JP2012502938A - 癌の治療のためのモノクローナル抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腫瘍関連疾患、例えば乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態を含む、ＧＴ４６８を発現する細胞に関連する疾患を治療する及び／又は予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。１つの実施形態において、腫瘍疾患は肺の転移性癌である。

Description

抗体に基づく癌療法は、臨床に導入されて成功を収めており、過去１０年間にわたって腫瘍学における最も有望な治療法として浮上してきた。
癌のための抗体に基づく療法は、従来の薬剤と比較してより高い特異性とより低い副作用プロフィールの潜在的可能性を有する。その理由は、抗体による正常細胞と腫瘍細胞との正確な識別、並びにそれらの作用機構が、補体の活性化及び細胞傷害性免疫細胞の活動のようなより毒性の低い免疫学的抗腫瘍機構に基づくという事実にある。
抗体療法のための標的は、正常細胞と腫瘍細胞との間の適切な識別のための基礎を形成する、特定の性質を有する必要がある。明らかに、腫瘍細胞に排他的に限定され、正常組織では完全に検出不能である標的は、効率的で安全な抗体療法の開発のために理想的である。もう１つの態様では、高レベルの過剰発現が治療ウインドウ及び低い副作用のための基礎となり得、これは、遺伝子増幅の結果として抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の良好な標的である、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ−２）によって例示される。
腫瘍治療に関して既に承認されているか又は臨床開発中である抗体についての他の標的は、腫瘍細胞上の標的分子の数的過剰発現には基づかない、特徴的な性質を有する。プロテオグリカンＭＵＣ−１に対する抗体の場合は、標的の骨格内のペプチド反復エピトープが腫瘍細胞ではグリコシル化不十分であり、それ故その正常対応物へと変化する。ＣＤ２０（リツキシマブ）、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）及びＣＤ２２（エプラツズマブ）に対する抗体の場合は、抗体標的が腫瘍細胞と正常リンパ球上で同等の発現レベルを有する。ここでは、標的陰性幹細胞が正常なリンパ球レパートリーを回復するので、抗体による正常細胞の切断が耐容される。抗体標的の区別的アクセス可能性の他の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡ９）である。どちらの抗原も、それぞれ結腸及び腎臓の正常上皮で発現される。しかし、放射性標識イメージング抗体は、腫瘍と正常組織を正しく識別し、細胞傷害性抗体は良好に耐容される。これは、おそらくＩｇＧ抗体がアクセスできない正常上皮組織の管腔側でのＣＡ９及びＣＥＡの発現が制限されていることによると考えられる。抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）もこのカテゴリーに属する。上皮細胞についての同型細胞接着分子として、Ｅｐ−ＣＡＭは細胞間隙に局在する。興味深いことに、高親和性抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は非常に毒性が強いが、中間親和性の抗体は良好に耐容される。これは、正常細胞上のＥｐ−ＣＡＭ標的のアクセス可能性を示唆するだけでなく、抗体結合の動力学が治療ウインドウを開き得ることも指示する。
８つの抗体が腫瘍性疾患の治療に関して承認されているが、それらのほとんどはリンパ腫及び白血病における治療である（Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．＆Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１４７−１１５７）。３つのｍＡｂ、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ａｖａｓｔｉｎ及びＥｒｂｉｔｕｘだけが、癌が引き起こす死亡の９０％超を占める、固形癌タイプを対象とする。残存する実質的な医学的必要性、承認されたｍＡｂが既に提供してきた重要な臨床的恩恵及びそれらの大きな商業的成功の全体が、広範囲の患者群のために抗体療法を開発することのみならず、それらの効果も改善しようとする革新的手法の波をもたらした（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．＆Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２，５２−６２；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １，１１８−１２９）。
次世代の改善された抗体に基づく癌療法の出現のために克服されるべき課題の１つは、好ましい毒性／効果プロファイルのための鍵となる、適切な標的分子の選択である。
固形癌の治療のために現在使用可能な抗体は、正常組織でのそれらの標的の発現のために、抗体分子に組み込まれた作用機構の累積的な力を十分に発揮していない。例えば、ハーセプチンの標的であるＨｅｒ２／ｎｅｕは、心筋を含む多くの正常ヒト組織で発現される（Ｃｒｏｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｆａｎ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４５９−４６５）。結果として、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、さもなければ許容されない毒性の故に、低い免疫学的効力で設計されており、その最大有効用量で投与することができない。この「潜在的に鋭利なナイフの切れ味の鈍化」がハーセプチンの治療効果を制限している。
毒性に関連する正常組織で発現しないことに加えて、腫瘍細胞の表面での堅固で高い発現と腫瘍促進機能の提示が、理想的な抗体標的のための望ましい特徴である（Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ，Ｐ．＆Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，６４０−６４４）。
癌の抗体療法の新たな標的の発見のために総合的なデータ検索と実験による検証手法を使用して、発明人はＧＴ４６８を同定した。ＧＴ４６８は、様々な腫瘍型において、特に乳癌においてしばしば異常に活性化され、高発現される胎盤特異的遺伝子である。ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉを介したＧＴ４６８のサイレンシングは、運動性、移動及び浸潤を大きく低下させ、ほぼ完全な増殖の排除を伴うＧ１／Ｓ細胞周期のブロックを誘導する。ＧＴ４６８のノックダウンは、サイクリンＤ１の発現低下及びＡＫＴキナーゼのリン酸化減少に結びつく。さらに、ＧＴ４６８は癌細胞の表面に局在し、この分子の生物学的機能に拮抗する抗体にとってアクセス可能である。
ＧＴ４６８は、この分子を治療抗体のための極めて魅力的な標的とするいくつかの性質を備える。妊娠のような例外的な状態においてのみヒトの身体に出現する細胞系譜の識別抗原であるので、自己抗原がおそらくそうであるように健常毒性関連組織には存在しない。様々な腫瘍実体におけるその高い存在率の故に、幅広い患者がＧＴ４６８標的化療法による治療に適格となる。例えば乳癌の場合は、患者の８２％がこの標的を担持する。これに対し、ハーセプチンの標的であり、この癌型の治療のために使用可能な唯一のｍＡｂであるＨｅｒ２／ｎｅｕは、乳癌患者の２０〜２５％においてしか過剰発現されない（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，７０７−７１２）。肺癌及び胃癌に関しては、それぞれ症例の４２％及び５８％においてＧＴ４６８が発現されるが、これらの癌型における適切な標的が存在しないために、今までのところ承認されたｍＡｂ治療はない。
Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．＆Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１４７−１１５７ Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．＆Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２，５２−６２ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １，１１８−１２９ Ｃｒｏｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｆａｎ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４５９−４６５ Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ，Ｐ．＆Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，６４０−６４４ Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，７０７−７１２
ＧＴ４６８は生細胞上の抗体による標的となり得、そのような抗体は、増殖阻害のような抗腫瘍作用を促進し得る。ＧＴ４６８は増殖に関与するだけでなく、細胞の運動性、移動及び浸潤にも関わる。最も興味深い点として、これらの特性すべてが、腫瘍表現型に実質的に寄与するのみならず、ヒト栄養膜の固有の性質でもあり、その生理的特徴は、速やかに成長し、子宮組織に効率よく侵入することである。ＡＤＣＣ及びＣＤＣのような免疫エフェクター機能を媒介する潜在的可能性に加えて、これらの機能すべてに同時に干渉する、ＧＴ４６８に対するｍＡｂが構築され得ると期待される。
本発明は、一般に、腫瘍関連疾患、例えば癌、特に乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態を含む、ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患を治療する及び／又は予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
１つの態様では、本発明は、ＧＴ４６８に結合する能力を有する抗体に関する。本明細書で述べる抗体は、好ましくは、ＧＴ４６８上に存在する抗原決定基、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメイン内に位置する抗原決定基、より好ましくは配列番号：３−１０及び３５−８２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は、細胞表面上に位置するＧＴ４６８に結合する能力を有し、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメイン内、好ましくはＧＴ４６８のアミノ酸残基２３−２１２内に位置する１つ又はそれ以上の抗原決定基に結合し、最も好ましくは配列番号：３−１０及び３５−８２のアミノ酸配列の１つの中に位置する抗原決定基に結合する。１つの好ましい実施形態では、抗体は配列番号：３−１０及び３５−８２のアミノ酸配列の１つ又はそれ以上に特異的である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号：２のアミノ酸２９−１１９、好ましくはアミノ酸２９−２１２、より好ましくはアミノ酸２３−２１２を含むペプチドに結合する能力を有する。
本発明に包含されるモノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ１−４、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤ抗体を含む。１つの実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より具体的にはＩｇＧ１κ又はＩｇＧ１λアイソタイプである。もう１つの実施形態では、抗体はＩｇＧ３抗体、より具体的にはＩｇＧ３κ又はＩｇＧ３λアイソタイプである。さらにもう１つの実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体、より具体的にはＩｇＧ４κ又はＩｇＧ４λアイソタイプである。さらにもう１つの実施形態では、抗体はＩｇＡ１又はＩｇＡ２抗体である。さらにもう１つの実施形態では、抗体はＩｇＭ抗体である。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：７５−７９に従ったペプチドの１つ又はそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：７５に従ったペプチド及び／又は配列番号：７６に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：７５に従ったペプチド及び配列番号：７６に従ったペプチドに結合する。もう１つの実施形態では、抗体は、配列番号：７７に従ったペプチド及び／又は配列番号：７８に従ったペプチド及び／又は配列番号：７９に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：７８に従ったペプチド及び配列番号：７９に従ったペプチドに結合するか又は配列番号：７７に従ったペプチド、配列番号：７８に従ったペプチド及び配列番号：７９に従ったペプチドに結合する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：４に従ったペプチド又は配列番号：８０に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。もう１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：６に従ったペプチド又は配列番号：８１に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。好ましくは、本発明の抗体は上記ペプチドの１つ又はそれ以上に結合する。
さらなる実施形態では、配列番号：７５に従ったペプチド及び／又は配列番号：７６に従ったペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：７５に従ったペプチド及び配列番号：７６に従ったペプチドに結合する抗体は、配列番号：４に従ったペプチド又は配列番号：８０に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。もう１つの実施形態では、配列番号：７７に従ったペプチド及び／又は配列番号：７８に従ったペプチド及び／又は配列番号：７９に従ったペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：７８に従ったペプチド及び配列番号：７９に従ったペプチドに結合するか又は配列番号：７７に従ったペプチド、配列番号：７８に従ったペプチド及び配列番号：７９に従ったペプチドに結合する抗体は、配列番号：６に従ったペプチド又は配列番号：８１に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：６１〜６６に従ったペプチドの１つ又はそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：６１に従ったペプチド及び／又は配列番号：６２に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６１に従ったペプチド及び配列番号：６２に従ったペプチドに結合する。もう１つの実施形態では、抗体は、配列番号：６４に従ったペプチド及び／又は配列番号：６５に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６４に従ったペプチド及び配列番号：６５に従ったペプチドに結合する。もう１つの実施形態では、抗体は、配列番号：６５に従ったペプチド及び／又は配列番号：６６に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：６５に従ったペプチド及び配列番号：６６に従ったペプチドに結合する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：８２に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。好ましくは、本発明の抗体は上記ペプチドに結合する。配列番号：８２に従ったペプチドは、アミノ酸１と１６の間のペプチドにおけるジスルフィド結合の形成を助けるために付加されたＣ末端ＧＳリンカーを有する。このペプチドは、おそらくＧＴ４６８の天然配座に類似する。配列番号：８２に従ったペプチドを免疫のために使用して得られたハイブリドーマ５１−１Ａ−１によって産生された抗体は、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖及びコロニー形成に対して強い阻害活性を示した。
さらなる実施形態では、配列番号：６４に従ったペプチド及び／又は配列番号：６５に従ったペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：６４に従ったペプチド及び配列番号：６５に従ったペプチドに結合する抗体、又は配列番号：６５に従ったペプチド及び／又は配列番号：６６に従ったペプチドに結合する、より好ましくは配列番号：６５に従ったペプチド及び配列番号：６６に従ったペプチドに結合する抗体は、配列番号：８２に従ったペプチドを免疫のために使用して得られる。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：５７〜６０に従ったペプチドの１つ又はそれ以上に結合する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号：５７に従ったペプチド及び／又は配列番号：５８に従ったペプチド及び／又は配列番号：５９に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：５７に従ったペプチド及び配列番号：５８に従ったペプチド及び配列番号：５９に従ったペプチドに結合する。もう１つの実施形態では、抗体は、配列番号：５９に従ったペプチド及び／又は配列番号：６０に従ったペプチドに結合し、より好ましくは配列番号：５９に従ったペプチド及び配列番号：６０に従ったペプチドに結合する。
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞、特に本明細書で言及する癌型の細胞に結合し、好ましくは非癌細胞には実質的に結合せず、より好ましくは胎盤細胞及び精巣細胞以外の非癌細胞には実質的に結合しない。好ましくは、癌細胞のようなＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞への前記抗体の結合は、前記細胞の死滅を媒介する、並びに／又は運動性、移動、浸潤、増殖及び／若しくはコロニー形成などの、そのような細胞の１つ又はそれ以上の活性を阻害する。好ましくは、抗体は前記細胞の増殖及び／又はコロニー形成を阻害する。
