químico que édistinto de moléculas biológicas tais como carboidratos,polipeptídeos, ácidos nucléicos, ou lipídeos. O moduladorou composto de baixo peso molecular pode incluir semlimitações antagonistas, agonistas, mimetizadores depeptídeos, inibidores,, ligantes, e fatores de ligação paraligação Bst2/L de Bst2.

Conforme é aqui utilizado,, o termo "variante"refere-se a uma proteína ou fragmento da mesma, que tem umaseqüência diferente de uma seqüência de aminoácidos nativosde uma proteína, mediante uma eliminação, uma inserção, umasubstituição não conservadora ou conservadora ou umacombinação das mesmas. Por exemplo, as trocas deaminoácidos em proteínas e peptídeos que não alteramgeralmente a atividade das proteínas ou peptídeos sãoconhecidas na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, TheProteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas deocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu,Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly,Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai,Ala/Glu e Asp/Gly, em ambos os sentidos.

0 termo "vetor", conforme é aqui utilizado, quedescreve um vetor capaz de expressar uma proteína deinteresse em uma célula hospedeira adequada, refere-se a umconstructo genético que compreende elementos reguladoresessenciais a que um inserto de gene é ligadooperacionalmente de forma a ser expressado em uma célulahospedeira.

Proteína Bst 2

A Bst2 participa na adesão intercelular durante ainflamação. Em um aspecto, a presente invenção proporcionaantagonistas de proteína Bst2 (Antígeno-2 Estromatoso deMedula Óssea) para prevenir adesão intercelular e ativaçãode células imunes para as células endoteliais ou entre urnase outras durante a inflamação.

Os presentes inventores, através de estudosutilizando (1) um modelo de agregação homotípica de célulasmonocíticas U937 humanas para investigação do efeito deBst2 na agregação de células imunes, (2) um modelo deagregação heterotípica entre células U937 e HUVECs parainvestigação do efeito de Bst2 na adesão intercelular entrecélulas imunes e células endoteliais, (3) um modelo decélulas T Jurkat para investigação do efeito de Bst2 naativação de linfócitos T, descobriram que a proteína Bst2participa em um processo de inflamação em que ocorremigração de leucócitos para o sitio da inflamação,reconhecem componentes de matriz extracelular parainteração com células, e aderem às células. Gs presentesinventores descobriram adicionalmente que um antagonista deproteína Bst2 inibe efetivamente essa adesão intercelular eé portanto capaz de tratar com eficácia doençasinflamatórias.

A proteína Bst2 foi inicialmente identificada emcélulas estromatosas da medula óssea e é consideradaenvolvida na diferenciação e proliferação de células. Em1995 foi clonado um cDNA codificando Bst2, e foi descobertoque o gene de Bst2 se encontra localizado no cromossomahumano 19pl3.2 (Ishikawa e outros, Genomics 26:527-534,1995) . Os gene de Bst2 consiste em cinco éxons e quatroíntrons. A Bst2 é uma proteína transmembrana tipo II de 30até 36 kD que consiste em 180 aminoácidos (Ohtomo e outros,Biochem. Biophys. Res. Commun. 258:583-591, 1999). Q genede Dampl., um homólogo murino do gene de Bst2 humano, temuma identidade de seqüência de DNA de 45% com o gene deBst2 humano, e conforme se encontra ilustrado na Fig. 1,tem uma similaridade de seqüência de aminoácidos de menosde 4 0% com relação à Bst2 humana. A proteína Bst2 épredominantemente expressada no fígado, nos pulmões, nocoração e na placenta, e em menores níveis no pâncreas, nosrins, nos músculos esqueletais e no cérebro. A expressãosuperficial de Bst2 em células de fibroblasto acelera ocrescimento dependente de células estromatosas de célulaspré-B derivadas de medula óssea murina. Este resultadosugere que a Bst2 regula o crescimento de células pré-B oudesempenham um papel critico na ativação de células B emartrite reumatóide. A Bst2 é também sobre-expressada emalguns tipos de câncer, incluindo câncer da boca, câncer domama, adenoma e câncer cervical. Deverá ser observado quena referência à Fig. 1, as margens do domínio transmembrananão se encontram limitadas à seqüência conforme ilustrada.As regiões transmembrana podem ter mais ou menos 5aminoácidos em qualquer um dos terminais N ou C da região.

Com relação à proteína Bst2, foram relatados aisolação e expressão de um gene codificando proteína Bst2(EP 1033401), e o uso da proteína Bst2 para diagnóstico decâncer (WO 01/57207 e WO 01/51513) . A proteína Bst2 édividida em três domínios: citoplásmico, transmembrana eextracelular, e um domínio intracelular contém domínioscitoplásmico e transmembrana.

Doenças Inflamatórias

A presente composição inventiva pode ser utilizadapara prevenção ou tratamento de todos os tipos de doençasinflamatórias que envolvem sobreexpressão de Bst2. De fato,a Bst2 foi sobreexpressada em diversas doençasinf lamatórias incluindo asma., aterosclerose, artritereumatóide, psoríase, doença de Crohn, colite ulcerativa,gastrite crônica ativa, apendicite aguda, e Lúpuseritematoso (Fig. 19). Desta forma, as doenças que podemser prevenidas ou tratadas pela presente composição incluemsem limitação, aterosclerose, artrite reumatóide, asma,sepsia, colite ulcerativa, esclerose múltiplas, infartoagudo do miocárdio, ataque cardíaco, psoriase, dermatite decontato, osteoartrite, rinite, doença de Crohn, diabetestipo II, neuropatia diabética, doença pulmonar obstrutivacrônica, caquexia, pancreatite aguda., vasculite autoimune,hepatite autoimune e viral, hipersensibilidade de tiporetardado, congestão, restenose coronária,glomerulonefrite, doença de rejeição de transplante,uveite, doença ocular inflamatória que pode ser associadacom transplante de córnea, lesão cerebral resultante detrauma, epilepsia, hemorragia ou ataque. Os bloqueadores deBst2 podem igualmente ser úteis para tratamento de doençade células falciformes. A adesão de leucócitos a outrascélulas do sangue e endotélio foi observada contribuir paravaso-oclusão em doença de células falciformes (Okpala I.Curr Opin Hematol. 2006, Jan;13(1):40-4). Adicionalmente, aidéia de que a ativação da via pró-inflamatória podeconstituir uni mecanismo para a resistência à insulinaassociada com obesidade emergiu nos anos mais recentes(Roytblat e outros, Obes Res. 2000, 8(9):673-5;Straczkowski e outros, Science. 1996, 271(5249):665-8;Hirosumi e outros, Nature. 2002, 420(6913):333-6). Osbloqueadores de Bst2 podem igualmente ser benéficos pararesistência à insulina, diabetes tipo II e obesidade.

Outras doenças associadas com inflamação incluemdegeneração macular relacionada com a idade ("Age-re 1-atedMacular Degeneration" - AMD), Eczema, dermatite,incapacidade de aprendizado/cognitiva, doençasneurodegenerativas, doença de Parkinson., doença deAlzheimer, colite ulcerativa, lesões induzidas porradiação, lesões induzidas por queimaduras ou eletricidade,envenenamento causador de necrose de tecidos e infiltraçãode células imunes, lesões induzidas por drogas, lesõesinduzidas por inalação, radiação, lesões nos pulmõesinduzidas por aspiração, inflamação resultante dequimioterapia ou terapia de radiação, doenças autoimunesincluindo Lupus, doença de Schogren, doenças dedesmielinização incluindo esc ler-o se múltipla, miopatiainflamatória incluindo poliomiosite, escleroderma,poliarterite nodosa, sarcoidose, miosite ossificantelocalizada e generalizada, doenças de tipo amilóideincluindo a doença de Alzheimer, hérnia de disco, lesões naespinha dorsal e nervos, sindrome de Reye, meningite eencefalite bacteriana e viral, doença associada a Prions,sindrome de GuilIain-Barre, hidrofobia, poliomielite,hemorragia cerebral, lesões relacionadas com hemorragiaintracraniana, sindrome de fadiga crônica, tromboflebite,gota, granulomatose, nefrite incluindo glomerulonefrite enefrite intersticial, alergia a picada de insetos, choqueanafilático, anemia aplásica, insuficiência da medulaóssea, insuficiência múltipla de órgãos, tiroidite,insulite, cirrose (hepatite crônica e aguda), emboliapulmonar, doenças hepáticas induzidas por toxinas e drogas,pancreatite., doenças intestinais isquêmicas, síndrome dedistúrbio respiratório agudo, e pericardite"Decoy" de Bst2

Qualquer forma solúvel de proteína Bst2 ou umfragmento ou variante da mesma pode ser utilizada comoequivocador ("decoy") que se liga competitivãmente a umamolécula ou ura ciclo à qual ou ao qual uma célula imuneexpressando Bst2 se ligaria para induzir inflamação. 0fragmento de B-st.2 utilizado como "decoy" não éespecificamente limitado desde que tenha um efeitosupressor de inflamação mediante inibição de adesãointercelular, porém é preferencial uma proteína Bst2 comuma eliminação da totalidade ou de uma parte do domíniointracelular. Em uma configuração exemplificada, ofragmento de proteína Bst 2 é um fragmento de proteína Bst2compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. 0fragmento de proteína Dampl é um fragmento de proteínaDampl compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ IDNO:2. Foi determinado que o fragmento de proteína Bst2 e ofragmento de proteína Dampl inibem com eficácia a adesãointercelular induzida por Bst2.Deverá ser entendido que em certos aspectos dainvenção, poderá ser utilizada Dampl murina ao invés deBst2 e que as mesmas podem ser utilizadas de formaintercambiável. Por exemplo, quando é utilizado um "decoy"de Bst2, é igualmente contemplado que possa ser utilizadoum "decoy" de Dampl, incluindo quaisquer constructosquiméricos de "decoy" de Dampl. É igualmente contempladoque a Dampl e suas variantes possam ser utilizadas paratratamento ou redução de inflamação em um pacientejuntamente com Bst2. Desta forma, deverá ser entendido quequalquer utilização específica de Bst2 indicada no presentepedido de patente se aplica igualmente a Dampl e poderá serreivindicada da mesma forma.

0 escopo da presente invenção inclui proteínaspossuindo uma seqüência de aminoácidos nativa da proteínaBst2 ou um fragmento ou variante da mesma, e DNA e RNAcapaz de codificar essa proteína com um efeito supressor deinflamação mediante inibição de sinalização e adesãointercelular.

Adicionalmente, a proteína ou fragmento da mesmaprovidos na presente invenção podem ter a forma de cadeiasde açúcares nativas, cadeias de açúcares aumentadas emcomparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcaresdecrescidas em comparação com a forma nativa, ou podemencontrar-se em uma forma desglicosilada. O aumento,decréscimo ou remoção de cadeias de açúcares da proteínapode ser obtido por ura método convencional, tal como ométodo químico, um método enzimático, ou um método deengenharia genética com utilização de um microorganismo. 0método de engenharia genética inclui a eliminação de uma oumais frações de carboidrato encontradas em seqüênciasnativas de Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc, e/ouadição de um ou mais sítios de glicosilação que não seencontram presentes nas proteínas nativas.

Variantes de "decoy" de Bst2-Fc/"decoy" de -Bst2

Uma depuração ("clearance") excessivamente rápida.,particularmente de pequenas proteínas, pode limitar aeficácia terapêutica. Elementos terapêuticos de proteínasinjetados pode ser processados por plasma proteases,ligarem-se a proteínas do plasma ou receptores nas célulasendoteliais ou células do sangue, o que poderá resultar emcaptação da proteína. As proteínas que escapam à capturavascular podem então ser depuradas no fígado ou nosglomérulos renais. No sistema renal, a proteína entrará naurina e abandonará o corpo. A barreira glomerulardiscrimina proteínas tanto com base em tamanho molecularquanto em carga molecular (Brenner e outros, Am J Physiol.,1978, 234:F455). Desta forma, aumentos de tamanho molecularou carga negativa podem reduzir a depuração renal (Wilson eoutros, J Gen.. Physiol., 1970, 74:495).

As estratégias em geral para aperfeiçoamento daatividade in vivo e duração da ação do "decoy" de Bst2incluem PEGilação, modificações químicas com objetivo dereduzir a depuração, interligação cruzada de proteína paraalbumina, multimerização, fusão direta com albuminautilizando tecnologia de DNA recombinante, fusão com Fc eassim por diante. Adicionalmente, a glicoengenharia étambém aplicável como estratégia para aumento da atividadein vivo e para prolongar a duração da ação do "decoy" deBst2 ou do constructo de "decoy" de Bst2-Fc.Oligossacarídeos N-Iigados suplementares são acoplados aseqüências consensuais (Asn-X/Ser/Thr, em que X é qualqueraminoácido exceto prolina) (Imperiali B e Shannon KL.Biochemistry, 1991, 30; 4374). Os carboidratos N-Iigadosforam adicionados a proteínas tais como Epo, ligante Mpl oumesmo Ieptina que normalmente é totalmente desprovida decarboidratos. As proteínas glicoengenheiradas apresentaramuma atividade substancialmente aumentada in vivo e umaduração de ação muito maior (Elliott S. e outros, Nat.Biotechnol. 2003, 21:414).

Podem ser geradas variante de "decoy" de Bst2("decoy" de Bst2-Fc) com maior afinidade de ligação a L deBst2. 0 domínio de dimerização de Bst2 pode estar envolvidono controle da afinidade de ligação de ligante de Bst2.Acredita-se que a dimerização de bst2 desempenha um papelna transdução de sinais de Bst2. Os receptores parainterleucinas 2, 3, 5 e 6 e fator de estimulação de colôniade granulócitos contêm duas sub-unidades diferentes(Hatakeyama Μ, e outros, Science. 1989, 244 (4904):551-6;Kitarnura Τ, e outros., Cell. 1991, 66 (6) : 1165-74) . As sub-unidades de ligação de ligante do receptor de fator deestimulação de colônia de granulócitos, receptor deprolactina e receptor de hormônio de crescimento formamhomodimeros (Larsen A, e outros, J Exp Med. 1990,172 ( 6) :1559-70, Kelly PA, e outros, Recent Prog Horm Res.1993, 48:123-64). Foi indicado que a dimerização produzreceptores de alta afinidade e proporciona a primeira etapado percurso de transdução de sinais (Cunningham BC, eoutros, Science,. 1991, 254 (5033) : 821-5; Nicola NA, MetcalfD, Cell. 1991, 67(1):1-4).

Devido ao fato de a homodimerização de Bst 2desempenhar provavelmente um papel na transdução de sinaisinduzidos por L (ligante) de Bst2, é contemplado que asvariantes de "decoy" de Bst2 ("decoy" de Bst2-Fc) com maiorafinidade de ligação possam ser obtidas por mutação deresíduos de aminoácidos dentro do domínio de dimerizaçãopotencial.

A análise SMART de Bst'2 prevê um domínio helicoidal("coiled coil") nas regiões de aminoácidos de 96-153 '(Bst 2humana) (ou 102-149, Bst2 murina) ou na regiãocorrespondente em Dampl murina. 0 domínio helicoidal("coiled coil") de Bst2 pode estar envolvido na dimerizaçãode Bst2.

Determinação do Domínio de Dimerização de Bst2A dimerização de Bst2 induzida por citocinas podeser demonstrada era células estáveis transfectadas com doisBst2 marcados diferentemente (tais como HA-Bst2 e Bst2-Flag) ou após transfecção transiente com vetores deexpressão para Bst2 marcado. A dimerização de Bst2 édemonstrada por co-imunoprecipitação das proteínas Bst2marcadas. Pode ser demonstrada a dimerização do receptor deBst2 de tipo natural. Quando a dimerização de Bst2 éconfirmada, podem ser obtidas informações sobre resíduoscríticos para dimerização após análise de eliminação,análise de mutação de varredura de alanina, e/ou mutagêneseorientada a sítio. As mutações serão realizadas no domínioextracelular inteiro ou no domínio helicoidal ("coiledcoil"). Muito embora possa ser demonstrada a dimerização doreceptor de tipo natural, os mutantes contendo umaeliminação ou substituição era resíduos importantes paradimerização não se co-imunoprecipitariam. Os mutantes deBst2 contendo urna eliminação ou substituição no domínio dedimerização podem funcionar como um mutante negativo-dominante para bloquear respostas inflamatórias e inibiradesão célula-célula após estimulação de citocina quandotransfectados transientemente para células contendo Bst2.Quando são expressados de forma estável em células Dampl -/- (por exemplo, fibroblastos embrionários de camundongoDampl -/-), estes mutantes podem não ser capazes demanifestar respostas inflamatórias ou adesão de célula-célula com eficiência.

Muitas variantes de eliminação, variantes deinserção ou variantes de substituição são submetidas atriagem, para utilização como "decoy" de Bst2 de altaafinidade ou "decoy" de Bst2-Fc. A eliminação, inserção ousubstituição pode ser introduzida nos sítios de mutaçãoalvos no domínio extracelular inteiro, domínio helicoidal("coiled coil") ou domínio de dimerização identificadoconforme foi descrito acima. A localização dos sítios demutação pode encontrar-se, por exemplo, nas regiões debaixa homologia em Bst2 humana, Bst2 murina, e Damplmurina. Pode ser realizada eliminação do resíduo deaminoácido alvo, inserção de um ou mais resíduos deaminoácidos adjacentes ao resíduo de aminoácido alvo, ousubstituição do resíduo de aminoácido alvo. Os resíduos deaminoácidos alvo podem ser resíduos de aminoácidos simplesou múltiplos. As eliminações ou inserções de seqüências deaminoácidos podem ser feitas de 1-5 resíduos contíguos, jáque eliminações/inserções radicais podem resultar em perdatotal de atividade biológica.

Os resíduos de aminoácidos alvos para eliminação,inserção ou substituição incluem os resíduos críticos paradimerização de B-st.2 conforme identificados acima. Outrossítios de interesse incluem aqueles em que os resíduos deaminoácidos são similares ou idênticos em Bst2 humana, Bst2murina e Dampl murina. Para mutagênese de substituição,poderá ser realizada mutagênese aleatória.

Triagem para Variantes de "Decoy" de Bst2 Decoy ou "Decoy"de Bst2-Fc

1. As variantes de "decoy" de Bst2-Fc ou "decoy" deBst2 são submetidas a triagem mediante utilização do ensaiode adesão célula-célula. As variantes com maior afinidadeinibem a adesão célula-célula mais eficientemente que aproteína mãe de "decoy" de Bst2-Fc ou "decoy" de Bst2.

2. As variantes de "decoy" de Bst2-Fc sãosubmetidas a triagem mediante utilização do ensaio de fasesólida conforme aqui descrito. As placas são revestidas comanticorpo anti-Fc e incubadas com as variantes de "decoy"de Bst2. A linhagem celular de fonte para L de Bst2 (ver oExemplo 29-1, em Identificação de uma fonte celular invitro abundante para L de Bst2) ou células U937 (ver oExemplo 20) é então marcada por rádio com 3H-timidina eadicionada ao receptáculo. Após isolação e validação de Lde Bst2 (ver os Exemplos 28-34), células transfectadas como vetor de expressão para L de Bst.2 podem ser marcadas porrádio e igualmente utilizadas para o ensaio. Após fixação,é medida a aderência das células marcadas por rádio.

3. Os métodos aqui descritos permitem que umapessoa normalmente versada na técnica identifique mutantescom maior afinidade de ligação sem necessidade depurificação de proteínas. Os "primers" de PCR de Bst 2mutagênese são concebidos para mutagênese aleatória deresíduos de aminoácidos selecionados ou qualquer aminoácidoaleatório no domínio extracelular, domínio helicoidal oudomínio de dimerização. Os produtos de PCR que codificammutações são sub-clonados no vetor de expressão de Bst2digerido. As células C0S7 são transfectadas transientementecom cDNAs de Bst2. Neste método, as variantes de Bst2contendo mutações no domínio extracelular, domíniohelicoidal ("coiled coil") ou domínio de dimerização sãoexpressadas nas superfícies das células transfectadas para"panning". As células são adicionadas a placas "panning"revestidas com L de Bst2 purificado. As células queexpressam "decoy" de Bst2 com maior afinidade para L deBst 2 são então submetidas a triagem por imunofluorescênciaindireta ou análise FACS com L-Fc de Bst2 humana marcadacom FITC, seguida por marcação secundária de anticorpos. ODNA de plasmídeo é recuperado das células acopladas à placae é usado para o ciclo de enriquecimento seguinte. 0"decoy" de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc é modificado paraconter as seqüências mutadas selecionadas. A variante de"decoy" de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc contendo as mutaçõesselecionadas é testada no ensaio de adesão célula-célulapara validação funcional.

Produção de Bst2, "Decoy" de Bst2, "Decoy" de Bst2-Fc, L deBst2, Uma parte Destas Proteínas ou Mutantes DestasProteínasO escopo da presente invenção inclui métodos paraconstrução dos vetores de expressão para proteínas Bst2,"decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc, L de Bst2, uma partedestas proteínas ou mutantes destas proteínas paraexpressão em células hospedeiras com origem em mamíferos,insetos, fungos, plantas ou bactérias., e métodos parapurificação destas proteínas. Bst2, "decoy" de B.st2,"decoy" de Bst2-Fc ou L de Bst2 incluem aquelas derivadasde homólogos de Bst2 e L de Bst2 de camundongos, ratos,coelhos, cães, primatas e outros animais. Para construçãode vetores de expressão para produção de proteínasrecombinantes, seria necessário sintetizar quimicamente oscorrespondentes genes ou fragmentos de Bst2, "decoy" deBst2, "decoy" de B.st 2-Fe, L de Bst2 ou seus mutantes comseqüências de nucleotídeos com códons otimizados para cadasistema de expressão.

Os vetores de expressão projetados para expressãode Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc ou L de Bst2em células de mamíferos, insetos (baculovírus, células deSchneider), fungos, plantas ou bactérias são construídosmediante inserção do fragmento de DNA que codifica Bst2,"decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc ou L de Bst2 naadjacência do promotor específico-célula hospedeira em umvetor específico de célula hospedeira, que pode encontrar-se em uma forma viral ou de plasmídeo. Estas proteínaspodem ser expressadas como uma proteína de fusão marcada emcélulas de mamíferos, insetos, fungos., plantas oubactérias. As marcações são seqüências de proteínas curtas,que possuem uma alta afinidade de ligação a anticorpos ousuportes sólidos especialmente modificados. A marcação podeincluir, sem entretanto ser necessariamente ser limitada amarcadores de Histidina, Flag, V5, GST e HA. 0 "decoy" deBst.2 marcado é purificado com base na afinidade do marcadorao suporte sólido tal como colunas ou contas ("beads").Podem ser utilizadas etapas adicionais incluindocromatografia líquida para aumentar a pureza de todas asproteínas relacionadas com Bst2.

Se assim for desejado, a proteína ou fragmento deBst2, "decoy" de Bst2 ou L de Bst2 pode ser modificada poracetilação da amina N-terminal, amidação do grupo carboxilaC-terminal, fosforilação de resíduos de serina, treonina outirosina, metilação nos grupos alfa-amino de resíduos delisina, arginina e histidina, desamidação de resíduos deglutaminil e asparaginil, hidroxilação de prolina e lisina,biotinilação, palmitilação, sulfação, farnesilação, esimilares.

A proteína Bst 2 ou L de Bst2, "decoy" de Bst2,fragmento da mesma, ou variante da mesma, que tem um efeitosupressor de inflamação mediante inibição de adesãointercelular, pode ser naturalmente isolada ou sintetizada(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2156, 1963), oupode ser preparada por um método de recombinação baseado emseqüência de DNA (Sambrook e outros, Molecular Cloning[Clonagem Molecular],, Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York, USA, 2nd Ed., 1989). Quando é utilizada umatécnica de recombinação genética, pode ser obtida umaproteína desejada mediante inserção de um ácido nucléicoque codifica a proteína Bst2 ou L de Bst2, um fragmento damesma ou uma variante da mesma, em um vetor de expressãoadequado, transformando-se uma célula hospedeira com umvetor de expressão, cultivando-se a célula hospedeira paraexpressar a proteína desejada, e recuperando-se a proteínaproduzida da cultura.

1. Preparação de forma recombinante de Bst2,"decoy" de Bst2, Mecoy" de Bst2-Fc, L de Bst2, uma partedestas proteínas ou mutantes

As abordagens de recombinação baseadas em proteínacom êxito requerem capacidade de produzir uma proteínabiologicamente ativa que possa ser facilmente escalonadapara produção em massa. A compatibilidade de utilização decódons entre a seqüência genética nativa das proteínasrelacionadas a Bst2 mencionadas acima e a do hospedeiro deexpressão constitui uma consideração importante.

Adicionalmente às utilidades terapêuticas deproteínas de "decoy" de Bst:2 e "decoy" de Bst2-Fc, asproteínas recombinantes de Bst2, "decoy" de Bs t2, "decoy"de Bst2-Fc, L de Bst2, uma parte destas proteínas oumutantes destas proteínas são necessárias para triagem devariantes de anticorpo anti-Bst2 ou anticorpo anti-L deBst 2.

As proteínas recombinantes Bst2, "deeoy" de Bst2 e"decoy" de Bst2-Fc são igualmente utilizadas em ensaiospara identificação de L de Bst2 envolvido na interação deligação. A Bst2 pode ser Bst2 propriamente dita, ou outrasproteínas, peptídeos ou moléculas.

Bst2, "decoy" de B.st2, "decoy" de Bs t2-Fc7 L deBst2, partes das mesmas e mutantes podem ser utilizadaspara triagem de peptídeos ou agonistas ou inibidores demoléculas pequenas da interação Bst2-L-Bst2. Esses ensaiosde triagem incluem ensaios de ligação proteína-proteína dealto rendimento, ensaios baseados em célula, inunoensaiosou ensaios de triagem bioquímica de listagens químicas,adequados para identificação de drogas candidatas demolécula pequena.

As formas recombinantes de Bst2, "decoy" de Bst2, Lde Bst2, partes e mutantes das mesmas podem igualmente serúteis para abordagens de vacinas baseadas em proteínasrecombinantes.

1-1. Expressão de Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" deBst2-Fc7 L de Bst2, urna parte destas proteínas ou mutantesdestas proteínas (diversas proteínas associadas a Bst2) emcélulas de mamíferos

Muitos sistemas de células hospedeiras e vetores deexpressão de mamíferos encontram-se comercialmentedisponíveis. No Exemplo 4 foi descrito um exemplo deexpressão em mamífero.

1-2. Expressão das diversas proteínas relacionadascom Bst2 em baculovírus

Adicionalmente às células de mamíferos, proteínasglicosiladas de Bst2, "decoy" de Bst2, L de Bst2 e outrasproteínas relacionadas co Bst2 podem ser derivadas decélulas de invertebrados incluindo células de insetos taiscomo Drosophila S2, Sf9 bem como células de plantas. Paraexpressão de baculovírus as correspondentes seqüências deBst2 ou L de Bst2 são fundidas a montante de um epitopomarcado, por exemplo, vetor de expressão de baculovírus commarcação poli-his. O "decoy" de Bst2-Fc pode ser utilizadosem outro marcador. Muitos vetores de expressão debaculovírus são disponíveis comercialmente. A infecçãoviral e expressão de proteína é realizada conforme édescrito por O'Reilley e outros, Baculovírus expressionvectors: A Iaboratory Manual [Vetores de expressão debaculovírus: um Manual de laboratório], Oxford: OxfordUniversity Press (1994). O baculovírus recombinante égerado por co-transfecção de vetores de baculovírus deBst 2, "decoy" de Bst2 e DNA de vírus BaculoGold(Pharmingen) em células Sf9 (ATCC) utilizando-selipofectina. Após 4 - 5 dias de incubação a 28° C, os vírusliberados são colhidos e utilizados para amplificação.

Os Bst2, "decoy" de Bst2 ou L de Bst2 com marcaçãopoli-his são purificados por cromatografia de afinidade dequeIato-Ni2if (Rupert e outros, Nature., 362:175, 1993). Apurificação de "decoy" de Bst2-Fc pode ser realizada comutilização de cromatografia de coluna A de proteína.

1-3. Expressão das diversas proteínas relacionadascom Bst2 em Pichia pastoris

Pichia pastoris é um eucarioto unicelular que temmuitas similaridades com E. coli era termos de facilidade declonagem de genes estranhos, bem como por apresentar umaexpressão induzível extremamente controlada em culturasfáceis de processar (Kocken, C. H. e outros, Infect. Immun.67:43-49. 1999). Sendo um eucarioto, P. pastoris é capaz devárias modificações pós-translacionais, por exemplo, acapacidade de formar ligações de dissulfito que permitemdobramento ("folding") adequado de proteínas de organismoPichia é igualmente conhecido como potencial glicosiladorde proteínas (Yadava A e Ockenhouse, Infect. Immun.71:4 961, 2003).

Os genes das diversas proteínas relacionadas comBst2 são sintetizados quimicamente utilizando seqüências denucleotídeos otimizadas para utilização de códons dePichia. Os constructos de P. pastoris, por exemplo., PicZa(Invitrogen) , um plasmídeo zeocina-selecionável., sãoutilizados para clonagem e expressão das proteínasrelacionadas com Bst2 em P. pastoris. 0 plasmídeo contém umpromotor álcool oxidase 1 de P. pastoris fundido ao fatorde α- a c op 1 ame η to de Sãcchâroniyces cerevisiâe para orientara proteína para a via de secreção. Após indução commetanol, a proteína é expressada sob controle do promotorálcool oxidase 1 e é secretada para o meio de cultura.

Após construção dos vetores de expressão PicZa dediversas proteínas relacionadas com Bst2, células azuis XL-1 de E. coli são transformadas com os construetos, e clonesresistentes a zeocina são submetidos a triagem para oinserto por PCR e digestão de restrição. Os clonespositivos são utilizados para transformar P. pastoris. Amistura de transformação é disposta em placas de levedo-peptona-dextrose-sorbitol contendo zeocina. Para expressão,os clones positivos são cultivados em um meio de gliceroltamponado durante cerca de 24 horas. As células sãopelotizadas em induzidas com mídia fresca contendo 1% demetanol durante outras 24 horas. Os sobrenadantes sãotestados para expressão por ELISA ou "Western Blot" paradetecção de diversas proteínas relacionadas com Bst2. Aproteína de expressão de Pichia é purificada dosobrenadante da cultura.

1-4. Expressão das diversas proteínas relacionadascom Bst2 em levedo

Os vetores de expressão era levedo são construídospara produção ou .secreção intracelular com utilização deseqüências otimizadas em termos de códons. Para secreção,DNAs codificando Bst2, "decoy" de Bst2, L de Bst2, partesou mutantes destas proteínas, podem ser clonados para oplasmídeo selecionado cora DNA codificando o promotor deADH2/GAPDH, a seqüência de sinalização/líder de secreção defator alfa de Ie vedo. As células de levedo podem sertransformadas com os plasmideos de expressão e cultivadasem mídias de fermentação selecionadas (Hsiao e outros,Proc. Natl. Acad.. Sei. USA, 76:3829, 1979). Ossobrenadantes do levedo são analisados pro precipitação deTCA, SDS-PAGE e marcação azul Coomassie. As proteínasrecombinantes relacionadas com Bst2 podem ser isoladas desobrenadante concentrado mediante utilização de métodos decromatografia de coluna selecionado.

1-5. Expressão de Bst2, "decoy" de Bst2 em E. coli

Em determinadas condições, algumas das proteínasrelacionadas com Bst2 mencionadas acima podem serproduzidas em E. coli. Entretanto, é sabido que nem todasas proteínas solúveis produzidas em E. coli podem sercorretamente dobradas ("folded"), e proteínas dobradasincorretamente podem formar agregados insolúveis na formade corpos de inclusão (Carrio, M. M., e A. Villaverde.2002. J. Biotechnol. 96:3-12).

A seqüência de DNA que codifica as proteínasrelacionadas com Bst2 para expressão em um sistema E. cõlié amplificada mediante utilização de "primers" de PCRcontendo sítios de enzimas de restrição adequados. Umavariedade de vetores de expressão encontram-se disponíveiscomercialmente. O vetor é digerido com enzima de restriçãoe desfosforilado. As seqüências amplificadas por PCR sãoentão ligadas ao vetor. A mistura de ligação é entãoutilizada para transformar a cepa de E. coli. Gstransformantes são selecionados e o DNA de plasmídeo éisolado. Os clones selecionados são cultivados em meio decultura liquido e são subseqüentemente utilizados para umacultura de maior escala, durante a qual o promotor deexpressão é ativado. A pelota de célula pode sersolubilizada e as proteínas relacionadas com Bst2solubilizada podem ser então purificadas medianteutilização, por exemplo, de uma coluna de quelação demetal, se a proteína for expressada de um vetor contendouma seqüência poli-his e sítio de clivagem deenteroquinase.

2. Preparação de Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" deBst2-Fc, L de Bst2, uma parte destas proteínas ou mutantespor síntese de peptídeos

Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc, L deBst2, diversas partes das mesmas ou mutantes podem serproduzidos por síntese direta de peptídeos utilizando umatécnica de fase sólida ou através de uma combinação demétodos de fase sólida e de fase de solução (Stewart eoutros, Solid Phase peptide Synthesis [Síntese de peptídeosde Fase Sólida], W.H. Freeman Co., San Francisco, CA,(1969) ; Barlos K e outros., Int J Pept Protein Res. 1991;37: 513-520; Babiker E e outros., J Org Chem. 1978; 43:4196-4199). Diversas partes destas proteínas relacionadascora Bst2 podem ser quimicamente sintetizadas separadamentee combinadas por métodos químicos ou enzimáticos paraprodução das formas de extensão total de Bst2, "decoy" deBst2, L de Bst2 ou mutantes.

0 método de síntese de peptídeos pode igualmenteser útil para produzir versões modificadas destas proteínas(por exemplo, uma versão fosforilada).

Os peptídeos podem ser sintetizados medianteutilização de aminoácidos de forma L ou forma D. Emparticular, as proteases e peptidases de mamíferos nãopodem degradar peptídeos sintetizados de D-aminoácidos. Aforma D de "decoy" de Bst2 ou diversas porções de forma Dde "decoy" de Bst2 seriam muito estáveis in vivo apesar desuas reduzidas dimensões e podem ser administradas era águade beber ou misturadas com alimentos., em aerossóis com are/ou em adesivos.

A proteína Bst2 ou fragmento da mesma., provida napresente invenção, que tem um efeito supressor deinflamação mediante inibição de adesão intercelular ouinteração intercelular e ativação de células imunes, podeencontrar-se em uma forma monomérica ou multimérica. Uraaforma multimérica pode ser formada por diversos métodosnormalmente conhecidos na técnica e o método para formaçãode ura raultímero não é especificaraente limitado.O multimero pode ser um dímero, um trímero, umtetrâmero, um pentâmero, um hexâmero, e assim por diantesem limitações. Por exemplo, um multimero pode serpreparado mediante utilização de uma seqüência indutora deformação de multimero, por exemplo uma seqüência "zipper"de isoleucina (ILZ) indutora de formação de trimero, ouproteina-D tensoativa TxSurfactant Protein-D" - SP-D)indutora de formação de dodecâmero. De outra forma, Ummultimero pode ser preparado por conjugação de dois ou maispolipeptideos tendo sido produzidos individualmente em umaforma monomérica, por exemplo mediante utilização de umcomponente de ligação.

0 multimero pode formar estruturas paralelas ouanti-paralelas, urna combinação de estruturas paralelas eanti-paralelas da proteína Bst2 ou fragmento da mesma.Muito embora se considere que a Bst2 funciona como umhomodímero, a orientação de cada monômero nos homodimerosnão é conhecida. Para construção dos vetores de expressãopara o multimero que contém uma estrutura anti-paralela daproteína Bst2 ou fragmento da mesma, as seqüências decodificação para a proteína Bst2 de estrutura anti-paralelaou fragmento da mesma devem ser sintetizadas quimicamentecom seqüências de nucleotídeos utilizadas em termos decódons. No vetor de expressão, cada unidade de proteínaBst2 (ou fragmento) pode ser ligada por um componente deligação sintético. Um componente de ligação sintéticoinclui um componente de ligação sintético rico em Gli/Ser(Berezov Δ e outros, 2001, J Med Chem 44:2565) ou umcomponente de ligação flexível de Gli (Kim e outros., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 96:10092, 1999).

Quando a unidade de fragmento de Bst2 ésuficientemente pequena para ser sintetizada diretamentepor síntese de peptídeo, podem ser produzidos tantomultímeros de forma L quanto multímeros de forma D.

A proteína Bst2, ou fragmento da mesma, que tem umefeito supressor de inflamação por inibir adesãointercelular, ou interação e ativação de células imunes,pode ser modificada por um polímero não-peptídico.

Em um aspecto detalhado adicional, o antagonistainclui uma proteína Bst2 ou fragmento da mesma modificadapor polímero não peptídico, que tem um efeito supressor deinflamação por inibição de interação ou adesão intercelulare ativação de células imunes.

A ligação da proteína Bst2 ou fragmentos da mesmacom um polímero não peptídico inclui ligações covalentes etodos os tipos de ligações não covalentes, tais comoligações de hidrogênio, interações iônicas, forças de vander Waals e interações hidrofóbicas. Preferencialmente, opolímero é ligado a uma proteína através de um gruporeativo específico. Exemplos de grupos reativos do polímeroincluem um grupo aldeído, um grupo aldeído propiônico, umgrupo aldeído butila, um grupo maleimida, um grupo cetona,um grupo vinil sulfona, um grupo tiol, um grupo hidrazida,um grupo carbonildimidazol (CDI), um grupo nitrofenilcarbonato (NPC), um grupo trisilato, um grupo isocianato, ederivados de succinimida. 0 polímero não peptídico reagecom grupos reativos de um polipeptídeo, por exemplo, umacadeia lateral, C-terminal e/ou N-terminal de resíduos deaminoácidos (por exemplo., cadeia lateral de um resíduo delisina, um resíduo de histidina ou um resíduo de cisteína).

A proteína Bst2, que tem um efeito supressor deinflamação mediante inibição de adesão intercelular, ouinteração intercelular e ativação de células imunes, podeser ligada a um polímero não-peptídico em uma razão molarde 1:1 até 1:10, preferencialmente 1:1 até 1:2. Quando aproteína Bst2, ou fragmento da mesma, é modificada por doisou mais polímeros não peptídicos, os polímeros nãopeptídicos são idênticos ou diferentes. As proteínas podemter metabolismo e estabilidade aperfeiçoados in vivoatravés de modificação com polímeros não peptídicos.

Em um outro aspecto ainda, a presente invençãoproporciona uma composição para prevenção ou tratamento dedoenças inflamatórias, compreendendo uma ou maisselecionada de entre, conforme foi descrito acima, proteínaBst2 ou fragmento da mesma possuindo um efeito supressor deinflamação por inibição de interação ou adesão intercelulare ativação de células imunes; e proteína Bst2 ou fragmentoda mesma modificada por polímero não peptídico possuindo umefeito supressor de inflamação por inibição de adesãointercelular.

A presente invenção pode .ser aplicada a seremhumanos, bem como a gado cujas doenças inflamatórias possamser inibidas ou reduzidas mediante administração de Bst2,tal como gado bovino, cavalos, carneiros, porcos, cabras,antílopes, cães e gatos. Neste contexto, os presentesinventores descobriram que a Bst2 humana e a Dampl murinapossuem uma similaridade funcional e atuam em células com amesma origem bem como era células de origens diferentes.

Em um outro aspecto detalhado ainda, a presenteinvenção refere-se a um método de prevenção ou tratamentode doenças inflamatórias, compreendendo a administração aum paciente de uma ou mais proteínas selecionadas de entreproteína Bst2 ou um fragmento da mesma possuindo um efeitosupressor de inflamação mediante inibição de interação ouadesão intercelular e ativação de células imunes.

