JP2015512616A - Ｃ１ｏｒｆ３２抗体およびがんの治療のためのその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、がんを治療するための、Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体、該抗体のフラグメント、ならびに該抗体を含む代替足場、複合体および組成物に関する。

Description

本発明は、少なくともいくつかの態様において、がんを治療するための、Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体、その抗体フラグメント、これらを含む複合体、代替足場および組成物、ならびにこれらの使用に関する。
Ｔ細胞の活性化は防御免疫応答および病的免疫応答の制御において中心的な役割を果たしており、Ｔ細胞が活性化されるためには、精緻に組み合わさった一連の特定のステップが様々な重大事象によって阻害または妨害されることなく完了されなければならない。ナイーブＴ細胞が活性化されて産生能を獲得するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの２つの独立したシグナルを受け取らなければならない。第１のシグナル（シグナル１）は抗原特異的であり、Ｔ細胞抗原受容体がＡＰＣ上に提示された適切な抗原−ＭＨＣ複合体に遭遇すると発生する。このシグナルは必須のものであるが、免疫応答の運命を決定づけるには不十分である。免疫応答の運命は、ＡＰＣ上に発現されたリガンドと噛み合ったＴ細胞共刺激分子によって伝達される第２の抗原非依存性シグナル（シグナル２）によって決定される。この第２のシグナルは刺激性（正の共刺激）または抑制性（負の共刺激または共抑制）であり得る。共刺激シグナルがない場合や共抑制シグナルがある場合、Ｔ細胞の活性化は損なわれ中断される。これによって、抗原特異的不応答（Ｔ細胞アナジーとして知られている）が誘導されるか、あるいはＴ細胞のアポトーシス死が引き起こされる。
通常、共刺激分子対は、ＡＰＣ上に発現されたリガンドとＴ細胞上に発現されたそのコグネイト受容体とからなる。共刺激分子のリガンド／受容体ペアのプロトタイプはＢ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌである。
腫瘍細胞はしばしば負の共刺激分子を発現しており、これらの分子の免疫調節活性を利用して免疫監視を回避している。このような負の共刺激分子として腫瘍で発現されたＢ７は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として機能することから、能動的がん免疫療法（ワクチン接種）や（抗体を介した）受動的がん免疫療法に利用できるがんバイオマーカーおよび薬物標的として注目を集めており、このような用途でＢ７を使用することによって免疫寛容を破綻させ、かつ免疫系を刺激するための戦略を提供することが可能となる。
がんワクチン接種は、腫瘍抗原の投与を必要とし、免疫寛容を破綻させ、かつ腫瘍に対する能動的なＴ細胞応答を誘導するために行われる。ワクチン療法では、ネイキッドＤＮＡ、ペプチド、組換えタンパク質や細胞を使用して治療が行われ、患者自身の腫瘍細胞がワクチンの材料として使用される。
がんを治療するために抗ＴＡＡ抗体が使用される例としては、ネイキッド抗体を用いた治療法、薬物／毒素結合抗体を用いた治療法、養子免疫療法、および細胞性免疫を用いた融合療法（抗ＴＡＡ抗体活性を有する細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団の作製）などが挙げられる。これらの治療法が標的とする抗原エピトープは細胞表面に存在し、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞に過剰発現されており、機能活性の遮断、細胞増殖の抑制、または細胞死の誘導を行うために抗体の標的として利用される。
免疫チェックポイントと呼ばれる免疫系の負の調節因子は、自己抗原に対する寛容の維持に重大な役割を果たしている。腫瘍は免疫チェックポイントを利用することによって腫瘍免疫が効果的に機能することを妨げている。したがって、免疫チェックポイントは、腫瘍の関与さえなければ腫瘍に対して効果的に働く抗腫瘍免疫応答を抑制するのに重要な役割を果たしている。免疫チェックポイントのいくつかは、負の共刺激タンパク質、すなわち免疫調節因子であるＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーである。負の調節因子チェックポイントを標的とする免疫調節抗体療法（immunomodulatory antibody therapy）、たとえば、ＣＴＬＡ４やＰＤ−１を標的とする免疫調節抗体療法は有望な臨床結果を示している。
受動的な免疫療法戦略は腫瘍学においてよく確立されており、標的療法として抗がんモノクローナル抗体の受動移入が行われる。対照的に、能動的な免疫療法戦略は、生体の抗腫瘍免疫を誘導することを目的としており、近年になってようやくがんの治療において成功を収めつつある。免疫系を活性化することによりがんに対する治療効果を得ることは腫瘍学において長年の目標であった。いくつかの能動的な免疫療法のうち、免疫調節抗体療法は、モノクローナル抗体を使用して、Ｔ細胞などの抗腫瘍免疫応答の構成要素の機能を直接増強するか、あるいは該抗体の関与がなければ効果的な抗腫瘍免疫を抑制してしまう免疫チェックポイントを遮断することを指す。免疫制御抗体（immune regulatory antibody）とも呼ばれるこの戦略は、近年になって、臨床試験における概念実証（proof of concept）をようやく取得した。免疫チェックポイントを遮断することによって、抗腫瘍免疫応答の潜在能力を解放することができると考えられ、これはヒトがん治療薬に対する考え方を一変するものである。最も注目すべきは、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブによって、従来の治療法では治療できなかった転移性悪性黒色腫の患者の生存率を有意に上昇させることができたことである。有意義な臨床反応は、抗ＰＤ−１抗体であるＭＤＸ−１１０６による治療を受けた患者においても得られている。
悪性黒色腫などの免疫原性の高い腫瘍は、免疫系の操作に対して最も応答性が高いため、このような治療法の多くはまず初めに悪性黒色腫患者に適用される。しかしながら、現在進行中の臨床研究の多くは、免疫チェックポイントを標的とする薬物と、他のより標準的なアプローチ（標的療法、化学療法、放射線療法など）や他の新しい免疫療法アプローチ（がん治療ワクチンなど）とを組み合わせることによって、様々な腫瘍を標的とするように設計されている。実際に前臨床試験において、腫瘍細胞死をもたらす治療薬が腫瘍抗原を解放させることによって、腫瘍の免疫原性が低い場合であってもチェックポイント遮断抗体に適切な刺激が与えられ、上述のような薬物間において目覚ましい相乗的な治療効果がもたらされることが広範なデータによって示されている。類似の観察結果が複数の前臨床試験で得られており、がん治療ワクチンとチェックポイント遮断との相乗的な効能が実証されている。
上述のような薬物は、患者の抗原に対する免疫応答を増強させるアジュバントとしての腫瘍持異抗原と併用投与することができる。さらに、上記の薬物は、腫瘍特異的Ｔ細胞集団を増殖させて腫瘍細胞を攻撃し破壊するように仕向ける養子免疫療法などの、他のタイプのがん免疫療法に有用であり得る。このような抗腫瘍応答を増強することができる薬物は、治療薬として有効である可能性が非常に高く、腫瘍免疫療法における障壁を克服する試みにおいて有益だと考えられる。
様々な共刺激タンパク質に対するアゴニストおよびアンタゴニストを使用した共刺激調節は、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギーおよびがんの治療戦略として広く研究されている。この分野においては、ＲＡの治療用に承認されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト、オレンシア（登録商標））、および悪性黒色腫の治療用に最近承認された抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ、Yervoy（登録商標））が先駆けて臨床開発されている。現在、臨床開発が進んだ段階にある他の共刺激調節因子としては、進行性／転移性腎明細胞癌（ＲＣＣ）の治療用として開発中の抗ＰＤ−１抗体（ＭＤＸ−１１０６）や、同種腎移植の治療用の抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ＢＧ９５８８、Antova（登録商標））などが挙げられる。さらに、共刺激の調節と様々な感染症とを結び付ける証拠が多数報告されており、上述のような薬物が感染症の治療に有効である可能性が裏付けられている。このような状況に伴い、ウイルス感染のための上述のような薬物が臨床開発中であり、たとえば、抗ＰＤ−１抗体（ＭＤＸ−１１０６）がＣ型肝炎の治療用に試験されている。この他にも、たとえば、ＣＰ−６７５,２０６（トレメリムマブ）や抗ＣＴＬＡ４抗体が、肝細胞癌を有するＣ型肝炎ウイルス感染患者において臨床試験中である。
誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の蓄積は腫瘍の多くで一般的に見られ、腫瘍組織中において免疫抑制細胞の主要なサブセットを形成している。Ｔｒｅｇは免疫抑制環境を構築して抗腫瘍免疫を制限しており、免疫監視に対抗する腫瘍のメカニズムとして主要な役割を果たしている。したがって、ｉＴｒｅｇはがん療法における重要な細胞標的であると見られている。
エフェクターＴ細胞応答を減弱させる機能に加えて、ｉＴｒｅｇはその表面に複数の免疫チェックポイント受容体（ＣＴＬＡ４やＰＤ−１の他にもＴＩＭ３やＬＡＧ３など）を高レベルに発現しており、これらの免疫チェックポイント受容体は、エフェクター免疫応答に対するＴｒｅｇ細胞媒介性抑制を直接的に促進する。臨床試験中の免疫チェックポイント抗体の多くは、ｉＴｒｅｇの免疫抑制活性を阻害して抗腫瘍免疫を増強するメカニズムを採用していると考えられる。実際に、イピリムマブによるＣＴＬＡ４阻害の作用機序は、エフェクターＴ細胞活性の増強およびＴｒｅｇ免疫抑制活性の阻害という２つの重要な要素からなっている。
ｉＴｒｅｇの機能を失わせ、かつエフェクターＴ細胞の抗腫瘍機能を回復させることを目的として、単独でも標準的療法や免疫療法との併用でも使用可能な様々な戦略が開発中である。
Ｂ細胞は外来抗原の認識に重要な役割を果たしており、様々なタイプの感染性因子からの防御に必要な抗体を産生する。Ｔ細胞によるＢ細胞の補助は適応免疫応答における中心的プロセスである。濾胞ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞は、Ｂ細胞の補助に特化したＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットである（Crotty, Annu. Rev. Immunol. 29: 621-663, 2011において再調査されている）。Ｔｆｈ細胞は、ＣＸＣＬ１３依存的にＴｆｈ細胞自身をリンパ節内のＢ細胞濾胞に移動させるＢ細胞ホーミングケモカイン受容体（ＣＸＣＲ５）を発現する。Ｂ細胞の補助にＴｆｈ細胞が必要であること、および抗体応答がＴ細胞依存性であることは、Ｔｆｈ細胞が様々なタイプの感染性因子に対する防御免疫や合理的なワクチン設計に非常に重要であることを示している。
近年、がん生物学やがん療法について理解が進んでいるにもかかわらず、がん療法の成功率は未だ低い。したがって、たとえば、抗腫瘍免疫系を刺激することにより治療を行うための特異的遮断抗体などのような、がんを完治することができる新たな治療法が未だ必要とされている。
「遮断抗体」は、特定のタンパク質またはタンパク質上のエピトープに結合し、そのタンパク質と１つ以上の他の結合パートナーとの相互作用を遮断しうるあらゆる抗体を指す。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗原結合フラグメント、ならびに／またはこれらを含む代替足場、複合体および／もしくは免疫複合体であって、
配列番号１、７、９、１３、１７、１０３からなる群から選択されるＣ１ＯＲＦ３２（ＩＬＤＲ２）タンパク質のいずれか１つ、配列番号１４、１０、１１、１５からなる群から選択される該タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合し、
該抗体が、特にがんおよび悪性腫瘍の治療および／または診断を目的とした、治療薬および／または診断薬（インビトロ診断法およびインビボ診断法）としての使用に適していること、ならびに
該がんが、非転移性、浸潤性、または転移性であること
を特徴とする抗体、抗原結合フラグメント、代替足場、複合体および／または免疫複合体を提供する。
本明細書において「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗原結合フラグメント、これらを含む代替足場、複合体、免疫複合体のいずれであってもよい（さらにこれらの組み合わせであってもよい）。
驚くべきことに、Ｃ１ＯＲＦ３２−Ｉｇタンパク質はＣＤ４ Ｔ細胞からｉＴｒｅｇへの分化を増強することが示されており、このことはＣ１ＯＲＦ３２経路がｉＴｒｅｇの誘導および分化に関連していることを示唆している。本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、遮断モノクローナル抗体を使用してＣ１ＯＲＦ３２をターゲティングし、ｉＴｒｅｇの蓄積およびその免疫抑制能を阻害する。本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、そのようなＣ１ＯＲＦ３２遮断抗体はエフェクターＴ細胞活性を増強する。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３からなる群から選択されるＣ１ＯＲＦ３２（ＩＬＤＲ２）タンパク質のいずれか１つ、配列番号１４、１０、１１、１５からなる群から選択される該タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合する遮断抗体を提供し、この遮断抗体は、単独または内因性抗腫瘍応答を増強する増強手段と組み合わせてがん免疫療法に特化して使用してもよく、また、このようにしてがん免疫療法に特化して使用することが好ましい。
さらに驚くべきことに、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３からなる群から選択されるＣ１ＯＲＦ３２（ＩＬＤＲ２）タンパク質のいずれか１つ、配列番号１４、１０、１１、１５からなる群から選択される該タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合する抗体を、これらの抗体が特に効果的に作用する特定のがんの治療に特化して使用してもよく、また、このような特定のがんの治療に特化して使用することが好ましいことが分かった。また、本発明は、上述のような抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらに驚くべきことに、上記の抗体は、悪性細胞、腫瘍浸潤免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、骨髄系抑制細胞、マスト細胞など）および／または間質腫瘍細胞にＣ１ＯＲＦ３２を発現しているがんなどの特定のがんに特に効果的であることが分かった。先に挙げた細胞のＣ１ＯＲＦ３２の発現は、標準的な治療薬による治療前に見られてもよく、治療後に誘導されてもよい。
上記の特定のがんは、甲状腺癌、食道扁平上皮癌；乳癌、面皰型乳癌、浸潤性乳管癌、髄様型乳癌、卵巣癌、卵巣乳頭状漿液性・粘液性がん、卵巣顆粒細胞腫瘍、卵巣表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、卵巣嚢胞腺癌、卵巣類内膜腫瘍；腎臓がん、腎明細胞癌、嫌色素性腎腺腫、肉腫様腎癌、前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝癌、偽腺管型（腺様型）肝癌、多形態型（巨細胞型）肝癌、明細胞型肝癌、胆管癌、膵臓がん、膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、膵臓腺扁平上皮癌、膵印環細胞癌、膵臓肝様癌、膵臓膠様癌、未分化型膵癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化型膵癌、低〜中悪性度の膵臓神経内分泌癌、膵カルチノイド腫瘍；悪性黒色腫；骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、リンパ腫、子宮がん、膀胱がん、肺がん、精巣セミノーマ、結腸直腸がん、および脊髄腫瘍のいずれか１以上を含む。
１．甲状腺癌は、甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌（好ましくはステージIIおよびIII）、偶発乳頭癌（IPC）、甲状腺髄様癌および退形成甲状腺癌の１以上を含むことが好ましい。
２．乳癌は、浸潤性乳管癌（好ましくはステージII〜IVの、かつ／または低分化型の浸潤性乳管癌）、面皰性乳癌および髄様癌（好ましくはグレード２）を含むことが好ましい。
３．卵巣癌は、乳頭状漿液性・粘液性癌（好ましくはステージＩc〜IIIb）、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍の１以上を含むことが好ましい。
４．腎臓がんは、明細胞癌（好ましくはステージＩ〜II）、嫌色素性腺腫、および肉腫様癌の１以上を含むことが好ましい。
５．前立腺腺癌は、適切なステージの前立腺腺癌（好ましくはステージＩ〜III）、良性前立腺肥大症またはグリーソンスコア５以上の前立腺腺癌を含むことが好ましい。特定の一実施形態では、前立腺腺癌はグリーソンスコア５以上から選択される。
６．肝細胞癌（HCC）は、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌および明細胞型肝細胞癌および胆管癌の１以上を含むことが好ましい。
７．膵臓がんは、膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC)、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌および膵カルチノイド腫瘍の１以上を含むことが好ましい。
８．悪性黒色腫は、ステージIVの悪性黒色腫を含むことが好ましく、かつ／または悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫および軟部組織黒色腫の１以上を含むことが好ましい。
９．肉腫は、骨、軟骨、および軟部組織の肉腫の１以上を含むことが好ましく、このような肉腫として、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫および神経線維肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
１０．リンパ腫は、ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型すなわちリンパ球優勢型、リンパ球減少型、および非特定型）、Ｂ細胞リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（NMZL）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫（節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（セザリー症候群および菌状息肉腫）、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫）の１以上を含むことが好ましい。
１１．子宮がんは、類内膜腺癌（好ましくはステージＩ〜IIIc）から選択される子宮がんを含むことが好ましい。
１２．膀胱がんは、移行上皮癌（好ましくはステージII〜IV）を含むことが好ましい。
１３．肺がんは、小細胞肺がん（好ましくはステージＩ〜IIIb）、非小細胞肺がん（好ましくは低〜中分化型の扁平上皮癌および腺癌）および大細胞癌を含むことが好ましい。
１４．結腸直腸がんは、結腸直腸腺癌（好ましくは中〜低分化型）を含むことが好ましい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、上記がんにおいて、上記のタイプまたはサブタイプのがんはいずれも別の実施形態を構成してもよく、かつ／または一実施形態または下位実施形態を構成するために組み合わせてもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、上記がんの治療方法ならびに上記がんのための本発明の抗体および医薬組成物の使用であって、
上記がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること
を特徴とする、治療方法ならびに抗体および医薬組成物の使用が提供される。
本明細書において「それらのエピトープ」は、配列番号２、３、５または６に示すエピトープを指してもよいが、これらに限定されない。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、がんおよび悪性腫瘍の治療のための医薬組成物であって、
配列番号１、７、９、１３、１７、１０３からなる群から選択されるＣ１ＯＲＦ３２タンパク質のいずれか１つ、配列番号１４、１０、１１、１５からなる群から選択される該タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／または抗原結合フラグメントを含み、
該がんが、非転移性、浸潤性、転移性のいずれであってもよいこと
を特徴とする医薬組成物を提供する。
本明細書に記載の投与または使用には、上記のモノクローナル抗体のいずれを使用してもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、配列番号２、３、５、６のいずれかに特異的に結合する抗原結合部位を含む、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、がんの治療に適したモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
該抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１、７〜１０、１１、１３〜１５、１７、１０３のいずれか１つで示される配列を有するＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドのいずれか１つ、ならびに／またはそのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を含むこと、ならびに
該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
を特徴とする抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、配列番号２、３、５、６のいずれかに特異的に結合する抗原結合部位を含む、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、モノクローナル抗体であって、
配列番号５２、配列番号６８、配列番号８４および配列番号１００から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号５３、配列番号６９、配列番号８５および配列番号１０１から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；配列番号５４、配列番号７０、配列番号８６および配列番号１０２から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；または
配列番号６２、配列番号４６、配列番号７８および配列番号９４から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号６３、配列番号４７、配列番号７９および配列番号９５から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；配列番号６４、配列番号４８、配列番号８０および配列番号９６から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含むアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体が提供される。
たとえば、実施形態のいくつかにおいて、上記抗体は、
配列番号５２、配列番号６８、配列番号８４および配列番号１００から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号５３、配列番号６９、配列番号８５および配列番号１０１から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；ならびに配列番号５４、配列番号７０、配列番号８６および配列番号１０２から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
配列番号６２、配列番号４６、配列番号７８および配列番号９４から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号６３、配列番号４７、配列番号７９および配列番号９５から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；ならびに配列番号６４、配列番号４８、配列番号８０および配列番号９６から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含んでいてもよい。
たとえば、実施形態のいくつかにおいて、上記抗体は、
１）配列番号５２に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号５３に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号５４に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号６２に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号６３に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号６４に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含んでいてもよい。
たとえば、別の実施形態において、上記抗体は、
１）配列番号６８に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号６９に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号７０に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号４６に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号４７に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号４８に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含んでいてもよい。
たとえば、別の実施形態において、上記抗体は、
１）配列番号８４に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号８５に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号８６に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号７８に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号７９に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号８０に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含んでいてもよい。
たとえば、別の実施形態において、上記抗体は、
１）配列番号１００に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号１０１に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号１０２に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号９４に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号９５に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号９６に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含んでいてもよい。
上記抗体は、配列番号４０、５６、７２、８８のいずれか１つから選択される重鎖アミノ酸配列、および／もしくは配列番号４２、５８、７４、９０のいずれか１つから選択される軽鎖アミノ酸配列、またはこれらと少なくとも８５％の相同性を有する配列、少なくとも９０％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号４０に示す重鎖アミノ酸配列および／または配列番号４２に示す軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号５６に示す重鎖アミノ酸配列および／または配列番号５８に示す軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号７２に示す重鎖アミノ酸配列および／または配列番号７４に示す軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号８８に示す重鎖アミノ酸配列および／または配列番号９０に示す軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、
１）配列番号４９、配列番号６５、配列番号８１および配列番号９７から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域；配列番号５０、配列番号６６、配列番号８２および配列番号９８から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域；ならびに配列番号５１、配列番号６７、配列番号８３および配列番号９９から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域；またはそれらの縮重バリアントを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号４３、配列番号５９、配列番号７５および配列番号９１から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域；配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６および配列番号９２から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域；ならびに配列番号４５、配列番号６１、配列番号７７および配列番号９３から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域；またはそれらの縮重バリアントを含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体が提供される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、
１）配列番号４９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号５０に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号５１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号４３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号４４に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号４５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体が提供される。
実施形態のいくつかでは、核酸配列によってコードされる上記抗体は、
１）配列番号６５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号６６に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号６７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号５９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号６０に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号６１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含む。
実施形態のいくつかでは、核酸配列によってコードされる上記抗体は、
１）配列番号８１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号８２に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号８３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号７５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号７６に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号７７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含む。
実施形態のいくつかでは、核酸配列によってコードされる上記抗体は、
１）配列番号９７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号９８に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号９９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；ならびに／または
２）配列番号９１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号９２に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号９３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
を含む。
上記抗体は、配列番号３９、５５、７１、８７のいずれか１つから選択される核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４１、５７、７３、８９のいずれか１つから選択される核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列、またはそれらの縮重バリアントを有していてもよい。
上記抗体は、配列番号３９に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号５５に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号５７に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号７１に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号７３に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、配列番号８７に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号８９に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有していてもよい。
上記抗体は、（ａ）上記に記載のＣＤＲアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）に記載のＣＤＲアミノ酸配列において、重鎖ＣＤＲ３に存在する１００Ａ番目（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）のセリン残基以外の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸が保存的に置換された配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｄ）上記アミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでいてもよい。
上記の抗体はいずれも、たとえば本明細書に記載されているようなアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を含むベクターで形質転換されたハイブリドーマによって分泌されたものであってもよい。
上記抗体は、２０１３年１月１８日にATCC Receiving Departmentにより受領され、ブダペスト条約の規定に従ってAmerican Type Culture Collection (ATCC) Patent Depository（10801 ユニバーシティ・ブールバード、マナッサス、バージニア、20110-2209、米国）に寄託された、仮受託番号５１６６−２ ＰＴＡ−１３４７２の５１６６−２ハイブリドーマおよび／または仮受託番号５１６６−９ ＰＴＡ−１３４７３の５１６６−９ハイブリドーマから分泌されたものであってもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、２０１３年１月１８日にATCC Receiving Departmentにより受領され、ブダペスト条約の規定に従ってAmerican Type Culture Collection (ATCC) Patent Depository（10801 ユニバーシティ・ブールバード、マナッサス、バージニア、20110-2209、米国）に寄託された、仮受託番号５１６６−２ ＰＴＡ−１３４７２のハイブリドーマおよび／または仮受託番号５１６６−９ ＰＴＡ−１３４７３のハイブリドーマが提供される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、上記ハイブリドーマによって産生された抗体が提供される。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントにおいて、上記がんは、腫瘍として集合したがん細胞に浸潤した免疫細胞上またはがん細胞上に１つ以上のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドを発現していてもよい。また、該１つ以上のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドは、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３のポリペプチドの１つ以上、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープを含んでいてもよい。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントにおいて、該抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体であってもよい。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントにおいて、該抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントおよび最小認識単位からなる群から選択されてもよい。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントにおいて、該抗体は二重特異性であってもよく、「二重特異性」とは、Ｉｇ分子の一方の腕が本明細書に記載の標的タンパク質またはエピトープに特異的に結合することができ、Ｉｇ分子のもう一方の腕が、抗体またはフラグメントの生物学的活性を増強したり、抗体またはフラグメントの生物学的活性に指向性を持たせることが可能な別の特異性を有していることを意味する。この点において、多重特異性抗体も少なくとも二重特異性であると考えられる。さらに、上記抗体またはフラグメントは、多価の多重特異性抗体であってもよい。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントにおいて、該抗体は、薬物、放射性核種、発蛍光団、酵素、毒素、治療薬、および化学療法薬から選択される成分とカップリングされていてもよく、
これらを検出するマーカーは、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物のいずれであってもよい。
本明細書に記載の抗体またはフラグメントは、該抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物として提供されてもよい。
がんを治療するための、本明細書に記載の抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の医薬組成物の使用であって、
該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに、
該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
を特徴とする使用が提供されてもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、がんの治療方法であって、
本明細書に記載の抗体もしくは抗体結合フラグメントまたは本明細書に記載の医薬組成物の有効量を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含み、
該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに
該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
を特徴とする方法が提供される。
上記治療は、がんの治療に有用な別の成分または治療法と組み合わせてもよい。
上記治療法は、放射線療法；抗体療法；化学療法；光線力学療法；養子Ｔ細胞療法；Ｔｒｅｇ除去；手術；または慣用の薬物との併用療法であってもよい。
上記成分は、免疫抑制薬、細胞傷害薬、腫瘍ワクチン、抗体（たとえばベバシズマブ、アービタックス）、ペプチド、ペプチボディ、小分子、細胞傷害薬および細胞増殖抑制薬などの化学療法薬（たとえばパクリタキセル、シスプラチン、ビノレルビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、テモゾロミド、イリノテカン、５ＦＵ、カルボプラチン）、インターフェロンおよびインターロイキンなどの免疫調節薬、免疫刺激抗体、成長ホルモンおよび他のサイトカイン、葉酸、ビタミン、無機質、アロマターゼ阻害薬、ＲＮＡｉ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、ならびにプロテアソーム阻害薬からなる群から選択されてもよい。
がんを診断するための、本明細書に記載の抗体またはフラグメントの使用であって、
該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに
該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
を特徴とする使用が提供されてもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、対象のがんを診断する方法であって、
配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドのいずれか１つ、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープを、対象または対象から得られた試料において検出することを含み、
該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
を特徴とする方法が提供される。
上記ポリペプチドの検出は、インビボまたはインビトロで行ってもよい。上記検出は、イムノアッセイによって行ってもよい。さらに、上記検出は、本明細書に記載の抗体またはフラグメントを使用して行ってもよい。
下記の実施形態および下位実施形態は、本明細書に記載の抗体、方法、組成物または使用を使用して実施してもよく、上記甲状腺癌は、甲状腺乳頭癌、（好ましくはステージIIおよびIIIの）甲状腺濾胞癌、偶発乳頭癌（IPC）、甲状腺髄様癌、および退形成甲状腺癌から選択される１以上であってもよい。
上記食道癌は、食道扁平上皮癌であってもよい。
上記浸潤性乳管癌は、ステージII〜IVの、かつ／もしくは低分化型の浸潤性乳管癌であってよく、かつ／または
上記髄様癌は、グレード２の髄様癌であってよい。
上記漿液性・粘液性卵巣癌は、ステージＩc〜IIIbの漿液性・粘液性卵巣癌から選択されてもよい。
上記明細胞腎癌は、ステージＩ〜IIの明細胞腎癌から選択されてもよい。
上記肝細胞癌は、ステージII〜IIIの肝細胞癌から選択されてもよい。
上記ホジキンリンパ腫は、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型すなわちリンパ球優勢型、リンパ球減少型、および非特定型から選択されてもよい。
上記Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（NMZL）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症からなる群から選択されてもよい。
上記Ｔ細胞リンパ腫は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（セザリー症候群および菌状息肉腫）、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択されてもよい。
上記類内膜腺癌は、ステージＩ〜IIIcの類内膜腺癌から選択されてもよい。
上記膀胱移行上皮癌は、ステージII〜IVの移行上皮癌から選択されてもよい。
上記小細胞肺がんは、ステージＩ〜IIIbの小細胞肺がんから選択されてもよく、かつ／または
上記非小細胞肺がんは、低〜中分化型の扁平上皮癌および腺癌から選択されてもよい。
上記抗体またはフラグメントは、Ｃ１ＯＲＦ３２によって誘導された活性を抑制してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、Ｂ７関連共刺激を調節してもよく、Ｔ細胞の活性化を増強してもよく、Ｔ細胞の抑制を軽減してもよく、サイトカインの分泌を増強してもよく、ＩＬ−２の分泌を増強してもよく、Ｔ細胞によるインターフェロン−γの産生を増強してもよく、Ｔｈ１の応答を増強してもよく、Ｔｈ２の応答を減弱してもよく、がんのエピトープ拡大（epitope spreading）を促進してもよく、Ｔ細胞活性化の抑制を減弱してもよく、哺乳動物におけるＴ細胞応答を増強してもよく、抗原特異的メモリー応答を刺激してもよく、がん細胞のアポトーシスまたは溶解を誘導してもよく、がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を刺激してもよく、がん細胞の直接殺傷を誘導してもよく、補体依存性細胞傷害作用および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、がんに対する免疫応答を増強してもよい。
してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の活性を減弱してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、ｉＴｒｅｇへの分化を抑制してもよい。
本明細書に記載の抗体、方法、組成物または使用は、治療効果を得るために増強手段と組み合わせて該抗体および／または該組成物を対象に投与することを特徴としてもよく、該増強手段は、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的／古典的化学療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Ｔｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、がん治療ワクチン、ならびに養子細胞移入からなる群から選択されてもよい。
上記の標準的／古典的化学療法薬は、ゲムシタビン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン（および他の白金系化合物）、シクロホスファミド、アントラサイクリン類（たとえばドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、タキサン類（たとえばパクリタキセル、ドセタキセルなど）、微小管阻害薬（たとえばビンクリスチンなど）、葉酸拮抗薬（たとえばメトトレキサートなど）、ｍＴＯＲ経路阻害薬（たとえばテムシロリムス、ラパマイシンなど）、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンならびにミトキサントロンから選択されてもよい。
上記標的療法薬は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬（たとえば、ボリノスタット、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５など）、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、ＪＡＫ２阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）（たとえば、エルロチニブ、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブなど）、ならびに治療用モノクローナル抗体（たとえば、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブ、ならびにanatimumabおよびトラスツズマブなど）から選択されてもよい。
上記免疫抑制細胞であるＴｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬は、抗有糸分裂薬（たとえば、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体など）、ＣＯＸ−２阻害薬、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を認識してＴｒｅｇを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体（たとえば抗ＣＤ２５であるダクリズマブおよびバシリキシマブ）、リガンド標的毒素（たとえば、デニロイキン ディフィトックス（オンタック）（ヒトＩＬ−２とジフテリア毒素との融合タンパク質）およびＬＭＢ−２（ＣＤ２５に対するｓｃＦｖと緑膿菌外毒素との融合物）など）、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を標的とする抗体、ＴＬＲ調節薬、アデノシン作動経路を阻害する薬物（たとえば、エクトヌクレオチダーゼ阻害薬、Ａ２Ａアデノシン受容体阻害薬など）、ＴＧＦ−β阻害薬、ケモカイン受容体阻害薬、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、ホスホジエステラーゼ５阻害薬（たとえばシルデナフィルなど）、ならびにＲＯＳ阻害薬（たとえばニトロアスピリンなど）から選択されてもよい。
上記免疫刺激抗体は、ＣＴＬＡ４（例：イピリムマブ）、ＰＤ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６）、ＰＤＬ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５）、ＬＡＧ−３（例：ＩＭＰ−３２１）、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡなどの免疫チェックポイントを標的とするアンタゴニスト抗体；および／またはＣＤ４０（例：ＣＰ−８７０,８９３）、ＣＤ１３７（例：ＢＭＳ−６６３５１３）、ＯＸ４０（例：抗ＯＸ４０）、ＧＩＴＲ（例：ＴＲＸ５１８）などの免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体から選択されてもよい。
上記がん治療ワクチンは、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するために使用されるタンパク質またはペプチドを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクターを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードするＤＮＡベースの外因性がんワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質を含む外因性がんワクチン、樹状細胞を含む外因性がんワクチン、ならびにＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＦｌｔ３リガンドを発現する遺伝子修飾腫瘍細胞を含む外因性がんワクチンから選択されてもよい。
上記がん治療ワクチンは、樹状細胞ベースのワクチンを含んでいてもよい。
上記抗体のいずれかにおいて、上記がんは、腫瘍として集合したがん細胞に浸潤した免疫細胞上またはがん細胞上に１つ以上のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドを発現していてもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および／または標的細胞に対するＣＤＣ活性もしくはＡＤＣＣ活性を有している抗体もしくは抗体フラグメントであることを特徴とする、上記の抗体およびそのフラグメントを提供する。
上記の抗体およびそのフラグメントの具体例としては、免疫活性化作用または免疫抑制作用を有する抗体およびフラグメント、たとえば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性により細胞を標的とする抗体またはフラグメントなどが挙げられる。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、上記の治療法およびこれに関連する診断法に有用な上記の抗体フラグメントおよび該抗体フラグメントを含む複合体を提供し、該抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明の抗体およびフラグメントは、マーカー；検出マーカーなどの他のエフェクター成分；または酵素、毒素、治療薬、化学療法薬などのエフェクター成分に直接または間接的に結合されている。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物、または化学発光化合物に直接または間接的に結合された上記の抗体またはフラグメントを提供する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、治療および／または診断に効果的な形態の上記の抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物および／または診断組成物を提供する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、上記の抗体および／または医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む、がんを治療または予防するための方法を提供する。
上述したように、上記の治療は、がんを治療するのに有用な別の成分または治療法と組み合わせてもよい。該治療法は、放射線療法；抗体療法；化学療法；光線力学療法；養子Ｔ細胞療法；Ｔｒｅｇ除去；手術；または慣用の薬物との併用療法であってもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、生体試料または対象において、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質の存在および／またはＣ１ＯＲＦ３２タンパク質レベルをインビトロまたはインビボで検出するためのアッセイであって、上記の抗体と試料とを接触させること、試料および／または対象におけるＣ１ＯＲＦ３２タンパク質の結合を検出することを含むアッセイを提供する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、Ｃ１ＯＲＦ３２の発現を検出することを含む、がんの検出方法、がんの診断方法、がんの進行、がんに対する治療効果またはがんの再発のモニタリング方法、がんの治療法の選択方法、およびがんの影響を受けた細胞の検出方法を提供する。
上記の診断方法は、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドのいずれか１つ、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープを、対象または対象から得られた試料において検出すること含んでいてもよい。上記ポリペプチドの検出は、インビボまたはインビトロで行ってもよく、イムノアッセイを使用して行ってもよく、抗体またはフラグメントを使用して行ってもよい。
一実施形態によれば、試料中のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの存在および／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルを検出することによって、がんの存在、ならびに／またはその重症度および／もしくは進行度が分かる。別の実施形態によれば、健常者または健常者から得られた試料中におけるＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの発現量および／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルと比較したときの、Ｃ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの発現量および／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルの変化から、がんの存在、ならびに／またはその重症度および／もしくは進行度が分かる。さらなる実施形態によれば、がんの初期段階の対象またはがんの初期段階の対象から得られた試料中におけるＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの発現量および／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルと比較したときの、Ｃ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの発現量および／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルの変化から、がんの進行度が分かる。さらなる実施形態によれば、Ｃ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの存在を検出すること、ならびに／またはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドの発現量および／もしくはＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドレベルの相対的変化を検出することは、がんの治療法の選択および／またはがんの治療のモニタリングに有用である。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、本明細書に記載の抗体およびフラグメントであって、
該抗体が１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣ１ＯＲＦ３２に結合してもよく、そのようなＫＤでヒトＣ１ＯＲＦ３２に結合することが好ましいこと、および
該抗体が、Ｂ７関連共刺激の調節、Ｔ細胞活性化の増強、Ｔ細胞抑制の軽減、サイトカイン分泌の増強、ＩＬ−２分泌の増強、Ｔ細胞によるインターフェロン−γの産生の増強、Ｔｈ１応答の増強、Ｔｈ２応答の減弱、がんのエピトープ拡大の促進、Ｔ細胞活性化の抑制の減弱、哺乳動物におけるＴ細胞応答の増強、抗原特異的メモリー応答の刺激、がん細胞のアポトーシスまたは溶解の誘導、がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用の刺激、がん細胞の直接殺傷の誘導、ならびに補体依存性細胞傷害作用および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の誘導から選択される少なくとも１つの特性を示すこと
を特徴とする抗体およびフラグメントを提供する。