本発明の抗体による、細胞の死滅化並びに／又は細胞の１若しくはそれ以上の活性の阻害、特に細胞増殖及びコロニー形成の阻害は、好ましくは前記細胞によって発現される及び／又は前記細胞の細胞表面と結合しているＧＴ４６８への抗体の結合によって誘導される。そのような細胞の死滅化及び／又は細胞の１若しくはそれ以上の活性の阻害は、本明細書で述べるように治療において利用できる。特に、細胞の死滅化及び／又は細胞の増殖の阻害及び／又は細胞のコロニー形成の阻害は、癌転移を含む、癌を治療するか又は予防するために利用できる。細胞の運動性、移動、浸潤、増殖及び／又はコロニー形成の阻害は、特に、癌の転移及び癌細胞の転移拡大を治療するか又は予防するために利用できる。
ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に、以下の癌疾患：乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態の、腫瘍形成性癌細胞からなる群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
本発明の抗体は、標的細胞傷害、すなわち腫瘍細胞の死滅をもたらすために１つ又はそれ以上の治療エフェクター成分、例えば放射性標識、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する物質等に結合させ得る。
好ましくは、本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した溶解、アポトーシス、同型接着及び／又は食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解及び／又はＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する。しかし、本発明はまた、抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した溶解、アポトーシス、同型接着及び／又は食作用を誘導せずに、細胞の死滅並びに／又は細胞の１若しくはそれ以上の活性の阻害、例えば細胞増殖及びコロニー形成の阻害のような本明細書で述べるその活性を及ぼす実施形態を包含する。例えば、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＧＴ４６８に結合することによって、それ故、例えば細胞の増殖をブロックすることによっても作用を及ぼし得る。１つの実施形態では、本発明の抗体は、細胞のＣＤＣ媒介性溶解を誘導しない。
好ましくは、細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解は、特定実施形態では単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮからなる群より選択される、エフェクター細胞の存在下で起こり、そして食作用はマクロファージによるものである。
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞、好ましくは乳癌細胞などの癌細胞の増殖を阻害するか又は低減する活性を有する。この活性は、ブロモデオキシウリジン（５−ブロモ−２−デオキシウリジン、ＢｒｄＵ）を使用した解析においてＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖を測定することにより、試験管内で測定できる。ＢｒｄＵは、チミジンの類似体である合成ヌクレオシドであり、複製細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれて（細胞周期のＳ期の間に）、ＤＮＡ複製の間にチミジンを置換することができる。例えばＢｒｄＵに特異的な抗体を使用して、組み込まれた化学物質を検出することは、そのＤＮＡを活発に複製していた細胞を示す。細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＧＴ４６８を発現した癌細胞として使用することができる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８の１つ又はそれ以上の増殖を阻害又は低減し、好ましくは細胞株ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＣＦ−７の両方の増殖を阻害又は低減し、最も好ましくは細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８のすべての増殖を阻害又は低減する。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ３５−４８Ｂ−１、３５−５０Ａ−２ａ、３８−１０Ｂ−１、３８−１Ａ−１、４５−２Ａ−１、４５−８Ａ−２、４８−３Ｂ−１、４８−４Ａ−１、４９−３Ａ−１、５１−１Ａ−１、５３−１３Ａ−２、５３−２９Ａ１、５６−４Ａ−２、６２−９Ｂ−１、７８Ｈ１１ １Ｈ６及び４４−３Ａ−２によって産生される抗体及び／又は前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体及び、特に、（ｉ）の下にある抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体からなる群より選択される。これに関して本発明の特に好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ３５−４８Ｂ−１、４８−３Ｂ−１、５１−１Ａ−１及び５６−４Ａ−２によって産生される抗体及び／又は前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体及び、特に、（ｉ）の下にある抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体からなる群より選択される。
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞、好ましくは乳癌細胞などの癌細胞のコロニー形成を阻害するか又は低減する活性を有する。この活性は、クローン原性アッセイにおいて試験管内で測定することができる。細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＧＴ４６８を発現した癌細胞として使用できる。クローン原性アッセイは、細胞の生存及び増殖への特定物質の有効性を試験するための微生物学技術である。このアッセイは、増殖腫瘍細胞への薬剤又は放射線の作用を測定するために癌研究室においてしばしば使用される。実験は３つの主要な工程：（ｉ）細胞、特に癌細胞の試料に治療を適用する工程、（ｉｉ）組織培養容器に細胞を植える工程、及び（ｉｉｉ）細胞を増殖させる工程を含む。生成されたコロニーを固定し、染色して、計数する。コロニー形成は、個々の腫瘍細胞が器官に定着した場合の転移の形成に関して重要である。抗体の阻害活性は、転移の形成を抑制する上でのそれらの潜在能を示す。クローン原性アッセイにおいてコロニー形成を阻害又は低減する活性を有する抗体は、転移及び、特に本明細書で言及する癌型の、癌細胞の転移拡大を治療するか又は予防するために特に有用である。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４、７８Ｈ１１ １Ｈ６、１６−５Ｂ−１、２２−１Ａ−１、２９−８Ｂ−１及び５１−１Ａ−１によって産生される抗体及び／又は前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体及び、特に、（ｉ）の下にある抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体からなる群より選択される。これに関して本発明の特に好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４、２９−８Ｂ−１及び５１−１Ａ−１によって産生される抗体及び／又は前記ハイブリドーマから得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体及び、特に、（ｉ）の下にある抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体からなる群より選択される。
１つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、上記で説明したようにＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害するか又は低減する活性を有し、且つ、上記で説明したようにＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のコロニー形成を阻害するか又は低減する活性を有する。これに関して本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ハイブリドーマ５１−１Ａ−１によって産生される抗体及び／又はハイブリドーマ５１−１Ａ−１から得られる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、並びに（ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体及び、特に、（ｉ）の下にある抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含む抗体からなる群より選択される。
１つの実施形態では、本発明は、（ｉ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に結合し、且つ（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞には結合しない抗体に関する。本発明の抗体は、好ましくは、（ｉ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介し及び／又は前記細胞の増殖を阻害し、且つ（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞の死滅を媒介しない及び／又は前記細胞の増殖を阻害しない。
本発明の抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントであり得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体からなる群より選択され得る。
本発明の抗体は完全ヒト抗体を含む。そのような抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプを産生することができる、非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスにおいて作製し得る。そのようなトランスジェニック動物はまた、米国特許出願公開第２００３／００１７５３４号に開示されているようなポリクローナル抗体を産生するためのトランスジェニックウサギであり得る。
ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、例えば補体系の活性化によって、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介し得る、並びに／又はＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の増殖を阻害し得る。あるいは、又はＧＴ４６８を発現する及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介すること並びに／又はＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害することに加えて、ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞（例えば腫瘍細胞）の運動性、移動、コロニー形成及び／又は浸潤を阻害することができ、それ故、腫瘍細胞の転移拡大を阻害し得る。ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅は、以下の機構：ＧＴ４６８を発現する及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシス；ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のエフェクター細胞食作用；又はＧＴ４６８を発現する及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、の１つ又はそれ以上によって起こり得る。
本発明のすべての態様によると、ＧＴ４６８は、好ましくはヒトＧＴ４６８であり、好ましくは配列番号：２に従ったアミノ酸配列を有する、より好ましくは配列番号：２に従ったアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する、特に配列番号：２のアミノ酸２３−２１２にわたるアミノ酸配列を有するヒトＧＴ４６８である。
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：３〜１０及び３５〜８２のような、生細胞の表面に存在するＧＴ４６８の天然抗原決定基に結合する。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は、癌細胞、好ましくは乳癌細胞に特異的である。好ましくは、本発明の抗体は、細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１のようなＧＴ４６８を発現する癌細胞に特異的であり、ＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞のようなＧＴ４６８を発現しない癌細胞には結合しない。
本発明のある実施形態では、ＧＴ４６８は、細胞表面上で発現される細胞及び／又は細胞の表面と結合する。
本発明の抗体は、配列番号：２〜１０及び３５〜８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、又は前記タンパク質若しくはペプチド又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体を発現する核酸又は宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって入手し得る。好ましくは、本発明の抗体は、前述したタンパク質、ペプチド又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体に特異的である。免疫において使用されるタンパク質又はペプチドに関連して、誘導体は、それが由来するタンパク質又はペプチドと同じ免疫原性を有する、そのようなタンパク質又はペプチドの変異体に関する。特に、抗体、中でもモノクローナル抗体の作製のために免疫において使用される場合のタンパク質又はペプチドの誘導体は、前記タンパク質又はペプチドを免疫において使用した場合に得られる抗体と同じ特異性を有する抗体を提供する。例えば、そのような誘導体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含み得る。特に、前記誘導体は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか又はその両方にシステインなどの１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加を含み得る。
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２）又はＤＳＭ ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１）を有するクローンによって産生される。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質などの治療薬に結合される。
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマに関する。好ましいハイブリドーマは、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２）又はＤＳＭ ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１）を有するものである。
本発明の抗体は、本明細書では、抗体の名称を参照することによって及び／又は抗体を産生するクローン、例えば４Ｅ９−１Ｈ９を参照することによって指定される。
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞及び非悪性細胞を含む種々の細胞型によって発現されるＧＴ４６８変異体を識別する能力を有する。
本発明の抗体は、ＧＴ４６８に結合することにより、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅を媒介する。好ましくは、ＧＴ４６８は前記細胞の表面上で発現される。１つの実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、例えば少なくとも約２０−４０％のＣＤＣ媒介性溶解、好ましくは約４０〜５０％のＣＤＣ媒介性溶解、より好ましくは５０％超のＣＤＣ媒介性溶解を誘導する。あるいはＣＤＣを誘導することに加えて、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮ）の存在下でＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを誘導する、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の同型接着を誘導する、並びに／又はマクロファージの存在下でＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用を誘導する能力を有し得る。本発明の抗体は、上述した機能特性の１つ又はそれ以上を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＣＤＣ媒介性溶解及びＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導し、より好ましくはＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導するが、前記細胞のＣＤＣ媒介性溶解は誘導しない。本発明の抗体についての例示的な標的細胞は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする癌細胞を含むが、これらに限定されない。特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体によって媒介される細胞の死滅はＧＴ４６８特異的である、すなわち本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の死滅、好ましくはＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ媒介性溶解を媒介するが、ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない細胞の死滅は媒介しない。上述した抗体は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態などの癌の治療又は予防において腫瘍細胞の死滅を媒介するために使用され得る。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを含むがこれらに限定されない様々な種に由来し得る。本発明の抗体もまた、１つの種、好ましくはヒトに由来する抗体定常領域が別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされているキメラ分子を包含する。さらに、本発明の抗体は、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位がヒト起源の定常領域及びフレームワーク領域と組み合わされているヒト化分子を包含する。