Estabilização de "Decoy" de Proteína por Fusão de Fc

É descrita a fusão do "decoy" de Bst2 à parte de Fcde um anticorpo. A fusão resultante foi capaz de prolongaro efeito terapêutico da proteína "decoy" de Bst2,permitindo um cronograma de dosagem mais favorável, foitambém demonstrado que a fusão com albumina prolonga ameia-vida sérica de pequenas proteínas, tal como a fusão do"decoy" de Bst2 à parte de Fc de um anticorpo, a fusão do"decoy" de Bst2 com albumina pode aumentar a meia-vidasérica do "decoy" de Bst.2,

Muitas proteínas terapêuticas potenciais incluindoo "decoy" de Bst2 são menores que 40 kDa e são portantosuscetíveis de depuração ("clearance") renal por filtraçãoglomerular. Estas pequenas proteínas raramente constituemprodutos farmacêuticos perfeitos. A reformulação deproteínas para promoção de meia-vida sérica mais longaconstitui um importante objetivo médico e comercial. Namedida em que as proteínas precisam ser geralmenteadministradas por injeção, é preferencial ter proteínasterapêuticas que minimizem a freqüência de administração deproteínas.

De uma forma geral, o peso molecular efetivo de umaproteína pode ser aumentado mediante fusão a uma proteínatransportadora heteróloga, tal como albumina ou a região Fcde um anticorpo que pode auxiliar a purificação da proteína(Capon e outros, Nature. 1989 Feb 9;337(6207):525-31; YehP. e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 89:1904-1908,1992). A seqüência heteróloga pode ser qualquer seqüênciadesde que permita que a proteína quimérica resultanteretenha pelo menos uma das atividades biológicas do "decoy"de Bst 2..

Acredita-se que a Bst2 exista como um homodímérosobre a superfície da célula (Ohtomo e outros, BiochemBiophys Res Commun. 1999, 258 (3):583-91). Acredita-seigualmente que a B.st.2 requer dimerização para suaatividade. Desta forma, são preferenciais seqüênciasheterólogas que promovem associação dos monômeros de"decoy" de Bst2 para formação de dímeros, trímeros e formasmultiméricas mais elevadas. A construção de uma proteínaquimérica de Fc utilizando uma proteína pequena com um pesomolecular inferior a 40 kDa produz como resultado umaumento dramático da meia-vida sérica (Lo e outros, PCT WO00/40615, 2000). 0 constructo "decoy" de Bst2-Fc é umaproteína de fusão quimérica recombinante consistindo nodomínio extracelular de Bst2 humana e na região Fc de IgGhumana. O constructo "decoy" de Bst2-Fc foi produzido comoum dímero e em certa medida como um multímero mais elevado.

"Decoy" de Bst 2 Murino-Fc

O Bst 2 murino tem 44% e 70% de similaridade deaminoácidos relativamente ao Bst2 humano e ao Dampl murino,respectivamente (Kupzig e outros, 2003, Traffic 4(10):694). Um domínio helicoidal putativo encontra-se presentena região dos aminoácidos 96-153 (ou 102-14 9) na proteínaBst2 humana, e nas regiões correspondentes da proteína Bst2murina e da proteína Dampl murina.

A observação de que o "decoy" de Darapl murino inibeinteração célula-eélula entre células endoteliais humanas ecélulas U937 monocíticas humanas, e que o "decoy" de Bst2humana funciona no modelo de asma murino indica que o"decoy" de Bst2 e "decoy" de Bst2-Fc funcionam emcruzamento de espécies. A eficácia das proteínas "decoy" deDampl murina (fusão Fc), "decoy" de Bst2 murina (fusão Fc)ou "decoy" de Bst2 humana (fusão Fc) pode ser investigadaem qualquer modelo de doença animal incluindo camundongos,ratos, coelhos, cães ou primatas, de forma intercambiávelsem barreira entre espécies. Alternativamente, a fusão Fcde "decoys" derivados de homólogos de Bst2 de coelhos, cãesou primatas pode ser utilizada. Para tratamento deanticorpos em ratos, podem ser utilizados anticorpos anti-Dampl murino ou anticorpos anti-Dampl de rato. Paratratamento de anticorpos em ratos, coelhos, cães ouprimatas, pode ser utilizado um anticorpo específico paraos homólogos de Bst2 destes animais. Um método para geraçãode painéis de anticorpos monoclonais contra Dampl murinaconsiste na utilização de camundongos Dampl-/-. Oscamundongos Dampl -./- ("knockout") são gerados por métodosde recombinação de homologia bem conhecidos.

Os anticorpos monoclonais anti-Dampl de rato podemser produzidos mediante utilização de tecnologia dehibridoma de rato (Lebacq-Verheyden e outros, Hybridoma.1983, 2(3):355-8.). Similarmente, o tratamento deanticorpos em ratos pode ser realizado com utilização deanticorpos monoclonais anti-Bst'2 de rato murinos.

Camundongos Constitutivos de Damp 1 -/- ("Knock-Out")

Os camundongos Dampl -/- são gerados por métodos derecombinação homóloga. Conforme foi indicado acima, podemser obtidos anticorpos monoclonais anti-Dampl de camundongomediante utilização de camundongos Dampl -/-.Adicionalmente, os camundongos Dampl -/- são úteis parageração de informações sobre quais modelos de doença podemser abordados com os bloqueadores de Bst'2 ("decoy" deBst2(Dampl), anti-Bst2(Dampl)). Devido ao fato de ser muitodispendioso produzir drogas de proteínas purificadas paraestudos pré-clínicos, é difícil testar numerosos modelos dedoença. Por outro lado, a maioria dos tratamentosinduzíveis por doença utilizados para os modelos animais,por exemplo, tratamento de colage.no ou adjuvante paramodelos de artrite, tratamento de ovalbumina para modelosde asma, ou quaisquer outros tratamentos vulgarmenteutilizados em modelos animais, podem ser facilmenteimplementados sem custos excessivos. Mediante comparação dagravidade dos sintomas e do progresso da doença emcamundongos do tipo selvagem Dampl -/- após diversostratamentos induzíveis por doença, podem ser obtidasinformações valiosas sobre quais modelos de doença podemser abordados com os bloqueadores de Bst2. Desta forma,podem ser geradas mais opções de tratamento utilizandobloqueadores de Bst2.

Camundongos com Dampl -/- ("Knock-Out") Específico deTecidos

Muito embora a expressão transgênica de umaproteína negativa dominante de Dampl ou Bst2, ou simplesDampl -/- ("knock-out") conforme descrito acima possa serrelevante para as vias de inflamação/autoimunes de doençashumanas, a eliminação de Dampl em um tipo de célulaespecifico seria igualmente valiosa para estudo da funçãogenética de Dampl/Bst2 e dedução da função genética deBst2.

Os sistemas de recombinase especifica de sitio taiscomo o amplamente utilizado sistema CreloxP (Lasko M eoutros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:5860, 1996; Orban Pe outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:6861, 1992) podemser utilizados. Neste sistema, duas linhagens decamundongos transgênicos são necessárias para facilitar"knockout" de Dampl especifico de tecido. A primeiralinhagem de camundongos expressa Cre recombinase sobcontrole de um promotor especifico de tecido livrementeescolhido. Encontram-se atualmente disponíveis praticamente4 0 ~ 50 linhagens Cre, e continua aumentando adisponibilidade e variedade de linhagens Cre. A segundalinhagem porta sítios IoxP em torno de Darnpl. Após inter-cruzamento, o gene de Dampl é removido, das células queexpressam Cre recombinase. Uma ou ambas as cópias do genede Dampl pode(m) ser designada(s) como alvo(s), por exemplopara exame da sensibilidade à dosagem do gene de Dampl.

Camundongos com Darapl -/- ("Knock-Out") Específico deTecidos e InduzivelA relevância fisiológica da função do gene de Damplem uma doença pode requerer adicionalmente um controletemporal adicionalmente à especificidade para tecido. Umaforma de adquirir a expressão induzivel de Cre recombinaseespecifica de tecido consiste na utilização de formas deCre reguladas por ligantes de receptor de esteróidemediante fusão de um domínio de ligação de ligante dereceptor de estrogênio (ER) mutante ao terminal-C de Cre.

Estas proteínas de fusão são induzidas pelo antagonista deestrogênio sintético 4-OH tamoxifen, mas são insensíveis abeta-estradiol endógeno. Três diferentes receptores deestrogênio mutantes, o ERTM murino (Danielian PS, Curr.Biol. 8:1323, 1998), o ERT humano (Logie e Stewart, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 92:5940, 1995) e o ERT2 humano (FeilR e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752, 1997),encontram-se disponíveis. Mediante colocação de CreER sob ocontrole de um promotor específico de tecido, é possívelgerar um sistema de "knock-out" de Dampl em uma formaespecífica de tecido e induzivel por tamoxifen. A segundalinhagem transgênica porta sítios IoxP em torno de Dampl.Após o intercruzamento, o gene de Dampl é removido dascélulas que expressam Cre recombinase de uma formainduzivel por tamoxifen..

Em uma outra abordagem podem ser utilizadossistemas sensíveis à tetraciclina. A tetraciclina liga-se àproteína trans-ativadora de tetraciclina, tTA, ou proteínatrans-ativadora de tetraciclina reversa, rtTA. Estescomplexos reprimem ou ativam a atividade de Dampl ligando-se ao operador Tet (tetO). Para obtenção de "knockout"induzível por Tet de Dampl de uma forma especifica paratecido, são requeridos camundongos transgênicos triplos. Naprimeira linhagem, a proteína tTA ou rtTA é expressada sobcontrole de um intensificador/promotor específico detecido. A segunda linhagem porta promotor operador de Tet(tetO) e Cre-recombinase. Somente na presença de tTA ourtTA, e tetraciclina fornecida na água de beber, o promotortetO é ativado e a Cre recombinase é expressada. A terceiralinhagem porta sítios IoxP flanqueando Darapl. Em seguida, aCre recombinase realiza a excisão do gene de Dampl de umaforma específica de tecido, induzível por Tet.

Animais Transgênicos com "Knockdown" de Dampl ou Bst2 ViaRNAi (Interferência de RNA) Utilizando shRNA

Dada a dificuldade de aplicação da tecnologia de"knockout" de gene a espécies diversas de camundongos, ainterferência de RNA (RNAi) pode ser utilizada parasilenciar a expressão de Dampl ou Bst2 em camundongos ououtros animais, respectivamente. Seria possível silenciar ogene de Dampl em camundongos ou homólogos de Bst2 em outrosanimais utilizando pedaços curtos de siRNA de Dampl ou Bst2em animais transgênicos. O "knockdown" de Bst2 ou Damplespecífico de tecidos mediante utilização de interferênciade RNA poderia constituir uma abordagem alternativa parageração de modelos de perda de função.

A interferência de RNA é o silenciamento de genepós-transcricional, especifico de seqüência, por um pequenoRNA de fita dupla ("double-stranded RNA" - dsRNA) homólogoàs seqüências do gene silenciado. Os mediadores dedegradação de RNA mensageiro especifico de seqüência sãopequenos RNAs interferentes (siRNAs) de 21 e 22nucleotideos gerados por clivagem de dsRNAs mais longos(Bernstein E e outros, Nature 409:363, 2001; Elbashir SM eoutros, Nature 411:494, 2001). Estes siRNAs sãoincorporados a um complexo silenciador indutor de RNAmultiproteína. A fita "antisense" guia o complexosilenciador para seu mRNA alvo homólogo resultando emclivagem. Foi demonstrado que uma RNase especifica de fitadupla no interior da célula designada Dicer pode processarpequenas estruturas de RNA em forma de grampo ("smallhairpin RNA" - shRNA) resultando na geração de micro RNAs.Mediante inibição de translação, o micro RNA podeefetivamente silenciar a expressão de gene utilizandosomente um vetor. Os sistemas shRNA podem ser utilizadospara geração de animais transgênicos que silenciam aexpressão de gene de forma estável.

siRNA de Dampl ou Bst2: o siRNA de Dampl ou Bst2pode ser construído mediante incorporação de seqüênciascorrespondentes do siRNA de Bst2 humano utilizado na Fig.9, ou podem ser construídos novos siRNAs. Para seleção deseqüências potenciais de siRNA de Dampl(Bst2) para geraçãode shRNAs de Dampl(Bst2), células de mamíferos tais comocélulas Cos-7 são co-transfectadas com um constructo defusão Dampl(Bst2)-proteína fluorescente verde ("GreenFluorescent Protein" - GFP) mais diferentes siRNAsorientadas contra Dampl(Bst2). A expressão e "knockdown" daproteína de fusão Dampl(Bst2)-GFP é analisada por"immunoblotting".

Construção do vetor de expressão Dampl(Bst2)-shRNA:São utilizados tanto promotores pol III quanto promotorespol II para síntese de RNA tipo grampo curto ("shorthairpin RNA" - shRNA) para "knockdown" de expressão degenes em células de mamíferos e animais. Para construção dovetor de expressão de shRNA, o mais eficiente dos siRNAsconforme obtido por triagem acima é então clonado para umplasmídeo de expressão de shRNA no qual fitas "sense" e"antisense" de seqüências curtas de Dampl(Bst2) sãotranscritas para estruturas tipo grampo sob o controle de,por exemplo, um promotor U6, como uma seqüência de DNAcodificando o Dampl (Bst2)-shRNA., e são então processadaspara síRNAs funcionais por RNase específica de fita dupla,Dicer, no interior das células. Om vetor de expressão deshRNA é gerado mediante clonagem dos correspondentesoligonucleotídeos de DNA para um plasmídeo de expressão deshRNA tal como pSilencer 1.0-U6 da empresa Ambion (Austin,TX, USA). Os oligonucleotídeos abrangem a seqüência "sense"e "antisense" de Dampl (Bst2) e um enlace de 7 bp, e oproduto recozido contém sítios de enzima de restrição,adequados. Este duplex é ligado para pSilencer 1.0-U6. Estevetor é então utilizado para expressão endógena de shRNA emcélulas de mamíferos. 0 vetor de controle de RNAi éconstruído por inserção de uma seqüência que expressa umsiRNA com homologia limitada para quaisquer seqüênciasconhecidas nos genomas murino ou humano.

Geração de animais transgênicos expressando Damplou Bst2-shRNA: Utilizando o método de injeção pró-nuclear,Xia e outros (PLoS Genet. 2006; 2(1): elO) conseguiramdemonstrar que shRNAs transcritos do promotor Pol II humanotal como o promotor C de ubiquitina humano podem mediar osilenciamento de genes em camundongos. Os camundongostransgênicos foram obtidos por injeção pronuclear doconstructo linearizado para o interior dos ovosfertilizados. Similarmente, é possível utilizar qualquertipo de promotor específico de tecido acoplado a shRNA deDampl ou Bst2 para geração de camundongos transgênicos porsimples injeção pronuclear.

Alternativamente, podem ser utilizados parafornecimento do transgene para animais., vetores viraisadeno-associados ("Adeno-Associated Viral" - AAV) (A.Auricchio e outros, Hum. Mol. Genet. 10 (2001), pp. 3075-3081) ou vetores Ientivirais (Golding MC e outros, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2006 Apr 4; 103(14):528 5-9 0)expressando o shRNA de Dampl ou Bst2.

Animais Transgênicos Expressando Bst2, L de Bst2, Partes ouMutantes de Bst2 ou L de Bst2

Animais transgênicos (um camundongo ou rato)sobreexpressando a totalidade de Bst 2 ou L de Bst2 (ouqualquer porção da mesma), são úteis no desenvolvimento etriagem de reagentes terapeuticamente úteis tais corno anti-Bst2, "decoy" de Bst2, "decoy" de Bst2-Fc e anti-L de Bst2.

As linhagens transgênicas podem ser construídas paraexpressarem as proteínas Bst2 ou L de Bst2constitutivamente, de uma forma induzível, uma formaespecífica de tecido, ou uma forma induzível/específica detecido.

Os animais transgênicos expressando Bst2 ou L deBst 2 (ou qualquer porção da mesma) podem apresentarcondições patológicas associadas com sobreexpressão de Bst2ou L de Bst2. Estes animais podem ser tratados com obloqueador de Bst2, e uma incidência reduzida da condiçãopatológica, em comparação com animais não tratadosportadores do transgene de Bst2 ou L de Bst2, indicaria umbenefício terapêutico potencial. Quando é identificada umaversão dominante-negativa de Bst2 (Dampl) ou L de Bst2 (Lde Dampl) Ique interfere com a função da proteína de tiponatural), os animais transgênicos que expressam as formasdominantes negativas destas proteínas podem ser geradospara testar se o processo de doença foi inibido. Os animaistransgênicos que expressam a proteína dominante negativa deBst2 humana podem ser criados com camundongos de "knock-in"anteriormente aos testes do processo de doença.

Cassetes de expressão de transgene contêm a unidadede transcrição incluindo a seqüência de consenso Kozak,éxons de codificação da Bst2 ou L de Bst2, porções oumutantes destas proteínas, um sinal de terminação (poli-A-final) e elementos reguladores que controlam a expressão dotransgene. Encontram-se disponíveis na literatura numerososintensificadores/promotores específicos de tecidos.Encontram-se disponíveis comercialmente sistemas induzíveisincluindo sistemas induzíveis por tetraciclina ou portamoxifen para controle da expressão temporal (vide acima,em Camundongos com Dampl -/- ("Knock-Out") Específico deTecidos e Induzível). Os métodos para geração decamundongos ou ratos transgênicos tornaram-se convencionais(patentes norte-americanas n° US 4.736.866 e n° US4.870.009).

Animais Transgênicos Expressando "Decoy" de Bst2, "Decoy"de Bst2-Fc e Fusão de Albumina-"Decoy" de Bst2

Animais transgênicos expressando o domínioextracelular de Bst2 ou Dampl (ou qualquer porção dosmesmos), ou o domínio extracelular de Bst2, ou Dampl (ouqualquer parte do mesmo) fundido com o fragmento Fc oualbumina, podem ser utilizados para avaliação de efeitosterapêuticos do "decoy" de Bst 2 (Fc) sob condiçõespatológicas. Camundongos transgênicos expressando estasproteínas podem ser criados com camundongos "knock-in"expressando Bst2 para avaliação dos efeitos terapêuticos daproteína de "decoy" de Bst2 (Fc)7 em monoterapia ou terapiade combinação., em qualquer condição patológica. Aslinhagens transgênicas podem ser construídas paraexpressarem estas proteínas constitutivamente, de umamaneira induzível, uma maneira específica de tecido, ou umamaneira induzível/específica de tecido.

Camundongo "Knock-In" - Criação de Camundongos com Bst2Quimérica Humana-Murina

Devido ao fato de a homõlogia de seqüências deaminoácidos entre Bst2 humana e Dampl murina/Bst2 de ratonão ser muito grande, não é possível testar a eficácia dospainéis dos anticorpos anti-Bst2 humana em modelos murinosou de ratos de doenças inflamatórias imune. Como forma desuperar este problema consiste em gerar camundongos "knock-in" expressando Bst 2 humana, neste caso a Bst2 quiméricahumana-murina. Os camundongos "knock-in" podem ter a regiãode codificação inteira de Dampl substituída por humana ouapenas o domínio extracelular de Dampl substituído pelodomínio extracelular de Bst2 humana resultando em umaproteína quimérica. Muito embora possam ser utilizados paraeste propósitos camundongos transgênicos expressando Bst2humana, um sistema de sobreexpressão não é um sistema idealpara testar a eficácia dos bloqueadores de Bst2. Umaabordagem de "knock-in" que permite a expressão de Bst2quimérica humana-murina nos níveis fisiológicos supera aabordagem transgênica. Um camundongo "knock-in" expressandoBst2 quimérica humana-murina pode ser produzido de acordocom um protocolo de recombinação homóloga de "knock-in"convencional, e pode ser realizado mediante utilização deum constructo exemplificado conforme ilustrado na Fig. 28.Os camundongos "knock-in" são tratados para a indução decondições inflamatórias-imunes. São administradosanticorpos anti-Bst2 humana.

Estes camundongos são igualmente úteis para testara eficácia de uma terapia de combinação com anticorpo anti-B st 2 humana ou "decoy" de Bst2-Fc com diversos anticorposde rato contra um alvo de proteína de camundongo. Porexemplo, camundongos "knock-in" expressando Bst2 humanapodem ser tratados com colágeno para indução de artrite(Andren e outros, J Immunol. 2006, 63(4):282-9) e podem serem seguida tratados com "decoy" de Bst2 humana-Fc,ou anti-Bst2 humana em combinação com qualquer agente único, doisagentes., três agentes, ou quatro agentes de TNFR anti-camundongo (TNF alfa receptor I ou II) de rato, receptorIN-6 anti-camundongo de rato (Genzyme)i, receptor IL-I anti-camundongo de rato (Abcam) ou CTLA4-Ig murino ("in-house").Foi determinado que o CTLA4-Ig murino inibe respostas decélulas T em rato (Shiraishi T e outros, 2002, Am JTransplant 2:223).Modelos de Doenças Animais para Teste da Eficácia dosBloqueadores de Bst2

Os modelos animais úteis para teste da eficácia dosbloqueadores de Bst2 incluem, sem limitações, um modelo deartrite induzida por colágeno em ratos ou camundongos (Webbe outros, Eur J Immunol. 1996, 26(10):2320-8; Andren eoutros, Scand J Immunol. 2006, 63:282), um modelo deartrite induzida por adjuvante em ratos ou camundongos(Haruna e outros, Arthritis Rheum. .2006, 54 (6) : 1847-1855;Hida e outros, J Autoimmun. 2005 Sep;25 (2) : 93-101) , ummodelo de asma induzida por ovalbumina (Sy e outros, IntImmunopharmacol. 2006, 6(7):1053-60) , um modelo deosteoartrite (Averbeck e outros, J Rheumatol. 2004Oct;31(10):2013-20), um modelo de doença de rejeição detransplante ("Graft versus Host Disease" - GvHD) (Zhang eoutros, Blood., 2006, 107:2993-3001; Baliga e outros,Transplantation. 1994, 58 (10):1082-90) , um modelo dediabetes tipo 1 em camundongos não obesos diabéticos (NOD -non-obese diabetic) ou ratos BB (BioBreeding) (Yang Y,Santamaria P. Clin Sei. 2006., 110 (6) : 627-39) , um modelo deisquemia/reperfusão (Arumugam e outros, Nat Med. 2 006Jun;12(6):621-3), um modelo de choque séptico (Motobu eoutros, Phytother Res. 2006, 20 (5):359-63), um modelo deuveite autoimune (Yilmaz e outros, Curr Eye Res. 2005,30(9):755-62), encefalomielite alérgica experimental("Experimental Allergic Encephalomyelitis" - EAE) emcamundongos, que é um modelo animal para esclerose múltipla(Mujtaba e outros, J Immunol. 2005,175(8):5077-8 6), ummodelo de embolia cerebral em coelho (Chapman DF, Stroke.2001,32(3):748-52), um modelo de colite em camundongo paradoença de Crohn e doença infLamatória dos intestinos (Yen De outros, J Clin Invest. 2006, 116(5):1310-6), um modelo delesão hepática induzida por concanavalina A para hepatiteautoimune ou viral (Li e outros, Hepatology. 2006.Jun;43(6):1211-9) , um modelo de psoriase (Gudjonsson JE,Elder JT, Eur J Hum Genet. 2006,14(1):2-4 ), e um modelo derejeição de aloenxerto de córnea em coelho (Shirao E,Deschenes J, Char DH. Curr Eye Res. 1986, 5(11) :817-22) .Foram descritos modelos animais para estudo de AMD (Dithmare outros, Arch Ophthalmol 2001,119(11):1643-9; Cousins eoutros, Exp Eye Res. 2002, 75 (5) :543-53) .

0 bloqueio de B,st2 pode suprimir uma aceleraçãoprematura de aterosclerose mediante estabilização deaterosclerose estabelecida. Esta hipótese pode ser testadaem camundongos apoE-nulos tratados com estreptozotocina(diabético) ou camundongos "knock-out" de receptor de LDL(Jackson laboratories) (Bucciarelli e outros, Circulation,2002, 106(22):2827) . Csaky K. Exp Eye Res. 2002, 75 (5) : 543-53) . Muitos pacientes com diabetes tipo II desenvolvematerosclerose. Os efeitos dos bloqueadores de Bst2 emdiabetes tipo II e aterosclerose podem ser testados emcamundongos mutantes tipo db/db apoE-null double mutant.O conceito de a interferência com a ação de Bst.2ser ou não benéfica para tratamento de uma doença autoimunemediada por anticorpos é inicialmente testado mediantemedição de resposta de anticorpos a células vermelhas dosangue de ovelhas e hemocianina de moluscos "key holeIimpet" conforme descrito em Linsley PS, Wallace PM,Johnson J, Gibson MG, Greene JL, Ledbetter JA, Singh C,Tepper MA. Science. 1992, 257(5071):792-5.

Outros modelos de doenças autoimunes incluemdoenças tipo lupus (Finck e outros, Science. 1994,265(5176):1225-7) e modelo de glomerulonefrite em ratos(Nishikawa e outros, Eur J Immunol. 1994, 24(6):1249-54.).

A tolerância a transplante especifico de doador pode sertestada com utilização de camundongos diabéticos quereceberam xenoenxertos de ilhotas de células pancreáticas(Lenschow e outros, Science, 1992,, 257 (5071) : 751). Podeigualmente ser demonstrada tolerância em um modelo dealoenxerto cardíaco murino vascularizado (Larsen e outros,Nature, 1996, 381(6581):434-8; Pearson e outros,Transplantation, 1995, 59(3):450) e um modelo de rejeiçãode aloenxerto de pele em camundongos (Tepper e outros,Transplant Proc. 1994, 26(6):3151-4) e um modelo detransplante renal (Laskowski IA. J Am Soc Nephrol. 2002,13 (2) :519-27).

Terapia de Combinação

As doenças inflamatórias imunes são distúrbioscomplexos mediados por uma rede complexa de sinalizaçãoinflamatória imune. Estes eventos podem ser estritamenteassociados entre Si, entretanto os processos celulares emoleculares subjacentes podem diferir consideravelmente.Desta forma, uma remissão completa de doenças imuno-inflamatórias pode requerer terapias combinadas.Normalmente, foi demonstrado que terapias combinadas quepodem ter uma capacidade variada de afetar diversosprocessos pró-inflamatórios são superiores à monoterapia.

O conceito para terapia de combinação com osbloqueadores de Bst2 foi testado in vitro com um ensaio deadesão célula-célula utilizando ICAMl (molécula de adesãointercelular) como exemplo (Exemplo .25 e Exemplo 26). AICAMl foi selecionada por ter sido demonstrado que a ICAMlregula muitos genes críticos para vias inflamatórias imunese foi extensivamente estudada quanto a seu envolvimento emmuitas doenças inflamatórias imunes.

A ICAM1 é o contra-receptor de célula alvo doantigeno relacionado com função de linfócito, LFA-I(CD11c/CD18), um membro da sub-família das integrinasexpressado em leucócitos. A interação entre estas duasmoléculas é crucial para ativar a reação imune celular.Acredita-se igualmente que a ICAM-1 desempenhe um papel narejeição aguda de tecidos aloenxertados. A ICAM1 e o LFA1estão envolvidos na interação célula-célula entre célulasque apresentam antigenos e células Τ. A ICAM1 em APCs podeligar seu receptor LFAl em células Tea ICAMl em células Tpode ligar LFAl a APC (Mackay CR, Imhof BA, Immunol Today,1993, 14:99). O acúmulo de indicações suporta a noção deque várias moléculas anteriormente consideradas como sendomoléculas de adesão são também capazes de fornecer sinaisde co-estimulação para ativação de células T (por exemplo.,LFA3, LFAl e ICAMl) (Mackay CR Imhof BA, Immunol Today,1993, 14:99). As moléculas co-estimulatórias fornecem àscélulas T sinais adicionais que resultam do inicio eintensificação de proliferação (Steinman RM Young JW. 1991,Curr. Opin Immunol 3:361).

Terapia de Combinação para Doenças Cárdio-vasculares

A terapia de combinação para doenças cárdio-vasculares pode ser realizada com estatina, inibidores deACE, bloqueadores beta, bloqueadores de canal de cálcio,ReoPro, Clopidogrel, e inibidores de renina-angiotensina. Adisfunção de células endoteliais é associada a distúrbioscárdio-vasculares tais como aterosclerose, hipertensão, eproliferação de células de músculos lisos vasculares. Aexpressão de Bst2 é induzida por citocinas inflamatóriastais como TLF alfa, gama interferon e histamina, o queindica que a Bst2 pode estar envolvida em doenças cárdio-vasculares. Desta forma, o bloqueio de Bst2, seja comomonoterapia ou em combinação com terapias convencionaisincluindo estatina, inibidores de ACE, bloqueadores beta,bloqueadores de canal de cálcio, ReoPro, Clopidogrel, einibidores de renina-angiotensina pode trazer benefícios aotratamento de doenças cárdio-vasculares.

Adicionalmente, a Bst2 é induzida por citocinasinflamatórias em células de músculos lisos. A proliferaçãode células de músculos lisos pode reduzir a taxa de êxitode angioplastia, um procedimento que aumenta o diâmetro daartéria aterosclerótica, tipicamente a artéria coronária. 0bloqueio de Bst2 pode reduzir a proliferação de células demúsculos lisos e aumentar a taxa de sucesso deangioplastia.

Terapia de Combinação para Artrite Reumatóide

Terapia de combinação para artrite reumatóide comCTLA4-Ig ou bloqueadores de TNF alfa, IL6 ou ILl. A artritereumatóide ("rheumatoid arthritis" - RA) é um distúrbioinflamatório complexo caracterizado por inflamação sinovialcrônica, erosão óssea e destruição de cartilagens. 0bloqueio de uma única citocina pró-inflamatória, o fator denecrose tumoral (TNF alfa) inibiu com eficácia o processoartrítico em ensaios clínicos, entretanto, uma remissãocompleta de sinais e sintomas de RA é raramente obtidapelos bloqueadores de TNF alfa isoladamente, sugerindo quediversas vias pró-inflamatórias podem atuarindependentemente de TNF alfa. Foi observado que o bloqueiode TNF alfa detém a erosão óssea em um grande número depacientes cujos sinais clínicos de inflamação nãoapresentam resposta. Os efeitos de TNF alfa nos ossos sãoindependentes de uma resposta clinica nos sinais e sintomasdê doença. 0 efeito relativo de TNF alfa em inflamações dejuntas, erosão óssea e destruição de cartilagens podeportanto diferir.

Foi demonstrado que o bloqueio de uma molécula alvoprincipal de TNF alfa, interleucina-1 (IL-I), apresentoualguns efeitos em RA. A IL-I demonstrou seus efeitos emdanos em cartilagens, muito embora a monoterapia deantagonista de receptor de IL-I não tenha eliminado ossinais clínicos e sintoma da artrite em uma maioria depacientes. Muito embora uma remissão completa de sinais esintomas de RA seja raramente obtida por qualquer urna dasmonoterapias, e nem mesmo por inibição de TNF, osresultados preliminares de inibição combinada de TNFalfa/IL-1, TNF alfa/RANKL ou TNF a1fa/IL-I/RANKL em modelosexperimentais sugeriram que esse tratamento pode terefeitos de adição. Estes resultados reforçam o motivo parautilização de bloqueio combinado de mais de uma via pró-inflamatória para tratamento de artrite reumatóide.

Foi recentemente observado que anti-IL6 ou oantígeno 4-Ig associado a linfócito T citotóxico (CTLA4-Ig)é igualmente benéfico para o tratamento de artrite. Aregião promotora do gene de Bst2 tem sítios de ligação paraSTAT3, que media a expressão genética de resposta deinterleucina-6 (IL-6) sugerindo que a expressão de Bst2pode ser regulada pela via IL6 - STAT3 (Ohtomo e outros,Biochem Biophys Res Commun. 1999, 258(3):583-91). 0bloqueio de Bst2 que é um alvo de jusante de IL6 pode serbenéfico para o tratamento de RA.

O antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico(CTLA4) é o receptor de células T com regulagem ascendente("upregulated") após ativação das células T. Na maioria doscasos os sinais do receptor de células T ("T-cell receptor"- TCR) isoladamente são insuficientes para produzirem comoresultado a respostas imunes otimizadas e é requerido umsegundo sinal eo-estimulatório para superar um limiar paraa resposta das células T. Esta intensificação dos sinais deTCR é provida principalmente por CD28 nas células T7 quepode ser ativado por B7 expressado nas células portadorasde antigeno. Após serem ativadas, as células T expressam umsegundo receptor, CTLA-4, que pode igualmente ligar asmesmas moléculas B7. Em contraste com CD28, o CTLA-4 inibeas respostas de células Τ.

Α CTLA4-Ig é uma proteína de fusão quiméricarecombinante que consiste no domínio extracelular de CTLA4humano e na região Fc de IgG humana (Abatacept, Bristol-Myers Squibb). A CTLA4-Ig liga-se â molécula B7 de APC(antigen presenting cell - célula portadora de antígeno),bloqueando sua interação com o receptor de CD28 na célulaT., dessa forma bloqueando a interação co-estimulatória comCD28 em células T .(Linsley e outros, J Exp Med. 1991,174(3):561-9). Foi observado que a CTLA4-Ig é eficaz notratamento de artrite reumatóide (Moreland e outros, NatRev Drug Discov. 2006, 5(3):185-6). Desta forma, otratamento combinado dos bloqueadores de Bst2 com CTLA4-Ig,ou bloqueadores de TNF alfa., IL6 ou ILl pode ser benéficopara o tratamento de artrite.

0 modelo de artrite induzida por colágeno em ratosou o modelo induzido por adjuvante em ratos pode serutilizado. 0 anticorpo anti-Bst2 de rato em camundongos, o"decoy" de Bst2 humano-Fc, o "decoy" de Bst2 de rato-Fc ouo "decoy" de Dampl murino-Fc podem ser testados emcombinação com anticorpos monoclonais anti-TNFR de rato emcamundongos, receptor de IL6 de ratos ou receptor de ILl deratos, ou com CTLA4-Ig murina. A CTLA4-Ig murina produzidaconforme é relatado em Lane e outros (Lane e outros,Immunology, 1993, 80(1):56-61) pode ser utilizada emmodelos de ratos conforme é indicado por outros estudos(Shiraishi e outros, Am J Transplant. 2002, 2(3):223-8). ACTLA4-Ig murina pode ser feita do gene quimérico da parteextracelular do gene de CTLA-4 murino e da região constantede IgGl humana. A CTLA4-Ig humana (Abatacept, BristolSquibb) pode também ser utilizada em um modelo de rato deartrite induzida por colágeno.

Podem igualmente ser utilizados camundongos "knock-in" expressando Bst2 humana Os camundongos "knock-in" sãotratados com colágeno ou adjuvante para indução de umacondição artritica e são então tratados com anticorpo anti-Bst2 humana ou "decoy" de Bst2 humana-Fc em combinação comanticorpos monoclonais anti-receptor de TNF alfa murino derato (Abcam), anti-receptor de IL6 murino (Genzyme) ouanti-receptor de ILl murino (Abcam), ou com CTLA4-Igmurina. 0 tratamento anti-Bst2 pode igualmente serutilizado para tratamento de uma forma mais comum deartrite, a osteoartrite, que tem igualmente um componenteinflamatório.

Terapia de Combinação para Asma

Descreve-se a terapia de combinação para asma,particularmente com teofilina, glicocorticóide,bloqueadores de TNF alfa ou anti-ICAMl. A maioria dasdescrições das características patológicas da asma incluemcontração/hipertrofia dos músculos lisos dos brônquios,edema da mucosa e espessamento da membrana da baseepitelial e células inflamatórias, particularmenteeosinófilos, em tecido submucosal. Acredita-se que esteseventos ocorrem de forma seqüencial, causando ascaracterísticas patológicas da asma. 0 tratamento atualpara a asma inclui: anticolinérgicos, esteróides, agonistacompetitivo de adenosina e agonistas de beta 2 de atuaçãolonga e curta. Uma terapia combinada dos bloqueadores deBst2 com estes tratamentos convencionais poderá serbenéfica para a asma. Adicionalmente, nossos dados deperfil de expressão genética indicam que a Bst2 é altamenteinduzível em células de músculos lisos após estimulaçãoinflamatória tal como gama interferon (Fig. 34). Estesdados indicam a possibilidade de a Bst2 estar envolvida nafisiologia das células de músculos lisos, e os bloqueadoresde Bst2 poderem manifestar alguns efeitos benéficosadicionais, além das respostas antiinflamatóriasanteriormente caracterizadas, durante o curso do tratamentoda asma. Por estes motivos, a terapia de combinação dosbloqueadores de Bst2 com terapias convencionais para asmapoderá ter efeitos aditivos.

Quando a asma se torna progressivamente mais graveou o paciente não responde à terapia de teofilina, opaciente é tratado com corticosteróides. A terapia decombinação de bloqueadores de Bst2 e corticosteróides podepermitir uma redução da dosagem de corticosteróides,reduzindo assim seus efeitos colaterais.

Foram demonstrados os papéis de ICAMli, alfa 4integrina e TNF alfa em modelos de asma induzida porovalbumina em ratos ou primatas (Taylor e outros, Am JRespir Cell Mol Biol. 1997, 17 (6) :757-66) . A inibiçãocombinada de Bst2 com bloqueadores de ICAMl, TNF alfa e/oualfa 4 integrina pode ser eficaz no tratamento de asma. Osanticorpos anti-ICAMl de rato murinos, anticorpos antiICAMl murino de ratos, anticorpos anti-TNFR de ratomurinos, anticorpos anti-TNFR murino de ratos, anticorposanti-alfa 4 integrina de rato e anticorpos anti-alfa 4integrina murina de ratos encontram-se disponíveiscomercialmente para estudos pré-clinicos com utilização demodelos murinos ou de rato. Os anticorpos anti-ICAM1 derato murinos, anticorpos anti ICAM1 murino de ratos,anticorpos anti-TNFR de rato murinos, anticorpos anti-TNFRmurino de ratos, anticorpos anti-TNF alfa de ratos oucamundongos, anticorpos anti-alfa 4 integrina de ratomurinos e anticorpos anti-alfa 4 integrina murina de ratosencontram-se disponíveis comercialmente para estudos pré-clinicos utilizando modelos murinos ou de ratos.

Terapia de Combinação para Hepatite Autoimune

Descreve-se a terapia de combinação para hepatiteautoimune ("Autoimmune Hepatitis" - AIH), particularmentecom utilização de corticosteróides. A hepatite autoimune éurna doença crônica progressiva do fígado. Possíveis fatorescausais incluem vírus, outros distúrbios autoimunes edrogas. G histórico natural da hepatite autoimune apresentauma prognose pessimista, com freqüente progressão paracirrose e insuficiência hepática em pacientes não tratados.A AIH raramente apresenta regressão espontânea.

Os mecanismos moleculares que contribuem para apatogênese incluem: reações de auto-anticorpos contra auto-antígenos, moléculas de adesão celular e citocinas; eocorrência de angiogênese (Medina e outros, AlimentPharmacol Ther. 2003, 17(1):1-16). Níveis séricos elevadosde moléculas-1 de adesão intercelular ("serum IntercellularAdhesion Molecule-1" - sICAM-1), moléculas-1 de adesãocelular vascular ("serum Vascular Cell Adhesion Molecule-1"- sVCAM-I) , (S) E-Selectina., (s) P-selectina e receptor deinterleucina-2 solúvel ("soluble Interleukin-2 Receptor" -SIL-2R), IL4, LFAl, LFA3, TGF beta ocorrem em pacientes comAIH (Simpson e outros, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1995,7(5):455-60). Em hepatite viral crônica, hepatiteautoimune, os mecanismos imunes mediados por células Tdesempenham um papel importante na patogênese das lesões emtecidos (Bruck e outros, Isr Med Assoc J. 2000, 2 Suppl:74-80) .