上記抗体またはフラグメントは、がんに対する免疫応答を増強してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の活性を減弱してもよい。
上記抗体またはフラグメントは、ｉＴｒｅｇへの分化を抑制してもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、二重特異性分子であって、上記の抗体またはその抗原結合部分と、該抗体またはその抗原結合部分に連結されており、抗原結合標的または抗原結合特異性が該抗体またはその抗原結合部分と同一または異なる第２の機能成分とを含む二重特異性分子を提供する。
本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、そのような核酸を含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを含む宿主細胞も本発明に包含される。さらに、本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子およびヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を含み、本発明の抗体を発現するトランスジェニックマウス、ならびにそのようなマウスから調製され、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、がんを治療するための、上記モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗原結合フラグメント、および／またはこれらを含む医薬組成物の使用であって、該がんが、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞にＣ１ＯＲＦ３２タンパク質を発現していることを特徴とする使用を提供する。なお、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体について例示してきたが、それらのフラグメント、該抗体およびそれらのフラグメントを含む代替足場、複合体および／または免疫複合体も上記の実施形態の一部を構成するものとして包含されていてもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体、そのフラグメント、ならびに／またはこれらを含む複合体および／もしくは医薬組成物は、併用療法において投与することもでき、すなわち、他の増強手段および／または増強療法、たとえば、当技術分野において公知の標準的ながん療法（たとえばhttp://www.cancer.gov/cancertopicsに記載されているようながん療法）のいずれとも組み合わせることができる。
実施形態の少なくともいくつかによれば、上記の抗体またはフラグメントは、治療効果を得るために増強手段と組み合わせて対象に投与してもよく、該増強手段は、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的／古典的化学療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Ｔｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、がん治療ワクチン、ならびに養子細胞移入からなる群から選択されるが、この実施形態に限定されない。
上記の標準的／古典的化学療法薬は、ゲムシタビン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン（および他の白金系化合物）、シクロホスファミド、アントラサイクリン類（たとえばドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、タキサン類（たとえばパクリタキセル、ドセタキセルなど）、微小管阻害薬（たとえばビンクリスチンなど）、葉酸拮抗薬（たとえばメトトレキサートなど）、ｍＴＯＲ経路阻害薬（たとえばテムシロリムス、ラパマイシンなど）、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンならびにミトキサントロンから選択されてもよい。
上記標的療法薬は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬（たとえば、ボリノスタット、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５など）、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、ＪＡＫ２阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）（たとえば、エルロチニブ、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブなど）、ならびに治療用モノクローナル抗体（たとえば、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブ、ならびにanatimumabおよびトラスツズマブなど）から選択されてもよい。
上記免疫抑制細胞であるＴｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬は、抗有糸分裂薬（たとえば、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体など）、ＣＯＸ−２阻害薬、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を認識してＴｒｅｇを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体（たとえば抗ＣＤ２５であるダクリズマブおよびバシリキシマブ）、リガンド標的毒素（たとえば、デニロイキン ディフィトックス（オンタック）（ヒトＩＬ−２とジフテリア毒素との融合タンパク質）およびＬＭＢ−２（ＣＤ２５に対するｓｃＦｖと緑膿菌外毒素との融合物）など）、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を標的とする抗体、ＴＬＲ調節薬、アデノシン作動経路を阻害する薬物（たとえば、エクトヌクレオチダーゼ阻害薬、Ａ２Ａアデノシン受容体阻害薬など）、ＴＧＦ−β阻害薬、ケモカイン受容体阻害薬、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、ホスホジエステラーゼ５阻害薬（たとえばシルデナフィルなど）、ならびにＲＯＳ阻害薬（たとえばニトロアスピリンなど）から選択されてもよい。
上記免疫刺激抗体は、ＣＴＬＡ４（例：イピリムマブ）、ＰＤ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６）、ＰＤＬ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５）、ＬＡＧ−３（例：ＩＭＰ−３２１）、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡなどの免疫チェックポイントを標的とするアンタゴニスト抗体；および／またはＣＤ４０（例：ＣＰ−８７０,８９３）、ＣＤ１３７（例：ＢＭＳ−６６３５１３）、ＯＸ４０（例：抗ＯＸ４０）、ＧＩＴＲ（例：ＴＲＸ５１８）などの免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体から選択されてもよい。
上記がん治療ワクチンは、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するために使用されるタンパク質またはペプチドを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクターを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードするＤＮＡベースの外因性がんワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質を含む外因性がんワクチン、樹状細胞を含む外因性がんワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質を含む外因性がんワクチン、ならびに樹状細胞を含む外因性がんワクチンから選択されてもよい。
上記がん治療ワクチンは、樹状細胞ベースのワクチンを含んでいてもよい。
免疫したウサギの試験採血から得た血清および免疫前のウサギの血清（1:250）を使用して、マウスIgG2aタンパク質融合C1ORF32細胞外ドメイン（C1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質）（配列番号４）のウエスタンブロット分析を行った結果を示す。予想されるバンドサイズ（約50kDa）において、特異的抗C1ORF32抗体（免疫したウサギNo.R1（R7531）、R2（R7532）、R4（R7534）から得た血清）は、組換えC1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号４）を認識したが、免疫したウサギR3から得た血清では特異的シグナルは検出されなかったことが示されている。凡例:レーン1はR1（R7531）の免疫血清を表し；レーン2はR1（R7531）の免疫前血清を表し；レーン3はR2（R7532）の免疫前血清を表し；レーン4はR2（R7532）の免疫血清を表し；レーン5はR3（R7533）の免疫前血清を表し；レーン6はR3（R7533）の免疫血清を表し；レーン7はR4（R7534）の免疫前血清を表し；レーン8はR4（R7534）の免疫血清を表す。 C1ORF32をトランスフェクトした組換えHEK293T細胞のプールのウエスタンブロット分析を、アフィニティー精製したポリクローナル抗体R7531を使用して行った結果を示す。空ベクター（レーン1）、ヒトC1ORF32（配列番号１）（レーン2）、ヒトC1ORF32-HAタグ（配列番号22）（レーン3）、キメラ型マウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）（レーン4）、およびマウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）（レーン5）をそれぞれトランスフェクトしたHEK293Tプールの溶解物30μgのウエスタンブロット分析を、抗C1ORF32ポリクローナル抗体R7531（2μg/mL）を使用して行った結果が示されている。C1ORF32をトランスフェクトした様々なHEK293T細胞では、ネガティブコントロールである安定なHEK293Tプールの全細胞抽出液と比較して、ヒトC1ORF32（配列番号１）において予想サイズ約30kDaに相当するバンドが検出され、マウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）において予想サイズ約70kDaに相当するバンドが検出された。より高い分子量では非特異的バンドがすべての細胞株で観察された。 C1ORF32特異的ポリクローナル抗体（R7531、R7532、R7534）を用いたフローサイトメトリー分析により、ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）を発現する組換えHEK293T細胞（図３Ａ）と、HEK293T細胞（図３Ｂ）とを比較した結果を示す。無関係なウサギIgG（シグマ社、カタログNo.I5006）をネガティブコントロールとして使用した。実験の結果、抗C1ORF32抗体を使用することによって、C1ORF32の細胞表面発現を確認することができた。 C1ORF32タンパク質を発現するHEK293T細胞のウエスタンブロット分析を、抗C1ORF32モノクローナル抗体5159-1（2μg/mL）を使用して行った結果を示す。空ベクターおよび様々なコンストラクトをそれぞれトランスフェクトしたHEK293Tプールの全細胞溶解液のウエスタンブロット分析が示されている（空ベクターをトランスフェクトした細胞（ネガティブコントロール細胞）（レーン1）、ヒトC1ORF32（配列番号１）発現細胞（レーン2）、ヒトC1ORF32-HAタグ（配列番号22）発現細胞（レーン3）、キメラ型マウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）発現細胞（レーン4）、およびマウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）発現細胞（レーン5））。pIRES-puro3空ベクターをトランスフェクトした安定なHEK293Tプールの全細胞抽出液（レーン1）と比較して、約30kDaに相当する特異的なバンドがヒトC1ORF32（レーン2）およびヒトC1ORF32-HAタグ（レーン3）で検出された。弱いシグナルがキメラ型マウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）（レーン4）で観察され、マウスC1ORF32-FLAG（配列番号21）発現細胞ではシグナルは検出されなかった。 マウス抗C1ORF32モノクローナル抗体（20μg/mL）または比較のための無関係なIgG1コントロール抗セファロスポリンを使用した後、1:250に希釈したDyLight 549標識ロバ抗マウスIgG二次抗体で染色することにより測定した、様々なC1ORF32タンパク質の膜発現量を示す。図５Ａは空ベクターをトランスフェクトした細胞を示し、図５ＢはヒトC1ORF32をトランスフェクトした細胞（配列番号１）を示し、図５ＣはヒトC1ORF32-HAタグをトランスフェクトした細胞（配列番号22）を示し、図５Ｄはキメラ型マウス-ヒトC1ORF32をトランスフェクトした細胞（配列番号８）を示し、図５ＥはマウスC1ORF32をトランスフェクトした細胞（配列番号21）を示す。 ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）を発現する組換えCHO-K1細胞またはpIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトした安定なプール細胞に対するFACS分析を、抗C1ORF32モノクローナル抗体5159-1および無関係な抗体ネガティブコントロールとしてのマウス抗セファロスポリンを使用して行った結果を示す。 ヒトC1ORF32タンパク質に対する抗C1ORF32モノクローナル抗体5166-2（左）および5166-9（右）の結合性を、C1ORF32（配列番号１）を発現する組換えCHO-K1細胞と、pIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトしたCHO-K1の安定なプールとで比較した結果を示す。マウス抗セファロスポリンおよび正常マウス血清をネガティブコントロールとして使用した。 小細胞肺がんおいてC1ORF32陽性に染色された浸潤免疫細胞を示す。がん細胞の免疫反応性は低いが、腫瘍に浸潤したマクロファージはC1ORF32強陽性を示す（矢印）。 HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32のJurkat細胞活性化に対する効果を評価するための実験の設定の概略図を示す。 HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）がJurkat細胞の活性化を抑制することを示す。C1ORF32を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞2.5×104個（図１０Ａ）または5×104個（図１０Ｂ）と、Jurkat細胞（5×104個/ウェル）とを共培養し、CD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図１０Ｃに示す。 HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）が、抗CD3-UCHTクローンで活性化したJurkat細胞を抑制することを示す。C1ORF32を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞2.5×104個（図１１Ａ）または5×104個（図１１Ｂ）を、Jurkat細胞（5×104個/ウェル）とともに一晩インキュベートし、CD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図１１Ｃに示す。 HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）が、抗CD3および抗CD28で活性化したJurkat細胞を抑制することを示す。プレート上に結合させた抗CD3（0.1μg/mLまたは0.25μg/mL）で活性化したJurkat細胞（図１２Ａ）、またはプレート上に結合させた抗CD3（0.1μg/mLまたは0.25μg/mL）と可溶性抗CD28とで活性化したJurkat細胞（図１２Ｂ）を一晩インキュベートし、これらの細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図１２Ｃは、0.1μg/mLまたは0.25μg/mLの抗CD3（OKTクローン）でコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を2.5×104個/ウェル、5×104個/ウェルまたは10×104個/ウェルの濃度で播種し、5×104個のJurkat細胞を加えて一晩インキュベートした結果を示す。Jurkat細胞のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ΔMFI値を図に示す。図１２Ｄは、0.1μg/mLまたは0.25μg/mLの抗CD3（OKTクローン）でコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を5×104個/ウェルの濃度で播種し、5×104個のJurkat細胞のみを加えて、または5×104個のJurkat細胞と2μg/mLの可溶性抗CD28とを加えて一晩インキュベートした結果を示す。Jurkat細胞のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ΔMFI値を図に示す。 HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）がJurkat細胞の活性化を抑制することを示す。図１３Ａおよび図１３Ｃは、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞2.5×104個を、Jurkat細胞5×104個とともに7.5時間または一晩インキュベートした結果を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｄは、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞5×104個を、Jurkat細胞5×104個とともに7.5時間または一晩インキュベートした結果を示す。Jurkat細胞のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図に示す。 休止期マウスT細胞および活性化されたマウスT細胞に対するC1ORF32（配列番号24）の結合プロファイルを示す。マウスCD4+CD25-CD4 T細胞を静置し（「活性化していない」）、これとは別にマウスCD4+CD25-CD4 T細胞を可溶性抗CD28（2μg/mL）の存在下で固相化抗CD3（2μg/mL）により刺激した。48時間後、抗CD3/28で刺激したCD4細胞を、Fcγ受容体をブロッキングするためのマウス抗CD16/32の存在下でビオチン化C1ORF32 H:M（N278A；脱グリコシル化、配列番号38）またはアイソタイプコントロール（ビオチン化マウスIgG2a；Biolegend社）で染色し、次いでストレプトアビジン-PEで染色した。 C1ORF32（配列番号１）の異所性発現がTCR刺激後のマウスCD4 T細胞の細胞分裂を抑制することを示す。図１５Ａは、プレート結合抗CD3（0.5μg/mL）で刺激したCFSE標識マウスCD4+CD25-T細胞（1×105個）のフローサイトメトリー分析を、C1ORF32T発現HEK293トランスフェクタント（青色）または空ベクターHEK293トランスフェクタント（灰色）の存在下においてHEK293:CD4の比を1:4または1:2として行った結果を示す。図中のパーセンテージは細胞分裂した回数が２回を超えた細胞の画分を示す。図１５Ｂは、細胞分裂した回数が２回を超えた細胞のパーセンテージ（平均±SD）を示すヒストグラムである（*P値<0.05、P値<0.001、studentのT検定）。 C1ORF32タンパク質（配列番号17および１）の細胞外ドメインを認識する特異的ポリクローナル抗体（Rb-抗7531）を使用して、空ベクター、配列番号17または配列番号１を発現する刺激細胞のFACS分析を行うことによって、C1ORF32タンパク質の膜発現レベルを評価した結果を示す。 配列番号１もしくは配列番号17のC1ORF32分子、またはコントロールとしての空ベクター、公知の共刺激分子もしくは公知の共抑制分子を発現する刺激細胞に応答したバルクT細胞の増殖の結果を示す。6つの実験の平均値±SEMを示す。**p<0.01および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。 様々なC1ORF32分子、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（CD4+）の増殖の結果を示す。3つの実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05、**p<0.01および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。 様々なC1ORF32分子、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（CD8+）の増殖の結果を示す。3つの実験の平均値±SEMを示す。**p<0.01、***p<0.001および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。 様々なC1ORF32分子、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（ナイーブCD4+CD45RA+）の増殖の結果を示す。**p<0.01および***p<0.001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。 様々なC1ORF32分子、またはコントロールとしての共刺激分子、共抑制分子もしくは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（バルク）の増殖（A）およびサイトカイン分泌（B〜G）の結果を示す。サイトカインのデータは、３連のウェルからプールした上清を３連で測定した結果を示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。 C1ORF32の細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナル抗体（5159-1）を使用して、C1ORF32を形質導入した悪性黒色腫細胞（mel526、mel624.38およびSK-mel23）のFACS分析を行い、これらの細胞におけるC1ORF32タンパク質の膜発現レベルを評価した結果を示す。 刺激後にTCR F4を形質導入したCD8+細胞（CTL）のFACS分析を、形質導入したこの特異的TCRの細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナル抗体（5159-1）を使用して行い、この特異的TCRの膜発現レベルを評価した結果を示す。 共培養アッセイにおいて、SK-mel 23悪性黒色腫細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）が、F4 TCRを発現するCTLの活性化を抑制したことを示す。これは、IFN-γの分泌の減少によって観察された。グラフは、4人の異なるドナーから得たCTLにF4 TCRを形質導入して使用した4つの独立した実験を示す。mel624.38悪性黒色腫細胞上に発現されたC1ORF32もCTLの活性化を抑制したが、この効果は統計的有意差を示さなかった。mel526悪性黒色腫細胞上に発現されたC1ORF32はCTLの活性化を抑制しない（*p<0.01）。 C1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）によるTregへの分化の誘導を示す。ナイーブCD4+T細胞の活性化は、iTreg細胞への分化を促進する条件下で、コントロールIg（10μg/mL）またはC1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）（1μg/mLまたは3μg/mL）の存在下において、放射線を照射したBalb/c脾細胞（1:1比；１ウェルあたり5×105個のT細胞を使用）およびOVA323-339ペプチド（20μg/mL）とともに培養することにより行った。4日間培養した後、T細胞のTregマーカーFoxP3の発現をフローサイトメトリーによって分析した。 活性化した初代NK細胞または新たに単離したNK細胞に対するC1ORF32（配列番号24）の結合性を示す。3人の異なるドナーから得た初代ヒトNK細胞株（図２６Ａ）または3人の別のドナーから新たに単離したNK細胞（図２６Ｂ）を、5μgの非標識C1ORF32（配列番号24）またはコントロールアイソタイプmIgG2aとともにインキュベートした。灰色のヒストグラムはmIgG2aを示し、赤色のヒストグラムおよび黒色のヒストグラムはC1ORF32を示す。 HEK293T細胞上に発現させたC1ORF32（配列番号１）によって、NK細胞の細胞傷害性に対するHEK293T細胞の感受性がわずかに減少したことを示す。Y軸は、細胞傷害（％）を示す。X軸は、エフェクター細胞と標的細胞の比（E：T）を示す。*（アスタリスク）はp値<0.05を示す。 抗C1ORF32抗体5166-9が、C1ORF32発現HEK293に対して強力なCDC活性を示すことを示す。HEK293細胞株を、補体の存在下において5166-9またはアイソタイプコントロールmIgMとともに1時間インキュベートした後、生存率を測定した。 抗C1ORF32抗体5166-9が、C1ORF32発現CHOK1細胞に対してCDC活性を示すことを示す。CHOK1細胞株を、補体の存在下において5166-9またはアイソタイプコントロールmIgMとともに1時間インキュベートした後、生存率を測定した。 C1ORF32の発現をHEK293T細胞とCHOK1細胞とで比較した結果を示す。C1ORF32抗体5159-1を使用してC1ORF32を検出した結果、C1ORF32発現HEK293細胞は、C1ORF32発現CHOK1細胞と比較してより多くの標的抗原を発現することが分かった。
実施形態の少なくともいくつかにおいて、本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのフラグメントおよび／もしくは複合体、ならびに／またはこれらを含む医薬組成物および／もしくは診断組成物であって、
該抗体が、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質に特異的に結合すること、ならびに、
該抗体が、特にがんの治療および／または診断を目的とした、治療薬および／または診断薬としての使用に適した抗体、具体的には、Ｃ１ＯＲＦ３２によって誘導された活性を促進または抑制する抗体を包含する、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であること
を特徴とするポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのフラグメントおよび／もしくは複合体、ならびに／またはこれらを含む医薬組成物および／もしくは診断組成物に関する。
排他的な理論や単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、本発明の様々な実施形態による抗体は後述する特性の１以上を有していてもよい。このような中和抗体は、Ｔｈ２からＴｈ１へのシフトを促進してもよく、この促進効果によって、抗腫瘍免疫応答を低下させる作用を持つ腫瘍微小環境の誘導によりＴｈ２／Ｍ２環境側へとシフトした状態を元に戻すことができる。したがって、該抗体は、がんを助長する免疫系構成要素（Ｔｈ２）を抑制しつつ、がんに対抗する免疫系構成要素（Ｔｈ１）を活性化してもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、そのような抗体は、ｉＴｒｅｇの蓄積およびその免疫抑制能を阻害し、かつ／またはエフェクターＴ細胞の活性を増強してもよい。
本明細書において「がん」は、悪性増殖または悪性腫瘍を発生させる無秩序な異常細胞分裂を特徴とする（浸潤性または転移性の）あらゆる新生物疾患を包含すると理解される。これらの具体例は本明細書に記載されているが、これらに限定されない。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、上記抗体は特定の生殖細胞系重鎖配列および生殖細胞系軽鎖配列に由来し、かつ／または特定の構造上の特徴を含む（たとえば、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を少なくとも１つ有する）。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、単離された抗体、該抗体の製造方法、該抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、該抗体を含む医薬組成物および診断組成物、ならびに本発明の実施形態の少なくともいくつかによる免疫複合体、代替足場および二重特異性分子を提供する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、インビトロおよびインビボにおいてＣ１ＯＲＦ３２タンパク質のいずれか１つを検出するための、上記抗体およびそのフラグメントの使用方法に関する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、さらに本発明は、本明細書に記載のがんを治療するための、上記の抗体、そのフラグメントおよび／もしくは複合体、ならびに／またはこれらを含む医薬組成物の使用方法に関する。Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質は、本願と同じ出願人によって出願されたＰＣＴ出願WO 2009/032845およびWO 2012/001647に開示されており、これらの文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。これらの出願においては、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびサイトカイン分泌によって誘導されたヒトおよびマウスＴ細胞の活性化が、マウスＩｇＧ２ａとＣ１ＯＲＦ３２分子のＥＣＤ配列との融合タンパク質によって抑制されることが実証されている。さらに、このＣ１ＯＲＦ３２融合タンパク質は、Ｔｈ２を誘導しつつＴｈ１の活性化を抑制する。このことは、Ｃ１ＯＲＦ３２がＴ細胞全体を抑制するのではなく、Ｔ細胞の生態においてより特異的な役割を果たしていることを示唆している。また、このＣ１ＯＲＦ３２融合タンパク質は、多発性硬化症（ＥＡＥ）マウスモデルおよび関節リウマチ（ＣＩＡ）マウスモデルの疾患の症状を改善する。このことは、Ｃ１ＯＲＦ３２が免疫調節において重要な役割を果たしていることを示している。上記のWO 2012/001647では、Ｃ１ＯＲＦ３２の免疫調節機能、具体的には、インビトロ、エクスビボおよびインビボ研究を含む様々な実験系における、Ｔ細胞の活性化に対する抑制活性が示されている。これらの結果を考え合わせると、負の共刺激因子のＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーであるＣ１ＯＲＦ３２は、新規の免疫チェックポイントであると言える。
WO 2009/032845では、Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体が、治療薬および／または診断薬（インビトロ診断法およびインビボ診断法）として有用である可能性が開示されている。Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体の具体例としては、免疫活性化作用または免疫抑制作用を有する抗体およびフラグメントが挙げられ、たとえば、特にＣ１ＯＲＦ３２抗原が差次的に発現されている状態（様々ながんおよび悪性腫瘍など）を治療するための、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性を介して細胞を標的とする抗体または抗体フラグメントが挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかにおいて、Ｃ１ＯＲＦ３２は、ｉＴｒｅｇの誘導および分化に関連することが分かった。単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、Ｃ１ＯＲＦ３２に特異的な遮断モノクローナル抗体は、ｉＴｒｅｇの蓄積およびその免疫抑制能を阻害し、かつエフェクターＴ細胞の活性を増強することが分かった。したがって、Ｃ１ＯＲＦ３２遮断抗体は、単独または内因性抗腫瘍応答を増強する１つ以上の増強手段と組み合わせてがん免疫療法に使用してもよく、また、このようにしてがん免疫療法に使用することが好ましい。
さらに驚くべきことに、本発明の様々な実施形態による抗体は、本明細書に記載の特定のがんの治療に特に有用であることが分かった。
本発明の理解をより容易にするために、まず特定の用語の定義を説明する。その他の用語の定義は、発明の詳細な説明において別途記載する。
「免疫細胞」は、造血器由来のあらゆる細胞を指し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびマクロファージを含むが、これらに限定されない。
本明細書において「ポリペプチド」は、修飾（たとえばリン酸化またはグリコシル化）の有無にかかわらず、ある一定の長さを有するアミノ酸鎖を指す。
本明細書において「共刺激ポリペプチド」または「共刺激分子」とは、Ｔ細胞上の細胞表面分子と相互作用することによって、Ｔ細胞応答を調節するポリペプチドである。
本明細書において「共刺激シグナル伝達」とは、抗原特異的Ｔ細胞応答の際に、抗原提示細胞上の共刺激ポリペプチドとＴ細胞上のその受容体との相互作用により生じるシグナル伝達活性である。単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、抗原特異的Ｔ細胞応答は以下の２種類のシグナルによって媒介されると考えられている。
１）ＭＨＣに関連して提示される抗原ペプチドとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との連結（シグナル１）
２）種々の共刺激受容体とリガンドとが接触してペアを形成するときに伝達される抗原非依存性の第２のシグナル（シグナル２）
単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、この「第２のシグナル」は、Ｔ細胞応答のタイプ（活性化または抑制）やＴ細胞応答の強度および持続期間を決定するのに重要な役割を果たしており、Ｂ７ファミリータンパク質などの共刺激分子からの正のシグナルと負のシグナルの両方の調節を受ける。
本明細書において「Ｂ７」ポリペプチドは、Ｔ細胞を共刺激するＢ７ファミリータンパク質のメンバーを指し、このファミリーのメンバーとしては、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｓ３、ならびにこれらの生物学的に活性なフラグメントおよび／またはバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的に活性なフラグメントの代表例としては、Ｔ細胞を共刺激する細胞外ドメインまたは該細胞外ドメインのフラグメントが挙げられる。
本明細書において「Ｃ１ＯＲＦ３２」は、がんにおいてがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に差次的に発現されている、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３のいずれかに示すタンパク質のいずれか１つ、配列番号１４、１０、１１、１５からなる群から選択される該タンパク質の細胞外ドメイン、それらのバリアント、オーソログおよび／もしくはフラグメント、ならびに／またはこれらをコードする核酸配列を指す。
本明細書において「免疫」応答は、レシピエント患者体内のペプチドに対する（抗体を介した）有益な液性応答および／または（抗原特異的Ｔ細胞またはこれらの分泌物を介した）細胞性応答の発生を指す。このような応答は、免疫原の投与によって誘導された能動的応答であってもよく、抗体もしくは感作Ｔ細胞の投与によって誘導された受動的応答であってもよい。単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、細胞性免疫応答は、クラスＩまたはクラスII ＭＨＣ分子と関連したポリペプチドエピトープの提示によって惹起され、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。この応答は、さらに、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、および好酸球の活性化、好中球または他の先天性免疫の構成要素の活性化または動員を伴ってもよい。細胞媒介性免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって確認することができる。免疫原の防御効果または治療効果に液性応答および細胞性応答が相対的にどの程度寄与しているのかは、免疫した同系の動物から抗体およびＴ細胞を別々に単離し、第２の対象において防御効果または治療効果を測定することにより調べることができる。
「免疫原」は、（必要に応じてアジュバントとともに）哺乳動物に投与されることによって、自体に対する免疫応答を誘導することができる。
本明細書において「抗体」は、完全なポリクローナル抗体、完全なモノクローナル抗体、およびこれらの抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）または一本鎖を包含する。さらに、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、少なくとも１つの重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）と重鎖定常領域とで構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインで構成されている。それぞれの軽鎖は、少なくとも１つの軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）と軽鎖定常領域とで構成されている。軽鎖定常領域は、ＣＬと呼ばれる１つのドメインで構成されている。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、超可変領域と超可変領域の間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が点在している。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端の方向に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）や古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの宿主組織または宿主因子と免疫グロブリンとの結合を媒介しうる。
本明細書において、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２分子および／またはそのフラグメント）に特異的に結合する能力を保持する１つ以上の抗体フラグメントを指す。抗体の抗原結合能は、完全長抗体の複数のフラグメントによって発揮されることが示されている。抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントとしては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント（軽鎖Ｖドメイン、重鎖Ｖドメイン、および軽鎖定常ドメイン（ＣＬおよびＣＨ１）からなる１価のフラグメント）；
（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；
（iii）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；
（iv）抗体の１つの腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；
（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；ならびに
（vi）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）
が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２種のドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別々の遺伝子によってコードされているが、これらのドメインを１つのタンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーでこれらのドメインを組換え法により連結することができ、これによって、一対のＶＬ領域およびＶＨ領域から１価の分子が形成される（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」に包含される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の慣用の技術を使用して得られ、完全な抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書において「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質に特異的に結合する単離された抗体および／またはそのフラグメント）。しかしながら、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の生物種由来のＣ１ＯＲＦ３２分子などの他の抗原に対して交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
本明細書において「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子で構成される抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性（アフィニティ）を示す。
本明細書において「ヒト抗体」は、可変領域のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する抗体を包含する。さらに、この抗体が定常領域を含んでいる場合、この定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発、またはインビボにおける体細胞突然変異誘発により導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体は、本明細書の「ヒト抗体」に含まれない。
「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を示す抗体であって、該抗体の可変領域のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマから産生され、ハイブリドーマとしては、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを持つ非ヒトトランスジェニック動物（たとえばトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞と、不死化細胞とを融合させたものが挙げられる。
本明細書において「組換えヒト抗体」は、組換え技術によって調製、発現、作製、または単離されたあらゆるヒト抗体を包含し、このような抗体として、たとえば、
（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたトランスジェニック動物もしくはトランスクロモソミック動物（たとえばマウス）またはこれらの動物より調製されたハイブリドーマから単離された抗体（さらに詳しくは後述する）；
（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（たとえばトランスフェクトーマ）から単離された抗体；
（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；および
（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングによる別のＤＮＡ配列の形成などを含む他の方法により調製、発現、作製、または単離された抗体
が挙げられる。このような組換えヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列を導入したトランスジェニック動物を使用した場合はインビボ体細胞突然変異誘発）に付することができることから、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつこれらの配列に関連するものではあるが、ヒト生殖細胞系のインビボ抗体レパートリーには本来存在しない配列であってもよい。
本明細書において「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体の種類（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
本明細書において「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という用語は、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同じ意味で用いられる。
本明細書において「ヒトＣ１ＯＲＦ３２タンパク質に特異的に結合する」抗体は、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質に結合する抗体を指し、好ましくは５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは３×１０−８Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−１０ＭのＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−１１ＭのＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−１２Ｍ以下のＫＤでＣ１ＯＲＦ３２タンパク質に結合する抗体を指す。
本明細書において「Ｋassoc」または「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指し、本明細書において「Ｋdiss」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。本明細書において「ＫＤ」は、解離定数を指し、Ｋａに対するＫｄの比率（すなわちＫｄ／Ｋａ）で得られ、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤ値を決定するための方法としては、表面プラズモン共鳴を使用した方法が好ましく、また、Biacore（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用した方法も好ましい。
本明細書において、ＩｇＧ抗体の「高親和性（アフィニティ）」とは、標的抗原に対する該抗体のＫＤが１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらに好ましくは１０−１０Ｍ以下であることを指す。しかしながら、「高親和性」結合は抗体のアイソタイプよって異なりうる。たとえば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、該抗体のＫＤが１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下であることを指す。
本明細書において「対象」または「患者」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を包含する。「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。
本明細書において「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を向上させる生物学的製剤を指す。ワクチンは抗原を含み、抗原としては、たとえば、免疫応答を惹起させることが可能な、弱毒化または死滅化させた病原体、そのような病原体の毒素、そのような病原体の表面タンパク質の１つなどが挙げられる。通常、ワクチンは、免疫系を刺激するための免疫増強薬としてアジュバントを含む。本明細書において「治療ワクチン」および／または「治療用ワクチン接種」は、感染症またはがんなどの進行中の疾患を治療するために使用されるワクチンを指す。
本明細書において「アジュバント」は、それ自体はいかなる特異的抗原性も有さないが、免疫系を刺激しワクチンに対する応答を増強させる薬物を指す。
本発明の様々な態様を以下の小章においてさらに詳細に説明する。
抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体
特定の生殖細胞系配列を有する抗体、相同抗体、保存的修飾を有する抗体、遺伝子操作された抗体、および修飾抗体を包含する本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、特定の機能的特徴または特定の機能的特性を有することを特徴とする。たとえば、これらの抗体はヒトＣ１ＯＲＦ３２に特異的に結合する。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、たとえばＫＤが１０−８Ｍ以下、または１０−９Ｍ以下、さらには１０−１０Ｍ以下であるような高い親和性（アフィニティ）でＣ１ＯＲＦ３２に結合することが好ましい。本発明の実施形態の少なくともいくつかによるＣ１ＯＲＦ３２特異的抗体は、
（ｉ）本明細書に記載されているようなＫＤ値、たとえば５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣ１ＯＲＦ３２に結合すること；
（ii）抗腫瘍免疫および自己免疫に関与するＴ細胞応答などの、免疫共刺激ならびにそれに関連する活性および機能を調節（増強または抑制）すること；
（iii）がん細胞によって発現されたＣ１ＯＲＦ３２抗原に結合するが、正常細胞には実質的に結合しないこと；
（iv）Ｔ細胞の増殖を増強すること；
（ｖ）Ｔ細胞によるインターフェロン−γの産生を増強すること；
（vi）ＩＬ−２の分泌を増強すること；
（vii）Ｔｈ１応答を増強すること；
（ｅ）Ｔｈ２応答を減弱すること；
（ｆ）抗原特異的メモリー応答を刺激すること；
（ｇ）抗体応答を刺激すること；ならびに
（ｈ）インビボにおけるがん細胞の増殖を抑制すること
から選択される特徴の１以上を示すことが好ましく、
上記がんは、甲状腺癌、好ましくは、甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌（好ましくはステージIIおよびIII）、偶発乳頭癌（IPC）、甲状腺髄様癌、および退形成甲状腺癌；扁平上皮癌、食道扁平上皮癌；乳癌、好ましくは、ステージII〜IVかつ／または低分化型の浸潤性乳管癌、面皰性乳癌および髄様癌（好ましくはグレード２）；卵巣癌、乳頭状漿液性・粘液性癌（好ましくはステージＩc〜IIIb）、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍；腎臓がん、明細胞癌（好ましくはステージＩ〜II）、嫌色素性腺腫、および肉腫様癌；前立腺腺癌（好ましくはステージＩ〜III）、良性前立腺肥大症、肝細胞癌（好ましくはステージIIおよびIII）、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、および胆管癌；膵臓がん、膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌および膵カルチノイド腫瘍；悪性黒色腫、好ましくは、ステージIVの悪性黒色腫、ならびに／または悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および軟部組織黒色腫の１以上；骨、軟骨、および軟部組織の肉腫、たとえば、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫および神経線維肉腫など（ただし、これらに限定されない）；リンパ腫、好ましくは、ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型すなわちリンパ球優勢型、リンパ球減少型、および非特定型）、Ｂ細胞リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（NMZL）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫（節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（セザリー症候群および菌状息肉腫）、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫）；子宮がん、好ましくは、類内膜腺癌（好ましくはステージＩ〜IIIc）；膀胱がん、好ましくは、移行上皮癌（好ましくはステージII〜IV）；肺がん、好ましくは、小細胞肺がん（好ましくはステージＩ〜IIIb）、非小細胞肺がん（好ましくは低〜中分化型の扁平上皮癌および腺癌）および大細胞癌；精巣セミノーマ；結腸直腸がん、好ましくは、結腸直腸腺癌（好ましくは中〜低分化型）；ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択される。
さらに、上記の抗体および／またはその複合体は、このようながん細胞の選択的死滅を効果的に誘導し、自己免疫およびがんに関与する免疫応答を効果的に調節することが好ましい。
Ｃ１ＯＲＦ３２に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは当技術分野において公知であり、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡが挙げられる。適切なアッセイは実施例において詳細に説明する。抗体の結合動態（たとえば結合アフィニティなど）も、当技術分野において公知の標準的なアッセイ（たとえばBiacore分析など）で評価することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、Ｃ１ＯＲＦ３２に結合可能な抗体からＣ１ＯＲＦ３２に特異的な抗体配列を調製した後、ＶＨ配列およびＶＬ配列を「混合および組み合わせ」て別の抗Ｃ１ＯＲＦ３２結合分子を作製することができる。このような「混合および組み合わせ」により作製した抗体のＣ１ＯＲＦ３２に対する結合性は、上記の結合アッセイ（たとえばＥＬＩＳＡなど）を使用して評価することができる。ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを混合および組み合わせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＨ配列を、構造的に類似したＶＨ配列と置き換えることが好ましい。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ配列を、構造的に類似したＶＬ配列と置き換えることが好ましい。たとえば、相同抗体から得たＶＨ配列およびＶＬ配列は、特に容易に混合および組み合わせることができる。
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
本明細書において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用した系からヒト抗体の可変領域を得た場合、該ヒト抗体は、特定の生殖細胞系配列の「産物」または「由来物」である重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。上記のような系として、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを目的抗原で免疫化する系、およびファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的抗原を用いてスクリーニングする系が挙げられる。特定のヒト抗体がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」または「由来物」であることの同定は、該ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列とを比較し、該ヒト抗体の配列に最も類似した配列を有する（すなわち同一性（％）が最も高い）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することによって行うことができる。
特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」または「由来物」であるヒト抗体は、たとえば体細胞自然突然変異または意図的に導入された部位特異的突然変異などによって、生殖細胞系配列と比較してアミノ酸が異なっていてもよい。しかしながら、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ他の生物種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（たとえばマウスの生殖細胞系配列）と比較したときにヒトの抗体であると同定されるアミノ酸残基を含んでいる。特定の場合においては、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。通常、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、このヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比較したときのアミノ酸差異が１０個以下であろう。特定の場合においては、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比較したときのアミノ酸差異が５個以下、さらには４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下であってもよい。
相同抗体
さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、好ましい抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体から単離された抗Ｃ１ＯＲＦ３２アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、かつ親抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の所望の機能特性を保持している。
本明細書において、２つのアミノ酸配列間の相同性（homology）（％）は、２つのアミノ酸配列間の同一性（identity）（％）と同じ意味である。２つの配列間の同一性（％）は、これらの配列においてアミノ酸が一致している位置の数の関数（すなわち、相同性（％）＝一致している位置の数／位置の総数×１００）で表され、２つの配列のアライメントを最適化するために導入する必要のあるギャップの数およびギャップの長さが考慮に入れられている。２つの配列間の配列比較および同一性（％）の決定は、以下の例示（ただしこれらに限定されない）に記載されているように、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。
２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝１２、ギャップペナルティ＝４として、ALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. MeyersおよびW. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを使用し、ギャップウェイト＝１６、１４、１２、１０、８、６、または４、ギャップ長ウェイト＝１、２、３、４、５、または６として、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（市販）に含まれるＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムを用いて決定することもできる。