本発明の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含み、ＩｇＧ２ａ（例えばＩｇＧ２ａκ、λ）、ＩｇＧ２ｂ（例えばＩｇＧ２ｂκ、λ）、ＩｇＧ３（例えばＩｇＧ３κ、λ）及びＩｇＭ抗体を含む。しかし、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体を含む、他の抗体アイソタイプも本発明に包含される。抗体は、全長抗体又は、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖフラグメン若しくは二重特異性抗体トを含む、その抗原結合フラグメントであり得る。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド（例えば重鎖可変領域又は軽鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を包含する。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号及び同第２００３／０１３３９３９号においてさらに開示されている。
本発明の抗体は、好ましくは約１−１００ｎＭ、又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でＧＴ４６８から解離する。好ましくは、本発明の抗体は、関連細胞表面抗原と交差反応せず、それ故それらの機能を阻害しない。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、以下の性質：
ａ）ＧＴ４６８に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭ又はそれ以下、好ましくは約５−１０ｎＭ又はそれ以下、より好ましくは約１−３ｎＭ又はそれ以下のＧＴ４６８に対する結合親和性；
ｃ）ＣＤ５５／５９陰性細胞又はＣＤ５５／５９陽性細胞のいずれか上で高レベルのＣＤＣを媒介する能力；
ｄ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する能力；
ｅ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを誘導する能力；
ｆ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の同型接着を誘導する能力；
ｇ）エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＡＤＣＣを誘導する能力；
ｈ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞を有する被験者の生存を延長させる能力；
ｉ）ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を枯渇させる能力；
ｊ）低レベルのＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を枯渇させる能力；並びに／又は
ｋ）生細胞の表面上でＧＴ４６８を集合させる能力
の１つ又はそれ以上によって特徴づけることができる。
本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、誘導体化する、他の結合特異性成分に連結する、又は他の結合特異性成分と共発現させることができる。特定の実施形態において、本発明は、ＧＴ４６８に対する少なくとも１つの第一結合特異性（例えば抗ＧＴ４６８抗体又はそのミメティック）、及びＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩなどのＦｃγ受容体、若しくは何らかの他のＦｃ受容体）又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３に対する結合特異性などの、エフェクター細胞に対する第二結合特異性を含む、二重特異性又は多重特異性分子を提供する。
従って、本発明は、ＧＴ４６８とＦｃ受容体又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３の両方に結合する二重特異性及び多重特異性分子を包含する。Ｆｃ受容体の例は、ＩｇＧ受容体、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。ＩｇＡ受容体（例えばＦｃαＲＩ）などの他のＦｃ受容体も標的することができる。Ｆｃ受容体は、好ましくはエフェクター細胞の表面上、例えば単球、マクロファージ又は活性化単核細胞の表面上に位置する。好ましい実施形態では、二重特異性及び多重特異性分子は、受容体の免疫グロブリンＦｃ（例えばＩｇＧ又はＩｇＡ）結合部位とは異なる部位でＦｃ受容体に結合する。それ故、二重特異性及び多重特異性分子の結合は、生理的レベルの免疫グロブリンによってブロックされない。
さらにもう１つの態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体を誘導体化するか、もう１つ別の機能的分子、例えば別のペプチド若しくはタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に連結するか、又は別の機能的分子と共発現させる。例えば、本発明の抗体は、もう１つ別の抗体（例えば二重特異性又は多重特異性抗体を作製するため）、細胞毒、細胞リガンド又は抗原（例えばイムノトキシンなどの免疫複合体を作製するため）などの、１つ又はそれ以上の他の分子実体に機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方法によって）。本発明の抗体は、他の治療成分、例えば放射性同位体、低分子抗癌薬、組換えサイトカイン又はケモカインに連結することができる。従って、本発明は、多種多様な抗体複合体、二重特異性及び多重特異性分子、並びに融合タンパク質を包含し、これらのすべてが、ＧＴ４６８発現細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に結合し、他の分子をそのような細胞に標的するために使用できる。
一般に、本発明の目的のために、本明細書で述べる抗体複合体、二重特異性及び多重特異性分子、並びに融合タンパク質などのすべての抗体誘導体は、「抗体」という用語に包含される。
さらなる態様では、本発明はまた、非免疫グロブリンドメインに由来するＧＴ４６８結合タンパク質、特に一本鎖タンパク質を考慮する。そのような結合タンパク質及びそれらの生産のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１０）：１２５７−１２６８に述べられている。免疫グロブリン又は免疫グロブリン由来の結合分子に関して本明細書で与えられる教示は、同様に非免疫グロブリンドメインに由来する結合分子にも適用されることを理解されたい。特に、非免疫グロブリンドメインに由来するそのような結合分子を使用して、上記標的を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面と前記標的の結合を特徴とする細胞のＧＴ４６８をブロックし、それ故、本発明の抗体に関して本明細書で開示される治療効果、特に腫瘍細胞の増殖のような本明細書で開示される腫瘍細胞の１つ又はそれ以上の活性の阻害を生じさせることが可能である。必須ではないが、例えば抗体のＦｃ領域への融合によって、そのような非免疫グロブリン結合分子に抗体のエフェクター機能を付与することが可能である。
本発明は一般に、細胞によって発現される細胞及び／又は細胞の表面と結合しているＧＴ４６８を標的することによる、疾患、特に腫瘍性疾患の治療及び／又は診断を包含する。これらの方法は、そのような細胞の選択的検出及び／又は根絶を提供し、それによりＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴としない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。治療又は診断のための好ましい疾患は、腫瘍性疾患、特に本明細書で述べるような癌疾患などの、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与するものである。
１つの態様では、本発明は、本発明の抗体の１つ又は本発明の抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物及び診断組成物／キットを提供する。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含有してもよく、場合により１つ又はそれ以上のアジュバント、安定剤等を含有してもよい。特定実施形態では、組成物は、異なる抗原決定基に結合するか又は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣを誘導すること及びアポトーシスを誘導することのような、異なる機能特徴を有する抗体の組合せを含有する。本発明のこの実施形態では、抗体は、組合せとして、例えば２つ又はそれ以上の抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体を含有する医薬組成物として使用され得る。例えば、異なるが補完的な活性を有する抗ＧＴ４６８抗体を、所望の治療効果を達成するために単一療法において組み合わせることができる。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＤＣを媒介する抗ＧＴ４６８抗体を、アポトーシスを誘導する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合わせて含有する。もう１つの実施形態では、組成物は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の極めて有効な死滅を媒介する抗ＧＴ４６８抗体を、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合わせて含有する。
本発明はまた、本発明の２つ又はそれ以上の抗ＧＴ４６８抗体の同時又は連続投与を含み、好ましくは、上記抗体の少なくとも１つはキメラ抗ＧＴ４６８抗体であり、そして少なくとも１つのさらなる抗体はヒト抗ＧＴ４６８抗体であって、それらの抗体はＧＴ４６８の同じ抗原決定基又は異なる抗原決定基に結合する。好ましくは、本発明のキメラＧＴ４６８抗体を最初に投与し、次いで本発明のヒト抗ＧＴ４６８抗体を投与するが、ヒト抗ＧＴ４６８抗体は、好ましくは長期間にわたって、すなわち維持療法として投与される。
本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子及び組成物は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する細胞並びに／又はＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を選択的に死滅させるための、上記細胞の増殖を阻害する細胞及び／又は上記細胞を死滅させるように上記細胞を上記抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子又は組成物の有効量と接触させることによる様々な方法において使用することができる。１つの実施形態では、その方法は、場合によりエフェクター細胞の存在下で、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用によって、又はこれらの機構の２若しくはそれ以上の組合せによって、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させることを含む。本発明の抗体を使用して阻害するか又は死滅させることができる、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、癌細胞を含む。
本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子及び組成物は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する様々な疾患を、そのような疾患に罹患している患者に抗体を投与することによって治療する及び／又は予防するために使用できる。治療（例えば改善）できるか又は予防できる例示的な疾患は、腫瘍形成性疾患を含むが、これらに限定されない。治療できる及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態などの癌疾患を含む。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
本発明の１つの態様では、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の運動性、移動、浸潤、増殖及びコロニー形成から選択される１つ又はそれ以上の活性、好ましくは増殖及び／又はコロニー形成を阻害する方法であって、前記細胞を本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子又は組成物の有効量と接触させることを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様では、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患又は障害を治療するか又は予防する方法であって、本発明の抗体、複合体、二重特異性／多重特異性分子又は組成物を被験者に投与することを含む方法に関する。好ましくは、上記疾患又は障害は腫瘍関連疾患であり、特定実施形態では、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態からなる群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。ＧＴ４６８は、好ましくは前記細胞の表面上で発現される。
本発明は、腫瘍性疾患の予防及び／又は治療処置のための、すなわち腫瘍性疾患を有するか又は腫瘍性疾患を発症する危険性がある患者を治療するための、本明細書で述べる作用物質及び組成物の使用を含み得る。１つの態様では、本発明は、本明細書で述べる作用物質及び組成物の１つ又はそれ以上の投与を含む、腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
好ましくは、本明細書で述べる作用物質及び組成物は、胎盤組織及び／又は精巣組織のような、組織又は器官が腫瘍を有さない場合はその細胞がＧＴ４６８を実質的に発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面でのＧＴ４６８の発現によって特徴づけられる組織又は器官に、治療活性物質が送達されない又は実質的に送達されないような方法で投与される。このために、本明細書で述べる作用物質及び組成物は局所的に投与され得る。
本発明の１つの態様では、本明細書で述べる治療方法における使用のために本明細書で述べる抗体を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べる治療方法における使用のために本明細書で述べる医薬組成物を提供する。
本発明の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、化学療法剤、放射線、又はサイトカインなどの、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγ受容体の発現若しくは活性を調節する、例えば増強する若しくは阻害する物質で付加的に治療される。治療の間に投与するための典型的なサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。典型的な治療薬は、中でも特に、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソテール、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン及びシクロホスファミドなどの抗腫瘍薬を含む。
さらにもう１つの態様では、本発明は、抗体を得るためにマウスなどの非ヒト動物をヒトＧＴ４６８又はそのペプチドフラグメントで免疫する免疫方法に関する。免疫のための好ましいペプチドは、配列番号：２−１０及び３５−８２からなる群より選択されるもの又はそれらの誘導体である。従って、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号：２−１０及び３５−８２からなる群より選択されるペプチド又はそれらの誘導体を使用した免疫によって得られるものである。同様に、ＧＴ４６８に対する抗体は、遺伝子組換えマウスなどの遺伝子組換え非ヒト動物において作製できる。遺伝子組換え非ヒト動物は、抗体の全部又は一部をコードする重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子組換えマウスであり得る。
野生型並びに遺伝子組換え非ヒト動物は、ＧＴ４６８抗原並びに／又はＧＴ４６８を発現する核酸及び／若しくは細胞又はそのペプチドフラグメントの精製又は冨化製剤で免疫することができる。好ましくは、非ヒト動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ）を産生することができる。アイソタイプスイッチは、例えば古典的又は非古典的アイソタイプスイッチによって起こり得る。
従って、本発明のさらにもう１つの態様では、上述した非ヒト動物由来の単離Ｂ細胞を提供する。単離Ｂ細胞は、次に、本発明の抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供するために不死化細胞への融合によって不死化することができる。そのようなハイブリドーマ（すなわち本発明の抗体を産生する）も、本発明の範囲に包含される。
本発明のさらなる態様では、本発明の抗体を使用して、患者から単離された生物学的試料においてＧＴ４６８又はＧＴ４６８を発現する細胞及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を検出する及び／又はその量を測定することを含む、腫瘍性疾患の診断、検出又は観測のための方法に関する。生物学的試料は、腫瘍性疾患を有する若しくは腫瘍性疾患にかかることが疑われるか又は腫瘍性疾患についての潜在的可能性を有する患者から単離され得る。