0 tratamento preferido para pacientes com AIHutil iza glicocorticóides, como monoterapia ou em combinaçãocom azatioprina (Czaja AJ, Drugs 57:49-68, 1999, Cook eoutros, Q J Med. 1972, 40:159; Murray-Lyon e outros,Lancet, 1973, 1:735-7). Muito embora os corticosteróidesreduzam a incidência de cirrose durante a fase inicial deterapia, a cirrose desenvolve-se apesar da terapia em maisde 90% dos pacientes dentro de 5-10 anos (Davis e outros,1984, Gastroenterology 87:1222-7).

0 tratamento com corticosteróides está associado aefeitos colaterais dependentes de dosagem bem conhecidos(Summerskill e outros, Gut 16:876-83, 1975, Czaja AJ, In:Krawitt EL, Wiesner RH, eds. Autoimmune Liver Disease. NewYork; Raven Press, 1991:143-66). São igualmente freqüentesefeitos hiperglicêmicos e hipertensão. Desta forma, épreciso prestar uma atenção especial a pacientesdiabéticos, bem como a pacientes com doenças ósseasmetabólicas causadas pela doença hepática..

A terapia de combinação de anti-Bst2 ou "decoy" deBst2 com corticosteróides pode ser benéfica para manter aremissão da doença. Esta combinação pode permitir urnaredução da dose de corticosteróides, reduzindo assim seusefeitos colaterais e proporcionando melhores resultados queaqueles obtidos com corticosteróides em dosagens elevadas.

A utilização de anti-Bst2 ou "decoy" de Bst 2 podeser investigada mediante utilização de modelos tal como omodelo de lesão hepática induzida por concanavalina A emcamundongos (Kaneko e outros, Biochem Biophys Res Commun.2006, 345(1):85-92) utilizando-se anticorpo anti-Damplmurino que pode ser gerado utilizando-se camundongos Dampl-/-, anti-Dampl murino de rato ou "decoy" de .Bst2 (Dampl) -Fc humano, murino ou de rato ou em modelo de cirrosehepática induzida por tioacetamida em ratos (Zimmermann eoutros, Gastroenterol Hepatol. 2006, 21(2) :358-66)utilizando-se anti-Bst2 de rato ou humana murino ou "decoy"de Bst2 (Dampl) Fc de rato ou camundongo.

Terapia de Combinação para Transplante

É descrita a terapia de combinação paratransplante, particularmente com ciclosporina, rapamicina,ou anticorpo anti-LFAl. Foi demonstrado que as moléculas deadesão se encontram criticamente envolvidas na rejeição deenxertos e constituem candidatos moleculares óbvios paraterapia de intervenção dirigida a alvo. As moléculas deadesão afetam os mecanismos celulares de rejeição dealoenxertos mediante controle do tráfico de leucócitos dohospedeiro para o aloenxerto. 0 tráfico de células para oaloenxerto é mediado por ligação de pares ligante-receptorde moléculas de adesão entre leucócitos em circulação e oendotélio vascular. No interior do aloenxerto, as moléculasde adesão podem igualmente participar em reconhecimento decélulas T de células alvo.

O imunossupressor ciclosporina ou rapamicina éutilizado em medicina de transplantes como potente inibidorde calcineurina. Entretanto, os pacientes tratados cominibidores de calcineurina estão associados a efeitosnefrotóxicos que podem causar insuficiência renal (Miller eoutros, J Heart Lung Transplant, 1995,14:S227; Vitko S,Viklicky O. Transplant Proc. 2004, 36(2 Suppl):243S-247S).Outros efeitos colaterais incluem neurotoxicidade,hiperpotassemia e hipertensão.

A terapia de combinação de "decoy" de Bst2 ou anti-Bst2 com alternativamente uma dose subclinica ou moderadade ciclosporina ou rapamicina pode ter um efeitoimunossupressor sinergético benéfico com uma redução depotencial nefrotóxico.

Os modelos animais de transplante para teste daeficácia dos bloqueadores de Bst2 incluem um modelo derejeição de aloenxerto de pele em camundongos (Tepper eoutros, Transplant Proc. 1994, 26(6);3151-4), um modelo dedoença de rejeição de enxerto ("Graft versus-Host Disease"- GvHD) (Zhang e outros, BIood, .2006, 107:2993-3001; Baligae outros, Transplantation.. 1994, 58 (10) : 1082-90) , um modelode rejeição de aloenxerto de córnea em coelho (Shirao eoutros, Curr Eye Res. 1986, 5(11):817-22) , um modelo dexenoenxerto de ilhotas celulares pancreáticas (Lenschow eoutros, Science, 1992, 257 (5071) :751), um modelo dealoenxerto cardíaco murino (Larsen e outros, Nature, 1996,381(6581):434-8; Pearson e outros, Transplantation, 1995,59(3):450) e um modelo de transplante renal.

Para estudos pré-clínicos., são utilizados anti-Dampl murino, anti-Dampl murino de rato, anti-Bst2 de ratomurino, "decoy" de Bst2(Dampl)-Fc humano, murino e de rato,dependendo dos modelos., em combinação com diferentes dosesde ciclosporina ou rapamicina. São examinadas asobrevivência do enxerto e ativação/proliferação de células T.

Terapia de Combinação para Esclerose Múltipla

É descrita a terapia de combinação para esclerosemúltipla, em particular com bloqueadores de alfa 4integrina. A esclerose múltipla ("Multiple Sclerosis" - MS)é uma doença inflamatória e desmielinante comum do sistemanervoso central ("Central Nervous System" - CNS) com umasuposta etiologia inflamatória autoimune. Os anticorpospara bloqueio da adesão de células T ativadas a célulasendoteliais pode reduzir a característica inflamatória daplaca de esclerose múltipla. Os tratamentos atuais incluemanticorpos monoclonais contra alfa 4 integrinas(Natalizumab), beta interferon e glatiramer (Ropper AH,2006, N Engl J Med. 354:965; Rudick RA, e outros, N Engl JMed. 2006, 354 (9) : 899-910.)

A terapia de combinação de anti-Bst2 ou "decoy" deBst2 com anticorpo monoclonal contra alfa 4 integrinas podeser benéfico. 0 uso de anti-Bst2 ou "decoy" de Bst2 podeser investigado mediante utilização de um modeloexperimental de encefalomielite alérgica ("ExperimentalAllergic encephalomyelitis" - EAE) em camundongosutilizando anticorpo anti-Dampl, anti-Dampl murino decamundongo que pode ser gerado com utilização decamundongos Dampl -/-, anti-Dampl murina de rato ou "decoy"de Bst2 (Dampl)-Fc humano, de rato ou murino com anti-alfa4 integrina murina de rato (Abcam).

Terapia de Combinação para Minimização de Lesões em Tecidos

Uma lesão em tecidos pode ocorrer como resultado deisquemia, hemorragia, trauma, inchaço, queimaduras, ouexposição a produtos químicos, toxinas ou drogas. A mortecelular resultante de reações inflamatórias a lesões emtecidos aumenta freqüentemente as lesões nos tecidos.Mediante o bloqueio de Bst2, as lesões em tecidos podem serminimizadas. Por exemplo, esteróides tais comoglicocorticóides são utilizados para minimização de danoscerebrais após ataques. O bloqueio de Bst2 durante ouimediatamente após o ataque, em combinação com esteróides,pode minimizar o grau final de dano cerebral. Similarmente.,o bloqueio de Bst2 durante o imediatamente o infarto domiocárdio pode reduzir o grau de lesão cardíaca.

Terapia Combinada para Doença de CrohnÉ descrita a terapia de combinação para doença deCrohn, em particular com anticorpos anti-alfa 4 integrina.A doença de Crohn é uma doença crônica debilitantecaracterizada por uma grave inflamação do cólon causada porcélulas T auxiliares CvT helper" - Th)1. O papel doantagonista de Bst2 pode ser testado mediante utilização deum modelo murino de colite (Gonzalez-Rey e outros,Gastroenterology. 2006 Jun;130(6):1707-20). Para doençainflamatória dos intestinos, uma terapia de combinação comanticorpos anti-alfa 4 integrina pode ser benéfica.

Terapia de Combinação para Síndrome MetabólicaÉ descrita a terapia de combinação para síndromemetabólica, particularmente com metformina, TZD, estatina,NSAID, inibidores de ACE e bloqueadores de receptor deangiotensina.

Nos últimos anos surgiu o conceito de que aativação da via pró-inflamatória pode constituir ummecanismo para resistência à insulina associada comobesidade. O fator alfa de necrose tumoral (TNF)- é elevadoem tecido adiposo e sangue de roedores obesos, e o bloqueiode TNF alfa melhora a sensibilidade à insulina. Ainterleucina (IL)-6 e proteína quimioatraente de monócito("Monocyte Chemoattractant Protein" - MCP-I) podemigualmente causar resistência à insulina e foram relatadosníveis elevados de TNF alfa, IL-6 e IL-8 em pacientesresistentes à insulina e diabéticos (Roytblat e outros,Gbes Res. 2000, 8(9):673-5; Straczkowski e outros, J ClinEndocrinol Metab. 2002, 87(10):4 602-6; Hotamisligil eoutros., Science. 1996, 271 (5249) : 665-8; Sartipy P,Loskutoff DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 100 (12) : 7265-70; Hotamisligil e outros, J Clin Invest. 1995, 95 (5) :2409-15) . Adicionalmente, são observados níveis elevados daproteína C-reativa ("C-reactive protein" - CRP) marcadorainflamatória em pacientes com resistência à insulina(Visser e outros, JAMA. 1999, 282 (22) :2131-5).Adicionalmente, o tratamento com altas doses de salicilatopode inibir Ikappa B quinase (""Ikappa B Kinase" - IKK) , umaquinase preponderante na via inflamatória, e reverter aintolerância à glicose e a resistência à insulina emroedores obesos (Yuan e outros, Science. 2001,293(5535):1673-7).

A resistência à insulina pode promover disfunçãoendotelial, e o bloqueio anti-TNF alfa proporciona umarápida melhoria da função endotelial. A inflamaçãosistêmica, resistência à insulina e disfunção endotelialforam implicadas no desenvolvimento de doenças cárdio-vaseulares. O endotélio é responsável pela manutenção dehomeostase vascular. Em condições fisiológicas, o endotélioatua mantendo o tônus vascular, o fluxo de sangue e afluidez de membrana, a disfunção endotelial que ocorre nasindrome metabólica resulta de efeitos das citocinasinflarnatórias tal como TNF-alfa. Assim, a sindromemetabólica é considerada um estado de inflamação crônicaacompanhado de disfunção endotelial, por exemplo, causandoum aumento de incidência de eventos cárdio—vascularesisquêmicos, resistência à insulina e elevada taxa demortalidade. Desta forma, acredita-se que terapias capazesde bloquearem a condição inflamatória minimizemconseqüentemente o risco cárdio-vascular, a diabetes tipoII e dislipidemia devido a sindrome metabólica.

A seguinte medicação é amplamente utilizada paratratamento da sindrome metabólica: anti-diabéticos oraistais como metformina e tiazolidinedionas (TZD), anti-hipertensivos tais como inibidores de enzima conversora deangiotensina ("Angiotensin-Converting Enzyme - ACE) ebloqueadores de receptor de angiotensina Cx AngiotensinReceptor Blockers" - ARBs) e drogas de estatina redutorasde lipideos, e drogas antiinflamatórias não esteroidais("Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug - NSAID). Estasdrogas, que se observou reduzirem a incidência e/ouretardam o inicio de diabetes tipo 2 e ateroscleroseaparentaram possuir propriedades antiinflamatórias.

Foi observado que a metformina ativa AMPK quedesempenha um papel central na regulação de homeostase deenergia e esforço metabólico. A metformina também inibiu deforma independente de dose a ativação de NF-kappaB induzidopor (TNF)-alfa e a atividade de IkappaB quinase ("IkappaBKinase" - IKK) induzida por TNF-alfa. Adicionalmente, ametformina atenuou a expressão genética induzida por TNFalfa de diversas moléculas de adesão celular e pró-inflamatórias, tal como a molécula-1 de adesão celularvascular ("Vascular Cell Adhesion Molecule-1" - VCAMl), E-selectina, molécula-1 de adesão intercelular("Intercellular Adhesion Molecule-1" - ICAMl), e proteina-1quimioatraente de monócito ("Monocyte ChemoattractantProtein-1" - MCPl). Os inibidores de enzima conversora deangiotensina ("Angiotensin-Converting Enzyme" - ACE) ebloqueadores de receptor de angiotensina (λν AngiotensinReceptor Blockers" - ARBs) reduzem os marcadores deinflamação, e reduzem o risco de desenvolvimento dediabetes tipo 2. As drogas sensibilizadoras para insulina,Tiazolidinedionas (TZDs), são ligantes seletivos dereceptor gama ativado por proliferador de peroxisoma("Peroxisome-Proliferator-Activated Receptor gamma" - PPARgamma) amplamente utilizados no tratamento de diabetes tipo2. Os PPARs são membros da superfamília de receptores dehormônios nucleares de fatores de transcrição e sãoreguladores preponderantes em diversos processospatofisiológicos relacionados com o metabolismo de energia,incluindo metabolismo de Iipideos e carboidratos einflamação. O PPAR gama é abundantemente expressado emtecido adiposo e foi relatado que as vias de sinalização dePPAR gama exercem efeitos antiinflamatórios medianteinibição de NF-kappaB. De acordo com estes resultados, foidemonstrado tanto em estudos in vitro quanto em estudos invivo que as TZDs possuem propriedades antiinflamatórias. AsTZDs inibem a ativação de macrófagos e reduzem a expressãoe liberação de citocinas inflamatórias em macrófagos emonócitos. In vivo, o tratamento com TZDs reduz o teor deNF-kB nuclear em células mononucleares em circulação eaumenta simultaneamente, nas mesmas células, a expressão deIkB, um inibidor de NK-kB, inibindo mediadoresinflamatórios tais como interleucina-1 beta (IL-1 beta), IL6, moléculas de adesão, VCAM-I e P-selectina e monócito.

Ligante de Bst2 (L de Bst2)

O "decoy" de Bst2 que consiste no domínioextracelular da proteína receptora, Bst2, inibe interaçõescélula-célula tanto homotípicas quanto heterotípicas invitro. Devido ao fato de o domínio extracelular de qualquerdeterminado receptor ser o domínio que interage com seuligante, a inibição mediada por "decoy" de Bst2 deinteração célula-célula indica que 1) existe um ligante deocorrência natural para Bst2 (L de Bst2), 2) é requeridainteração entre Bst2 e L de Bst2 para adesão célula-célula,e 3) o "decoy" de Bst2 deve interagir com L de Bst2 deocorrência natural e inibir a interação célula-célula noensaio de adesão mediante neutralização de L de Bst2, dessaforma regulando negativamente as reações inflamatóriasimunes.

A observação de que o Mecoy" de Bst2 inibe oacoplamento de U937 a HUVEC indica que a L de Bst 2 seencontra presente na superfície celular de células U937 nãoestimuladas. Uma outra observação de que o "decoy" de Bst2inibe agregação homotípica de células T ativadas ou célulasU9.37 ativadas sugere que o L de Bst2 pode ser expressado nasuperfície de células T e/ou de células U937 tanto antesquanto após a ativação. A expressão de L de Bst2 pode sersubmetida a regulagem ascendente ("upregulated") apósativação das células T ou células U937. Desta forma, o L deBst2 pode ser expressado em células U937 (ou outraslinhagens de células monocíticas), células T, ou célulashematopoiéticas primárias anteriormente ou após a ativação,por exemplo, condições de ativação de células T oucondições de estimulação de LPS. 0 L de Bst2 podeigualmente ser expressado em células B, célulasdendríticas, células endoteliais ou fibroblastos.

O L de Bst2 pode consistir em proteínas oumoléculas. 0 L de Bst 2 pode consistir em proteínas demembranas ou proteínas solúveis. É possível que possamexistir muitas diferentes proteínas ou moléculas de L deBst2 apresentando as diferentes especificidades de ligaçãoe características funcionais do receptor de Bst2. Éigualmente contemplado que o Bst2 propriamente dito possaser o ligante funcional potencial de Bst2, já que éconhecido que a Bst2 forma um homodímero. A Bst2 na célulainflamada pode reconhecer Bst2 nos leucócitos infiltrados ecélulas imunes. É possível que todas as proteínas oumoléculas de L de Bst2 sejam totalmente, não relacionadas emtermos das características funcionais ou de ligação umasdas outras. Desta forma, deve ser testado minuciosamente seas características funcionais mediam etapas de limitação detaxa nas respostas inflamatórias ou imunes paraestabelecimento do alvo terapêutico para o "de-coy" de Bst2("decoy" de Bst2-Fe) e o desenvolvimento subseqüente dematerial terapêutico para prevenção e/ou tratamento dascondições inflamatórias. Outras proteínas ou moléculas de Lde Bst2 que podem não se encontrar nas etapas limitadorasde taxas nas vias inflamatórias poderão mediar outras viasimportantes em diferentes processos de doenças.

A demonstração da existência de L de Bst2 é umacaracterística significativa da presente invenção, namedida em que o L de Bst2 pode constituir um alvo parainteração com moléculas antiinflamatórias. Os anticorposcontra L de Bst2 podem tornar-se um anticorpo terapêuticopara tratamento de diversas doenças imunes e inflamatórias.As moléculas quiméricas do domínio extracelular de L deBst2 para Fc podem ser igualmente benéficas. É possível queo L de Bst2 esteja envolvido, por exemplo, em sinalizaçãoco—estimulatória (ou inibitória) de células T para ativaçãode células T. Muito embora o L de Bst2 venha ligar-se aBst2, o L de Bst2 pode interagir com muitos outrosreceptores em células T ou células portadoras de antigenosque mediara sinais co-estimulatórios ou co-inibitórios. Osanticorpos agonisticos ou antagonísticos de proteínas defusão Fc destes novos grupos de receptores podem tornar-sedrogas terapêuticas de proteínas para tratamento dediversas doenças inflamatórias imunes.

Adicionalmente, mediante utilização de L de Bst2,pode ser estabelecido um ensaio de ligação direta ou umensaio de competição de ligação para triagem de variante de"decoy" de Bst2-(Fc) ou moduladores de pequenas moléculasde Bst2. Estes ensaios permitem que os inventores realizemtriagem de variantes de "decoy" de Bst2 ou moduladores demoléculas pequenas de Bst2 para inibição ou aumento dainteração Bst2-L de Bst2.

Anticorpo Anti-L de Bst2

Se a administração de L de Bst2 (L de Dampl murino)aumenta as respostas inflamatórias imunes, será lógicogerar anti-L de Bst2 para tratamento de diversas doençasinflamatórias imunes. É igualmente contemplada a terapia decombinação de anticorpo anti-Bst2 e anticorpo anti-L deBst2.

Anticorpo Anti—Bst2

Os anticorpos de IgG convencionais são bivalentescom capacidade para se ligarem a dois antigenos. Estacapacidade aumenta significativamente sua afinidadefuncional e confere um elevado tempo de retenção em muitosantigenos e receptores de superfície celular. Os anticorposa-nti-Bst2 podem ser anticorpos antagonistas ou agonistas,que inibem ou aumentam respostas inflamatórias imunes,respectivamente. Tanto anticorpos anti-Bst2 antagonistasquanto agonistas podem ser obtidos nos seguintes exemplosde muitos formatos diferentes de anticorpos anti-Bst2.

1. Os anticorpos anti-Bst2 da invenção podem seranticorpos monoclonais humanizados ou anticorposmonoclonais humanos. Um mAb murino inteiramente antigênicotorna-se compatível com seres humanos quando pequenaspartes dos anticorpos murinos são enxertadas em moléculasde ímunoglobulina humana criando alternativamenteanticorpos quiméricos em que somente a parte Fc da moléculade ímunoglobulina é humana, ou anticorpos humanizados emque somente as regiões determinantes de complementaridade(vvComplementarity Determining Regions" - C DR) da

Imunoglobulina são murinas e 90 até 95% da molécula éhumana. Em um aspecto, podem ser gerados anticorposmonoclonais totalmente humanos em camundongos transgênicosmediante emprego de métodos convencionais tais como astecnologias HuMAb-Mouse (GenPharm-Medarex) ou XenoMouse(Abgenix, Inc.) os anticorpos humanizados incluemimunoglobulinas humanas nas quais resíduos de uma CDR dorecipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de umaespécie não humana tal como camundongo, rato ou coelhopossuindo a especificidade, afinidade e função biológicadesejadas.

Podem igualmente ser produzidos anticorpos humanosmediante utilização de técnicas tais como bibliotecas deexibição de fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 1991,227:381, Marks e outros, J. Mol. Biol. 1991, 222:581). Sãobem conhecidos métodos para humanização de anticorpos nãohumanos. A humanização pode ser realizada de acordo com ométodo de Winter e outros, conforme divulgado em Jones eoutros, Nature, 1986,, 321:522; Riechmann e outros, Nature.,1988, 332:323; e Verhoeyen e outros, Science, 1988,239:1534 mediante substituição de seqüências de CDR deroedores ou CDRs para as seqüências correspondentes de umanticorpo humano. Esses anticorpos humanizados sãoanticorpos quiméricos (patente norte-americana n° US4.816.567). Tipicamente, os anticorpos humanizados sãoanticorpos em que os resíduos de CDR são substituídos porresíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

2. Os anticorpos anti—Bst2 da invenção podem serNanocorpos. Os anticorpos de cadeia pesada que funcionamsem cadeias leves ocorrem naturalmente em tubarões "nursesharks", "wobbegong sharks" e Camelidae (Greenberg AS. eoutros, 1995, Nature 374:168; Nuttall SD. e outros, Mol.Immunol. 2001, 38 :313; Hamers-Casterman C. e outros, 1993.,Nature 363:446). Seu sitio de ligação de antígenos éreduzido a um único domínio, o domínio VhH.. Devido ao fatode o domínio variável dos anticorpos de cadeia pesada ser omenor fragmento de ligação de antígenos totalmentefuncional com uma massa molecular de apenas 15 kDa, estaentidade é designada como um Nanocorpo.

O Nanocorpo pode vir a constituir uma nova classede anticorpos terapêuticos. Os Nanocorpos possuempropriedades superiores em comparação com anticorposclássicos na medida era gue são muito pequenos, muitoestáveis, fáceis de produzir em grandes quantidades efáceis de reformatar para proteínas multivalentes oumultiespecíficas. Os Nanocorpos podem ser administrados pormeios não injetáveis. Desta forma, os Nanocorposproporcionam a afinidade de ligação e especificidade dosanticorpos, com o pequeno tamanho, a estabilidade e aspropriedades farmacocinéticas de moléculas pequenas.

As reduzidas dimensões dos Nanocorpos tornam osmesmos particularmente adequados para estabelecerem comoalvos antígenos em locais obstruídos tais como tumores emque a penetração é crítica, ou em regiões que sãoinacessíveis para anticorpos convencionais, os Nanocorposanti-Bst2 podem ser úteis para imunoensaios diagnósticos invitro e aplicações de formação de imagens in vivo. OsNanocorpos anti-Bst2 podem cruzar a barreira hematocerebrale podem assim fornecer o Nanocorpo terapêutico para océrebro.

O Nanocorpo anti-Bst2 pode ser obtido medianteutilização de uma técnica de exibição de fagos. Abiblioteca de Nanocorpos é construída do dromedárioimunizado conforme descrito (Conrath KE. e outros,Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45:2807). A bibliotecade exibição de fagos é então utilizada para "panning" emBst2 humana revestida sobre placas de microtitulação. Aseleção de clones enriquecidos é realizada com ELISA, e osclones são seqüenciados. As proteínas são purificadas declones positivos.

3. Os anticorpos anti-Bst2 da invenção podem seranticorpos bi-específicos. Os anticorpos bi-específicos sãoanticorpos monoclonais, preferencialmente anticorposhumanos ou humanizados que possuem especificidades de duplaatribuição de alvo. os anticorpos bi-específicos sãoderivados da recombinação de domínios variáveis de doisanticorpos com diferentes especificidades; os anticorposbi-específicos são portanto capazes de ligar ambos osantígenos de seus anticorpos parentais. No caso de anti-Bst2, uma das especif icidades de ligação poderia ser paraBst2 e a outra poderia ser para L de Bst2, ou qualqueroutra proteína de superfície celular, por exemplo,receptores em células T ou outras proteínas inflamatóriasna superfície das mesmas células que expressam Bst2 emcondições inflamatórias ou autoimunes.. Estes anticorposanti-Bst2 bi-específicos podem funcionar como anticorposantagonistas ou agonistas.

Os métodos para obtenção de anticorpos bi-específicos são bem conhecidos (Traunecker e outros, EMBOJ, 1991, 10:3655; WO 93/08829; Suresh e outros, Methods i.nEnzmology [Métodos em Enzimologia], 1986, 121:210; Milsteine Cuello, 1983, Nature, 305:537). Resumidamente, domíniosvariáveis de anticorpos com as específicidades de ligaçãodesejadas são fundidos com um domínio constante deimunoglobulina. Esta fusão contém um domínio constante decadeia pesada de imunoglobulina (parte das regiões CH2 eCH3 de articulação) e contém preferencialmente a primeiraregião constante de cadeia pesada (CHI). Os DNAs quecodificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e acadeia leve de imunoglobulina são inseridos em vetores deexpressão separados e são co-transfectados.

4. Os anticorpos anti-Bst2 da invenção podemconsistir em um anticorpo de fragmento variável de cadeiaúnica ("single-chain Variable Fragment" - scFV). Algumasabordagens recombinantes levaram ao desenvolvimento de umanticorpo de fragmento variável de cadeia única (scFv). UmscFv monomérico tem urna massa molecular de apenas cerca de30 kDa, que é expressada em uma variedade de sistemas comoura único par VL-VH interligado por um elemento deinterligação sintético rico em Gli/Ser (Berezov A. eoutros, 2001, J Med Chern 44:2565). Quando expressado embactérias ou células eucarióticas, o scFv dobra-se("folds") para uma conformação semelhante à da regiãocorrespondente do anticorpo parental. Foi observado quemantém uma afinidade comparável à de um Fab (Kortt eoutros, 1:994, Eur J Biochem 221:151). Os scFvs sãopassíveis de diversas modificações genéticas tais comohumanização e produção de proteínas de fusão para aumentode seu potencial como agentes terapêuticos. Por exemplo,foi observado que o Pexelizumab, um scFv humanizado que seliga ao componente C5 de complemento, reduz infartos domiocárdio durante cirurgia de enxerto de "bypass" daartéria coronária (Varrier e outros, 2004, JAMA 291:2319).

ScFvs de especificidade diferente podem igualmenteser interligados uns aos outros para produzirem anticorposbi-específicos que ligam dois receptores diferentes em umaúnica célula ou em células diferentes. No caso de anti-Bst2, poderiam ser moléculas semelhantes a anticorpos bi-específicos com um scFv anti-Bst2 ou scFv anti-L de Bst2,ou com scFv anti-Bst2 de quaisquer outras proteínas desuperfície celular, por exemplo, receptores em células T ououtras proteínas inflamatórias na superfície das mesmascélulas que expressam Bst:2 em condições inf lamatórias ouautoimunes.O método de exibição de fagos pode ser utilizadopara produção de scFv anti-Bst2. Neste método, grandesrepertórios de cDNAs da região variável de anticorpo sãocolhidos das células B e combinações de VHs e VLs sãoexpressadas na forma de scFvs sobre a superfície debacteriófagos filamentosos. Os fagos que expressam scFvsdevem ser obtidos por "panning" de placas revestidas comantigenos. A afinidade do scFv anti-Bst2 pode seraperfeiçoada mediante mutação das CDRs do constructo comsubseqüente repetição do procedimento de "panning".

5. Os anticorpos anti-Bst2 da invenção podem seranticorpos Fab, anticorpos bi-específicos Fab2, anticorpostri-específicos Fab3, minicorpos bivalentes, tricorpostrivalentes, ou tetracorpos tetravalentes.

6. Os anticorpos anti-Bst2 da invenção podem seranticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais sãopreparados mediante utilização de métodos de hibridoma,tais como aqueles descritos por Kohler e Milstein (Nature,1975, 256:495). Um camundongo, rato, hamster ou outroanimal hospedeiro é imunizado com um agente imunizante parageração de linfócitos que produzem anticorpos comespecificidade de ligação ao antígeno imunizante. em umaabordagem alternativa, os linfócitos podem ser imunizadosin viüro.

Anticorpo Monoclonal para Bst2

O uso de terapia imune tornou-se recentementepopular em casos em que foi determinado o alvo protéico deuma doença. O direcionamento altamente especifico a alvosdos anticorpos terapêuticos produz como resultado umavirtual ausência de efeitos colaterais, mesmo em dosagensrelativamente elevadas. Isto também utiliza a estabilidadesérica naturalmente inerente dos anticorpos, proporcionandoa base para uma molécula terapêutica de longa atividade.

A terapia de anticorpos situa-se geralmente em umade duas categorias que não são mutuamente exclusivas. Aprimeira categoria é dependente da região variável (partede reconhecimento de proteína alvo) do anticorpo. 0 epitopoespecifico reconhecido pelo anticorpo permitirá que oanticorpo iniba a ligação da proteína alvo a outrasproteínas (efeito inibidor ou antagonista) interferindo cominterações célula-célula ou cancelando a transdução desinais através da proteína alvo., ou gerando um sinalartificial como resultado de sua ligação com a proteínaalvo na ausência de uma proteína secundária requerida(ativação ou efeito agonista) como no caso da sinalizaçãode receptor dependente de dimerização ou mimetização deligante dependente de receptor. A segunda categoria dependeda região constante (parte Fc) do anticorpo, que determinaque, caso existam,, as funções de efetor imune serãoativadas como resultado da ligação da parte Fc ao anticorpocom seu receptor Fc cognato presente nas células efetorasimunes. A presença de uma proteína alvo específica nasuperfície de uma célula alvo estabelece essa célula comoalvo para destruição por uma função efetora.

Mediante desenvolvimento de um anticorpo que éaltamente específico para Bst2, os presentes inventorespuderam criar um anticorpo terapêutico que compartilhamuitas das características da molécula de "decoy" de Bst2rno fato de ser capaz de interferir na adesão célula-célulae atuar como proteína terapêutica na inibição de respostainflamatória específica de doença.

Em certos casos que se encontram associados aosmecanismos patogênicos do sistema imune mucosal, osanticorpos podem ser administrados por via oral ou por vianasal. O sistema imune mucosal é ímpar, na medida em queuma tolerância é preferencialmente induzida após aexposição a um antígeno, e a indução de células Tregulatórias constitui um mecanismo principal de tolerânciaoral. O anticorpo administrado oralmente pode serrapidamente absorvido pelo tecido linfóide associado aointestino ("Gut-Associated Lymphoid Tissue" - GALT), ondeexerce seus efeitos imunológicos. A administração oral deanticorpo pode sinalizar as células T no intestino de umaforma que fornece um sinal fraco porém eficaz para aumentara função regulatória das células Τ. A administração oral deanticorpo específico para CD3 foi demonstrada em um modelode encefalite autoimune experimental ("ExperimentalAutoimmune Encephalitis" - EAE). Estes estudos demonstraramque a parte Fc do anticorpo específico para CD3 não eranecessária. Um fragmento F(ab')2 de anticorpo específicopara CD3 administrado oralmente proporcionou supressão deEAE.

Engenharia de Anticorpos

1. Engenharia de anticorpos

Quando os anticorpos anti-Bst2 terapêuticos seencontram disponíveis, a etapa seguinte consiste naengenharia dos domínios de ligação de anticorpos(estabilidade, maturação de afinidade.) e alteração dasfunções efetoras (citotoxicidade celular dependente deanticorpos ("Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity" -ADCC), citotoxicidade celular dependente de componente("CompIement-Dependent cellular Cytotoxicity" - CDC) , etaxa de depuração ("clearance rate")). Uma outra forma deaumentar a potência de anticorpos anti-Bst2 consiste nabusca de conjugado anticorpo-toxina, anticorpo bi-específico e/ou na exploração de polimorfismo de FcR(receptor de Fc).

Os anticorpos anti-Bst2 bloqueiam a interação entreBst2 e L de Bst2 após ligação à Bst2 destinada às célulasresultando na intervenção de um sinal celular. Paraengenharia de anticorpos, é importante caracterizar osanticorpos anti-Bst2 se os mesmos realizarem interligaçãocruzada para elicitarem um sinal intracelular paraapoptose, fornecerem toxinas para uma célula apósinternalização, ou utilizarem funções efetoras para matarcélulas. Todos estes parâmetros de anti-Bst2 podem serimportantes em tratamento de condiçõesautoimunes/inflamatórias.

1-1. Aperfeiçoamento de anticorpos anti-Bst'2 medianteengenharia dos domínios de ligação de antígenos

1-1-1- Fragmento F(ab) de anti-Bst2

Os fragmentos F(ab) de anti-Bst2 podem serutilizados quando é requerida urna rápida depuração ou umame ia-vida curta tal como no caso de ReoPro (Centocor).

Devido a seu menor tamanho, os fragmentos F(ab) podempenetrar melhor em tecidos sólidos. Os fragmentos F(ab)podem ser feitos em E. coli ao invés de células demamíferos. A interligação cruzada de Bst2 por anticorposanti-Bst2 bivalentes de extensão plena pode causar apopto.sedas células alvo. Dependendo das doenças a serem tratadas,essa apoptose pode ser alternativamente vantajosa oudesvantajosa. O uso de um F(ab) pode ser benéfico se ainterligação cruzada de .Bst2 por um anticorpo anti-Bst2 deextensão plena for desvantajoso.

1-1-2.. Maturação de afinidade

A hipermutação somática de genes de imunoglobulinaé crítica na geração de anticorpos de alta afinidade invivo mas ocorre somente após imunização. Desta forma, embibliotecas de exibição de fagos de doadores não imunizadossão raramente encontrados anticorpos de alta afinidade. Amaturação de afinidade in vitro é freqüentemente necessáriapara aperfeiçoar os anticorpos dessas bibliotecas.Independentemente de o anticorpo anti-Bst2 ser ou nãoderivado de uma biblioteca de fagos, hibridoma ou outrastecnologias, a afinidade de anticorpo pode requereraperfeiçoamento.. A afinidade pode . não somente serimportante para um bloqueio eficiente da interação Bst2-Lde Bst2, mas também para redução de dosagem e maioreconomia de custo.

Relativamente à afinidade de anticorpos,entretanto, pode nem sempre ocorrer que os anticorpos anti-Bst2 com maior capacidade de ligação constituam a melhorseleção. Um anticorpo pode ligar-se fortemente a Bst2 porémabranger somente uma parte do sitio de ligação de L de Bst2em Bst2, ao passo que um outro anticorpo pode ligar-se aBst2 mais fracamente porém pode abranger corretamente ositio de ligação de L de Bst2.. Esta última pode constituira melhor escolha, em estudos realizados por Adams e outrosutilizando anticorpos anti-Her2 (Câncer Res. 61: 4750,2001), o anticorpo com maior afinidade não apresentava umapenetração ideal em um tecido sólido/tumor. Fragmentos descFv de alta afinidade foram retidos na periferia do tumor,ao passo que os anticorpos de média afinidade penetraramtotalmente o tumor. Dependendo das doenças a seremtratadas, uma penetração insuficiente nos tecidos podeconstituir uma preocupação potencial relativamente àmaturação de afinidade de anticorpos anti-Bst2.

1-1-2-1. Método gerais para maturação de afinidade

Em maturação de afinidade (Levin e Weiss, Mol.BioSyst. 2 :49, 2006), resíduos nas CDRs são variados comutilização de mutagênese, e os anticorpos mutadosresultantes são submetidos a triagem quanto acaracterísticas aperfeiçoadas de ligação e eficácia, forampublicados diversos métodos de maturação de afinidade.Estes métodos incluem maturação de afinidade via fagos(Gram e outros, PNAS 89:3576, 1992; Lowman e outros, J.Mol. Biol., 1993, 234, 564), exibição de ribossomas(Lipovsek e outros, J. Immunol. Methods 290 (2004), pp. 51-67) , exibição de superfície de fermento (Graff e outrosProtein Eng. Des. ;Sel. 17 (2004)., pp. 293-304), PCR comtendência de erro (Schlapschy e outros, Protein Eng. Des.Sei. 17 (2004), pp. 847-860), cepas bacterianas mutadoras(Low e outros, J. Mol. Biol. 260:359, 1996), mutagênesefocalizada em etapas (Wu e outros, PNAS 95:6037, 1998) emutagênese de saturação (Nishimiya e outros, J. Biol. Chem.275:12813, 2000; Yang e outros, J. Mol. Biol. 254:392,1995; Chowdhury e Pastan Nat. Biotechnol. 17 :568 , 1999).Outras técnicas utilizam freqüentemente mutagênese dirigidaa sítio ou varredura de alanina para geração de coleçõeslimitadas de variantes específicas.

1-1-2-2. Afinidade de maturação via método demutagênese "Look-Through" PLook-Through Mutagenesis" -LTM)

Recentemente, Rajpal e outros (Bioren, San Carlos,CA) desenvolveram a tecnologia de mutagênese "Look-Through"(" Look-ThrougTi Mutagenesis" - LTM) para otimização deanticorpos utilizando o sistema de exibição de fermento. ALTM pode ser igualmente útil para triagem de variante dealta afinidade de "decoy" de Bst2 (ou "decoy" de Bst2-Fc).Encontra-se ilustrada abaixo uma breve descrição do métodode acordo com Rajpal e outros para maturação de afinidadede anticorpos anti-Bst2.

A LTM é um método de mutagênese multidimensionalque permite uma única mutação de aminoácido em todas asposições para cada CDR para rápida intensificação deafinidade. Na LTM, as posições alvo são substituídasalternativamente com um resíduo de tipo natural ou um denove aminoácidos representando as características químicasprincipais de cadeia lateral - pequena (A) , nucleofílica(S, Η), hidrofóbica (L, P), aromática (Y), ácida (D), amida(Q) , ou básica (K) . A LTM gera uma série de mutaçõesindividuais dentro de uma CDR em que cada resíduo de tiponatural é substituído por um de nove aminoácidosselecionados.

Em primeiro lugar, o constructo de scFv anti-Bst2 éconstruído por PCR de sobreposição utilizando códonsotimizados tanto para S. cerevisiae quanto para E. coli, esubclonado para vetor de exibição de fermento. Esteconstructo original serve como gabarito para subseqüentesbibliotecas de LTM anti-Bst2. Para construção debibliotecas de LTM .anti-Bst.2, os oligonucleotideos de CDRindividuais são sintetizados para codificarem uma CDRmutagenizada com uma substituição de aminoácido alvo paracada posição de CDR. PCRs contendo misturas deoligonucleotideos de LTM são utilizados para amplificaçãode fragmentos de CDR substituídos por LTM. Na biblioteca deCDR tripla, os oligonucleotideos para CDRl, CDR2 e CDR3 sãocombinados para produção de biblioteca com três CDRsmutagenizadas (tanto para domínios VH quanto para domíniosVL). As correspondentes bibliotecas de anticorpos são entãoexibidas na superfície celular do fermento.

Após seleção positiva, os clones que produzem comoresultado uma maior afinidade de ligação a Bst2 sãoseqüenciados, e essas mutações benéficas são mapeadas. Paraidentificação de mutações sinérgicas para aperfeiçoamentode ligação, são geradas bibliotecas de mutaçõescombinatórias benéficas por sondas de DNA degeneradomisturadas. Oligonucleotideos degenerados codificando asmutações de aminoácidos selecionadas e o aminoácido de tiponatural são sintetizados e montados para produção destasbibliotecas. Para seleção positiva de clones, a Bst2 (ou"decoy" de Bst2) é biotinilada. As células são incubadascom Bst2 biotinilada e são ligadas a contas deEstreptavidina. É utilizada uma estratégia de "pulse-chase"para marcar as células de fermento com Bst 2 biotinilada (ou"decoy" de Bst2) e marcar subseqüentemente com Bst2 (ou"decoy" de Bst2) não marcada, para selecionar clones queapresentam maior capacidade de ligação a Bst2 (ou "decoy"de Bst2) biotinilada. Estes clones podem ser diferenciadospor FACS. Após várias rodadas de seleções, podem serobtidas mutações que conferem uma maiòr afinidade. Todos osscFvs são então sub-clonados para vetores de expressão esecretados para o E. coli. As afinidades de ligação dosanticorpos scFv são medidas com utilização de um sistema deressonância de plásmon de superfície BIAcore (BIAcore,Suíça).