上記に加えてまたは別法として、たとえば関連配列を同定する目的で、本発明のタンパク質配列を「クエリー配列」として使用して公共データベースを検索することもできる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J Mol. Biol. 215:403-10によるXBLASTプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。XBLASTプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）によりBLASTタンパク質検索を行い、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を行う目的でギャップが挿入されたアライメントを得るためには、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTを使用することができる。BLASTプログラムおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（たとえばXBLASTおよびNBLAST）の初期パラメータを使用することができる。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であって、これらのＣＤＲ配列の１つ以上が、本明細書に記載の方法を使用して単離および調製された好ましい抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列が保存的に修飾された配列を含むこと、ならびに当該抗体が、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の所望の機能特性を保持していることを特徴とする。
実施形態のいくつかにおいて、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、たとえば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
本明細書において「保存的配列修飾」は、上記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に顕著な影響または変化を及ぼさないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加および欠失を包含する。修飾は、たとえば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技術によって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸残基を類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換することである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体のＣＤＲ領域内の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーに属する他のアミノ酸残基と置換することができ、このようにして改変された抗体は、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、特定の機能（すなわち上記（ｃ）〜（ｊ）に記載の機能）を保持しているかどうかを評価することができる。さらに、当技術分野でよく知られているように、このような修飾およびこれと同時に実施される他の最適化を行うためにコンピュータープログラムを使用することができる。
実施形態のいくつかでは、１個のアミノ酸のみが置換される。実施形態のいくつかでは、２〜３個のアミノ酸が置換される。さらに別の実施形態では、４〜６個のアミノ酸が置換される。さらに別の実施形態では、７〜１０個のアミノ酸が置換される。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２と同一のエピトープに結合する抗体
別の実施形態において、本発明は、Ｂ７共刺激の調節およびこれに関連する機能などの所望の機能特性を有する、ヒトＣ１ＯＲＦ３２上の好ましいエピトープに結合する抗体を提供する。所望のエピトープ特異性を有する他の抗体を選択してもよく、このような抗体は、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原との結合において所望の抗体と交差競合する能力を有するであろう。
遺伝子操作された抗体および修飾された抗体
本発明の実施形態の少なくともいくつかにおいて、出発物質としての抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体に由来するＶＨ配列および／またはＶＬ配列を１つ以上有する抗体を使用して、修飾抗体を遺伝子操作により作製することができ、このような修飾抗体は、出発抗体に由来する特性が改変されたものであってもよい。抗体は、片方または両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）の１つ以上の残基を修飾することによって遺伝子操作することができ、たとえば１つ以上のＣＤＲ領域および／または１つ以上のフレームワーク領域の１つ以上の残基を修飾することによって抗体を遺伝子操作することができる。上記に加えてまたは別法として、たとえば抗体のエフェクター機能を改変する目的で、定常領域の残基を修飾して抗体を遺伝子操作することができる。
実施可能な可変領域に対する遺伝子操作の１つとして、ＣＤＲの移植が挙げられる。抗体は、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在するアミノ酸残基を主に介して標的抗原と相互作用する。このことから、ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも抗体ごとに大きく異なる。ＣＤＲ配列は抗体−抗原相互作用の大部分を担っているため、特定の天然抗体のＣＤＲ配列をこの抗体とは異なる特性を有する別の抗体のフレームワーク配列に移植した発現ベクターを構築することによって、この天然抗体が有する特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winterに付与された米国特許第5,225,539号；ならびにQueenらに付与された米国特許第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号；および第6,180,370号を参照されたい）。
適切なフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公表されている文献から得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上で利用可能な）「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースから得ることができ、さらに、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; および Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J Immunol. 24:827-836（これら文献の内容は本明細書の一部を構成するものとして援用される）にも記載されている。
可変領域を修飾するための別の方法として、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域および／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を変異させることにより、目的の抗体の１つ以上の結合特性（たとえば親和性）を向上させることが挙げられる。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ突然変異誘発を実施することにより突然変異を導入することができ、また、変異導入が抗体の結合性または目的とする他の機能特性に及ぼす効果は、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイで評価することができる。（上述したような）保存的修飾を導入することが好ましい。突然変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であってもよいが、アミノ酸の置換であることが好ましい。さらに、通常、ＣＤＲ領域の１個、２個、３個、４個または５個以下の残基が改変される。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる遺伝子操作された抗体は、たとえば抗体の特性を向上させることなどを目的として、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク残基に修飾がなされたものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を低下させる目的で行われる。たとえば、このような方法の１つとして、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列へと「復帰突然変異させる」方法が挙げられる。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、この抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含んでいてもよい。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と、この抗体が由来する生殖細胞系配列とを比較することによって同定することができる。
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域になされる修飾に加えてまたはこの別法として、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、Ｆｃ領域に修飾が加えられるように遺伝子操作してもよく、このような修飾は、通常、血清中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害などの抗体の１つ以上の機能特性を改変するために行われる。さらに、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、化学的に修飾してもよく（たとえば、１つ以上の化学成分を抗体に結合させることができる）、その糖鎖を改変するために修飾を行ってもよく、これらの場合においても抗体の１つ以上の機能特性を改変するために修飾が行われる。このような実施形態については以下で詳細に説明する。Ｆｃ領域の残基はＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い番号を付ける。
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾して、ヒンジ領域のシステイン残基数がたとえば増加または減少するように改変する。この方法は、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに詳細に説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数の改変は、たとえば軽鎖および重鎖の構築を容易にしたり、抗体の安定性を増加また減少させたりするために行われる。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインの界面領域に１つ以上のアミノ酸突然変異を導入することによって、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に対する抗体の結合性を、ネイティブＦｃヒンジドメイン−ＳｐＡ結合よりも低下させる。この方法は、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に説明されている。
別の実施形態では、抗体を修飾してその生物学的半減期を増加させる。様々な方法を採用することができる。たとえば、Wardによる米国特許第6,277,375号に記載されているように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの突然変異の１つ以上を導入することができる。別法として、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られたサルベージ受容体結合エピトープがＣＨ１領域またはＣＬ領域に含まれるように抗体を改変することによって、生物学的半減期を増加させることができる。
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域の少なくとも１個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換して改変することにより、抗体のエフェクター機能を改変する。たとえば、２３４番目、２３５番目、２３６番目、２３７番目、２９７番目、３１８番目、３２０番目および３２２番目のアミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置換することによって、親抗体の抗原結合能力を保持させつつ、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性を改変することができる。親和性が改変された抗体が認識するエフェクターリガンドは、たとえばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であってもよい。この方法は、Winterらによる米国特許第5,624,821号および第5,648,260号にさらに詳細に説明されている。
別の実施形態では、３２９番目、３３１番目および３２２番目のアミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置換することによって、抗体のＣ１ｑ結合性を改変させ、かつ／または抗体の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低下または欠失させることができる。この方法は、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に説明されている。
別の実施形態では、２３１番目および２３９番目のアミノ酸残基の１個以上を改変することによって、抗体が補体を結合する能力を改変する。この方法は、BodmerらによるＰＣＴ国際公開WO 94/29351にさらに詳細に説明されている。
さらに別の実施形態では、２３８番目、２３９番目、２４８番目、２４９番目、２５２番目、２５４番目、２５５番目、２５６番目、２５８番目、２６５番目、２６７番目、２６８番目、２６９番目、２７０番目、２７２番目、２７６番目、２７８番目、２８０番目、２８３番目、２８５番目、２８６番目、２８９番目、２９０番目、２９２番目、２９３番目、２９４番目、２９５番目、２９６番目、２９８番目、３０１番目、３０３番目、３０５番目、３０７番目、３０９番目、３１２番目、３１５番目、３２０番目、３２２番目、３２４番目、３２６番目、３２７番目、３２９番目、３３０番目、３３１番目、３３３番目、３３４番目、３３５番目、３３７番目、３３８番目、３４０番目、３６０番目、３７３番目、３７６番目、３７８番目、３８２番目、３８８番目、３８９番目、３９８番目、４１４番目、４１６番目、４１９番目、４３０番目、４３４番目、４３５番目、４３７番目、４３８番目または４３９番目のアミノ酸の１個以上を修飾することによってＦｃ領域を修飾し、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増強させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この方法は、PrestaによるＰＣＴ国際公開WO 00/42072にさらに詳細に説明されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ結合部位、ＦｃγＲII結合部位、ＦｃγＲIII結合部位およびＦｃＲｎ結合部位はマッピングされており、結合性を向上させたバリアントが文献に記載されている（Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照されたい）。また、２５６番目、２９０番目、２９８番目、３３３番目、３３４番目および３３９番目における特異的突然変異は、ＦｃγＲIIIに対する結合性を向上させることが示されている。さらに、Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの多重突然変異によりＦｃγＲIIIに対する結合性が向上することが示されている。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓなどの突然変異は、ＦｃＲｎに対する結合性を向上させ、抗体の循環半減期を延長させる（Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301-316を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体の糖鎖を改変する。たとえば、脱グリコシル化された抗体（すなわち糖鎖を持たない抗体）を作製することができる。糖鎖を改変することによって、たとえば、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。このような糖鎖の改変は、たとえば、抗体配列の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによって行うことができる。たとえば、１個以上のアミノ酸を置換することによって、可変領域のフレームワークから１つ以上のグリコシル化部位を取り除き、その部位の糖鎖を除去することができる。このような脱グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を増加させてもよい。このような方法は、Coらによる米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に説明されている。
上記に加えてまたは別法として、改変された糖鎖を有する抗体を作製することができ、たとえば、フコシル残基の数を減少させた低フコシル化抗体やバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体などを作製することができる。このようなグリコシル化パターンの改変によって、抗体のＡＤＣＣ能が増強されることが実証されている。このような糖鎖の改変は、たとえば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって行うことができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において知られており、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組換え抗体を発現させて、改変された糖鎖を有する抗体を産生させるための宿主細胞として使用することができる。たとえば、Ｍｓ７０４細胞株、Ｍｓ７０５細胞株およびＭｓ７０９細胞株はフコシルトランスフェラーゼ（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８））遺伝子を欠くことから、Ｍｓ７０４細胞株、Ｍｓ７０５細胞株およびＭｓ７０９細胞株において発現された抗体はその糖鎖にフコースを持たない。このようなＭｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞株は、２種の置換ベクターを使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって作製される（Yamaneらによる米国特許公開第20040110704号およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照されたい）。別の例として、Hanaiらによる欧州特許第1,176,195号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能破壊された細胞株が記載されており、この細胞株において発現された抗体は、α１，６結合に関連する酵素が減少または除去されたことによってフコシル残基の数が減少している。さらに、Hanaiらの文献には、抗体のＦｃ部分に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低い細胞株、およびこのような酵素活性を有さない細胞株（たとえばラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）が記載されている。PrestaによるＰＣＴ国際公開WO 03/035835には、ＣＨＯ細胞株のバリアント（Ｌｅｃ１３細胞）が記載されており、この細胞株では、Ａｓｎ（２９７番目）に結合した糖鎖にフコースを付加する能力が低減されていることから、この宿主細胞において発現された抗体のフコシル残基数も低減されている（Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。UmanaらによるＰＣＴ国際公開WO 99/54342には、糖タンパク質修飾を行うグリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII））を発現するように遺伝子操作された細胞株が記載されており、この遺伝子操作された細胞株において発現される抗体は、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加しており、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増強されている（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。別法として、フコシダーゼを使用して抗体のフコース残基を切断してもよい。たとえば、α−Ｌ−フコシダーゼというフコシダーゼは、抗体からフコシル残基を取り除く（Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23）。
本明細書において実施可能な別の抗体修飾として、ＰＥＧ化が挙げられる。たとえば抗体の生物学的（たとえば血清中）半減期を増加させることなどを目的として、抗体をＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するためには、通常、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合するような条件下において、抗体またはそのフラグメントをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（たとえばＰＥＧの反応性エステル誘導体または反応性アルデヒド誘導体など）と反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により行うことが好ましい。本明細書において「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるあらゆる形態のＰＥＧを包含し、たとえば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコール、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールマレイミドが挙げられる。特定の実施形態では、脱グリコシル化抗体をＰＥＧ化する。タンパク質をＰＥＧ化する方法は当技術分野において公知であり、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体に使用することができる。たとえば、Nishimuraらによる欧州特許第0 154 316号およびIshikawaらによる欧州特許第0 401 384号を参照されたい。
抗体の遺伝子操作方法
上述したように、本明細書に開示されているＶＨ配列およびＶＫ配列を有する抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体のＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列またはこれらの配列に結合した定常領域を修飾することによって、新たな抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製することができる。したがって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる別の一態様においては、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の構造上の特徴を利用して、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体の少なくとも１つの機能特性（たとえばヒトＣ１ＯＲＦ３２に対する結合性など）を保持する構造的に関連した抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製する。たとえば、上述したように、１つのＣ１ＯＲＦ３２抗体またはその突然変異体の１つ以上ＣＤＲ領域と、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲとを組換え技術により組み合わせることによって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる遺伝子操作された別の組換え抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製することができる。他のタイプの修飾としては上述の章に記載したものが挙げられる。上記の遺伝子操作方法における出発物質は、本明細書に記載のＶＨ配列および／またはＶＫ配列の１つ以上、またはこれらのＣＤＲ領域の１つ以上である。遺伝子操作された抗体を作製するためには、本明細書に記載のＶＨ配列および／もしくはＶＫ配列の１つ以上またはこれらの配列のＣＤＲ領域の１つ以上を有する抗体を実際に調製することは必要とされない（すなわちタンパク質として発現させることは必要とされない）。このような抗体を実際に調製するのではなく、これらの配列に含まれている情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する「第二世代」の配列を作製し、次いでこの「第二世代」の配列をタンパク質として調製および発現させる。
標準的な分子生物学的技術を使用して、改変した抗体配列を調製したり発現させることができる。
改変された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載の方法および配列を使用して作製された抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の機能特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてを保持するものであることが好ましく、このような機能特性として、特定のＫＤ値以下でＣ１ＯＲＦ３２抗原に結合すること、Ｂ７共刺激を調節すること、およびたとえばＣ１ＯＲＦ３２抗原を発現しているがん細胞などの所望の標的細胞に選択的に結合することが挙げられる。
改変された抗体の機能特性は、当技術分野において使用可能かつ／または本明細書に記載の標準的なアッセイを使用して評価することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を遺伝子操作するための方法の特定の実施形態において、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体をコードする配列の全体またはその一部に沿ってランダムまたは選択的に突然変異を導入し、その結果得られた改変抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を結合活性および／または他の所望の機能特性についてスクリーニングすることができる。
突然変異の導入方法は当技術分野において知られている。たとえば、ShortによるＰＣＴ国際公開WO 02/092780には、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ、またはこれらの組み合わせを使用して抗体突然変異体を作製し、次いでこの抗体をスクリーニングする方法が記載されている。別法として、LazarらによるＰＣＴ国際公開WO 03/074679には、コンピュータによるスクリーニング方法を使用して抗体の生理化学的な特性を最適化する方法が記載されている。
抗体をコードする核酸分子
本発明の別の一態様は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞中または細胞溶解物中に含まれていてもよく、部分的に精製された形態であっても実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、当技術分野でよく知られている他の方法などの標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質（たとえば他の細胞核酸またはタンパク質）を除去する精製工程を経た場合に「単離された」または「実質的に純粋である」と言える。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる核酸は、たとえばＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（たとえば、さらに詳しくは後述するような、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから作製されたハイブリドーマ）により発現される抗体の場合、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローン技術を使用して、該ハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。（たとえば、ファージディスプレイ技術を使用して）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから抗体を得る場合は、抗体をコードする核酸を該ライブラリーから回収することができる。
ＶＨセグメントコードするＤＮＡ断片およびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を得た後、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作し、たとえば、これらの可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域やフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に機能可能に連結される。
本明細書において「機能可能に連結する」とは、上記２種のＤＮＡ断片によりコードされるそれぞれのアミノ酸配列をインフレームに維持したまま、上記２種のＤＮＡ断片を連結させることを指す。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（たとえば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、ヒト重鎖定常領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域であってよいが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域が最も好ましい。Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子は、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することにより作製することができる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（Ｆａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（たとえば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、ヒト軽鎖定常領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域であってよいが、κ定常領域が最も好ましい。
ｓｃＦｖ遺伝子の作製は、ＶＨをコードするＤＮＡ断片およびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカー（たとえばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３など）をコードする別のフラグメントに機能可能に連結させ、次いで、ＶＨ領域とＶＬ領域とがフレキシブルリンカーによって連結された一本の連続したタンパク質鎖としてＶＨ配列およびＶＬ配列を発現させることによって行うことができる（たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照されたい）。
抗Ｃ１ＯＲＦ３２モノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は慣用のモノクローナル抗体方法論（たとえば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など）を包含する様々な技術によって作製することができる。原則として、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術（たとえば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発がん性形質転換など）を使用することもできる。
ハイブリドーマを作製するための動物系としてはマウス系が好ましい。マウスにおけるハイブリドーマの作製は十分に確立された手法である。融合に用いる免疫した脾細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび免疫化技術は、当技術分野において知られている。融合パートナー（たとえばマウスミエローマ細胞）および融合手順も公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上述のように作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。上記の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的とする抗体を産生するマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学技術を使用して、非マウス（たとえばヒト）の免疫グロブリン配列を含有するように遺伝子操作することができる。たとえば、当技術分野で公知の方法を使用してマウス可変領域をヒト定常領域に連結することによって、キメラ抗体を作製することができる（たとえば、Cabillyらに付与された米国特許第4,816,567号を参照されたい）。また、当技術分野で公知の方法を使用してマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することによって、ヒト化抗体を作製することができる（たとえば、Winterに付与された米国特許第5,225,539号；ならびにQueenらに付与された米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号および第6,180,370号を参照されたい）。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、上記の抗体はヒトモノクローナル抗体である。Ｃ１ＯＲＦ３２に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系の代わりにヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。このようなトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書においてＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを包含し、本明細書においてこれらのマウスは合わせて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ社）は、内因性のμ鎖座およびκ鎖座を不活性化する標的突然変異を有し、再構築されていないヒト重鎖（μ鎖およびγ鎖）免疫グロブリン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座を含んでいる（たとえばLonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、このマウスはマウスＩｇＭまたはマウスκ鎖の発現が低下しており、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子のクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こし、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を産生する（前掲のLonberg, N. et al. (1994）に記載されており；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546において再調査されている）。ＨｕＭａｂマウスの作製および使用、ならびにこのマウスが持つゲノム修飾については、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに詳細に記載されており、これらの文献の具体的内容はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。さらに、LonbergおよびKayに付与された米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号、および第5,770,429号；Suraniらに付与された米国特許第5,545,807号；LonbergおよびKayに付与されたＰＣＴ国際公開WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884およびWO 99/45962；およびKormanらに付与されたＰＣＴ国際公開WO 01/14424も参照されたい。
別の実施形態では、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を持つマウス（たとえば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を持つマウスなど）を使用して作製することができる。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるマウスは、Ishidaらに付与されたＰＣＴ国際公開WO 02/43478に詳しく説明されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系も当技術分野において使用することができ、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製するために使用することができる。たとえば、Xenomouse（アブジェニックス社）と呼ばれる別のトランスジェニック系を使用することができ、このマウスは、たとえば、Kucherlapatiらに付与された米国特許第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号および第6,162,963号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソミック動物系も当技術分野において使用することができ、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製するために使用することができる。たとえば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を持つマウスを使用することができ、このマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を持つウシが当技術分野において報告されており（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、このウシも、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を作製するために使用することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して作製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は当技術分野において確立されている。たとえば、Ladnerらに付与された米国特許第5,223,409号、第5,403,484号、および第5,571,698号；Dowerらに付与された米国特許第5,427,908号および第5,580,717号；McCaffertyらに付与された米国特許第5,969,108号および第6,172,197号；ならびにGriffithsらに付与された米国特許第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号および第6,593,081号を参照されたい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒトモノクローナル抗体は、免疫化によりヒト抗体応答を惹起できるように再構築されたヒト免疫細胞を有するＳＣＩＤマウスを使用して作製することもできる。このようなマウスは、たとえば、Wilsonらに付与された米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記載されている。
ヒトＩｇマウスの免疫化
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗体を作製するためにヒトＩｇマウスを使用する場合、このマウスを、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原および／または組換えＣ１ＯＲＦ３２融合タンパク質の精製調製物または濃縮調製物で免疫することができ、このような方法は、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；ならびにＰＣＴ国際公開WO 98/24884およびWO 01/14424に記載されている。６〜１６週齢のマウスに最初の注入を行うことが好ましい。たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原の精製調製物または組換え調製物（５〜５０μｇ）を腹腔内投与することによりヒトＩｇマウスを免疫することができる。
他の研究者による様々な抗原を用いた過去の実験より、まず、完全フロイントアジュバントを加えた抗原を腹腔内（ＩＰ）投与することにより免疫し、次いで、不完全フロイントアジュバントを加えた抗原を２週間に１回腹腔内投与することにより免疫（計６回まで）すると、トランスジェニックマウスにおいて応答が確認されることが示されている。しかしながら、フロイント以外のアジュバントも効果的であることが分かっている。さらに、アジュバント非存在下の細胞は免疫原性が高いことが分かっている。後眼窩採血によって得られる血漿試料を使用して、免疫化プロトコル中に免疫応答をモニターすることができる。（後述の）ＥＬＩＳＡによって血漿をスクリーニングすることができ、抗Ｃ１ＯＲＦ３２ヒト免疫グロブリンの力価が十分に高いマウスを融合に使用することができる。屠殺および脾臓摘出の３日前に、抗原をマウスに静脈内投与することによりブーストを行うことができる。それぞれの抗原の免疫化につき２〜３回の融合が必要であると予想される。通常、抗原それぞれに対して６〜２４匹のマウスを免疫する。通常、ＨＣｏ７株およびＨＣｏ１２株を使用する。さらに、ＨＣｏ７由来導入遺伝子とＨＣｏ１２由来導入遺伝子とを交配して、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスを作製することもできる。別法としてまたは上記に加えて、ＫＭマウス株を使用することもできる。
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫したマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞株などの適切な不死化細胞株と融合させることにより作製することができる。このようにして得られたハイブリドーマから抗原特異的抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。たとえば、免疫したマウスから得られた脾リンパ球の単一細胞懸濁液と、６分の１の細胞数のP3X63-Ag8.653マウス非分泌型ミエローマ細胞（ATCC、CRL 1580）とを５０％ＰＥＧを用いて融合させることができる。平底マイクロタイタープレートに約２×１０５個の細胞を播種し、次いで、20% fetal Clone Serum、18%「653」調整培地、5% origen（IGEN社）、4mM Ｌ−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM ２−メルカプトエタノール、50単位/mLペニシリン、50mg/mLストレプトマイシン、50mg/mLゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（シグマ社；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加する）を含む選択培地中で２週間インキュベートする。約２週間後、ＨＡＴの代わりにＨＴを添加した培地中で細胞を培養することができる。次いで、各ウェルをヒトモノクローナルＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。ハイブリドーマが広範に増殖してから、通常１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再び播種して、再度スクリーニングを行い、ヒトＩｇＧがなお陽性であれば、このモノクローナル抗体を限界希釈法により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次いで、安定なサブクローンを特性評価用の組織培養培地でインビトロ培養して少量の抗体を産生させることができる。
ヒトモノクローナル抗体の精製を目的として、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２Ｌスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清をろ過および濃縮した後、プロテインＡセファロース（ファルマシア社（ニュージャージー州ピスカタウェイ））を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付することができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を確保することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、吸光係数１．４３を用いてＯＤ２８０で濃度を測定することができる。モノクローナル抗体は小分けし−８０℃で保存することができる。
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、たとえば当技術分野においてよく知られているような組換えＤＮＡ技術と遺伝子導入技術との組み合わせなどを使用して、宿主細胞であるトランスフェクトーマから作製することもできる（たとえばMorrison, S. (1985) Science 229:1202を参照されたい）。
たとえば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させることを目的として、完全長軽鎖および完全長重鎖またはそれらの一部をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学技術（たとえば目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって得た後、このＤＮＡを発現ベクターに挿入して、該遺伝子を転写制御配列および翻訳制御配列に機能可能に連結させることができる。本明細書において「機能可能に連結する」とは、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するという本来の機能を発揮できるように、抗体遺伝子をベクターにライゲートすることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができるが、より一般的には両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。これらの抗体遺伝子は、標準的な方法（たとえば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターの相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を使用して、あらゆる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製することができる。すなわち、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域がすでにコードされている発現ベクターに、本明細書に記載の抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入し、ベクター内のＣＨセグメントに重鎖可変領域のＶＨセグメントを機能可能に連結し、かつベクター内のＣＬセグメントに軽鎖可変領域のＶＫセグメントを機能可能に連結することによって、あらゆる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製することができる。上記に加えてまたは別法として、上記の組換え発現ベクターには、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドがコードされていてもよい。該シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組換え発現ベクターは、上記の抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（たとえばポリアデニル化シグナル）を包含する。このような調節配列は、たとえば、Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列の選択を包含する発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって左右されうることは当業者であれば十分に理解できるであろう。哺乳動物宿主細胞における発現に好適な調節配列としては、哺乳動物細胞においてタンパク質を高発現させるウイルスエレメント、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターやβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。さらに、由来の異なる様々な配列から構成される調節エレメント、たとえば、ＳＶ４０早期プロモーターに由来する配列とヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列に由来する配列とを含むＳＲαプロモーター系（Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）などが挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組換え発現ベクターは、上記の抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、たとえば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば複製開始点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を保有していてもよい。選択マーカー遺伝子によって、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易となる（たとえば、Axelらに付与された米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、第5,179,017号を参照されたい）。たとえば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、（メトトレキサートにより選択／増幅が行われるｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８選択用の）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
上記の軽鎖および重鎖を発現させることを目的として、上記の軽鎖および重鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術を用いて宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語およびこの用語の変化形は、たとえば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションなどの、原核宿主細胞または真核宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するために一般的に使用される様々な技術を包含する。理論上、原核宿主細胞および真核宿主細胞のいずれにおいても本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞において抗体を発現させることが最も好ましく、これは、このような真核細胞、具体的には哺乳動物細胞は、原核細胞と比較して、適切に折りたたまれかつ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性がより高いからである。抗体遺伝子を原核細胞において発現させても、活性な抗体を高収率で産生させることはできないことが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組み換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞が挙げられ、この細胞は、たとえばR. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621などに記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。具体的には、ＮＳＯミエローマ細胞を使用する場合、別の好ましい発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036および欧州特許第338,841号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞において抗体を発現させるのに十分な時間、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地中に抗体が分泌されるのに十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を作製する。抗体は標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
抗原に対する抗体の結合の特性評価
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、たとえば標準的なＥＬＩＳＡなどによって、Ｃ１ＯＲＦ３２に対する結合性を評価することができる。簡単に述べると、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍＬの精製Ｃ１ＯＲＦ３２でマイクロタイタープレートをコーティングし、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。希釈した抗体（たとえば免疫したマウスから得た血漿を希釈したもの）を各ウェルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼ標識第２試薬（たとえば、ヒト抗体に対しては、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍＬ）で発色させ、ＯＤ４０５〜６５０で分析する。最も高い力価を示したマウスを融合に使用することが好ましい。
上述のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｃ１ＯＲＦ３２免疫原に対して陽性の反応を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。Ｃ１ＯＲＦ３２と高いアビディティで結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらにその特性を評価する。親細胞の反応性（ＥＬＩＳＡで評価）を保持する各ハイブリドーマから１つのクローンを選択し、細胞バンクとして５〜１０本のバイアル中に−１４０℃で保存するとともに、抗体精製に使用する。
抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２Ｌスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清をろ過および濃縮した後、プロテインＡセファロース（ファルマシア社（ニュージャージー州ピスカタウェイ））を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付することができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を確保することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、吸光係数１．４３を用いてＯＤ２８０で濃度を測定することができる。モノクローナル抗体は小分けし−８０℃で保存することができる。
選択した抗Ｃ１ＯＲＦ３２モノクローナル抗体が、ユニークなエピトープに結合するかどうか確認するために、市販の試薬（ピアス社（イリノイ州ロックフォード））を使用して抗体をビオチン化することができる。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用した比較試験は、上述したような、Ｃ１ＯＲＦ３２をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して行うことができる。ビオチン化モノクローナル抗体の結合は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼプローブで検出することができる。
精製した抗体のアイソタイプを確認するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを行うことができる。たとえば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを確認するために、１μｇ／ｍＬ抗ヒト免疫グロブリンでマイクロタイタープレートの各ウェルを４℃で一晩かけてコーティングすることができる。１％ＢＳＡでブロッキングした後、１μｇ／ｍＬ以下の濃度の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプコントロールとプレートとを環境温度において１〜２時間反応させる。次いで、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭに特異的なアルカリホスファターゼ標識プローブとウェルとを反応させることができる。上述したようにプレートを発色させて分析する。
さらに、抗Ｃ１ＯＲＦ３２ヒトＩｇＧは、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原との反応性についてウエスタンブロットにより試験することができる。簡単に述べると、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、１０％ウシ胎仔血清でブロッキングし、試験モノクローナル抗体をプローブとして用いてＣ１ＯＲＦ３２抗原を検出する。ヒトＩｇＧの結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出することができ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Sigma Chem社（ミズーリ州セントルイス））で発色させることができる。
代替足場
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、特異的抗体と類似した特異性および親和性を有する足場タンパク質に関する。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、１つ以上のエピトープ結合ドメインに連結した足場タンパク質を含む抗原結合コンストラクトに関する。遺伝子操作されたこのような足場タンパク質は、通常、ループ領域またはそれ以外の許容される表面部位に突然変異を誘発させたランダムライブラリーを設計し、次いで、ファージディスプレイまたはその関連技術を使用して任意の標的に結合するバリアントを選択することによって得られる。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は代替足場に関し、代替足場としては、アンチカリン（anticalin）、DARPin、アルマジロリピートタンパク質、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、チオレドキシン、化学的に束縛されたペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、がん、自己免疫疾患および感染症の治療薬ならびにインビボ診断薬として使用される代替足場に関する。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、さらに、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本明細書において「足場タンパク質」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場を包含するがこれに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）足場としては、たとえば、ＩｇＧ足場が挙げられ、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場は、四本鎖抗体であっても二本鎖抗体であってもよく、抗体のＦｃ領域のみを含んでいてもよく、抗体の定常領域を１つ以上含んでいてもよく（この定常領域はヒト由来であっても霊長類由来であってもよい）、ヒトまたは霊長類由来の定常領域の人工キメラであってもよい。このような足場タンパク質は、１つ以上の定常領域に加えて抗原結合部位を含んでいてもよく、たとえば、足場タンパク質は完全なＩｇＧを含んでいてもよい。また、上記のような足場タンパク質は、他のタンパク質ドメイン、たとえば抗原結合部位を有するタンパク質ドメイン（たとえばエピトープ結合ドメインまたはｓｃＦｖドメインなど）と連結する能力を有するであろう。