本発明による腫瘍性疾患の診断、検出又は観測のための方法の１つの実施形態では、生物学的試料及び／又は対照／標準試料は、腫瘍性疾患による障害に関して診断、検出又は観測されることになる組織又は器官に対応する組織又は器官に由来する；例えば診断、検出又は観測される腫瘍性疾患は乳癌であり、生物学的試料及び／又は対照／標準試料は乳房組織である。そのような組織及び器官を、例えば種々の腫瘍性疾患及び癌に関連して、本明細書で述べる。
腫瘍性疾患の診断、検出又は観測のための方法の１つの実施形態では、生物学的試料は、組織又は器官が腫瘍を有さない場合はその細胞がＧＴ４６８を実質的に発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の実質的な結合によって特徴づけられない組織又は器官に由来する。好ましくは、前記組織は、胎盤組織又は精巣組織以外の組織である。
典型的には、生物学的試料中の標的分子のレベルを標準レベルと比較し、標準レベルからの逸脱が被験者における腫瘍性疾患の存在及び／又は病期を指示する。標準レベルは、対照試料（例えば健常組織又は健常被験者からの）において測定されたレベル又は健常被験者からの平均レベルであり得る。前記標準レベルからの「逸脱」は、何らかの有意の変化、例えば少なくとも１０％、２０％又は３０％、好ましくは少なくとも４０％又は５０％、又はそれ以上の上昇又は低下を表す。好ましくは、上記生物学的試料におけるＧＴ４６８の存在又はＧＴ４６８を発現する及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の存在、又は標準レベルと比較して高いＧＴ４６８の量又はＧＴ４６８を発現する及び／若しくはそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の量は、腫瘍性疾患の存在を示す。
典型的には、本発明の方法における検出及び／又は量の測定は、標的分子に特異的に結合する標識抗体の使用を含む。
本発明の特定の態様では、検出可能な標識に結合した本発明の抗体を患者に投与することを含む、腫瘍性疾患の検出、すなわち腫瘍性疾患の位置又は部位、例えば特定の組織又は器官の決定のための方法に関する。上記患者における組織又は器官の標識化は、上記組織又は器官における腫瘍性疾患の存在又は危険性を指示し得る。
本明細書で例示するように、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接入手できるか、又はクローニングして、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞又はリンパ球細胞）において組換え発現させることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌などの微生物及び酵母などの真菌である。あるいは、本発明の抗体は、遺伝子組換え非ヒト動物又は植物において組換え生産することができる。しかし、本発明はまた、抗体が、本明細書で開示される免疫方法を用いた免疫又はワクチン接種によって患者においてあるがままの状態で産生される実施形態も考慮する。
本発明の抗体を作製するための好ましいハイブリドーマ細胞は、以下の名称とアクセッション番号を有する、ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたものである：
１．２００７年３月１３日に寄託された、４Ｅ９−１Ｈ９、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２２
２．２００７年３月１３日に寄託された、９Ｂ６−２Ａ９、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２６
３．２００７年３月１３日に寄託された、５９Ｄ６−２Ｆ２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２４
４．２００７年３月１３日に寄託された、６１Ｃ１１−２Ｂ５、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２５
５．２００７年３月１３日に寄託された、７８Ｈ１１−１Ｈ６、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２３
６．２００８年３月１１日に寄託された、２２−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９５
７．２００８年３月１１日に寄託された、２２−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９３
８．２００８年３月１１日に寄託された、２２−９Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９６
９．２００８年３月１１日に寄託された、２３−３３Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９７
１０．２００８年３月１１日に寄託された、２３−１９Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９１
１１．２００８年３月１１日に寄託された、Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９４
１２．２００８年３月１１日に寄託された、４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９２
１３．２００８年３月１１日に寄託された、４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８９８
１４．２００８年９月１日に寄託された、４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９６１
１５．２００８年９月１日に寄託された、５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９６２
１６．２００８年９月１日に寄託された、１６−５Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４３
１７．２００８年９月１日に寄託された、２０−１１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５６
１８．２００８年９月１日に寄託された、２９−１Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４７
１９．２００８年９月２日に寄託された、２９−８Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９６４
２０．２００８年９月１日に寄託された、３５−４８Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５９
２１．２００８年９月１日に寄託された、３５−５０Ａ−２ａ、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９６３
２２．２００８年９月１日に寄託された、３８−１０Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５７
２３．２００８年９月１日に寄託された、３８−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５８
２４．２００８年９月１日に寄託された、４４−３Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４８
２５．２００８年９月１日に寄託された、４５−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４９
２６．２００８年９月１日に寄託された、４５−８Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５０
２７．２００８年９月１日に寄託された、４８−３Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５１
２８．２００８年９月１日に寄託された、４８−４Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５２
２９．２００８年９月１日に寄託された、４９−３Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４６
３０．２００８年９月１日に寄託された、４９−８Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４５
３１．２００８年９月１日に寄託された、５１−１Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９４４
３２．２００８年９月１日に寄託された、５３−１３Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５３
３３．２００８年９月１日に寄託された、５３−２９Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５５
３４．２００８年９月１日に寄託された、５４−４Ｂ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９６０
３５．２００８年９月１日に寄託された、５６−４Ａ−２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９５４
３６．２００９年７月１６日に寄託された、６２−９Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ３００１。
本発明の好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生される及び上述したハイブリドーマから得られるもの並びにそのキメラ及びヒト化形態である。本発明のさらなる好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生される及び上述したハイブリドーマから得られる抗体の特異性を有するもの及び、特に、上述したハイブリドーマによって産生される及び上述したハイブリドーマから得られる抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含むものである。
好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１７又は２４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントのようなヒト重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を含む抗体を包含する。さらなる好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１８又は２２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントのようなヒト軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体を包含する。特定の好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１７又は２４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントのようなヒトＣＨに由来するアミノ酸配列を有するＣＨを含み、且つ配列番号：１８又は２２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントのようなヒトＣＬに由来するアミノ酸配列を有するＣＬを含む抗体を包含する。
配列番号：１７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号：２０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：２４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号：２３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：１８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号：１９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号：２２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号：２１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。
上記で使用される「フラグメント」又は「アミノ酸配列のフラグメント」は、抗体配列の一部、すなわちＮ末端及び／又はＣ末端で短縮された抗体配列であり、抗体内で前記抗体配列に取って代わった場合、ＧＴ４６８への前記抗体の結合、及び好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解又はＡＤＣＣ媒介性溶解の機能を保持する配列に関する。好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。本明細書で述べるアミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列のそれぞれのフラグメントによってコードされ得る。
本発明はまた、本明細書で述べる抗体又はその部分、例えば抗体鎖をコードする遺伝子又は核酸配列を含む核酸に関する。核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ又は、例えば遺伝子工学において従来使用される別のベクター内に含まれ得る。ベクターは、適切な宿主細胞において及び適切な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含み得る。さらに、ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントを含み得る。そのような制御エレメントは当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット及び翻訳開始コドンを含み得る。
好ましくは、本発明の核酸は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする上記発現制御配列に作動可能に連結される。真核細胞又は原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。
本発明による核酸分子の構築のため、上記核酸分子を含むベクターの構築のため、適切に選択された宿主細胞へのベクターの導入のため、発現を生じさせるか又は達成するための方法は、当分野において周知である。
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸又はベクターを含有する宿主細胞に関する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
ＧＴ４６８は、癌細胞において異常に活性化される栄養膜系譜のマーカーである。（Ａ）正常組織、原発性乳癌試料及び癌細胞株における３５サイクルのエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ（１、ＭＣＦ−７；２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ；３、ＢＴ−５４９；４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；５、ＳＮＵ−１６；６、ＬＣＬＣ−１０３Ｈ；７、ＫＹＳＥ−５１０；８、ＫＹＳＥ−３０；９、ＥＦＯ−２７；１０、ＴＯＶ−２１Ｇ；１１、ＴＯＶ−１１２Ｄ；１２、ＣＡＯＶ−３；１３、ＥＦＯ−２１；１４、ＦＵ−ＯＶ−１；１５、ＬＮＣＡＰ；１６、ＣＡＰＡＮ−２）。（Ｂ）正常組織（１、精巣；２、胎盤；３、脳；４、肺；５、乳房；６、結腸；７、肝臓；８、胃；９、腎臓；１０、前立腺；１１、膵臓；１２、卵巣；１３、脾臓；１４、皮膚；１５、心筋；１６、子宮内膜；１７、静止ＰＢＭＣ；１８、増殖ＰＢＭＣ；１９、副腎）、原発性乳癌試料及び（Ｃ）癌細胞株における４０サイクルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８サイレンシングの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｅ）ｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８タンパク質発現の低下のウエスタンブロット分析。対照細胞は、未処理であるか又はスクランブル非サイレンシング二本鎖（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。（Ｆ）正常及び腫瘍ヒト組織におけるＧＴ４６８タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。（Ｇ）ＧＴ４６８特異的抗体を使用した正常ヒト乳房組織（左）及び乳癌（右）に由来する切片の免疫組織化学。 ＧＴ４６８は細胞表面結合タンパク質である。ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１）又は非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）によるトランスフェクション後の抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体での（Ａ）メタノール固定染色及び（Ｂ）非固定ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞の染色。 ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の運動性、移動及び浸潤を促進する。（Ａ）上部並びに下部チャンバーに添加した５％ＦＣＳによるトランスウエル移動アッセイにおけるケモキネシス（運動性）分析を１２時間後に実施した。（Ｂ）勾配を得るために５％ＦＣＳを下部チャンバーだけに添加してから１２時間後のトランスウエル移動アッセイにおけるＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の走化性分析。（Ｃ）５％ＦＣＳを化学誘引物質として下部チャンバーに添加した２４時間後のＭａｔｒｉｇｅｌへの走化性浸潤の分析。 ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の増殖を促進する。（Ａ）ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によってノックダウンを開始させてから７２時間後のＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞における増殖の分析。（Ｂ）種々の細胞周期状態での細胞画分の棒グラフとして示した、ＧＴ４６８サイレンシングの開始から７２時間後の細胞の細胞周期分析。