1-1-3. Anticorpos de alta afinidade sem maturaçãode afinidade

Hoet e outros, da empresa Dyax, montarambibliotecas de F(ab) humano com uma combinação de CDR3 decadeia pesada de ocorrência natural e seqüências de cadeialeve obtidas de doadores humanos, e diversidade sintéticaem sítios de contato de antígenos em formas pesadas de CDRle CDR2. Os F(ab)s selecionados para ligação a quatro alvosde drogas humanos utilizando a biblioteca de F(ab) da Dynaxdemonstraram maiores afinidades que anticorpos terapêuticosaprovados (Hoet e outros, Nature Biotechnol. 23:344, 2005).Essas bibliotecas de F(ab) podem constituir um meioeficiente para geração de anticorpos anti-Bst2 de altaafinidade, contornando a necessidade de maturação deafinidade.

1-1-4, Eliminação da glicosilação ligada a Asn nodomínio variável

A glicosilação ligada a Asn no domínio variável deanticorpo pode afetar a ligação de antígeno (Leibiger eoutros, Biochem J. 338:529, 1999). Se a glicosilação ligadaa Asn for observada no domínio variável dos anticorposa-nti-Bst.2 e o carboidrato não for requerido para ligação ouatividade biológica dos anticorpos, a Asn na regiãovariável poderá ser removida mediante alteração da Asn paraAla, Gln ou outros aminoácidos.

Foi relatado que uma seqüência Asn-Gly ou Asp-Glyna CDR sofreu isomerização espontânea formando ácidoisoaspártico -(Cacia e outros, Biochemistry 35:1897, 1996).

A formação de isoaspartato pode debilitar ou anular aligação do anticorpo. Se as CDRs nos anticorpos anti-Bst2contiverem estas seqüências, a substituição da Asn ou Asppor Ala, Gln ou Glu poderá ser benéfica. É possíveldeterminar se estas substituições são capazes de manter aligação e eficácia do anticorpo.

A presença de metionina em uma CDR pode também serproblemática se a metionina for oxidada e isto interferirna ligação. Se isto ocorrer com os anticorpos anti-Bst.2,poderá ser investigada a substituição da metionina poroutros aminoácidos..

1-1-5. Aumento de estabilidade de anti-Bst2 atravésde mutagênese dos domínios de ligação de antígeno

A estabilidade de anti-Bst2 pode ser obtidamediante alteração de resíduos específicos que influenciamestabilidade, enxerto das CDRs de um scFv em uma estruturamais estável conforme foi demonstrado por Angal e outros(Mol. Immunol. 30:105, 1993), ou alteração da interface VH-VL via introdução de ligações de dissulfito conforme foidemonstrado por Schuurman e outros (Mol. Immunol. 38:1,2001).

1-2. Aperfeiçoamento de anticorpos anti-Bst2através de engenharia de Fc

Diferentemente de drogas de baixo peso molecular,que precisam ser capazes tanto de ligar um alvo quanto deafetar sua função, os anticorpos terapêuticos podem ligarum alvo e orientar o sistema imune a atacar o mesmo atravésde funções efetoras: citotoxicidade celular dependente deanticorpos (xxAntibody-Dependent Cellular Cytotoxicity" -ADCC), citotoxicidade dependente de complemento(xvComplement-Dependent Cytotoxicity" - CDC) e fagocitose.Entretanto, os anticorpos monoclonais que funcionambloqueando uma interação ligante-receptor, o que pode ser ocaso dos anticorpos anti-Bst2, podem funcionar semutilização de mecanismos efetores (Agus e outros, J. Clin.Oncol. 23 (2005), pp. 2534-2543; Wang e outros,Angiogenes i s 7 (2004), pp. 33 5-3 45).

Não obstante, urna função efetora intensificadapoderia ser benéfica na ação dos anticorpos anti-Bst2. Porexemplo, todas as terapias com anticorpos monoclonaisorientados para CD20 produzem como resultado um esgotamentotemporário de células B para o tratamento de distúrbiosinflamatórios autoimunes, particularmente de artritereumatóide, devido às funções efetoras. É igualmenteconhecido que Infliximab (anti-TNF alfa) produz igualmentecomo resultado CDC e ADCC após ligação a TNF alfa in vivo(Scallon e outros, Cytokine, 1995).

Para anticorpos anti-Bst2, é importante decidir sea ativação de ADCC, CDC e/ou a subseqüente destruição dacélula alvo são benéficas ou prejudiciais para o tratamentode doenças. Uma forma de avaliar o efeito de ADCC e CDC nasfunções terapêuticas de anti-Bst2 consiste em testar aeficácia de anticorpos anti-Bst2 em camundongos "knock-out" FcyR.

1-2-1. Uso de Bst2 "knock-in" FcyR "knock-out"(duplos mutantes) para determinar se as funções efetorassão vantajosas ou desvantaj osas.

A ADCC e a fagocitose são mediadas por interaçãocom um conjunto de receptores gama Fc (FcyR) intimamenteassociados com atividades tanto ativadoras quantoinibitórias; a CDC através de interação com proteínas nosistema de complemento (por ex. Clq, C3, C4, etc.); e taxade depuração ("clearance")/meia-vida através de ligação deanticorpos ao receptor de Fc neonatal (FcRn). O papel deFcyR (e potencialmente da ADCC) no mecanismo de ação deanticorpos anti-Bst2 pode ser investigado medianteutilização de camundongos com deficiência da cadeia gamacomum (FcyR -/-) (Takai e outros, Cell 7 6:519, 1994),desprovidos dos receptores de Fc de ativação FcyRI eFcyRIII, e camundongos deficientes em FcyRIIB (Takai eoutros, Nature 379:346, 1996).

Seriam utilizados camundongos Bst2 "knock-in"cruzados com FcyR "knock-out". Quando é gerado "knock-in"de Bst2 em camundongos C57B1/6, por exemplo, uma cepadeficiente em FcyR é cruzada para C57B1/6 e submetida acruzamento reverso para estabelecimento de uma cepaisogênica. Esta cepa isogênica é então cruzada comcamundongos "knock-in" de Bst2 para geração de camundongosFcyR-/-/Bst2/Bst2 e FcyRIIB-/-/Bst2/Bst2. Estes camundongosduplos-mutantes são submetidos a tratamentos induziveis dedoenças. Os camundongos são então tratados com anticorposanti-Bst2.

1-2-2. Aperfeiçoamento de atividade anti-Bst2mediante intensificação de funções efetoras e/ouestabilidade

Se os anticorpos anti-Bst2 utilizam ADCC para açãoterapêutica, a engenharia do Fc de IgG para aperfeiçoamentoda função efetora (mediante aperfeiçoamento de ligação aFcyR e/ou complemento) poderia constituir umaperfeiçoamento valioso para o anticorpo terapêutico. Foiobtido um aperfeiçoamento de ligação por mutação deresíduos no Fc (Shields e outros, J. Biol. Chem. 276:6591,2001), remoção da fração de fucose do carboidratoconservado no Fc (Shields e outros, J. Biol. Chem.277:2 6733, 2002; Shinkawa e outros, J. Biol. Chem.276:3466, 2003) e Fc múltiplo (Scallon e outros, Mol.Immunol. 41:73, 2004) .

1-2-2-1. Via alterações de aminoácidos no Fe

Foi demonstrado que a alteração de resíduos deaminoácidos na IgG humana intensifica a ligação de FcyR efunção efetora. Uma parte significativa desse trabalhoconcentrou-se na região de articulação (resíduos 216-230) ena região de articulação inferior (resíduos 231-236). Nosúltimos anos, foi publicado um mapa abrangente do sítio deligação em IgGl humana para receptores humanos FcRI,FcRIIA, FcRIIB, FcRIIIA, e FcRn (Shields e outros, J. Biol.Chem. 276:6591, 2001 e referências contidas no mesmo).Neste estudo, variantes selecionadas de IgGl com ligaçãoaperfeiçoada a FcRIIIA apresentaram uma intensificaçãosignificativa de ADCC. Foi igualmente relatado que pode serpossível aperfeiçoar a ligação de Clq mediante alteração deresíduos de IgGl específicos (Idusogie e outros, J.Immunol. 166 (2001), pp. 2571-2575).

O receptor de Fc neonatal (FcRn) desempenha umpapel na taxa de depuração ("clearance") de anticorposmonoclonais terapêuticos (Lencer e Blumberg, Trends CellBiol. 15 (2005) , pp. 5-9) . Em contraste com os FcyRs quesão membros da superfamília da imunoglobulina, o FcRn éestruturalmente associado à classe I de MHC, compreendendouma cadeia γ que se associa não-covalentemente com a2-microglobulina (Martin e outros, Mol. Cell 7 (2001), pp.867-877).

As informações geradas por Shields e outros seriamúteis para construção de variantes de anti-Bst2 com ligaçãoaperfeiçoada a FcyR para intensificação de funçõesefetoras. Um aumento da meia-vida de anti-Bst2 pode serobtido mediante alteração de sua afinidade para FcRn.

1-2-2-2. Desfucosilação de anticorpos anti-Bst2para aperfeiçoamento de função efetora

Uma outra forma de aperfeiçoar as funções efetorasde anticorpos anti-Bst2 pode ser realizada mediantealteração de glicosilação (fucosilação ou sialilação) naAsn297 no domínio Fc.

A glicosilação de IgG é essencial para ligação detodos os receptores Fc gama (Jefferis e Lund, Immunol.Lett. 82:57, 2002). Na IgG humana, o carboidrato ligado aAsn2 97 é encontrado no domínio Fe. Este completocarboidrato é composto de oligossacarídeo de núcleo quecontém GlcNAc (N-acetilglicosamina) e manose. 0 núcleocontém igualmente diversos monossacarídeos adicionaisacoplados tais como galactose, fucose, GlcNAc, e/ougalactose-ácido siálico em uma ou ambas N-acetilglicosaminas terminais. Foram detectados mais de 30diferentes glicans acoplados covalentemente neste únicositio de glicosilação (Routier e outros, J. Immunol.Methods 213:113, 1998).

Foi demonstrado que a presença ou ausência dafração de fucose desempenha um papel significativo naligação a FcyR. Os anticorpos monoclonais desfucosiladosapresentaram um aumento significativo de ligação a FcyR eapresentaram aumento de ADCC in vitro (Shields e outros, J.Biol. Chem. 277 (2002), pp. 26733-26740; Shinkawae outros,J. Biol. Chem. 276 (2003), pp. 3466-3473; Nimmerjahn eRavetch, Science 310:1510, 2005; Niwa e outros, Câncer Res.64 (2004), pp. 2127-2133).

Subseqüentemente foi estabelecida por engenhariauma linhagem de células de ovário de hamster Chinês em quea-1,6-fucosiltransferase foi submetida a "knock-out"(Yamane-Ohnuki e outros, Biotechnol. Bioeng. 67 (2004), pp.614-622) . As empresas GlyArt (Zurique, Suíça) e BioWa(Princeton, NJ, E.U.A.) desenvolveram tecnologia deengenharia de linhagens celulares para produção deanticorpos com fucosilação reduzida. Os anticorposproduzidos com esta linhagem celular tinham falta de fucosee os anticorpos desfucosilados apresentaram intensificaçãode ADCC in vitro (Niwa e outros. Câncer Res 64:2127, 2004).

1-2-2-3. Alteração de sialilação de Fc emanticorpos anti-Bst2 para intensificação de função efetoraOs receptores Fc detectam a presença em IgG tantode resíduos de ácido siálico quanto de fucose. Estudosrecentes demonstraram que ácidos siálicos Fc no sitio deAsn2 97 são críticos para determinação da interação dereceptores Fc e IgG para atividade de anticorpos (Kaneko eoutros, Science 313:670, 2006.) suportando adicionalmente umpapel de glicosilação em resposta imune. A sialilação doglican ligado a Asn297 de IgG produziu como resultado umaredução de afinidades de ligação aosFcyRs e redução decitotoxicidade in vivo.

A alteração de sialilação em anticorpos anti-Bst2pode ser benéfica para aperfeiçoar a potência de anticorposanti-Bst2. A influência de ácidos siálicos na atividadeanti-Bst2 pode ser investigada mediante realização deanálise de ligação de ressonância de plásmon superficial(análise BIAcore) com anticorpos anti-Bst2 asialiladostratados com neuraminidase e os anticorpos anti-Bst2contendo ácido siálico. Anticorpos anti-Bst'2 enriquecidosem teor de ácido siálico podem ser passíveis de obtençãopor cromatografia de afinidade de lectina. Em primeirolugar deve ser comparada a afinidade de ligação deanticorpos anti-Bst2 contendo ácido siálico e asialilados aFcyRs ativadores e inibidores. Estes anticorpos podemapresentar diferenças de afinidade de ligação aos FcyRs,sem apresentarem diferenças de afinidade de ligação paraBst2. A eficácia in vivo de anticorpos anti-Bst2asialilados (tratados com neuraminidase) é então testadautilizando modelos animais e comparada à dos anticorposanti-Bst2 sialilados ou anticorpos anti-Bst2 normais nãotratados. Devido ao fato de as seqüências deoligossacarideos de IgG serem determinadas pelo nivel deglicosiltransferases ou glicosidases, a alteração desialilação em anticorpos anti-Bst2 pode ser obtida porengenharia celular.

1-2-2-4 Acoplamento de variantes de Fc da empresaXencor a F(ab) anti-Bst2

O acoplamento de novas variantes de Fc tais como asda empresa Xencor a F(ab) anti-Bst2 pode aumentar apotência anti-Bst2.

Lazar e outros, da empresa Xencor (Monrovia, CA,E.U.A.) utilizaram uma combinação de algoritmos decomputador e triagem de proteínas de alto rendimento paraalterarem aminoácidos na região Fe, alternativamenteaumentando ou reduzindo a resposta pelo sistema imune(Lazar e outros, PNAS 103:4005, 2006). A empresa Xencorproduziu por engenharia uma série de variantes de Fc comotimização de afinidade a FcyR e especificidade. Quando onovo Fc da Xencor foi acoplado às drogas Trastuzumab(Herceptina; Genentech, :S. San Francisco, CA, E.U.A.) eRituximab (Rituxan; Genentech), ela aumentou a potência dosanticorpos em cerca de 500 vezes era um ensaio in vitro; adroga Rituximab alterada foi igualmente mais potente em ummodelo símio.

1-2-3. Aperfeiçoamento de atividade anti-Bst2mediante eliminação de funções efetoras

Em casos diferentes, dependendo das doenças a seremtratadas, as funções efetoras de anticorpos anti-Bst2 podemser desnecessárias ou até mesmo prejudiciais. Por exemplo,anti-CD3 (Xu, M.L. e outros, Cell. Immunol. 200 (2000), pp.16-2 6; Carpenter e outros, J. Immunol. 165 (2000), pp.6205-6213; Bolt e outros, Eur. J. Immunol. 23 (1993), pp.403-411) e anti-CD4 (Newman e outros, Clin. Immunol. 98(2001), pp. 164-174) orientados para alvos de células Tapresentaram efeitos colaterais prejudiciais devido àligação dos anticorpos monoclonais a células portadoras deFcyRy causando esgotamento ou ativação de células T. Nocaso de anti-CD3, variantes obtidas por engenharia comligação reduzida para FcyR aliviaram o problema (Herold eoutros, Diabetes 54 (2005), pp. 1763-1769; Carpenter eoutros, Biol. BloodMarrowTransplant. 11 (2005), pp. 465-471).

1-2-3-1. Uso de IgG4 ou IgG2 para anti-Bst2

Quando as funções efetoras de ant.i-Bst2 não sãogarantidas, é possível utilizar alternativamente IgG2 ouIgG-4 humana, visto que estas duas sub-classes sãoineficientes para ou desprovida de fixação de complemento(Presta LG, J Allergy Clin Immunol. 2005, 116(4):731).Devido ao fato de ter sido relatada constantemente ausênciade ativação de complemento por IgG4, em vista da escolhaentre a utilização de IgG2 ou IgG4, considera-se que a IgG4é a melhor escolha. Entretanto, anticorpos de uma sub-classe especifica podem não ser equivalentes em termos deeficácia de sua função efetora (Chan e outros, Mol.Immunol. 41 (2004), pp. 527-538).

1-2-3-2. Remoção de glicosilação associada a Asn297dos anticorpos anti-Bst2

A ausência do carboidrato acoplado a Asn297 do Fcfoi relatada como resultando em redução de funções efetorasem alguns casos (Leatherbarrow e outros, Mol. Immunol. 22(1985), pp. 407-415). Adicionalmente, um relatório recentesobre um ensaio clinico de fase II de anti-CD3 aglicosilado(Keymeulen e outros, N. Engl. J. Med. 352 (2005), pp. 2598-2608) em diabetes tipo 1 apresentou dados promissores.

1-2-3-3. Mutagênese de resíduos no Fc de anti-Bst2para redução de ligação a FcR

Utilizando o mapa abrangente do sitio de ligação emIgGl humana divulgado por Shields e outros (Shields eoutros, J. Biol. Chern.. 276:6591, 2001 e referênciascitadas), poderá ser possível construir variantes anti-Bst2com redução de ligação a FcyR ou FcRM.

1-2-3-4. Variantes de articulação de Fc de anti-Bst2 para redução de função efetora

Quando as funções efetoras não são vantajosas paraanticorpos anti-Bst.2, podem ser investigadas variantes dearticulação de anti-Bst2. 0 intercâmbio de regiões dearticulação entre sub-classes de IgG demonstrou que aarticulação é importante para ligação de FcyR e Clq.Mutações especificas na articulação (Leu235Glu) ou for a daarticulação (Asp265Ala) apresentaram uma redução de ligaçãoa FcyR (Shields e outros, J. Biol. Chem. 276 (2001), pp.6591-6604; Lund e outros, FASEB J. 9 (1995), pp. 115-119;Morgan e outros, Immunology 86 (1995), pp. 318-324; Clynese outros, Nat. Med. 6 (2000), pp. 443-4 4 6). Variantes dearticulação de anticorpos monoclonais anti-CD3 com funçãoefetora delimitada encontram-se presentemente em ensaioclinico (Herold e outros, Diabetes 54 (2005), pp. 1763-1769; Carpenter e outros, Biol. Blood Marrow Transplant. 11(2005), pp. 4 65-471).

1-3. Aperfeiçoamento de anti-Bst2 mediante geraçãode anticorpos biespecificos

Um anticorpo biespecifico que tem por alvo Bst2 eoutra droga alvo para doenças inflamatórias expressadas namesma célula podem causar ADCC e CDC mais eficientemente.Esses anticorpos biespecificos para Bst2 podem ser maispotentes que os anticorpos que têm como alvo um únicoantigeno. Os anticorpos biespecificos cujo alvo é receptorde fator de crescimento epidérmico e receptor de fator decrescimento similar a insulina foram relatados como sendomais potentes que anticorpos cujo alvo é um único antigeno(Lu D. J. Biol. Chem.. 279:2856, 2004) .1-4. Aperfeiçoamento de anti-Bst2 mediante geraçãode conjugados de anticorpo com materiais tóxicos

Uma outra forma de aperfeiçoar a potência dosanticorpos consiste em interligar os mesmos a toxinas ouligante.s radioativos. Um anticorpo liga-se ao alvo nascélulas, internaliza-se, fornece a toxina e mata a célula.Estas toxinas são acopladas a anticorpos medianteutilização de um elemento de interligação que é clivado porenzimas intracelulares tais como catepsinas. A seleçãotanto da droga quanto do elemento de interligação écrucial. Se o elemento de interligação for clivado fora dacélula ocorrerá liberação de toxinas para a correntesangüínea. Os anticorpos anti-Bst2 que se internalizam apósligação a Bst2 são requeridos para fornecimento de toxinasa alvo. Alguns anticorpos anti-Bst2 podem ligar-sefortemente a Bst2 mas não a um epitopo ideal parainternalização. Por este motivo, é requerido umdesenvolvimento de técnicas de triagem para selecionar osanticorpos anti-Bst2 com internalização mais eficiente.Foram desenvolvidos métodos para triagem de anticorpos cominternalização intensificada (Marks JD, Methods Mol. Biol.248:201, 2004; Neve e outros, Biochem. Biophys. Res.Commun. 280 (2001), pp. 274-279; Heitner e outros, J.Immunol. Methods 248 (2001), pp. 17-30).

1—5, Aperfeiçoamento de anticorpos anti-Bst2 viapolimorfismo de FcRO polimorfismo de FcR parece desempenhar um papelsignificativo em muitas doenças incluindo doençasautoimunes, doenças infecciosas, doenças Cardiovascularesraterosclerose e biologia de transplante (van Sorge eoutros, Tissue Antigens 61 (2003), pp. 189-202; Karassa eoutros, Biomed. Pharmacother. 58 (2004), pp. 286-291;Kastbom e outros, Rheumatology 44 (2005), pp. 1294-1298;van Sorge e outros, J. Neuroimmunol. 162 (2005), pp. 157-164; Brouwer e outros, J. Infect. Dis.. 190 (2004), pp.1192-1198; Gruel e outros, Blood 104 (2004), pp. 2791-2793;Gavasso e outros, Atherosclerosis 180 (2005), pp. 277-282;van der Meer e outros, Thromb. Haemost. 92 (2004), pp.1273-1276; Pawlik e outros, Transplant. Proc. 36 (2004),pp. 1311-1313) .

Foi igualmente relatado que formas polimórficas deFcyR de pacientes afetam a resposta a anticorposmonoclonais terapêuticos tais como a droga Rituximab (anti-CD20) para cânceres (Cartron e outros, Blood 99 (2002), pp.754-758; Carton e outros, Blood 104 (2004), pp. 2635-2642;

Treon e outros, J. Clin.. Oncol. 23 (2005), pp. 474-481;Ghielmini e outros, Ann. Oncol. 16 (2005), pp. 1675-1682),Rituximab para lupus eritematoso sistêmico (Anolik eoutros, Arthritis Rheum. 4 8 (2003), pp. 455-459), eAlemtuzumab (anti-CD52) para leucemia linfocitica crônica(Lin e outros, Blood 105 (2005), pp. 289-291).

Assim, em doenças em que o polimorf ismo de FcyRpode ter um papel, a engenharia de anticorpos anti —Bst2 comligação aumentada ou reduzida a FcyR pode prover uma novacl asse de anticorpos monoclonais anti-Bst2 terapêuticos.

Expansão de Células Tronco

Acredita-se que a Bst2 desempenhe igualmente umpapel no crescimento e proliferação de células parapromoção de crescimento e diferenciação de célulashematopoiéticas. Como antígeno de células do estroma damedula óssea e uma proteína de adesão, a Bst2 podedesempenhar um papel preponderante para interação críticacélula-célula em hematopoiese e diferenciação de outrascélulas tronco.

O crescimento e diferenciação de muitas célulashematopoiéticas in vivo requer contato direto com célulasde estroma que produzem uma variedade de fatores decrescimento, e em alguns sistemas, é requerido contatodireto entre células de estroma e células hematopoiéticaspara crescimento e diferenciação de células (Daniel eoutros, Haematol. Blood Transfus. 32:172, 1989). Assim, ascélulas de estroma de medula óssea e os antígenos decélulas de estroma medula óssea são importantes reguladoresde sobrevivência de células e apoptose.

A medula óssea contém diversos tipos de célulastronco. Entre as mesmas encontram-se células troncohematopoiéticas,, que são precursoras de todas as células dosangue, e células tronco mesenquimatosas. As células troncomesenquimatosas trans-diferenciam-se em muitos diferentestipos de células; células ósseas, adipócitos, condrócitos,tendócitos, células nervosas e células de estroma da medulaóssea. A Bst2 pode igualmente regular a diferenciação decélulas tronco mesenquimatosas.

A importância das células de estroma na regulaçãoda proliferação e apoptose é adicionalmente exemplificadana regulação de sobrevivência de células e apoptose decélulas de câncer incluindo células de leucemia. Porexemplo, foi observado que células de leucemia AML ficamprotegidas de apoptose induzida por quimioterapia quando ascélulas de leucemia são incubadas com células de estroma demedula óssea (Garrido e outros, Exp. Hematol 2:9:448, 2001;Konopleva M e outros, Leukemia 16:1713, 2002). Estudosrecentes demonstraram que a Bst2 media diretamente o efeitoregulador das células de estroma de medula óssea nascélulas de leucemia, causando urna proteção das células deleucemia quanto a apoptose induzida por quimioterapia (Ge eoutros, Blood 107:1570., 2006). Em consistência com essepapel da Bst2 em quimio-sensibilidade, foi igualmenterelatada uma regulagem ascendente ("up-regulation") da Bst2em células de câncer de mama com resistência a Tamoxifen(Becker e outros, Mol. Câncer Ther. 4:151, 2005) sugerindopotenciais funções múltiplas da Bst 2 em diferentescânceres. Todo estes estudos sugeriram que a Bst2 é umaproteína pleiotrópica que media múltiplas funções.Agonistas de Bst2, mimetizadores de peptídeo deBst2 e IIgantes de Bst2 podem ser utilizados paraestimulação de crescimento/proliferação de células troncoin vitro para uma grande preparação de células tronco. Ascélulas tronco expandidas ex vivo podem ser usadas paratransplantes. Por exemplo, células tronco mesenquimatosascultivadas in vitro podem ser utilizadas paraintensificação de transplante de células troncohematopoiéticas mediante reconstrução do micro-ambiente demedula óssea danificado após terapia de radiação e/ouquimioterapia.

Agonistas de Bst2, mimetizadores de peptideo deBst2 e ligantes de Bst2 podem ser utilizados para expansãoex vivo de células tronco mesenquimatosas para terapiagenética. Acredita-se que as células tronco mesenquimatosassão promissoras como veículos para terapia e transferênciade genes. As células mesenquimatosas cultivadas podemencaminhar-se para a medula óssea após o transplante, podemdiferenciar-se e podem produzir a proteína intacta.

Moduladores de Bst2 de Baixo Peso Molecular

Um outro aspecto da presente invenção consiste naprovisão de moduladores de Bst2 de baixo peso molecular("molecular weight" - m.w.) para tratamento ou prevenção dediversas doenças inflamatórias/imunes. Os moduladores deBst2 podem afetar a função ou atividade de Bst2 em umacélula e modular ou afetar a interação Bst2-L de Bst2 etransdução de sinais. Adicionalmente, os moduladores deBst2 podem afetar alvos a jusante e moléculas que sãoreguladas por, ou que interagem com Bst2 na célula.

O principal fator para composto de baixo pesomolecular é se a interface de interação entre Bst2 e L deBst2 é suficientemente pequena para que uma moléculapequena possa perturbar ou aumentar suficientemente asinterações Bst2/L de Bst2 para produzir um inibidor ouativador com elevada afinidade. As interações proteina-proteina do receptor e Iigante requerem usualmente umagrande interface de interação. Destes muitos resíduos,entretanto, é possível que somente alguns resíduos em umaárea muito pequena possam contribuir para a atividade deligação. Estudos de mutação sugerem que as interaçõesproteína-proteína sejam promovidas em muitos casos por umpequeno conjunto dos resíduos de contato, designados como"hot spots", cujos "footprints" não são significativamentemaiores que aqueles cobertos por moléculas pequenas(Clackson T, Wells JA.. Science. 1995;267:383-386; DeLanoWL. Curr Opin Struct Biol. 2002;12:14-20. Wells JA. ProcNatl Acad Sci USA. 1996;93:1-6).

Se a Bst2 se ligar a L de Bst2 através de pequenosepitopos, o potencial para se encontrar Iigantes demoléculas pequenas poderá ser bom.

Moduladores Antagonistas e Agonistas de Bst 2

Os moduladores de Bst2 incluem antagonistas,agonistas, mimetizadores de peptídeo, inibidores, ligantes,e fatores de ligação. Os antagonistas incluem compostos,materiais, ou drogas que antagonizam, inibem, reduzem,bloqueiam, suprimem, diminuem, e reduzem ou eliminam afunção de proteína de Bst2 e/ou a atividade em umainteração Bst2-L de Bst2 e/ou uma via de sinalização dejusante de Bst2. Os moduladores agonistas de Bst2 incluemcompostos ou drogas que agonizam, intensificam,, estimulam,aumentam, ou amplificam a função de proteína de Bst2 e/ouatividade em uma interação Bst2-L de Bst2 em uma célulae/ou as vias de percurso de sinalização de jusante de Bst2.

Utilidade de moduladores de Bst2

Muito embora os anticorpos anti-Bst2 e "decoy" deBst2 (Fc) possam ter um papel terapêutico em doençasinflamatórias/imunes, inibidores de baixo peso molecularcom afinidade suficiente para bloquearem a ligação de Bst2a ligante de Bst2 poderão igualmente ser terapeuticamentevaliosos para tratamento de diversas doençasinflamatórias/imunes.

Adicionalmente às doenças inflamatórias/imunes, osantagonistas moduladores de Bst2 podem ser igualmentevaliosos para tratamento de alguns tipos de câncer. A Bst2pode estar envolvida na interação entre células de estromade medula óssea e células de câncer tais como célulasleucêmicas, causando sobrevivência de células leucêmicas,conforme exemplificado em estudos recentes de Ge Y e outros(Blood 107:1570, 2006). A Bst2 pode igualmente desempenharum papel Importante na interação de células de estroma comcélulas de câncer para progressão e invasão de tumores emalguns cânceres tais como câncer de próstata ou câncer demama.

Os agonistas de Bst2, mimetizadores de peptideos deBst2 e Iigantes de Bst2 podem ser terapeuticamente valiosospara tratamento de pacientes com deficiência do sistemaimune incluindo pacientes de HIV e pacientes com o sistemaimune comprometido. Os mimetizadores de peptideos de Bst2sintetizados com aminoácidos de forma D podem ser estáveisin vivo. Estes peptideos estáveis podem ter um maiorpotencial terapêutico em comparação com os mimetizadores deforma L.

Os agonistas de Bst, mimetizadores de peptideo deBs 12 e 1 igantes de Bst 2 podem igualmente desempenhar umpapel no tratamento de anemia ou doenças dos ossosincluindo osteoporose. 0 sistema hematopoiético precisa sersustentado por um ambiente de estroma que lhe proporcionesuporte, permitindo manutenção e diferenciação de célulastronco hematopoiéticas ("Hematopoietic Stem Cells" - HSC).

Entretanto, somente um número limitado de clones destascélulas de estroma suportam hematopoiese na ausência de umasuplementação de citocinas. Os agonistas de Bst2,mimetizadores de peptideo de Bst2 e ligantes de Bst2 podemser úteis para promoção de hematopoiese.Os agonistas de Bst2, mimetizadores de peptídeo deBst2 e ligantes de Bst2 podem ser úteis para tratamento decélulas de medula óssea danificadas após terapia deradiação e/ou quimioterapia. Mediante restauração domicroambiente de medula óssea, estes moduladores de Bst2podem ser úteis para o tratamento de pacientes de câncersubmetidos a quimioterapia ou terapia de radiação.

1. Métodos de triagem de alto rendimento ("HighThroughput Screening" - HTS) para moduladores de Bst2.

São descritos abaixo diversos métodos de triagem dealto rendimento (HTS) baseados nas propriedades conhecidasde Bst2 e/ou L de Bst2 para triagem de moduladores de Bst2.Os compostos encontrados identificados por métodos HTSforam adicionalmente avaliados por vários métodos de ensaiosecundários conforme se encontra indicado abaixo.

1-1. Triagem de alto rendimento de inibidores deBst2 mediante detecção de ligação direta a Bst2 com ensaiode deslocamento térmico de fluorescência.

A maioria das moléculas pequenas que se ligam aBst2 podem modular de alguma forma a atividade de Bst2,devido a uma ligação de afinidade preferencial ou maior àsáreas funcionais ou sítios na Bst2, por exemplo no sitio deligação de Bst2 ou o sitio de dimerização importante para aformação de dímeros Bst2-Bst2. A triagem e os ensaios dede te cção de moléculas pequenas para identificação demoléculas pequenas que possam ligar-se a Bst2 ou peptídeosde Bst2 podem ser projetados mediante utilização de ensaiosde deslocamento térmico. Para ensaios de deslocamentotérmico, tudo o que é necessário é a proteína Bst2purificada e uma biblioteca química. Os ensaios dedeslocamento térmico baseados em florescência seriamparticularmente úteis quando os ligantes de Bst2 in vivofossem desconhecidos.

As drogas ou moléculas de ligação determinadas poresta técnica podem ser adicionalmente analisadas pormétodos tais como aqueles aqui descritos em Ensaios detriagem secundária, para determinar se as moléculas afetamou modulam a função ou atividade da Bst2.

1-1-1. Ensaio de deslocamento térmicoO ensaio de deslocamento térmico baseado em15 fluorescência (3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP,Exton, Pa.) conforme descrito nas patentes norte-americanasn° US 6.020.141 e n° US 6.036.920 concedidas a Pantoliano eoutros; J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8);

Pantoliano e outros, J. Bioimol Screen 6:429, 2001; Lo MC eoutros, Anal Biochem. 332:153, 2004) é um método geral paraidentificação de inibidores de proteínas alvo debibliotecas de compostos. Pantoliano e outros descreveramseu aparelho de ensaio de deslocamento térmico baseado emfluorescência para triagem de alto rendimento de drogas.

Neste ensaio, com utilização de um corantefluorescente com sensibilidade ambiental para monitoraçãodo desdobramento térmico de proteína, a afinidade deligação do ligante é avaliada com base no deslocamento datemperatura de desdobramento {Delta Tm) obtida na presençados compostos relativamente àquela obtida na ausência doscompostos.

Para monitoração de desdobramento de proteína, éutilizado um corante fluorescente tal como Sypro de corlaranja. O corante Sypro de cor laranja é um corantesensível ao meio ambiente. O processo de desdobramentoexpõe a região hidrofóbica das proteínas e produz comoresultado um grande aumento de fluorescência, que éutilizado para monitorar a transição de desdobramento daproteína.

Foi concebida e implementada por Pantoliano eoutros uma instrumentação totalmente automatizada pararealização de ensaios de deslocamento térmico baseados emfluorescência miniaturizados em um formato de micro-placaspara triagem de alto rendimento de bibliotecas de compostos(J. Biomol. Screen 6:429, 2001).

O ensaio de deslocamento térmico pode serigualmente realizado no sistema de detecção em tempo realiCycler iQ Real Time Detection System (Bio-Rad, Hercules,CA) , originalmente concebido para PCR, conforme descritopor Lo e outros (,Anal Biochem. 332:153, 2004) . 0 sistemainclui um dispositivo de aquecimento/refrigeração paracontrole adequado de temperatura e um detector do tipodispositivo de acoplamento de carga ("Charge-CoupledDevice" - CCD) para formação simultânea de imagens dasalterações de florescência nos receptáculos da microplaca.reação contém Bst2 (aproximadamente 1 uM), corante Syprode cor laranja, composto {O, 10, 50, 100 uM), e o tampão. Aplaca é aquecida de 25 para 89° C com uma taxa deaquecimento de 0,5° C/min. A intensidade de fluorescência émedida com Ex/Em:490/530 nm. Os dados de formação deimagens de fluorescência são analisados de acordo com asEquações divulgadas por Pantoliano e outros (J. Biomol.Screen 6:429, 2001). Mediante ajuste da intensidade defluorescência à equação foi obtido para cada receptáculo, atemperatura de ponto intermédio de transição, Tm.

1-2. Triagem de alto desempenho de moduladores deBst2 mediante detecção da via Bst2-NFkB com ensaios dereportador de luciferase duplos.

A sobreexpressão de Bst2 produz como resultadoativação de NFkB em células de mamíferos (Matsuda e outros,Oncogene 22:3307, 2003). Muito embora o mecanismo desinalização detalhado da Bst2 nas vias de inflamaçãopermaneça desconhecido, um relato anterior de Matsuda eoutros sugere que a sobreexpressão de Bst2 e sua ativaçãocausam ativação de transcrição mediada por NFkB através deum elemento de resposta de NFkB.

Utilizando esta propriedade da Bst2, foramconcebidos ensaios de reportador de luciferase duplos dealto rendimento (Promega, Madison, WI7 Paguio e outros,Cell Notes 16:22, 2006) para triagem de moduladores de Bst2mediante acoplamento de inibição ou ativação de Bst2 àregulação de transcrição de gene reportador de luciferase.

1-2-1. Constructos de DNA para ensaios deluciferase duplos de HTS e linhagens celulares estáveis

Neste ensaio, o primeiro plasmídeo é construídopara expressar, por exemplo, luciferase de vaga-lume("firefly luciferase") acoplada a elementos de resposta deNFkB dispostos em seqüência a montante da luciferase devaga-lume e um marcador de seleção tal como higromicina(Promega). O segundo plasmídeo expressa Bst2 e uma outraluciferase tal como luciferase de Renilla como controleinterno - um marcador de seleção (tal como neomicina) defusão (Promega). O método de ensaio de Bst2 de reportadorduplo de luciferase possui um controle embutido utilizandoluciferase de Renilla. A atividade de luciferase de vaga-lume para cada amostra é normalizada com utilização daatividade de luciferase de Renilla.

Células de mamíferos e células transfectadas com osconstructos reportadores e as linhagens celulares estáveisduplamente transfectadas são então obtidas para o ensaio detriagem de alto rendimento. São igualmente obtidaslinhagens celulares estáveis de controle expressando umvetor vazio. As células que expressam Bst2 devem apresentaruma maior atividade de luciferase conforme relatado emestudos realizados por Matsuda e outros (Oncogene 22:3307,2003) em comparação com as células estáveis de controle quecontêm um vetor vazio da fusão neomicina-luciferase deRenilla.

1-2-2. Ensaio de Bst2 de HTS de reportador duplo de1-ueiferase

0 ensaio de triagem é realizado em um formato de394 receptáculos utilizando cada um dos compostos(normalmente 10 uM ou concentrações mais elevadas). Sãodispostas em placa dez mil células/receptáculo. Metade dosreceptáculos são estimulados com compostos e metade sãopseudo—estimulados. As células são colhidas após váriashoras. A atividade de luciferase é determinada medianteutilização do sistema Dual Glo Luciferase Assay System(Promega) e é quantificada com utilização do monitor deluminância ("luminomitor"). São obtidos resultados de umaplaca de amostra de NFkB-Iuciferase de vaga-lume/Bst2. Osresultados positivos podem ser definidos como uma expressãode reportador superior a um triplo ou um quádruplo deinibição ou ativação acima da média do controle nãoinduzido. 0 valor de luciferase de controle obtido dascélulas estáveis de controle indicará o nível mais elevadode inibição. Todos os ensaios são realizados eraquadruplicado. A indução ou inibição é calculada como amédia de LU estimulada (NFkB) de vaga-lume/média de RLUpseudo-estimulada.1-2-3. Experimentos de titulação para validação deresultados positivos

A linhagem celular de Bst2/elementos de respostaNFkB estáveis duplamente transfectados é disposta em placasa uma razão de 10.000 células/receptáculo em uma placa de96 receptáculos. Cada composto é diluído serialmente narazão 1:2, e é adicionado aos receptáculos emquadruplicado. As células são incubadas com antagonistas ouagonistas durante várias horas, são colhidas e analisadascom utilização do sistema Dual Glo Assay System (Promega).

A atividade de luciferase é medida com o instrumento GloMax96 Microplate Luminometer (Promega).

1-3. Triagem de alto rendimento de moduladores deexpressão de Bst2 mediante monitoração da expressão depromotor de Bst2/luc utilizando ensaio de luciferase duplo

Existem muitos precedentes de utilização dosconstructos reportadores contendo promotor paraidentificação de produtos terapêuticos de baixo pesomolecular. Por exemplo, os promotores de BMP-2, BMP-4 eBMP-7 foram fundidos com a molécula reportadora,alternativamente beta galactosidase ou luciferase paratriagem de pequenas moléculas capazes de se ligarem aopromotor e aumentarem a expressão do gene reportador.