「ドメイン」は、タンパク質の他の部分から独立した三次構造を持つ折りたたまれたタンパク質構造である。通常、ドメインは、タンパク質が有する独立した様々な機能特性を担い、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／または該ドメインの機能を損なうことなく、他のタンパク質に付加されてもよいし、タンパク質から除去されてもよいし、他のタンパク質へと移動されてもよい。「単一の抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折りたたまれたポリペプチドドメインである。したがって、単一の抗体可変ドメインには、完全な抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメインが包含され、たとえば、抗体可変ドメインの特徴を有さない配列によって１つ以上のループが置換された修飾可変ドメイン、切断された抗体可変ドメイン、Ｎ末端伸長またはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも完全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折りたたみフラグメントが包含される。
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、Ｖ領域やＶドメインの違いとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、様々な他の可変領域または可変ドメインを有する形態（たとえばホモ多量体またはヘテロ多量体）であってよく、このような他の可変領域または可変ドメインは、該免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原への結合に必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらなる可変ドメインとは無関係に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合することが可能な本明細書に記載の「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよく、さらに、他の生物種由来の単一抗体可変ドメイン、たとえば、（たとえばWO 00/29004に開示されている）げっ歯類、テンジクザメおよびラクダ科のＶＨＨ ｄＡｂなどをも包含する。ラクダ科ＶＨＨは、軽鎖を欠いた重鎖抗体を天然に産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコなどの生物種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野において利用可能な標準的な技術によってヒト化してもよく、本発明によれば、このようなドメインも「ドメイン抗体」に包含される。本明細書において「ＶＨ」は、ラクダ科ＶＨＨドメインを包含する。ＮＡＲＶは、テンジクザメなどの軟骨魚類において同定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。このドメインは、新規な抗原受容体可変領域（Novel Antigen Receptor variable region；一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）として知られている。詳細については、MoI. Immunol. 44, 656-665 (2006)および米国特許第20050043519(A)号を参照されたい。
「エピトープ結合ドメイン」は、Ｖ領域またはＶドメインの違いとは関係なく抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。エピトープ結合ドメインは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）（たとえばヒト、ラクダ科、サメ科の免疫グロブリン単一可変ドメイン）であってもよく、ＣＴＬＡ−４（Evibody）；リポカリン；プロテインＡのＺドメイン（Affibody、SpA）、Ａドメイン（Avimer／Maxibody）などのプロテインＡ由来分子；ＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（trans-body）；アンキリンリピートタンパク質（DARPin）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチン領域（tetranectin）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（affilin）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害薬のサソリ毒kunitz型ドメイン；アルマジロリピートタンパク質；チオレドキシン；ならびにフィブロネクチン（adnectin）からなる群から選択される足場誘導体であるドメインであってもよく、これらの足場誘導体は、天然リガンド以外のリガンドに結合するようにタンパク質工学により遺伝子操作されている。
抗体のＣＤＲに相当するループを異種配列で置換することにより該抗体に様々な結合特性を付与することができる（すなわちEvibody）。詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、脂質などの疎水性低分子を輸送する細胞外タンパクのファミリーである。リポカリンは、円錐形構造の開放端にいくつかのループを有する強固な二次構造を持ち、このループを遺伝子操作することによって様々な標的抗原に結合させることが可能となる。アンチカリン（anticalin）は、１６０〜１８０個のアミノ酸で構成されており、リポカリンに由来する。詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第7250297(B1)号および米国特許第20070224633号を参照されたい。affibodyは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに由来する足場であり、抗原に結合するように遺伝子操作することができる。affibodyは、３つのヘリックスの束からなり、約５８個のアミノ酸で構成されている。affibodyを含むライブラリーは表面残基をランダム化することによって作製されている。詳細については、Protein Eng. Des. SeI. 17, 455-462 (2004)および欧州特許第1641818(A1)号を参照されたい。アビマー（avimer）は、Ａドメイン足場ファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。アビマーを作製する元となるドメインは、約３５個のアミノ酸からなり、明確なジスルフィド結合構造をとっている。Ａドメインファミリーに起こる自然変異を様々に組み合わせることによって、アビマーに多様性を持たせることができる。詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照されたい。トランスフェリンは、血清中に存在する単量体の輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、改変可能な表面ループにペプチド配列を挿入することによって、様々な標的抗原に結合するように遺伝子操作することができる。遺伝子操作されたトランスフェリン足場として、trans-bodyが挙げられる。詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照されたい。
アンキリンリピートタンパク質（DARPin）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリンを元に設計されている。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスと１つのβターンとからなる３３残基のモチーフである。アンキリンリピートは、各リピートの第１αヘリックスおよびβターンの残基をランダム化することによって、様々な標的抗原に結合するように遺伝子操作することができる。モジュールの数を増やすことによって、結合面を増加させることができる（この方法はアフィニティ成熟と呼ばれる）。詳細については、J. MoI. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)、J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007)および米国特許第20040132028(A1)号を参照されたい。
フィブロネクチンは、抗原に結合するように遺伝子操作することが可能な足場である。アドネクチン（adnectin）は、ヒトフィブロネクチンタイプIII（ＦＮ３）を構成する１５個の繰り返し単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を骨格とする。βサンドイッチの一端の３つのループを遺伝子操作することによって、アドネクチンに目的とする治療標的を特異的に認識させることが可能となる。詳細については、Protein Eng. Des. SeI. 18, 435-444 (2005)、米国特許第20080139791号、WO 2005056764および米国特許第6818418(B1)号を参照されたい。
ペプチドアプタマーは、束縛された可変ペプチドループが活性部位に挿入された定常足場タンパク質（通常チオレドキシン（ＴｒｘＡ））からなるコンビナトリアル認識分子である。詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5. 783-797 (2005)を参照されたい。
ミクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含む２５〜５０アミノ酸長の天然のマイクロタンパク質に由来し、このようなマイクロタンパク質としては、KalataBI、コノトキシンおよびknottinが挙げられる。これらのマイクロタンパク質には、マイクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を及ぼすことなく２５個までのアミノ酸を付加することによって遺伝子操作可能なループが存在する。遺伝子操作されたknottinドメインの詳細については、WO 2008098796を参照されたい。
他のエピトープ結合ドメインとして、様々な標的抗原結合特性を遺伝子操作するための足場として使用されてきたタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、ヒトγＢ−クリスタリン、ヒトユビキチン（affilin）、ヒトプロテアーゼ阻害薬のkunitz型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質であるＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が挙げられ、これらは、Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)の第７章およびProtein Science 15:14-27 (2006)において再検討されている。本発明のエピトープ結合ドメインは、上記の代替タンパク質ドメインのいずれに由来していてもよい。
複合体または免疫複合体
本発明は、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原およびその可溶性部分（細胞外ドメイン、一部分、バリアントなど）を含む、免疫療法に使用される複合体を包含する。たとえば、本発明は、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原のＥＣＤが免疫グロブリンまたはそのフラグメントに結合された複合体を包含する。本発明は、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原の活性（たとえば免疫共刺激など）を促進または抑制するための上記複合体の使用、ならびに本明細書に記載の移植片拒絶の徴候、自己免疫疾患の徴候、およびがんの徴候の治療における上記複合体の使用を意図したものである。
別の一態様において、本発明は、細胞毒素、薬物（たとえば免疫抑制薬）、放射性毒素などの治療成分に結合させた抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体またはそのフラグメントを含む免疫複合体を特徴とする。本明細書において、このような複合体を「免疫複合体」と呼ぶ。１以上の細胞毒素を含む免疫複合体を「免疫毒素」と呼ぶ。細胞毒素または細胞傷害薬は、細胞に有害な（たとえば細胞を死滅させるような）あらゆる薬物を包含する。このような薬物として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。さらに上記のような治療薬として、たとえば、代謝拮抗薬（たとえばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化薬（たとえばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（II）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（たとえば（以前はダウノマイシンと呼ばれていた）ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば（以前はアクチノマイシンと呼ばれていた）ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（たとえばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体に結合可能な他の好ましい治療用細胞毒素としては、デュオカルマイシン類、カリケアミシン類、メイタンシン類およびオーリスタチン類、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアミシン−抗体複合体の一例として、市販品（Mylotarg（登録商標）；Wyeth社）が挙げられる。
細胞毒素は、当技術分野において利用可能なリンカー技術を使用して、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体に結合することができる。細胞毒素を抗体に結合するために使用されているリンカーとしては、ヒドラゾン類、チオエーテル類、エステル類、ジスルフィド類、およびペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。選択可能なリンカーとしては、たとえば、リソソーム区画内において低ｐＨ条件下で切断されやすいリンカー、およびプロテアーゼ（たとえばカテプシン類（たとえばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの、腫瘍組織において選択的に発現されるプロテアーゼなど）により切断されやすいリンカーが挙げられる。
細胞毒素の種類、リンカーの種類、および治療薬を抗体に結合させる方法のさらなる考察については、Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P. A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091;およびSenter, P. D. and Springer, C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.も参照されたい。
さらに、本発明の抗体を放射性同位体と結合させて、細胞傷害性を有する放射性医薬品（放射性免疫複合体とも呼ぶ）を作製することもできる。診断または治療に用いることを目的として抗体に結合することが可能な放射性同位体としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。放射性免疫複合体の調製方法は当技術分野において確立されている。市販されている放射性免疫複合体としては、ゼヴァリン（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals社）およびベキサール（登録商標）（Corixa Pharmaceuticals社）が挙げられ、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を使用して、類似の方法により放射性免疫複合体を調製することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体複合体を使用して任意の生物学的応答を修飾することができ、抗体複合体の薬物成分は古典的な化学治療薬に限定されない。たとえば、薬物成分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質として、たとえば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素またはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子およびインターフェロン−γなどのタンパク質；ならびに、リンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、他の増殖因子などの生物学的応答調節因子が挙げられる。
このような治療成分を抗体に結合するための技術はよく知られており、たとえば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照されたい。
二重特異性分子
別の一態様において本発明は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能分子、たとえば別のペプチドもしくはタンパク質（たとえば、別の抗体、受容体に対するリガンドなど）と連結することによって、少なくとも２種の異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。また、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を誘導体化するか、または２種以上の他の機能分子に連結することによって、３種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を作製してもよく、このような多重特異性分子も本明細書の「二重特異性分子」に包含される。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子は、抗体を１以上の他の結合分子に（たとえば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合などにより）機能的に連結することによって作製することができ、該他の結合分子としては、たとえば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド、結合ミメティックなどが挙げられる。
したがって、本発明は、Ｃ１ＯＲＦ３２に対する第１の結合特異性を少なくとも１つと、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異性分子を包含する。本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、第２の標的エピトープは、Ｆｃ受容体、たとえば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本発明は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲまたはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（たとえば単球、マクロファージまたは多核白血球（ＰＭＮ））と、Ｃ１ＯＲＦ３２を発現する標的細胞との両方に結合することができる二重特異性分子を包含する。このような二重特異性分子によって、エフェクター細胞をＣ１ＯＲＦ３２発現細胞にターゲティングし、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性、たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２発現細胞に対する食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカインの放出、スーパーオキシドアニオンの発生などを引き起こさせる。
二重特異性分子が多重特異性を有する本発明の実施形態の少なくともいくつかにおいて、この二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗６ｆ結合特異性に加えて、第３の結合特異性をさらに有していてもよい。一実施形態において、第３の結合特異性は、抗増強因子部分（anti-enhancement factor (EF) portion）であり、抗増強因子成分とは、たとえば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質と結合することによって標的細胞に対する免疫応答を増強させる分子である。
「抗増強因子部分（anti-enhancement factor portion）」は、任意の分子（たとえば抗原や受容体）と結合することによって、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原と結合する決定基の作用を増強させる抗体、機能的抗体フラグメントまたはリガンドであってもよい。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原と結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第１の結合特異性および第２の結合特異性による結合対象とは異なる対象に結合することができる。たとえば、抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞と結合することができる（たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１、もしくは他の免疫細胞を介して結合すること、または細胞傷害活性に関与する表面タンパク質と結合することができ、これによって標的細胞に対する免疫応答を増強する）。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、二重特異性分子は結合特異性として少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメントを含み、このような抗体フラグメントとして、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖Ｆｖが挙げられる。また、Ladnerらによる米国特許第4,946,778号（この文献の内容は本明細書の一部を構成するものとして援用される）に記載されているように、上記の抗体は、軽鎖二量体、重鎖二量体、またはそれらの最小フラグメント（Ｆｖや一本鎖コンストラクトなど）であってもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、二重特異性分子は当技術分野で公知の技術に基づいて作製され、このような公知技術の具体例としては、「Dual variable domain」（DVD）抗体（アボット社、米国特許第7,612,181号（この文献の内容は本明細書の一部を構成するものとして援用される）に記載）；「Dual-affinityre-targeting」（DART）（Macrogenics社, Blood. 2011; 117(17):4542-4551）；「Modular antibody technology by F-star」（Protein Eng Des Sel. 2010; 23(4):289）；「Bispecific T-cell engager technology」（BITE）（Micromet社、J Immunother. 2009 Jun;32(5):452-64）；「Bicycle technology」（Bicycle Therapeutics社、Nature Chemical Biology 2009; 5, 502-507）；「Dual targeting domain antibodies」（dAbs）（Domantis社、米国特許第20100247515号）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体によって付与され、この抗体による結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によって遮断されない。本明細書において「ＩｇＧ受容体」は、第１染色体に位置する８個のγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらのγ鎖遺伝子は、合計１２種の膜貫通型または可溶性の受容体アイソフォームをコードし、これらの受容体アイソフォームは３つのＦｃγ受容体クラス、すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲII（ＣＤ３２）およびＦｃγＲIII（ＣＤ１６）に分類される。好ましい一実施形態において、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体のＩｇＧに対して高い親和性（１０８〜１０９Ｍ−１）を示す。
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の作製およびその特性評価については、FangerらによってＰＣＴ公開WO 88/00052および米国特許第4,954,617号に記載されており、これらの教示はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。これらの抗体は、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲII受容体またはＦｃγＲIII受容体のエピトープに結合するが、これらのエピトープは当該受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位に存在するため、該抗体と該エピトープとの結合は生理的濃度のＩｇＧによって実質的に遮断されない。本発明において有用な抗ＦｃγＲＩ抗体は、具体的には、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ受託番号：ＨＢ９４６９）から入手可能である。別の実施形態において、抗Ｆｃγ受容体抗体はヒト化されたモノクローナル抗体２２（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の作製および特性評価については、Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002およびＰＣＴ公開WO 94/10332に記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞株はＨＡＯ２２ＣＬＩの名称でAmerican Type Culture Collectionに寄託されており、その受託番号はＣＲＬ １１１７７である。
さらに別の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、たとえばＦｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））などのヒトＩｇＡ受容体に結合する抗体によって付与され、その結合はヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によって遮断されないことが好ましい。「ＩｇＡ受容体」は、第１９染色体に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むものである。この遺伝子は選択的スプライシングされた５５〜１１０ｋＤａの膜貫通型アイソフォームをいくつかコードすることが知られている。
ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸球および好中球に構成的に発現されているが、非エフェクター細胞集団には発現されていない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有しているが、これは、Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露により上昇する（Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440）。ＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体として、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７の４種が同定されており、これらはＩｇＡリガンド結合ドメイン以外の部位でＦｃαＲＩに結合することが報告されている（Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764）。
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子において使用されるトリガー受容体として好ましく、この理由として、
（１）主として免疫エフェクター細胞（たとえば、単球、ＰＭＮ、マクロファージ、樹状細胞）上に発現されること；
（２）高レベル（たとえば細胞１個あたり5,000〜100,000）に発現されること；
（３）細胞傷害活性（たとえば、ＡＤＣＣ、食作用）を媒介すること；
（４）これらの受容体にターゲティングされた抗原提示（自己抗原を含む）の増強を媒介すること
が挙げられる。
二重特異性分子に使用される抗体としてヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子において使用することができる他の抗体として、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、結合特異性を有する構成成分同士を結合させることによって作製することができ、たとえば、抗ＦｃＲ結合特異性を有する成分と、抗Ｃ１ＯＲＦ３２結合特異性を有する成分とを結合させることによって作製することができる。たとえば、二重特異性分子を構成する結合特異性成分は、それぞれ別々に作製した後に結合させてもよい。結合特異性成分がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を使用して共有結合によりこれらを結合させることができる。架橋剤としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（たとえば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686；およびLiu, M A et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法としては、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されているものが挙げられる。結合剤としてはＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣが好ましく、これらはいずれもピアスケミカル社（イリノイ州ロックフォード）より入手可能である。
上記の結合特異性成分がいずれも抗体である場合、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりこれらの抗体を結合させてもよい。特に好ましい実施形態では、抗体を結合させる前に、ヒンジ領域を修飾して奇数個、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を付加する。
あるいは、両方の結合特異性成分を同一ベクター内にコードし、同一宿主細胞において発現および再構築させることができる。二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、この方法は特に有用である。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体と結合決定基とを含む一本鎖分子であってもよく、２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含んでいてもよい。二重特異性分子の作製方法は、たとえば、米国特許第5,260,203号；米国特許第5,455,030号；米国特許第4,881,175号；米国特許第5,132,405号；米国特許第5,091,513号；米国特許第5,476,786号；米国特許第5,013,653号；米国特許第5,258,498号；および米国特許第5,482,858号に記載されている。
特定の標的に対する二重特異性分子の結合は、たとえば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（たとえば増殖抑制）またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、通常、目的とする特定のタンパク質−抗体複合体の存在を、この目的複合体に特異的な標識試薬（たとえば抗体）を使用して検出する。たとえば、ＦｃＲ−抗体複合体は、たとえば、このＦｃＲ−抗体複合体を認識しこれに特異的に結合する酵素標識抗体または酵素標識抗体フラグメントを使用して検出することができる。あるいは、上記の目的複合体は、様々な他のイムノアッセイを使用して検出することもできる。たとえば、抗体を放射能で標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（たとえば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986（この文献は本明細書の一部を構成するものとして援用される）を参照されたい）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターを使用した方法、またはオートラジオグラフィによって検出することができる。
医薬組成物およびその使用
別の一態様おいて、本発明は組成物を提供し、たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を単独または組み合わせて含み、薬学的に許容される担体とともに製剤化された医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体、免疫複合体、代替足場および／または二重特異性分子を単独または（たとえば２種以上の異なるものを）組み合わせて含んでいてもよい。たとえば、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する抗体（もしくは免疫複合体もしくは二重特異性分子）の組み合わせ、または相補的な活性を有する抗体（もしくは免疫複合体もしくは二重特異性分子）の組み合わせを含んでいてもよい。
Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体、特にＣ１ＯＲＦ３２特異的ヒト抗体およびＣ１ＯＲＦ３２特異的抗体組成物は、がんの治療および診断を含む様々な治療用途ならびにインビトロおよびインビボにおける診断用途に有用であり、該がんは、甲状腺癌、好ましくは、甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌（好ましくはステージIIおよびIII）、偶発乳頭癌（IPC）、甲状腺髄様癌、および退形成甲状腺癌；扁平上皮癌、食道扁平上皮癌；乳癌、好ましくは、ステージII〜IVかつ／または低分化型の浸潤性乳管癌、面皰性乳癌および髄様癌（好ましくはグレード２）；卵巣癌、乳頭状漿液性・粘液性癌（好ましくはステージＩc〜IIIb）、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍；腎臓がん、明細胞癌（好ましくはステージＩ〜II）、嫌色素性腺腫、および肉腫様癌；前立腺腺癌（好ましくはステージＩ〜III）、良性前立腺肥大症；肝細胞癌（好ましくはステージIIおよびIII）、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、および胆管癌；膵臓がん、膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌および膵カルチノイド腫瘍；悪性黒色腫、好ましくは、ステージIVの悪性黒色腫、ならびに／または悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および軟部組織黒色腫の１以上；骨、軟骨、および軟部組織の肉腫、たとえば、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫および神経線維肉腫など（ただし、これらに限定されない）；リンパ腫、好ましくは、ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型すなわちリンパ球優勢型、リンパ球減少型、および非特定型）、Ｂ細胞リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（NMZL）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫（節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（セザリー症候群および菌状息肉腫）、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫）；子宮がん、好ましくは、類内膜腺癌（好ましくはステージＩ〜IIIc）；膀胱がん、好ましくは、移行上皮癌（好ましくはステージII〜IV）；肺がん、好ましくは、小細胞肺がん（好ましくはステージＩ〜IIIb）、非小細胞肺がん（好ましくは低〜中分化型の扁平上皮癌および腺癌）および大細胞癌；精巣セミノーマ；結腸直腸がん、好ましくは、結腸直腸腺癌（好ましくは中〜低分化型）；ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択される。
単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、がん細胞に作用するＴ細胞刺激の負の調節を阻害してもよい。たとえば、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体分子は、様々な疾患の治療、予防、および診断を目的として、インビトロまたはエクスビボにおいて培養細胞に投与したり、たとえばインビボなどにおいてヒト対象に投与したりすることができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体（たとえば、ヒト抗体、多重特異性分子、二重特異性分子、免疫複合体、代替足場および組成物）は、Ｃ１ＯＲＦ３２発現細胞の増殖抑制および／または破壊；ヒトエフェクター細胞の存在下における、Ｃ１ＯＲＦ３２発現細胞に対する食作用またはＡＤＣＣの媒介；ならびにＣ１ＯＲＦ３２とＣ１ＯＲＦ３２リガンドとの結合の阻害から選択される生物学的活性の１つ以上をインビボまたはインビトロにおいて誘導するために使用することができる。
「治療」は治療処置および予防手段の両方を指す。治療を必要とする対象としては、既にがんを発症している対象およびがんの予防処置がなされる対象が挙げられる。したがって、本明細書において治療対象となる哺乳動物は、がんを有すると診断されたもの、がんの素因を有するもの、がんに罹患しやすいもののいずれであってもよい。本明細書において「治療する」は、上記がん疾患、障害または状態の、予防、発症の遅延、治癒、改善、減弱、緩和、最小化、抑制、悪影響の阻止、または識別可能な症状の安定化を行うことを指す。さらに、「治療する」は上記のがんの管理を行うことを含む。「管理」は、疾患の重症度の低減、疾患のエピソード出現頻度の低減、疾患のエピソード出現期間の短縮、疾患のエピソードの重症度の低減、がん細胞の成長または増殖の遅延／抑制、少なくとも１つの症状の進行の遅延、少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善などを意味する。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を指し、ヒト、家畜、動物園の飼育動物、スポーツに使用される動物、愛玩動物、たとえば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが挙げられる。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
「治療有効量」は、哺乳動物の疾患または障害を治療するのに効果的な本発明の薬物の量を指す。
本発明の治療薬は、対象に単独で提供することができ、あるいは、薬学的に許容される担体と混合することにより医薬組成物の一部として提供することができる。
また、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体、そのフラグメントおよび／もしくは複合体、ならびに／またはこれらを含む医薬組成物は、併用療法において投与すること、すなわち、他の増強手段および／または他の治療法と組み合わせて投与することができる。実施形態の少なくともいくつかによれば、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、当技術分野において公知の標準的ながん療法（たとえば、http://www.cancer.gov/cancertopicsに記載されているようながん療法）のいずれとも組み合わせて使用することができると考えられる。
たとえば、併用療法は、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体、そのフラグメントおよび／もしくは複合体、ならびに／またはこれらを含む医薬組成物と、少なくとも１つの他の治療薬、免疫調節薬、化合物、免疫療法または免疫刺激法との組み合わせを含んでいてもよく、組み合わせられる薬物または治療法としては、腫瘍ワクチン；養子Ｔ細胞療法；Ｔｒｅｇ除去；抗体（たとえば、ベバシズマブ、アービタックス、イピリムマブ）；ペプチド；ペプチボディ；小分子；細胞傷害薬および細胞増殖抑制薬（たとえば、パクリタキセル、シスプラチン、ビノレルビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、テモゾロミド、イリノテカン、５ＦＵ、カルボプラチン）などの化学療法薬；インターフェロンおよびインターロイキンなどの免疫調節薬；免疫刺激抗体；成長ホルモン；他のサイトカイン；葉酸；ビタミン；無機質；アロマターゼ阻害薬；ＲＮＡｉ；ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬；プロテアソーム阻害薬などが挙げられるが、これらに限定されない。別の例において、併用療法は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体またはＣ１ＯＲＦ３２調節薬と、少なくとも１つの他の治療薬または免疫調節薬との組み合わせを含んでいてもよく、該抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体またはＣ１ＯＲＦ３２調節薬としては、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチド複合体、およびＣ１ＯＲＦ３２に結合する、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、他の薬物などの小分子などが挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体と組み合わせて使用することができる治療法は、抗腫瘍応答を高める増強手段である。
がん免疫療法を行うことを目的として、抗ＩＬＤＲ２遮断抗体と増強手段とを様々な方法で組み合わせることができる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、主として内因性の抗腫瘍応答を増強するように設計された増強手段と組み合わせて使用され、このような増強手段としては、たとえば、
ａ．他のがん免疫療法（たとえば、養子Ｔ細胞療法、がん治療ワクチン、免疫刺激抗体など）との組み合わせ；
ｂ．特定の致死刺激およびアポトーシス誘導物質（たとえば、放射線療法およびいくつかの古典的化学療法など）によって、immunogenic cell deathを引き起こし、それによって死滅したがん細胞を内因性の治療ワクチンとして機能させて、抗腫瘍免疫応答を刺激すること；
ｃ．いくつかの抗がん薬（たとえば古典的化学療法および標的療法など）によって、腫瘍細胞のimmunogenic cell deathを誘導することにより、または免疫系のエフェクター機構を作動させることにより、腫瘍特異的免疫応答を刺激すること（Galluzziら、2012）（これに関して言えば、定期的な化学療法は免疫抑制作用ではなく免疫刺激作用を発揮すると考えられる）
などが挙げられる。
抗腫瘍免疫応答を増強するための手段としての慣用／古典的化学療法薬は、
ゲムシタビン（悪性細胞上のＭＨＣクラスＩの発現を増加させ、Ｔ細胞への腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを増強し、骨髄系抑制細胞（ＭＤＳＣ）を選択的に殺傷する）；
オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン（および他の白金系化合物）（これらの薬物も悪性細胞上のＭＨＣクラスＩの発現を増加させ、Ｔ細胞への腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを増強する）；
シクロホスファミド（この薬物も悪性細胞上のＭＨＣクラスＩの発現を増加させ、さらに、低用量のシクロホスファミドは、ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇを含む抑制性細胞サブセットを選択的に抑制し、ＣＤ４ヘルパー細胞からＩＬ−１７分泌抗腫瘍サブタイプへの分化を促進し、ＮＫ細胞およびＴ細胞のエフェクター機能を回復し、かつ免疫抑制サイトカイン（すなわちＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）の産生を抑制する）；
アントラサイクリン類（たとえば、ドキソルビシン（腫瘍抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を増強し、ＩＬ−１７産生γδＴ細胞および活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を促進する）、ダウノルビシン（がん細胞による抗原発現を阻害する）など）；
タキサン類（たとえば、パクリタキセル（サイトカインの産生を阻害し、Ｔｒｅｇの生存力を損なう）、ドセタキセル（ＭＤＳＣレベルを低下させる）など）；
他の微小管阻害薬（たとえば、ビンクリスチン（特定のＤＣサブセットの存在量を増加させ、ＤＣ媒介性抗原提示を刺激する）など）；
葉酸拮抗薬（たとえば、メトトレキサート（低濃度において、ＤＣの成熟およびＤＣのＴ細胞刺激能を増強すると考えられている）など）；
ｍＴＯＲ経路阻害薬（たとえば、テムシロリムスおよびラパマイシン（免疫刺激作用を発揮することができ、ＩＤＯ発現およびＴｒｅｇを減少させるとともに、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を増強することができる）など）；
特定の化学療法薬（たとえば、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびミトキサントロン（immunogenic cell deathを誘起する）など）
からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体と併用することができる化学療法薬のいくつか、たとえば、パクリタキセル、シスプラチンおよびドキソルビシンなどは、グランザイムＢに対する腫瘍細胞の浸透性を亢進させることができ、それによって、腫瘍細胞は、たとえＣＴＬによって認識される抗原を発現していなくても、ＣＴＬに媒介される溶解を起こしやすくなる（すなわちバイスタンダー効果）。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、抗がん活性を有することが示されているビスホスホネート類（特にアミノビスホスホネート（ＡＢＰ））と組み合わせて使用される。ＡＢＰに関連する活性のいくつかは、先天免疫と獲得免疫の境界に位置し、かつ強力な抗腫瘍活性を有するヒトγδＴ細胞において見られる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、標的療法と組み合わせることによって、抗腫瘍免疫応答を増強する薬物として使用される（Galluzzi et al 2012; Vanneman and Dranoff 2012）。
標的薬には、少なくとも部分的にオフターゲットメカニズムに基づいて治療効果を発揮するものもあれば、免疫系の媒介によって治療効果を発揮するものもあると考えられる。
たとえば、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬のいくつか、たとえば、ボリノスタット、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５などは、がん細胞表面のＮＫ活性化受容体リガンドの発現を増加させることによって、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の認識を容易にする。プロテアソーム阻害薬であるボルテゾミブは、ＣＴＬ媒介性またはＮＫ媒介性細胞融解に対する感受性を腫瘍細胞に付与する。
ＢＲＡＦ阻害薬であるベムラフェニブは、腫瘍抗原の発現を増加させ、腫瘍による免疫抑制サイトカインの分泌を減少させる。ＪＡＫ２阻害薬は、ＤＣの成熟、ＤＣ媒介性抗原提示およびＴ細胞プライミングを増強する。
特定のチロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）、たとえば、エルロチニブ、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブなどは、ＭＨＣクラスIIの発現を増加させることによりがんに対する免疫応答を促進し、immunogenic cell deathを誘導し、免疫抑制細胞（ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣ）の腫瘍への浸潤を減少させ、腫瘍細胞による免疫抑制酵素ＩＤＯの発現を減少させ、かつ／またはＤＣ機能を抑制する。
特定の治療用モノクローナル抗体、たとえば、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブおよびパニツムマブ、ならびに抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブなどは、腫瘍特異的細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の産生、ＮＫ細胞の腫瘍への浸潤、およびＮＫ細胞媒介性のモノクローナル抗体依存性細胞傷害を促進する。ベバシズマブはＴｒｅｇを減少させ、ＤＣの分化を促進する。
実際には、標的療法薬のいくつかは、腫瘍に対する免疫応答を惹起するのに不利となる望ましくない免疫抑制メカニズムを作動させるため、すべての標的療法薬が抗腫瘍免疫応答を増強するとは限らない。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、Ｔｒｅｇを標的とする治療薬と組み合わせて使用される（Facciabene et al 2012; Byrne et al 2011; Gabrilovich and Nagaraj 2009）。
一般的に使用される化学療法薬の多くは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数またはＴｒｅｇの免疫抑制能を低下させる。Ｔｒｅｇを非特異的標的とするこのような薬物としては、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビンなどの抗有糸分裂薬、サリドマイド、サリドマイド誘導体およびＣＯＸ−２阻害薬が挙げられる。
Ｔｒｅｇを特異的標的とする新規薬物として、以下のものが挙げられる。
１）Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を認識することによってＴｒｅｇを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体、たとえば、抗ＣＤ２５抗体であるダクリズマブおよびバシリキシマブなど
２）リガンド標的毒素、たとえば、デニロイキン ディフィトックス（オンタック）（ヒトＩＬ−２とジフテリア毒素との融合タンパク質）、ＬＭＢ−２（ＣＤ２５に対するｓｃＦｖと緑膿菌外毒素との融合物）など
３）Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を標的とする抗体、たとえば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＯＸ４０、ＧＩＴＲなど
Ｔｒｅｇの機能を破壊する他の方法としては、ＴＬＲの調節、アデノシン作動経路を阻害する薬物（たとえばエクトヌクレオチダーゼ阻害薬など）、およびＡ２Ａアデノシン受容体阻害薬が挙げられる。
Ｔｒｅｇの誘導を阻害する方法としてはＴＧＦ−β阻害薬が挙げられ、腫瘍組織へのＴｒｅｇの動員を阻害する方法としては、たとえばＣＣＬ２／ＣＣＲ４経路などに対するケモカイン受容体阻害薬が挙げられる。
ＭＤＳＣを標的とする方法としては、ＭＤＳＣから抑制機能を持たない成熟骨髄性細胞への分化を促進する方法が挙げられる。ビタミンＡ代謝産物、たとえば、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）などは、ＭＤＳＣからＤＣおよびマクロファージへの分化を刺激することが分かっている。また、ビタミンＤ３がＭＤＳＣに対して類似の作用を発揮することが最近示されている。
別の方法としては、ＣＯＸ２阻害薬、ホスホジエステラーゼ５阻害薬（シルデナフィルなど）、またはＲＯＳ阻害薬（ニトロアスピリンなど）を使用して、ＭＤＳＣの抑制活性を阻害する方法が挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、免疫刺激抗体と組み合わせることによって、抗腫瘍免疫応答を増強する薬物として使用される（Pardoll 2012）。
免疫刺激抗体は、免疫機能を直接調節すること、すなわち、他の抑制性標的を阻害すること、または共刺激タンパク質を増強することによって、抗腫瘍免疫を促進する。免疫刺激抗体としては、ＣＴＬＡ４（例：イピリムマブ）、ＰＤ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６）、ＰＤＬ−１（例：ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５）、ＬＡＧ−３（例：ＩＭＰ−３２１）、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡなどの免疫チェックポイントを標的とするアンタゴニスト抗体；およびＣＤ４０（例：ＣＰ−８７０,８９３）、ＣＤ１３７（例：ＢＭＳ−６６３５１３）、ＯＸ４０（例：抗ＯＸ４０）、ＧＩＴＲ（例：ＴＲＸ５１８）などの免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体が挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、Ｔ細胞プライミングと抗原提示とを向上させることが可能ながん治療ワクチンと組み合わせることによって、抗腫瘍免疫応答を増強する薬物として使用される（Mellman et al 2011; Palucka and Banchereau 2012）。
そのようながん治療ワクチンとしては、外因性がんワクチンおよび樹状細胞ベースのワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
外因性のがんワクチンとしては、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するために使用されるタンパク質またはペプチド（樹状細胞の誘引物質、たとえば、ＧＭ−ＣＳＦなどを含んでいてもよい）、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクター（炎症誘発性物質または他の誘引物質、たとえば、ＧＭ−ＣＳＦを含んでいてもよい）、腫瘍抗原をコードするＤＮＡベースのワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質、樹状細胞、樹状細胞を標的とするタンパク質、樹状細胞が挙げられる。
樹状細胞（ＤＣ）はがん患者から単離することができ、このようにして得られた樹状細胞をいくつかの方法によってプライミングすることにより腫瘍特異的Ｔ細胞を得ることができる。たとえば、刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦなど）の存在下で腫瘍抗原の融合タンパク質または融合ペプチドをＤＣに取り込ませるか、ＤＣ標的モノクローナル抗体とＤＣとを結合させるか、あるいは腫瘍細胞またはその溶解物をＤＣに取り込ませた後、次いでエクスビボにおいてＤＣを活性化および成熟させ、患者に点滴で戻すことができる。また、単球を用いて類似の方法を実施することができる。さらに、腫瘍患者から得たサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど）分泌腫瘍細胞に放射線を照射した後、その腫瘍細胞を腫瘍患者に注射で戻すことによって、インビボで樹状細胞をプライミングすることもでき、その結果、樹状細胞は腫瘍細胞を貪食し、インビボにおいてＴ細胞に腫瘍抗原を提示する。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、がん免疫療法のための抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は、養子細胞移入と併用することにより、抗腫瘍免疫応答を増強する（Restifoら、2012）。
免疫療法を実施する方法の１つは、天然または遺伝子操作された腫瘍特異的細胞を養子移入することに基づく。エクスビボで増殖させた細胞集団を用いて患者を治療することを養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ぶ。エクスビボで増殖させた後に点滴で患者に戻された細胞は、腫瘍へと移動し、腫瘍の破壊を媒介することができる。所望のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）特異性を有する腫瘍塊から抽出したエクスビボＴ細胞は、選択して増殖させた後、がん患者に養子移入することができる。養子移入の前に、放射線療法および／または化学療法を行うことによって宿主の免疫を除去することができる。リンパ球除去、養子細胞移入およびＴ細胞増殖因子（ＩＬ−２など）を組み合わせることによって、腫瘍患者の腫瘍を永続的に根絶することができる。さらに、エクスビボでＴ細胞を遺伝子操作することによって、腫瘍関連抗原に対する特異性を付与することができる。たとえば、特に良好な抗腫瘍応答を示すＴ細胞のＴＣＲのクローンをウイルス発現ベクターに挿入し、治療を受ける患者から得られた自家Ｔ細胞に感染させることができる。別の方法としては、抗体様特異性を有し、かつ標的細胞表面上のＭＨＣ非拘束性構造を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、Ｔ細胞を活性化することが可能なＴＣＲ細胞内ドメイン上に移植する方法が挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるＣ１ＯＲＦ３２特異的抗体、ならびに／または該抗体を含む代替足場、多重特異性分子、二重特異性分子、免疫複合体および／もしくは組成物は、１つ以上の別の治療薬と共投与することができ、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組成物と該別の治療薬との同時作用または相乗作用によりがんを治療または予防することができる。Ｃ１ＯＲＦ３２関連治療薬と該１以上の別の治療薬は、順番に投与することも同時に投与することも可能である。該別の治療薬としては、たとえば、細胞傷害薬、放射性毒性薬および免疫抑制薬が挙げられる。医薬組成物は、（免疫複合体として）該別の薬物に結合することも、該別の薬物と別々に投与することも可能である。後者の場合（別々に投与する場合）、医薬組成物の投与は、該別の薬物の投与前、投与後、または投与と同時に行うことができ、あるいは、他の公知の治療法（たとえば抗がん療法、たとえば、放射線療法）と併用することができる。このような治療薬としては、特に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素などの、単独で使用された場合、患者に毒性または準毒性を示すレベルにおいてのみ効果を発揮する抗新生物薬が挙げられる。シスプラチンは、１００ｍｇ／投与の用量で４週に１回静脈内投与され、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍＬの用量で２１日に１回静脈内投与される。本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体ならびに／またはその抗原結合フラグメントおよび／または代替足場を化学療法薬と共投与することによって、異なるメカニズムでヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害効果を発揮する２種の抗がん薬が提供される。このような共投与によって、薬物耐性の発現に起因する問題、および抗体との反応が起こらなくなる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。別の実施形態では、上記の治療に加えて、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する（たとえば増強または抑制する）薬物で対象を治療することができ、たとえば、サイトカインで対象を治療することができる。多重特異性分子による治療中に投与することが好ましいサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。