（Ｃ）ｓｉＲＮＡの形質転換した７２時間後にアネキシンＶ染色によって測定した細胞のアポトーシス。アネキシンＶ染色に対する陽性対照として細胞を６μＭカンプトテシンで１２時間処理した。 ＧＴ４６８は機能拮抗性抗体による標的となり得る。種々の量の抗ＧＴ４６８抗体及び対照抗体（アイソタイプ対照）と共に４８時間増殖させた後のＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の増殖分析。 サイクリンＤ１及びＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。細胞をＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖で７２時間処理した後のサイクリンＤ１の（Ａ）定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析及び（Ｂ）ウエスタンブロット分析。（Ｃ）ＧＴ４６８ノックダウンの７２時間後及び（Ｄ）抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体による処理の１時間後のＡＫＴ Ｓｅｒ４７３リン酸化のウエスタンブロット分析。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清は、免疫のために使用したペプチドとのみ反応性である。 ＧＴ４６８に対して惹起した抗体を含有するハイブリドーマ上清による、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰを形質転換したＣＨＯ細胞の染色。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８−ｅＧＦＰを発現する細胞を特異的に染色する。 ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。ハイブリドーマ上清と共に７２時間反応した後の種々の癌細胞株の増殖分析。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するための粗溶解産物（ＣｒＥＬＩＳＡ）（Ａ）又はペプチド特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８溶解産物（Ａ）又は免疫のために使用したそれぞれのペプチド（Ｂ）とのみ反応性である。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのフローサイトメトリー分析。すべてのハイブリドーマ上清はＧＴ４６８形質転換体の特異的染色を示したが、偽の形質転換体では染色を認めなかった。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを形質転換したＨＥＫ２９３細胞の溶解産物との特異的反応性を示したが、偽の形質転換体の溶解産物はシグナルを示さなかった。偽の溶解産物中のハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ ＧＴ４６８溶解産物のスピルオーバーによるものである。 ＧＴ４６８タンパク質における抗体結合エピトープを同定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１は各々、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆する２つのオーバーラップペプチドへの結合を示した。２２−２Ａ−１及び２２−９Ｂ−１の結合パターンは、ＧＴ４６８タンパク質の配座エピトープ（不連続エピトープ）に対する反応性を示唆する。 ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間又は１２０時間反応した後の異なる癌細胞株の増殖分析。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのフローサイトメトリー分析。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８ａａ１１６〜２１２を形質転換した細胞の特異的染色を示したが、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった。 ＧＴ４６８を内因性に発現する非固定腫瘍細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞）へのモノクローナル抗体の特異的結合を測定するためのフローサイトメトリー分析。ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。抗体は、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞に結合することができる。 ＧＴ４６８を内因性に発現する非固定腫瘍細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞）へのモノクローナル抗体の特異的結合を測定するためのフローサイトメトリー分析。ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。抗体は、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞に結合することができる。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８発現プラスミドを形質転換したＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示したが、偽の形質転換体の溶解産物はシグナルを示さなかった。 ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間増殖した後の種々の癌細胞株の増殖分析。 ＧＴ４６８を内因性に発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞のコロニー形成への、ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体の阻害活性を分析するためのクローン原性アッセイ。細胞を抗体と共に反応することはコロニー形成を低減又は阻害した。 リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した、正常組織におけるＧＴ４６８発現の定量。３名の個人からの組織を各々の正常組織型に関して試験した。微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を越える正常組織は胎盤と精巣だけであった。誤差バー、ＳＴＤ。乳癌（図１参照）に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌及び頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現が認められた。 リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した、正常組織におけるＧＴ４６８発現の定量。３名の個人からの組織を各々の正常組織型に関して試験した。微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を越える正常組織は胎盤と精巣だけであった。誤差バー、ＳＴＤ。乳癌（図１参照）に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌及び頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現が認められた。 癌細胞株におけるＧＴ４６８発現のウエスタンブロット分析。ＧＴ４６８の発現は、ＧＴ４６８発現プラスミド（陽性対照）、ＳＫ−ＢＲ−３（乳癌）、ＢＥＷＯ（胎盤性絨毛癌）、ＪＡＲ（胎盤性絨毛癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＬｎＣａＰ（前立腺癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＪＥＧ−３（胎盤性絨毛癌）、ＪＩＭＴ−１（乳癌）、ＬＡ１−５５ｎ（神経芽細胞腫）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＢＴ−２０（乳癌）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（骨髄腫）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において検出された。ＭｅｌＨＯ（悪性黒色腫）及びＮＵＧＣ４（胃癌）は試験陰性であった。 ＧＴ４６８は機能拮抗性モノクローナル抗体による標的となり得る。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間反応した後のＧＴ４６８陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞及びＧＴ４６８陰性ＮＵＧＣ４胃癌細胞の増殖分析。 ハイブリドーマ上清中のＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８発現プラスミドを形質転換したＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示したが、偽の形質転換体の溶解産物はシグナルを示さなかった。 抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体による処置は、ヌードマウスにおいてＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌異種移植腫瘍の増殖を減弱させる。ＢＥＷＯ細胞の皮下注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回、２週間にわたって処置した。 ＧＴ４６８タンパク質における抗体結合エピトープを同定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清２９−８Ｂ−１、３５−４８Ｂ−１、４４−３Ａ−２、４９−３Ａ−１、４９−８Ａ−１、５１−１Ａ−１、５３−１３Ａ−２及び６２−９Ｂ１は各々、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆する１つ又はそれ以上のオーバーラップペプチドへの結合を示した。２９−１Ａ−２及び５４−４Ｂ−２の結合パターンは、ＧＴ４６８タンパク質の配座エピトープ（不連続エピトープ）に対する反応性を示唆する。 抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体による処置は、実験的転移アッセイにおいてＭＣＡＦ−７乳癌細胞の転移拡大を有意に低減する。１×１０６のＭＣＦ−７細胞の静脈内注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回処置した。動物の肺における転移腫瘍量を、接種の５週間後にヒトマイクロサテライトＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを使用した定量的ＰＣＲによって測定した。
用語の定義
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明全体を通じて述べる。
「ＧＴ４６８」という用語は、好ましくはヒトＧＴ４６８、特に（ｉ）配列番号：１の核酸配列を含む核酸のような、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸又は（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、前記配列のあらゆる変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、配座変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体及び種ホモログ、特に天然に存在するものを包含する。対立遺伝子変異体は遺伝子の正常配列の変化に関するものであり、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子についての数多くの対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸又はアミノ酸配列が起源とするものとは異なる種を起源とする核酸又はアミノ酸配列である。「ＧＴ４６８」という用語は、（ｉ）ＧＴ４６８スプライス変異体、（ｉｉ）特にＮグリコシル化状態のような異なるグリコシル化を有する変異体を含む、ＧＴ４６８の翻訳後修飾変異体、（ｉｉｉ）ＧＴ４６８配座変異体、（ｉｖ）ＧＴ４６８癌関連及びＧＴ４６８非癌関連変異体を包含する。
１つの実施形態では、「ＧＴ４６８」という用語は、細胞外ドメイン又はエクトドメインに対応するＧＴ４６８の部分に関し、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを含まないＧＴ４６８のアミノ酸配列に関する。「ＧＴ４６８」という用語は、配列番号：２のアミノ酸２９〜１１９、好ましくはアミノ酸２９〜２１２、より好ましくはアミノ酸２３〜２１２又は配列番号：２の変異体の対応するアミノ酸を含むタンパク質を包含する。
本発明によれば、ＧＴ４６８についての「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」という用語は、ＧＴ４６８を発現する細胞の表面に結合して認められるＧＴ４６８の部分に関する。好ましくは、上記「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」は細胞外画分に存在する。ＧＴ４６８の「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」は、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを欠く完全長ＧＴ４６８の部分を指す。本発明によれば、ＧＴ４６８についての「疎水性ドメイン」という用語は、細胞外ドメインの一部ではなく、好ましくはＧＴ４６８のＮ末端近傍に位置する疎水性配列を含むＧＴ４６８の部分に関する。ＧＴ４６８の「疎水性ドメイン」は、ＧＴ４６８の疎水性配列に先行し、Ｎ末端に位置する配列を含み得る。配列番号：２に関して、Ｎ末端疎水性ドメインは、好ましくはアミノ酸１〜２２を含む。本発明のＧＴ４６８ポリペプチドに関して同定されるいかなる疎水性ドメイン又は配列も、疎水性ドメイン又は配列を同定するために当分野で通常使用される判定基準に従って同定されることが了解される。疎水性ドメインの正確な境界は異なり得るが、おそらく本明細書で最初に同定されるドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸以下が異なると考えられる。場合により、それ故、ＧＴ４６８ポリペプチドの細胞外ドメインは、本明細書で同定される疎水性ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの側に約５又はそれ以下のアミノ酸を含み得る。
「細胞表面」は、当分野における通常の意味に従って使用され、タンパク質及び他の分子による結合のためにアクセス可能な細胞の外側を含む。
「細胞の表面上で発現されるＧＴ４６８」という表現は、細胞によって発現されるＧＴ４６８が上記細胞の表面と結合して認められることを意味する。
ＧＴ４６８は、細胞の表面に位置する場合、前記細胞の表面と結合しており、細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合のためにアクセス可能である。好ましい実施形態では、その細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞は、ＧＴ４６８を発現する細胞である。ＧＴ４６８が細胞によって発現される場合、前記細胞の表面と結合したＧＴ４６８は、発現されるＧＴ４６８の一部だけ、特に上記で定義したその細胞外ドメインだけであってもよいことを理解されたい。
本発明によれば、発現及び／又は結合のレベルが胎盤細胞又は胎盤組織における発現及び／又は結合と比較してより低い場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されない及び／又は細胞表面と実質的に結合していない。好ましくは、発現及び／又は結合のレベルは、胎盤細胞又は胎盤組織における発現及び／又は結合の１０％未満、好ましくは５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％又は０．０５％未満であるか又はさらにより低い。好ましくは、発現及び／又は結合のレベルが、脳、肺、乳房、結腸、肝臓、胃、腎臓、前立腺、膵臓、卵巣、脾臓、皮膚、心筋及び子宮内膜の１つ又はそれ以上の非腫瘍形成性、非癌性組織における発現及び／又は結合のレベルを２倍だけ、好ましくは１．５倍だけ上回る、好ましくは前記非腫瘍形成性、非癌性組織における発現及び／又は結合のレベルを超えない場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されない及び／又は細胞表面と実質的に結合していない。好ましくは、発現若しくは結合のレベルが検出限界より下である場合及び／又は発現若しくは結合のレベルが細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合を可能にするには低すぎる場合、ＧＴ４６８は細胞において実質的に発現されない及び／又は細胞表面と実質的に結合していない。
本発明によれば、発現及び／又は結合のレベルが、脳、肺、乳房、結腸、肝臓、胃、腎臓、前立腺、膵臓、卵巣、脾臓、皮膚、心筋及び子宮内膜の１つ又はそれ以上の非腫瘍形成性、非癌性組織における発現及び／又は結合のレベルを好ましくは２倍以上、好ましくは１０倍、１００倍、１０００倍又は１００００倍上回る場合、ＧＴ４６８は細胞において発現される及び／又は細胞表面と結合している。好ましくは、発現若しくは結合のレベルが検出限界より上である場合及び／又は発現若しくは結合のレベルが細胞に添加されたＧＴ４６８特異的抗体による結合を可能にするのに十分なだけ高い場合、ＧＴ４６８は細胞において発現される及び／又は細胞表面と結合している。好ましくは、細胞において発現されるＧＴ４６８は、前記細胞の表面上で発現されるか又は表面上に露出されている。
「ラフト」という用語は、細胞の形質膜の外葉領域に位置するスフィンゴ脂質及びコレステロールに富む膜マイクロドメインを指す。特定のタンパク質がそのようなドメイン内で結合する能力及び「集合体」又は「巣状集合体」を形成するそれらの能力は、タンパク質の機能を生じさせることができる。例えば、そのような構造体内へのＧＴ４６８分子の転位は、本発明の抗体によって結合された後、形質膜において高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体を形成する。そのような高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体は、ＣＤＣの間の補体系の効率的な活性化を可能にし得る。
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書で述べる癌の形態を含む、何らかの病的状態を指す。
「ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患」は、本発明によれば、疾患組織又は器官の細胞における発現及び／又は結合が、好ましくは健常組織又は器官における状態と比較して上昇していることを意味する。上昇は、少なくとも１０％、特に２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％又はさらにそれ以上の上昇を指す。１つの実施形態では、発現及び／又は細胞表面との結合は疾患組織においてのみ認められ、一方健常組織における発現は抑制される。本発明によれば、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞に関連する疾患は、癌疾患などの腫瘍性疾患を含む。さらに、本発明によれば、癌疾患などの腫瘍性疾患は、好ましくは腫瘍細胞又は癌細胞がＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられるものである。
本明細書で使用される、「腫瘍性疾患」、「腫瘍関連疾患」又は［腫瘍形成性疾患］は、腫瘍及び／又は腫瘍転移の生成又は生成する傾向をもたらし得る、異常に調節された細胞成長、増殖、分化、接着及び／又は移動によって特徴づけられる疾患を包含する。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常な細胞を意味する。
「腫瘍」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける細胞又は組織の異常な群を意味する。腫瘍は、構造機構及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は、良性、前悪性又は悪性のいずれかであり得る、独特の組織塊を形成する。
好ましくは、本発明による「腫瘍性疾患」、「腫瘍関連疾患」又は「腫瘍形成性疾患」は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、「腫瘍性疾患」、「腫瘍関連疾患」又は「腫瘍形成性疾患」は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞によって特徴づけられ、腫瘍細胞は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする。
ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、好ましくは腫瘍細胞又は癌細胞であり、好ましくは本明細書で述べる腫瘍及び癌の腫瘍細胞又は癌細胞である。好ましくは、そのような細胞は、胎盤細胞及び／又は精巣細胞以外の細胞である。
本発明による好ましい癌疾患又は癌は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態からなる群より選択される。１つの実施形態では、癌疾患は、肺の転移性癌からなる群より選択される。
本発明によれば、「癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、器官の内層（上皮細胞）から発症する癌である。
胎盤性絨毛癌は、通常は胎盤の、悪性で栄養膜性及び高侵襲性の癌である。胎盤性絨毛癌は肺への早期血行性転移を特徴とする。
肉腫は、中胚葉の増殖を生じさせる結合組織（骨、軟骨、脂肪）の癌である。これは、上皮起源である癌腫と大きく異なる。
腎細胞癌又は腎細胞腺癌としても知られる腎細胞癌腫は、血液をろ過して老廃物を除去する腎臓内の非常に小さな管である、近位曲尿細管の内層に由来する腎癌である。腎細胞癌腫は、成人における群を抜いて最も一般的なタイプの腎癌であり、すべての尿生殖器腫瘍の中で最も致死的である。腎細胞癌腫の異なるサブタイプは、明細胞腎細胞癌及び乳頭状腎細胞癌である。明細胞腎細胞癌は最も一般的な形態の腎細胞癌腫である。顕微鏡で見ている時、明細胞腎細胞癌を構成する細胞は、非常に色が薄い又は透明に見える。乳頭状腎細胞癌は２番目に頻度の高いサブタイプである。これらの癌は、腫瘍の、大部分ではないにせよ一部においては、小指様の突起（乳頭と呼ばれる）を形成する。
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔及び脈管に侵入するための内皮基底膜の貫通、及び次に、血液によって運搬された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後にも起こり、これは、腫瘍細胞又は成分が残存し、転移能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍及び所属リンパ節系から遠く離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
続発性又は転移性腫瘍の細胞はもとの腫瘍におけるものと同様である。これは、例えば、卵巣癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、異常な肝細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成される。肝臓における腫瘍は、その場合、肝癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
「疾患の治療」という用語は、疾患又はその症状を治癒する、期間を短縮する、改善する、予防する、進行若しくは悪化を遅らせる若しくは阻止する、又は発症を予防する若しくは遅延させることを包含する。
「患者」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長動物又は別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物又はマウス及びラットなどのげっ歯動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
本発明によれば、試料は、本発明において有用な任意の試料、特に体液を含む組織試料及び／又は細胞試料のような生物学的試料であり得、パンチ生検を含む組織生検のような従来の方法で、及び血液、気管支吸引物、痰、尿、便又は他の体液を採取することによって入手し得る。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の画分を包含する。
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。「抗体」という用語はまた、抗体のすべての組換え体、特に本明細書で述べる抗体のすべての組換え体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体並びに本明細書で述べる何らかの抗原結合抗体画分及び誘導体のすべての組換え体を包含する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨとＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子であって、分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含み得るか又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得るか又は１若しくはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る、例えばヒト免疫グロブリンにより密接に類似するように修飾され得る。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。また別の形態は、もとの抗体に比べて変化した１つ又はそれ以上のＣＤＲを有する。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の各々の一部が、特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する抗体内の対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントは別の抗体内の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、例えばヒト細胞試料に由来する定常領域と組み合わせて、可変領域が、容易に入手可能なＢ細胞又は非ヒト宿主生物からのハイブリドーマを使用して現在公知のソースから好都合に誘導できることである。可変領域は調製の容易さという利点を有し、その特異性はソースに影響されないが、ヒトである定常領域は、抗体を注射したとき非ヒトソースからの定常領域の場合よりもヒト被験者から免疫応答を惹起する可能性が低い。しかし、前記定義はこの特定例に限定されない。
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「結合部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって遂行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていてもよい２つ又はそれ以上の単離ＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号及び同第２００３／０１３３９３９号に開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
「ｅｐｉｔｏｐｅ」という用語は、抗体に結合することができるタンパク質決定基を意味し、その場合「結合」という用語は、本明細書では、好ましくは特異的結合に関する。抗原決定基は、通常はアミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群からなり、一般に特異的な三次元構造上の特徴並びに特異的な電荷特性を有する。配座及び非配座抗原決定基は、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないことによって区別される。
本明細書で使用される「不連続抗原決定基」という用語は、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の配座抗原決定基を意味する。
「二重特異性分子」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する何らかの物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し得るか又はそれらと相互作用し得る。「多重特異性分子」又は「ヘテロ特異性分子」という用語は、３以上の異なる結合特異性を有する何らかの物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合し得るか又はそれらと相互作用し得る。従って、本発明は、ＧＴ４６８に対する、及びエフェクター細胞上のＦｃ受容体のような他の標的に対する、二重特異性、三重特異性、四重特異性及び他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はまた、ダイアボディを包含する。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を許容するには短すぎるリンカーを使用して、それにより前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３参照）。
本発明はまた、本発明のために「抗体」という用語によって包含される、本明細書で述べる抗体の誘導体を含む。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体ともう１つ別の物質又は抗体の複合体を指す。本明細書で使用される場合、抗体が動物を免疫することによって又は免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによってある系から得られ、選択された抗体が、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一である場合、その抗体は特定の生殖細胞系配列に「由来する」。典型的には、特定生殖細胞系配列に由来する抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の相違、より好ましくは５個以下、又はさらに一層好ましくは４、３、２又は１個以下のアミノ酸相違を示す。
本明細書で使用される、「ヘテロ抗体」という用語は、共に連結された２つ又はそれ以上の抗体、それらの誘導体又は抗原結合領域であって、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有するものを指す。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、及び標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原又は抗原決定基に対する結合特異性を含む。
本明細書で述べる抗体はヒト抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば試験管内でのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって又は細胞内での体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体は、特定の抗原決定基に対する単一の結合特異性及び親和性を示す。１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、非ヒト動物、例えばマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子組換え又はトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）又はそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかの他の手段によって調製された、発現された、作製された又は単離された抗体などの、組換え手段によって調製される、発現される、作製されるか又は単離されるすべての抗体を包含する。
「トランスフェクトーマ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を包含する。
本明細書で使用される、「異種抗体」は、そのような抗体を産生する遺伝子組換え生物に関連して定義される。この用語は、遺伝子組換え生物で構成されない生物において認められるものに対応する、及び一般に遺伝子組み換え生物以外の種に由来するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を指す。
本明細書で使用される、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
本明細書で述べる抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、ＧＴ４６８に特異的に結合する単離抗体は、ＧＴ４６８以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒトＧＴ４６８の抗原決定基、イソ型又は変異体に特異的に結合する単離抗体は、しかし、他の関連抗原、例えば他の種からの関連抗原（例えばＧＴ４６８種ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、実質的に他の細胞物質及び／又は化学物質不含であり得る。本発明の１つの実施形態では、「単離」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、十分に定義された組成で組み合わされた抗体に関する。
本発明による「結合」という用語は、好ましくは、特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体のような物質が、それが特異的である抗原又は抗原決定基などの（あらかじめ定められた）標的に対し、別の標的への結合に比べてより強く結合することを意味する。ある物質が第一標的に対して第二標的についての解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数で結合する場合、その物質は第二標的に比べて第一標的により強く結合する。好ましくは、物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、その物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）よりも１０倍上、好ましくは２０倍、より好ましくは５０倍、さらに一層好ましくは１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍よりも低い。典型的には、抗体は、約１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤに相当する親和性で結合し、あらかじめ定められた抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性より少なくとも２桁低いＫＤに相当する親和性であらかじめ定められた抗原に結合する。
「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図されている。
本明細書で使用される、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
本明細書で使用される、「アイソタイプスイッチ」は、それによって抗体のクラス又はアイソタイプがある１つのＩｇクラスからその他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
物体に適用される場合の、本明細書で使用される「天然に生じる」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、自然界で供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ基本的に完全なＶＨ又はＶＬドメインをコードする配座においてＤ−Ｊ又はＪセグメントにすぐ隣接して位置する、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定できる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有する。
Ｖセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」又は「生殖細胞系配置」という用語は、ＶセグメントがＤ又はＪセグメントにすぐ隣接するように組み換えられていない配置を指す。
「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を包含することが意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本発明において述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）試験管内で、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動分画によって精製された、又は（ｖｉ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作のために使用可能な核酸である。