Com base nos experimentos utilizando microarranjos,é evidente que existem várias moléculas terapeuticamenteimportantes que podem induzir Bs t2 (gama interferon, TNFalfa, hi stamina, etc.). Adicionalmente, com base em umapesquisa na literatura, é evidente que algumas outrasmoléculas poderiam também fazer o mesmo. Adicionalmente(Blood 107:1570, 2006; Matsuda e outros, Oncogene 22:3307,2003; Goto e outros, Blood 84:1922, 1994) A regiãopromotora do gene de Bst2 foi analisada. Foram encontradosvários tipos importantes incluindo os de AML,, GATAl, STAT eAPl. Todos estes estudos indicam que a regulação detranscrição de Bst2 é um importante mecanismo regulatórioda atividade ou função de Bst2 em uma célula.

Os ensaios HTS podem ser projetados paraidentificação de compostos que se ligam às seqüênciasregulatórias no gene de Bst2. A região promotora de Bst2(aproximadamente 1 kb ou mais) é fundida para montante dogene de luciferase. Os compostos encontrados por triagemapós este ensaio podem modular o nível de expressão de genede Bst2. Nos ensaios de triagem secundária, os compostossão triados quanto a atividade inibidora ou estimuladorarelativamente a adesão célula-célula e função inflamatóriada Bst2.

1-3-1. Constructos de DNA e linhagens celularesestáveis

A região promotora de Bst2 que se espalha por 759bp a montante do sítio de início de translação e 211 bp doéxon 1 é amplificada por PCR utilizando "primers" de avanço(5 ' -ttcacgctagccccctttgcagatgaagaaacaggctcaga-3 1 (-SEQ IDNO:97)) e "primers" reversos (5'-ttcacctcgaggcaggagatgggtgacattgcgacactc-3' (SEQ ID NO:98))contendo sítios de enzimas de restrição para NheI e XhoIconforme relatado por Ge e outros (Blood 107:1570, 2006).Para construção de vetores de DNA contendo fragmentos maislongos do promotor de Bst2, a região promotora de Bst2estendendo-se por 1 kb ou mais é amplificada por PCR. 0produto amplificado é digerido com NheI e XhoI e é ligadoaos sítios correspondentes do vetor de gene reportadorexpressando luciferase de vaga-lume. Este constructo éutilizado para triagem de alto rendimento utilizando ensaiode luciferase.

1-3-2. Ensaio HTS de luciferase de reportador duploutilizando o constructo de fusão promotor deBst2/luciferase

No formato HTS, as células de mamíferos sãoadicionadas aos receptáculos das placas de 384receptáculos, e são co-transfectadas com o constructo degene reportador de Bst2 e um gene reportador de luciferasede Renilla interno utilizando reagente Fugene 6 (Roche). Asatividades de luciferase são testadas com utilização dosistema de ensaio de luciferase duplo (Promega) e sãonormalizadas.

1-4. Triagem de alto rendimento de moduladores deBst 2 mediante detecção de interação Bst2-Bst2 comutil iζação de tecnologia de Polarização de FluorescênciaAcredita-se que a Bst2 exista na forma dehomodimero nas superfícies das células (Ohtomo e outros,Biochem Biophys Res Commun. 1999, 258 (3):583-91). Acredita-se igualmente que a Bst2 requer dimerização para suaatividade. Para consistência com esta teoria, a proteína"decoy" de Bst2 (domínio extracelular de Bst2) foiexpressada e secretada como um dímero (vide a Fig. 3,painel B).

Adicionalmente., o domínio extracelular de Bst2contém uma região helicoidal prevista que pode desempenharum papel na dimerização de Bst2. Todos estes resultadossugerem que Bst2 interage com Bst2.

Utilizando esta propriedade de homodimerização deBst2, foi criado um ensaio de ligação de Bst2 competitivode alto rendimento para os moduladores de Bst2 comcapacidade de bloquear a interação Bst2~Bst2, conformeindicado abaixo.

Este método de triagem inclui a técnica depolarização de fluorescência (Roehrl e outros, Biochemistry43:16056, 2004 ), que é um dos métodos de alto rendimentomais sensível para estudo de interações proteína-proteína,e a plataforma de citometria de fluxo HyperCyt. Nestemétodo, uma Bst2 marcada com fluorescência, ou "decoy" deBst2, ou hélice de Bst2 ("Bst2 coiled coil" - Bst2 CC) ouqualquer fragmento destas proteínas é excitado por luzpolarizada. A dissociação de Bst2 relativamente a uma formamarcada com fluorescência de Bst2, "decoy" de Bst2, Bst2 CCou qualquer fragmento destas proteínas na presença depequenas moléculas pode ser detectada por ensaio decompetição de ligação no formato HTS.

1-4-1. HyperCyt

A HyperCyt é uma plataforma de análise decitometria de fluxo de alto rendimento ("High-ThroughputFlow Cytometry" - HTFC) automatizada em que amostras decélulas são rapidamente aspiradas de receptáculos demicroplacas e fornecidas para o citômetro de fluxo (EdwardsBS Molecular Pharmacology 68:1301, 2005; Young SM e outros,(2005) J Biomol Screen 10: 374-382; Arnold LA e outros,Science STKE (2006) 2006:pl3). Esta abordagem de triagempermite a realização de ensaios de interação proteína-proteina de alto rendimento em um formato homogêneo semperdas que não seria possível com leitores convencionais deplaca de fluorescência. A plataforma HyperCyt para triagemHTFC demonstrou constituir um método robusto, sensível ealtamente quantitativo para triagem de bibliotecas decompostos principais (Ramireζ e outros, (2003) Cytometry53A: 55-65; Kuckuck e outros, (2001) Cytometry 44: 83-90).

1-4-2. Reagentes de Bst2, proteínas de Bst2recombinantes e linhagens de células estáveis marcados comfluoresceína

É preparado Bst2, "decoy" de Bst2, Bst2 CC ouqualquer fragmento destas proteínas com marcação defluoresceina. É expressada e purificada uma proteínarecombinante de Bst2, "decoy" de Bst2, ou "decoy" de Bst2-Fc. São geradas linhagens de células estáveis expressandoBst2. Se for possível identificar o mutante de B st.2 que nãose internaliza após ligação a Bst2, este mutante de Bst2poderá ser utilizado ao invés da Bst2 de tipo natural parageração de linhagens de células estáveis para triagem dosmoduladores de Bst2.

1-4-3. Ensaio HTS de polarização de fluorescênciapor detecção de interação Bst2-Bst2

O ensaio de polarização de fluorescência mede acapacidade dos compostos de teste para competirem com umaforma fluorescente de Bst2, "decoy" de Bst2, Bst2 CC ouqualquer fragmento destas proteínas, para ligação a Bst2 demembrana celular ou Bst2 purificada, "decoy" de Bst2 ou"decoy" de Bst2-Fc.

Para o ensaio de alto rendimento, uma bibliotecaquímica é triada em formato de 384 receptáculos. Osreceptáculos de controle contêm proteínas Bst2 não marcadasou apenas tampão. Formas não marcadas de "decoy" de Bst2,Bst2 CC ou qualquer fragmento destas proteínas sãoadicionadas em uma concentração 100 vezes mais alta quebloqueia totalmente a ligação das formas marcadas comfluorescência de "decoy" de Bst2, Bst2 CC ou qualquerfragmento destas proteínas. É igualmente estabelecido umoutro controle que contém apenas tampão. Os valores depolarização de fluorescência destes controles positivos enegativos determinam 0% e 100% de inibição de recrutamentode Bst2, "decoy" de Bst2, Bst2 CC ou qualquer fragmentodestas proteínas.

As adições aos receptáculos são realizadas emseqüência da seguinte forma: 1) compostos de teste ereagentes de controle (normalmente 10 uM e mais); 2)células estáveis de Bst2 (10^7 células/ml); 3) (apósincubação a 4°C) formas marcadas com fluoresceína de"decoy" de Bst2, Bst2 CC ou qualquer fragmento destasproteínas. Após uma incubação adicional a 4°C, as placassão analisadas por citometria de fluxo com a plataformaHyperCyt.

Em um outro formato, os ensaios de alto rendimentopodem ser realizados com utilização de formas purificadasde Bst2, "decoy" de Bst 2 ou "decoy" de Bst 2-Fc.Anteriormente ao estabelecimento do HTS, são determinadas aconstante de ligação de Bst2 e as concentrações de triagem.O valor Kd é determinado após a ligação das diluiçõesseriais de proteína Bst2, "decoy" de Bst2 ou "decoy" deBst2-Fc às formas marcadas por fluorescência de Bst2,"decoy" de Bst2, Bst2 CC ou qualquer fragmento destasproteínas. A ligação é medida com utilização defluorescência de polarização (excitação a 485 nm, emissão a530 nm) com leitor de placa. Os dados são analisadosutilizando-se programas como SigmaPlot e o valor Kd édeterminado. Após a determinação do valor Kdr os compostosde teste são adicionados aos receptáculos. É adicionadaproteína Bst2, "decoy" de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc e sãoadicionadas formas com marcação fluorescente de Bst2,^decoy" de Bst2, Bst2 CC ou qualquer fragmento destasproteínas. São estabelecidos controles positivo e negativocom quantidade excessiva de formas não marcadas de Bst2,"decoy" de Bst2, B st.2 CC ou qualquer fragmento destasproteínas, ou somente tampão. A polarização defluorescência e a intensidade de fluorescência são medidascom um leitor de placa.

A inibição de composto de teste de peptídeofluorescente é calculada conforme descrito em estudosrealizados por Edwards BS e outros (Molecular Pharmacology68:1301, 2005) como 100 χ [1 - (MFITesteMFIBloqueado)/(MFINãobloqueado - MFIBbloqueado)], em queMFI é a intensidade média de fluorescência de células emreceptáculos contendo compostos de teste, receptáculos decontrole bloqueados e receptáculos de controle nãobloqueados.

Após a triagem inicial, a análise de resposta dedosagem utilizando um ensaio de ligação de competiçãodetermina o valor IC50 dos compostos.

1-5. Triagem de alto rendimento de moduladores deBst 2 mediante detecção de interação Bst2-L de Bst.2utilizando tecnologia de Polarização de Fluorescência1-5-1. Célula expressando L de Bst20 ensaio HTS descrito abaixo requer célulasexpressando L de Bst.2, ou fragmentos de L de Bst ou L deBst2 purificado. Uma das células que expressa L de Bst2 é acélula U937 conforme ilustrada em nossos experimentos(Figs- 6, 7 e 24 ) . A observação de que o "decoy" de Bst2inibe o acoplamento de células U937 a HUVECs indica que a Lde Bst 2 se encontra presente na superfície celular decélulas U937 não estimuladas (Fig. 7). Uma outra observaçãode que o "decoy" de Bst2 inibe agregação homotipica decélulas T ativadas (Fig. 2) ou células U937 ativadas (Fig.6) sugere que o L de Bst2 pode ser expressado na superfíciede células T e/ou de células U937 tanto antes quanto após aativação. Confirmando estes resultados, foi demonstrada aligação direta de células U937 à proteína "decoy" de Bst2purificada (Fig. 24).

Após identificação da proteína L de Bst2 eseqüência de nucleotídeos, o L de Bst2 purificado oufragmentos respectivos, ou células CHO ou células COStransfectadas de forma estável com L de Bst2 podem serutilizadas para .substituição de células U937.

1-5-2. Ensaio HTS de polarização de fluorescênciapor detecção de interação Bst2-L de Bst2

Utilizando a interação do "decoy" de Bst225 purificado (ou Bst2 e das células U937 expressando L deBst2 (ou quaisquer células expressando L de Bst2), o ensaiode competição de ligação de alto rendimento para triagem demoduladores de Bst2 é estabelecido conforme se encontraindicado abaixo.

Este ensaio HTS é baseado no deslocamento da formamarcada com fluorescência de Bst2 ou "decoy" de Bst2 do Lde Bst2 de membrana nas células que expressam L de Bst2tais como células U937. 0 ensaio de polarização defluorescência mede a capacidade de competição dos compostosde teste com uma forma fluorescente de Bst2 ou "decoy" deBst2 para ligação ao L de Bst2 de membrana ou L de Bst2purificado (ou fragmentos).

Para o ensaio de alto rendimento, as adições aosreceptáculos são feitas em seqüência da seguinte forma:

Os compostos de teste são adicionados aoreceptáculo em primeiro lugar e em seguida são adicionadasas células U937. Após incubação, são adicionadas formasmarcadas fluorescentemente de Bst2, "decoy" de Bst 2 oufragmentos das mesmas. Após uma incubação adicional a 4o C,as placas são analisadas por c i tome t ri-a de fluxo com aplataforma HyperCyt.

Em um outro formato, este ensaio HTS pode serrealizado mediante utilização de L de Bst2 purificado oufragmentos do mesmo, e formas marcadas por fluorescência deBst2, "decoy" de Bst2 ou fragmentos das mesmas. Oscompostos de teste são adicionados aos receptáculos, sãoadicionados L de Bst2 ou fragmento de L de Bst2 e são entãoadicionadas formas marcadas por fluorescência de Bst2,decoy de Bst2 ou fragmento das mesmas. São estabelecidoscontroles positivos e negativos conforme descrito acima emensaio de polarização de fluorescência HTS para detecção deinteração Bst2-L de Bst2, A polarização de fluorescência ea intensidade de fluorescência são medidas com um leitor deplaca.

Em um outro formato, este ensaio de alto rendimentopode ser realizado utilizando formas purificadas de Bst2 ou"decoy" de Bst 2 e peptídeo de L de Bst2 marcada porfluorescência. Os compostos de teste são adicionados aosreceptáculos, é adicionada proteína Bst2 ou "decoy" de Bst2e é adicionado peptídeo de L de Bst2. São estabelecidoscontrole positivo e negativo. A polarização defluorescência e a intensidade de fluorescência são medidascom um leitor de placa.

1-6. Triagem de alto rendimento de moduladores deBst2 mediante detecção das interações entre Bst2-mimetizadores de peptídeo de Bst2 utilizando tecnologia dePolarização de Fluorescência

1-6-1. Mimetizadores de peptídeo de Bst2

Pequenos peptídeos que se ligam com alta afinidadea Bst2 podem ser utilizados como mimetizadores de peptídeode Bst2. Esses peptídeos podem ser identificados porexibição de fagos conforme se descreve abaixo. O ensaio decompetição de ligação de alto rendimento para moduladoresde Bst2 é criado por detecção da interação entre Bst2 emimetizadores de peptideo de Bst2 utilizando tecnologia depolarização de fluorescência.

1-6-2. Isolação de mimetizadores de peptideo deBst2 que se ligam a Bst2 com alta afinidade, através deexibição de fagos

Os mimetizadores de peptideo de Bst2 que se ligamao domínio extracelular de Bst2 com alta afinidade podemser triados através de exibição de fagos. Vastasbibliotecas de peptideos podem ser criadas através declonagem de misturas complexas de oligonucleotídeossintetizados combinatoriamente para vetores de exibição defagos. 0 sistema de exibição de fagos filamentosos, em queos peptideos expressados são exibidos como fusões aproteínas de revestimento de fagos, têm sido eficazes paradescoberta de ligantes de peptideos (Devlin e outros,Science 24 9 : 404 , 1990; Greenwood e outros, J. -Mol. Biol.220:821, 1991; Scott e Smith Science 249:386, 1990).

Os bancos de fagos são incubados com contasrevestidas com a proteína "decoy" de Bst2 ou as contas decontrole, e os bancos positivos são selecionados por ummétodo de separação magnética, a purificação de afinidadeda população de partículas de fagos em contas de "decoy' deBst2 é utilizada para recuperação de peptideos comatividade de ligação. 0 seqüenciamento do segmentoapropriado do DNA de cada fago capturado proporciona aseqüência primária de peptideos que se ligam a "decoy" deBst2. Os mimetizadores de peptideo de Bst2 sãoadicionalmente triados em ensaios funcionais para seleçãodaqueles que possuem atividade para estimulação derespostas inflamatórias.

1-6-3. Confirmação da capacidade dos mimetizadoresde peptideo de Bst2 para se ligarem a Bst2

A capacidade ou incapacidade do peptideoselecionado para se ligar a Bst2 é confirmada no ensaio deligação das células expressando L de Bst2 marcado tais comocélulas U937 a formas imobilizadas de proteína "decoy" deBst2 ou "decoy" de Bst2-Fc. Diferentes concentrações dosmimetizadores de peptideo de Bst2 são adicionadas a esteensaio de ligação para medição de competição de ligação.

Em um outro formato, o ensaio de ligação pode serestabelecido com células expressando L de Bst2 imobilizadotais corno células U937, e "decoy" de Bst2-Fc ou "decoy" deBst2 biotinilado como sonda.

Em um outro formato, quando a proteína L de Bst'2 éidentificada, é possível realizar o ensaio de ligação de Lde Bst2 marcado com 125I a "decoy" de Bst2 imobilizado ou"decoy7 de Bst2-Fc imobilizado.

1-6-4. Confirmação da atividade de mimetizador depeptideo de Bst2 em ensaios biológicos

A função biológica dos mimetizadores de peptideo deBst2 pode ser avaliada em muitos diferentes ensaios. Umdesses ensaios é conforme se descreve a seguir: HUVEc's sãotransfectados com o vetor de expressão para Bst2 ou umvetor vazio. Após 48 horas de transfecção, as células sãotratadas com mimetizadores de peptideo de Bst2 ou peptideosde controle. A expressão de genes para mediadoresinflamatórios e moléculas de adesão é analisada por RT-PCRe a expressão de proteínas desses genes é determinada por"immunoblotting". Os mimetizadores de peptideo de Bst2estimulam respostas inflamatórias em UVECs que expressamBst2.

1-6-5. Triagem de alto rendimento de moduladores deBst 2 com tecnologia de Polarização de Fluorescênciautilizando os mimetizadores de peptideo de Bst2

O ensaio HTS é realizado de uma maneira similaràquela descrita acima. Resumidamente, o mimetizador depeptideo de Bst2 é marcado por fluorescência. As células demamíferos são transfectadas de forma estável com o vetor deexpressão para Bst2. Se for conhecido o mutante de Bst2 quenão se internaliza após a ligação a Bst2, este mutante deBst2 é transfectado para células de mamífero para triagemdos moduladores de Bst2.

Para o ensaio HTS, os compostos de teste sãoadicionados aos receptáculos. Células estáveis expressandoBst2 são adicionadas, com subseqüente adição demimetizadores de peptideo de Bst2 marcados porfluorescência. A polarização de fluorescência e aintensidade de fluorescência são medidas com ura leitor deplaca tal como acima.

Em um outro formato, formas purificadas de Bst2 ou"decoy" de Bst.2 podem ser utilizadas ao invés de célulasestáveis expressando Bst2. A resposta dependente de dosedos compostos é avaliada para validação dos resultadospositivos.

2. Ensaios secundários para validação de resultadospositivos após triagem de alto rendimento

Os resultados positivos iniciais devem serconfirmados através de urna série de ensaios de perfilagemem qualquer processo de descoberta de droga. A confirmaçãode resultados positivos através de ensaios secundáriosdestina-se a determinar se a inibição ou ativação peloscompostos de baixo peso molecular é biologicamenterelevante. Os ensaios secundários aqui descritos constituemapenas alguns exemplos de possíveis ensaios alternativosque podem ser utilizados para validação de compostos comresultado positivo.

2-1. Validação de resultados positivos por ensaiode ligação Bst2-L de Bst2

A atividade do composto de baixo peso molecular émedida pela interação Bst2-L de Bst2 como função deconcentração de composto em um formato ELISA. A formabiotinilada de "decoy" de Bst2 (ou "decoy" de Bst2-Fc) éimobilizada nos receptáculos de uma placa de 96receptáculos revestida com estreptavidina (ou revestida comanticorpo anti-Fc) . Diluições seriais dos c-ompostosprincipais selecionados são adicionadas a uma solução de Lde Bst2 e o mutante de L de Bst2 (se estiver disponível)que não se liga a "decoy" de Bst2 como controle, e sãoincubadas com o "decoy" de Bst2 imobilizado. 0 L de Bst2não contido é lavado da placa. 0 L de Bst2 contido é medidocom anticorpo anti-L de Bst2 marcado com peroxidase derábano com subseqüente reação colorimétrica para peroxidasede rábano.

2-2. Validação de resultados positivos por ensaiode ligação Bst2-L de Bst2 utilizando tecnologia deressonância de plásmons de superfície Biacore

A ligação Bst2-L de Bst2 pode ser analisada comtecnologia de ressonância de plásmons de superfície Biacoreem ura formato de competição de solução. Uma série deconcentração de cada composto é incubada com L de Bst2recombinante e é subseqüentemente injetada sobre umasuperfície de "chip" com "decoy" de Bst2 recombinantecapturado. A ligação é medida em equilíbrio e calculadacomo a porcentagem de ligação máxima.

2-3. Validação de resultados positivos por ensaio"Pull-down" de Glutationa S Transferase

A proteína "decoy" de Bst2-GST é expressada em E.coli e purificada. Uma forma rádio—marcada (35S)-L de Bst2pode ser obtida mediante utilização de um sistema detranscrição-translação TNT T7. Uma diluição serial docomposto de resultado positivo é preparada em DMSO. 1 ul decomposto de resultado positivo de cada concentração éadicionado a tubos. São adicionadas gotas contendo proteína"decoy" de Bst2-GST. É então adicionado L de Bst2 rádio-marcado e o mesmo é incubado. 0 ensaio "Pull-down" érealizado de acordo com as instruções do fabricante.

2-4. Validação de resultados positivos por ensaiode adesão célula-célula utilizando células com marcaçãofluorescente

Os ensaios de adesão de células são realizadosconforme descritos por Edwards e outros (MolecularPharmacology 68:1301, 2005). Células com Bst2 (célulasestáveis expressando Bst2) são marcadas com marcadorfluorescente vermelho Fura-Red (Invitrogen) e células com Lde Bst2 (podem ser usadas células estáveis expressando L deBst2 ou células U937) marcadas com marcador fluorescenteverde de éster de succidinimila de diacetato de 5,6-carboxifluoresceina (Invitrogen) e mantidas em gelo até oexperimento. Trezentos microlitros de células com Bst2 (1 χIO6 células/ml) e 300 μΐ de células com L de Bst2 (3 χ IO6células/ml) são incubadas separadamente durante 5 minutos a37° C na presença ou ausência de compostos de teste (100 μΜfinal). As células são então combinadas e analisadas nocitômetro de fluxo, e durante esse tempo a suspensão decélulas é agitada continuamente a 300 rpm e 37° C com umavareta de agitação magnética. Após 90 segundos de agitaçãopara determinação dos níveis basais de adesão de células,os compostos são adicionados em diferentes concentrações.

As células com Bst2 são resolvidas em duas frações nocitômetro de fluxo: "singlets" que são uniformementevermelhos fluorescentes e conjugados contendo co-fluorescência vermelha/verde (células com Bst 2fluorescentes vermelhas aderidas as células com L de Bst2fluorescentes verdes). Em cada ponto de tempo indicado, aporcentagem de células com Bst2 aderentes é calculada como100 χ (número de conjugados)/(número de conjugados + númerode "singlets").

2-5. Validação de resultados positivos por ensaiode reportador de luciferase

A atividade antagonista ou agonista de Bst2 podeser confirmada com ensaios de reportador de luciferaseutilizando (NFkB)n-luc, um plasmideo contendo múltiplossítios de NFkB a montante de um reportador de luciferase.Células 293T são transfectadas com o (NFkB)n-luc e um vetorde expressão de mamífero para Bst2. Após 48 horas, ascélulas são tratadas com concentrações variáveis doscompostos selecionados. Após 6 horas de incubação, o ensaiode luciferase é realizado e a luminescência é medida comutilização de um luminômetro.

2-6. Validação de resultados positivos por ensaiode transcriçãoO ensaio de transcrição determina se as moléculaspequenas inibiram ou aumentaram a transdução de sinalmediada por Bst2 nas vias inflamatórias no ambientecelular. Um desses ensaios é conforme descrito a seguir.Células HUVECs são transfectadas com o vetor de expressãopara Bst2 ou um vetor vazio. Após 48 horas de transfecção,as células são tratadas com diversas concentrações decompostos de resultado positivo. A expressão de genes paramediadores inf 1 amat-órios e moléculas de adesão é analisadapor RT-PCR e a expressão de proteínas destes genes édeterminada por "immunoblotting" ou ELISA.

Bst2 e Angiogênese

A angiogênese é o crescimento de novos vasossangüíneos capilares. Uma inflamação pode promoverangiogênese e novos vasos também aumentam a inflamação detecido. Desta forma, a angiogênese e a inflamação sãoprocessos co-dependentes (Jackson e outros, FASEB J 11:457,1997), apesar de a angiogênese e a inflamação poderemtambém ocorrer independentemente uma da outra.Particularmente as inflamações crônicas podem estimularcrescimento de vasos. A angiogênese é requerida paraembriogênese, reparo de tecidos após lesões, crescimento, epara o ciclo reprodutivo feminino. A angiogênese tambémcontribui para a patologia de câncer e uma variedade dedoenças inflamatórias crônicas incluindo psoríase,retinopatia, artrite reumatóide, osteoartrite, asma efibrose pulmonar. Por exemplo, a angiogênese é requeridapara suportar o crescimento da maioria dos tumores sólidosacima de um diâmetro de 2-3 mm. Estudos recentesdemonstraram que os inibidores de angiogênese bloqueiam aprogressão de tumores. Adicionalmente, o câncer não é aúnica doença em que o uso de inibidores de angiogênese podeestabelecer uma diferença. A angiogênese desempenha umpapel critico em degeneração macular relacionada com idadee retinopatia diabética. Estes distúrbios causam perda devisão quando ocorre infiltração de vasos sangüíneos naretina, embaçando a mesma e eventualmente destruindo amesma. Na realidade, os bloqueadores de vasos sangüíneos(anticorpos, compostos de baixo peso molecular) constituemo tratamento mais novo e mais eficiente para degeneraçãomacular associada com a idade, que é a principal causa decegueira em pessoas com mais de 65 anos. Os inibidores deangiogênese podem reduzir inflamações e pode ser previstoque os inibidores de inflamações crônicas inibam aangiogênese nos casos em que o estímulo de crescimentovascular é derivado de células inflamatórias (Stogard eoutros, J Clin Invest 103:47, 1:999) . É possível que a Bst2induza angiogênese e que os bloqueadores de Bst2 possam teratividades anti-angiogênicas inibindo neovascularização

Administração

No que se refere a administração, adicionalmente àsrotas de administração convencionais tais como injeçõessubcutâneas, intravenosas, intramusculares eintraperitoneais, os bloqueadores de Bst2 podem seradministrados por adesivos transdérmicos e métodos deliberação controlada. A liberação controlada de reagentesde bloqueio de Bst2 tais como anticorpo de ligação a Bst2ou "decoy" de Bst2 pode ser obtida localmente ousistemicamente mediante implantação de reagentes debloqueio de Bst2 que foram encapsulados ou acoplados a umamatriz sólida e passíveis de degradação ou esvaziamento aolongo do tempo para liberação dos reagentes bloqueadores deBst2 durante períodos de tempo mais longos que através deinjeções. Os reagentes bloqueadores de Bst2 podem tambémser aplicados topicamente na forma de creme ou ungüentopara tratamento de lesões ou doenças de pele.

A presente composição pode ser administrada em umaquantidade farmaceuticamente eficaz.. O termo "quantidadefarmaceuticamente eficaz", conforme é aqui utilizado,,refere-se a uma quantidade suficiente para tratamento dedoenças, que é compatível com uma razão de risco/benefíciorazoável aplicável para tratamento médico. Uma quantidadede dosagem eficaz da composição pode ser determinadadependendo do tipo de doença, gravidade da doença, idade esexo do paciente, atividade da droga, sensibilidade àdroga, tempo de administração, vias de administração, taxasde excreção de uma droga, duração do tratamento, drogasutilizadas em combinação com a composição, e outros fatoresconhecidos nas áreas médicas. A presente composição podeser administrada na forma de agentes terapêuticosindividuais ou em combinação com outros agentesterapêuticos., e pode ser administrada seqüencialmente ousimultaneamente com agentes terapêuticos convencionais. Aadministração pode ser feita em dosagens únicas oumúltiplas. Considerando-se todos os fatores, é importanterealizar a administração com um mínimo de doses capazes deproporcionarem os maiores efeitos sem efeitos adversos, eas doses poderão ser prontamente determinadas por aquelesque são versados na técnica.

A presente invenção não deverá ter seu escopolimitado pelas configurações específicas aqui descritas. Defato, diversas modificações da invenção além daquelas aquidescritas irão tornar-se aparentes para aqueles que sãoversados na técnica com base na descrição aqui dada e nasfiguras que se encontram em anexo. É pretendido que essasmodificações sejam abrangidas no escopo das reivindicaçõesem anexo. Os exemplos a seguir são dados a título deilustração da presente invenção, e não a título delimitação.

Exemplos

Exemplo 1 - Cultura de células

Uma linhagem de células monocíticas humanas U937(ATCC, U.S; Cat. CRL-1593.2) foi cultivada em suspensão emRPMI-1640 (Gibco-BRL) suplementado com soro fetal bovino a10% (FBS; Gibco-BRL), 100 U/ml de penicilina (Gibco-BRL) e100 pg/ml de estreptomicina (Gibo-BRL) a 37° C era umaatmosfera de 5% de CO2.

Uma linhagem de células endoteliais de veiaumbilical humana HUVEC (Cambrex, U.S.; Cat. CC-2517A) foisub-eultivada em midia EGM-2 (Cambrex, U.S.) suplementadacom FBS a 10% a 37° C em uma atmosfera de 5% de CO2. Nosexemplos a seguir, as células foram pré-tratadas com FBS a0,5%, ao invés de FBS a 10%, durante 16 horas. De acordocondições determinadas, as células foram pré-tratadas comgama-interferon recombinante humano {10 ng/ml, Calbiochem,U.S.) e PMA (1 ng/ml, Cambiochem) ou uma midia por umperíodo de tempo previamente determinado.

Uma linhagem celular monocítica murina WEHI-274.1(ATCC, Cat. CRL-1679), e uma linhagem celular endotelialmurina, SVEC 4-10 (ATCC, Cat. CRL-2181), foram cultivadas epré-tratadas de acordo com o mesmo método utilizado naslinhagens celulares humanas.

Uma linhagem de células de linfócitos-T humanasJurkat (ATCC, clone de TIB152) foi cultivada em suspensãoem RPMI-1640 (Gibco-BRL) suplementado com FBS a 10%, 100U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina a 37° C emuma atmosfera de 5% de CO2.

A expressão e purificação de proteínas foramrealizadas com utilização de células CHO-S (Invitrogen,Cat. 11619-012). As células CHO-S foram cultivadas emsuspensão em uma mídia F12/HAM (Gibco-BRL) suplementada comFBS a 10%, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml deestreptomicina a 37° C em uma atmosfera de 5% deC02.

Exemplo 2 - Clonagem de gene de Bst2 humana e gene de Damplmurina

Um vetor de expressão de B-st'2 marcada com histidinafoi construído da forma descrita a seguir. Um cDNA deextensão plena (NM004335) de gene de Bst2 humana foisintetizado pela empresa Origene Technologies (USA), eamplificado por PCR utilizando Pfu ultra HF DNA polimerase(Stratagene) em um volume de 50 μl. Um produto de PCR foiclonado para um vetor pCMV HA (Clontech) utilizando SalI eNotI.

Os vetores para expressão de "decoys"de Bst2 eDampl foram construídos da forma descrita a seguir. A Fig.2 ilustra as localizações de "primers" de PCR utilizadospara clonagem dos "decoys". Um fragmento de DNA codificandoa região extracelular da proteína Bst2 humana foi obtidopor PCR, e foi fundido no terminal-N a uma seqüência desinal P de tPA (tissue Plasminogen activator - ativador dePlasminogêneo de tecido) para promover secreçãoextracelular após ser expressado. O fragmento de DNA foiigualmente fundido no terminal-C a um marcador de seishistidinas para facilitar a determinação de níveis deexpressão de proteína e purificação de proteína. 0 "decoy"de Bst.2 não continha 21 resíduos de aminoácido no terminal-C e também não continha os domínios transmembrana ecitoplásmico. 0 produto de PCR foi tratado com umaconcentração final de 0,8% de dimetil sulfóxido (DMSO;Sigma), foi digerido com BamHI e XbaI, e foi clonado paraum vetor ρCDNA 3.1 (Invitrogen). Em outros experimentos, asseqüências de nucleotídeos de "decoy" de Bst2 humanotiveram otimização de códons para o sistema de expressão emmamífero e os fragmentos de DNA foram sintetizadosquimicamente.

Um cDNA de extensão plena (NM 198095) de gene deDampl murino foi obtido por RT-PCR utilizando-se mRNAisolado de fígado murino. Um produto de RT-PCR foi digeridocom BamHI e XbaI e foi clonado para CDNA 3.1 (Invitrogen)..Urna região de "decoy" foi determinada por análise dehomologia de seqüências de aminoácidos entre Bst2 humana eDampl murina. Como resultado, foram obtidos um vetorexpressando o fragmento de Bst2 solúvel da SEQ ID NO:1 e umoutro vetor expressando o fragmento de Dampl solúvel da SEQID NO:2.

Exemplo 3 - RT-PCR quantitativo em tempo real

Os níveis de expressão intracelular de genesespecíficos foram analisados por RT-PCR quantitativo emtempo real utilizando ABI Prism 7 900HT (Applied Biosystems,Foster City, CA) e um kit de ensaio SYBR-Green. Os"primers" e sondas utilizados foram projetados comutilização de software Primer Express (Applied Biosystems).

10 ng de cDNA de fita única foram dispostos em umtubo de reação e submetidos a PCR TaqMan multiplex (50 μΐ)utilizando o sistema TaqMan Universal PCR Master Mix. Aquantidade relativa de cDNA alvo foi calculada comutilização do método de limiar de ciclo ("Cycle Threshold"- CT) comparativo. Os produtos de PCR foram analisados poreletroforese de gel de agarose.

Os níveis relativos de um gene A específico foram expressados como uma alteração em comparação com umaamostra de controle (células não transfectadas) . Todos osvalores foram obtidos com utilização de um método decálculo 2-CT (Cti-Cto, Cti=CtiA-CtiB, cto=ctoa-CtOB) relativo aum gene de normalização B {gene GAPDH humano) em célulastransfectadas. Cada valor foi obtido de cada amostra emtriplicado. Os experimentos acima foram realizados paraquantificação da expressão do gene de Bst2 e interleucina-2.

Exemplo 4 - Expressão e purificação de um fragmento deproteína Bst2 solúvel ou um fragmento de proteína Damplsolúvel

Para expressão do fragmento de proteína Bst2solúvel ou fragmento de proteína Dampl solúvel preparadoacima., um DNA de vetor foi introduzido transientemente oupermanentemente em células animais específicas. Atransfecção transiente foi realizada por precipitação defosfato de cálcio {CaPO4) , da seguinte forma. 24 horasantes da transfecção, 7xl06 células 293T (ATCC) foramsemeadas em uma placa de cultura de células de 150-mm eforam cultivadas. Uma hora antes da transfecção, o meio decultura foi trocado por mídia IMDM (Cambrex) suplementadacom soro fetal bovino a 2% (FBS; GIBCO-BRL) . 1, . 5 ml detampão TE (1 mM Tris7 OfI mM EDT.A, pH 8,0) contendo 75 μgde DNA e 250 mM de cálcio foi misturado com 1,5 ml detampão HEPES (50 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1,4 mM Na2HPG4, pH7,05), foi incubado durante cerca de 1 minuto à temperaturaambiente, e foi aplicado às células pré-cultivadas. Ascélulas foram incubadas em um incubador de CO2 a 37° Cdurante 6 horas. Após a solução de cálcio/DNA ser removida,as células foram realimentadas com mídia isenta de soro eforam cultivadas adicionalmente por 72 horas ou mais, e omeio de cultura foi então recuperado. Separadamente, umalinhagem de células permanentes foi estabelecida comutilização de Iipofectamina e dihidrofolato reductase commarcador selecionável da forma descrita a seguir. 4 8 horasantes da transfecção, 1,35xl06 células CH0-DUKX-B11 (dhfr")(ATCC) foram semeadas em uma placa de cultura de 100-mm eforam cultivadas em mídia IMDM complementada com FBS a 10%.0,6 ml de mídia IMDM isenta de soro contendo 18 μg de DNAforam misturados com 0,6 ml de mídia IMDM isenta de sorocontendo 54 μΐ de Lipofectamina 2000 (Invitrogen), e foramincubados à temperatura ambiente durante 45 minutos. Amistura de DNA/lipofectamina foi suplementada com 8,8 ml demidia IMDM isenta de soro e foi aplicada às células pré-cultivadas.As células foram incubadas em um incubador deCO2 a 37° C durante 6 horas. 0 meio de cultura foi trocadopor um meio de seleção, midia IMDM contendo FBS de diálisea 10%. Para análise da proteína expressada transientemente,as células foram adicionalmente cultivadas durante 72 horasou mais. 0 meio de cultura foi então recuperado e passadoatravés de um filtro de 0,2 μιη (Millipore). A proteína de"decoy" de Bs t.2 produzida foi analisada por"immunoblotting" utilizando-se um anticorpo policlonalanti-Bst2 (Roche) ou um anticorpo anti-histidina (Roche).

Para expressão em larga escala e purificação dofragmento de proteína Bst 2 solúvel ou do fragmento deproteína Dampl solúvel, foram selecionadas como linhagensde células produção linhagens de células hospedeiras nasquais um vetor de expressão de bst2 ou Dampl foiintroduzido de forma estável, como segue. Células CHOdeletadas em gene de dihidrofolato reductase (DHFR) foramtransfectadas com um vetor de expressão. Na medida em que ovetor de expressão portava o gene de DHFRf a dihidrofolatoreductase foi utilizada como marcador selecionável. Após 48horas, as células CHO transfectadas foram semeadas em umaplaca de cultura de c;células de 96 receptáculos cora umadensidade de IxlO3 células/receptáculo e foram cultivadasem uma mídia contendo 20 nM de metotrexato (MTX) paraamplificação do gene de DHFR. Após duas semanas, a mídiafoi recuperada e submetida a ensaio ELISA com utilização deanticorpo anti-Bst2 para comparação de clones para osníveis de expressão de proteína "decoy" de Bst2. Os clonesque apresentavam níveis de expressão elevados foramselecionados e expostos a concentrações gradualmentecrescentes de MTX até 300 nM para completação deamplificação de genes. Subseqüentemente/ a mídia foicolhida de cada clone e submetida a ensaio ELISA e"immunoblotting" para seleção final de uma linhagem decélulas de produção que apresentava os níveis de expressãomais elevados. Devido ao fato de a proteína "decoy" de Bst2ter sido produzida no meio de cultura em condições deausência de soro, a proteína expressada foi purificada damídia colhida com utilização do marcador de seis-histidinaadicionado ao terminal-C. A purificação de proteína foirealizada por cromatografia de quelação NTA utilizando umacoluna, agarose de quelação NTA CL-6B (Peptron Inc.). Apureza da proteína purificada foi analisada porelectroforese e ELISA, e a quantidade de proteínapurificada foi determinada por um método BCA (Biorad, USA)e espectrofotometria de UV.

A "decoy" de Bst 2 humana e a "decoy" de Damplmurina, purificadas conforme descrito acima, foramanalisadas por 4-20% SDS-PAGE (Fig. 3, painel A). Otratamento de 1% de ditiotreitol (DTT) e N-glicosidase F(Sigma) teve como resultado o "decoy" de Bst2 ser umaglicoproteína dimérica (Fig. 3, painel B) . Os resultadosdos exemplos a seguir foram obtidos usando, entre os"decoys" preparados, um fragmento de proteína Bst2 solúvelpossuindo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 e umfragmento de proteína Dampl solúvel possuindo a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID NO:2.