標的特異的エフェクター細胞、たとえば、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組成物（たとえばヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子）に結合させたエフェクター細胞も治療薬として使用することができる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球、単球などのヒト白血球であってよい。他の細胞としては、好酸球、ナチュラルキラー細胞、およびＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体を有する他の細胞が挙げられる。所望に応じて、エフェクター細胞は治療を受ける対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液中に懸濁された細胞懸濁液として投与することができる。投与される細胞は約１０８〜１０９個であってよいが、治療目的によってその数は異なるであろう。通常、上記の細胞数は、標的細胞、たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質を発現している腫瘍細胞に上記の細胞を局在化させ、かつ、たとえば食作用などによって細胞を破壊するのに十分な量であろう。投与経路も様々であってよい。
標的特異的エフェクター細胞を用いた治療法は、標的細胞を除去するための他の技術を併用して実施することができる。たとえば、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組成物（たとえばヒト抗体、多重特異性分子、および二重特異性分子）および／または該組成物に結合させたエフェクター細胞を使用した抗腫瘍療法は、化学療法と併用することができる。さらに、免疫療法を併用し、２種の異なる細胞傷害性エフェクター集団によって腫瘍細胞の拒絶を引き起こしてもよい。たとえば、抗ＦｃγＲＩまたは抗ＣＤ３に結合させた抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体と、ＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体に特異的な結合薬とを併用してもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子および多重特異性分子を使用して、ＦｃγＲレベルまたはエフェクター細胞上のＦｃγＲレベルを調節することもでき、これは、たとえばエフェクター細胞表面の受容体を塞いだり、除去したりすることによって行うことができる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的に使用することができる。
補体と結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＭの一部分などの補体結合部位を有する本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療用組成物（たとえば、ヒト抗体、代替足場、多重特異性分子、二重特異性分子および免疫複合体）は、補体の存在下でも使用することができる。一実施形態において、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる結合薬と適切なエフェクター細胞とによる、標的細胞を含む細胞集団のエクスビボ治療は、補体または補体を含む血清を添加することによって補強することができる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる結合薬で覆われた標的細胞に対する食作用は、補体タンパク質を結合させることによって向上させることができる。別の実施形態では、本発明の実施形態の少なくともいくつかよる組成物（たとえば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子）で覆われた標的細胞を補体によって溶解することもできる。さらに別の実施形態では、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組成物は補体を活性化しない。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療用組成物（たとえば、ヒト抗体、代替足場、多重特異性分子、二重特異性分子および免疫複合体）は補体とともに投与することもできる。したがって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、ヒト抗体、多重特異性分子または二重特異性分子と、血清または補体とを含む組成物が提供される。このような組成物は、ヒト抗体、多重特異性分子または二重特異性分子の極めて近傍に補体を存在させることができるという点で有利である。あるいは、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗体、多重特異性分子または二重特異性分子は、補体または血清とは別々に投与することができる。
本明細書において「薬学的に許容される担体」は、生理学的に許容されるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張化剤、吸収遅延剤などを包含する。担体は、（たとえば注射または点滴による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、表皮投与に適していることが好ましい。投与経路によっては、活性化合物、すなわち、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原の細胞外ドメイン、抗体、免疫複合体、代替足場および／または二重特異性分子を含む可溶性ポリペプチド複合体を、何らかの材料でコーティングすることによって、該活性化合物を失活しうる酸の作用および他の自然条件から該活性化合物を保護してもよい。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬化合物は、薬学的に許容される塩を１以上含んでいてもよい。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す（たとえば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照されたい）。このような塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒な無機酸に由来するもの；および脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸、芳香族スルホン酸などの無毒な有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの；およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒な有機アミンに由来するものが挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される酸化防止剤としては、
（１）水溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；
（２）油溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および
（３）金属キレート剤、たとえば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など
が挙げられる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬組成物において使用してもよい適切な水性および非水性の担体としては、水、エタノール、ポリオール類（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を一定に保つためには、たとえば、レシチンなどのコーティング剤を使用したり、分散液の場合は粒子径を必要な大きさに保ったり、界面活性剤を使用したりすることができる。
このような組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などのアジュバントを含んでいてもよい。微生物の混入を確実に防ぐために、上述の滅菌処理と、様々な抗菌薬および抗真菌薬（たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）の添加との両方を行ってもよい。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に添加することも望ましいと考えられる。さらに、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンなどの吸収遅延剤を添加することによって、注射剤形態の医薬品を持続的に吸収させてもよい。
薬学的に許容される担体としては、滅菌注射溶液または滅菌分散液を即時調製するための、滅菌水溶液または滅菌分散液、および滅菌散剤が挙げられる。薬学的活性物質のための、このような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。慣用の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬組成物に慣用の媒体または薬剤を使用してもよい。また、補助的な活性化合物を医薬組成物に含有させることもできる。
治療用組成物は、通常、製造過程および保存中において無菌かつ安定でなければならない。治療用組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高濃度の薬物に適した他の秩序構造に製剤化することができる。担体は溶媒または分散媒であってよく、溶媒または分散媒としては、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性を一定に保つためには、たとえば、レシチンなどのコーティング剤を使用したり、分散液の場合は粒子径を必要な大きさに保ったり、界面活性剤を使用したりすることができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖類、多価アルコール（たとえばマンニトールやソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを組成物に添加することが好ましいであろう。また、たとえばモノステアリン酸塩、ゼラチンなどの吸収遅延剤を注射用組成物に添加することによって、該注射用組成物を持続的に吸収させることができる。滅菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物と、上記の成分のうちの１つまたは上記の成分の組み合わせとを混合し、必要に応じて滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。分散液は、通常、基本的な分散媒と上記の他の成分のうち必要とされる成分とを含む滅菌ビヒクルに活性化合物を分散させることによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌散剤の場合は、有効成分と所望のさらなる成分とを含む溶液をあらかじめ滅菌ろ過し、この溶液を真空乾燥または凍結乾燥することによって、有効成分と所望のさらなる成分とを含む粉末を調製する方法が好ましい。
滅菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物と、上記の成分のうちの１つまたは上記の成分の組み合わせとを混合し、必要に応じて滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。分散液は、通常、基本的な分散媒と上記の他の成分のうち必要とされる成分とを含む滅菌ビヒクルに活性化合物を分散させることによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌散剤の場合は、有効成分と所望のさらなる成分とを含む溶液をあらかじめ滅菌ろ過し、この溶液を真空乾燥または凍結乾燥することによって、有効成分と所望のさらなる成分とを含む粉末を調製する方法が好ましい。
単一剤形を調製するために担体材料と組み合わせられる有効成分の量は、治療対象および特定の投与方法によって異なるであろう。単一剤形を調製するために担体材料と組み合わせられる有効成分の量は、通常、治療効果をもたらす上記組成物の量であろう。有効成分の量は、通常、薬学的に許容される担体と組み合わせる場合、全体を１００％として、約０．０１％〜約９９％の範囲、好ましくは約０．１％〜約７０％の範囲、最も好ましくは約１％〜約３０％の範囲であろう。
投与計画は所望の応答（たとえば治療応答）が最適化されるように調整される。たとえば、単一のボーラスとして投与してもよく、数回分の用量に分割して一定期間にわたり投与してもよく、あるいは、治療状況に伴う緊急性に応じて用量を減少または増加させてもよい。投与を容易にするためおよび用量を均一にするために単位剤形の非経口組成物を製剤化すると特に有利である。本明細書において、単位剤形は、治療を受ける対象に単位用量を投与するのに適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体とともに所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の活性化合物を含んでいる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物に特有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を治療するための上記のような活性化合物の調剤技術に固有の制限事項によって決定されかつこれらによって直接的に左右される。
抗体を投与する場合、その用量は宿主の体重あたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。たとえば、上記の用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれであってもよく、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。典型的な治療計画においては、投与を週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回行う。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体の投与計画としては、
（ｉ）４週ごとに１回の投与を計６回行い、以降３ヶ月ごとに１回投与；
（ii）３週ごとに１回投与；
（iii）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回投与後、１ｍｇ／ｋｇ体重を３週ごとに１回投与
から選択される投薬スケジュールのうちの１つを使用して、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重の抗体を静脈内投与することを含むことが好ましい。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の用量は上記の範囲内である。通常、抗体は複数回にわたって投与される。１回の投与と次の投与との間隔は、たとえば、１週間、１ヶ月、３ヶ月、１年のいずれであってもよい。標的抗原に対する抗体の患者血中レベルの測定値を指標として、投与間隔を不規則にしてもよい。いくつかの方法では、血漿中抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍＬとなるように用量を調整し、さらにいくつかの別の方法では血漿中抗体濃度が約２５〜３００μｇ／ｍＬとなるように用量を調整する。
あるいは、治療薬を徐放性製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は上記よりも少なくなる。用量および投与頻度は、患者体内における治療薬の半減期によって異なる。通常、半減期はヒト抗体が最も長く、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が後に続く。融合タンパク質の半減期は、融合タンパク質ごとに大きく異なりうる。用量および投与頻度は、その処置が予防目的か、治療目的かによって異なりうる。予防的な投与においては、比較的低用量を比較的長い間隔で長期間にわたり投与する。一部の患者においては、生涯にわたり処置を行う。治療目的の投与においては、疾患の進行が低下または停止するまで、好ましくは患者において疾患の症状が部分的または完全に改善されるまで、比較的高用量を比較的短い間隔で投与することが必要とされる場合がある。この後、患者に予防的な投与を行ってもよい。
患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物および投与方法において所望の治療効果を得るのに効果的な有効成分量とするため、本発明の医薬組成物に含まれる有効成分の実際の投与量レベルは様々であってよい。投与量レベルは、様々な薬物動態学的要因に応じて選択され、薬物動態学的要因としては、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性；投与経路；投与時期；使用する特定の化合物の排泄速度；治療期間；使用する特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および／または材料；治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態および既往症；ならびに医学分野においてよく知られている同様の要因が挙げられる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の「治療有効量」によって、疾患の症状の重症度の低下、疾患の症状が消失している時期の出現頻度の増加およびその持続期間の延長、寿命の延長、疾患の寛解、または疾患によって引き起こされる機能障害または身体障害の予防もしくは低減がもたらされることが好ましい。たとえば、Ｃ１ＯＲＦ３２陽性腫瘍の治療においては、「治療有効量」によって、治療を受けていない対象と比較して細胞増殖または腫瘍増殖が、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％抑制されることが好ましい。化合物の腫瘍に対する増殖抑制能は、ヒト腫瘍における有効性を予測することが可能な動物モデル系で評価することができる。あるいは、組成物の腫瘍に対する増殖抑制能は、化合物の抑制能を試験することにより評価することができ、このような抑制能をインビトロで分析する方法は当業者に公知である。治療有効量の治療化合物によって腫瘍の大きさを減少させることまたは対象の症状を改善することができる。
当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、選択した特定の組成物、選択した投与経路などの要因に基づいて治療有効量を決定することができるであろう。
本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法の１以上を使用し、１以上の投与経路を介して投与することができる。当業者によって十分に理解されるように、投与経路および／または投与方法は所望とする効果によって異なるであろう。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療薬の好ましい投与経路としては、血管内送達（たとえば注射または点滴）、静脈内送達、筋肉内送達、皮内送達、腹腔内送達、皮下送達、脊髄送達、経口送達、経腸送達、直腸送達、肺送達（たとえば吸入）、経鼻送達、局所送達（経皮送達、頬側送達および舌下送達を含む）、膀胱内送達、硝子体内送達、腹腔内送達、経膣送達、脳内送達（たとえば脳室内送達、脳内送達、およびＣＥＤ（convection enhanced diffusion）法）、ＣＮＳ送達（たとえば髄腔内送達、脊髄周囲送達、および脊髄内送達）、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む）、経粘膜投与（たとえば舌下投与）、移植片を介した投与、他の非経口投与経路（たとえば注射または点滴などによる非経口投与経路）、ならびに当技術分野において公知の他の送達経路および／または投与形態が挙げられる。本明細書において「非経口投与」は、経腸投与および局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、非経口投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨下における注射および点滴が包含されるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるタンパク質、治療薬または医薬組成物は、腹腔内または静脈内に投与することができる。
あるいは、Ｃ１ＯＲＦ３２タンパク質の活性を調節する機能を有する、Ｃ１ＯＲＦ３２特異的抗体、その複合体および／もしくは代替足場ならびに／またはそれらの組み合わせは、非経口経路以外の経路で投与することができ、たとえば、鼻腔内投与、経口投与、経膣投与、直腸投与、舌下投与、局所投与などの、局所投与経路、表皮投与経路、粘膜投与経路により投与することができる。
活性化合物は、該活性化合物の急速な放出を防ぐ担体を使用して調製することができ、たとえば移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達システムなどの放出制御製剤とすることができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生物分解性および生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、数多くが特許されており、当業者によく知られている。たとえば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
治療用組成物は当技術分野において公知の医療器具を用いて投与することができる。たとえば、好ましい実施形態では、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療用組成物は、針を備える皮下注射器で投与することができ、このような器具は、米国特許第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；または第4,596,556号に開示されている。本発明において有用な公知の移植片およびモジュールとしては、米国特許第4,487,603号（制御された速度で薬剤を供給するための、移植可能なマイクロ輸液ポンプが開示されている）；米国特許第4,486,194号（皮膚を介して薬剤を投与するための治療器具が開示されている）；米国特許第4,447,233号（正確な輸液速度で薬剤を送達するための薬剤輸液ポンプが開示されている）；米国特許第4,447,224号（連続的な薬剤送達のための、流量の変更および移植が可能な輸液装置が開示されている）；米国特許第4,439,196号（マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムが開示されている）；および米国特許第4,475,196号（浸透圧薬物送達システムが開示されている）が挙げられる。これらの特許文献は本明細書の一部を構成するものとして援用される。このような移植片、送達システムおよびモジュールとして、他にも数多くのものが当業者に知られている。
特定の実施形態において、上記の抗体は、インビボにおいて確実に適切な分布となるように製剤化することができる。たとえば、脳血液関門（ＢＢＢ）は数多くの高親水性化合物を排除するが、（所望であれば）本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療化合物がＢＢＢを確実に通過するように、たとえば、リポソームに内包させて製剤化することができる。リポソームの製造方法については、たとえば、米国特許第4,522,811号；第5,374,548号；および第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器へ選択的に輸送される１以上の成分を含んでいてもよく、それによってターゲティングされた薬物送達を増強してもよい（たとえば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。ターゲティングのための典型的な成分としては、葉酸塩またはビオチン（たとえば、Lowらに付与された米国特許第5,416,016号を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、さらに、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体は中和抗体として使用することができる。中和抗体（Ｎａｂ）は、特定の抗原に結合してこれを中和または抑制することによって、その抗原が有する生物学的作用を抑制することができる抗体であり、たとえば、細胞またはウイルスの受容体を遮断することにより宿主細胞へのウイルスの結合を抑制する。ＮＡｂは、特定の作用因子の生物学的作用を部分的または完全に打ち消すことができ、作用因子の活動に必要とされる重要な表面分子を遮断するか、または標的細胞の受容体への作用因子の結合を阻害することによってその効果を発揮する。
非経口投与用製剤
さらなる実施形態では、本明細書に開示の組成物（ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を包含する）は、水溶液の形態で非経口注射により投与される。この製剤は、懸濁液であっても乳液であってもよい。通常、本発明により提供される医薬組成物は、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体をさらに含んでいてもよい。このような組成物は、希釈剤；滅菌水；様々な緩衝剤成分（たとえば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝食塩水；ならびに添加剤から選択される１以上を含んでいてもよく、該添加剤としては、洗浄剤および可溶化剤（たとえば、TWEEN 20（ポリソルベート２０）、TWEEN 80（ポリソルベート８０））、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤）、保存剤（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール）ならびに増量成分（たとえばラクトース、マンニトール）が挙げられる。非水性溶媒またはビヒクルとしては、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油、トウモロコシ油など）、ゼラチン、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が挙げられる。上記の製剤は、凍結乾燥または真空乾燥されていてもよく、使用の直前に再溶解／再懸濁してもよい。上記の製剤の滅菌は、たとえば、細菌捕集フィルターを通した濾過、組成物への滅菌剤の添加、組成物への放射線照射、または組成物の加熱によって行ってもよい。
局所投与用製剤
本明細書に開示のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、フラグメント、融合ポリペプチド、核酸およびベクターは、局所適用することができる。ペプチド製剤は局所投与しても効果を発揮しないものが多いが、特に肺、鼻、口腔（舌下、頬側）、膣、または直腸粘膜に適用すると効果を発揮する場合がある。
組成物は、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾルまたはスプレー乾燥粉末として送達した場合、肺に送達することができ、吸入された組成物は肺上皮層を横切って血流に達する。治療薬を肺送達するために設計された様々な機械装置を使用することができ、このような装置としては、ネブライザー、定量吸入器および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されず、このような装置はいずれも当業者によく知られている。市販のこのような装置の具体例としては、Ultraventネブライザー（マリンクロット社、ミズーリ州セントルイス）；Acorn IIネブライザー（Marquest Medical Products社、コロラド州エングルウッド）；Ventolin定量吸入器（グラクソ社、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）；およびSpinhaler粉末吸入器（ファイソンズ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）が挙げられる。Nektar、AlkermesおよびMannkindはいずれも承認下または臨床試験中の吸入型インスリン粉末調製物を含有しており、このような技術は本明細書に記載の製剤に適用できる可能性がある。
粘膜投与用製剤は、通常、スプレー乾燥された薬物粉末であり、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液または乳液の形態としてもよい。標準的な医薬品賦形剤は製薬会社から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤またはロゼンジの形態であってもよい。経皮製剤として調製してもよい。経皮製剤は、通常、軟膏剤、ローション剤、スプレーまたはパッチであり、これらはいずれも標準的な技術を使用して調製することができる。経皮製剤には経皮吸収促進剤の添加が必要であろう。
送達制御ポリマーマトリックス
本明細書に開示のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、フラグメント、融合ポリペプチド、核酸およびベクターは、放出制御製剤の形態で投与してもよい。放出制御ポリマーデバイスは、ポリマーデバイス（棒状、円柱状、フィルム状、円盤状）を移植または注射（マイクロパーティクル状）した後、長期間にわたり薬物が全身に放出されるように製剤化してもよい。マトリックスは、マイクロスフェアなどのマイクロパーティクルの形態であってもよく、ペプチドは固体のポリマーマトリックス内またはマイクロカプセル内に分散されている。このようなマイクロパーティクルは、それぞれの材質が異なるコアとポリマーシェルとからなり、自然な状態で液体であっても固体であってもよいコアにペプチドが分散または懸濁されている。本明細書に特に記載されていない限り、マイクロパーティクル、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルという用語は同じ意味で用いられる。別の方法として、ポリマーは、ナノメーター単位〜４ｃｍの薄い板状またはフィルム状に流延してもよく、粉砕または他の標準的な技術により粉末にしてもよく、さらには、ヒドロゲルなどのゲルにしてもよい。非生物分解性マトリックスと生物分解性マトリックスのいずれを使用してもポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を送達することができるが、生物分解性マトリックスを使用することが好ましい。これらのマトリックスは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、分解性および放出特性に優れていることから合成ポリマーが好ましい。ポリマーは所望の放出時間に基づいて選択される。直線性の放出挙動が最も有益である場合もあれば、パルス放出または「バルク放出」がより効果的である場合もある。ポリマーは、ヒドロゲル（通常、最大約９０重量％の水を吸収している）の形態であってもよく、多価イオンまたはポリマーで架橋されていてもよい。
マトリックスは、溶媒留去、スプレー乾燥、溶媒抽出および当業者に公知の他の方法によって形成することができる。生体内分解性マイクロスフェアは、薬物送達用マイクロスフェアの製造のために開発された方法を使用して調製することができ、このような方法は、たとえば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987);Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987);およびMathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988)に記載されている。
上記のポリマーデバイスは、局所放出により移植部位または注射部位を治療するものとして製剤化することができ（通常、全身を治療する際の用量よりもはるかに少ない用量が送達される）、あるいは、全身送達を行うものとして製剤化することができる。このようなポリマーデバイスは、筋肉や脂肪中に皮下移植または皮下注射することができ、あるいは経口投与することができる。
抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体の診断用途
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、上記の抗体（たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子、二重特異性分子および組成物）を使用して、Ｃ１ＯＲＦ３２レベルまたは膜表面上にＣ１ＯＲＦ３２を含む細胞の濃度を検出することができ、検出されたレベルまたは濃度を特定の疾患の症状と関連付けることができる。あるいは、上記の抗体を使用してＣ１ＯＲＦ３２の機能を抑制または遮断することにより、がんの予防または改善を行うことができる。これらの方法は、Ｃ１ＯＲＦ３２とこれに対応する抗体との間で複合体を形成することが可能な条件下において、試料またはコントロール試料と抗Ｃ１ＯＲＦ３２抗体と接触させることよって行うことができる。Ｃ１ＯＲＦ３２と抗体との間で形成された複合体であればどのようなものでも試料中およびコントロール中において検出および比較することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、上記の抗体（たとえば、ヒト抗体、多重特異性分子、二重特異性分子および組成物）は、まず、治療用途または診断用途に関連する結合活性についてインビトロで試験される。たとえば、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる組成物は、フローサイトメトリーアッセイを使用して試験することができる。
さらに、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるＣ１ＯＲＦ３２特異的抗体（たとえば、ヒト抗体、代替足場、二重特異性分子、多重特異性分子または免疫複合体）と使用説明書とを含むキットも本発明の範囲内に含まれる。該キットは、１以上のさらなる試薬（免疫抑制性試薬、細胞傷害薬、放射性毒性薬など）、または本発明の実施形態の少なくともいくつかによる１以上のさらなるヒト抗体（たとえば、第１のヒト抗体とは異なる抗原エピトープに結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含んでいてもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を使用して、ＦｃγＲまたはＣ１ＯＲＦ３２を発現している細胞をターゲティングすることができ、これによって、たとえば、このような細胞を標識することができる。また、このようなターゲティングによって、検出可能な分子に本発明の結合薬を連結することができる。したがって、本発明は、エクスビボまたはインビトロにおいて、ＦｃγＲなどのＦｃ受容体またはＣ１ＯＲＦ３２抗原を発現している細胞の位置を特定する方法を提供する。検出標識は、たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、酵素補因子のいずれであってもよい。
特定の実施形態において、本発明は、試料中のＣ１ＯＲＦ３２抗原の存在および／もしくはＣ１ＯＲＦ３２抗原レベルを検出する方法、またはＣ１ＯＲＦ３２抗原の量を測定する方法を提供し、これらの方法は、抗体またはその一部とＣ１ＯＲＦ３２との間で複合体を形成することが可能な条件下において、試料またはコントロール試料と、Ｃ１ＯＲＦ３２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分とを接触させることを含む。次いで、形成された複合体を検出し、複合体の形成における差異を試料とコントロール試料との間で比較することによって、試料中のＣ１ＯＲＦ３２抗原の存在を知ることができる。上述したように、本発明は特に、Ｃ１ＯＲＦ３２抗原をインビトロおよびインビボで検出するためのアッセイを包含し、このようなアッセイとしては、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ラジオアッセイ、放射性イメージングアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、スロットブロット、免疫組織化学的アッセイ、当業者によく知られている他のアッセイなどが挙げられる。
さらに別の実施形態では、本発明の抗体と化合物（たとえば治療薬、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制薬など）とを結合させた本発明の免疫複合体を使用して、このような化合物を、Ｃ１ＯＲＦ３２細胞表面受容体を有する細胞にターゲティングすることができる。したがって、本発明はさらに、エクスビボまたはインビボにおいて、（たとえば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、酵素補因子などの検出可能な標識を使用して）Ｃ１ＯＲＦ３２発現細胞の位置を特定する方法を提供する。別の方法として、免疫複合体を使用して、細胞毒素または放射性毒素をＣ１ＯＲＦ３２抗原にターゲティングすることにより、Ｃ１ＯＲＦ３２細胞表面受容体を有する細胞を死滅させることができる。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、臓器または組織をイメージングする方法であって、
（ａ）臓器または組織のイメージングを必要とする対象に標識ポリペプチドを投与すること；および
（ｂ）標識ポリペプチドが対象のどこで濃縮されているのかを決定するために標識ポリペプチドを検出すること
を含む方法を提供する。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる標識ポリペプチドをイメージング用途に使用する場合、通常、造影剤を標識ポリペプチドに共有結合または非共有結合を介して結合させる。適切な造影剤としては、放射性核種、検出可能なタグ、発蛍光団、蛍光タンパク質、酵素タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドに造影剤を結合するための他の方法は、当業者によく知られているであろう。たとえば、造影剤は部位特異的な結合を介してポリペプチドに結合させることができ、たとえば、Ｆｃ融合分子のカルボキシル末端に付加された５〜７個のアルギニンを有するポリアルギニン部分などのようなペプチドリンカーに造影剤を共有結合させることができる。また、造影剤は非部位特異的結合を介してポリペプチドに直接結合させることもでき、たとえば、ポリペプチドに存在する第一級アミン基に造影剤を共有結合させることができる。非共有結合性相互作用（たとえば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合など）を介して造影剤をタンパク質に結合することも可能であることは、当業者によって容易に理解されるであろう。
特定の場合においては、放射性核種をポリペプチドに直接結合させることによって、ポリペプチドを放射性核種で放射標識する。別の特定の場合においては、ポリペプチドに結合されたキレート剤またはキレート剤リンカーに放射性核種を結合させる。直接結合させるのに適した放射性核種としては、18Ｆ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤とともに使用するのに適した放射性核種としては、47Ｓｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、89Ｓｒ、86Ｙ、87Ｙ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ａｇ、111Ｉｎ、117mＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、211Ａｔ、212Ｂｉ、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤に結合される放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、111Ｉｎ、またはこれらの混合物が好ましい。適切なキレート剤としては、ＤＯＴＡ、ＢＡＤ、ＴＥＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、これらのホスホン酸アナログ、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドに放射性核種、キレート剤およびキレート剤リンカーを結合させる方法は、当業者によく知られているであろう。このような結合は簡便に行うことができ、具体的には、たとえば、ポリペプチド上の官能基のうち該ポリペプチドの機能を阻害しない位置に存在する官能基に結合することが可能であり、さらに放射性核種、キレート剤またはキレート剤リンカーとも連結することが可能な、市販の二機能性連結基（通常、ヘテロ二機能性連結基）を使用することによって簡便に行うことができる。
造影剤として使用するのに適した発蛍光団または蛍光色素としては、Alexa Fluor（登録商標）色素（インビトロジェン社；カリフォルニア州カールスバッド）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（登録商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、CyDye（登録商標）fluors（たとえばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられるが、これらに限定されない。
造影剤として使用するのに適した蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質（たとえばＤｓＲｅｄ）、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、およびこれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない（たとえば、米国特許第6,403,374号、第6,800,733号および第7,157,566号を参照されたい）。ＧＦＰバリアントの具体例としては、enhanced GFP（EGFP）、destabilized EGFP、Doan et al., Mol. Microbiol., 55:1767-1781 (2005)に記載されているＧＦＰバリアント、Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 (1996)に記載されているＧＦＰバリアント、Rizzo et al., Nat. Biotechnol, 22:445 (2004)およびTsien, Annu. Rev. Biochem., 67:509 (1998)に記載されているセルリアン蛍光タンパク質、およびNagal et al., Nat. Biotechnol., 20:87-90 (2002)に記載されている黄色蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＤｓＲｅｄバリアントは、たとえば、Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22:1567-1572 (2004)に記載されており、mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydewおよびmTangerineを含む。さらなるＤｓＲｅｄバリアントは、たとえば、Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:16745-16749 (2004)に記載されており、mRaspberryおよびmPlumを含む。ＤｓＲｅｄバリアントとしてはさらに、Fischer et al., FEBS Lett.,577:227-232 (2004)に記載されているmRFPmars、およびFischer et al., FEBS Lett., 580:2495-2502 (2006)に記載されているmRFPrubyが挙げられる。
別の実施形態において、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるポリペプチドに結合される造影剤としては、検出可能なタグ、たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどが挙げられる。さらなる実施形態では、造影剤は酵素タンパク質を含み、酵素タンパク質としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キシラナーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
対象中に存在する放射性核種からの放射線放射を検出するための、当技術分野で公知の装置および方法はいずれも本発明での使用に適している。たとえば、シングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）（回転型ガンマカメラを使用して単光子放出核種から放射されるγ線を検出する）、および放射性核種シンチグラフィ（シンチレーションガンマカメラを使用して、組織、臓器または身体系における放射性核種の分布を一枚の画像または一連の連続画像として得る）などの方法を本発明の放射性標識ポリペプチドから放射される放射線の検出に使用してもよい。また、対象中に存在する放射線を検出するのに適した別の技術としては、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられる。小型で柔軟に使える医療用の放射線検出器は、Intra-Medical LLC（カリフォルニア州サンタモニカ）によって製造されている。さらに、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）または当業者に公知の他のイメージング技術も、放射性核種からの放射線放射を検出するのに適している。使用する方法や装置に関係なく、上記のような検出は、標識ポリペプチドが対象のどこで濃縮されているのかを決定することを目的としており、そのような濃縮は疾患活動性の指標となる。
動物およびヒトの非侵襲的な蛍光イメージングによってもインビボ診断情報を得ることができ、このような技術は様々な臨床専門分野において使用することができる。たとえば、ＵＶ励起後に簡便に視覚的観察を行うための技術や高度な機器を使用した精巧な分光イメージングが長年にわたって開発されてきた（たとえば、Andersson-Engels et al., Phys. Med. Biol., 42:815-824 (1997)を参照されたい）。発蛍光団や蛍光タンパク質などから発せられる蛍光をインビボにおいて検出するための当技術分野で公知の装置または方法の具体的として、インビボ近赤外線蛍光（たとえばFrangioni, Curr. Opin. Chem. Biol., 7:626-634 (2003)を参照されたい）、Maestro（登録商標）インビボ蛍光イメージングシステム（Cambridge Research & Instrumentation, Inc.；マサチューセッツ州ウォーバーン）、フライングスポットスキャナーを使用したインビボ蛍光イメージング（たとえばRamanujam et al., IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 48:1034-1041 (2001)を参照されたい）などが挙げられるが、これらに限定されない。
光学的応答を検出するための他の方法または装置としては、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャン装置、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、および光電子増倍管を使用した信号増幅が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態のいくつかによれば、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる診断アッセイを実施するために対象（患者）から採取される試料は、体液および分泌液からなる群から選択され、体液および分泌液としては、血液、血清、尿、血漿、前立腺液、精漿、精液；皮膚、呼吸器、腸および泌尿生殖路の外分泌液；涙液、脳脊髄液、滑液、喀痰、唾液、乳汁、腹水、胸膜液、嚢胞液、乳管系分泌液（および／または洗浄液）、肺胞洗浄液、生殖器系洗浄液、身体の他の部分または身体の他の系の洗浄液；単離された細胞または組織などの、任意の臓器から得られた試料（肺、前立腺、結腸、卵巣、乳房組織、および／または他の固体組織から選択される臓器（ただしこれらに限定されない）から得ることができる細胞または組織）；便、組織試料；ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態のいくつかにおいて、上記の試料は、インビボ細胞培養の構成物から得られた試料を包含する。診断アッセイに試料を供する前に、試料を適切な溶離液で希釈してもよい。
実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の「マーカー」は、本明細書に記載の疾患および状態のいずれか１つを有する患者（対象）から採取された試料と、本明細書に記載の疾患も状態も有していない対象から採取された同種の試料とを比較したときに、患者試料中に示差的に存在している核酸フラグメント、ペプチドまたはポリペプチドを指す。
実施形態のいくつかにおいて、「示差的に存在する」とは、本明細書に記載の疾患および状態のいずれか１つを有する患者から採取された試料と、本明細書に記載の疾患も状態も有していない患者から採取された同種の試料とを比較したときの、試料中に存在するマーカーの量的差異または質的差異を指す。たとえば、ハイブリダイゼーションおよび／またはＮＡＴに基づいたアッセイなどによって測定したときに、一方の試料中の核酸フラグメントの量がもう一方の試料とは顕著に異なる場合、核酸フラグメントは２つの試料間において示差的に存在しているといえる。また、一方の試料中のポリペプチドの量がもう一方の試料とは顕著に異なる場合、ポリペプチドは２つの試料間において示差的に存在している。特定のマーカーが一方の試料において検出可能であるが、もう一方の試料では検出できない場合、このようなマーカーは示差的に存在していると考えられることには注意すべきである。本明細書に記載されているように、比較的小さなアップレギュレーションをマーカーとして使用してもよい。当業者はマーカーのこのような相対レベルを容易に測定することができる。マーカーについては、後述の各マーカーの説明においてさらに詳しく説明する。
実施形態のいくつかにおいて「診断」は、病態の存在またはその特徴を同定することを意味する。感度および特異度は診断方法によって異なる。診断アッセイの「感度」とは、試験において陽性と判定された疾患個体のパーセンテージ（「真の陽性」のパーセント）である。診断アッセイによって検出されない疾患個体を「偽陰性」という。疾患を有しておらず、診断アッセイにおいて陰性と判定された対象は「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いた値であり、「偽陽性」率は、疾患を有していないにもかかわらず陽性と判定された個体の割合と定義される。診断方法によっては病態の確定診断をすることができない可能性があるが、診断の手がかりとなる陽性の兆候が得られればその診断方法で足りる。
本明細書において「診断」は、病態または疾患の兆候および症状から、具体的には様々な診断法の結果から、病態または疾患を同定する方法を指し、診断法としては、たとえば、個体から得られた生体試料中（たとえば、下記に定義するように、細胞中、組織中または血清中）に存在する本発明の実施形態の少なくともいくつかによる核酸またはポリペプチドの発現量を検出することが挙げられる。さらに、本明細書において「診断」は、疾患のスクリーニング；疾患の存在またはその重症度の検出；疾患の予後診断；疾患の進行または再発のモニタリング；治療効果の評価および／もしくは疾患、障害もしくは病態の再発の評価；疾患の治療法および／もしくは処置の選択；疾患に対して選択された治療法の最適化；疾患に対する処置のモニタリング；特定の患者または亜集団に対して治療法が適切であるかどうかの予測；ならびに／または患者または亜集団における治療薬の適切な用量の決定を包含する。診断法はインビボで行ってもよくインビトロで行ってもよい。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの差異について言及する場合、当業者によって容易に理解されるように「定性的」は、たとえば、実施形態のいくつかでは発現の存在と非存在との比較を指し、実施形態のいくつかでは発現の一時的な制御を指し、実施形態のいくつかでは発現のタイミングを指し、実施形態のいくつかでは発現された分子への翻訳後修飾を指す。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの差異について言及する場合、「定量的」は、実施形態のいくつかでは、当技術分野で公知の任意の手段によって決定された発現量の絶対的差異を指し、別の実施形態では統計的に有意であってもよい相対的差異を指し、実施形態のいくつかでは、全体をひとつとして観察した場合または長期間にわたり観察した場合の、発現量の差異の経時的変化を示す。
実施形態のいくつかにおいて「診断する」は、疾患または症状を分類すること、疾患の重症度を決定すること、疾患の進行をモニタリングすること、疾患の転帰を予測すること、および／または回復の見込みを立てることを指す。「検出する」は上記のいずれを包含していてもよい。
実施形態のいくつかにおいて、本発明による疾患の診断は、対象から得られた生体試料中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを測定することによって行うことができ、測定したレベルと、疾患の素因または疾患の存在もしくは非存在とを相互に関連付けることができる。「対象から得られた生体試料」は、より詳細に後述するように、対象から物理的に採取された試料以外の試料をも包含してもよいことには注意すべきである。
実施形態のいくつかでは、「レベル」は、ＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現レベル、または本発明のマーカーのＤＮＡコピー数を指す。
通常、対象から得られた生体試料中のマーカーのレベルは、健常個体から得られた類似試料中の同一マーカーのレベルとは異なっている（すなわち増加または減少している）（生体試料の例は本明細書に記載されている）。
対象中の目的のマーカーであるＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを測定することを目的とした対象からの生体試料の回収は、様々な公知の組織回収方法または体液回収方法を使用して行うことができる。
回収方法としては、細針生検、針生検、コア針生検および外科的生検（たとえば脳生検）、ならびに洗浄が挙げられるが、これらに限定されない。使用した方法に関係なく、生検材料／試料が得られれば、マーカーレベルを測定することができ、診断を行うことができる。
同一由来の正常組織における同一マーカーのレベルの測定を行うと共に、正常組織と比較したマーカーの発現上昇、増幅および／または発現低下の検出を行うことが好ましい。
実施形態のいくつかにおいて、マーカーの「評価量」は、特定の疾患または状態の診断と一致する、対象から得た試料中のマーカーの量を指す。評価量は、絶対量（たとえばμｇ／ｍＬ）であっても、相対量（たとえばシグナルの相対強度）であってもよい。
実施形態のいくつかでは、マーカーに対する「コントロールの量」は、マーカーの評価量と比較される任意の量であっても量範囲であってもよい。たとえば、マーカーに対するコントロールの量は、特定の疾患もしくは状態を有する患者におけるマーカーの量であってもよく、特定の疾患も状態も有さない個人におけるマーカーの量であってもよい。コントロールの量は、絶対量（たとえばμｇ／ｍＬ）であっても、相対量（たとえばシグナルの相対強度）であってもよい。
実施形態のいくつかでは、「検出する」は、検出対象の存在、非存在またはその量を同定することを指す。
実施形態のいくつかでは、「標識」は、分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、または化学的方法によって検出可能な任意の成分または要素を包含する。たとえば、有用な標識として、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえばＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような酵素）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質、ならびに標的と配列相補性を有する核酸分子が挙げられる。これらの標識は、多くの場合、測定可能なシグナル、たとえば、放射性シグナル、発色シグナル、蛍光シグナルなどを発生し、これらのシグナルを使用して、試料中の結合した標識の量を定量することができる。標識は、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、または水素結合を介して、プライマーまたはプローブに組み込んだり付加することができ、たとえば、放射性ヌクレオチドに組み込んだり、ストレプトアビジンによって認識されるビオチン化ヌクレオチドに組み込むことができる。標識は、直接的または間接的に検出可能であってよい。間接的な検出においては、第１の標識に第２の標識を直接または間接的に結合させてもよい。たとえば、標識は、特定の結合パートナーのリガンド（たとえば、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチン）であってもよく、相補的配列の結合パートナーであり、かつ相補的配列が特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列であってもよい。結合パートナーは、それ自体が直接的に検出可能であってもよく、たとえば、抗体自体を蛍光分子で標識してもよい。結合パートナーは間接的に検出可能であってもよく、たとえば、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸を分岐ＤＮＡ分子の一部として使用し、この分岐ＤＮＡ分子を別の標識核酸分子を用いたハイブリダイゼーションにより検出してもよい（たとえば、P. D. Fahrlander and A. Klausner, Bio/Technology 6:1165 (1988)を参照されたい）。シグナルの定量は、たとえば、シンチレーション計数、デンシトメトリーまたはフローサイトメトリーによって行う。
イムノアッセイにおいて使用してもよく、かつイムノアッセイにおいて使用することが好ましい検出可能な標識として典型的なものとしては、磁気ビーズ、蛍光色素、放射性標識、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、および比色定量標識（金コロイド、着色ガラス、プラスチックビーズなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、試料中のマーカーは間接的なアッセイを使用して検出することができ、たとえば、マーカーに結合したマーカー特異的抗体を第２の標識抗体を使用して検出することができ、かつ／または競合アッセイもしくは阻害アッセイを使用して、たとえば、マーカーの別のエピトープに結合するモノクローナル抗体を混合物と一緒にインキュベートすることにより検出することができる。
「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、特定の抗体の特異的結合特性を利用して、抗原を単離、ターゲティング、かつ／または定量することを特徴とする。