核酸は、本発明によれば、単独で又は同種若しくは異種であり得る他の核酸との組合せで存在し得る。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して同種又は異種であり得る発現制御配列に機能的に連結されており、この場合「同種」という用語は、核酸が天然の状態でも発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
ＲＮＡ及び／又はタンパク質若しくはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が、その後、コード配列に機能的に連結された発現制御配列により機能的タンパク質へと翻訳されるはずである場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こさずに又は前記コード配列が所望のタンパク質若しくはペプチドへと翻訳されることができない事態を引き起こさずに、前記核酸の転写を生じさせる。
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを包含する。本発明の特定実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の正確な構造は種又は細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５'非転写配列並びに５'及び３'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流活性化配列を含み得る。
本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列に対して上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識及び結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識及び結合部位を含み得る。プロモーターは、原核生物又は真核生物遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは「誘導的」であり得、誘導物質に応答して転写を開始させ得るか、又は転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導的プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は発現されないか又はわずかだけ発現される。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入るか又は転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
本発明による好ましいプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼについてのプロモーター、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びある部分又は複数の部分が、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のような他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターのある部分又は複数の部分に融合しており、付加的なイントロンを含むか又は含まない、それらの人工ハイブリッドプロモーター（例えばＣＭＶ）を包含する。
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産又はＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この語はまた、核酸の部分的発現を包含する。さらに、発現は一過性又は安定に行われ得る。
好ましい実施形態では、核酸分子は、本発明によれば、適切な場合は核酸の発現を制御するプロモーターと共に、ベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核及び／又は真核細胞に導入され、適切な場合はゲノム内に組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間媒体を包含する。この種のベクターは、好ましくは細胞において複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
抗体の発現のためのベクターとして、抗体重鎖と軽鎖が異なるベクター内に存在するベクター型又は重鎖と軽鎖が同じベクター内に存在するベクター型のいずれかが使用できる。
特定の核酸配列及びアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書で与える教示は、上記特定配列と機能的に等価の配列、例えば特定アミノ酸配列の性質と同じ又は類似の性質を示すアミノ酸配列及び特定核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の性質と同じ又は類似の性質を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じさせる、前記特定配列の修飾型にも該当するように解釈されるべきである。同様に、特定抗体又は特定抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細書で与える教示は、特定抗体のアミノ酸配列及び／又は核酸配列と比較して修飾されているが機能的に等価であるアミノ酸配列及び／又は核酸配列によって特徴づけられる抗体にも該当するように解釈されるべきである。１つの重要な性質は、その標的への抗体の結合を保持すること又は抗体のエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定配列に関して修飾された配列は、それが抗体内の前記特定配列に取って代わったときＧＴ４６８への前記抗体の結合を保持し、及び好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解又はＡＤＣＣ媒介性溶解の機能を保持する。
特にＣＤＲ、超可変領域及び可変領域の配列は、ＧＴ４６８に結合する能力を失わずに修飾され得ることが当業者に認識される。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書で指定する抗体領域に同一であるか又は高度に相同である。「高度に相同」により、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１若しくは２の置換がＣＤＲ内で為され得ることが企図される。加えて、超可変領域及び可変領域は、本明細書で具体的に開示する領域と実質的な相同性を示すように修飾され得る。
本明細書で述べる特定の核酸はまた、特定の宿主細胞又は生命体においてコドン使用頻度を最適化するために修飾された核酸を包含することを理解されたい。生物間でのコドン使用頻度の相違は、異種遺伝子発現に関する様々な問題を導き得る。もとの配列の１つ又はそれ以上のヌクレオチドを変化させることによるコドン最適化は、核酸が発現されるはずである同種又は異種宿主における前記核酸の発現の最適化、特に翻訳効率の最適化をもたらすことができる。例えば、ヒトに由来し、抗体の定常領域及び／又はフレームワーク領域をコードする核酸を、例えばキメラ又はヒト化抗体を作製するために本発明に従って使用する場合、特に、場合により本明細書で述べる他の生物に由来する核酸などの異種核酸に融合した前記核酸を、マウス又はハムスターなどのヒトとは異なる生物からの細胞において発現させる場合は、コドン使用頻度の最適化のために前記核酸を修飾することが好ましいと考えられる。例えば、それぞれ配列番号：１９及び２０に従った核酸配列のようなヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸配列は、最適化されたコドン使用頻度をもたらすがアミノ酸配列の変化は生じさせない、１つ又はそれ以上、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０及び好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０又は１００まで又はそれ以上のヌクレオチド置換を含むように修飾することができる。そのようなヌクレオチド置換は、好ましくは、配列番号：１９及び２０と、それぞれ、それらの修飾された対応物との以下のアラインメントに示す置換から選択され、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない、それぞれ配列番号：１９及び２０内のヌクレオチドの置換に関するか、又はそれぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする他の核酸配列内の対応位置での対応する置換に関する。好ましくは、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない、配列番号：１９及び２０と、それぞれ、それらの修飾された対応物との以下のアラインメントに示す置換はすべて、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸配列内で生じる。
配列番号：１９と配列番号：２１のアラインメント：
配列番号：２０と配列番号：２３のアラインメント：
さらに、本発明によれば、本明細書で述べるアミノ酸配列、特にヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を、所望の別模式標本、例えば白人母集団において認められる別模式標本に配列を適合させるように修飾することは望ましいと考えられる。そのような修飾は、好ましくは配列番号：１７内の又は他のヒト重鎖定常領域内の対応する位置での以下のアミノ酸置換：Ｋ９３Ｒ、Ｄ２３５Ｅ及びＬ２３７Ｍからなる群より選択される。好ましくは、これらの修飾のすべてがヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列に含まれる。
本発明によれば、「対応する位置」という用語は、２つの核酸又はタンパク質配列の配列アラインメントにおいて互いに整列されるヌクレオチド又はアミノ酸残基に関する。
本発明によれば、核酸配列、アミノ酸配列又はペプチドの変異体、誘導体、修飾形態又はフラグメントは、好ましくは、それぞれそれが由来する核酸配列、アミノ酸配列又はペプチドの機能特性を有する。そのような機能特性は、他の分子との相互作用又は他の分子への結合を含む。１つの実施形態では、核酸配列、アミノ酸配列又はペプチドの変異体、誘導体、修飾形態又はフラグメントは、それぞれそれが由来する核酸配列、アミノ酸配列又はペプチドと免疫学的に等価である。
好ましくは、特定核酸配列と、前記特定核酸配列に関して修飾された又は前記特定核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。ＧＴ４６８核酸変異体に関して、同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００又は少なくとも約６３０ヌクレオチドの領域にわたって与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、配列表に示す核酸配列などの参照核酸配列の全長にわたって与えられる。好ましくは、２つの配列は、互いにハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができ、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（厳しい条件）下で実施される。厳しい条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに述べられており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを転写した膜を、例えば２×ＳＳＣ中室温で、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体及び／又はアミノ酸置換変異体を含む。
好ましくは、実質的な相同性を示すアミノ酸配列間のような、特定アミノ酸配列と、上記特定アミノ酸配列に関して修飾された、又は上記特定アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。ＧＴ４６８ポリペプチド変異体に関して、類似性又は同一性の程度は、好ましくは少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０又は２１２アミノ酸の領域にわたって与えられる。好ましい実施形態では、類似性又は同一性の程度は、配列表に示すアミノ酸配列などの参照アミノ酸配列の全長にわたって与えられる。
上述した修飾配列又は配列変異体はすべて本発明の範囲内である。
「配列類似性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドの割合を示す。
「同一性パーセント」は最良の配列後に得られ、このパーセントは純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はランダムに及びそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、それらを最適に整列した後これらの配列を比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために断片ごとに又は「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適の配列は、手操作に加えて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、又はこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で除して、これら２つの配列間の同一性パーセントを得るために得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似度に基づいて為され得る。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む；（ｃ）正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む；並びに（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）の群の中で実施され得る。加えて、グリシンとプロリンは、αへリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。一部の好ましい置換は、以下の群：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；及び（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩにおいて実施され得る。公知の遺伝暗号、並びに組換え及び合成ＤＮＡ技術を考慮して、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
本発明は、抗体の機能又は薬物動態特性を変化させるためにＦｃ領域内で変更が加えられた抗体を包含する。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合とＣＤＣ又はＦｃγＲ結合とＡＤＣＣの低下又は上昇を生じさせ得る。置換は、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１つ又はそれ以上において実施でき、それにより、修飾抗体と比較して、抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能の変化を生じさせ得る。米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号参照。
抗体の細胞内における半減期は、分子が無傷ＣＨ２ドメイン又は無傷Ｉｇ Ｆｃ領域を含まないようにＩｇ定常ドメイン又はＩｇ様定常ドメインのサルベージ受容体抗原決定基を修飾することによって改善できる。米国特許第６，１２１，０２２号及び同第６，１９４，５５１号参照。細胞内における半減期は、Ｆｃ領域内に突然変異を作製することによって、例えば２５２位のロイシンをトレオニンに置換することによって、２５４位のセリンをトレオニンに置換することによって、又は２５６位のフェニルアラニンをトレオニンに置換することによってさらに延長できる。米国特許第６，２７７，３７５号参照。
さらに、抗体のエフェクター機能を変化させるために抗体のグリコシル化パターンを改変することができる。例えば、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性を高め、ひいてはＮＫ細胞の存在下で抗体のＡＤＣＣ上昇を生じさせるために、通常はＦｃ領域の２９７位のＡｓｎに結合するフコース単位を付加しないトランスフェクトーマにおいて抗体を発現させることができる。Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ，２７７：２６７３３参照。さらに、ＣＤＣを改変するためにガラクトシル化の修飾が実施できる。
あるいは、もう１つの実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、抗ＧＴ４６８抗体コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに突然変異を導入することができ、生じる改変された抗ＧＴ４６８抗体を結合活性に関してスクリーニングできる。
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も表すことが意図されていると理解されるべきである。突然変異又は環境影響のいずれかのためにある種の修飾が後継世代において起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがあるが、それでもなお本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に包含される。組換え宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞及びリンパ球細胞などのトランスフェクトーマを含む。
本明細書で使用される、「被験者」という用語は、あらゆるヒト又は非ヒト動物を包含する。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類等のような哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。