Exemplo 5 - Avaliação do efeito da proteína Bst2 naagregação homotípica de células U937

Exemplo 5-1 - Alteração de níveis de expressão deBst2 durante a agregação a células U937

Os níveis de expressão de proteína Bst2 foramexaminados durante a agregação de células monocíticashumanas U937. IxlO6 células U937 foram tratadas com PMA (2ng/ml) e LPS (10 μg/ml) durante 24 horas para indução deagregação homotípica de células U937, e foram observadasquanto ao grau de agregação homotípica de células em ummicroscópio de sistema invertido de contraste de fase(Olympus 1X71, USA). Para determinação do grau de agregaçãode células, o tamanho dos agregados de células formados foimedido como intensidade de pixel, com utilização dosoftware Adobe Photoshop, versão 7.0. Os valores de desviopadrão apresentados em desenhos foram calculados de valoresmédios de seis agregados selecionados aleatoriamente.Subseqüentemente, todas as células usadas foramrecuperadas, e o RNA total foi isolado e submetido a RT-PCRutilizando-se um conjunto de "primers" das SEQ ID NOS:3 e 4para avaliação dos níveis de expressão de Bst2.

Oligômero "sense": 5' -TTTTCTCTTCTCAGTCTC-3' (SEQ IDNO: 3)

Oligômero "antisense": 5'- GCATCTACTTCGTATGAC-3' (SEQID NO:4)

Uma hora após as células U937 terem sido tratadascom PMA e LPS para indução de agregação homotípica, aexpressão de B st.2 intracelular aumentou em cerca de trêsvezes. Este nível aumentado foi mantido por 24 horas. Estesresultados indicam que a expressão genética de Bst2 aumentadurante a agregação homotípica de células U937 (Fig. 4).

Exemplo 5-2 - Efeito de Bst2 na agregação homotípicade células U937

Para determinar se o aumento de expressão de genede Bst2 é essencial para agregação homotípica de célulasU937, foi avaliada a agregação de células quando a proteínaBst2 foi sobreexpressada.

1xlO6 células U937, cultivadas nas condiçõesanteriormente mencionadas, foram semeadas em uma placa decultura de células de 96 receptáculos (NUNC) e foramtratadas com PMA (2 ng/ml, Calbiochem) e LPS (10 μς/πιΐ,Ca Ibi o-ch em.) durante 24 horas. As células foram entãoobservadas quanto ao grau de agregação homotípica decélulas em um microscópio de sistema invertido de contrastede fase (Olympus 1X71, state, USA).

A proteína Bst2 propriamente dita não induziuagregação de células U937, ao passo que o tratamento comPMA/LPS estimulou agregação homotípica de células U937. Asobreexpressão transiente de Bst2 aumentou a agregaçãohomotípica de células U937 estimuladas com PMA/LPS em cercade quatro vezes (Fig. 5) . Estes resultados indicam que aexpressão de Bst2 promove agregação homotípica dosleucócitos monocíticos ativados.

Exemplo 5-3 - Inibição de agregação homotípica decélulas U.937 com utilização de "decoy" de Bst2

Para confirmar se o aumento de expressão de gene deBst2 é essencial para agregação homotípica de células U937,a agregação de células foi avaliada quando a ação daproteína Bst2 foi suprimida.

As células U937 foram pré-tratadas com PMA e LPSpara indução de agregação de células, e foram tratadas comdiluições seriais de mídia (mídia de "decoy") contendo um"decoy" de Bst2 expressado transientemente em células CHO-S. Foi observado que o "decoy" de Bst2 reduziu a agregaçãode células U937 induzida por PMA e LPS em 50% em comparaçãocom a cultura (mídia de controle) de células CHO-S nãoexpressando o "decoy" de Bst2 (Fig. 6) . Estes resultadosindicam que o "decoy" de Bst2 inibe agregação horaotipica decélulas U937.

Exemplo 6 - Avaliação do efeito da proteína Bst2 naagregação heterotípica entre dois tipos de célulasdiferentes

Exemplo 6-1 - Inibição de agregação entre célulasU937 de HUVECs utilizando "decoy" de Bst2

HOVECs (I-SxlO4 células/ml) foram semeadas sobreuma placa de cultura de células de 12 receptáculos. Após umdia, a mídia foi trocada por uma mídia de baixo teor desoro contendo 0,5% FBS7 e as células foram pré-tratadas comgama interferon (IFN-γ; Calbiochem) em uma concentraçãofinal de 10 ng/ml durante 24 horas. Em seguida, as HUVECspré-tratadas foram co-cultivadas com células U937 (2xl06células/ml, 500 μΐ) a 37° C durante 4 horas. A co-culturafoi lavada com tampão de fosfato três ou quatro vezes, e ascélulas restantes foram fixadas com 4% de paraformaldeído eforam observadas ao microscópio.

As células U937 apresentaram uma redução de ligaçãoa HUVECs tratadas com IFND.-quando a mídia contendo "decoy"de Bst2 foi adicionada à cultura. Na mídia de controledesprovida de "decoy" de Bst2, as células U937 ligaram-seeficientemente a HUVECs tratadas com IFND.e formaramagregados de células heterotípicas. O tratamento de umamídia de controle ou albumina não afetou a agregaçãocelular (Fig. 7) . Na Fig, 7, HUVECs de "mídia normal" nãopré-tratadas com IFN-γ não se ligaram a células U937. Emcontraste, as HUVECs tratadas com IFN-γ ligaram-se acélulas U937 e formaram agregação de células heterotípicas.As HUVECs tratadas com uma mídia contendo proteína "decoy"de Bst2, obtidas da cultura pré-tratada com IFN-γ,apresentaram uma agregação reduzida a células U937. Otratamento de uma mídia básica ou albumina não afetou aagregação celular (Fig. 7) . Na Fig. 7, uma "mídia normal"indica uma mídia geral contendo FBS, e uma "mídia decontrole" indica um fluido de cultura de células nãoexpressando uma proteína "decoy" de Bst2. Adicionalmente, aagregação heterotípica de células foi inibida de forma aser dependente da concentração de "decoy" de Bst2 (Fig. 8).

Exemplo 6-2 - Inibição de agregação entre célulasU937 e HUVECs utilizando siRNA de Bst2

Diversas moléculas de siRNA atuando de uma formaespecífica para Bst2 foram construídas (QIAGEN). Foiconstruído um total de 23 moléculas de siRNA específicaspara Bst2.

Os resultados do teste abaixo foram obtidos comutilização de siRNA consistindo em urna fita de RNA"antisense", complementar ao mRNA de Bst2 codificado pelaseqüência da SEQ ID NO: 5., e uma fita de RNA "sense"complementar à fita de RNA "antisense",.HUVECs foram transfectadas com um vetor deexpressão para Bst2, tratadas com ou sem IFN-D esubseqüentemente transfectadas com siRNA de Bst2. Estascélulas foram avaliadas quanto a adesão a células U937 .

Seqüência alvo: 5'- AAGCGTGAGAATCGCGGACAA-3' (SEQ IDNO: 5)

Oligômero "sense": 5'-r (UUGUCCGCGAUUCUCACGC) d (TT) -3'(SEQ ID NO:6)

Oligômero "anti sense": 5'-r(GCGUGAGAAUCGCGGACAA)d (TT)-3' (SEQ ID NO:7)

A Bst2 expressada exogeneamente promoveu ligação decélulas U937 a HUVECs tratadas com ou sem INF-γ. 0tratamento com siRNA de Bst2 produziu como resultado umdecréscimo de adesão a células U937 (Fig. 9) . Juntamentecom os dados ilustrados na Fig. 29 demonstrando o efeitoinibidor de siRNA de Bst2 na adesão celular entre HUVECsnão transfectadas e células U937, estes resultados sugeremque a Bst2 desempenha um papel na adesão HUVEC-U937.Exemplo 7 - Avaliação do efeito da proteína Bst2 naagregação homotípica de linfócitos T e atividade daagregação

Exemplo 7-1 - Efeito da sobreexpressão de Bst2 naagregação homotípica de linfócitos T e produção de IL-2

Células T Jurkat humanas foram induzidas paraformação de agregação homotípica de células e foramativadas da forma descrita a seguir.

Quando células Jurkat f5xl05 células/ml) foramincubadas com um anticorpo monoclonal anti~CD3 (0KT3: 10μς/ml, BD Pharmingen) a 4o C durante 20 minutos esubseqüentemente com anticorpo policlonal anti-imunoglobulina murina (25 pg/ml, Zymed) a 37° C durante 1hora, ocorreu agregação de células., e as células foramativadas e induzidas a produzirem interleucina-2 (IL-2)(Figs. 10 e 11). De acordo com o mesmo método, quando foiinduzida sobreexpressão de proteína fluorescente verde("Green Fluorescent Protein7' - GFP) , não ocorreu nenhumefeito. Em contraste, quando células Jurkat foramtransfectadas com um vetor de sobreexpressão de Bst2 eforam induzidas a se ativarem, a agregação homotipica decélulas aumentou (Fig. 10, painel A). Os niveis de mRNA deIL-2 após ativação de células T foram medidos por RT-PCR emtempo real (Exemplo 3) . A expressão de mRNA de IL-2 foielevada em cerca de duas vezes com sobreexpressão de Bst2,em comparação com resultado obtido com sobreexpressão deGFP (Fig. 10, painel B).

Exemplo 7-2 - Efeito de "decoy" de Bst2 e siRNA deBst2 na agregação homotipica de linfócitos T e produção deIL-2

Células Jurkat foram pré-tratadas com um "decoy" deBst2 30 minutos antes da ativação, e foram ativadas comutilização de anticorpo monoclonal anti-CD3, e foramavaliadas quanto a inibição de agregação de células. Ascélulas foram tratadas com uma quantidade relativa dediluições seriais de um fluido de cultura de célulasanimais contendo um xMecoy' de Bst2. O tamanho dosagregados foi representado como uma razão relativamente aotamanho dos agregados de um grupo sem tratamento.

O pré-tratamento com "decoy" de Bst.2 na condição deativação produziu como resultado uma redução significativade agregação de células Jurkat. Adicionalmente, a expressão3 vezes aumentada de IL-.2 por ativação de células Jurkatfoi novamente decrescida para o nível basal pelo tratamentocom vVdecoy" de Bst2 (Figs. 11 e 12).

Os dados aqui apresentados indicam que a Bst2 éimportante para inflamação e imunidade. 0 bloqueio dafunção de Bst2 pode reduzir doenças induzidas porinflamações. Em sujeitos com comprometimentos do sistemaimune tais como pacientes de AIDS e pacientes comdeficiências imunes, o acréscimo de sinalização imunepoderá beneficiá-los. Uma proteína de fusão bivalentecomposta de "decoy" de Bst2 e uma outra molécula Y, quepode ser uma proteína ou um composto, poderá agir comoadaptador forçando a interação e sinalização entre a célulaque expressa ligante de Bst2, e uma outra célula queexpressa o receptor para Y. Vide a Figura 35.

Exemplo 8 - Avaliação da ação de "decoy" de Bst2 em ummodelo muri.no de asmaExemplo 8-1 - Indução de asma em camundongosFoi preparado um modelo murino de asma mediantesensibilização de camundongos (C57B6, 8 semanas) comovalbumina. Em maior detalhe, os camundongos foraminicialmente sensibilizados durante cinco dias contínuosmediante injeção intranasal de ovalbumina. Após trêssemanas, os camundongos foram novamente sensibilizados porvia intranasal com ovalbumina durante cinco dias contínuos.Uma semana após a sensibilização secundária, foi impostaovalbumina aos camundongos por via nasal três vezes a cada24 horas para indução de asma. Neste caso, um "decoy" deBst 2 foi injetado por via intravenosa em camundongos 30minutos anteriormente à sensibilização com ovalbumina, efoi injetado em camundongos 30 minutos anteriormente àprimeira sensibilização e à última injeção de ovalbumina.Três dias após a última injeção, foram colhidos doscamundongos amostras de soro, tecidos dos pulmões esimilares.

Exemplo 8-2 - Alterações induzidas por "decoy" deBst2 do número de células imunes sedimentadas

Em camundongos sensibilizados com ovalbumina etratados com um "decoy" de Bst2, o número total de célulasde infiltração e um número de cada tipo de célula(neutrófilos, eosinófilos e linfócitos) foram

significativamente reduzidos no fluido de irrigaçãobroncoalveolar (Fig. 13) .Exemplo 8-3 - Efeito de "decoy" de Bst2 na produçãode citocinas

Quando um "decoy" de Bst2 ou de Dampl foi injetadoem um modelo murino de asma induzida por sensibilização eataque com ovalbumina, os níveis de expressão de citocinas(interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) einterleuci:na-13 (IL-13) ) foram medidos da forma descrita aseguir. Após irrigação broncoalveolar, foram excisadostecidos dos pulmões de camundongos, e foram isoladasproteínas dos tecidos dos pulmões.. Foram isoladas proteínascitosólicas mediante utilização de tampão de Iise contendoNP-4 0. As proteínas isoladas foram separadas em um gel SDS-PAGE gel, e foram transferidas para uma membrana de PVDFpor um método de transferência úmida. 0 "blot" foi incubadoem uma diluição de 1:1000 de cada um de vários anticorposprimários (anticorpo anti-IL-4 (Setotec Inc.), anticorpoanti-IL-5 (Santa Cruz Inc.), anticorpo anti-IL-13 (R&DInc.), e anticorpo anti-actina (Sigma Inc.)). Os anticorposprimários ligados foram detectados com um anticorposecundário HRP-conjugado (IgG anti-HRP-conjugado de coelho)utilizando reagente ECL. Foi observado que os níveis decitocinas tais como IL-4, IL-5 e IL-13 aumentaram no tecidopulmonar de camundongos com asma induzida porsensibilização e ataque com ovalbumina. Além disso, quandoos camundongos asmáticos sensibilizados com ovalbuminaforam injetados com uma proteína "decoy' de Bst2, os níveisde citocina diminuíram com o aumento de doses da proteína"decoy". Estes resultados indicam que a proteína "decoy" deBst2 possui um efeito terapêutico na asma --(Fig. 14) .

Exemplo 9 - Avaliação de similaridade funcional entreproteína Bst2 humana e proteína Dampl murina

Existe cerca de 35% de similaridade de seqüênciasde aminoácidos entre a proteína Bst2 humana e a proteínaDampl murina. Neste contexto, foi examinado se as duasproteínas apresentariam uma similaridade funcional emensaios de adesão célula—célula realizados In vitro e nomodelo murino de asma in vivo. As proteínas Bst2 humana deDampl murina foram examinadas quanto a um efeito inibidorde adesão entre HUVECs tratadas com IFM-γ e células U937 deacordo com o mesmo método do Exemplo 6.

Exemplo 10 — Preparação de anticorpo policlonal anti—Bst2

As proteínas "decoy" de Bst2 e Dampl purificadasexpressadas em células CHO-S foram misturadas com umadjuvante Ribi em uma razão de 1:1, e foram injetadas emcoelhos com intervalos de tempo de duas semanas. Durante aimunização foram colhidas amostras de sangue, que foramexaminadas quanto a produção de anticorpos. Após trêsimunizações, foram obtidas amostras de soro de coelhos. 0anticorpo policlonal anti-Bst2 foi purificado porcromatografia de afinidade com utilização de uma coluna emque a proteína Bst2 foi ligada a um suporte imobilizado.Exemplo 11 - Preparação de formas PEG-conjugadas paraaperfeiçoamento de metabolismo de "decoy" de Bst2

Exemplo 11-1 - Preparação de formas PEG-conjugadas

A conjugação com PEG foi realizada por dois tiposde PEG: (1) PEG de aldeido e (2) PEG de carbonato desuccinimidila .(Fig.. 17) . Em primeiro lugar, foi realizada aconjugação de PEG de aldeido, da seguinte forma. 1 mg deproteína "decoy" de Bst2 foi submetida a diálise em 0,1 Mde tampão de fosfato (pH 7,5), e foi misturada com umarazão molar de 30 vezes de (mPEG12000-OCH2COGly-Gly) 2 (ácido2, 4-diamino butílico)-PEG1-NHS, com subseqüente incubação àtemperatura ambiente por 2 horas com agitação,.Separadamente, para conjugação de PEG de carbonato., 1 mg deproteína "decoy" de Bst2 foi submetido a diálise em 0,1 Mde tampão de fosfato (pH 5,0), e foi misturado com umarazão molar de 20 vezes de PEG de carbonato desuccinimidila, com subseqüente incubação à temperaturaambiente por 2 horas com agitação. Após a reação sercompletada, foram isolados e purificados "decoys" de Bst2PEG-conjugados utilizando uma coluna de exclusão de tamanho(Superdex-200, Pharmacia), que foram submetidos a diáliseem 50 mM de tampão de fosfato (pH 7,4).

Exemplo 11-2 - 0 efeito intensif icador de formasPEG-conjugadas na estabilidade in vivo de "decoy" de Bst2

As formas PEG-conjugadas de "decoy" de Bst2,preparadas no Exemplo 11-1, foram injetadas na veia dacauda de ratos machos Sprague-Dawley com 7 semanas de idadeem uma dose de 0,4 até 2 mg/kg. Um grupo de controlenegativo foi injetado com uma dose igual de sorofisiológico salino. Além disso, uma dose igual de proteína"decoy" de Bst2 foi utilizada como controle positivo, foramcolhidas amostras de sangue anteriormente à administraçãoda droga, e 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas após aadministração da droga, da veia jugular, com utilização deuma cânula. As amostras de sangue colhidas foram submetidasa análise por ELISA.. Uma placa de 96 receptáculos foirevestida com um anticorpo anti-"decoy" de Bst2 (100 ng/mlem PBS) a 4o C durante 8 horas ou mais, e foi bloqueada comalbumina em PBS a 37° C durante 2 horas. A placa foireagida com uma diluição adequada de soro de rato ou"decoy" de Bst2 (amostra padrão) a 37° C durante 2 horas. Aplaca foi então reagida com um anticorpo monoclonal (mAbconjugado com peroxidase de rábano, Roche Inc.)reconhecendo o marcador de histidina adicionado aoterminal-C de "decoy" de Bst2 a 37° C durante 2 horas. Apósser bem lavada, a placa foi tratada como urna substância deperoxidase, e a absorvência foi medida a 450 nm. Aquantificação dos "decoys" de Bst2 PEG-conjugados presentesno sangue foi realizada com utilização das amostras padrão(Fíg. 18). Na Fig. 18, "20ΓΒ-Η" indica uma amostra de"decoy" de Bst2 humana, e "201B-HP" indica uma amostra de"decoy" de Bst2 humana PEG-conjugada com aldeído.

Exemplo 12 - Expressão e distribuição de Bst2 em doençasassociadas com inflamações

Foram obtidos tecidos de pacientes com diversasdoenças inflamatórias para investigação da expressão edistribuição de Bst2. Os tecidos obtidos incluíram: tecidopulmonar de paciente asmático, tecido de vaso sangüíneoarterial de paciente aterosclerótico, lesões de pele depaciente com psorlase, tecido do intestino de paciente comdoença de Crohn, tecido de intestino/cólon de paciente comulcerações, tecido do estômago de paciente com gâstritecrônica ativa, e tecido do ceco de paciente com apendiciteaguda. Cada tecido foi selecionado como lesãorepresentativa apresentando fenótico típico de inflamação.

Para asma, um bloco de parafina do tecido pulmonar,preparado por fixação do tecido pulmonar em formaldeído a10% e embutimento do tecido em parafina, foi seccionado comuma espessura de I7S μιη, e foi montado em lâminas de vidro.

As lâminas foram manchadas com hematoxilina e eosina parainvestigação das alterações no tecido pulmonar de acordocom alérgeno e administração de droga. Foi realizado histo-manchamento com o anticorpo policlonal preparado no Exemplo10. Outros tecidos foram preparados de uma maneira similar.

Em comparação com o tecido normal, a proteína Bst2 foisobreexpressada em doenças associadas com inflamações. Foidetectada Bst2 era células imunes, células endoteliaisvasculares e outros tipos de células (Fig. 19).

Exemplo 13 - Cultura de Células

Foi realizada cultura de células conforme seencontra descrito no Exemplo 1.

Exemplo 14 - Construção dos vetores de expressão para"decoy" de Bst2 humana e fusões "decoy" de Bst2-Fc

Foram preparados constructos de fusão com base novetor de expressão pCDNA 3.1 ou outros vetores DHFRdisponíveis comercialmente.

A Fig. 20 ilustra um diagrama de fusões de "decoy"de Bst2 e outras fusões Fc. Estas são representaçõesesquemáticas de possíveis proteínas de fusão. Fazendoreferência à Fig. 20., a Fig. 20A ilustra o "decoy" de Bst2propriamente dito, a Fig. 2 OB ilustra o "decoy" de Bst2fundido à parte de articulação CH2-CH3 de um Fc de cadeiapesada de IgG com expressão separada de "decoy" de Bst2para formação de um dímero de "decoy" de Bst2 na cabeça decada proteína de fusão.. Ά Fig. 20C ilustra uma forma em queé expressada fusão Bst2-kappa em concordância com a fusãoBst2-IgG Fc para permitir a formação estável de dímero de"decoy" de Bst2 na cabeça de cada proteína de fusão que éestabilizada através da ligação de dissulfito de cadeiakappa-cadeia pesada de IgG de ocorrência natural. A Fig.2OD ilustra urna forma em que "decoy" de Bst2-IgG Fc éexpressado sem outras contrapartidas de dimerização deBst2. A dimerização da parte de articulação CH2-CH3 dafusão ocorre em cada caso era que a parte de Fc de IgG éexpressada devido à ligação de dissulfito de ocorrêncianatural entre estas cadeias..

A Figura 21 ilustra mapas de vetores de proteínasde fusão "decoy" de Bst2-IgG Fc descritas acima. Encontram-se ilustrados vetores de expressão representativosapresentando os vetores de expressão para as fusões IgGl eIgG2 Fe. A Fig. 2IA ilustra "decoy" de Bst2 (dBst2) . 0vetor de expressão de "decoy" de Bst2 foi construídomediante clonagem por PCR de um sitio 5' de Xbal do inícioda proteína "decoy" com um peptídeo de sinalização tPA determinal-N e marcador-His de terminal-C seguido por umsítio BamHl na extremidade 3'; este inserto foi clonadopara pcDNA3.1 cortado com Xbal e BarnHl. A Fig. 2IB ilustraa fusão dBst2-IgGlFc. A região de articulação CH2-CH3 decadeia pesada de IgGl foi clonada por PCR e fundida àextremidade de terminal-C do "decoy" de Bst2 com um sítio5' Xhol e um sítio 3' Not 1; este inserto foi clonado parapcDNA3.1 cortado com Xhol e Notl. A Fig. 2IC ilustra umafusão dBST-kappa. A região constante da cadeia leve de IgGkappa foi clonada por PCR e fundida à extremidade determinal-C de "decoy" de Bst2 com um sítio 5' Xhol e umsítio 3' Not1; este inserto foi clonado para pcDNA3.1cortado com Xhol e Notl. (d) Fusão dBST2-IgG2HC. A regiãode articulação CH2-CH3 de cadeia pesada de IgG2 foi clonadapor PCR e fundida à extremidade de terminal-C de "decoy" deBst.2 com um sitio 5' Xhol e um sitio 3' Not 1; este insertofoi elonado para pcDNA3.1 cortado com Xhol e Notl.

Exemplo 15 - Construção de vetor

Um vetor de expressão de "decoy" de Bst2 marcadocom histidlna foi construído da seguinte forma.

Fragmentos de gene de imunoglobulina foram clonadosde uma biblioteca de cDNA de células de sangue humano(Clontech) por PCR: A região Fc (articulação, região CHl eCH2) de cadeia pesada de IgGl humana (Genbank No:BC089417. , "primers" 1, 2), a região constante de cadeiakappa de imunoglobulina humana (Genbank No: BCO67O92,"primers" 3, 4), e a região constante (CHl-articulação-CH2-CH 3) de cadeia pesada de IgG2 humana (Genbank No: AJ294731,"primer" 5, 6) . As seqüências de "primers" de PCRutilizadas para clonagem do fragmento são as seguintes.

Seqüência 1

201-H-5': 5' - ctc cca gga cga gcc caa ate ttg - 3'(SEQ ID NO:8)

Seqüência 2

201-IgGl-3' : 5' - ggcggccgc TCA ttt acc cgg gga -3' (SEQ ID NO:9)

Seqüência 3

201-L-5' : 5' - ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc - 3'(SEQ ID NO:10)

Seqüência 42 Ol-kappa-3'': 5' - ggcggccgc TTA aca ctc tcc cct -3' (SEQ ID NO:11)

Seqüência 5

201-H2-5': 5'- ctc cca gga cgc ctc cac caa ggg - 3'(SEQ ID NO:12)

Seqüência 6

20.l-IgG.2-3' : 5' - ggcggccgc TCA ttt acc cag aga -3' (SEQ ID NO:13)

Exemplo 16 - Constructos de fusão de "decoy" de Bst2 humana-Fc (IgGl, 2, e 4)

Três diferentes constructos de fusão de "decoy" deBst2 humana-Fc foram clonados para o vetor de expressãoρCDNA3.1 (Invitrogen). Um fragmento de DNA codificando aregião extracelular de proteína Bst2 humana foi obtido porPCR, e foi fundido no terminal-N à seqüência de peptideo desinalização de tPA para promover secreção extracelular apósa expressão. O fragmento extracelular de Bst2 foiigualmente fundido no terminal-C à região Fc de IgGl deIgGl, IgG2 e IgG4 ou à região constante de cadeia kappa. 0produto de PCR de sobreposição foi digerido com XhoI eNotI, e foi clonado para o vetor pcDNA3.1 (Invitrogen).Estes fragmentos fundidos foram produzidos por PCR desobreposição e os "primers" foram conforme se encontraindicado a seguir, e designados como "peDNA-dBST2-IgG1Fc","pcDNA-dBST2-kappa", e "pcDNA-dBST2-IgG2HC" ou ρcDNA-dBST2-IgG4Fc.Exemplo 17 - Estratégia de clonagem de PCR e fusãoa estratégia de clonagem e fusão encontra-seexposta na Fig. 22. Foram utilizados os seguintes"primers".

Seqüência 7

tPAsig_XhoI_Fw.: 5' - cgctcgagacagccatcATGgatg - 3'(SEQ ID NO:14)

Seqüência 8

201-H-5': 5' - ctc cca gga cga gcc caa ate ttg - 3'(SEQ ID NO:15)

Seqüência 9

201-H-3': 5' - ttg ggc tcg tcc tgg gag ctg ggg - 3'(SEQ ID NO:16)

Seqüência 10

201-IgGl-3' : 5' - ggcggccgc TCA ttt acc cgg gga -3' (SEQ ID NO:17)

Seqüência 11

201-L-5': 5' - ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc - 3'(SEQ ID NO:18)

Seqüência 12

201-L-3': 5' - acc gta cgg tcc tgg gag ctg ggg - 3'(SEQ ID NO:19)

Seqüência 13

201-kappa-3' : 5' - ggcggccgc TTA aca ctc tcc cct -3' (SEQ ID NO:20)

Seqüência 14201-Η2-5' : 5' - etc cca gga cgc ctc cac caa ggg -3' (SEQ ID NO:21)

Seqüência 15

201-H2-3' : 5' - gtg gag gcg tcc tgg gag ctg ggg -3' (SEQ ID NO:22)

Seqüência 16

201-IgG2-3' : 5' - ggcggccgc TCA ttt acc cag aga -3' {SEQ ID NO:23)

Seqüência 17

201-H4-3' ; 5' -cat att tgg act cgt cct ggg agc-3'(SEQ ID NO:24)

Seqüência 18

201-H4-5'; 5' -ctc cca gga cga gtc caa ata tgg tccc-3' (SEQ ID NO:25)

Seqüência 19

201-IgG4-3'; 5 ' -ggc ggc cgc TCA ttt acc cag agacag g-3' (SEQ ID NO:26)

Exemplo 18 - Expressão de proteínas de fusão de "decoy"-Fcsolúveis

Foram preparadas proteínas de fusão de "decoy" deBst2-Fc após transfecção transiente conforme descrito noExemplo 4. Linhas de células estáveis expressando "decoy"de Bst2 e proteínas de fusão de "decoy" de Bst2-Fc foramestabelecidas conforme descrito no Exemplo 4. Foi realizadaexpressão e purificação em larga escala conforme seencontra descrito no Exemplo 4.Exemplo 19 - PAGE de "decoy" de Bst2 purificado e outrasfusões Fc

Proteínas de fusão Fc foram purificadas do meio decultura. Após concentração por ultra-filtração, foiutilizado um processo de cromatografia de duas etapas,incluindo cromatografia de afinidade de Proteína A(Amersham Biosciences, MabSelect) e cromatografia deexclusão de tamanho (Amersham Bioscrences., Superdex 200) .

As proteínas de fusão Fc foram carregadas em umacoluna carregada com proteína A previamente equilibrada comtampão PBS (1,06 mM de fosfato de potássio monobásico,155,17 mM de cloreto de sódio, 2,97 mM de fosfato de sódiodibásico, pH 7,4). A coluna foi lavada com uma quantidadede excesso de PBS para remoção de contaminantes. Osanticorpos ligados foram eluídos por tampão de baixo pH,tal como 50 mM glicina-HCl com utilização de um gradientede etapa e foram neutralizados com volume igual de IM Tris(pH 8,0).

Uma etapa adicional de cromatografia de exclusão detamanho foi empregada para remoção de multímeros deimunoglobulina. A mistura de multímeros de anticorpopurificada foi carregada em uma coluna Superdex 200previamente equilibrada com PBS (pH 7,4).. A taxa de fluxolimiar do tampão foi selecionada de taxas dentro da faixade 50 cm/h até 150 cm/h.

A Fig. 23 ilustra um gel de PAGE representativo(gel de gradiente 4-12%, Invitxogen) marcado com Coomassieapresentando diversas proteínas de fusão de Bst2 após apurificação de afinidade. A Fig. 23B mostra que formasmultiméricas de alto peso molecular podem ser removidas porcromatografia de exclusão de tamanho apropriada.

Exemplo 20 - Ligação direta de "decoy" de Bst a célulasimunes

Placas de 96 receptáculos do fundo plano foramrevestidas com Mecoy " de Bst2 com bicarbonato de sódio(100 mM, pH 9,5) durante 2 horas a 37° C. As placas foramlavadas com PBS (pH 7,4) e incubadas com albumina de sorobovino a 1% (BSA) a 25° C. Após enxagüamento com PBS CpH7,4) contendo 1 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2, foramadicionadas células U937 (1 χ IO6 /ml) a cada receptáculorevestido com dBst2. Após 2 horas de incubação a 37° C, ascélulas não ligadas foram removidas por duas lavagenssuaves com mídia RPMI1640 (Gibco-BRL) e as células ligadasforam fixadas com paraformaldeído a 2% durante 20 minutos,foram lavadas e marcadas com violeta cristal a 0,5%. Após30 minutos a 25° C, as placas foram lavadas com PBS e foirealizada a contagem das células ligadas.

A Fig. 24 ilustra a ligação direta de Mecoy" deBst2 a células U937. As células U937 foram acopladas aosreceptáculos contendo Mecoy" de Bst2 mas não contendo BSA.

Exemplo 21 - Meia-vida plasmática de fusões de "decoy" deBst2-Fc

A Figura 25 ilustra a meia-vida plasmática de"decoy" de Bst2 ou fusões Fe. A proteína "decoy" de Bst2fundida a diversas regiões Fc de IgG de estabilizaçãodemonstrou uma maior estabilidade sérica, conforme seencontra indicado por um gráfico farmacocinéticorepresentativo para duas fusões de "decoy" de Bst2-IgGl emcomparação com "decoy" de Bst2 simplesmente.

Para determinação da meia-vida plasmática de"decoy" de Bst2 ou outras fusões Fc, ratos (machos Sprague-Dawley) foram cirurgicamente implantados com cateteresintravenosos. durante sessões subseqüentes, os cateteresforam acoplados a uma bomba de infusão.. A amostra deproteína foi administrada por infusão manual durante 1minuto através de cateteres lavados com solução salinaheparinizada para redução do risco de formação de coágulos..0 final da infusão foi designado como tempo 0. Amostras desangue {0,4 ml) foram retiradas dos cateteres em diversospontos no tempo. 0 plasma foi separado por centrifugação eaplicado a um ensaio ELISA de sanduíche para determinaçãoda concentração plasmática de "decoy" de Bst2 ou outrasproteínas de fusão Fe. Os receptáculos em uma placa de 96receptáculos foram revestidos (100 μΐ/receptáculo) com umasolução de 5ug/ml de anticorpo policlonal anti-Bst2 decoelho em 50 πιΜ de tampão de carbonato (pH 9,2) ebloqueados com 1% BSA/PBS. Cada amostra de plasma diluídapara se situar na faixa linear da curva padrão foi incubadaa 25° C durante 90 minutos. Após lavagem com PBS, osreceptáculos foram incubados com anti-IgG humano de bodemarcado com peroxidase de rábano (diluição de 1:50.000,especifico para Fc, Sigma, Cat. No. A-0170) à temperaturaambiente durante 1 hora e foram subseqüentemente tratadoscom substrato TMB (Pierce). As placas foram lidas a 4 50 nmem um leitor de placa e os dados foram analisados comutilização do programa de ajuste de curva de quatroparâmetros. Para curva padrão para cada proteína diferente,cada padrão de proteína purificada foi utilizado na soluçãode 1% BSA, 1% soro pré-imune de rato com concentraçõesapropriadas.

Exemplo 22 - Inibição de fusões "decoy" de Bst2-Fc naligação entre "decoy" de Bst2 e células

As proteínas de fusão "decoy" de Bst2-IgG Fcdemonstram uma inibição dependente de concentração deligação de células U937 a placas de cultura de célulasrevestidas com "decoy" de Bst2 indicando que as proteínasde fusão de "decoy" de Bst2-IgG Fc são funcionais.

A inibição competitiva de proteínas de fusão Fc naligação entre "decoy" de Bst2 e células foi medida da formaindicada a seguir. Placas de 96 receptáculos de fundo planoforam revestidas com "decoy" de Bst2 (50 ug/ml) combicarbonato de sódio (100 mM, pH 9,5) durante 2 horas a 37°C. As placas foram lavadas com PBS (pH 7,4) e incubadas coma Ibumina de soro bovino a 1% (BSA) a 25° C. Apósenxagüamento com PBS (pH 7,4) contendo 1 mM de CaCl2 e 0,5mM de MgCl2, foram adicionadas células U937 (1 χ IO6 /ml) acada receptáculo revestido com Bst2. Anteriormente àadição, as células foram pré-incubadas com proteínas defusão de "decoy" de Bst2-Fc durante 2 horas a 31° C. Ascélulas ligadas foram contadas conforme foi descrito noExemplo 20.

Exemplo 23 - Efeito de fusões de "decoy" de Bst2-Fc em ummodelo murino de asma

Foi preparado um modelo murino de asma conforme seencontra descrito no Exemplo 8-1.

O efeito das fusões de "decoy" de Bst2-Fc eminfiltração de células imunes foi avaliado conforme seencontra descrito no Exemplo 8-2. Quando camundongossensibilizados com ovalbumina foram tratados com um "decoy"de Bst2, o número total de células de infiltração foireduzido, e particularmente os números de neutrófilos,eosinófilos e linfócitos com exceção da macrófagos foramreduzidos em irrigação bronco-alveolar ("BronchoalveolarLavage" - BAL) (Fig. 27).

A expressão de Il-4y IL-5 e IL-13 foi medida nomodelo murino de asma conforme se encontra descrito noExemplo 8-3 após injeção de "decoy" de Bst2 ou proteínas defusão de "decoy" de Bst2-Fe. O nível destas citocinas foireduzido sugerindo que as proteínas "decoy" de Bst2 possamter efeitos terapêuticos na asma (dados não ilustrados.) .

Exemplo 24 - Criação de camundongos de Bst 2 quiméricohumaηo-murino

É criado um camundongo Bst2 quimérico humano-murinoutilizando o tipo de constructo exemplificado na Fig. 28. Éilustrado o vetor de direção a alvo que substitui o domínioextracelular e terminal-C de Bst2 (Dampl) murina com odomínio extracelular e terminal-C de Bst2 humana a serutilizado para recombinação homóloga em células troncoembrionárias ("Embryonic Stem" - ES) ou outras células decamundongos. Uma recombinação homóloga adequada envolverecombinação homóloga nos braços de flanqueamentoilustrados (x) e células com uma adequada recombinaçãohomóloga seriam resistentes a seleção (por exemplo,Neomicina ou G418 ou outro marcador de seleção utilizado).As células com recombinação homóloga adequada sãoselecionadas por triagem alternativamente com "SouthernBlotting" ou PCR após seleção para a Neomicina (G418) , queé um marcador exemplificado. Podem ser utilizados outrosmarcadores de seleção. Para eliminação da Neomicina, ouqualquer outro marcador, no vetor de direcionamento a alvo,é possível alternativamente transfectar células ESrecombinadas com um vetor de expressão para Cre recombinaseanteriormente à produção de camundongos quiméricos ou épossível cruzar os camundongos quiméricos com um camundongoque expresse Cre recombinase. Os camundongos quiméricospodem ser gerados utilizando-se as células ES recombinadasatravés de técnicas convencionais para geração decamundongos "knock-out", "knock-in" ou outros tipos decamundongos transgênicos. Na medida . em que a parteextracelular da Bst2 quimérica humana-murina é idêntica aodomínio extracelular da Bst2 humana, podem ser utilizadoscamundongos para teste de anticorpos de Bst2 humana emestudos pré-clínicos. Uma outra opção consiste emsubstituir a região de codificação inteira do gene de Bst2murino pela região de codificação do gene de Bst2 humano, enão apenas a região de codificação do domínio extracelularconforme se encontra ilustrado nesta figura, utilizando-sea mesma estratégia aqui descrita.

Exemplo 25 - Procedimento experimental para terapia decombinação In vitro

Foram cultivados HUVECs em placas de 12receptáculos com ou sem transfecção de siRNA de Bst2 ousiRNA de controle durante 6 horas, com subseqüentetratamento com ou sem IFNy durante 24 horas. Em algunsexperimentos, as células foram tratadas com mídia cruacontendo "decoy" de Bst2 ou anticorpos murinos anti-ICAMlhumano. Após uma lavagem com PBS (solução salina tamponadacom sulfato), células U937 foram re-suspensas em mídiaisenta de soro em uma concentração de 2 X IO6 células/ml.

Os ensaios foram iniciados com a adição de 200 ul decélulas U937 a HUVEC para um volume final de 1 ml. Após 4horas a 37° C, as células U937 não ligadas foram removidasmediante lavagem das placas três vezes com PBS. As célulasligadas foram fixadas por adição de 4% de paraformaldeídoem PBS, e as células ligadas foram contadas por microscopiaem diferentes campos. Todas as análises estatísticas foramrealizadas em Excel e a significância estatística foiavaliada com teste t Student. Em alguns experimentos foramobtidas amostras de RNA de HUVECs após tratamento com IFNye/ou siRNAs, e foram realizadas análises de reação decadeia de polimerase em tempo real ,("Real-Time PolymeraseChain Reaction" - RT-PCR).