実施形態のいくつかにおいて、タンパク質またはペプチド（または他のエピトープ）について言及する場合、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、「特異的に（または選択的に）免疫反応性を示す」または「特異的に相互作用または結合する」は、複数種のタンパク質と他のバイオロジクスとの不均一集団において特定のタンパク質の存在を決定づける結合反応を指す。したがって、選択したイムノアッセイ条件下において、特定のタンパク質に対する特定の抗体の結合は、バックグラウンド（非特異的シグナル）の少なくとも２倍であり、該抗体は、試料中に存在する他のタンパク質とは実質的にほとんど結合しない。このような条件下での抗体との特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性に基づいて選択された抗体を必要としてもよい。たとえば、ラット、マウス、ヒトなどの特定の生物種から得た精漿塩基性タンパク質（seminal basic protein）に対して作製したポリクローナル抗体を選択することにより、精漿塩基性タンパク質には特異的な免疫反応性を示すが、精漿塩基性タンパク質の多型バリアントやアレル以外の他のタンパク質には免疫反応性を示さないポリクローナル抗体のみを得ることができる。このような選択は、他の生物種から得た精漿塩基性タンパク質分子と交差反応する抗体を取り除くことによって行ってもよい。様々なイムノアッセイ系を使用して、特定のタンパク質に特異的な免疫反応性を示す抗体を選択してもよい。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、特定のタンパク質に特異的な免疫反応性を示す抗体を選択するために日常的に使用されている（特異的な免疫反応性の測定に使用することができるイムノアッセイ系およびそのアッセイ条件については、たとえば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)の記載を参照されたい）。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはバックグラウンドノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０〜１００倍である。
別の実施形態では、本発明は、生体試料中の本発明のポリペプチドを検出する方法であって、
本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体と生体試料とを接触させること、および
これらの相互作用を検出することを含み、
該相互作用の存在と生体試料中のポリペプチドの存在とが相関していること
を特徴とする検出方法を提供する。
本発明の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載のポリペプチドは、たとえば、疾患および／または徴候的な状態を診断するためのマーカーとして使用することができるが、本明細書に記載のポリペプチドの用途はこれに限定されない。本発明のマーカーはそれぞれ単独または組み合わせて様々な用途に使用することができ、たとえば、疾患および／または兆候的な状態の、予後診断、転帰予測、スクリーニング、早期診断、進行度の判定、治療法の選択、ならびに治療のモニタリングなどに使用することができるが、用途はこれらに限定されない。
上述したように、本発明のポリペプチド／ポリヌクレオチドはそれぞれ単独または組み合わせて様々な用途に使用することができ、たとえば、疾患および／または兆候的な状態の、予後診断、転帰予測、スクリーニング、早期診断、進行度の判定、治療法の選択、ならびに治療のモニタリングなどに使用することができるが、用途はこれらに限定されない。
上記の組み合わせは、マーカーの任意のサブコンビネーション、および／または少なくとも１つの他のマーカー（たとえば公知のマーカー）を特徴とする組み合わせを含んでいてもよい。さらに、上記の組み合わせは、上述したように、本明細書に記載の任意のマーカーと、本明細書に記載の別のマーカー、公知の他のマーカーおよび／またはその他のマーカーとの定量値または半定量値の比を決定するために使用してもよく、この用途で使用することが好ましい。
本発明の実施形態のいくつかにおいて、疾患または状態を診断するための方法、使用、装置、およびアッセイが提供される。複数のマーカーを本発明とともに使用してもよい。この複数のマーカーは、本明細書に記載のマーカーおよび／または１つ以上の公知のマーカーを含んでいてもよい。さらに、この複数のマーカーを疾患または状態と相互に関連付けることが好ましい。たとえば、このような相関付けは、複数のマーカーの各濃度を測定すること、および各マーカーの濃度をそれぞれの閾値レベルと比較することを含んでいてもよい。マーカー濃度が閾値レベルよりも高いか低い場合（マーカーおよび／または実施される診断検査によって異なる）、そのマーカー濃度は疾患または状態と相関している可能性がある。複数のマーカーの濃度が疾患または状態と相関していてもよく、このような相関関係が見られることが好ましい。
あるいは、このような相関付けは、複数のマーカーの各濃度を測定すること、複数のマーカーの各濃度に基づいた単一の指標値をそれぞれ算出すること、および該指標値をそれぞれの閾値レベルと比較することを含んでいてもよい。
あるいは、このような相関付けは、複数のマーカーのうち少なくとも１つのマーカーの一時的な変化を測定すること、この一時的な変化を相関付けに使用することを含んでいてもよい。
あるいは、このような相関付けは、複数のマーカーのうち少なくとも「Ｘ」個のマーカーの濃度が所定の範囲を外れているかどうか、かつ／または（上述したような）閾値よりも高いか低いかを判断することを含んでいてもよい。「Ｘ」は、上記複数のマーカーのうちの１個のマーカー、複数個のマーカー、すべてのマーカーのいずれであってもよく、これとは別法としてまたはこれに加えて、あらゆるマーカーを「Ｘ」に含めるよりも、（所定の範囲および／または閾値に応じて）上記複数のマーカーのうち１個以上の特異的マーカーを疾患または状態との相関付けに使用してもよい。
あるいは、このような相関付けは、２つのマーカーの濃度の比率が所定の範囲を外れているかどうか、かつ／または閾値よりも高いか低いかを判断することを含んでいてもよい。上記比率が閾値レベルよりも高いか低い場合および／または所定の範囲を外れている場合、上記比率と疾患または状態とは相関している可能性がある。
上述の相関関係の２つ以上の組み合わせを、単一のパネルとともに使用してもよく、かつ／または複数のパネル間の相関付けに使用してもよい。
上記の方法は、少なくとも７０％の感度および少なくとも８５％の特異度で、疾患または状態と正常な対象とを識別してもよい。本明細書において、感度は、存在するすべての陽性試料から検出された陽性（疾患を有する）試料の数に関連し、特異度は、存在するすべての陰性試料から検出された真の陰性（疾患を有さない）試料の数に関連する。上記の方法は、少なくとも８０％の感度および少なくとも９０％の特異度で、疾患または状態と正常な対象とを識別することが好ましい。上記の方法は、少なくとも９０％の感度および少なくとも９０％の特異度で、疾患または状態と正常な対象とを識別することがより好ましい。また、上記の方法は、少なくとも７０％の感度および少なくとも８５％の特異性で、疾患または状態と、疾患または状態の症状とよく似た症状を示す対象とを識別することがより好ましい。
マーカーパネルは、当業者によく知られている様々な方法で分析してもよい。たとえば、パネルに含まれる各メンバーを、「正常」値、または特定の転帰を示す値と比較してもよい。特定の診断／予後診断は、各マーカーと正常値または特定の転帰を示す値との比較に基づいていてもよく、あるいは、マーカーの１つのサブセットのみが正常範囲を外れた場合、このサブセットを指標として特定の診断／予後診断を行ってもよい。また、診断マーカー、示差的な診断マーカー、予後マーカー、発症マーカー、疾患または状態の識別マーカーなどを、単一のアッセイまたは装置において組み合わせてもよいことも当業者にとって明らかであろう。マーカーは通常、複数の目的に使用してもよく、たとえば、異なる閾値または異なる重み付け係数をマーカーに適用することによって、マーカーを異なる複数の目的に使用してもよい。
一実施形態において、マーカーを含むパネルの使用目的としては、疾患の診断；疾患が急性期である場合および／または急性期疾患が発症した場合の疾患および兆候の診断；疾患が非急性期である場合および／または非急性期疾患が発症した場合の疾患および兆候の診断；急性期状態と非急性期状態とが混在しているかどうか、または急性期疾患と非急性期疾患とが同時に発症したかどうかを示す兆候の診断；疾患の診断およびそれに続く有害転帰の予後診断；疾患の診断およびそれに続く急性期状態もしくは非急性期状態の予後診断または急性発症もしくは非急性発症の予後診断；疾患の進行の診断（たとえば、がんの場合、疾患の進行はたとえば転移の発生または転移の再発を含んでいてもよい）が挙げられる。
上記の診断は、特定の疾患と他の疾患とを識別するための鑑別診断を含んでいてもよく、該他の疾患としては、該特定の疾患と同じ症状または類似の症状を１以上有することを特徴とする疾患が含まれうる。
特定の実施形態では、１以上の診断の指標または予後の指標の存在または非存在のみに基づいて、該１以上の診断の指標または予後の指標と、状態または疾患とを相互に関連付ける。別の実施形態では、診断の指標または予後の指標の閾値レベルを設定することができ、患者試料中のこれらの指標のレベルと閾値レベルとを単純に比較することができる。診断検査および／または予後検査の感度および特異度は、検査の分析「品質」以外のものによっても左右され、すなわち、異常値がどのように定義されるかによっても左右される。実際上は、通常、「正常」集団および「疾患」集団における変数値をその相対頻度に対してプロットすること、ならびに／または治療前、治療中および／もしくは治療後に対象から得られた結果を比較することによって、受信者動作特性曲線（「ＲＯＣ」曲線）を算出する。
イムノアッセイ
本発明の別の実施形態では、イムノアッセイを使用して、試料中のマーカーを定性的または定量的に検出および分析することができる。この方法は、マーカーに特異的に結合する抗体を提供すること；該抗体と試料とを接触させること；および試料中のマーカーに抗体が結合した複合体の存在を検出することを含む。
マーカーに特異的に結合する抗体を調製するために、精製されたタンパク質マーカーを使用することができる。タンパク質マーカーに特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知の適切な方法を使用して調製することができる。
抗体が提供された後、公知の様々な免疫結合アッセイのいずれかを使用してマーカーを検出および／または定量することができる。有用なアッセイとしては、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロットアッセイ、およびスロットブロットアッセイが挙げられる（たとえば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号を参照されたい）。通常、対象から得られた試料は、マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることができる。
抗体を試料と接触させる前に、抗体を固相支持体に固定させて、複合体の洗浄およびそれに続く単離を容易なものとすることができる。固相支持体としては、たとえば、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズの形態の、ガラスおよびプラスチックが挙げられるが、これらに限定されない。抗体を固相支持体に付着させることもできる。
抗体とともに試料をインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成された抗体−マーカー複合体を検出することができる。複合体の検出は、洗浄後の混合物を検出試薬とともにインキュベートすることによって行うことができる。あるいは、試料中のマーカーは間接的なアッセイを使用して検出することができ、たとえば、マーカーに結合したマーカー特異的抗体を第２の標識抗体を使用して検出することができ、かつ／または競合アッセイもしくは阻害アッセイを使用して、たとえば、マーカーの別のエピトープに結合するモノクローナル抗体を混合物と一緒にインキュベートすることにより検出することができる。
アッセイ全体にわたって、試薬の添加ごとにインキュベーションステップおよび／または洗浄ステップが必要となりうる。インキュベーションステップは、約５秒間〜数時間の範囲から選択してもよく、約５分間〜約２４時間の範囲から選択することが好ましい。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイの構成、マーカー、溶液量、濃度などに左右されるであろう。アッセイは、１０℃〜４０℃などの一定の温度範囲において行うことができるが、通常、環境温度において実施されるであろう。
イムノアッセイは、対象から得た試料中のマーカーの評価量を測定するために使用することができる。まず、試料中のマーカーの評価量を上記のイムノアッセイ法を使用して検出することができる。試料中にマーカーが存在する場合、上記の適切なインキュベーション条件下において、マーカーは、マーカーに特異的に結合する抗体とともに抗体−マーカー複合体を形成するであろう。抗体−マーカー複合体の量は、スタンダードと比較することによって決定してもよい。上述したように、測定値をコントロールの量および／またはコントロールシグナルと比較することが可能であれば、マーカーの評価量を絶対単位で測定する必要はない。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
この方法の一形態は所望の基質を沈殿させることを含み、本明細書において後述される方法では、アガロースビーズなどの沈殿可能な担体上に固相化された放射性標識抗体結合タンパク質（たとえば１２５Ｉで標識したプロテインＡ）と特異的抗体とを使用して所望の基質を沈殿させる。沈殿ペレット中のカウント数は基質の量と比例する。
ＲＩＡの別の形態では、標識した基質と、標識していない抗体結合タンパク質とを使用する。未知量の基質を含む試料を様々な量で添加する。沈殿物中の標識基質に由来するカウントの減少は、添加した試料中の基質の量に比例する。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
この方法は、マイクロタイタープレートのウェルなどの表面に、タンパク質基質を含む試料を固定すること（たとえば固定した細胞またはタンパク質溶液）を含む。酵素とカップリングさせた基質特異的抗体を添加し、基質と結合させる。次いで、抗体にカップリングさせた酵素を利用した比色反応により、抗体の存在を検出しその量を定量する。この方法において一般的に使用される酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。較正が適切であり、かつ反応が直線領域内にある場合、試料中に存在する基質の量は呈色の量に比例する。通常、定量精度を向上させるために標準基質を使用する。
ウエスタンブロット
この方法は、アクリルアミドゲルを用いて他のタンパク質からの基質を分離し、次いで膜（たとえばナイロンまたはＰＶＤＦ）に基質を転写することを含む。次いで、基質に特異的な抗体を用いて基質の存在を検出した後、抗体結合試薬を用いて抗体を検出する。抗体結合試薬は、たとえばプロテインＡであっても他の抗体であってよい。上述したように、抗体結合試薬は放射性標識してもよく、酵素と結合させてもよい。検出はオートラジオグラフィ、比色反応、化学発光のいずれによって行ってもよい。この方法では、基質の定量と、アクリルアミドゲル上での電気泳動の際の泳動距離を示す膜上の相対位置からの基質の同定との両方を行うことができる。
免疫組織化学法
この方法は、基質特異的抗体を用いて、固定された細胞中の基質をインサイチューで検出することを含む。基質特異的抗体は、酵素に結合されていてもよく、発蛍光団に結合されていてもよい。検出は顕微鏡観察および主観評価による。酵素を結合させた抗体を使用する場合、比色反応が必要とされうる。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
この方法は、基質特異的抗体を用いて、細胞中の基質をインサイチューで検出することを含む。基質特異的抗体は発蛍光団に結合される。検出は、細胞が光線を通過する際にそれぞれの細胞から発せられる光の波長を読み取るセルソーティング装置を用いて行う。この方法では２種以上の抗体を同時に使用してもよい。
放射性イメージング方法
この方法は、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）およびシングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）含むが、これらに限定されない。これらの技術はいずれも非侵襲性であり、様々な組織事象および／または組織機能を検出および／または測定するために使用することができ、たとえば、がん細胞の検出などを行うことができる。ＰＥＴとは異なり、ＳＰＥＣＴでは２種の標識を同時に使用してもよい。ＳＰＥＣＴは他にも利点をいくつか有し、たとえば、コストおよび使用可能な標識の種類の点で有利である。たとえば、米国特許第6,696,686号には、乳がんを検出するためのＳＰＥＣＴの使用が記載されており、この文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
セラノスティクス
セラノスティクス（theranostics）は、診断検査を使用して、疾患を診断し、診断検査の結果に応じて適切な治療計画を選択し、かつ／または診断検査の結果に応じた治療法に対する患者の応答をモニターすることを指す。セラノスティクス試験を使用することによって、患者に対して特に有益であり、副作用を起こさないと考えられる治療法を患者のために選択することができる。さらに、セラノスティクス試験は、個々の患者における治療効果の早期かつ客観的な指標を示すことができるため、治療を最小限の遅れで（必要に応じて）変更することができる。たとえば、DAKO社とジェネンテック社は共同で、乳がんの治療のためのHercepTestおよびハーセプチン（トラスツズマブ）を開発したが、これは初めてのセラノスティクス試験であり、新規の治療薬と同時に承認された。HercepTest（免疫組織化学的試験）に加えて、従来の臨床化学、イムノアッセイ、細胞に基づいた技術および核酸試験を使用した他のセラノスティクス試験も現在開発中である。PPGx社は最近ＴＰＭＴ（チオプリン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ）試験を上市したが、医師がこの試験を実施することにより、６−メルカプトプリン（白血病の治療において用いられる薬物）に対して致命的な副作用を起こす危険性のある患者を識別することが可能となる。さらに、Nova Molecular社は、アルツハイマー病患者のコリン様作用薬療法に対する応答を予測するための、アポリポ蛋白質Ｅ遺伝子のＳＮＰ遺伝子型決定法を先駆けて開発しており、現在、新薬の臨床試験においてこの指標を得るために広く利用されている。このように、セラノスティクス分野は、治療に対する患者の応答を予測する診断検査情報と、その特定の患者のための適切な治療の選択とが融合したものである。
代理マーカー
代理マーカーは、研究所において検出可能かつ／または患者の身体的兆候または症状に応じて検出可能であり、臨床的意義のあるエンドポイントの代わりとして治験において使用されるマーカーである。代理マーカーは、患者の知覚、身体機能、生存率を具体的に示す直接的な尺度であり、治療法の効果を予測するものであると考えられている。代理マーカーは、患者に対する治療効果を示す目的のエンドポイント（臨床エンドポイントと呼ばれる）よりも代理マーカーの方が早期に、簡便にまたは頻回に測定可能である場合に主として使用される。理想的には、代理マーカーは生物学的に妥当性があり、疾患の進行を予測でき、標準化されたアッセイ（従来の臨床化学、イムノアッセイ、細胞に基づいた技術、核酸試験および画像診断法を含むが、これらに限定されない）によって測定可能であるべきである。
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。以下の情報および実施例は説明を目的としたものであり、本発明をさらに限定するものとして解釈されるべきでない。図示されたすべての図、ならびに本出願において引用されたすべての引用文献、特許文献および公開特許出願の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
実施例１：C1ORF32タンパク質のクローニング
ａ．ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）
ヒトC1ORF32のshort isoform（配列番号１にコードされる）の全長クローニングは、完全長ORF（配列番号20）を増幅するように設計した遺伝子特異的プライマーを使用し、小細胞肺がん試料に由来するcDNAをテンプレートとしてRT-PCRを行うことにより実施した。
PCR反応物50μL中には、テンプレートとしての小細胞肺がん10ngと、100-746_For（配列番号27）および100-787_Rev（配列番号29）の各プライマー2.5μL（10μM）ずつと、Platinum PFX（登録商標）（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド、カタログNo.:1178-021）とが含まれていた。PCRプログラムは、95℃5分；94℃30秒→55℃30秒→68℃50秒を35サイクル；68℃10分であった。
PCR産物を精製し、制限酵素NheIおよびEcoRI（ニュー・イングランド・バイオラボ社、米国マサチューセッツ州ベヴァリー）で消化した。次いで、消化したDNAを、上記と同じ制限酵素であらかじめ消化したpIRESpuro3（pRp）ベクター（クロンテック社、カタログNo.:631619）にT4 DNAリガーゼ（プロメガ社、カタログNo.:M1801）を使用してライゲートした。
メーカーの説明書に準じ、得られたDNAでコンピテントE.Coli細菌DH5α（RBC Bioscience社、台湾国台北、カタログNo.:RH816）を形質転換し、次いで、組換えプラスミド選択用LB-アンピシリン寒天平板に播種し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、陽性のコロニーを、100μg/mLアンピシリンを添加した5mLのTerrific Broth中で振盪しながら37℃で一晩増殖させた。Qiaprep（登録商標）Spin Miniprep Kit（キアゲン社、カタログNo.:27106）を使用して、細菌培養物からプラスミドDNAを単離した。インサートはシークエンシング（Hylabs、イスラエル国レホボト）により確認した。得られたDNAに対応する核酸配列を配列番号20に示す。
ｂ．ヒトC1ORF32-HAタグタンパク質（配列番号22）
ヒトC1ORF32-HAタグ（配列番号22にコードされる）の全長クローニングは、C1ORF32（配列番号22）の細胞外ドメイン領域内の51番目のアミノ酸位置にHAタグをインフレームで挿入する特異的プライマー（配列番号27および28）を使用し、タグを付加していない上記コンストラクトの完全長ORFをテンプレートとしてPCRを行うことにより実施した。
Platinum PFXと、テンプレートとしてのヒトC1ORF32_pIRESpuro3（pRp）ベクター10ngと、100-746_For（配列番号27）および100-927_Rev（配列番号28）の各プライマー10μMずつとを使用したPCRによりクローニングを行った。得られたDNAでコンピテントE. Coli細菌DH5αを形質転換した。このクローニングと形質転換は上記と同様にして行った。得られたDNAに対応する核酸配列を配列番号22に示す。
ｃ．キメラマウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）
マウス細胞外ドメイン（ECD）内に存在する２つのアミノ酸ミスマッチ（T75→PおよびS79→A）を導入することにより、配列番号１にコードされるヒトC1ORF32から、マウスECDを有するタンパク質を作製した。このタンパク質は、マウスECD配列とヒトshort isoform由来の短いテールとを有するキメラタンパク質であった。このタンパク質の作製は、部位特異的変異誘発を使用して以下のように行った。
PCR反応物50μLには、テンプレートとしてのヒトC1ORF32_pRpコンストラクト（配列番号21）10ngと、200-386_For（配列番号25）および200-387_Rev（配列番号26）の各プライマー2.5μL（10μM）ずつと、PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社、カタログNo.:600670）とが含まれていた。PCRプログラムは、95℃3分；95℃1分→55℃1分→72℃3分を12サイクル；47℃1分；72℃10分であった。PCR産物は、DpnI（ニュー・イングランド・バイオラボ社、カタログNo.:R0176S）2μLを使用して37℃で2時間処理した。メーカーの説明書に準じ、PCR産物5μLでNEB 5-αコンピテントE. coli細胞（カタログNo.:NEB-C2987H）を形質転換し、上記と同様にして処理を行った。シークエンシングによりDNAを確認した。このDNAを配列番号30に示す。
ｄ．マウスC1ORF32-FLAGタグタンパク質（配列番号21）
配列番号21にコードされるマウスC1ORF32-FLAGの全長クローニングは、遺伝子合成（GENEWIZ社、米国）によって行った。
合成したDNA（配列番号21）を、制限酵素NheIおよびNotI（ニュー・イングランド・バイオラボ社、米国マサチューセッツ州ベヴァリー）で消化した。消化した後、DNAを1%アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムで染色し、1×TAE溶液中において100Vで電気泳動し、UV光で可視化した。予想されるバンドサイズを確認した後、QIAquick（登録商標） Gel Extraction Kit（キアゲン社、カタログNo.:28707）を使用して、PCR産物をゲルから切り出し抽出した。次いで、消化したDNAを、上記と同じ制限酵素であらかじめ消化したpIRESpuro3（pRp）ベクター（クロンテック社、カタログNo.:631619）にT4 DNAリガーゼ（プロメガ社、カタログNo.:M1801）を使用してライゲートした。上記と同様にして、得られたDNAでNEB 5-αコンピテントE. coli細胞を形質転換した。pIRESpuro3ベクター特異的プライマーを使用したPCRにより陽性のコロニーをスクリーニングし（データ示さず）、シークエンシングによりインサートを確認した。得られたDNAに対応する核酸配列を配列番号21に示す。
実施例２：C1ORF32タンパク質に特異的なポリクローナル抗体の作製
C1ORF32に対して特異的なポリクローナル抗体（pAb）を作製するための手順は、ペプチドの合成、ペプチドの担体への結合、動物の免疫化、採血、および抗体の精製を含み、これらはすべてシグマ アルドリッチ社（イスラエル国）において行った。２羽１組としたウサギ２群（１つのエピトープに対して１組）に注射を行い、C1ORF32（配列番号１）特異的抗体を作製した。動物の管理、取り扱いおよび注射はすべてシグマ社（イスラエル国）において行った。
ウサギの免疫化に使用したペプチドは、C1ORF32タンパク質（配列番号１）の75〜93番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有しているC1ORF32-ep1ペプチド（配列番号２:TRAQSLSKRNLEWDPYLDC）であった。使用した第２のペプチドは、C1ORF32タンパク質（配列番号１）の148〜163番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有しているC1ORF32-ep2ペプチド（配列番号３:TTPDDLEGKNEDSVEL）であった。KLH担体に結合させるため、C1ORF32-ep2ペプチド（配列番号３）にはC末端システインを付加した（配列番号６:TTPDDLEGKNEDSVEL-C）。
95%の純度で各ペプチドを25mg合成し、そのうち10mgをKLH担体に結合させた。2羽1組の各群のウサギは、担体結合ペプチドを用いて以下のように免疫した。ウサギR1（R7531）およびR2（R7532）はC1ORF32-ep1ペプチド（配列番号２）で免疫し、ウサギR3（R7533）およびR4（R7534）はC1ORF32-ep2ペプチド（配列番号６）で免疫した。ウサギの免疫化は２週ごとに１回行った。全採血により各ウサギから60mLの血液を回収し、各抗体を作製するための免疫原として使用したペプチドを用いてアフィニティー精製を行った。
C1ORF32に対して作製したポリクローナル抗体（pAb）と、これに対応する配列番号４のC1ORF32タンパク質（マウスIgG2aタンパク質に融合させたC1ORF32 ECD部分（配列番号４）に相当する）との結合性は、ウサギNo.1、2、3および4からの試験採血より得られた血清を使用したウエスタンブロット分析によって後述のように測定した。
タンパク質0.1μgに4× NuPAGE（登録商標）LDSサンプルバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0007）25μLを加えた。さらに、1,4-ジチオトレイトール（DTT；還元剤）をその最終濃度が100mMとなるように加えた。次いでサンプルを70℃で10分間インキュベートし、20,000×gで１分間遠心分離した。
メーカーの説明書に準じ、タンパク質サンプルを4-12% NuPAGE Bis-Trisゲル（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0321）にロードし、XCell SureLock（登録商標）Mini-Cell（インビトロジェン社、カタログNo.:E10001）を使用して、1×MOPS SDSランニングバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0001）中でゲル泳動を行った。次いで、メーカーの説明書に準じ、XCell（登録商標）IIブロッティング装置（インビトロジェン社、カタログNo.:E19051）を使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社、カタログNo.:401385）に転写した。
ブロットしたタンパク質を含む膜を以下のように処理して抗体を検出した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に0.05%Tween-20を添加して調製した緩衝液（PBST）で希釈した5%スキムミルク中で上記の膜を室温で30分間インキュベーションすることにより、膜の非特異的領域をブロックした（これ以降のインキュベーションはすべて室温、１時間の条件で行った）。次いで、ブロッキング溶液を一次抗体液（C1ORF32に対する上記のウサギポリクローナル抗体をブロッキング溶液で1:250に希釈したもの）に交換した。５分間の洗浄を３回行った後、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ（ペルオキシダーゼ標識AffiniPureヤギ抗ウサギIgG（Jackson社、カタログNo.:111-035-003））をブロッキング溶液で1:10,000に希釈したもの）を加えた。５分間の洗浄を３回行った後、ECL基質（ピアス社、カタログNo.:PIR-34080）を１分間適用し、X線フィルム（富士フイルム、カタログNo.:100NIF）に露光させた。図１に結果を示す。
図１は、組換えC1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号４）に対する結合性を、予想されるバンドサイズ約50kDaにおいて、免疫したウサギR1（R7531）、R2（R7532）およびR4（R7534）から得た血清と、免疫前血清とで比較した結果を示す。この実験条件において、ウサギR3から得た血清は検出不能であった。
実施例３：C1ORF32タンパク質を発現する安定なプールの作製
HEK-293T細胞上にヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）、キメラ型ヒト-マウスC1ORF32タンパク質（配列番号８）およびマウスC1ORF32タンパク質（配列番号21）を過剰発現させた安定なプール細胞の確立
以下のようにして、ヒトC1ORF32 pIRESpuro3コンストラクト（配列番号22）またはpIRESpuro3空ベクターをHEK-293T細胞に安定にトランスフェクトした。あらかじめ温めておいた完全培地2mLを使用して、HEK293T（ATCC、CRL-11268）細胞を、組織培養に適した滅菌6ウェルプレートに播種した。この完全培地の組成は、DMEM［ダルベッコの改変イーグル培地（バイオロジカルインダストリーズ社（イスラエル国Beit Ha'Emek）、カタログNo.:01-055-1A）］+10%FBS［ウシ胎仔血清（バイオロジカルインダストリーズ社（イスラエル国Beit Ha'Emek）、カタログNo.:04-001-1A）］+4mM L-グルタミン［バイオロジカルインダストリーズ社（イスラエル国Beit Ha'Emek）、カタログNo.:03-020-1A］であった。94μLのOptiMEM（Gibco社、31985-047）で希釈したFuGENE 6試薬（ロシュ社、カタログNo.:11-814-443-001）6μLを使用して、１ウェルあたり500,000個の細胞にDNAコンストラクト2μgを以下のようにトランスフェクトした。まず、FuGENE 6試薬とDNAコンストラクトとの混合物を室温で15分間インキュベートし、次いで、形成された複合体を含む混合物を上記細胞に滴下し、回転撹拌した。37℃に保った5%CO2インキュベーターに細胞を静置した。トランスフェクションの48時間後、選択培地（5μg/mLピューロマイシン（シグマ社、カタログNo.:P8833）を添加した完全培地）15mLを入れた75cm2の組織培養フラスコにトランスフェクト細胞を移した。細胞をインキュベーターに静置し、クローンの形成が観察されるまで培地を３〜４日ごとに交換した。
十分量の細胞が選択された後、細胞を回収した。プロテアーゼ阻害剤（ロシュ社、カタログNo.:11873580001）を添加したRIPAバッファー（50mM Tris-HCl pH8、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS）300μL中で細胞を氷上で20分間かけて溶解した。20,000×g、4℃で15分間遠心分離した後、透明な上清を清潔な試験管に移し、4× NuPAGE LDSサンプルバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0007）100μLを加えた。さらに、1,4-ジチオトレイトール（DTT；還元剤）をその最終濃度が100mMとなるように加えた。次いでサンプルを70℃で10分間インキュベートし、20,000×gで１分間遠心分離した。メーカーの説明書に準じ、4-12% NuPAGE Bis-Trisゲル（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0321）の1レーンあたり30μLのサンプルをロードし、XCell SureLock（登録商標）Mini-Cell（インビトロジェン社、カタログNo.:E10001）を使用して、1×MOPS SDSランニングバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0001）中でゲル泳動することによって、SDS-PAGE（Laemmli, U.K., Nature 1970; 227; 680-685）を実施した。メーカーの説明書に準じ、XCell IIブロッティング装置（インビトロジェン社、カタログNo.:E19051）を使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社、カタログNo.:401385）に転写した。
サンプルを上記と同様にしてSDS-PAGEでさらに処理して分析した。
CHO-K1細胞上にC1ORF32タンパク質を過剰発現する安定なプール細胞の確立
ヒトC1ORF32（配列番号１）プラスミドおよびpIRESpuro3空ベクタープラスミドを、以下のようにしてCHO-K1細胞に安定にトランスフェクトした。CHO-K1（ATCC、CCL-61）細胞を、あらかじめ温めておいた完全培地2mLを含む、組織培養に適した滅菌6ウェルプレートに播種した。この完全培地の組成は、F12 Nutrient Mixture（Ham）（Gibco社、カタログNo.:01-055-1A）+10%FBS［ウシ胎仔血清（バイオロジカルインダストリーズ（イスラエル国Beit Ha'Emek）、カタログNo.:04-001-1A）］+4mM L-グルタミン（バイオロジカルインダストリーズ（イスラエル国Beit Ha'Emek）、カタログNo.:03-020-1A）であった。100μLのOpti-MEM（登録商標） I Serum Free Medium（インビトロジェン社、カタログNo.:31985-047）で希釈したLipofectamine 2000 transfection reagent（インビトロジェン社、カタログNo.:11668019）4.5μLを使用して、１ウェルあたり500,000個の細胞にDNAコンストラクト2μgを以下のようにトランスフェクトした。まず、Lipofectamine 2000 transfection reagentとDNAコンストラクトとの混合物を室温で15分間インキュベートし、次いで、形成された複合体を含む混合物を上記細胞に滴下した。37℃に保った5%CO2インキュベーターに細胞を静置した。トランスフェクションの48時間後、選択培地（12μg/mLピューロマイシン（シグマ、カタログ番号:P8833）を添加した完全培地）15mLを含む75cm2の組織培養フラスコに細胞を移した。細胞をインキュベーターに静置し、クローン形成が観察されるまで培地を３〜４日ごとに交換した。
実施例４：C1ORF32を発現する安定なプールを使用した抗C1ORF32ポリクローナル抗体の特性評価
Ａ．抗C1ORF32ポリクローナル抗体を使用した、C1ORF32を発現する安定なプールのウエスタンブロット分析
C1ORF32を発現する組換えHEK293T細胞の安定なプールの全細胞抽出液を、精製した抗C1ORF32ポリクローナル抗体R7531を使用したウエスタンブロット分析で評価することによって、該抗体の特異性を確認した。
十分量の細胞が選択された後、細胞を回収した。プロテアーゼ阻害剤（ロシュ社、カタログNo.:11873580001）を添加したRIPAバッファー（50mM Tris-HCl pH8、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS）300μL中で細胞を氷上で20分間かけて溶解した。20,000×g、4℃で15分間遠心分離した後、透明な上清を清潔な試験管に移し、4× NuPAGE LDSサンプルバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0007）100μLを加えた。さらに、1,4-ジチオトレイトール（DTT；還元剤）をその最終濃度が100mMとなるように加えた。次いでサンプルを70℃で10分間インキュベートし、20,000×gで１分間遠心分離した。メーカーの説明書に準じ、4-12% NuPAGE Bis-Trisゲル（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0321）の1レーンあたり30μLのサンプルをロードし、XCell SureLock Mini-Cell（インビトロジェン社、カタログNo.:E10001）を使用して、1×MOPS SDSランニングバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0001）中でゲル泳動することによって、SDS-PAGE（Laemmli, U.K., Nature 1970; 227; 680-685）を実施した。メーカーの説明書に準じ、XCell IIブロッティング装置（インビトロジェン社、カタログNo.:E19051）を使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社、カタログNo.:401385）に転写した。
サンプルを上記と同様にしてSDS-PAGEでさらに処理して分析した。
図２に結果を示す。
図２は、空ベクター（レーン1）、ヒトC1ORF32（配列番号１）（レーン2）、ヒトC1ORF32-HAタグ（配列番号22）（レーン3）、キメラ型マウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）（レーン4）、およびマウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）（レーン5）をそれぞれトランスフェクトしたHEK293Tプールの溶解物30μgのウエスタンブロット分析を、抗C1ORF32ポリクローナル抗体R7531（2μg/mL）を使用して行った結果を示す。C1ORF32をトランスフェクトした様々なHEK293T細胞では、pIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトした安定なHEK293Tプールの全細胞抽出液と比較して、ヒトC1ORF32において予想サイズ約30kDaに相当するバンドが検出され、マウスC1ORF32（配列番号21）において予想サイズ約70kDaに相当するバンドが検出された。しかしながら、より高いMW（分子量）では非特異的バンドがすべての細胞株で観察された。
Ｂ．抗C1ORF32ポリクローナル抗体を使用した、C1ORF32を発現する安定なプールのFACS分析
上述の安定なトランスフェクションにおいて天然型細胞表面C1ORF32タンパク質（配列番号１）に対する上記ポリクローナル抗体の結合性を確認するために、本明細書の「C1ORF32タンパク質に特異的なポリクローナル抗体の作製」の章に記載の抗C1ORF32ポリクローナル抗体R7531、R7532およびR7534を使用したフローサイトメトリー分析を行った。無関係なウサギIgG（シグマ社、カタログNo.I5006）をネガティブコントロールとして使用した。抗C1ORF32抗体で染色したC1ORF32発現組換えHEK293T細胞（A）またはpIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を、FITC標識ロバ抗マウス二次抗体（Jackson社、711-096-152）で染色し、蛍光シグナルの存在を観察した。
Cell dissociation buffer Enzyme-Free PBS-Based（Gibco社；13151-014）を使用して、組換えHEK293T-C1ORF32細胞をプレートから剥離し、FACSバッファー［ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（バイオロジカルインダストリーズ社、02-023-1A）／1%ウシアルブミン（シグマ社、A7030）］で洗浄し、細胞数をカウントした。0.5×106個の細胞を20μg/mLの抗体溶液100μL中に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を氷冷FACSバッファーで洗浄し、上記の二次抗体とともに氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷FACSバッファーで洗浄し、FACSバッファー300μL中に再懸濁し、FACS装置（FACSCalibur、BD社）で分析した。Cellquest Pro VER. 5.2を使用してデータを取得し分析した。図３に結果を示す。
図３は、C1ORF32に特異的なポリクローナル抗体（R7531、R7532、R7534）を使用したフローサイトメトリー分析により、タグを付加していないC1ORF32タンパク質を発現する組換えHEK293T細胞（A）と、pIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞（B）とを比較した結果を示す。無関係なウサギIgG（シグマ社、カタログNo.I5006）をネガティブコントロールとして使用した。実験の結果、ポリクローナル抗体が天然型細胞表面C1ORF32タンパク質に特異的に結合することが示された。
実施例５Ａ：C1ORF32タンパク質特異的マウスモノクローナル抗体の作製
C1ORF32タンパク質（配列番号１）に対するモノクローナル抗体の作製は、SLRC社（Silver Lake Research Corporation、米国カリフォルニア州）において行った。
ペプチドの合成、動物の管理および取り扱い、動物の免疫化、採血、融合、ハイブリドーマのスクリーニングならびにサブクローニングを含むすべての操作は当業者によく知られている手順に準じてSLRC社において行った。
C1ORF32タンパク質（配列番号１）に対するモノクローナル抗体の作製は、プロジェクト5159（A）とプロジェクト5166（B）の２つのプロジェクトにより以下のように行った。
プロジェクト5159
SLRC社において、特許取得済みのEAP（登録商標）（Enhanced Affinity Platform）システムを使用して、ペプチド配列を用いた免疫化を行うためのEAP修飾抗原を作製した。このEAP修飾抗原は、ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）の細胞外ドメインの63〜85番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有しており、C末端にCysが付加されていた（配列番号６:TTPDDLEGKNEDSVELC）。
結合スクリーニングは、精製した組換えECD-mIgG2a融合タンパク質（配列番号４）を使用したELISA、または上述のC1ORF32タンパク質を過剰発現するHEK-293T細胞の安定なプールを使用したELISAにより行った。３つの陽性クローンをさらに処理してサブクローニングし、安定なハイブリドーマクローンを樹立した。抗体を産生させその精製を行うために、ハイブリドーマの安定化、サブクローニングおよびさらなる処理を行った。モノクローナル抗体5159-1、5159-2および5159-3を産生させ、その精製を行った後、各モノクローナル抗体からラージスケールで精製バッチを作製し、さらなる分析に使用した。
アイソタイピングにより、これらの抗体は5159-1 マウスIgG1 κ；5159-2 マウスIgG1 κ；5159-3 マウスIgM κであることが確認された。
プロジェクト5166
SLRC社において、特許取得済みのEAPシステムを使用して、C1ORF32 ECD-hIgG1融合タンパク質（配列番号23）およびC1ORF32 ECD-mIgG2a融合タンパク質（配列番号24）を免疫原として使用した免疫化を行うためのEAP修飾抗原を作製した。
結合スクリーニングは、C1ORF32 ECD-hIgG1融合タンパク質（配列番号23）およびC1ORF32 ECD-mIgG2a融合タンパク質（配列番号24）を使用したELISA、または本明細書の「C1ORF32タンパク質を発現する安定なプールの作製」の章に記載の、C1ORF32を過剰発現するHEK293T細胞の安定なプールを使用したELISAにより行った。２つの陽性クローン5166-2および5166-9をさらに処理してサブクローニングし、安定なハイブリドーマクローンを樹立した。アイソタイピングにより、5166-2はマウスIgG1 κであり、5166-9はマウスIgM κであることを確認した。抗体を産生させその精製を行うために、ハイブリドーマの安定化、サブクローニングおよびさらなる処理を行った。モノクローナル抗体5166-2および5166-9を産生させ、その精製を行った後、各モノクローナル抗体からラージスケールで精製バッチを作製し、さらなる分析に使用した。
実施例５Ｂ：モノクローナル抗体シークエンシング
TRIzol（登録商標）Plus RNA Purification System（インビトロジェン社、カタログNo.:15596-026）の技術マニュアルに準じて、凍結したハイブリドーマ細胞からトータルRNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動でトータルRNAを分析した。SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis System（インビトロジェン社、カタログNo.:18080-051）の技術マニュアルに準じて、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを使用して、トータルRNAからcDNAに逆転写した。次いでRT-PCRを行い、抗体の重鎖および軽鎖を増幅した。GenScript社のRACEの標準作業手順書に準じて、VHおよびVLの抗体フラグメントを増幅した。
標準的な分子クローニング手順を使用して、増幅した抗体フラグメントを標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。
適切なサイズのインサートを有するクローンを特定するために、コロニーPCRによりスクリーニングを行った。
適切なサイズのVHインサートおよびVLインサートを有する10個の単一コロニーを用いてシークエンシングを行った。10個の異なるクローンのVH遺伝子およびVL遺伝子はほぼ同一であることが分かった。
下記に示すコンセンサス配列は、本明細書に記載の寄託されたハイブリドーマ5166-2によって産生された抗体（5166-2抗体）の配列である。5166-2抗体の重鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号39および40に示す。5166-2抗体の軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号41および42に示す。リーダー配列はイタリック体で示し、CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列は太字で示す。定常領域FR1、FR2、FR3およびFR4は通常のフォントで示す。5166-2抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号43、44、45に示す。これに対応する5166-2抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号46、47、48に示す。5166-2抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号49、50、51に示す。これに対応する5166-2抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号52、53、54に示す。
下記に示すコンセンサス配列は、本明細書に記載の寄託されたハイブリドーマ5166-9によって産生された抗体（5166-9抗体）の配列である。5166-9抗体の重鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号55および56に示す。5166-9抗体の軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号57および58に示す。リーダー配列はイタリック体で示し、CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列は太字で示す。定常領域FR1、FR2、FR3およびFR4は通常のフォントで示す。5166-9抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号59、60、61に示す。これに対応する5166-9抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号62、63、64に示す。5166-9抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号65、66、67に示す。これに対応する5166-9抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号68、69、70に示す。
下記に示すコンセンサス配列は5159-1抗体の配列である。5159-1抗体の重鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号71および72に示す。5159-1抗体の軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号73および74に示す。リーダー配列はイタリック体で示し、CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列は太字で示す。定常領域FR1、FR2、FR3およびFR4は通常のフォントで示す。
5159-1抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号75、76、77に示す。これに対応する5159-1抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号78、79、80に示す。5159-1抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号81、82、83に示す。これに対応する5159-1抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号84、85、86に示す。
下記に示すコンセンサス配列は5159-2抗体の配列である。5159-2抗体の重鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号87および88に示す。5159-2抗体の軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号89および90に示す。リーダー配列はイタリック体で示し、CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列は太字で示す。定常領域FR1、FR2、FR3およびFR4は通常のフォントで示す。
5159-2抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号91、92、93に示す。これに対応する5159-1抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号94、95、96に示す。5159-2抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3の核酸配列をそれぞれ配列番号97、98、99に示す。これに対応する5159-2抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号100、101、102に示す。
実施例６：C1ORF32を発現する安定な組換え細胞プールを使用した、抗C1ORF32モノクローナル抗体の特性評価
Ａ．抗C1ORF32モノクローナル抗体5159を使用した、C1ORF32を発現する組換え細胞のウエスタンブロット分析
C1ORF32 pIRESpuroコンストラクトまたは空ベクター（pIRES-puro3ネガティブコントロール）をトランスフェクトしたHEK-293T（ATCC、CRL-11268）細胞の全細胞溶解液をウエスタンブロット分析で評価することにより、抗体とタンパクとの相互作用を観察した。全細胞溶解液30μgに4× NuPAGE LDSサンプルバッファー（インビトロジェン社、カタログNo.:NP0007）25μLを加え、本明細書の実施例４と同様にして処理を行った。
図４は、空ベクター（レーン1）、ヒトC1ORF32（配列番号１）（レーン2）、ヒトC1ORF32-HAタグ（配列番号22）（レーン3）、キメラ型マウス-ヒトC1ORF32（配列番号８）（レーン4）、およびマウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）（レーン5）をそれぞれトランスフェクトしたHEK293Tプールの全細胞溶解液のウエスタンブロット分析を、精製した抗C1ORF32モノクローナル抗体5159-1（2μg/mL）を使用して行った結果を示す。pIRES-puro3空ベクターをトランスフェクトした安定なHEK293Tプールの全細胞抽出液（レーン1）と比較して、約30kDaに相当する特異的なバンドがヒトC1ORF32（レーン2）およびヒトC1ORF32-HAタグ（レーン3）で検出された。弱いシグナルが変異C1ORF32（レーン4）で観察され、マウスC1ORF32トランスフェクト細胞ではシグナルは検出されなかった。
Ｂ.抗C1ORF32モノクローナル抗体5159を使用した、C1ORF32を発現する組換え細胞のFACS分析
上記モノクローナル抗体が上述した安定なトランスフェクト細胞の天然型細胞表面C1ORF32タンパク質（配列番号１）に結合することを確認するために、フローサイトメトリー分析を行った。検出は、C1ORF32に特異的なモノクローナル抗体5159-1、5159-2、5159-3を使用して行った。抗セファロスポリン（SLRC社、CH2025P）をネガティブコントロールとして使用した。C1ORF32タンパク質を発現する組換えHEK293T細胞、すなわち、ヒトC1ORF32（配列番号１）を発現する組換えHEK293T細胞、キメラ型ヒト-マウスC1ORF32（配列番号８）を発現する組換えHEK293T細胞、およびマウスC1ORF32-FLAGタグ（配列番号21）を発現する組換えHEK293T細胞を、本明細書の実施例６と同様にして、抗C1ORF32抗体または抗セファロスポリンで染色し、次いでDyLight 549標識ロバ抗マウス二次抗体（Jackson社、715-506-150）で染色した。蛍光シグナルを観察した。図５に結果を示す。
図５は、マウス抗C1ORF32モノクローナル抗体（20μg/mL）または比較のための無関係なIgGコントロール抗セファロスポリンを使用した後、1:250に希釈したDyLight 549標識ロバ抗マウスIgG二次抗体で染色することにより測定した、様々なC1ORF32タンパク質の膜発現量を示す。図５Ａは空ベクターをトランスフェクトした細胞を示し、図５ＢはヒトC1ORF32をトランスフェクトした細胞（配列番号１）を示し、図５ＣはヒトC1ORF32-HAタグをトランスフェクトした細胞（配列番号22）を示し、図５Ｄはキメラ型ヒト-マウスC1ORF32をトランスフェクトした細胞（配列番号８）を示し、図５ＥはマウスC1ORF32-FLAGタグをトランスフェクトした細胞（配列番号21）を示す。
さらに、フローサイトメトリー分析により、ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）を発現する組換えCHO-K1細胞と、pIRESpuro3空ベクターをトランスフェクトしたCHO-K1細胞とを比較した。2μg/mLに希釈した抗C1ORF32モノクローナル抗体5159-1と細胞とを氷上で1時間インキュベートした後、1:100に希釈したAlexa Fluor 488標識ヤギ抗マウス二次抗体（インビトロジェン社、A11001）で染色した。マウス抗セファロスポリンをネガティブコントロールとして使用した。蛍光シグナルを観察した。図６に結果を示す。
図６は、フローサイトメトリー分析により、C1ORF32タンパク質に対する抗C1ORF32モノクローナル抗体5159-1の結合性を、ヒトC1ORF32タンパク質（配列番号１）を発現するCHO-K1（ATCC、CCL-61）細胞とCHO-K1細胞とで比較した結果を示す。
実施例７：細胞表面C1ORF32タンパク質に対するモノクローナル抗体5166の結合性のFACS分析
上述の安定なトランスフェクションにおいて天然型細胞表面C1ORF32タンパク質（配列番号１）に対するモノクローナル抗体の結合性を確認するために、抗C1ORF32モノクローナル抗体5166-2および5166-9を使用してフローサイトメトリー分析を行った。抗セファロスポリン（Silver Lake社、CH2025P）および正常マウス血清（Jackson社、カタログNo.:015-000-120）をネガティブコントロールとして使用した。
C1ORF32（配列番号１）を発現する組換えCHO-K1細胞を、C1ORF32に対するモノクローナル抗体5166または抗セファロスポリンで染色した後、1:100に希釈したAlexa Fluor 488標識ヤギ抗マウス（インビトロジェン社、A11001）二次抗体で染色し、蛍光シグナルの存在を観察した。
「抗C1ORF32モノクローナル抗体5159を使用したFACS分析による、C1ORF32を発現する安定なプールの特性評価」の章の記載と同様にして、組換えCHO-K1-ヒトC1ORF32（配列番号１）細胞を処理した。図７に結果を示す。
図７は、ヒトC1ORF32タンパク質に対する抗C1ORF32モノクローナル抗体5166-2（左）および5166-9（右）の結合性を、ヒトC1ORF32タンパク質を発現する組換えCHO-K1細胞とCHO-K1の安定なプールとで比較した結果を示す。マウス抗セファロスポリンをネガティブコントロールとして使用した。
実施例８：抗C1ORF32ポリクローナル抗体R1（R7531）を使用した免疫組織化学的（IHC）評価
抗C1ORF32抗体R1（R7531）の組織に対する結合特性を評価するために、正常（非新生物）ヒト組織パネルおよび腫瘍組織パネルを用いて該抗体を試験した。C1ORF32をトランスフェクトしたHEK-293細胞をポジティブコントロールとして使用して染色用の該ポリクローナル抗体の濃度調整を行った。また、ウサギ血清IgGをアイソタイプコントロール抗体として使用した。