Exemplo 26 - Resultados

A Fig. 29 demonstra que é requerida Bst2 endógenapara agregação heterotípica entre células endoteliais(HUVEC) e células monocíticas (U937) após estimulação comIFNy. Para demonstrar que o bloqueio da Bst 2 endógena éimportante para inibição da agregação heterotípica, asHUVECs foram tratadas com siRNA de Bst2 para supressão deexpressão endógena de Bst2 anteriormente ao tratamento comIFNy (10 ng/rnl, 24hr). A Fig. 30 demonstra que o tratamentocom siRNA de Bst2 ou o tratamento com siRNA de ICAMl nãoafeta a expressão de ICAMl ou a expressão de Bst2 em HUVECstratadas com IFNγ, respectivamente. Foram realizadasanálises RT-PCR-

Conforme se encontra ilustrado nas figuras 2 9 e 30,muito embora se considere que tanto a Bst2 quanto a ICAMldesempenhem um papel na adesão celular, não se sabe seestas proteínas dialogam entre si e funcionam em uma via desobreposição ou em vias independentes sem sobreposição.Para terapia combinada anti-adesão, a inibição combinada deduas proteínas de adesão que funcionam em vias redundantespoderá ser menos eficaz que com duas proteínas em vias nãosobrepostas. Quando foi adicionado siRNA de ICAMl à reaçãode siRNA de Bst2 (B+I siRNA), o siRNA de ICAMl não produziucomo resultado um decréscimo suplementar da expressão deBst2, o que sugere que o ICAMl não é necessário para aexpressão de Bst2. Similarmente, a adição de siRNA de Bst2à reação mediada por siRNA de ICAMl (I+B siRNA) não causounenhuma redução suplementar de expressão de ICAMl, o quesugere que a Bst2 não é necessária para expressão de ICAMl.Estes dados indicam que a Bst2 e o ICAMl podem mediar aadesão de células em vias sem sobreposição.

A Fig. 31 mostra que o tratamento de combinação desiRNA de Bst2 e siRNA de ICAMl demonstra efeitos aditivosem ensaio de adesão heterotípica. A Fig. 32 mostra aresposta dependente de dose de anti-ICAMl ou "decoy" deBst2 em ensaio de adesão heterotípica:, e uma análisequantitativa da resposta dependente de dose de anti-ICAMl e"decoy" de Bst2.

Com base nos experimentos, com siRNA da Fig. 31, oensaio de adesão celular foi realizado na presença deanticorpo murino anti-ICAMl humano ou "decoy" de Bst2. Foiutilizada uma mídia condicionada contendo "decoy" de Bst2.A quantidade de "decoy" de Bst2 no sobrenadante de célulascruas foi estimado aproximadamente mediante comparação dasintensidades de banda do "decoy" de Bst2 com marcação deHis e o padrão de proteína após SDS-PAGE.

A Fig. 33 mostra que o tratamento de combinação de"decoy" de Bst2 e anti-ICAM apresenta efeitos aditivos emadesão de células. Foram utilizadas doses sub-ótimas de"decoy" de Bst2 (100 ng/ml) e anti-ICAMl (1 ug/ml) . Aadesão celular foi totalmente inibida para o nível docontrole quando foram utilizados tanto "decoy" de Bst2quanto anti-ICAMl.

Os resultados apresentados nas Figs. 29-33 sugeremque o tratamento combinado dos bloqueadores de Bst2 ebloqueadores de outros mediadores de doenças inflamatóriasimunes poderá ser benéfico para tratamento de muitasdoenças inflamatórias imunes. Esses bloqueadores que podemser utilizados como os bloqueadores de Bst2 incluem CTLA4-Ig ou bloqueadores de TNF alfa, IL6, ILl, LFAl, alfa 4integrina, ICAMl ou VCAMl. Adicionalmente, o tratamento decombinação de "decoy" de Bst2-Fc ou anti-Bst2 comciclosporina ou glicocorticóide que suprime respostasinflamatórias imunes poderá ser benéfico para condições detransplante ou muitas doenças que requerem tratamento comcorticosteróides, respectivamente.

Para estudos pré-clínicos em modelos de rato oumurinos, encontram-se disponíveis comercialmente (Abcam ououtras empresas) anticorpos monoclonais de rato ou murinoscontra muitas das proteínas de ratos ou murinas listadasacima (TNFR, IL6R, IL1R, LFAl, alfa 4 integrina, ICAMlyVCAMl) . A CTLA4-Ig poderá ter que ser produzida nasinstalações do usuário. Para as proteínas alvo em que nãose encontram disponíveis anticorpos monoclonais ou se nãofor desejável utilizar anticorpos monoclonais, poderão serutilizadas para terapia de combinação era modelos animaisproteínas "decoy" de receptor solúvel dos correspondentesalvos protéicos, por exemplo TNFR-Fc (TNFRl solúvel).

Exemplo 27 - Possibilidade de a Bst2 constituir seu próprioligante

É conhecido que a Bst2 forma um homodimero apósativação. De acordo com este fato, aparentemente o "decoy"de Bst 2 é expressado como um dímero ou multímeros maiselevados. Esta propriedade de dimerização da Bst2 sugere apossibilidade de que a mesma possa ser utilizada como seupróprio ligante em interação célula-célula.

Para testar esta possibilidade, células U937 foramincubadas com anticorpo anti-Bst2, e as células U937tratadas com anticorpo foram adicionadas a HUVECs apóstratamento com interferon. Em um outro experimento, célulasU937 foram tratadas com siRNA de Bst2 ou siRNA de controle,e as células U937 tratadas com siRNA foram adicionadas aHUVECs após tratamento com interferon.

Se a Bst 2 nas células U937 for requerida parainteração célula-célula, as células tratadas com anti-Bst2ou siRNA de Bst2 não se ligarão a HUVECs. Estes resultadosindicam que a Bst2 em células U937 interage com a Bst2 eHUVECs para adesão identificando a Bst2 como uma daspossíveis proteínas L de Bst2.

Exemplo 28 - Identificação de Bst2 utilizando sistemas decDNA de extensão plena em todo o genoma ("Genome Wide Full-Length cDNA - GFC) e fluorometria

O L de Bs t2 pode ser triado com utilização dossistemas GFC- (Genome Wide Full-Length cDNA Arrays)(OriGene Technologies, Rockville, MD). Os sistemas GFC sãoconjuntos de plasmídeos de cDNA prontos para transfecção novetor de expressão de mamífero pCMVsport6 (GIBCO) dispostosem placas de 384 receptáculos descartáveis. Cadareceptáculo contém 62,5 ng de um único cDNA liofilizado,uma concentração otimizada para transfecção reversa parauma variedade de células. O protocolo padrão paratransfecção reversa é apropriado para a maioria dos tiposde células normalmente utilizados. A coleção contém mais de24.000 clones de cDNA humano de extensão plena prontos paratransfecção. 0 sistema GFC também proporciona umsubconjunto de conjuntos de genes humanos tais como osconjuntos de Proteínas Transmembrana e Genes Dirigidos aDrogas ("Druggable Genes") (genes para enzimas/receptoresque podem constituir alvos para drogas). Estes doissubconjuntos (ou os conjuntos completos) podem ser triadospara atividade de ligação a "decoy" de Bst2-Fc.

Resumidamente, por meio de uma metodologia detransfecção de alto rendimento, genes individuais sãotransfectados para células humanas tais como 2 93T, célulasCHO, células COS ou outras células de mamíferos. A cadareceptáculo de placas de 384 receptáculos contendo 62,5 ngde um cDNA distinto são adicionados 20 μΐ de mídia sem sorocontendo FuGENE 6 (Roche). Quarenta microlitros de mídia20% FBS DMEM contendo 293T, células CHO, células COS ououtras células de mamíferos são dispostas em placas em cadareceptáculo. Após 48 horas a 37° C em 5% de C02, umaquantidade otimizada de "decoy" de Bst2-Fc é adicionada acada receptáculo e marcada com anticorpo anti-Fc marcadocom FITC. A fluorescência é analisada mediante utilizaçãode fIuorometria de microplaca (formato de 384receptáculos). Cada receptáculo classificado como positivoé novamente testado tanto para "decoy" de Bst2-Fc quantopara Fc de controle. Após triagem com sistema GFC, cadareceptáculo positivo é validado por transfecçãoconvencional com o plasmídeo de cDNA específico. Todos oscDNAs em sistemas GFC são disponibilizados separadamentepela empresa OriGene (RockvilIe, MD).

Exemplo 29 - Isolação de L de Bst2 através de clonagem deexpressãoO método de clonagem de expressão requer aidentificação de uma abundante fonte de células in vitropara L de Bst2 para construção de uma biblioteca deexpressão de cDNA de plasmídeo. A biblioteca de expressãode c-DNA é então triada para L de Bst2 utilizando "decoy" deBst2-Fc ou "decoy" de Bst2 biotinilado com uma técnica de"panning"..

Exemplo 2 9-1 - Identificação de uma fonte de célulasabundante in vitro (células de fonte) para L de Bst2

A proteína de fusão recombinante de "decoy" deBst2-Fc é utilizada para identificação de uma linhagemcelular putativa ou células primárias expressandoabundantemente L de Bst2 na superfície. São tríadasdiversas linhagens celulares e células hematopoiéticasprimárias. As fontes possíveis de células para l de Bst2incluem, sem limitações, células T, linhagens de célulasmonocíticas/macrófagos tais como células U937 humanas,células RAW 264.7 murinas, células hematopoiéticasprimárias, células B, células dendríticas, célulasendoteliais e fibroblastos. As linhagens celulares murinase de ratos são também pesquisadas com utilização deproteína de fusão "decoy" de Bst2-Fc de rato e proteína defusão "decoy"de Dampl-Fc murina, respectivamente.

Devido ao fato de a "decoy" de Bst2 humana e a"decoy" de Dampl murina funcionar de forma intercambiávelno ensaio de adesão celular e no modelo de asma induzidapor ovalbumina in vivo conforme ilustrado nas Figs. 15-27,a linhagem celular de origem pode ser tríada tanto pelaproteína de fusão de "decoy" de Dampl-Fc murina quanto pelaproteína de fusão de "decoy" de Bst2-Fc humana independenteda espécie das linhagens celulares ou células primáriasutilizadas.

As linhagens celulares ou células primárias sãotríadas para a presença de L de Bst2 por imunofluorescênciaindireta ou análise de células ativadas por fluorescência("Fluorescence-Activated Cell Sorter" - FACS) após marcaçãocom proteínas de fusão "decoy" de Bst2-Fc humana ou "decoy"de Dampl-Fc murina marcadas com FITC, com subseqüentemarcação de anticorpo secundário, por exemplo com anticorposecundário anti-IgG humana de bode F(ab') (Smith CA, GrussHJ, Davis T, Anderson D, outros 1993, Cell 73, 1349-1360).As células são então analisadas por FACS.

Exemplo 29-2 - Validação da célula fonte de l deBst2 através de análise FACS com "decoy" de Bst2-Fc marcadocom FITC

A linhagem celular de origem identificada conformeacima deve apresentar uma significativa ligação específicaa "decoy" de Bst2-Fc marcada com FITC em comparação com aimunoglobulina de controle. 0 anticorpo secundárioisoladamente e a IgG-Fc humana purificada isoladamente nãodeverão ligar-se à superfície da linhagem celular deorigem. Estes resultados indicam que a ligação de "decoy"de Bst2-Fc é devida à fração de "decoy" de Bst2 ou de Damplmas não à parte Fe da sonda. Para demonstrar adicionalmentea especificidade de ligação, a ligação deve ser inibida por"decoy" de Bst2 não conjugado mas não deve ser inibida pelaproteína de controle não associada.

Exemplo 29-3 - Validação da célula de fonte de L deBst2 através de visualização de L de Bst2 com 125I-"decoy"de Bst 2 (Fc)

Para validação, as células de origem são incubadascom "decoy" de Bst2 mareado com 125I., ou "decoy" de Bst2-Fcmarcado com 125I na presença ou ausência de urna quantidadeexcessiva de proteína "decoy" de Bst2 não radioativa. Aiodi ζação pelo método de lactoperoxidase foi descrita(Urdal e outros, 1988, J. Biol. Chem. 263:2870-2877). Ascélulas são então incubadas com um reticulador[bis(sulfosuccinimidila)suberato]. As proteínas sãosolubilizadas com 1% Triton X-IOO cocktail, são submetidasa SDS-PAGE e são visualizadas por auto-radiografia.

Quando a linhagem celular de origem é encontrada evalidada conforme descrito (Exemplos 29-1, 29-2 e 29-3),poderá ser possível obter uma linhagem celular variante queexpressa um número elevado de L de Bst2 após muitos ciclosde análises FACS da fonte de células com marcação maisbrilhante.

Exemplo 29-4 - Construção de uma biblioteca deexpressão de cDNA de plasmídeo de urna linhagem celular deorigem ,para "panning"

Para isolação de L de Bst2, uma biblioteca deexpressão de cDNA é construída da célula de origem de L deBs't.2 identificada e validada conforme foi referido acima.Uma biblioteca de c DNA de plasmideo com "priming" oligo-dTdirecional é construída do mRNA da célula de origem e éligada aos vetores de expressão de mamíferos (Invitrogen).

A biblioteca é dividida em grupos de 1000 clones, e éobtido o DNA de plasmideo de cada grupo. De acordo com ométodo de Seed e Aruffo (Seed B, Arrufo A. Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 1987, 84:3365) e sua modificação por Laceye outros (Cell, 93:165, 1988), DNAs de um "pool" individualsão transfectados para células C0S7. Após aproximadamente48 - 72 horas, as células são marcadas com fusão de "decoy"de Bst2 humana-Fc durante aproximadamente 1 hora, sãolavadas e são então fixadas com paraformaldeído ouglutaraldeído. As culturas são tratadas com anticorpossecundários ligados a enzimas tal como anticorpo anti-IgGhumana (específico de Fc) de bode conjugado de fosfatasealcalina e são detectados complexos imunes mediante ensaio,por exemplo, para atividade de fosfatase alcalina.. Um"pool" positivo é selecionado, e é preparado DNA deplasmideo para transformação em E. coli. Os transformantesde E. coli são usados para o ciclo seguinte deenriquecimento. Mediante repetição deste ciclo, o cDNAespecífico que codifica a proteína L de Bst2 pode seraltamente enriquecido produzindo clones de cDNAindividuais.

O DNA de plasmídeo selecionado é então transfectadopara células C0S7 e imunomarcado alternativamente comdomínio Fc de IgG humana, proteína de fusão de "decoy" deBst2 humana-Fc, ou proteína de fusão Fc não relacionada,seguida por anticorpo secundário FITC-conjugado. Nesteestágio, somente a proteína de fusão de Bst2 humana-Fcdeverá ligar-se à célula de origem. Estes resultadosindicam então que esta célula (ou linhagem celular) deorigem codifica L de Bst2 e apresenta L de Bst2 em suasuperfície celular.

Em uma abordagem alternativa, placas de "panning"são revestidas com anticorpo policlonal Fc anti-IgGl humana(Jackson Immunoresearch) e são então revestidas com "decoy"de Bst2-Fc. Poderá ser necessário bloqueio com albumina desoro bovino. Células C0S7 transfectadas conforme foidescrito acima são então adicionadas às placas e as célulasaderentes ,são suspensas por tratamento com EGTA e EDTA. 0restante do método para "panning" é semelhante ao que foidescrito acima.

Exemplo 29-5 - Isolação de L de Bst2 medianteclonagem de expressão com utilização de "decoy" de Bst2biotinilado como sonda e "panning"

Em uma abordagem alternativa, se a célula de origemcontiver um nível elevado de L de Bst2,, o L de Bst2 poderáser isolado mediante utilização de "decoy" de Bst2biotinilado como sonda utilizando o método de Harada eoutros (Proc. Natl. Acad. Sei. 1990, USA 87:857). Nestemétodo, o "decoy" de Bst2 biotinilado é interligado("crosslinked") com células expressando L de Bst2, e ascélulas que expressam L de Bst2 são enriquecidas por"panning" sobre placas revestidas com anticorpo anti-biotina. Foi relatado que a interligação ("crosslinking") éessencial., já que sem a mesma as células não se acoplariamà placa de "panning".

A construção de biblioteca de cDNA e a transfecçãotransiente de células C0S7 são realizadas conforme foidescrito acima (ver o Exemplo 29-4). Após 48 - 72 horas, ascélulas são destacadas por incubação com PBS contendo 5 mMde EDTA. O "decoy" de Bst2 biotinilado é adicionado einterligado com as células. As células interligadas sãoadicionadas à placa de "panning" e são revestidas comanticorpo anti-biotina. O DNA de plasmideo é recuperado dascélulas acopladas à placa e é usado para transformar E.coli. O DNA de plasmideo amplif icado é utilizado para ociclo de enriquecimento seguinte até produzir um únicoclone. As células C0S7 transfectadas com um destes clonesdeverão então ligar-se especificamente a "decoy" de Bst2marcado com 125I.

Exemplo 29-6 - Isolação de um cDNA de extensão plenade L de Bst2 após "panning"Na medida em que o inserto de DNA obtido após"panning" em clonagem de expressão (vide os Exemplos 29-4 e29-5) será provavelmente um cDNA trancado mais curto, énecessária uma clonagem de cDNA de extensão plena.Bibliotecas de cDNA disponíveis comercialmente (Clontech)são pesquisadas em primeiro lugar com utilização do cDNAcurto selecionado dos procedimentos acima como sonda. 0c DNA de extensão plena de L de Bst2 é obtido mediantetriagem de uma biblioteca de cDNA da linhagem celular deorigem utilizando o cDNA curto como sonda. Uma análise"Northern Blot" dos mNRAs da linhagem celular de origemdeverá mostrar o (s) produto(s) de transcrição de L deBst2. "Northern Blots" disponíveis comercialmente(Clontech) poderão igualmente ser utilizados paravisualização do produto de transcrição.

Após a obtenção de um cDNA de extensão plena, érealizado o seqüenciamento de nucleotídeos. São pesquisadasseqüências para um peptídeo de sinalização, um domínio dequinase potencial, ou quaisquer outros domíniosinteressantes.

Se for detectado um peptídeo de sinalização nasseqüências de nucleotídeos, é testado se ocorre liberaçãode L de Bst2 para a mídia. 0 L de Bst2 é marcado comepitopo (por exemplo, hemaglutinina) no terminal-C ecélulas 293T são transfectadas com um vetor de expressãopara o L de Bst2-marcador (HA). Um "Western Blot" deextratos de células ou mídia condicionada é sondado comanticorpo anti-marcador (HA). Se for liberado para mídiacondicionada, é detectada na mídia condicionada uma bandamenor que aquela observada em extratos de células. Apurificação de afinidade da proteína solúvel e análise deseqüência de terminal-N da proteína solúvel revelam o sítiode clivagem.

Exemplo 30 - Purificação direta de L de Bst2 de rato ou L deDampl de uma fonte abundante de tecido animal (ou linhagemcelular) e pesquisa de homólogo para L de Bst2 humana

O método de purificação direta aqui descrito podeser aplicado a preparações de membrana de linhagenscelulares humanas se for identificada uma linhagem decélulas originais abundantes para L de Bst2 humana comutilização dos métodos descritos no Exemplo 29-1. As fontesde linhagens celulares (ou cultura de células), entretanto,poderão não ser conveniente ou ser muito dispendiosas paraproporcionarem material suficiente para caracterizaçãobioquímica e purificação. Desta forma, deverão ser buscadasfontes de tecidos alternativas de animais. A L de Bst2 ouDampl animal, tal como de rato, de cão, de coelho poderáser identificada em primeiro lugar para subseqüentepesquisa de um homólogo humano. A L de Bst2 animal pode seridentificada com utilização de métodos de purificaçãodireta após identificação de uma fonte de tecido abundanteem ratos, cães, coelhos, camundongos ou outros animais.A primeira etapa para este método consiste naidentificação de uma fonte de tecido in vivo abundante paraL de Bst2 em animais. Muito embora possam ser empregadasquaisquer espécies de animais, os métodos descritos abaixosão ilustrados com utilização de ratos.

A distribuição de atividade de ligação especificade Bst2 era tecidos de ratos é examinada por estudos decaptação ("uptake") (Yang e outros, J. Exp. Med 174:515,1991) 125I de "decoy" de Bst2-BSA ou RSA (rat serum albumina Ibumina de soro de rato). Os métodos abaixo, amodificação do método utilizado para isolação do receptorpara produtos finais de glicação avançados ("Receptor forAdvanced Glycation End products" - RAGE), são ilustradoscom "decoy" de Bst2 decoy-RSA marcado com 125I como sonda deligação. Após o estudo de captação demonstrar um sitioprincipal de L de Bst2, é realizada purificação diretaincluindo etapas de purificação de afinidade utilizando acoluna de Sefarose 4B de "decoy" de Bst2-BSA com utilizaçãode proteínas de membrana fracionada e solubilizada. Todasas frações de coluna são analisadas quanto a atividade deligação pelo ensaio de ligação de "decoy" de Bst 2 de fasesólida (ver abaixo). No final da etapa de purificação, asbandas de proteína são excisadas e eletro-eluídas paraanálise de seqüenciamento de aminoácidos. 0 homólogo humanopoderá ser pesquisado e clonado subseqüentemente.

Exemplo 30-1 - Distribuição em tecido in vivo deatividade de ligação de "decoy" de Bst2

Uma fonte de tecido animal in vivo para L de Bst2pode ser identificada mediante medição do seqüestro de"decoy" de Bst2-RSA (albumina sérica de rato) ou PSA(albumina sérica bovina) marcado com 125I, Para estudos dedistribuição de tecidos, uma Bst2-RSA ou Bst2-BSA modificacom formaldeido é preparada conforme descrito em outrosestudos (Horiuchi e outros, J Biol Chem 261: 4962, 1986),mediante incubação de RSA ou BSA com formaldeido. Aproteína é então rádio-iodada. Similarmente, RSA ou BSAnormal é iodada para uma atividade específica comparável.RBCs de rato recém colhidas são marcadas com 51Cr parapermitir uma correção subseqüente para contagens de tecidospara radioatividade associada ao sangue.

A distribuição de atividade de ligação específicade Bst2 em tecidos de rato é examinada por estudos decaptação de Bst2-RSA (BSA) marcada com 125I.Alternativamente, Bst2-RSA(BSA) marcada com 125I ou RSA(BSA)normal marcada com 125I é injetado por via intravenosa emratos juntamente com RBCs (células vermelhas do sangue),marcadas com 51Cr. São colhidas alíquotas de sangue emdiversos intervalos de tempo, e vários órgãos são removidose contados quanto a radioatividade. A especificidade decaptação de ligante de Bst2 era órgãos é avaliada medianteinjeção nos animais de uma quantidade excessiva de Bst2-RSA(BSA) não marcada anteriormente à administração da Bst2marcada. As RBCs são Usadas com água e a proteína éprecipitada com TCA a 20%. A razão de isotopos de sangue-para-tecido é calculada pela fórmula descrita no trabalhode Williamson e outros., Diabetes 36:813 (1987). Contagensde órgãos inteiros são corrigidas para contagens associadasa sangue.

A acumulação em tecidos de Bst2-RSA(BSA) não deveráser afetada pela injeção anterior de excesso de RSA(BSA)não marcada, enquanto o tratamento de ratos com excesso deBst2-RSA(BSA) não marcada deverá reduzir a acumulação deBs 12-RSA(BSA) nesse órgão. A captação de Bst2-RSA(BSA)deverá permanecer baixa em todos os órgãos principais, comou sem o competidor não marcado.. Quando estes critérios sãoatendidos, o órgão representa uma fonte potencialmente ricapara isolação das proteínas de ligação de Bst2.

Exemplo 30-2 - Confirmação da fonte de tecido invivo para L de Bst2 via ensaio de ligação de fase sólida eensaio de marcação "blotting"de ligante

Após o estudo de captação revelar um sítioprincipal de seqüestro de proteína "decoy" de Bst2 e afonte de tecido potencial para L de Bst2, são preparadasproteínas de membrana do tecido de acordo com os protocolosconvencionais específicos para os tecidos ou órgãos. Aatividade de ligação de extratos de tecidos pode serdemonstrada por ensaio de ligação de fase sólida e ensaiode marcação "blotting" de ligante com "decoy" de Bst2marcado com 125I conforme se encontra descrito abaixo. Estesensaios confirmam e validam as fonte de tecido in vivo paraL de Bst2.

Ensaio de ligação de fase sólida.

Um ensaio de ligação de fase sólida é necessáriopara facilitar a isolação de L de Bst2 do tecido. Proteínasde membrana solubilizadas com detergente são imobilizadassobre nitrocelulose e são sondadas quanto a atividade deligação específica de ligante com "decoy" de Bst2-RSAmarcado com 125I ou "decoy" de Bst2-Fc marcado com 125I. Oligante deverá ligar-se ao "decoy" de Bst2 marcado com 125Ide uma forma saturável e dependente de dose, e a ligaçãodeverá ser bloqueada por anticorpo para Bst2 e/ou por"decoy" de Bst2-Fc não marcado ou "decoy" de Bst 2 nãomarcado.. A expressão de L de Bst2 em células transfectádasdeverá igualmente permitir que as células liguem "decoy" deBst2 marcado com 125I de uma forma saturável e dependente dedose. Mediante utilização de preparações de membranasolubilizada com detergente similares de outros órgãos, omesmo ensaio de ligação de Bst2 de fase sólida poderá serrealizado para confirmação da fonte in vivo para L de Bst2.

Ensaio de marcação "blotting" de ligante paravisualização de L de Bst2 da fonte de tecido identificada.

É realizado um ensaio de marcação "blotting" deligante para visualização da banda de L de Bst2 da fonte detecido identificado. As proteínas obtidas da fonte detecido identificada para L de Bst2 são separadas poreletroforese em SDS-PAGE e são marcadas ("blotted") sobremembranas de nitrocelulose, incubadas com Bst2-BSA marcadacom 125I (ou "decoy" de Bst2-Fc) , e a ligação do ligante éavaliada por auto-radiografia.

Exemplo 30-3 - Purificação direta de L de Bst2 depreparações de membranas solubilizadas da fonte de tecidoin vivo

Após a identificação e confirmação da fonte detecido in vivo de L de Bst2 conforme foi descrito acima, apurificação direta de L de Bst 2 pode ser realizada comutilização do ensaio de ligação de "decoy" de Bst2 de fasesólida (ver o Exemplo 30-2) como forma de monitoração daatividade de L de Bst2. São utilizadas preparações demembranas de tecidos de animais (Exemplo 30-1) ou linhagensde células de origem de L de Bst2 (humanas ou de outrasespécies) (Exemplo 29-1).

Podem ser utilizadas diversas etapas de purificaçãoincluindo cromatografia de coluna e cromatografia deafinidade. É desejável empregar coluna de Sefarose 4B deBst2 ("decoy" de Bst2)-BSA para purificação de afinidadeapós uma ou duas etapas de purificação cruas tais como porcoluna DEAE ou coluna Sephadex. As proteínas ligadas àcoluna de afinidade são eluídas, concentradas e analisadasquanto a atividade de ligação de Bst2 ("decoy" de Bst2)-BSAmarcada com 125I. É então realizada eletroforesepreparatória. As bandas de proteínas são excisadas eeletro-eluídas para análise de seqüenciamento deaminoácidos de terminal-N..

Um homólogo humano pode ser identificado com basenas seqüências de L de Bst 2 de rato, cão ou coelho ouseqüências de L de Dampl de camundongos.

Exemplo 31 - Isolação de L de Bst2 através de sistema dedois híbridos de fermento

0 L de Bst2 é isolado com utilização do sistema dedois híbridos de fermento que se baseia na reconstituiçãodo ativador de transcrição GAL4 no fermento S. cerevísiae(Fields S e Song OK, 1989, Nature 340:245-24 6). Porexemplo, uma biblioteca disponível comercialmente obtida decélulas T humanas ativadas (Clontech) pode ser tríada com aisca contendo o domínio extracelular de Bst2 utilizando umkit de dois híbridos de fermento disponível comercialmente.

Exemplo 32 - Validação do L de Bst2 isolado através deensaio de ligação in vitro

0 L de Bst2 isolado conforme foi descrito acima(exemplo 28 - 31) deverá ligar-se especificamente in vitroa Bst2 ("decoy" de Bst2). A interação Bst2 ("decoy" deBst2)-L de Bst2 pode ser determinada em muitos ensaiosdiferentes, e vários exemplos desses ensaios são descritosabaixo.Em um aspecto, células C0S7 são transfectadas com ovetor de expressão contendo o cDNA de extensão plena,, e sãoincubadas com várias concentrações de "decoy" de Bst2-Fcmarcado com 125I na presença ou ausência do "decoy" de Bst2("decoy" de Bst2-Fc) não marcado ou proteína nãorelacionada (proteína não relacionada-Fc) em excesso. 0"decoy" de Bst2 ("decoy" de Bst2-Fc) não marcado deverábloquear totalmente a ligação de "decoy" de Bst2-Fc rádio-marcado. Estes resultados indicarão que o L de Bst2 se ligaespecificamente a formas biologicamente ativas de Bst2,"decoy" de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc. Os dados de ligaçãosão então analisados para determinação da afinidade enúmero de sítios por célula conforme descrito (Munson PJ,Rodbard D, 1980, Anal. Biochem.l 107:220-239).

Em um outro aspecto, a interação Bst2-L de Bst2pode ser determinada por análise FACS. 293 células, célulasCHO ou células COS são transfectadas transientemente com Lde Bst2. Após 24 - 48 horas, as células são incubadas por 1hora com um "decoy" de Bst2-Fc biotinilado recombinante. Ascélulas são adicionalmente incubadas por 30 minutos com umaestreptavidina conjugada com ficoeritrina (Gibco BRL) e sãoentão analisadas por análise de células ativadas comfluorescência ("Fluorescence Activated Cell Sorting"FACS).

Em um outro aspecto, a interação Bst2-L de Bst2pode ser determinada por ensaio de co-imunoprecipitação. Lde Bst 2 purificado é incubado com "decoy" de Bst2-Fc eimuno,precipitado com sefarose de proteína A. Osprecipitados são resolvidos por SDS-PAGE e são visualizadospor "immunoblot" com anti-L de Bst2.

Em um outro aspecto, é produzido um L de Bst2recombinante, por exemplo, em E. coli, e L de Bst2 marcadocom 125I é exposto aos mutantes de deleção de tipo naturalde Bst2, "decoy" de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc, e proteínasde controle imobilizadas para fibras de nylon após SDS-PAGEnão redutor. O L de Bst2 marcado com 125I deve reconhecer asproteínas Bst2. Este ensaio confirma a ligação direta Bst2-L de Bst2 in vitro. Quando são empregados vários mutantesde deleção de proteínas Bst2, "decoy" de B.st2 ou "decoy" deBst2-Fc, é também possível determinar o domínio de ligaçãode Bst2 estabelece a ligação com L de Bst2.

Exemplo 33 - Função in vitro do L de Bst2 isolado

Células tratadas com L de Bst2 recombinante podemcausar respostas inflamatórias. Células incluindo HUVECssão tratadas com L de Bst2 recombinante, citocinasinflamatórias tais como gama interferon, ou uma combinaçãode L de Bst2 de citocinas. São medidas a produção decitocinas destas células e a adesão de células U937 a estascélulas. É previsto que a Bst2 isoladamente ou emcombinação com citocinas inflamatórias aumente as respostasinflamatórias e a adesão célula-célula. O "decoy" de Bst2ou "decoy" de Bst2-Fc devem bloquear estes efeitos invitro. Similarmente, podem ser utilizados ensaios deativação e proliferação de células T para teste da funçãoin vitro de L de Bst2. Estes dados indicam que o L de Bst2media diretamente as interações célula-célula e a Bst2 e oL de Bst 2 são reguladores preponderantes de respostasinf1amatóri a s imunes. Estes ensaios podem ser repetidos comutilização de células de ratos ou camundongos para serexaminado se o L de Bst2 humana funciona nos sistemas derato ou de camundongo. Estes dados indicam que o L de Bst2media diretamente as interações célula-célula e que a Bst2e o L de Bst2 são reguladores preponderantes de respostasinflamatórias imunes.

Exemplo 34 - Função in vivo do L de Bst2 isolado

Camundongos ou ratos são injetados com L de Bst2recombinante, L de Dampl ou L de Bst2 de rato. Após ainjeção, são avaliados os parâmetros inf1amatórios in vivotais como liberação de citocinas. É previsto que a injeçãode L de Bst2 (L de Dampl) produza como resultado respostaspró-inflamatórias. Estas respostas inflamatórias deverãoser bloqueadas por injeção de "decoy" de Bst2 (Dampl)-Fc ouanticorpos anti-Bst2 (Dampl). Em uma outra abordagem,anticorpos anti-L de Bst2 deverão igualmente apresentarresultados anti-inflamatórios. Esses anticorpos anti-L deBst2 poderão então ser utilizados como outro agenteterapêutico para bloqueio da interação Bst2-L de Bst2.Exemplo 35 - Caracterização bioquímica e biológica doligante de Bst2

O L de Bst2 isolado deve atender os seguintescritérios biológicos.

Medição das propriedades de ligação da proteína Lde Bst2 de extensão plena. Células C0S7 são transfectadascom o vetor de expressão contendo o cDNA de extensão plena,e são incubadas com diversas concentrações de "decoy" deBst2-Fc marcado com 125I e é medida a radioatividade ligadaa célula. A competição com um excesso de Bst2 ou "decoy" deB-st 2-Fc não marcado, mas não com proteína não relacionadaou proteína-Fc não relacionada, deverá bloquear totalmentea ligação de "decoy" de Bst2-Fc rádio-mareado. Estesresultados indicam que o L de Bst2 se liga especificamentea formas biologicamente ativas de Bst2, "decoy" de Bst2 ou"decoy" de Bst2-Fc. Os dados de ligação são analisados paradeterminação da afinidade e número de sítios por célulaconforme descrito por Munson PJ, Rodbard D, 1980, Anal.Biochem.1 107:220-239.

Determinação do domínio de ligação de ligante deBst2 utilizando L de Bst.2 mareado com 125I como sonda. Um Lde Bst.2 recombinante é produzido, por exemplo, em E. coli,e L de Bst2 marcado com 125I é exposto aos mutantes dedeleção ou de tipo natural de Bst2 ou "decoy" de Bst2-Fc eproteínas de controle imobilizadas para filtros de nylonapós SDS-PAGE não redutor conforme descrito em estudos deChen e outros (Chen e outros, 1995; J. Biol. Chem.270:2874-2878)..

Exemplo 3€ - Construção de biblioteca Fab orientada paraBst2/Darapl

A proteína "decoy" de Bst2 humana ou "decoy" deDampl murina expressada nas células CHO foi imunizada paracoelhos (New Zealand White) mediante quantidade apropriadade injeção com adjuvante (RIBI1S ou Freund1sIncomplete/Complete) até ser alcançada saturação detitulação de anticorpo específico para antígenos deBst2/Dampl. A titulação de anticorpo de coelhos imunizadosfoi determinada por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima("Enzyme Linked Immunosorbent Assay" - ELISA) utilizandoanticorpos anti-His conjugados com peroxidase de rábano("Horseradish Peroxidase" - HRP) que reconhecem His marcadaem proteínas "decoy" de terminais-C.

Para preparação de bibliotecas de fagos de exibiçãode Fab, foi preparado RNA total de medula óssea e baço docoelho imunizado com utilização de reagente TRI. Foisintetizado cDNA de primeira fita mediante utilização dosistema de síntese Superscript II First-strand com oligo(dT) "priming" (Invitrogen),.

Os cDNAs de primeira' fita de cada coelho foramsubmetidas a urna primeira rodada de PCR com utilização deum sistema Expand High Fidelity PCR (Roche MolecularSystem) e foram usadas combinações de 10 "primers" paraamplificação de seqüência de codificação Vl de coelho ecombinações de 4 "primers" para amplificação de seqüênciasde codificação VH de coelho. Seqüências de codificação Ck eCH1 humanas foram amplificadas de Fab. Os "primers" "anti-sense" consistiram em seqüências híbridas de coelho/humanasdestinadas à fusão de seqüências de codificação de Vl e Vhde coelho para seqüências de codificação Ck e CHl humanas.Na segunda rodada de PCR, a região variável de Vh de coelhofoi sobreposta com CHl constante humana, e a regiãovariável de VL de coelho da primeira rodada foi sobrepostacom Ck constante humana. Na terceira rodada de PCR, osprodutos de cadeia leve quiméricos e os fragmentos decadeia pesada quiméricos foram unidos por um PCR deextensão de sobreposição.

Exemplo 36-1 - Conjuntos de "primers" de PCR daprimeira rodada

"Primers" "sense" * VD 5'

RSCVKl 5' ggg ccc agg cgg ccg age tcg tgm tga cccaga ctc ca 3' (SEQ ID NO:27)

RSCVK2 5' ggg ccc agg cgg ccg age tcg atm tga cccaga ctc ca 3' (SEQ ID NO:28)

RSCVK3 5' ggg ccc agg cgg ccg age tcg tga tga cccaga ctg aa 3' (SEQ ID NO:29)

"Primers" reversos * VD 3'

RHybKl-BS' aga tgg tgc age cac agt tcg ttt gat ttccac att ggt gcc 3' (SEQ ID NO:30)RHybK2- B 5' aga tgg tgc age cac agt tcg tag gat ctccag ctc ggt ccc 3' (SEQ ID NO:31)

RHybK3-B 5' aga tgg tgc age cac agt tcg ttt gac saccac ctc ggt ccc 3' (SEQ ID NO:32)"Primers" "sense" * VD 5'

RSCLl 5' ggg ccc agg cgg ccg age tcg tgc tga ctcagt cgc cct c 3' (SEQ ID NO:33)

"Primers" reversos * VD3'

RHybL-B 5' aga tgg tgc age cac agt tcg gcc tgtgac ggt cag ctg ggt ccc 3' (SEQ ID NO:34)"Primers" "sense" * VD 5'

RHyVHl 5' gct gcc caa cca gcc atg gcc cag tcg gtggag gag toe rgg 3' (SEQ ID NO:35)

RHyVH2 5' gct gcc caa caa gcc atg gcc cag tcg gtgaag gag tcc gag 3' (SEQ ID NO:3 6)

RHyVH3 5' gct gcc caa cca gcc atg gcc cag tcg ytggag gag tcc ggg 3' (SEQ ID NO:37)

RHyVH4 5' gct gcc caa cca gcc atg gcc cag sag cagctg rtg gag tcc gg 3' (SEQ ID NO:38)"Primers" reversos * VD 3'

RHyIgGCHl-B 5' cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga rgagay ggt gac cag ggt gcc 3' (SEQ ID NO:39)

* "Primer" Para Amplificação da Região Ck Humana ea Seqüência Lider pelB de ura Fab Humano Clonado

HKC-F ("sense") 5r cga act gtg gct gea cca tet gtc3' (SEQ ID NO:40)Lead-B (reverso) 5' ggc cat ggc tgg ttg ggc age 3'(SEQ ID NO:41)

*"Primers" para Amplificação da cadeia CHl Humanade um Fab Humano Clonado

HIgGCHl-F ("sense") 5' aga age gta gtc cgg aacgtc 3' (SEQ ID NO:42)

dpseq(reverso) 5' aga age gta gtc cgg aacgtc 3' (SEQ ID NO:43)

Exemplo 36-2 - Conjuntos de "primers" de PCR dasegunda rodada

*"Primers" para Montagem por PCR de Seqüências VLde Coelho com o Produto de PCR CK Humano

RSC-F("sense") 5' gag gag gag gag gag gag gcg gggccc agg cgg ccg age tc 3' (SEQ ID NO:44)

Lead-B (reverso) 5' ggc cat ggc tgg ttg ggc age 3'(SEQ ID NO:41)

*"Primers" para Montagem por PCR de Seqüências VHde Coelho com o Produto do PCR CHl Humanolider VH ("sense") 5' gct gcc caa cca gcc atggcc 3' (SEQ ID NO:45)

dpseq (reverso) 5' aga age gta gtc cgg aac gtc 3'(SEQ ID NO:4 6)

Exemplo 36-3 - Conjuntos de "primers" de PCR daterceira rodada

*"Primers" para Montagem por PCR de .Seqüências decadeia Leve Quiméricas com Seqüências de cadeia Pesada(Fd)Quiméricas

RSC-F("sense") 5' gag gag gag gag gag gag gcg gggccc agg cgg ccg age tc 3' (SEQ ID NO:44)

dp-EX(reverso) 5' gag gag gag gag gag gag aga agegta gtc cgg aac gtc 3' (SEQ ID NO:47)

Os produtos de PCR resultantes digeridos com SfiIforam ligados a um vetor fagemideo pComb3X (gene bankAF268281) e transformados para XLl-Blue/F1. a biblioteca defagos foi obtida da mídia de cultura durante a noite apósabsorção do fago auxiliar VSCMl3, seguido pela adição dePEG e NaCl.