上記のアフィニティー精製した抗C1ORF32抗体R1（R7531）を一次抗体として使用した。基本的な検出システムは、Vector社の抗ウサギ二次抗体（BA-1000）と、赤紫色に染色された沈着物を生成させるためのVector社のRed substrate kit（SK-5100）を使用したVector社のABC-AP kit（AK-5000）とで構成されていた。ネガティブコントロールは、一次抗体を使用せずに隣接する切片に対して免疫組織化学染色の全工程を行うことにより作製した。ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織は、Biomax Inc.またはAsterand plcから購入した。スライドは病理学者により評価した。それぞれの抗体について、特異的シグナルの存在およびバックグラウンドレベルを評価した。染色強度は０〜４の段階で記録した（０＝陰性、１＝赤みがかった色、２＝弱い染色、３＝中程度の染色、４＝強度の染色）。スライドは、ニコンE400顕微鏡に接続したDVC 1310Cデジタルカメラで撮影した。抗体R7531は、1.25μg/mLの濃度において、ポジティブコントロールのトランスフェクト細胞株に対して中程度の染色を示し、空ベクターネガティブコントロール細胞に対して陰性を示した。
表１は、評価結果を要約したものであり、上記抗体により大部分の細胞が中程度〜強度に染色された新生物組織を記載している。表１に示したように、中程度〜強度のC1ORF32の発現を示した腫瘍は、肝細胞癌（ステージIIおよびIII）、嫌色素性腎腺腫、膵島細胞癌、悪性黒色腫（ステージIV）、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、膀胱移行細胞癌（ステージII〜IV）およびホジキンリンパ腫であった。弱度〜中程度の染色が観察された腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌（浸潤性乳管癌ステージIIa、IIb〜IIIb）、甲状腺乳頭癌（ステージII）、卵巣漿液性・粘液性癌（ステージＩc〜IIIb）、卵巣顆粒細胞腫瘍、腎明細胞癌（ステージＩ〜II）、肉腫様腎癌、前立腺腺癌（ステージＩ〜III）、肝臓胆管癌、膵管内粘液性腺癌、皮膚扁平上皮癌、精巣セミノーマ、横紋筋肉腫、血管肉腫および子宮類内膜腺癌であった。２つの脊髄腫瘍はいずれも中程度の染色を示した。このように、染色性を示した細胞は本発明の抗体の潜在的標的であると考えられる。
末梢組織（１つの組織あたり１標本）では、中程度〜強度の染色が、子宮内膜腺、マクロファージのサブセット、およびランゲルハンス島内の細胞のサブセットで観察された。中程度の染色は、乳房上皮、形質細胞、クッパー細胞、精巣のライディッヒ細胞、マスト細胞、胎盤栄養膜細胞、軟骨細胞、混在する血管内皮、および子宮内膜間質細胞で観察された。
さらに、リンパ組織アレイを用いて正常リンパ節に特化したIHC評価を行った。このリンパ組織アレイには、生体内の様々な場所から得たヒトリンパ節をホルマリン固定したサンプルが48コア含まれていた。C1ORF32ポリクローナル抗体は1.25μg/mLの濃度で使用した。C1ORF32は、48コアのうちの9コアにおいて弱い染色として示され、48コアの正常リンパ節サンプルのうち39コアにおいてリンパ球の弱〜中程度の染色として示された。上述の腫瘍アレイには、３つの正常リンパ節サンプルも含まれており、これらのサンプルのリンパ球は赤みがかった色〜弱い染色像を示した。リンパ球に加えて、形質細胞ならびに混在するマクロファージおよび内皮細胞も染色性を示した。
TOP4がんTMAを使用した免疫組織化学的（IHC）分析
抗C1ORF32ウサギポリクローナル抗体の濃度調整は、ポジティブコントロール細胞株のFFPE切片を免疫組織化学染色することによって行った。PT Link装置を使用してFlex+ 3-in-1 pH9.0抗原賦活液中で切片の脱パラフィン、再水和、抗原賦活を行った後、0.3μg/mLの上記抗体とインキュベートした。結合した抗体はDAKO Envision Flex+検出試薬を使用して検出した。試験したポジティブコントロール細胞株サンプル中の特異的シグナルが上記抗体によって検出された。
最適条件に調整した後、ヒトがん組織マイクロアレイ（Asterand社の「Top4」TMA（登録商標））を用いて抗C1ORF32ポリクローナル抗体を試験した。C1ORF32タンパク質はマイクロアレイ全体で見て試験した腫瘍のいくつかで発現されていた。C1ORF32免疫反応性が最も一貫して示された腫瘍は、サンプルのすべてが陽性を示した前立腺腺癌であった（表２参照）。
乳房腫瘍セットでは染色強度は低く（1+）、３つの腫瘍のみがスコア2+を示した（低分化型浸潤性乳管癌（IDC）、グレード3のIDCおよび面皰性乳癌）。上皮細胞の大部分が陰性であった３つの乳がんサンプルでは、浸潤免疫細胞が陽性染色を示した（浸潤性乳管癌グレード2および3、髄様癌グレード2）。大腸セットでは腫瘍はすべて腺癌であり、分析したすべての腫瘍において低い免疫反応性が見られた。５つのサンプルで2+の免疫反応性が示された（これは、これらのサンプルが中〜低分化型であったことを示している）。肺腫瘍セットでは、腫瘍のうち２つはスコア2+の強い免疫反応性を示し、これらの腫瘍はいずれも低〜中分化型であり、一方は扁平上皮癌の組織像を示し、もう一方は大細胞癌の組織像を示した。１つの肺腫瘍コアは>50%の免疫反応性を示し、その染色強度は1+であった。正常肺サンプルについては、各ドナーのサンプルのうち少なくとも１つのコアは陽性であった。中程度に分化した肺扁平上皮癌の１つのサンプルでは、腫瘍のC1ORF32反応性は陰性であったが、浸潤免疫細胞は中程度の染色を示した。前立腺腫瘍では高レベルの免疫反応性が示された。26例の前立腺腺癌群においては、腫瘍はすべてC1ORF32免疫反応性を示し、そのほとんどがスコア+1であった。２つの腫瘍（グリーソンスコア6および7）でスコア3+が示され、６つの腫瘍（グリーソンスコア5、6および7）でスコア2+が示された。正常前立腺サンプルでは腺上皮が染色された。
前立腺腫瘍の切片全体および浸潤免疫細胞におけるC1ORF32の発現
10個の前立腺がんパラフィン包埋切片を脱パラフィンし、抗原賦活した後、染色した。抗原賦活および染色は、メーカーのプロトコルに準じVentana Ultra IHC/ISH systemを使用して行った。抗C1ORF32ポリクローナル抗体で染色するために、プロテアーゼ（製品番号:760-2018）を用いて抗原賦活を行った。抗CD68 KP-1マウスモノクローナル抗体はVentana社から購入した。標準的な賦活化プロトコル（CC1モジュール、Ventana社）を使用し、ギムザ染色液はVentana社（カタログNo.:860-006）から購入した。抗C1ORF32ポリクローナル抗体で染色したところ、すべてのサンプルにおいて少なくとも弱い染色性が観察された。６つの腫瘍がスコア+1を示し、４つの腫瘍がスコア+2を示した。マクロファージおよびマスト細胞であると形態学的に同定された浸潤免疫細胞のサブセットにおいても、C1ORF32の免疫反応性は陽性であった。これらの細胞の特性は、マクロファージに対しては抗CD68抗体を使用し、マスト細胞に対してはギムザ染色液を使用することによってさらに詳しく確認した。得られた様々なTMAデータを形態学的にさらに評価したところ、陽性を示した浸潤免疫細胞は、乳がん、小細胞肺がん（ステージI、II、IIIaおよびIIIb）（図８）、非小細胞肺がん、および結腸直腸がん（ステージIII）でも観察された。これらのがんのがん細胞の染色像は弱度〜陰性であったが、浸潤免疫細胞ではC1ORF32の免疫反応性は陽性であった。このことは、免疫系を刺激することによって抗がん療法を実施できる可能性があることを示しており、さらに、このような細胞種が、本明細書に記載の抗体療法の標的として使用されうることを示している。
実施例９：Jurkat T細胞の活性化に対するHEK293T細胞上に発現されたC1ORF32の効果
T細胞の活性化に対する膜型C1ORF32タンパク質（配列番号１）の抑制効果をさらに評価するために、C1ORF32を過剰発現するHEK293T細胞（C1ORF32の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を使用したフローサイトメトリーによってその発現を確認した）またはネガティブコントロールとしてベクター（pRp3）のみをトランスフェクトしたHEK293T細胞と、プレート結合抗CD3抗体の存在下で活性化させた初代CD4+マウスT細胞またはJurkat T細胞との共培養アッセイを行った。実験の設定を図９に示す。
C1ORF32タンパク質を過剰発現するHEK293T細胞は、本明細書の実施例３と同様にして作製した。
ａ）CD69の発現により測定した抗CD3媒介性Jurkat T細胞活性化
１日目：
１．1×PBSで希釈した抗CD3（クローンOKT3、eBioscience社、カタログNo.:16-0037-85；またはクローンUCHT1、BDバイオサイエンス社、カタログNo.555329）を、添付文書に記載の濃度で１ウェルあたり75μL使用して96ウェルプレート上に固相化した。
２．プレートをパラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
３．HEK293T-pRp細胞のプールとC1ORF32タンパク質（配列番号１）を異所性に発現するHEK293T細胞のプールをそれぞれT75プレートに12×106個/ウェルの濃度で播種し、10%FBS、L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で湿潤インキュベーターを用いて一晩培養した。
２日目：
１．抗CD3でコーティングしたウェルを×1 PBS200μLで3回洗浄した。洗浄液は無菌環境でデカントした。最後の洗浄後、プレートに残った洗浄液を滅菌吸収紙に吸収させて除去した。
２．前日に播種したHEK293T細胞をマイトマイシンC（シグマ社、M4287）で処理した。すなわち、H2O中で新たに調製した0.5mg/mLのマイトマイシンC溶液900μLを8.1mLの増殖培地に直接加えてその最終濃度を50μg/mLとした。細胞をマイトマイシンCとともに37℃で1時間インキュベートした。
３．マイトマイシンCで処理したHEK293T細胞を1×PBS10mLで3回洗浄し、cell dissociation buffer（Gibco社；カタログNo.:13151-014）2mLを加えて細胞を回収した。
４．剥離したHEK293T細胞を、10%FBS、L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したRPMI（Jurkat細胞用増殖培地）8mL中に再懸濁した。
５．ベックマン・コールター社のカウンターを使用して細胞を計数した後、細胞を希釈して0.5×106個/mLの濃度とした。
６．100μL/ウェルの（上述の）Jurkat細胞用RPMI増殖培地中で細胞を添付文書に記載の濃度に段階希釈して播種した。
７．2時間インキュベートしてHEK293T細胞を結合させた。
８．2μg/mL可溶性抗CD28（クローンCD28.2、eBioscience社、カタログNo.:16-0289-85）の存在下または非存在において、Jurkat細胞用RPMI増殖培地中50,000個のJurkat細胞（ATCC、クローンE6-1、TIB-152、ヒトT細胞白血病由来）を100μL/ウェルで各ウェルに加えた。
９．細胞を湿潤インキュベーターで一晩共培養した。
３日目：
１．細胞をU字底型プレートに移し、4℃、1500rpmで5分間遠心分離し、上清をデカントした。
２．抗CD69抗体（Biolegend社、PE-anti human CD69、クローンFN50、カタログNo.:310906、10μg/mL、2μL/ウェル）およびFc-blocker（Miltenyi Biotec社、ヒトFcRブロッキング試薬、カタログNo.:120000-442、1μL/ウェル）を、氷冷FACSバッファー（1×PBS+0.5%BSA+2mM EDTA+0.05%アジ化物）で希釈して各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を50μLとした。
３．（気泡が入らないように）ピペッティングして各ウェルの内容物を優しく混合した。
４．プレートを氷上で30分間インキュベートした。
５．細胞をFACSバッファー200μLで1回洗浄後、プレートを4℃、1500rpmで5分遠心分離した。上清をデカントで捨てた。
６．細胞をFACSバッファー200μLに再懸濁し、FACSバッファー100μLで満たしたFACSチューブに移した。
７．Jurkat細胞におけるCD69の細胞表面発現（平均蛍光強度（MFI））をフローサイトメトリーで分析した。Jurkat細胞は前方散乱（FSC）vs側方散乱（SSC）プロット上でゲーティングした。ゲーティング操作のバリデーションは、抗CD2抗体（Biolegend社、クローンRPA-2.10、カタログNo.:300206）で細胞を染色し、T細胞を同定することにより行った。
CD69の発現により測定した抗CD3媒介性Jurkat T細胞活性化の抑制
細胞膜上に発現されたC1ORF32（配列番号１）のT細胞活性化に対する効果は、プレート結合抗CD3抗体で活性化したJurkat T細胞と共培養したC1ORF32（配列番号１）トランスフェクトHEK293T細胞を使用して評価した。ベクター（pRp3）のみをトランスフェクトしたHEK293T細胞をネガティブコントロールとして使用した。
図１０および図１１に示す代表的な結果では、HEK293T/C1ORF32細胞の存在下において２種の異なる抗CD3クローン（OKT2およびUCHT1）でJurkat T細胞を刺激したところ、T細胞の活性化の初期マーカーであるCD69レベルが低下したことより、Jurkat T細胞の活性化が抑制されたことが示された。図１２に示すように、抗CD3抗体と抗CD28抗体とを併用してJurkat細胞を活性化したところ、類似した結果が得られた。Jurkat細胞の活性化の有意な抑制は7.5時間共培養した後でも観察することができる（図１３）。
図１０は、HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）がJurkat細胞の活性化を抑制することを示す。0.1μg/mLまたは0.25μg/mLの抗CD3（OKT3クローン）でプレコーティングしたウェルに、C1ORF32を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を2.5×104個（図１０Ａ）または5×104個（図１０Ｂ）で播種した。2時間後にJurkat細胞（5×104個/ウェル）を加え、一晩インキュベートし、Jurkat細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図１０Ｃに示す。
図１１は、HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）が、抗CD3-UCHTクローンで活性化したJurkat細胞を抑制することを示す。2μg/mLまたは4μg/mLの抗CD3（UCHT1クローン）でプレコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を2.5×104個（図１１Ａ）または5×104個（図１１Ｂ）で播種した。2時間後にJurkat細胞（5×104個/ウェル）を加え、一晩インキュベートし、Jurkat細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図１１Ｃに示す。
図１２は、HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）が、抗CD3および抗CD28で活性化したJurkat細胞を抑制することを示す。プレート上に結合させた抗CD3（0.1μg/mLまたは0.25μg/mL）で活性化したJurkat細胞（図１２Ａ）、またはプレート上に結合させた抗CD3（0.1μg/mLまたは0.25μg/mL）と可溶性抗CD28とで活性化したJurkat細胞（図１２Ｂ）を一晩インキュベートし、これらの細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図１２Ｃ）0.1μg/mLまたは0.25μg/mLの抗CD3（OKTクローン）でコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を2.5×104個/ウェル、5×104個/ウェルまたは10×104個/ウェルの濃度で播種した。2時間後に5×104個のJurkat細胞を加え、一晩インキュベートし、Jurkat細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ΔMFI値を図に示す。（図１２Ｄ）0.1μg/mLまたは0.25μg/mLの抗CD3（OKTクローン）でコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を5×104個/ウェルの濃度で播種した。2時間後に5×104個のJurkat細胞のみ、または5×104個のJurkat細胞と2μg/mLの可溶性抗CD28とを加え、一晩インキュベートし、Jurkat細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ΔMFI値を図に示す。
図１３は、HEK293T細胞上に発現されたC1ORF32（配列番号１）がJurkat細胞の活性化を抑制することを示す。0.5μg/mL、1μg/mLまたは2μg/mLの抗CD3（OKTクローン）でコーティングしたウェルに、C1ORF32（配列番号１）を発現するHEK293T細胞またはpRpベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞を2.5×104個（図１３Ａ、Ｃ）または5×104個（図１３Ｂ、Ｄ）で播種した。2時間後に5×104個のJurkat細胞を加え、7.5時間（図１３Ａ、Ｂ）または一晩（図１３Ｃ、Ｄ）共培養した。Jurkat細胞上のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69のΔMFI値を図に示す。
HEK293T細胞の細胞膜上に発現されたC1ORF32（配列番号１）はT細胞の活性化を抑制する。最も高い抑制効果は、2種の濃度の抗CD3（OKTクローン0.25〜1μg/mLまたはUCHT1クローン2〜4μg/mL）および2種の濃度のHEK293T細胞（1ウェルあたり25,000個または50,000個）を使用した系で観察された。T細胞の活性化の抑制は一晩インキュベートした後に観察され、さらには7.5時間インキュベートした後でも観察された。これらの結果より、C1ORF32タンパク質細胞外ドメインのFc融合形態と同様に、細胞表面上に発現されたこのような天然型膜タンパク質（C1ORF32）も機能抑制活性を有しており、したがって、この天然型膜タンパク質（C1ORF32）も抗がん療法に適した治療用アンタゴニストモノクローナル抗体の標的として使用することができることが示された。また、これらの結果は、「T細胞刺激性」BW-5147細胞の細胞膜上に異所性に発現されたC1ORF32タンパク質がヒトT細胞の増殖を抑制することが示された後述の他の知見とも一致している。
実施例１０：HEK293細胞の細胞膜上に発現されたC1ORF32によるマウスCD4 T細胞の抑制
マウスT細胞に対するC1ORF32タンパク質の抑制活性を確認するために、実施例３と同様にしてHEK293細胞上にC1ORF32タンパク質（配列番号１）を異所性に発現させた。ヒトC1ORF32（配列番号１）をコードする発現ベクターまたは空ベクターを使用した。トランスフェクタントの細胞膜上に発現されたC1ORF32は、特異的抗C1ORF32ポリクローナル抗体を使用したFACS分析によって確認した（データ示さず）。プレート結合抗CD3で活性化したCFSE標識マウスCD4+T細胞を使用して分析したところ、HEK293上に発現されたC1ORF32による抑制効果がはっきりと示された（図１５）。図１５に示すように、T細胞の数に対するHEK293細胞の数が多ければ多いほど、高い抑制効果が示された（すなわちHEK293:CD4の比が1:2の場合と1:4の場合とを比較した）。
図１５は、C1ORF32（配列番号１）の異所性発現がTCR刺激後のマウスCD4 T細胞の細胞分裂を抑制することを示す。図１５Ａは、プレート結合抗CD3（0.5μg/mL）で刺激したCFSE標識マウスCD4+CD25-T細胞（1×105個）の分析を、C1ORF32発現HEK293トランスフェクタントまたは空ベクターHEK293トランスフェクタントの存在下においてHEK293:CD4の比を1:4または1:2として行った結果を示す。4日目に細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。図中のパーセンテージは細胞分裂した回数が２回を超えた細胞の画分を示す。図１５Ｂは、細胞分裂した回数が２回を超えた細胞のパーセンテージ（平均±SD）を示すヒストグラムである（*P値<0.05、P値<0.001、studentのT検定）。
実施例１１：ヒトT細胞応答におけるC1ORF32の機能的役割
この実験は、C1ORF32を発現するT細胞刺激細胞を使用して、ヒトT細胞が活性化される際のC1ORF32の機能的役割を評価することを目的とした。
C1ORF32をコードする発現コンストラクトの作製および特性評価
C1ORF32タンパク質（配列番号17または配列番号１）のcDNA（マウス細胞で発現させるためにコドン最適化したcDNA、配列番号31または配列番号32）をそれぞれ遺伝子合成し、方向性をもたせてレトロウイルスベクターのSfi-I部位にクローニングした。
配列番号17または配列番号1の完全長C1ORF32タンパク質をコードするバイシストロン性発現コンストラクトおよびモノシストロン性発現コンストラクトを、pMIGIIベクターおよびpCJK2ベクターをそれぞれ用いて構築した。これらの発現コンストラクトをアガロースゲル電気泳動によって確認し、膜結合型抗CD3抗体を高レベルに提示するBw5147細胞（Bw-3/2）において発現させた（「mb-anti-CD3high stimulator cells」（Leitner, J., W. Et al.,. 2010. J. Immunol. Methods. 362:131-141.））。また、モノシストロン性発現のコントロールとして、pCJK2「空」ベクターを形質導入したBw5147細胞を使用し、バイシストロン性発現のコントロールとして、pMIGII「空」ベクターを形質導入したBw5147細胞を使用した。さらに、活性化共刺激分子（ICOSLまたはCD70）を発現するBw-3/2細胞、ならびに負の共刺激分子/共抑制分子として、モノシストロン性pBMN-B7-H3ベクターまたはバイシストロン性pMIGII-B7-H3ベクターの誘導によりB7-H3を発現するBw-3/2細胞（=「B7-H3」）、およびB7-H1（PD-L1）を発現するBw-3/2細胞を作製した。ICOSL、CD70またはB7-H3を発現する刺激細胞を用いた実験は過去に報告がなされている（Pfistershammer, K., C. Et al., 2006. Eur. J. Immunol. 36:1104-1113; Kober, J., et al., 2008. Eur. J. Immunol. 38:2678-2688; Leitner, J., W. Et al. 2010. J. Immunol. Methods. 362:131-141.）。バイシストロン性コンストラクトの存在およびその発現量は、GFPを用いたFACS分析によって確認した。刺激性の膜結合型抗CD3抗体が高レベルで均一に発現していることは、上記刺激細胞上に発現されたこのマウス一本鎖抗体と反応するDyLight-649抗マウスIgG（H+L）抗体を使用したFACSによって確認した。他の分子（たとえばB7-H3）を使用した過去の実験から、表面発現レベルはモノシストロン性レトロウイルスによる発現の方がはるかに高いことが予想される。それぞれの刺激細胞において発現されたモノシストロン性コンストラクトが高レベルに転写されていることは、primer3プログラムで作製した配列番号35と配列番号36とのプライマー対および配列番号35と配列番号37とのプライマー対を使用したqRT-PCRによって確認した。配列番号17および配列番号１（同一の細胞外ドメインを有する）の発現は特異的ポリクローナル抗体を使用して評価した。このポリクローナル抗体を使用したFACS分析の結果、配列番号17を導入した細胞では細胞膜上に非常に弱い発現が確認されたが、配列番号１を導入した細胞では細胞膜上に強い発現が確認された（図１６）。
T細胞
このプロジェクトで行った実験において、ボランティアドナーから得たヒト血液はウィーン医科大学の倫理委員会の承認を受けて使用した（EK Nr.:865/2011）。健常ボランティアドナー由来のバフィーコートまたはヘパリン処理血液からT細胞を精製し、Ficoll-Paque（GEヘルスケア社）を使用して標準的な密度遠心分離を行うことによって単核画分を得た。CD11b発現細胞、CD14発現細胞、CD16発現細胞、CD19発現細胞、CD33発現細胞およびMHCクラスII発現細胞を、これらの各抗原に対応するビオチン化モノクローナル抗体と常磁性ストレプトアビジンビーズとを併用したMACSを用いて除去することによってバルクヒトT細胞を得た（Leitner, J., et al., 2009. Eur. J. Immunol. 39:1754-1764.）。精製したCD8 T細胞およびCD4 T細胞は、上記のプールにビオチン化CD4モノクローナル抗体およびビオチン化CD8モノクローナル抗体を添加することによって得た。ナイーブCD4 T細胞は、Miltenyi Biotec社のナイーブCD4+T cellアイソレーションキットIIを使用して単離した。細胞の単離後、細胞の純度をFACSによって分析し、十分な純度（>90%）を有するサンプルを実験に使用した。
C1ORF32分子を発現する刺激細胞およびコントロール刺激細胞を使用したT細胞刺激実験
C1ORF32分子を発現する上記刺激細胞およびコントロール刺激細胞を使用した一連のT細胞活性化実験は、文献に記載されているような標準的な条件下で行った（Leitner, J., et al., 2010. J. Immunol. Methods. 362:131-141.）。10%FBS（シグマ社）、抗生物質（PenStrep）および抗真菌薬（アンホテリシン）を添加したRPMI 1640培地（インビトロジェン社）をBw細胞の培養および機能実験に使用した。簡単に述べると、上記の刺激細胞を回収し、細胞数をカウントし、放射線を照射し（3000rad×2回）、96ウェル平底プレートに播種した（20,000個/ウェル）。液体窒素で保存していたMACS精製T細胞を解凍し、細胞数をカウントし、ウェルに加え（100,000個/ウェル）、全量を200μL/ウェルとした。各条件につき３連（３つのウェル）で実験を行った。48時間共培養した後、３連のウェルから上清（SN）を回収して（50μL/ウェル）プールし、サイトカイン分析を行うため凍結保存した。IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-13に対する抗体ペアと、精製された組換えサイトカインとを使用したLuminexベースのmultiplexサイトカイン分析を行って標準曲線を作製した。いくつかの実験ではIL-17またはIL-4も測定したが、これらのサイトカインの濃度は概して非常に低かったため、大部分のサンプルにおいてこれらの測定値は除外した。測定は３連で行い、結果は平均値±SEMで示した。文献の記載に準じて48時間後に上清50μLを除去し、文献の記載に準じてメチル-3H-チミジンをウェルに加えた（培養培地で1:80に希釈にしたものを50μL/ウェルで添加；最終濃度：0.025 mCi；パーキンエルマー/New England Nuclear Corporation社、マサチューセッツ州ウェルスレイ）。さらに18時間培養した後、プレートの内容物をフィルタープレートで回収し、3H-チミジンの取り込みをβカウンターで測定した。さらに、MACSで精製したT細胞サブセット（CD4 T細胞、CD45RA陽性CD4 T細胞、CD8 T細胞）を使用して一連の類似した実験を行った。
すべての実験において上記の刺激細胞のみを添加したウェルをさらなるコントロールとして使用した（データ示さず）。これは、細胞を顕微鏡で評価するため、およびT細胞非存在下における上記の刺激細胞の3H-チミジンの取り込み量を測定するために行った。放射線照射後すぐに刺激細胞が崩壊した実験からのデータは分析から除外した。この現象は放射線照射後に時折見られたが、その原因はよく分かっていない。さらに、刺激していないT細胞およびPMA/イオノマイシンで刺激したT細胞についても、3H-チミジンの取り込みを分析した。
さらに、標準的なCFSE希釈実験も以下のようにして行った。T細胞をCFSE標識し、100,000個のT細胞と、放射線照射を照射した刺激細胞（20,000個/ウェル）とを共培養した。7日間共培養した後、細胞を抗CD8-APCで染色してFACS分析を行い、CD8 T細胞およびCD4（CD8陰性）T細胞を電子的にゲーティングすることによりCFSE希釈実験を評価した。
さらに、C1ORF32タンパク質が活性化マーカー（CD25およびCD69）を調節するかどうかを評価するために、刺激細胞を用いた実験を行った。しかしながら、これらの実験では、CD25分子およびCD69分子の非常に弱い誘導が観察され、これはC1ORF32タンパク質によって調節されていなかった（データ示さず）。
C1ORF32タンパク質の結果およびコントロール群の結果の両方が得られた実験のみを分析に含める方法で統計比較を行った。t検定を使用して統計分析を行い（多重比較のための調整は行わなかった）、C1ORF32タンパク質を発現する刺激細胞、CD70を発現する刺激細胞、ICOSLを発現する刺激細胞またはB7-H3を発現する刺激細胞との共培養におけるT細胞の増殖を、コントロール刺激細胞（pCJK2）と比較して評価した。実験はすべて３連で行った。
結果:
バルクT細胞を用いたT細胞刺激細胞実験
コントロール刺激細胞またはC1ORF32（配列番号17または配列番号１）発現刺激細胞で刺激したバルクT細胞の増殖を測定した6つの独立した実験の統計分析においては、配列番号1を発現する刺激細胞との共培養におけるT細胞の増殖はpCJK2コントロール刺激細胞と比較して顕著に少なかった(35%の抑制)。この効果はB7-H1による効果（32%）と同程度であった（図１７）。配列番号17を発現する刺激細胞による誘導においても増殖が抑制されたが、その程度は低く（12%の抑制）、統計的有意差を示さなかった。ただし、配列番号１と配列番号17とは同じ細胞外ドメインを有していることには注意しなければならない。このような知見は、共通の細胞外ドメインを認識する特異的抗体を使用したFACS分析で評価されたように（図１６）、配列番号17の発現が非常に低いことによると考えられる。予想されたとおり、共刺激分子CD70またはICOSLを発現する刺激細胞の誘導によるT細胞増殖は、コントロール刺激細胞による誘導よりも有意に多かった。B7-H3を発現する刺激細胞による誘導では、細胞増殖はコントロール刺激細胞による誘導よりもわずかに少なく、15%抑制されていたが、統計的有意差を示さなかった。
CD4 T細胞を用いたT細胞刺激細胞実験
CD4 T細胞を用いた3つの独立した実験を行った。CD70またはICOSLを発現する刺激細胞により誘導された増殖は、コントロール刺激細胞と比較して有意に多かった。B7-H3を発現する刺激細胞は増殖を有意に抑制した（53%、p<0.05）。これに対して、B7-H1を発現する刺激細胞では若干の減少（約20%）のみが観察され、統計的有意差を示さなかった。配列番号17または配列番号１を発現する刺激細胞により誘導された増殖では何ら変化は見られなかった。結果を図１８に示す。
図１８は、様々なC1ORF32分子、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（CD4+）の増殖の結果を示す。3つの実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05、**p<0.01および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。
CD8 T細胞を用いたT細胞刺激細胞実験
CD8 T細胞を用いた3つの独立した実験を行った。C1ORF32タンパク質を発現する刺激細胞により誘導されたCD8 T細胞の増殖は、コントロール刺激細胞と比較して少なかったが（31〜32%の抑制；図１９）、この効果は統計的有意差を示さなかった。コントロール刺激細胞と比較して、CD70またはICOSLを発現する刺激細胞により誘導された増殖は有意に多かったが、B7-H3またはB7-H1を発現する刺激細胞による増殖は有意に少なかった（53〜56%）。
図１９は、様々なC1ORF32タンパク質、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（CD8+）の増殖の結果を示す。3つの実験の平均値±SEMを示す。**p<0.01、***p<0.001および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。
ナイーブCD4 T細胞を用いたT細胞刺激細胞実験
ナイーブCD4 T細胞を用いた3つの独立した実験を行った。配列番号17または配列番号１を発現する刺激細胞により誘導された増殖は、コントロール刺激細胞により誘導された増殖応答と比較して変化は見られなかった（pCJK2；図２０）。B7-H3またはB7-H1を発現する刺激細胞により誘導された増殖は、コントロール刺激細胞と比較して少なかったが、統計的有意差を示さなかった。CD70またはICOSLを発現する刺激細胞により誘導された増殖は有意に多かった。
図２０は、様々なC1ORF32分子、共刺激分子もしくは共抑制分子の発現ベクターまたは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（ナイーブCD4+CD45RA+）の増殖の結果を示す。**p<0.01および***p<0.001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。
CFSE標識実験
2つのCFSE標識実験を行った。一方ではバルクT細胞を使用し、他方ではナイーブCD4 T細胞を使用した。いずれの実験においても、C1ORF32を発現する刺激細胞、B7-H3を発現する刺激細胞またはB7-H1を発現する刺激細胞によって誘導されたCFSE希釈系はいずれも、コントロール刺激細胞によって誘導されたCFSE希釈系と同程度の結果を示した。顕著な例外としてのCD70発現刺激細胞で刺激したT細胞を除いて、すべての刺激細胞は増殖応答をほとんど誘導しなかった（データ示さず）。
サイトカイン
実験の大半において、バルクT細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞およびナイーブT細胞の共培養の上清中のサイトカイン（IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17およびIFN-γ）の濃度を測定した。図２１Ａ〜Ｇは、バルクT細胞を用いた代表的な実験において、細胞増殖およびサイトカイン分泌に対する配列番号17および配列番号１の効果を評価した結果を示す。概して、共抑制分子を使用した場合、T細胞の増殖が抑制されると、それに伴いサイトカインの産生も抑制されることが認められた。サイトカインのいくつか（IL-2およびIL-13、特にIL-4）の濃度は、特に低いpgレベルを示し、極めて低濃度であると見なされた。
図２１は、様々なC1ORF32タンパク質、またはコントロールとしての共刺激分子、共抑制分子もしくは空ベクターを発現する刺激細胞に応答したT細胞（バルク）の増殖（A）およびサイトカイン分泌（B〜G）の結果を示す。サイトカインのデータは、３連のウェルから得たプール上清を３連で測定した結果を示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001および#p<0.0001（StudentのT検定）は、空ベクターと比較して有意差があったことを示す。
C1ORF32分子を発現する刺激細胞を用いた実験で得られた結果より、ヒトT細胞が活性化する際に、C1ORF32分子を発現する刺激細胞が存在すると、C1ORF32分子を発現する刺激細胞はこれらのT細胞の応答を抑制することができることが示された。配列番号１を発現する刺激細胞で刺激したヒトT細胞の増殖は、コントロール刺激細胞で刺激した場合と比較して少なかったという結果が示された（表３に要約する）。この効果の程度は、ポジティブコントロールであるB7-H3およびB7-H1のいずれかまたはその両方によって示された効果と類似していた。上述したように、配列番号17は弱く発現されたのみであり、このためその抑制活性も低かったと説明することができる。
C1ORF32分子を発現する刺激細胞の誘導による増殖を、バルクT細胞、ならびに精製されたCD8 T細胞、CD4 T細胞およびナイーブCD4 T細胞を使用して試験した。その効果はCD8 T細胞において最も顕著であり、これに対して他の細胞種の大部分ではその効果は低かった（表３）。通常、T細胞の増殖が抑制されると、サイトカインの分泌も抑制される。これらの結果から、ヒトT細胞の活性化に対するC1ORF32タンパク質の抑制効果が示唆される。
表３は、様々なT細胞サブタイプの活性化に対する、刺激細胞上に発現されたC1ORF32タンパク質および共抑制コントロールの抑制効果（増殖によって評価）をまとめたものである。空ベクターを発現する刺激細胞と比較したときの抑制率（%）を示す。*（アスタリスク）は統計的に有意な結果を示す。
膜結合型C1ORF32がT細胞の活性化に対する負のシグナルを生成することが示された上記の実施例に加えて、本願と同じ出願人によって出願されたWO/2012/001647の実施例５および８（この文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される）においても、C1ORF32 ECDとマウスIgG2A Fcドメインとを融合した融合タンパク質が、T細胞の活性化に対して抑制効果を有することが様々な実験系で示されている。すべての実験系において、C1ORF32 ECD-Fcが存在すると、アイソタイプを一致させたネガティブコントロール抗体と比較してT細胞の活性化が減少した。T細胞の活性化の減少は、T細胞の増殖の減少およびサイトカイン分泌の抑制として観察された。したがって、単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、C1ORF32に特異的な中和抗体はこのような受容体の抑制活性を打ち消すと予想され、それによって、腫瘍免疫監視を増強することができると予想される。
実施例１２：細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の機能活性に対するC1ORF32の効果
ヒト細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の機能活性に対する異所性に発現させたC1ORF32（配列番号１）の効果を実験系において試験した。この実験系においては、まず標的細胞としてのヒトがん細胞（過去に報告されているSK-MEL-23、mel624.38およびmel526（Topalian, S. L. , et al. 1989, J. Immunol. 142:3714-3725; Houghton, A. N., et al., 1987. J. Exp. Med. 165:812-829））上にC1ORF32（配列番号１）を過剰発現させ、次いで、腫瘍関連抗原（TAA）に特異的なHLA-A2拘束性T細胞受容体（TCR）を過剰発現するヒトCD8+T細胞（CTL）をプライミングし、上記ヒトがん細胞とともに共培養した。この試験においては、活性化依存性のサイトカイン分泌、活性化マーカーの発現、傷害活性などを測定した。
悪性黒色腫細胞株におけるC1ORF32（配列番号１）の発現:
標的細胞においてC1ORF32（配列番号１）を発現させるために、特異的プライマー（配列番号33および34）を使用してこのタンパク質をコードするcDNAを増幅し、酵素PciIおよびNotIで消化し、MSCVベースのレトロウイルスベクター（pMSGV1）にクローニングした（Cary Hsu., et al., J Immunol. 2005 December 1; 175(11):7226-7234）。クローニングは、まず制限酵素を使用して確認し、次いでシークエンシングによって確認した。配列を確認した後、次の工程で使用するために大量のレトロウイルスベクター（Maxi-prep）を作製した。
レトロネクチンベースのプロトコルを使用して、C1ORF32（配列番号１）をコードするレトロウイルスコンストラクトを3種のヒト悪性黒色腫細胞株（SK-MEL-23、mel624.38およびmel526）に形質導入した。簡単に述べると、レトロウイルスベクターおよびアンフォトロピックエンベロープ遺伝子（VSV-G）を293GP細胞（レトロウイルスパッケージング細胞株）にトランスフェクトして、該細胞からレトロウイルス上清を得た。形質導入の前に、レトロネクチンでコーティングしたプレートにレトロウイルス上清を加え、プレートにビリオンを結合させた。次いで、悪性黒色腫細胞をプレートに加え、6時間インキュベートした。その後、細胞を新たな培養容器に移した。形質導入した腫瘍細胞をC1ORF32特異的抗体（本明細書に記載の5159-1）で染色し、フローサイトメトリーで分析することによって、C1ORF32タンパク質の形質導入効率および発現量を測定した。
エフェクター細胞への形質導入:
ヒトCTLを用いて機能アッセイを行うために、HLA-A2+/MART1+悪性黒色腫細胞を認識するMART-1特異的HLA-A2+拘束性TCR（F4 TCR）を発現するように遺伝子操作した初代ヒトリンパ球を使用した。このTCRは、近年、悪性黒色腫の末期患者に対する臨床試験において、このTCRをコードするレトロウイルスを介して末梢血自己リンパ球に腫瘍認識能を特異的に付与する目的で使用されている（Morgan et al, 2006 Science, 314:126-129）。新たに単離したPBL（末梢血白血球）をPHAで5〜10日間刺激し、MART-126-35特異的TCR（F4と呼ばれる）のα鎖およびβ鎖をインビトロで転写したmRNAをエレクトロポレーションによってこのPBLにトランスフェクトした。簡単に述べると、エレクトロポレーションはElectroSquare Poratorを使用して400V/500msで行った。それぞれの鎖をインビトロで転写したmRNAの量は1×106個の細胞あたり1μgであった。次いでトランスフェクトしたリンパ球を新たな培養容器に移し、300IUのIL-2を含むリンパ球培養用培地中で培養し、２〜３日ごとに培地を補充した。
形質導入した候補細胞の媒介によるサイトカイン分泌:
C1ORF32（配列番号１）を発現する悪性黒色腫細胞と、F4-TCRを形質導入したT細胞との共培養を行った。サイトカイン（IFN-γおよびIL-2）の分泌をELISAによって測定し、形質導入した様々な腫瘍細胞株に対する該エフェクターCD8 T細胞による特異的認識および該エフェクターCD8 T細胞の応答を評価した。これらのアッセイにおいては、1×105個のエフェクター細胞と1×105個の悪性黒色腫標的細胞とを16時間共培養した。サイトカインの分泌は、直線領域内で測定できるように培養上清を希釈してELISAアッセイで測定した。
ヒト悪性黒色腫細胞株（SK-MEL-23、mel624.38およびmel526）は、C1ORF32タンパク質の発現を観察するために、まずC1ORF32特異的モノクローナル抗体5159-1を使用して染色した。これらの細胞株の親細胞（非形質導入細胞）をフローサイトメトリーによって分析したところ、細胞表面上にC1ORF32は検出されなかった（データ示さず）。次いで、これらの親細胞株に、本明細書に記載の配列番号１のC1ORF32タンパク質をコードするレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入の48時間後、C1ORF32の発現レベルをフローサイトメトリーによって評価し、親細胞株と比較した。試験した様々な細胞株のC1ORF32タンパク質の発現レベルは、バックグラウンドより30〜60%高かった（図２２）。
上記と同様にして、PBLをPHAで5〜10日間刺激し、次いでエレクトロポレーションによってMART-1特異的TCR F4をPBLに形質導入した。このエフェクターCD8+PBLを、IL-2を含むリンパ球培養用培地中で培養した。図２３は、2人の異なるドナーより得られたPBLのTCR発現レベルを示す。
上記エフェクターCD8+PBLを、悪性黒色腫親株（mel526、mel624.38またはSK-MEL 23）およびそれぞれのC1ORF32トランスフェクタントに別々に加えた。共培養を開始してから16時間後に、IFN-γおよびIL-2の分泌レベルを評価した。4人の異なるT細胞ドナーを使用した4つの独立した実験において、C1ORF32を発現するSK-MEL-23細胞株とCTLとを共培養すると、CTLは親細胞株と比較してIFN-γ分泌の有意な減少（約40%）を示した（p=0.01）。C1ORF32を発現する他の細胞株では、IFN-γの分泌に統計的有意差は見られなかった（図２４）。
しかしながら、２セット目の実験（計３つの実験）では、C1ORF32を発現するSK-MEL23細胞との共培養において観察されたIFN-γ分泌の減少はそれほど顕著ではなかった（約10%）（データ示さず）。さらに、形質導入した悪性黒色腫株におけるC1ORF32の発現レベルは、時間の経過とともに（6週間）わずかに減少したようであった。IL-2分泌に関しては、共培養実験のいくつかにおいてIL-2分泌のわずかな増加が見られるなどの一貫しない結果が得られ（データ示さず）、これらは統計的有意差を示さなかった。
この研究においては、CTLのエフェクター機能に対する異所性に発現されたC1ORF32の効果を分析している。これらの実験の結果から、悪性黒色腫細胞上にC1ORF32を発現させると、CTLによるIFN-γの分泌が減少することが示された。また、これらの結果から、活性に一定の傾向が示された。上記の実験系においては、さらに、いくつかの特性を以下ように最適化している。
１）悪性黒色腫細胞株上の異所性C1ORF32の発現レベルおよび発現均一性
２）初代活性化CD8細胞上のF4 T細胞受容体の発現レベル
３）CTLの傷害活性に対する直接的な効果を試験するための研究の拡張
単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、様々な悪性黒色腫細胞株上に発現されたC1ORF32のCTLに対する効果の差異は、これらの様々な悪性黒色腫株上に内因性に発現される共刺激／共抑制性タンパク質レパートリーが異なることによるものと考えられる。
実施例１３：インビトロでのC1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）による誘導性制御性T細胞（iTreg）分化のアップレギュレーション
Tregは、腫瘍免疫の回避に寄与する免疫抑制ネットワークにおいて極めて重要な役割を果たしている。Tregへの分化に対する抗C1ORF32抗体の遮断能を評価するために、まず、C1ORF32融合タンパク質とナイーブT細胞との相互作用がナイーブT細胞からiTregへの分化に影響を及ぼすかどうかを試験した。この目的のために、C1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）を使用し、制御性T細胞への分化に対する該融合タンパク質の効果を評価した。具体的には、iTreg誘導条件下でインキュベートしたときの、精製したCD4+CD25+T細胞による制御性T細胞マーカーFoxP3の発現を評価することによって行った。
Automaxを用いてソーティングすることによりDO11.10マウスからナイーブCD4+T細胞を単離した（CD4陰性細胞のソーティングとCD25陽性細胞の単離を行った後、CD62L陽性細胞のソーティングを行った）。
ナイーブCD4+T細胞の活性化は、コントロールIg（10μg/mL）またはC1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）（1μg/mLまたは3μg/mL）と、IL-2（100U/mL）と、TGF-β（10ng/mL）との存在下で、放射線を照射したBalb/c脾細胞（1:1比；１ウェルあたり5×105個のT細胞を使用）およびOVA323-339（20μg/mL）とともに培養することにより行った。培養4日目に、細胞を回収し、生存率、CD4の発現、CD25の発現およびFoxP3の発現を調べるために染色した。
図２５に示すように、C1ORF32 ECD-マウスIgG2a融合タンパク質（配列番号18）の存在下でナイーブCD4+CD25+T細胞をインキュベートすると、用量依存的にCD4+CD25+FoxP3+T細胞のパーセンテージが大幅に増加した。この結果から、C1ORF32タンパク質とこれに対応するT細胞上受容体との相互作用によって、T細胞からiTregへの分化が誘導されることが示された。したがって、単一の理論に拘束されることを望むものではないが、この相互作用を遮断するC1ORF32特異的抗体の使用は、iTregへの分化をダウンレギュレートするのに有用であり、これによって、がんに対抗する免疫系活性を上昇させることができると考えられる。
上述のように、このエクスビボ実験の結果から、C1ORF32-Ig融合タンパク質はCD4 T細胞からiTregへの分化を増強することが実証された。この結果から、C1ORF32経路がiTregの誘導および分化に関連していることが示唆されるとともに、遮断モノクローナル抗体を使用してC1ORF32をターゲティングすることによって、iTregの蓄積およびその免疫抑制能を阻害できることが示唆された。さらに、そのような遮断抗体を使用してC1ORF32の免疫チェックポイント活性を抑制することにより、エフェクターT細胞活性を増強することができると考えられる。したがって、C1ORF32遮断抗体がエフェクターT細胞活性を増強する作用とiTregの免疫抑制活性を阻害する作用とを有することから、C1ORF32遮断抗体を単独または増強手段と組み合わせて使用することによって、がん療法において増強された有益な効果を得ることができる。
iTregへの分化の促進におけるC1ORF32の役割が示された上記の結果に加えて、WO/2012/001647の実施例５、６および１１（この文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される）では、特定のThを誘導する条件下において、活性化したマウスおよびヒトCD4+T細胞を使用することにより、Thへの分化に対するC1ORF32の効果が示されている。マウスT細胞の活性化は抗原特異的またはポリクローナルである。マウス細胞またはヒト細胞を使用したこのような実験系による結果の大部分では、T細胞に対するC1ORF32の免疫調節作用が示されており、この免疫調節作用によって、抗炎症性サイトカイン（Th2由来サイトカインおよびIL-10）の分泌が促進される一方、Th1およびTh17誘導性応答（Th1およびTh17誘導条件下の炎症性サイトカインの分泌および細胞増殖）が抑制される。
腫瘍によって免疫監視の回避に利用されるメカニズムのうちの1つがTh2/M2にシフトした免疫応答の促進であることが知られている（Biswas SK, et al., 2010 Oct;11（10）:889-96）。したがって、単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、上述したC1ORF32の免疫調節作用を抑制する中和抗体（すなわちTh2応答の促進およびTh1応答の抑制）は、がんの治療に有益であると考えられる。
実施例１４：NK細胞へのC1ORF32の結合およびNK傷害活性に及ぼす異所性C1ORF32発現の影響
この分析は、NK細胞に対するC1ORF32（mIgG2aのFcに結合させたC1ORF32細胞外ドメインを含むFc融合タンパク質（配列番号24））の結合能を評価すること、およびHEK293T細胞上に異所性に発現させたC1ORF32がNK細胞の細胞傷害性に対するHEK293T細胞の感受性に影響を及ぼすかどうかを評価することを目的とした。使用したC1ORF32（配列番号１）過剰発現HEK293T細胞は、本明細書中に記載されている。
末梢血単核球からのNK細胞の単離:
ヒトNK細胞は、ヒトNK細胞単離キットおよびautoMACS機器（Miltenyi Biotec社、カリフォルニア州オーバーン）を使用して、PBL（末梢血細胞）から単離した。
初代NK細胞株の作製:
ヒト初代NK細胞株は以下のようにして得た。精製したヒト初代NK細胞を、10%FCS、10%白血球馴化培地および1μg/mL PHAを添加した完全培地を含む96ウェルU字底型プレートに1個/ウェルで播種した。放射線を照射したフィーダー細胞を加えた（2人のドナーから得た同種PBMC2.5×104個とRPMI 8866 B細胞株5×103個とを各ウェルに加えた）。播種したウェルの3分の1未満に細胞増殖が見られたときの増殖を細胞密度で評価することによって増殖クローンを選択し、完全培地を含む96ウェルプレートで増殖させた。このようにして得た活性化したヒト初代NK細胞株を、1mMグルタミン、1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2×10-5M β-MEおよび50U/mL rhu lL-2を添加した10%ヒト血清加RPMI中で培養した。この実験における結合アッセイおよび傷害アッセイは、NK細胞のポリクローナル集団（すなわち各ドナーから得た生存能力を有するすべてのNKクローンを１つに合わせたもの）を使用して行った。
細胞傷害アッセイ:
異所性C1ORF32を発現するHEK-293に対するNK細胞の細胞傷害活性はS35放出アッセイを使用して以下のように評価した。U字底型マイクロタイタープレートにおいて、エフェクター細胞（E）と5×103個の［S35］メチオニン標識標的細胞（T）とを様々なE/T比で混合した。37℃で一晩インキュベートした後、4℃、1,000rpmで10分間遠心分離することによってアッセイを完了させ、上清100μLを回収して、液体シンチレーションカウンターで測定した。特異的溶解率（％）は以下の式により算出した。

溶解率（%）=［（実験ウェルのcpm-自然放出によるcpm）/（最大放出のcpm-自然放出によるcpm）］）×100

自然放出は、S35標識標的細胞を培地のみでインキュベートすることによって測定した。最大放出は、0.1M NaOH中で標的細胞を溶解することによって測定した。すべて実験において、自然放出は最大放出の25%未満であった。
結合アッセイ:
NK細胞を、5μgのC1ORF32（配列番号24）またはアイソタイプコントロール（mIgG2a）とともに氷上で2時間インキュベートした。細胞を洗浄後、抗マウス二次抗体を加え、結合をフローサイトメトリーによって評価した。
NK細胞に対するC1ORF32の結合
この実験では、NK細胞（すなわち活性化した初代NK細胞株）に対するC1ORF32（配列番号24）の結合性、および数人の異なるドナーから新たに単離したNK細胞に対するC1ORF32（配列番号24）の結合性を評価した。
図２６に結果を示す。活性化した初代NK細胞または新たに単離したNK細胞に対するC1ORF32（配列番号24）の結合性が示されている。3人の異なるドナーから得たヒト初代NK細胞株（図２６Ａ）または3人の別のドナーから新たに単離したNK細胞（図２６Ｂ）を、5μgの非標識C1ORF32（配列番号24）またはコントロールアイソタイプmIgG2aとともにインキュベートした。灰色のヒストグラムはmIgG2aを示し、赤色のヒストグラムおよび黒色のヒストグラムはC1ORF32を示す。
図２６に示したように、C1ORF32（配列番号24）の大部分はNK細胞に結合しなかったが、いくつかの実験では非常に弱い結合が見られた（ドナーNo.3、5および6）。
HEK293T細胞上に過剰発現させたC1ORF32によるNK細胞の細胞傷害性の低下
HEK293T細胞上に異所性に発現させたC1ORF32（配列番号１）がNK細胞の細胞傷害性に対するHEK293T細胞の感受性に及ぼす影響を評価した。図２７は、HEK293T細胞上に発現させたC1ORF32（配列番号１）によって、NK細胞の細胞傷害性に対するHEK293T細胞の感受性がわずかに減少したことを示す。ヒト初代NK細胞を、C1ORF32を過剰発現したHEK293T細胞（293T-001）またはトランスフェクトしていないHEK293T細胞（293T-CTrl）とともにインキュベートし、本明細書の材料および方法に記載したように細胞傷害（％）を評価した。エフェクター細胞と標的細胞の比（E:T）（X軸）は、1:40〜1:5の範囲であった（エフェクター細胞を２倍段階希釈）。*（アスタリスク）はp値<0.05を示す。
図２７に結果を示す。C1ORF32（配列番号１）の発現によってNK細胞の傷害活性がわずかに減少し、最も高いE:T比においてのみ統計的有意差（p<0.05）が示された。
単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、C1ORF32（配列番号１）の過剰発現がNK細胞の細胞傷害性に対するHEK293T細胞の感受性に影響を及ぼすことが示された上記のデータから、NK細胞がC1ORF32の作用機序に関与している可能性が示唆された。結合アッセイにおいては、C1ORF32に対するカウンター受容体の低レベルの発現がNK細胞上に検出された。単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、NK細胞上のカウンター受容体に対するC1ORF32の結合親和性はNKクローンごとに異なる可能性があり、このことから、このアッセイにおいて結合を明確に検出することができなかったと考えられる。
NK細胞は、腫瘍やそれらの転移などの異常細胞を検出するために様々な受容体を利用している。NK細胞の活性は、活性化受容体と抑制性受容体との間のバランスによって決定される。上記の結果では、C1ORF32は、NK細胞上の対応する受容体に結合することによってNK細胞の細胞溶解活性を抑制する抑制性リガンドであることが示された。この結果は、この負の調節を抑制するC1ORF32特異的中和抗体を使用することによって、免疫系による腫瘍の排除を増強することを支持するものである。
実施例１５：活性化T細胞におけるC1ORF32推定受容体の発現
プレートに結合させた抗CD3および可溶性抗CD28を使用して、休止期マウスCD4 T細胞または活性化されたマウスCD4 T細胞に対するC1ORF32の結合性を試験することによって、C1ORF32に対応する推定受容体の発現を調べた。Fcγ受容体への結合を防ぐために、脱グリコシル化したC1ORF32（N278A変異を含むFc、配列番号38）を使用した。さらに、Fcγ受容体をブロッキングするために抗CD16/CD32抗体を使用した。
図１４に示す実験結果では、活性化されていないT細胞とC1ORF32との結合は検出できなかったが、活性化されたCD4+T細胞とC1ORF32との結合においては、わずかであるが明らかな結合の増加が示された。これらの結果から、活性化T細胞はC1ORF32に対する推定受容体を発現していることが示唆される。図１０〜１３および図１５〜２１に示したように、膜結合型C1ORF32はT細胞の活性化に対する負のシグナルを生成する。したがって、単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、C1ORF32に特異的な中和抗体は上記のような受容体による抑制活性を打ち消し、それによって、腫瘍免疫監視を増強することができると考えられる。
図１４は、休止期マウスT細胞および活性化されたマウスT細胞に対するC1ORF32の結合プロファイルを示す。未感作マウスCD4+CD25-CD4 T細胞を培地中で静置し（「活性化していない」）、これとは別に未感作マウスCD4+CD25-CD4 T細胞を可溶性抗CD28（2μg/mL）の存在下で固相化抗CD3（2μg/mL）により刺激した。48時間後、抗CD3/28で刺激したCD4細胞を、Fcγ受容体をブロッキングするためのマウス抗CD16/32の存在下で、ビオチン化C1ORF32 H:M（N278A；脱グリコシル化）（配列番号38）またはアイソタイプコントロール（ビオチン化マウスIgG2a；Biolegend社）で染色し、次いでストレプトアビジン-PEで染色した。
実施例１６：異所性C1ORF32発現細胞株に対する、補体依存性細胞障害（CDC）を介した抗C1ORF32抗体（5166-9）のエフェクター機能活性
この実験は、C1ORF32発現細胞株上に補体を結合させる能力についてC1ORF32モノクローナル抗体を評価するための機能アッセイを確立すること、およびこのアッセイを使用してCDCエフェクター機能を有する治療用抗体候補をスクリーニングすることを目的とした。
C1ORF32発現細胞株:
ヒトC1ORF32または空ベクターを発現するHEK293T細胞およびCHOK1細胞を上記と同様にして作製した。トランスフェクトしたHEK293T細胞を、5μg/mLピューロマイシンによる選択下において、10%FBSおよびグルタミン-Penstrepを添加したDMEM中で培養した。同様に、トランスフェクトしたCHOK1細胞を、12μg/mLピューロマイシンによる選択下において、10%FBSおよびグルタミン-Penstrepを添加したF12中で培養した。完全培地（CM）とは、それぞれの細胞株に適した培養培地を指す。
抗体:
C1ORF32に対する精製マウスモノクローナル抗体5166-9（IgM）、5159-3（IgG2a）および5159-1（IgG1）は、本明細書の記載に従ってSilverlake社（米国）において作製した。精製マウスIgMアイソタイプコントロール（クローンMM-30）（カタログNo.:401602）および精製マウスIgG2aアイソタイプコントロール（クローンMOPC-173）（カタログNo.:400224）は、Biolegend社（米国）から購入した。
試薬:
精製ウサギ補体（カタログNo.:CL-3441）は、Cedarlane laboratories社（カナダ国）から購入した。CellTiter-Glo試薬はプロメガ社（米国）（カタログNo.:G7570）から購入した。
細胞傷害アッセイ:
C1ORF32を異所性に発現するHEK293およびCHOK1に対するC1ORF32抗体のCDC活性は、細胞力価測定試薬CellTiter-Gloを使用して評価した。細胞を、１ウェルあたり50μLの完全培地（CM）を含む96ウェル組織培養プレートに5×103個/ウェルの細胞密度で播種した。一晩培養した後、抗体、アイソタイプまたは培地単独を2倍段階希釈し、それぞれのウェルに等容量で加えた。新たに再構成した補体を加え、プレートを37℃でインキュベートした。1時間後、プレートを室温に戻し、細胞力価試薬CellTiter-Gloを１ウェルあたり100μL加え、室温で5〜10分間インキュベートした。反応液170μLを白色のプレートに移し、Victor2プレートリーダー（パーキンエルマー社）でルミネセンスを測定した。データをエクスポートしてExcelで分析し、GraphPad Prismでプロットした。
CDC活性（%）は以下の式により算出した。
100 - ［（実験ウェルのRLU/補体のみによるRLU）×100］
実験は各条件につき３連で行った。データは２つの実験の代表的な値である。
FACS染色:
HEK293T親細胞、CHOK1親細胞、およびCGEN15001Tを発現する細胞を洗浄し、FACSバッファー（PBS（ライフテクノロジーズ社）、1%BSA（シグマ アルドリッチ社）および0.01%アジ化ナトリウム（シグマ アルドリッチ社））中の様々な濃度の5159-1を25μL使用して4℃で60分間染色した。細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG（Jackson Immunoresearch社、カタログNo.:115-606-146）のAlexa Fluor 647標識F(ab')2フラグメント25μL中に再懸濁し、4℃で30分間反応させた。細胞をFACSバッファーで再度洗浄し、FACSバッファー35μLおよび4%パラホルムアルデヒド35μL中に再懸濁し、FACS CaliburおよびIntellicyt HTFCのいずれかで分析した。データは、FlowJo、ExcelおよびGraphPad Prismで分析した。
5166-9などの抗C1ORF32抗体は、たとえば異所性C1ORF32発現HEK293などのC1ORF32発現細胞に対する強力なCDC活性を有している。
これらの実験では、C1ORF32を発現するHEK293T細胞およびCHOK1細胞に対する5166-9抗体（マウスIgMモノクローナル）の活性を評価した。図２８に示すように、5166-9は、C1ORF32発現HEK293T細胞に対してEC50が1.8ng/mLまたは0.01nMの強力なCDC活性を示した。空ベクターコントール細胞株では、有意に低い活性が観察された（右のグラフ）。空ベクター細胞株に対する活性が低レベルであったことは、恐らくC1ORF32抗原の内因性発現が低かったことによると考えられる（データ示さず）。HEK293T細胞の場合と同様に、5166-9抗体は、CHOK1細胞に対してEC50が33ng/mLまたは0.2nMの用量依存的なCDC活性を示した（図２９）。最大傷害作用は、C1ORF32発現HEK293Tと比較して低かった。このような作用強度の差異は、C1ORF32発現CHOK1トランスフェクタントにおける発現が不完全なものであったこと（FACS分析において細胞の40%は発現を示さなかった（データ示さず））、およびFACS（図３０）に示すようにC1ORF32の発現がより低レベルであったことによるものと考えられる。これらのアッセイにおいて、5159-3（IgG2aマウスモノクローナル）の活性は極めて低かった（データ示さず）。
図２８は、抗C1ORF32抗体5166-9が、C1ORF32発現HEK293に対して強力なCDC活性を示すことを示す。HEK293細胞株を、補体の存在下において5166-9またはアイソタイプコントロールmIgMとともに1時間インキュベートした後、生存率を測定した。図２９は、抗C1ORF32抗体5166-9が、C1ORF32発現CHOK1細胞に対してCDC活性を示すことを示す。CHOK1細胞株を、補体の存在下において5166-9またはアイソタイプコントロールmIgMとともに1時間インキュベートした後、生存率を測定した。図３０は、C1ORF32の発現をHEK293T細胞とCHOK1細胞とで比較した結果を示す。C1ORF32抗体5159-1を使用してC1ORF32を検出した結果、C1ORF32発現HEK293細胞は、C1ORF32発現CHOK1細胞と比較してより多くの標的抗原を発現することが分かった。
これらのデータによって、C1ORF32を発現するHEK293T細胞およびCHOK1細胞に対する抗C1ORF32抗体5166-9のCDC活性が示された。これらのアッセイは、C1ORF32機能的抗体の特性を評価するために使用できると考えられる。上記の結果から、ヒトIgG1サブクラス（補体結合活性を有することが知られている）のC1ORF32治療用抗体が、様々な作用機序を介して作用している可能性が示唆され、その１つがC1ORF32発現がん細胞に対するCDC媒介性エフェクター機能であることが示された。
実施例１７：がん免疫監視の調節因子としてのC1ORF32タンパク質の役割:
１）インビボ概念実証
ａ）マウスがん同系モデル:
（ｉ）C1ORF32タンパク質または無関係なコントロールタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞を、遺伝的に適合するマウスに移植する。次いで、腫瘍の体積（およびマウス屠殺後の腫瘍の重量）を測定して腫瘍増殖の遅延を評価する（すなわち、C1ORF32を過剰発現する腫瘍は、無関係なコントロールタンパク質を過剰発現する腫瘍よりも早く成長する）。腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞をエクスビボ分析することによって、制御性T細胞とエフェクターT細胞の比を評価する。
（ii）単独療法としてC1ORF32タンパク質に対する中和抗体を使用した同系腫瘍の治療
腫瘍細胞を遺伝的に同一のマウスに移植する。この担癌マウスに、C1ORF32タンパク質に対する中和抗体を様々な用量で注射する。C1ORF32タンパク質に特異的な中和抗体を使用した治療の結果、腫瘍の拒絶が増強する（すなわち、C1ORF32タンパク質に対する中和抗体で治療したマウスの腫瘍は、無関係な抗体で治療したマウスの腫瘍よりも成長が遅くなる）。腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞をエクスビボ分析することによって、制御性T細胞とエフェクターT細胞の比を決定する。
試験する腫瘍細胞株は様々な腫瘍由来であり、これには結腸癌、乳癌、卵巣癌、悪性黒色腫、肉腫および血液のがんが含まれる。同系モデルを使用した試験はいくつかのマウス株で行われ、このようなマウス株としてはBALB/c、C57bl/6およびC3H/Hejが挙げられる。１セット目の実験において使用される移植可能な同系モデルは、主として、がん免疫療法の結果を予測できることが実証されているものである。このような同系モデルとして、それぞれBALB/cを遺伝子背景とする、B16-F10悪性黒色腫（Tihui Fu et al Cancer Res 2011; 71:5445-5454に記載された方法に準じる）、MC38結腸がん（Ngiow SF et al. Cancer Res. 2011 May 15; 71（10）:3540-51に記載された方法に準じる）、ID8卵巣がん（Krempski et al. J Immunol 2011; 186:6905-6913に記載された方法に準じる）、MCA105肉腫（Wang et al. J. Exp. Med. Vol. 208 No. 3 577-592に記載された方法に準じる）、CT26結腸癌（Ngiow SF et al. Cancer Res. 2011 May 15; 71（10）:3540-51に記載された方法に準じる）、および4T1乳癌（Takeda K et al. J Immunol. 2010 May 15;184(10）:5493-501に記載された方法に準じる）が挙げられる。
（iii）同系腫瘍の確立およびC1ORF32タンパク質に対する中和抗体と別の種類の治療方法との併用による治療
腫瘍細胞を遺伝的に同一のマウスに移植する。腫瘍を樹立した後、C1ORF32タンパク質に対する中和抗体をマウスに様々な用量で腹腔内注射し、その際に慣用の化学療法（たとえばシクロホスファミド、Mkrtichyan et al. Eur. J immunol. 2011; 41, 2977-2986に記載された方法に準じる）と組み合わせたり、他の免疫チェックポイント遮断薬（たとえばPD1およびCTLA4、Curran et al.; Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 2; 107（9）:4275-80に記載された方法に準じる）と組み合わせたり、他の免疫調節薬（たとえば抗IL-18、Terme et al.; cancer res. 2011; 71:5393-5399に記載された方法に準じる）と組み合わせたり、がんワクチン（Hurwitz et al. Cancer Research 60, 2444-2448, May 1, 2000に記載された方法に準じる）と組み合わせたり、あるいは放射線療法（Verbrugge et al. Cancer Res 2012;72:3163-3174に記載された方法に準じる）と組み合わせたりする。
（iv）ヒトがん異種移植片モデル:
内因性にC1ORF32を発現するヒトがん細胞株を免疫欠損マウスに移植する。抗C1ORF32抗体で治療したマウスの腫瘍体積と、アイソタイプが一致する無関係な抗体で治療したマウスの腫瘍体積とを比較評価する。この実験では、抗C1ORF32抗体に毒素を結合させて（Luther N et al. Mol Cancer Ther. 2010 Apr;9(4）:1039-46に記載された方法に準じる）、抗体-薬物複合体（ADC）の活性を評価しつつ、これとは別に、C1ORF32に対するヒトIgG1またはマウスIgG2aアイソタイプ抗体でマウスを治療する（Holbrook E. Kohrt et al. J Clin Invest. 2012 March 1; 122（3）:1066-1075に記載された方法に準じる）。これらの抗体アイソタイプは抗体依存性細胞傷害（ADCC）を介した腫瘍除去を評価するために使用される。
２）発現分析
ａ）ヒト腫瘍生検から単離した腫瘍細胞上および免疫細胞上のC1ORF32タンパク質の発現
（i）C1ORF32タンパク質に対する特異的抗体を使用したC1ORF32タンパク質の発現の確認は、腫瘍から分離した細胞集団を用いて行う。Kryczek I. et al., J. Exp. Med.; 2006; Vol. 203; p.871-881およびCancer res. 2007; 67; 8900-8905の記載に準じて、様々な細胞集団（たとえば、腫瘍細胞、内皮、腫瘍関連マクロファージ（TAM）、ならびにDC、B細胞および様々なT細胞サブセット（CD4、CD8およびTreg））を腫瘍生検から新たに単離し、腫瘍細胞、腫瘍間質および浸潤免疫細胞におけるC1ORF32の発現を評価する。
（ii）結合アッセイは、ヒトC1ORF32 ECD-FCタンパク質を使用して、腫瘍から分離された細胞集団に対して行う。J. Exp. Med.; 2006; Vol. 203; p.871-881およびCancer res. 2007; 67; 8900-8905の記載に準じて、腫瘍生検によって腫瘍からの様々な細胞集団（たとえば、腫瘍細胞、内皮、腫瘍関連マクロファージ（TAM）、ならびにDC、B細胞、および様々なT細胞（CD4、CD8およびTreg））を新たに単離し、腫瘍細胞、腫瘍間質および免疫細胞における、C1ORF32のカウンター受容体の発現を評価する。
ｂ）担癌マウスの所属リンパ節および脾臓から単離された細胞におけるC1ORF32タンパク質の発現
（i）C1ORF32タンパク質に対する特異的抗体を使用したC1ORF32タンパク質の発現の確認は、M Rocha et al., Clinical Cancer Research 1996 Vol. 2, 811-820の記載に準じて、担癌C57マウスの上皮がん細胞および腫瘍の所属リンパから得た免疫細胞における発現を脾臓と比較することによって行う。B16（悪性黒色腫）、ID8（卵巣がん）およびMC38（結腸がん）の３つの異なるタイプのがんを試験に使用して、腫瘍細胞上および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞上におけるC1ORF32の発現を評価する。
（ii）マウスC1ORF32 ECD-FCタンパク質を使用した結合アッセイを上述のように実施して、担癌C57マウスの上皮がんから単離した細胞および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞における発現を脾臓と比較し、腫瘍細胞上および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞上における、C1ORF32のカウンター受容体の発現を評価する。
ｃ）M2型に極性化させたマクロファージにおけるC1ORF32タンパク質の発現
（i）C1ORF32タンパク質に対する特異的抗体を使用したC1ORF32タンパク質発現の確認は、Biswas SK, Nat. Immunol. 2010; Vol. 11; p. 889-896の記載に準じて、末梢血から単離した初代単球をマクロファージへと分化させ、「M2誘導刺激」（たとえば、IL-4、IL-10、グルココルチコイド、TGF-β）に暴露することによってマクロファージをM2型に分化させ、このM2型マクロファージにおけるC1ORF32の発現を評価することによって行う。
（ii）上述のように、末梢血から初代単球を単離し、マクロファージへと分化させ、「M2誘導刺激」（たとえば、IL-4、IL-10、グルココルチコイド、TGF-β）に暴露することによってマクロファージをM2型に分化させ、このM2型マクロファージに対してヒトC1ORF32 ECD-FCタンパク質を使用した結合アッセイを実施することによって、M2型マクロファージにおける、C1ORF32のカウンター受容体の発現を評価する。
実施例１８：C1ORF32タンパク質に対する遮断抗体と公知の免疫チェックポイントの遮断との併用による抗腫瘍効果
免疫細胞上の抑制性受容体は、がんの免疫回避における中心的な調節因子である。このような抑制性受容体として、CTLA4、PD-1、LAG-3などの免疫チェックポイントが知られている。単一の免疫チェックポイントを遮断することによって、しばしば腫瘍へのエフェクターT細胞の浸潤が増強されるが、遮断されていない他の負の受容体においてもエフェクターT細胞がアップレギュレートされるという代償性反応も起こりうる。しかしながら、２つ以上の抑制性経路を遮断すると、T細胞がより効果的な腫瘍応答を発揮し、制御性T細胞（Treg）に対するエフェクターT細胞（Teff）の比が増加する。具体的には、このような抑制性受容体の二重遮断は動物腫瘍モデルにおいて相乗的な治療効果を発揮することが示されている（Curran et al 2010 PNAS 107:4275-4280; Woo et al 2011 Cancer Res. 72:917-927）。これらの知見を元に、抗CTLA-4遮断抗体と抗PD-1遮断抗体との併用が、転移性悪性黒色腫患者において臨床試験中である。
C1ORF32に対する遮断抗体とPD-1に対する遮断抗体との併用は、C57Bl/6を遺伝子背景とする同系がんMC38モデルにおいて試験されている（Woo et al 2011 Cancer Res. 72:917-927に記載されている）。簡単に述べると、MC38細胞（2×106個）をC57Bl/6マウスに皮下移植する。触知可能な腫瘍を形成したマウスに抗C1ORF32モノクローナル抗体および/または抗PD-1モノクローナル抗体（4H2）を10mg/kgの用量で腹腔内注射する。アイソタイプコントロール抗体は、20mg/kgの用量で投与するか、あるいは抗PD-1抗体または抗C1ORF32抗体によるそれぞれの治療に加えて10mg/kgの用量を投与する。腫瘍の体積をデジタルキャリパーで測定し、腫瘍増殖に対する効果を算出する。腫瘍増殖の抑制として示される治療効果は、２つの標的（すなわちPD-1およびC1ORF32）それぞれに対する遮断抗体を併用することによって増強される。エフェクターT細胞（=Teff（CD8+IFN-γ+）細胞）の頻度およびTeffとTregの比を、腫瘍所属リンパ節および非所属リンパ節において測定する。
実施例１９：C1ORF32タンパク質に対する遮断抗体とシクロホスファミド定期療法との併用による抗腫瘍効果
シクロホスファミドは、直接的な細胞傷害作用と活発に細胞分裂している細胞に対する抑制活性とを有することから、特定の充実性腫瘍およびリンパ腫に対する標準的なアルキル化化学療法薬として使用されている。高用量のシクロホスファミドによって免疫細胞が除去されうるのに対し、低用量のシクロホスファミドは、主として免疫抑制性Treg細胞の数およびその機能を低下させることによって、免疫応答を増強し、かつ抗腫瘍免疫媒介性作用を誘導することが報告されている（Brode and Cooke 2008 Crit. Rev. Immunol. 28:109-126）。シクロホスファミド以外の古典的化学療法薬を使用した定期的な治療法も免疫刺激作用を有することが示されており、このような古典的化学療法薬として、ゲムシタビン；オキサリプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金系化合物；ドキソルビシンなどのアントラサイクリン類；パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン類；ビンクリスチンなどの微小管阻害薬などが挙げられる。
シクロホスファミドと他の免疫療法（たとえば、抗4-1BB活性化抗体、抗PD1遮断抗体など）との併用療法は相乗的な抗がん作用を示した（Kim et al. 2009 Mol Cancer Ther 8:469-478; Mkrtichyan et al. 2011 Eur. J. Immunol. 41:2977-2986）。
抗C1ORF32遮断モノクローナル抗体は、C57BL/6を遺伝子背景とする同系B16悪性黒色腫モデルにおいてシクロホスファミドと併用することにより試験される（Kim et al. 2009 Mol Cancer Ther 8:469-478の記載に準じる）。簡単に述べると、C57BL/6マウスに4×105個のB16-F10悪性黒色腫細胞を皮下注射する。腫瘍を移植した当日にシクロホスファミド（150mg/kg）を腹腔内注射により単回投与し、C1ORF32に対する中和抗体100μgの注射を腫瘍を移植した当日から開始し5日間の間隔を置いて計5回行う。樹立した腫瘍に対する併用療法の抗腫瘍効果を評価するためには、併用療法は、腫瘍細胞の注射後5日目または10日目に開始する。腫瘍の体積をデジタルキャリパーで測定し、腫瘍増殖に対する効果を算出する。腫瘍増殖の抑制として示される治療効果は、C1ORF32に対する遮断抗体とシクロホスファミドとの併用によって増強される。エフェクターT細胞（=Teff（CD8+IFN-γ+）細胞）の頻度およびTeffとTregの比を、腫瘍所属リンパ節および非所属リンパ節において測定する。
実施例２０：C1ORF32タンパク質に対する遮断抗体と腫瘍細胞ワクチンとの併用による抗腫瘍効果
がん治療ワクチンは、抗腫瘍応答を増強する薬物として機能することによって、Ｔ細胞のプライミングの増強および抗原提示の増強を行うことができる。がん治療ワクチンとしては、抗原の供給源または抗原を送達するプラットフォームとして細胞全体または細胞溶解物を使用した腫瘍細胞ワクチンが挙げられる。樹状細胞（DC）ベースのワクチンは、エクスビボにおいてDCに抗原を送達することに焦点を当てている。他のがん治療ワクチンは、免疫刺激性サイトカインまたは増殖因子（たとえば、GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）またはFlt3リガンドなど）を分泌するように遺伝子修飾された腫瘍細胞からなり、免疫刺激性のインビボ環境において内因性DCに腫瘍抗原を送達することを目的としている。
いくつかのインビボ研究では、免疫原性の低い腫瘍に対する免疫チェックポイントの遮断（抗CTLA-4抗体など）は、GM-CSFを形質導入した腫瘍ワクチン（Gvax）またはFlt3リガンドを形質導入した腫瘍ワクチン（Fvax）と併用した場合においてのみ強力な治療効果を示すこと（van Elsas et al 1999 J. Exp. Med. 190:355-366; Curran and Allison 2009 Cancer Res. 69:7747-7755）、および該抗体単独での使用は最も免疫原性の強いマウス腫瘍モデルにおいてのみ効果的であったことが示されている。さらに、抗CTLA4遮断抗体や抗PD-1遮断抗体などの２種の免疫療法薬の併用は、GvaxやFvaxなどのがん治療ワクチンとこのような遮断抗体との併用よりも効果的である（Curran et al 2010 PNAS 107:4275-4280）。
C1ORF32中和抗体と腫瘍細胞ワクチンとの併用による効果は、（Curran et al 2010 PNAS 107:4275-4280の記載に準じ）抗PD-1遮断抗体の存在下または非存在下において、GMCSFまたはFlt3リガンドを分泌するように遺伝子操作した放射線照射悪性黒色腫細胞（すなわちGVAXまたはFVAX）を使用して試験する。簡単に述べると、0日目にマウスの脇腹に5×104個のB16-BL6細胞を皮内注射する。3日目、6日目および9日目に、100μgの抗PD-1遮断抗体（クローンRMP1-14）または抗PDL-1遮断抗体（9G2）を使用して、または使用せずに、抗C1ORF32遮断抗体100μgを腹腔内に投与するとともに、放射線（150Gy）を照射した遺伝子修飾B16細胞（GMCSFまたはFlt3リガンドを発現）1×106個を反対側の脇腹に注射して治療を行う。ネガティブコントロールとしてアイソタイプIgを使用する。腫瘍の体積をデジタルキャリパーで測定し、腫瘍増殖に対する効果を算出する。腫瘍増殖の抑制として示される治療効果は、C1ORF32に対する遮断抗体と遺伝子修飾した腫瘍細胞ワクチンとを併用することによって増強される。抗PD-1遮断抗体または抗PDL-1遮断抗体はこの効果をさらに増強する。エフェクターT細胞（=Teff（CD8+IFN-γ+）細胞）の頻度およびTeffとTregの比を、腫瘍所属リンパ節および非所属リンパ節において測定する。
実施例２１：C1ORF32タンパク質に対する遮断抗体と放射線療法との併用による抗腫瘍効果
放射線療法は、強力な抗増殖作用および細胞死誘導作用を有することから抗がん療法として長年使用されてきた。しかしながら、最近の前臨床データおよび臨床データから、immunogenic cell deathは電離放射線の照射によって引き起こされる重要な効果のひとつでもある可能性、ならびに局所放射線療法によって抗腫瘍免疫応答の惹起および／または調節が引き起こされている可能性が示唆されている（Reits et al 2006 J. Exp. Med. 203:1259-1271）。前臨床試験では、抗4-1BB抗体の活性化などのさらなる免疫療法の非併用下または併用下における、免疫療法（CTLA4およびPD-1などの免疫チェックポイントに対する遮断抗体の使用など）と放射線療法との併用療法により治療効果が増強されることが示されている（Demaria et al 2005 Clin. Can. Res. 11:728-734; Verbruge et al 2012 Can. Res. 72:3163-3174）。
抗C1ORF32遮断抗体と放射線療法との併用は、（Demaria et al 2005 Clin. Can. Res. 11:728-734の記載に準じて）BALB/cを遺伝子背景とする同系4T1乳癌細胞株を使用して評価される。簡単に述べると、5×104個の4T1細胞をBALB/cマウスの脇腹に皮下注射する。腫瘍のサイズが平均直径5mm（体積：65mm3）に達してから治療を開始する。各マウス群にはそれぞれ別々に、各治療法単独（抗C1ORF32または放射線療法）、アイソタイプIgコントロール、抗C1ORF32と放射線療法との併用、またはIgコントロールと放射線療法との併用による治療を施す。放射線療法は、原発腫瘍に12Gyを1回または（48時間の間隔を置いて）2回照射する。抗C1ORF32抗体またはIgコントロールは、放射線療法の1日後、4日後および7日後に200μgを腹腔内投与する。別セットの実験において、抗PD-1モノクローナル遮断抗体（RMP1-14）および抗4-1BBモノクローナル活性化抗体（3E1）を使用する。腫瘍の体積をデジタルキャリパーで測定し、腫瘍増殖に対する効果を算出する。腫瘍増殖の抑制として示される治療効果は、C1ORF32に対する遮断抗体と放射線療法との併用によって増強される。抗PD-1遮断抗体または抗4-1BB活性化抗体はこの効果をさらに増強する。エフェクターT細胞（=Teff（CD8+IFN-γ+）細胞）の頻度およびTeffとTregの比を、腫瘍所属リンパ節および非所属リンパ節において測定する。
がんの治療および診断において使用される所望の抗C1ORF32抗体の作製およびその選択ついて本発明を説明し、その実施形態を提供した。本発明を以下の請求項によってさらに説明する。本明細書に記載の上記の実施形態または下位実施形態を組み合わせることによって適切なコンビネーションまたはサブコンビネーションを形成してもよい。

Claims (67)

  1. がんの治療に適したモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    該抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１、７、９〜１１、１３〜１５、１７、１０３のいずれか１つで示される配列を有するＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドのいずれか１つ、ならびに／またはそのフラグメントおよび／もしくはエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を含むこと、ならびに
    該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
    を特徴とする抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号２、３、５、６のいずれかに特異的に結合する抗原結合部位を含む、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 配列番号５２、配列番号６８、配列番号８４および配列番号１００から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号５３、配列番号６９、配列番号８５および配列番号１０１から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；配列番号５４、配列番号７０、配列番号８６および配列番号１０２から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；または
    配列番号６２、配列番号４６、配列番号７８および配列番号９４から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号６３、配列番号４７、配列番号７９および配列番号９５から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；配列番号６４、配列番号４８、配列番号８０および配列番号９６から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
    を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  4. 配列番号５２、配列番号６８、配列番号８４および配列番号１００から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号５３、配列番号６９、配列番号８５および配列番号１０１から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；ならびに配列番号５４、配列番号７０、配列番号８６および配列番号１０２から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と；
    配列番号６２、配列番号４６、配列番号７８および配列番号９４から選択される配列を含むＣＤＲ１領域；配列番号６３、配列番号４７、配列番号７９および配列番号９５から選択される配列を含むＣＤＲ２領域；ならびに配列番号６４、配列番号４８、配列番号８０および配列番号９６から選択される配列を含むＣＤＲ３領域；またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域と
    を含む請求項３に記載のモノクローナル抗体。
  5. １）配列番号５２に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号５３に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号５４に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ２）配列番号６２に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号６３に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号６４に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ３）配列番号６８に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号６９に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号７０に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ４）配列番号４６に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号４７に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号４８に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ５）配列番号８４に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号８５に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号８６に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ６）配列番号７８に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号７９に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号８０に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ７）配列番号１００に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号１０１に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号１０２に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ８）配列番号９４に示す配列を含むＣＤＲ１領域、配列番号９５に示す配列を含むＣＤＲ２領域、および配列番号９６に示す配列を含むＣＤＲ３領域、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
    を含む請求項４に記載のモノクローナル抗体。
  6. 配列番号４０、５６、７２、８８のいずれか１つから選択される重鎖アミノ酸配列、および／もしくは配列番号４２、５８、７４、９０のいずれか１つから選択される軽鎖アミノ酸配列、またはこれらと少なくとも９５％の相同性を有する配列もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
  7. 配列番号４０に示す重鎖アミノ酸配列および配列番号４２に示す軽鎖アミノ酸配列の少なくともいずれか１つまたはその両方を有する請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  8. 配列番号５６に示す重鎖アミノ酸配列および配列番号５８に示す軽鎖アミノ酸配列の少なくともいずれか１つまたはその両方を有する請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  9. 配列番号７２に示す重鎖アミノ酸配列および配列番号７４に示す軽鎖アミノ酸配列の少なくともいずれか１つまたはその両方を有する請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  10. 配列番号８８に示す重鎖アミノ酸配列および配列番号９０に示す軽鎖アミノ酸配列の少なくともいずれか１つまたはその両方を有する請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  11. 前記抗体のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド。
  12. 前記核酸配列によってコードされる前記アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、
    １）配列番号４９、配列番号６５、配列番号８１および配列番号９７から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域；配列番号５０、配列番号６６、配列番号８２および配列番号９８から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域；ならびに配列番号５１、配列番号６７、配列番号８３および配列番号９９から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域；またはそれらの縮重バリアントを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と；
    ２）配列番号４３、配列番号５９、配列番号７５および配列番号９１から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域；配列番号４４、配列番号６０、配列番号７６および配列番号９２から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域；ならびに配列番号４５、配列番号６１、配列番号７７および配列番号９３から選択される核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域；またはそれらの縮重バリアントを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と
    を含むモノクローナル抗体。
  13. 前記核酸配列によってコードされる前記アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、
    １）配列番号４９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号５０に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号５１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ２）配列番号４３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号４４に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号４５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ３）配列番号６５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号６６に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号６７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ４）配列番号５９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号６０に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号６１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ５）配列番号８１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号８２に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号８３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ６）配列番号７５に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号７６に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号７７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；または
    ７）配列番号９７に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号９８に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号９９に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、
    ８）配列番号９１に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ１領域、配列番号９２に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ２領域、および配列番号９３に示す核酸配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域
    を含むモノクローナル抗体。
  14. 配列番号３９、５５、７１、８７のいずれか１つから選択される核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４１、５７、７３、８９のいずれか１つから選択される核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列、またはそれらの縮重バリアントを有する請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  15. 配列番号３９に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有する請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  16. 配列番号５５に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号５７に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有する請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  17. 配列番号７１に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号７３に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有する請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  18. 配列番号８７に示す核酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、および配列番号８９に示す核酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列を有する請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  19. （ａ）前記請求項に記載の配列；
    （ｂ）（ａ）に記載の配列において、重鎖ＣＤＲ３に存在する１００Ａ番目（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）のセリン残基以外の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸が保存的に置換された配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の配列と８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
    （ｄ）前記アミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
  20. 前記請求項のいずれかに記載の配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター。
  21. 請求項２０に記載のベクターを含むハイブリドーマ。
  22. 請求項２１に記載のハイブリドーマから分泌される抗体。
  23. ２０１３年１月１８日にATCC Receiving Departmentにより受領され、ブダペスト条約の規定に従ってAmerican Type Culture Collection (ATCC) Patent Depository（10801 ユニバーシティ・ブールバード、マナッサス、バージニア、20110-2209、米国）に寄託された、仮受託番号５１６６−２ ＰＴＡ−１３４７２の５１６６−２ハイブリドーマおよび／または仮受託番号５１６６−９ ＰＴＡ−１３４７３の５１６６−９ハイブリドーマから分泌される、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
  24. ２０１３年１月１８日にATCC Receiving Departmentにより受領され、ブダペスト条約の規定に従ってAmerican Type Culture Collection (ATCC) Patent Depository（10801 ユニバーシティ・ブールバード、マナッサス、バージニア、20110-2209、米国）に寄託された、仮受託番号５１６６−２ ＰＴＡ−１３４７２の５１６６−２ハイブリドーマおよび／または仮受託番号５１６６−９ ＰＴＡ−１３４７３の５１６６−９ハイブリドーマ。
  25. 請求項２４に記載のハイブリドーマのいずれかによって産生される抗体。
  26. 前記がんが、腫瘍として集合したがん細胞に浸潤した免疫細胞上またはがん細胞上に１つ以上のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドを発現していることを特徴とする、前記請求項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  27. 前記１つ以上のＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３のポリペプチドの１つ以上、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープを含むことを特徴とする、請求項２６に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  28. 前記抗体が、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  29. 前記抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントおよび最小認識単位からなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  30. 前記抗体が、薬物、放射性核種、発蛍光団、酵素、毒素、治療薬、および化学療法薬から選択される成分とカップリングされており、
    これらを検出するマーカーが、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物、または化学発光化合物であることを特徴とする、
    前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  31. 前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
  32. がんを治療するための、前記請求項のいずれかに記載の抗体もしくは抗体結合フラグメントまたは請求項３１に記載の医薬組成物の使用であって、
    該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに、
    該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
    を特徴とする使用。
  33. がんの治療方法であって、
    前記請求項のいずれかに記載の抗体もしくは抗体結合フラグメントまたは請求項２８に記載の医薬組成物の有効量を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含み、
    該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに
    該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
    を特徴とする方法。
  34. 前記治療を、がんの治療に有用な別の成分または治療法と組み合わせることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  35. 前記治療法が、放射線療法；抗体療法；化学療法；光線力学療法；養子Ｔ細胞療法；Ｔｒｅｇ除去；手術；または慣用の薬物との併用療法であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  36. 前記成分が、免疫抑制薬、細胞傷害薬、腫瘍ワクチン、抗体、ペプチド、ペプチボディ、小分子、化学療法薬、細胞傷害薬、細胞増殖抑制薬、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、免疫刺激薬、成長ホルモン、サイトカイン、ビタミン、無機質、アロマターゼ阻害薬、ＲＮＡｉ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬およびプロテアソーム阻害薬からなる群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  37. 前記成分が、ベバシズマブ、アービタックス、パクリタキセル、シスプラチン、ビノレルビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、テモゾロミド、イリノテカン、５ＦＵ、カルボプラチンおよび葉酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  38. がんを診断するための、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗体結合フラグメントの使用であって、
    該がんが、配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチド、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープをがん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現していること、ならびに
    該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
    を特徴とする使用。
  39. 対象のがんを診断する方法であって、
    配列番号１、７、９、１３、１７、１０３を含むＣ１ＯＲＦ３２ポリペプチドのいずれか１つ、配列番号１０、１４、１１、１５からなる群から選択される該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに／またはそれらのフラグメントおよび／もしくはエピトープを、対象または対象から得られた試料において検出することを含み、
    該がんが、甲状腺癌、食道癌、浸潤性乳管癌、面皰型乳癌、グレード２の髄様型乳癌；漿液性・粘液性癌、顆粒細胞腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍（腺癌）、嚢胞腺癌および類内膜腫瘍からなる群から選択される卵巣がん；明細胞癌、嫌色素性腺腫および肉腫様癌からなる群から選択される腎臓がん；グリーソンスコア５以上の前立腺腺癌、ステージＩ〜IIIの前立腺腺癌、良性前立腺肥大症、ステージIIおよびIIIの肝細胞癌、悪性ヘパトーム、線維層板状肝細胞癌、偽腺管型（腺様型）肝細胞癌、多形態型（巨細胞型）肝細胞癌、明細胞型肝細胞癌、胆管癌；膵管内粘液性腺癌、膵島細胞癌、家族性メラノーマ多発性膵癌症候群（FAMMM-PC）、膵外分泌がん、膵管内腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、低〜中悪性度神経内分泌癌、および膵カルチノイド腫瘍から選択される膵臓がん；ステージIVの悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟部組織黒色腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、アスキン腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、神経線維肉腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、Ｔ細胞リンパ腫、類内膜腺癌、膀胱移行上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大細胞肺癌、精巣セミノーマ、中〜低分化型結腸直腸腺癌、ならびに脊髄腫瘍からなる群から選択されること
    を特徴とする方法。
  40. 前記ポリペプチドの検出をインビボまたはインビトロで行うことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  41. 前記検出をイムノアッセイによって行うことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
  42. 前記検出を前記請求項のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを使用して行うことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
  43. 前記甲状腺癌が、甲状腺乳頭癌、（好ましくはステージIIおよびIIIの）甲状腺濾胞癌、偶発乳頭癌（IPC）、甲状腺髄様癌、および退形成甲状腺癌から選択される１以上であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  44. 前記食道癌が、食道扁平上皮癌であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  45. 前記浸潤性乳管癌が、ステージII〜IVの、かつ／もしくは低分化型の浸潤性乳管癌であること、ならびに／または
    前記髄様癌がグレード２の髄様癌であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  46. 前記漿液性・粘液性卵巣癌が、ステージＩc〜IIIbの漿液性・粘液性卵巣癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  47. 前記明細胞腎癌が、ステージＩ〜IIの明細胞腎癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  48. 前記肝細胞癌が、ステージII〜IIIの肝細胞癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  49. 前記ホジキンリンパ腫が、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型すなわちリンパ球優勢型、リンパ球減少型、および非特定型から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  50. 前記Ｂ細胞リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（NMZL）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症からなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  51. 前記Ｔ細胞リンパ腫が、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（セザリー症候群および菌状息肉腫）、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  52. 前記類内膜腺癌が、ステージＩ〜IIIcの類内膜腺癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  53. 前記膀胱移行上皮癌が、ステージII〜IVの移行上皮癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  54. 前記小細胞肺がんが、ステージＩ〜IIIbの小細胞肺がんから選択されること、ならびに／または
    前記非小細胞肺がんが、低〜中分化型の扁平上皮癌および腺癌から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  55. 前記抗体またはフラグメントが、Ｃ１ＯＲＦ３２によって誘導された活性を抑制することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  56. 前記抗体またはフラグメントが、Ｂ７関連共刺激を調節すること、Ｔ細胞の活性化を増強すること、Ｔ細胞の抑制を軽減すること、サイトカインの分泌を増強すること、ＩＬ−２の分泌を増強すること、Ｔ細胞によるインターフェロン−γの産生を増強すること、Ｔｈ１の応答を増強すること、Ｔｈ２の応答を減弱すること、がんのエピトープ拡大を促進すること、Ｔ細胞活性化の抑制を減弱すること、哺乳動物におけるＴ細胞応答を増強すること、抗原特異的メモリー応答を刺激すること、がん細胞のアポトーシスもしくは溶解を誘導すること、がん細胞に対する細胞傷害作用もしくは細胞増殖抑制作用を刺激すること、がん細胞の直接殺傷を誘導すること、補体依存性細胞傷害作用および／もしくは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導すること、ならびに／またはＣＤＣ活性を有していることを特徴とする、請求項５５に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  57. 前記抗体またはフラグメントが、がんに対する免疫応答を増強することを特徴とする、請求項５６に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  58. 前記抗体またはフラグメントが、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の活性を減弱することを特徴とする、請求項５６に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  59. 前記抗体またはフラグメントが、ｉＴｒｅｇへの分化を抑制することを特徴とする、請求項５６に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  60. 治療効果を得るために１つ以上の増強手段と組み合わせて、該増強手段と同時にまたは連続して対象に投与され、
    該１つ以上の増強手段が、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的／古典的化学療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Ｔｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、がん治療ワクチン、ならびに養子細胞移入からなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の抗体、方法、組成物または使用。
  61. 前記の標準的／古典的化学療法薬が、ゲムシタビン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、白金系化合物、シクロホスファミド、アントラサイクリン類、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン類、パクリタキセル、ドセタキセル、微小管阻害薬、ビンクリスチン、葉酸拮抗薬、メトトレキサート、ｍＴＯＲ経路阻害薬、テムシロリムス、ラパマイシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびミトキサントロンから選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  62. 前記標的療法薬が、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬、ボリノスタット、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、ＪＡＫ２阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）および治療用モノクローナル抗体から選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  63. 前記標的療法薬が、エルロチニブ、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブ、anatimumabおよびトラスツズマブから選択されることを特徴とする、請求項６２に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  64. 前記免疫抑制細胞であるＴｒｅｇおよび／またはＭＤＳＣを標的とする治療薬が、抗有糸分裂薬、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体、ＣＯＸ−２阻害薬、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を認識してＴｒｅｇを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体、抗ＣＤ２５であるダクリズマブおよびバシリキシマブ、リガンド標的毒素であるデニロイキン ディフィトックス（オンタック）（ヒトＩＬ−２とジフテリア毒素との融合タンパク質）およびＬＭＢ−２（ＣＤ２５に対するｓｃＦｖと緑膿菌外毒素との融合物）、Ｔｒｅｇ細胞表面受容体を標的とする抗体、ＴＬＲ調節薬、アデノシン作動経路を阻害する薬物、エクトヌクレオチダーゼ阻害薬、Ａ２Ａアデノシン受容体阻害薬、ＴＧＦ−β阻害薬、ケモカイン受容体阻害薬、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、ホスホジエステラーゼ５阻害薬、シルデナフィル、ＲＯＳ阻害薬、ならびにニトロアスピリンから選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  65. 前記免疫刺激抗体が、ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、ＰＤ−１（ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６）、ＰＤＬ−１（ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５）、ＬＡＧ−３（ＩＭＰ−３２１）、ＴＩＭ−３、およびＢＴＬＡの１つ以上を標的とするアンタゴニスト抗体；ならびにＣＤ４０（ＣＰ−８７０,８９３）、ＣＤ１３７（ＢＭＳ−６６３５１３）、ＯＸ４０（抗ＯＸ４０）、およびＧＩＴＲ（ＴＲＸ５１８）の１つ以上を標的とするアゴニスト抗体から選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  66. 前記がん治療ワクチンが、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するために使用されるタンパク質またはペプチドを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクターを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードするＤＮＡベースの外因性がんワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質を含む外因性がんワクチン、樹状細胞を含む外因性がんワクチン、ならびにＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＦｌｔ３リガンドを発現する遺伝子修飾腫瘍細胞を含む外因性がんワクチンから選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
  67. 前記がん治療ワクチンが、樹状細胞ベースのワクチンを含むことを特徴とする、請求項６０に記載の抗体、方法、組成物または使用。
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