Exemplo 37 - "Panning" de bibliotecas de Fab para anticorposanti-Bst2 ou anti-Dampl.

Foram realizadas um total de quatro rodadas de"panning". Para clonagem de anticorpos de alta afinidadepara Bst2 e Dampl, foi utilizado um método de "panning"Dynalbead (DYNAL, Cat.No. 143.01) utilizando uma bibliotecade fagos Fab quiméricos.

Dynalbeads M270, Epóxi, foram revestido com "decoy"de Bst2, "decoy" de Dampl ou albumina sérica bovina (BSA)durante 16 ~ 24 horas a 37° C. As contas ("beads")revestidas com "decoy" de Bst2 foram lavadas com PBS (1,06mM de fosfato de potássio monobásico, 155,17 mM de cloretode sódio., 2,97 mM de fosfato de sódio dibásico, pH 7,4) e0,5% Tween 20 em PBS e foram então suspensas em 0,5% BSA emPBS. Para remoção de ligação não específica, uma bibliotecade fagos de Bst2 foi pré-incubada com contas revestidas comBSA. Os "pools" de fagos pré-depurados foram incubados comcontas de Bst2 durante 2 horas à temperatura ambiente eforam lavados com 0,5% Tween 20 em PBS por várias vezespelo método de separação magnética para remoção de fagos deligação não especifica. Os fagos de ligação especificaforam eluidos por incubação de 0,1 M de citrato de sódio(pH 3,0, 0,45 ml) durante 10 minutos por duas vezes e foramneutralizados com adição de 1 M de Tris-HCl (pH 9,5, 0,1ml). Os fagos eluidos foram infectados para XLl-Blue F' decrescimento logaritmico e amplificados por fagos auxiliaresVSCMl3 durante a noite. Os fagos foram preparados porprecipitação com 4% PEG e 3% NaCl (peso/volume), e foramentão suspensos com 1% BSA e 0,02% NaN3 em tampão PBS. 0"pool" de fagos de produção em cada rodada foi monitoradopor ELISA de fagos utilizando anti-HA-Peroxidase de rábano(Roche, Cat No 2 013 819). Os "pools" de fagos específicospara "decoy" de Dampl foram selecionados como o mesmoprotocolo que aqueles específicos para Bst2 conformedescrito acima.

Exemplo 38 - Triagem de bibliotecas de Fab para anticorposespecíficos tanto para Bst2 quanto para Dampl

Para seleção de clones reativos tanto para Bst2quanto para Damp1, um clone de fago único foi inoculado emcaldo 2χYT contendo 30 Dg/ml de tetraciclina, 50 ug/ml decarbenicilina, e 1% de glicose e foi cultivada a 37° Cdurante a noite. 0 sobrenadante da cultura foi sub-cultivado em caldo 2xYT contendo 30 Dg/ml de tetraciclina,50 Gg/ml de carbenicilina em uma placa de 96 receptáculosprofundos, e foi amplificado com utilização de fagoauxiliar VSCMl3 e kanamicina. após cultura durante a noite,0 sobrenadante de fago foi obtido por centrifugação durante30 minutos a 3000 rpm e utilizado no ensaio de ligaçãoBst2/Dampl no formato ELISA.

Cada receptáculo de uma placa "maxi-sorp" de 96receptáculos (Nunc) foi revestido cora 1 Dg de "decoy" deBst2 ou "decoy" de Dampl a 4o C durante a noite e bloqueadopor incubação de 5% BSA em TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mMNaCl, pH7,4) durante 24 horas a 37° C. Em seguida, 100 Dlde sobrenadante de fago foi subseqüentemente adicionadodurante 1 hora a 37° C. Cada receptáculo foi lavado cora0,05% Tween20 em TBS (7,4 pH) e foram adicionados 100 Dl deanticorpo anti-HA de peroxidase de rábano conjugada durante1 hora a 37° C. Após lavagem conforme mencionado acima,foram adicionados 200 Dl de solução de OPD (o-Fenilenodiamina dihidrocloreto, 0,4 mg/ml, Sigma), comsubseqüente adição de 50 ul de 3 M de ácido sulfúrico (50Dl) como solução de interrupção. Os resultados encontram-seilustrados na Fig. 36.

Exemplo 39 - Expressão de anticorpos selecionados

Os clones de fagos positivos obtidos acima foramanalisados por seqüenciamento de DNA e selecionados combase em alinhamento de seqüências.. Ver a Fig. 37.

Para expressão era forma IgGl plena, cada fragmentode DNA de Fab de fago foi clonado para o vetor deexpressão, pCDH e pCDK, derivado de pCDNA 3.1 (Invitrogen).

O pCDH é um vetor de clonagem intermediário para aexpressão de uma cadeia pesada de IgG de extensão plena. Osdomínios CH1-CH2-CH3 de uma cadeia pesada de IgG foramamplificados por PCR de um pCDH inteiro que é um vetor declonagem intermediário para expressão de uma cadeia pesadade IgG de extensão plena. Os domínios CH1-CH2-CH3 de umacadeia pesada de IgG foram amplificados por PCR de umabiblioteca de cDNA de células de sangue integrais(Clontech) com utilização de "primers" Rl-CHl e CH3-Notlclonados no sítio EcoRlr Notl de pcDNA3.1 após digestão derestrição de fEcoRl e Notl. Uma cadeia pesada de IgG deextensão plena passível secreção foi reconstruída mediantefusão do sinal de secreção para tPA 5' à região variável decadeia pesada através de clonagem por PCR de sobreposiçãomediante um primeiro PCR do peptídeo de sinalização de tPAcom "primers" Rl~tPA5 e tPA3 da biblioteca utilizada acimae PCR da região variável e CHl do fagemídeo utilizado paraexpressar o fragmento Fab com Heavy_CHl_Rev e o "primer"específico para a região variável (Ra_Hv_Fwl atéRa_Hv_Fw9); estes dois fragmentos de PCR foram entãofundidos através de uma reação de PCR de sobreposição com"primers" Rl-tPA5 e Heavy_CHl_Rev, digeridos com EcoRl eAgel e clonados para pCDH digerido com as mesmas enzimas.

0 pCDK é um vetor intermediário para expressão dacadeia leve de IgG por clonagem por PCR da cadeia leve com"primers" H3-light e light-Xbal, digestão do produto de PCRcom HindIII e XbaI e clonagem para pcDNA3.1 digerido com asmesmas enzimas. Uma cadeia leve de IgG de extensão plenapassível de secreção foi reconstruída mediante fusão dosinal de secreção para tPA 5' à região variável de cadeialeve através de clonagem por PCR de sobreposição medianteum primeiro PCR do peptídeo de sinalização tPA com"primers' H3-tPA5 e tPA3 da biblioteca utilizada acima ePCR da região variável e CK do fagemídeo utilizado paraexpressar o fragmento Fab com pares de "primers"específicos para as regiões variáveis (Ra_Kp_Fl até 6 e

Ra Kp_Rva até d); estes dois fragmentos de PCR foram entãofundidos através de uma reação de PCR de sobreposição com"primers" H3-tPA5 e o "primer" 3' específico de cadeialeve, digeridos com HinDIII e BsiWI e clonados para pCDKdigerido com as mesmas enzimas.

Rl-CHl 5' cgcgaattcgcctccaccaagggcccatcg 3' (SEQ IDNO:48)

CH3-Notl 5' ggcggccgctcatttacccgggga 3' (SEQ IDNO:49)

Rl-tPA5 5' cgcgaattcaggacctcaccatgggatgg 3'(SEQ ID NO:50)

tPA3 5' ggagtggacacctgtagct 3' (SEQ ID NO:51)Hea vy__CH l_Re ν 51 ccacgctgctgagggagtagagtc 3'.(SEQ ID NO: 52)

Ra_Hv_Fl: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccagcagcagctgatggag 3' (SEQ ID NO:53) 42-mer

Ra_Hv_F2: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccaggagcagctgatggagt 3' (SEQ ID NO:54) 43mer

Ra_Hv_F3: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccaggagcagctggtggagt 3' (SEQ ID NO:55) 43mer

Ra_Hv_F4: 5' gcaacagctacaggtgtccactccc a g t cg g t g a a g g a g t c c g 3' (SEQ ID NO:56) 43mer

Ra_Hv_F5: S1 gcaacagctacaggtgtccactcccagtcgttggaggagtccg 3' (SEQ ID NO:57) 43mer

Ra_Hv_F6: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccagtcggtggaggagtcc 3' (SEQ ID NO:58) 42raer

Ra_Hv_F7: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccagcggttggaggagtcc 3' (SEQ ID NO:59) 42mer

Ra_Hv_F8: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccagcagcagctggtggag 3' (SEQ ID NO:60) 42mer

Ra_Hv_F9: 5' gcaacagctacaggtgtccactcccagtcgctggaggagtcc 3' (SEQ ID NO:61) 42mer

H3-light: 5' gcgaagcttcgaactgtggctgcaccatct 3' (SEQID NO:62)

light-Xbal: 5' gcgtctagattaacactctcccct 3' (SEQ IDNO:63)

H3-tPA5: 57 gcgaagcttaggacctcaccatgggatgg 3' (SEQID NO: 6-4)Ra_Kp_Fl: 5' gcaacagctacaggtgtccactccgagctcgatatgacccagac 31 (SEQ ID NO:65) 44mer

Ra_Kp_F2: 5' gcaacagctacaggtgtccactccg a g c t c g t g c t g a a coca 3' (SEQ ID NO:66) 42mer

Ra_Kp_F3: 5' gcaacagctacaggtgtccactccgagctcgtgatgacccagac 3' (SEQ ID NO:67) 44mer

Ra_Kp_F4: 51 gcaacagctacaggtgtccactccgagctcgatctgacccagac 3' (SEQ ID NO:68) 44mer

Ra_Kp_Rva: 51 cgccgtacg taggatctccagctcggtcc 3'(SEQ ID NO:69) 29mer

Ra_Kp_Rvb: 5' cgccgtacg tttgatttccacattggtgcc 3'(SEQ ID NO:70) 3Omer

Ra_Kp_Rvc: 5' cgccgtacg tttgacgaccacctcggtc 3' (SEQID NO:71) 28raer

Ra_Kp_Rvd: 5' cgccgtacg taggatctccagctcggtccc 3'(SEQ ID NO:72) 3Omer

Para expressão em forma IgGl integral, cadafragmento de DNA de Fab de fago foi clonado para o vetor deexpressão, ρCDNA 3.1 (Invitrogen).

Para expressar anticorpos monoclonais (mAb, IgGl)selecionados acima, um DNA de vetor foi introduzido deforma transiente ou estável em células de mamífero, atransfecção transiente foi realizada por precipitação defosfato de cál cio (CaPO^) , da forma indicada a seguir . Umdia antes da transfecção, 7x1O6 células de 293T (ATCC)foram semeadas e cultivadas sobre uma placa de cultura decélulas de 150 mm. Uma hora antes da transfecção, a mídiade cultura foi trocada por mídia IMDM (Cambrex)suplementada com 2% de soro fetal bovino (GIBCO-BRL). Umtampão TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) contendo 75 μςde DNA e 250 mM de cálcio em um volume de 1,5 ml foimisturado com um volume igual de tampão HEPES (50 mM HEPES,140 mM NaCl, 1,4 mM Na2HPO4, pH 7,05) . A mistura foiincubada durante cerca de 1 minuto à temperatura ambiente efoi aplicada às células pré-cultivadas. As células foramincubadas em um incubador de CO2 a 37° C durante 6 horas.

Após ter sido removida a solução de cálcio/DNA, as célulasreceberam adição de mídia isenta de soro e foramadicionalmente cultivadas durante 72 horas ou mais, quandoentão o meio de cultura foi colhido. Cada mAb foipurificado do meio de cultura com utilização decromatografia de afinidade com Proteína A (AmershamBiosciences, MabSelect). 0 meio de cultura foi carregadopara a coluna carregada com proteína A previamenteequilibrada com tampão PBS (1,06 mM de fosfato de potássiomonobásico/ 155,17 mM de cloreto de sódio, 2,97 mM defosfato de sódio dibásico, pH 7,4). A coluna foi lavada comtampão PBS para remoção dos contaminantes com cerca de 20volumes de coluna. Os anticorpos ligados foram eluídos comtampão de baixo pH, tal como 50 mM glicina-HCl utilizandoum gradiente em etapas e foram neutralizados com volumeigual de IM Tris (pH 8,0). As amostras de proteínapurificadas foram submetidas a eletroforese com gel em 4 -20% PAGE nativo (4-20% native PAGE, Invitrogen). Ver a Fig.38 para as proteínas purificadas em gel.

Exemplo 40 - Ensaio de ligação competitivo (in vitro)

A inibição competitiva de mAbs específico para Bst2ou Dampl na ligação entre "decoy" de Bst2 e células foimedida conforme se encontra descrito no Exemplo 22.

Exemplo 41 - Efeito de mAbs em um modelo murino de asma

Foi preparado um modelo murino de asma conforme deencontra descrito no Exemplo 8-1. O efeito de anticorposant i-Bs 12/Damp1 na infiltração de células imunes foiavaliado conforme se encontra descrito no Exemplo 8-2. emcamundongos sensibilizados com ovalbumina e tratados comcada iriAb, o número total de células de infiltração foireduzido em irrigação broncoalveolar (vvBronchoalveolarLavage" - BAL) (Fig. 39) após tratamento com algunsanticorpos anti-Bst.2/Darnpl. 0 anticorpo anti-Dampl 2-15 nãobloqueou infiltração de células imunes significativamente.Uma possibilidade é que o anticorpo monoclonal 2-15 possaligar —se fortemente a "decoy" de Dampl mas não abranger comprecisão o sítio de ligação potencial de L de Dampl.

Exemplo 42 - Métodos de diagnóstico para medição de estadoinflamatório

A expressão de raRNA de Bst2 é aumentada era umacondição inflamatória. A medição do nível de mRNA de Bst2com PCR quantitativo, PCR em tempo real ou "Northern Blot"em células e tecidos isolados de um paciente podeproporcionar informações úteis sobre o estado de inflamaçãodessas células e tecidos. A medição de níveis de proteínaBst2 por "immunob1o11 i ηg" com anticorpo específico paraBst 2 ou alternativamente com microscopia deimunofluorescêncía e FACS (analisador de células ativadaspor fluorescência) utilizando um anticorpo com marcaçãofluorescente capaz de se ligar a Bst2 na membrana celularpode rá igualmente proporcionar informações referentes aestados de inflamação dessas células. Freqüentemente,proteínas de membrana tais como a Bst2 podem ser clivadaspara produção de fragmentos de Bst2 solúveis que circulamno corpo. A Bst2 em circulação nos fluidos corporais taiscomo soro e urina, pode ser quantificada com anticorpoespecífico para fragmento de Bst2 circulante, utilizandométodos convencionais tais como um ensaio rádio-imunológico("Radio immu η o1og i ca1 Assay" - RIA) e ELISA. A quantificaçãode fragmentos de Bst2 em circulação pode refletir o estadode inflamação do hospedeiro e pode ser útil para propósitode diagnóstico e terapêuticos.

Todas as referências aqui citadas são aquiincorporadas na íntegra a título de referência.

Aqueles que são versados na técnica poderãoreconhecer, ou serão capazes de determinar medianteutilização de experimentação meramente rotineira, muitasequivalências das configurações especificas da invençãoaqui especificamente descritas. Tais equivalências deverãoser consideradas abrangidas no escopo das reivindicações.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIASPedido PCT/US20O7/O14434 de 20.06.2007

Prioridades:

US 11/757.329 de 2007-06-01US 11/47.1.853 de 2006-06-20

Requerente: ISU ABXIS CO. LTD.

Inventores:

KIM, Myung

CHUNG, Jay

PARK, June-Young

YOO, Hyouna

LEE, Sang-Min

LEE, Yoon-Seok

KOO, Mison

PARK, Sang-Ho

LEE, Juheng

HUR, Young Mi

Titulo " MÉTODO DE PREVENÇÃO LIGAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES A OUTRAS CÉLULAS,"DECOY" DE Bst2, CONSTRUCTO QUIMÉRICO, ANTICORPO MONOCLONAL, MÉTODO PARAISOLAR UM LIGANTE PARA Bst2, CAMUNDONGO TRANSGÊNICO CUJAS CÉLULAS DOSOMATOPLASMA E CÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE Bst2 OU DAMPFUNCIONALMENTE PREJUDICADO, CAMUNDONGO TRANSGÊNICO CUJAS CÉLULAS DOSOMATOPLASMA E CÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE DAMP QUE É ,TOTALMENTEOU PARCIALMENTE SUBSTITUÍDO POR UM GENE Bst2, MÉTODO PARA REDUÇÃO DEINFLAMAÇÃO EM UM PACIENTE, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UM PACIENTE QUANTO ASINTOMAS DE UMA DOENÇA ASSOCIADA COM INFLAMAÇÃO, MÉTODO DE TESTE PARADETERMINAÇÃO DE UM COMPOSTO QUÍMICO EFICAZ PARA INIBIR LIGAÇÃO CÉLULA-CÉLULAMEDIADA POR, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM "DECOY" DE Bst2"

Número de seqüências: 98

Programa de Leitura: PatentIn versão 3.5<110> KIM, MyungCHUNG, JayPARK, June-YoungYOO, Hyouna

LEE, Sang-MinLEE, Yoon-SeokKOO1, MisonPARK, Sang-HoLEE, Juheng

HUR., Young Mi

<120> EFEITO DE BST2 EM INFLAMAÇÃO

<130> PX033095

<140> 11/757.329<141> 2007-06-01

<150> 11/471.853<151> 2006-06-20

<160> 98

<170> PatentIn versão 3.5

Número 1

<211> 116<212> PRT<213> Homo sap.iens

<400> 1

Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala1 5 10 15

Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr20 25 30

Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys35 40 45

Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala50 55 60

Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu65 70 75 80

Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg85 90 95

Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro100 105 110

Ser Ser Gln Asp115

Número 2

<211> 104

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400>Phe Ala Val Thr Ala Asn Ser Val Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala1 5 10 15

Gln Ala Glu Cys Arg Asn Thr Thr His Leu Leu Gln Arg Gln Leu Thr20 25 30

Arg Thr Gln Asp Ser Leu Leu Gln Ala Glu Thr Gln Ala Asn Ser Cys35 40 45

10 Asn Leu Thr Val Val Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Lys Lys Val Ser50 55 60

Gln Ala Leu Glu Gln Gln Ala Arg Ile Lys Glu Leu Glu Asn Glu Val65 70 75 80

Thr Lys Leu Asn Gln Glu Leu Glu Asn Leu Arg Ile Gln Lys Glu Thr85 90 95

Ser Ser Thr Val Gln Val Asn Ser100

Número 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Oligômero "sense"

<400> 3

ttttctcttc tcagtctc 18Núme ro 4

< 211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220 >

<223> Oligômero "antisense"

<400> 4gcatctactt cgtatgac

18

Número 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Seqüência alvo

<400> 5aagcgtgaga atcgcggaca a

21

Número 6

<211> 19

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

Seqüência artificial<220>

<221> c a r a c t e r i s t i c a_mi s t a

<222> (19)

<223> o grupo hidroxila de terminal 3' é ligado ao grupo hidroxilade terminal 5'da seqüência de desóxinucleotideo -TT- atravésde ligação fosfodiéster.

<400> 6

uuguccgcga uucucacgc

19

Número 7

<211> 19

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Seqüência Artificial

<220><221><222><223>

caracte ri s t ica_mi s ta

(19)

o grupo hidroxila de terminal 3' é ligado ao grupo hidroxilade terminal 5'da seqüência de desóxinucleotideo -TT- atravésde ligação fosfodiéster.

<400>

gcgugagaau cgcggacaaNumero 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 8

ctcccaggac gagcccaaat cttg

24

Número 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 9

ggcggccgct catttacccg ggga 24

Número 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer<400> 10

ctcccaggac cgtacggtgg ctgc

24

Número 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 11

ggcggccgct taacactctc ccct

24

Número 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 12ctcccaggac gcctccacca aggg

24

Número

13

<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<22 3> Prinier

<4Ό0> 13

ggcggccgct catttaccca gaga

24

Número 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 14

cgctogagac agccatcatg gatg

24

Número 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400>ctcccaggac gagcccaaat cttg

Número 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 16ttgggctcgt cctgggagct gggg

Número 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 17

ggcggccgct catttacccg ggga

Número 18

<211> 24

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 18

ctcccaggac cgtacggtgg ctgc

24

Número 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 19

accgtacggt cctgggagct gggg

24

Número 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<4 00> 20

ggcggccgct taacactctc ccct

24Número 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<22 3> -Primer

<400> 21

ctcccaggac gcctccacca aggg 24

Número

<211><212><213>

22

24DNA

Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 22

gtggaggcgt cctgggagct gggg 24

Número 23

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

Primer<40Ό> 23

ggcggccgct catttaccca gaga

24

Número<211><212><213>

<220><223>

24

24DNA

Seqüência Artificial

Primer

<400> 24

catatttgga ctcgtcctgg gagc

24

Número 25

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 25

ctcccaggac gagtccaaat atggtccc

28

Número 26<2.11> 28<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 26

ggcggccgct catttaccca gagacagg

Número<211><212><213>

<220><223>

27

38DNA

Seqüência Artificial

Primer

14

28

<400> 27

gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca

38

Número 28

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220><223>

Primer

<400> 28

gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactccaNúmero 29

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223 >

Primer

<400> 29

gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa

38

Número<211><212><213>

<220><223>

42DNA

Seqüência Artificial

Primer

<400> 30

agatggtgca gccacagttc gtttgatttc cacattggtg cc

42

Número 31

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 31

agatggtgca gccacagttc gtaggatctc cagctcggtc cc 42

Número 32

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 32

agatggtgca gccacagttc gtttgacsac cacctcggtc cc 42

Número 33

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 33

gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agtcgccctc 40

Número 34<211> 45<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 34

agatggtgca gccacagttc ggcctgtgac ggtcagctgg gtccc

45

Número 35

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 35

gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg gaggagtccr gg

42

Número 36

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer<4Ό0> 36

gctgcccaac aagccatggc ccagtcggtg aaggagtccg ag 42

Número 37

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 37

gctgcccaac cagccatggc ccagtcgytg gaggagtccg gg

42

Número 38

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 38

gctgcccaac cagccatggc ccagsagcag ctgrtggagt ccgg

44

Número 39<211> 45<212> DNA

<213>

Seqüência Artificial<220><223>

Prlmer

<400> 39

cgatgggccc ttggtggagg ctgargagay ggtgaccagg gtgcc

45

Número 40

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 40

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtc

24

Número 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 41

ggccatggct ggttgggcag cNúmero 42

<211> 21

<212> DNft

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 42

agaagcgtag tccggaacgt c

21

Número 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 43

agaagcgtag tccggaacgt c 21

Número 44

<211> 41

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer<400> 44

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c

41

Número 45

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 45

gctgcccaac cagccatggc c

21

Número 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

Primer

<400> 46

agaagcgtag tccggaacgt c 21

Número 47

<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 47

gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc

39

Número 48

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 48

cgcgaattcg cctccaccaa gggcccatcg

Número 4 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400>

49ggcggccgct catttacccg ggga

24

Número 50

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 50

cgcgaattca ggacctcacc atgggatgg

29

Núme ro 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 51ggagtggaca cctgtagct

19

Número 52<211> 24<212> DNA

<213>

Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 52

ccacgctgct gagggagtag agtc

24

Número 53

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 53

gcaacagcta caggtgtcca ctcccagcag cagctgatgg ag 42

Número 54

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 54

gcaacagcta caggtgtcca ctcccaggag cagctgatgg agt 43Número 55

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 55

gcaacagcta caggtgtcca ctcccaggag cagctggtgg agt

43

Número 56

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 56

gcaacagcta caggtgtcca ctcccagtcg gtgaaggagt ccg

43

Número 57

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer<400> 57

gcaacagcta caggtgtcca ctcccagtcg ttggaggagt ccg

43

Número<211><212><213>

<220><223>

58

42DNA

Seqüência Artificial

Primer

<400>

5-8

gcaacagcta caggtgtcca ctcccagtcg gtggaggagt cc

42

Numero 59

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 59

gcaacagcta caggtgtcca ctcccagcgg ttggaggagt cc

42

Número 60<211> 42<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 60gcaacagcta caggtgtcca ctcccagcag cagctggtgg ag

Número 61

<211> 42

<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 61gcaacagcta caggtgtcca ctcccagtcg ctggaggagt cc

Número 62

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 62gcgaagcttc gaactgtggc tgcaccatctNúmero 63

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Priraer

<400> 63

gcgtctagat taacactctc ccct

24

Número<211><212><213>

<220><223>

64

29DNA

Seqüência Artificial

Primer

<400> 64

gcgaagctta ggacctcacc atgggatgg 29

Número *65

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer

<400> 65

gcaacagcta caggtgtcca ctccgagctc gatatgaccc agac

44

Número 66

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 66

gcaacagcta caggtgtcca ctccgagctc gtgctgaacc ca

42

Numero<211><212><213>

<220><223>

67

44DNA

Seqüência Artificial

Primer

<400> 67

gcaacagcta caggtgtcca ctccgagctc gtgatgaccc agac 44

Número 68<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 68

gcaacagcta caggtgtcca ctccgagctc gatctgaccc agac 44

Número 69

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<40Q> 69

cgccgtacgt aggatctcca gctcggtcc 2 9

Número 70

<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Prirner<400> 70

cgccgtacgt ttgatttcca cattggtgcc 30

Número 71

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<400> 71

cgccgtacgt ttgacgacca cctcggtc

28

Número 72

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

Primer

<-400> 72

cgccgtacgt aggatctcca gctcggtccc

30

Número 73

<211> 180

<212> PRT

<213> Homo sapiens<40Ό> 73

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly1 5 10 15

Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Xeu Leu20 25 30

Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala35 40 45

Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg50 55 60

15 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly65 70 75 80

Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met85 90 95

Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys100 105 110

Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln115 120 125

Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu130 135 140

Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145 150 155 160

Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser165 170 175Ala Leu Leu Gln180

Número 74

<211> 172

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 74

Met Ala Pro Ser Phe Tyr His Tyr Leu Pro Val Pro Met Asp Glu Met

1 5 10 15

Gly Gly Lys Gln Gly Trp Gly Ser His Arg Gln Trp Leu Gly Ala Ala20 25 30

Ile Leu Val Val Leu Phe Gly Val Thr Leu Val Ile Leu Thr Ile Tyr35 40 45

Phe Ala Val Thr Ala Asn Ser Val Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala50 55 €0

Gln Ala Glu Cys Arg Asn Thr Thr His Leu Leu Gln Arg Gln Leu Thr65 70 75 80

Arg Thr Gln Asp Ser Leu Leu Gln Ala Glu Thr Gln Ala Asn Ser Cys85 90 95

Asn Leu Thr Val Val Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Lys Lys Val Ser100 105 110

Gln Ala Leu Glu Gln Gln Ala Arg Ile Lys Glu Leu Glu Asn Glu Val115 120 125Thr Lys Leu Asn Gln Glu Leu Glu Asn Leu Arg Ile Gln Lys Glu Thr130 135 140

Ser Ser Thr Val Gln Val Asn Ser Gly Ser Ser Met Val Val Ser Ser145 150 155 160

Leu Leu Val Leu Lys Val Ser Leu Phe Leu Leu Phe165 170

Número 75<211> 117<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 75

Met Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly1 5 10 15

Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn20 25 30

Ser Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45

Ile Gly Leu Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Glu Leu LysIle Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala ArgS5 90 95

Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser10 115

Número 76

<211> 120

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 76

Met Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr1 5 10 15

Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser20 25 30

Tyr Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr35 40 45

Ile Gly Ile Ile Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr65 70 75 80

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Ser Asn Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 77

<211> 120

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 77

Met Ala Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp1 5 10 15

Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser20 25 30

Tyr Met Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr35 40 45

Ile Gly Phe Ile Tyr Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys65 70 75 80

Ile Thr Ser Pro Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

85 90 95

Ser Ser Gly Trp Gly Tyr Gly Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 78

<211> 119

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 7:8

Met Ala Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly1 5 10 15

Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leia Ser Ser20 25 30

Tyr His Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr35 40 45

Ile Gly Phe Ile Asp Thr Val Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys65 70 75 80

Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly85 90 95

Asp Ser Gly Tyr Ser Ile Gly Thr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val10 100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115

Número 79

<211> 119

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 7 9

Met Ala Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro15 10 15

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser30 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Tyr Ile Gly Ile Ile Arg Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Tiir Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu65 70 75 80

Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala85 90 95

Arg Asp Ser Gly Tyr Ser Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115

Número 80

<211> 120

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 80

Met Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr1 5 10 15

Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser20 25 30

His Glu

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Tyr35 40 45Ile Gly Ile Ile Asn Ser Tyr Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala50 55 60

Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr65 70 75 80

Leu Thr Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95

Val Arg Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr15 115 120

Número 81

<211> 123

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 81

Met Ala Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly1 5 10 15

Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser20 25 30

Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr35 40 45

Ile Gly Phe Ile Ser Thr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys65 70 75 80

Ile Thr Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Arg85 90 95

Gly Pro Ala Lys Ser Gly Tyr Gly Thr Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 82

<211> 124

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 82

Met Ala Gln Glu Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro1 5 10 15

Gly Gly Ile Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser20 25 30Ser Tyr Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly ,Lys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Ile Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60

Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val65 70 75 80

Thr Leu Lys Het Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Ser Tyr Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Asp Ile Trp Gly100 105 110

Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 83

<211> 120

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 83

Met Ala Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser20 25 30Gly Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

Tyr Ile Gly Ile Ile Gly Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp65 70 75 80

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95

Val Arg Ser Pro Gly Gly Ser Ala Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 1.10

Val Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 84

<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 84

Met Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr1 5 10 15

Asp Thr

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser20 25 30

Tyr Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr35 40 45

Ile Gly Ile Ile Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60

Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr10 65 70 75 80

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Ser Asn Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr115 120

Número 85<211> 120<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo ntonoclonal

<400> 85

Met Ala Gln Ser Val Glu Glu Ser Arg Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr15 10 15Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr20 25 30

Tyr Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Tyr 35 40 45

Ile Gly Ile Ile Asn Ser Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala50 55 60

Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr65 70 75 80

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr20 115 120

Número 86

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

anticorpo monoclonal

<400> 86

Gln Ala Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 5 10 15Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile20 25 30

Gly Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Ile Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Asp Ser85 90 95

Ser Trp Asp Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu Arg100 105 110

Thr Val

Número 87

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 87

Gln Ala Ala Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly

85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 88

<211> 111

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

anticorpo monoclonal

<400>

88Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Val Gly1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Val Trp

5 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ile Tyr Asn Asp Ile.Asp85 90 95

Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr Val100 105 110

Número 89

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

anticorpo monoclonal

<400>Gln Ala Ala Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Thr Gln Ser Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Gln Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Gly85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 90

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> anticorpo monoclonal<400> 90

Gln Ala Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Lys Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Gln Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Gly85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 91

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

anticorpo monoclonal<400> 91

Gln Ala Ala Glu Leu Val Het Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Gly

85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 92

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223>

anticorpo monoclonal<400> 92

Gln Ala Ala Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr 1 5 .10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn65 70 75 80

Val Glu Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly 85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 93

<211> 111

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> anticorpo monoclonal

<400> 93

Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Thr Val Gly1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Ile Asn20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly50 55 60

Asn Val Ser Gly Ser Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly Ser Gly Val

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Thr Val100 105 110

Número 94

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223> anticorpo monoclonal

<400> 94

Gln Ala Ala Glu Leu Asp Het Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 S 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Met Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75 80

Met Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly85 90 95

Ser Gly Val Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val

Número 95

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 95

Gln Ala Ala Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Arg Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ala65 70 75 80

Ile Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly85 90 95

Ser Gly Val Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número 96

<211> 114

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> anticorpo monoclonal

<400> 96

Gln Ala Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr1 5 10 15

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Gly85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Phe Gly Thr Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105 110

Thr Val

Número<211 ><212>

97

41DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 97

ttcacgctag ccccctttgc agatgaagaa acaggctcag

Número 98

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 98

ttcacctcga ggcaggagat gggtgacatt gcgacactc

Claims (26)

1. MÉTODO DE PREVENÇÃO LIGAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES AOUTRAS CÉLULAS, caracterizado por compreender o contato dascélulas imunes e/ou das outras células com uma composiçãocompreendendo um antagonista de Bst2.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por as outras células serem células imunes,células endoteliais, células de músculos lisos, células docérebro, células de medula espinhal, células nervosasperiféricas, células do coração, células de músculosesqueléticos, células dos pulmões, células do figado, célulasdos rins, células de vasos sangüíneos, células do pâncreas,células do intestino grosso e delgado, células do estômago,células do esôfago, células nasofaríngeas, célulasmembranosas, ou células de tecido conjuntivo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por o antagonista de Bst2 ser um receptorequivocador ("decoy") de Bst2.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado por o "decoy" de Bst2 ser um fragmento de Bst2ou uma variante da mesma, apresentando propriedades deligação similares ou aperfeiçoadas em comparação com aproteína Bst2 para outra molécula ou proteína.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por o antagonista de Bst2 ser ura "decoy" deBst2 fundido com uma proteína estabilizadora, um construto defusão ou quimérico de "decoy" de Bst2-Fc, um constructo. defusão ou quimérico de "decoy" de Bst2-albumina, ou "decoy" deBst2 pegilado, ou "decoy" de Bst2 fundido com outra proteínaestabilizadora.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por o antagonista de Bst2 ser um anticorpomonoclonal ou um domínio de proteína semelhante a anticorpoque se liga especificamente a Bst2 e/ou proteína Dampl murina.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por o antagonista de Bst2 ser um compostoquímico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por as células imunes e outras células seremalternativamente localizadas em um sítio de inflamação ou emum sítio distante de inflamação porém poderem transmitircitocinas inflamatórias e imunes ou outros sinaisinflamatórios para um sítio de inflamação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por a composição compreender adicionalmente umcomposto inibidor de adesão celular e transmissão de sinaisou um composto imunossupressor.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado por o composto inibidor de adesão celular serum antagonista de ICAMl, ou um antagonista de LFA.

11. "DECOY" DE Bst2, caracterizado por apresentaratividade antiinflamatória.

12. CONSTRUCTO QUIMÉRICO, caracterizado por consistirem um constructo quimérico de Fc de imunoglobulina-"decoy" deBst2.

13. Constructo, de fusão de Fc-"decoy" de Bst2 deacordo com a reivindicação 11, caracterizado por o "decoy"ser fundido com qualquer domínio de uma iimmoglobulina.

14. ANTICORPO MONOCLONAL, caracterizado por serespecífico para Bst2 e/ou um homólogo de Bst2.

15. Anticorpo monoclonal, de acordo com areivindicação 14, caracterizado por compreender duasramificações em que uma ramificação é específica para umaproteína diversa de Bst2 ou homólogo da mesma.

16. Anti corpo monoclonal, de acordo com areivindicação 14, caracterizado por um homólogo ser proteínaDamp 1 murina.

17. Anticorpo monoclonal, de acordo com areivindicação 14, caracterizado por uma célula que expressaBst2 à qual o anticorpo monoclonal é ligado impede ainteração de ligante de Bst2-Bst2 ou a interação de Bst2-Bst2.

18. MÉTODO PARA ISOLAR UM LIGANTE PARA Bst2,caracterizado por compreender:(i) obtenção de células que se ligam a Bst2;(ii) triagem para um ligante que se liga a Bst2 dacélula que expressa o ligante, dessa forma isolando-se oligante para Bs t2.

19. CAMUNDONGO TRANSGÊNICO CUJAS CÉLULAS DOSOMATOPLASMA E CÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE Bst2OU DAMP FUNCIONALMENTE PREJUDICADO, caracterizado por oreferido gene prejudicado ser introduzido no camundongo ou emum ancestral do camundongo em estágio embrionário, que sendohomozigótico para o gene prejudicado apresentará um distúrbiode tipo inflamatório.

20. CAMUNDONGO TRANSGÊNICO CUJAS CÉLULAS DOSOMATOPLASMA E CÉLULAS GERMINATIVAS COMPREENDEM UM GENE DAMPQUE É TOTALMENTE OU PARCIALMENTE SUBSTITUÍDO POR UM GENE Bst2,caracterizado por o referido gene Bst2 ser introduzido nocamundongo ou em um ancestral do camundongo em um estágioembrionário.

21. MÉTODO PARA REDUÇÃO DE INFLAMAÇÃO EM UM PACIENTE,caracterizado por compreender a administração de umacomposição compreendendo antagonista de Bst2 para o sitio dainflamação.

22. MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UM PACIENTE QUANTO ASINTOMAS DE UMA DOENÇA ASSOCIADA COM INFLAMAÇÃO,caracterizado por compreender a administração de umacomposição compreendendo antagonista de Bst2 ao pacientenecessitado da mesma.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado por a composição compreender um outro compostoanti-inflamatório.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado por a doença ser selecionada de entre:aterosclerose, artrite reaumatóide, asma, sepsia, coliteulcerativa, diabetes tipo I, catarata, esclerose múltipla,infarto agudo do miocárdio, ataque cardíaco, psoríase,dermatite de contato, osteoartrite, rinite, doença de Crohn,doenças autoimunes, caquexia, pancreatite aguda, vasculiteauto-imune, hepatite viral e auto-imune, hipersensibilidadede tipo retardado, estenose coronária congestiva,glomerulonefrite, doença de rejeição de enxerto porhospedeiro, uveíte, doença inflamatória ocular associada comtransplante de córnea, dano cerebral resultante de trauma,epilepsia, hemorragia, ataque, doença das células falciformes,diabetes tipo II, obesidade, degeneração macular relacionadacom a idade ("Age-related Macular Degeneration" - AMD),eczema, dermatite, incapacidade cognitiva/de aprendizagem,doenças neurodegenerativas, doença de Parkinson, doença deAlzheimer, colite ulcerativa, lesões induzidas por radiação,lesões induzidas por queimaduras ou eletricidade,envenenamento causador de necrose de tecidos e infiltração decélulas imunes, lesões induzidas por drogas, lesões induzidaspor inalação, radiação, lesões dos pulmões induzidas poraspiração, inflamação resultante de quimioterapia ou terapiade radiação, doenças autoimunes, Lupus, doença de Schogren,doenças de desmielinização incluindo esclerose múltipla,miopatia inflamatória incluindo polimiosite, esclerodermia,poliarterite nodosa, sarcoidose, miosite ossificantelocalizada e generalizada, doenças de tipo amilóide incluindodoença de Alzheimer, hérnia de disco, danos na medula espinale nos nervos, sindrome de Reye, meningite e encefalitebacteriana e viral, doença associada a Prions, sindrome deGuilla in Barre, hidrofobia, poliomielite, hemorragia cerebral,danos relacionados com hemorragia intracraniana, sindrome defadiga crônica, tromboflebite, gota, granulomatose, nefriteincluindo glomerulonefrite e nefrite intersticial, alergia apicada de insetos, choque anafilático, anemia aplásica,insuficiência da medula óssea, insuficiência múltipla deórgãos, tiroidite, insulite, cirrose (hepatite crônica eaguda), embolia pulmonar, doenças hepáticas induzidas portoxinas e drogas, pancreatite, doenças intestinais isquêmicas,sindrome de distúrbio respiratório agudo, e pericardite.

25. MÉTODO DE TESTE PÁRA DETERMINAÇÃO DE UM COMPOSTOQUÍMICO EFICAZ PARA INIBIR LIGAÇÃO CÉLULA-CÉLULA MEDIADA POR,caracterizado por compreender a determinação de um compostoque se liga a Bst2.

26. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM "DECOY" DE Bst2,caracterizado por compreender a expressão recombinante do"decoy" de Bst2 em uma célula hospedeira.