「遺伝子組換え動物」という用語は、１つ又はそれ以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖及び／若しくは軽鎖導入遺伝子、又は導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡに組み込まれているか又は組み込まれていない）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現することができる動物を指す。例えば、遺伝子組換えマウスは、マウスが、ＧＴ４６８抗原及び／又はＧＴ４６８を発現する細胞で免疫された場合ヒト抗ＧＴ４６８抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子又はヒト重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、遺伝子組換えマウス、例えばＨＣｏ７又はＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込まれ得るか、又はヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持され得る。そのような遺伝子組換え及びトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＥ）を産生することができると考えられる。
本明細書で使用される「低減する」又は「阻害する」とは、レベル、例えば細胞増殖のレベルの全体的低下、好ましくは５％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７５％又はそれ以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。
「細胞の活性を阻害する」という語句又は同様の語句は、細胞の活性の完全な又は基本的に完全な阻害及び細胞の活性の低下を包含する。好ましくは、上記の細胞の活性の阻害は、腫瘍細胞の増殖を低減し及び／又は腫瘍細胞の死を誘導し、それ故、腫瘍阻害作用又は腫瘍破壊作用を有する。
ｍＡｂの作用機構
以下は、本発明の抗体の治療効果の基礎となる機構についての考察を提供するものであるが、いかなる意味においても本発明を限定するとみなされるべきではない。
本明細書で述べる抗体は、好ましくはＡＤＣＣ又はＣＤＣを介して、免疫系の成分と相互作用し得る。本発明の抗体はまた、ペイロード（例えば放射性同位体、薬剤又は毒素）を標的として腫瘍細胞を直接死滅させるためにも使用でき、又は伝統的な化学療法剤と協力作用的に使用して、化学療法剤のＴリンパ球への細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る補完的な作用機構を通して腫瘍を攻撃することができる。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＧＴ４６８に結合することによって、それ故、例えば細胞の増殖をブロックすることによって、作用を及ぼし得る。
抗体依存性細胞媒介毒性
ＡＤＣＣは、好ましくは抗体によって標識された標的細胞を必要とする、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表す。
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）とかみ合った場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、定義されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示を導く様々な程度の即時腫瘍破壊及び抗腫瘍Ｔ細胞応答の誘導を直接誘導する機構とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣの細胞内での誘導は、抗腫瘍Ｔ細胞応答及び宿主由来の抗体応答を導く。
補体依存性細胞傷害
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の両者も、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを指令するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の暴露を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの暴露されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高い親和性の相互作用へと変換し、それが一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを開始させ、エフェクター細胞の走化性／活性化物質Ｃ３ａ及びＣ５ａのタンパク質分解性放出を導く。好ましくは、補体カスケードは、細胞内及び細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
抗体の作製
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション技術が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性若しくは発癌性形質転換又は抗体遺伝子のライブラリーを使用したファージディスプレイ技術も使用できる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための好ましい動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は極めて広く確立された手順である。免疫プロトコール及び融合のために免疫脾細胞を単離する技術は当分野において公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための他の好ましい動物系は、ラット及びウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に記載されており、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
さらにもう１つの好ましい実施形態では、ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子組換え又はトランスクロモソーマルマウスを使用して作製できる。これらの遺伝子組換え及びトランスクロモソーマルマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスとして公知のマウスを含み、本明細書では集合的に「遺伝子組換えマウス」と称する。そのような遺伝子組換えマウスにおけるヒト抗体の作製は、国際公開第２００４ ０３５６０７号の中でＣＤ２０に関して詳述されているように実施できる。
モノクローナル抗体を作製するためのさらにもう１つの方法は、定義された方法の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することであり、例えばＢａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ参照。組換え抗体工学の詳細についは、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ ａｎｄ Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８及びＢｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＩＳＢＮ １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
免疫
ＧＴ４６８に対する抗体を作製するために、上述したように、組換え発現されたＧＴ４６８抗原若しくはそのフラグメント及び／又はＧＴ４６８を発現する細胞の富化製剤である、ＧＴ４６８配列に由来する担体結合ペプチドでマウスを免疫することができる。あるいは、完全長ヒトＧＴ４６８（例えば配列番号：１）をコードするＤＮＡ又はそのフラグメント、特に配列番号：３−１０及び３５−８２をコードするものでマウスを免疫することができる。ＧＴ４６８抗原の精製又は富化製剤を使用した免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するためにＧＴ４６８を発現する細胞、例えば細胞株でマウスを免疫することもできる。
免疫応答は、尾静脈又は後眼窩からの採血によって得られる血漿及び血清試料で免疫プロトコールの経過を観測できる。十分な力価の抗ＧＴ４６８免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用できる。特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を高めるために、犠死及び脾切除の３日前にＧＴ４６８発現細胞により腹腔内又は静脈内経路でマウスを追加免疫することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングできる。次に個々のウエルを、ＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマを分泌する抗体に関してスクリーニングできる。ＧＴ４６８発現細胞を使用した免疫蛍光法及びＦＡＣＳ分析により、ＧＴ４６８に対して特異性を有する抗体を同定することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再び平板培養し、再びスクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングできる。安定なサブクローンを、その後試験管内で培養し、特徴づけのために組織培養培地において抗体を生成することができる。
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体はまた、例えば当分野において周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質転換法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。
例えば、１つの実施形態では、対象とする遺伝子（１又は複数）、例えば抗体遺伝子を、国際公開第８７／０４４６２号、同第ＷＯ８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８ ８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系又は当分野で周知の他の発現系によって使用されるような、真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローニングされた抗体遺伝子を有する精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの真核生物宿主細胞、あるいは植物由来細胞、真菌又は酵母細胞のような他の真核細胞に導入できる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミンその他のような当分野で記述されている方法であり得る。宿主細胞へのこれらの抗体遺伝子の導入後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、その後それらを発現レベルに関して増幅し、抗体を生産するためスケールアップすることができる。これらの培養上清及び／又は細胞から組換え抗体を単離し、精製することができる。
あるいは、クローニングした抗体遺伝子を、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む他の発現系において発現させ得る。さらに、抗体は、ヒツジ及びウサギからの乳若しくはニワトリからの卵などのトランスジェニック非ヒト動物において、又はトランスジェニック植物において生産できる；例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
無傷抗体を発現するための部分抗体配列の使用（すなわちヒト化及びキメラ化）
ａ）キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素又は放射性同位体で標識した場合、ヒトにおいて治療用抗体として使用できる。非標識マウス抗体はヒトにおいて高度に免疫原性であり、反復適用した場合治療効果の低下をもたらす。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化又はヒト化した場合、低減するか又は完全に回避することができる。キメラ抗体は、マウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をヒト重鎖及び軽鎖の定常領域と連結することによって達成される（例えばＫｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８によって述べられているように）。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭである。
ｂ）ヒト化
抗体は、主として６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体の間で多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、特定の天然に生じる抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから入手できる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞の成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成され、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、個々に均一に可変領域全体にわたる高親和性二次レパートリー抗体の配列とも異なる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分及びフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的頻度が低い。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。このため、もとの抗体と類似の結合特性を有する無傷組換え抗体を再現するために特定抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（国際公開第９９／４５９６２号参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列は、典型的にはこの目的のために十分である。部分配列は、いずれの生殖細胞系可変及び連結遺伝子セグメントが組み換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを判定するために使用される。生殖細胞系配列は、次に、可変領域の欠けている部分を埋めるために使用される。重鎖及び軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠けている配列を加えるために、クローニングされたｃＤＮＡ配列を連結又はＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと結合することができる。あるいは、可変領域全体を、短いオーバーラップオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅によって結合して完全な合成可変領域クローンを作製することができる。この工程は、特定制限部位の除去若しくは組込み、又は特定コドンの最適化のようなある種の利点を有する。
ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を使用して、天然配列と同じアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製するために合成オリゴヌクレオチドの重複するセットを設計する。合成重鎖及びκ鎖配列は３つの点で天然配列と異なり得る：オリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅を容易にするために反復ヌクレオチド塩基の鎖が中断される；最適翻訳開始部位がコザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従って組み込まれる；及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流に構築される。
重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化したコード鎖及び対応する非コード鎖配列を対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０−５０ヌクレオチドに分割する。それ故、各々の鎖について、オリゴヌクレオチドを１５０−４００ヌクレオチドの断片にわたる重複する二本鎖セットに構築できる。次にそのプールを鋳型として使用して１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生成する。典型的には１つの可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分割し、それらを別々に増幅して２つの重なりあうＰＣＲ産物を生成する。次にこれらの重なりあうＰＣＲ産物をＰＣＲ増幅によって組み合わせて完全な可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物に容易にクローニングできるフラグメントを作製するために重鎖又は軽鎖定常領域の重なりあう画分をＰＣＲ増幅に含めることが望ましいと考えられる。
再構築したキメラ化又はヒト化重鎖及び軽鎖可変領域を、次に、クローニングしたプロモーター、リーダー、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳、ポリアデニル化及び転写終結配列と組み合わせて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物を単一ベクターに組み合わせる、宿主細胞に同時トランスフェクトする、連続的にトランスフェクトする、又は別々にトランスフェクトして、その後それらを融合し、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成することができる。ヒトＩｇＧκについての発現ベクターの構築において使用するためのプラスミドを述べる。ＰＣＲ増幅したＶ重鎖及びＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列を使用して完全な重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子を再構築できるようにプラスミドを構築し得る。これらのプラスミドを使用して、完全なヒト、又はキメラＩｇＧ１κ若しくはＩｇＧ４κ抗体を発現することができる。同様のプラスミドを、他の重鎖アイソタイプの発現のため又はλ軽鎖を含む抗体の発現のために構築し得る。
それ故、本発明のもう１つの態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体の構造特徴を利用して、ＧＴ４６８への結合のような、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する構造的に関連したヒト化抗ＧＴ４６８抗体を作製する。より具体的には、マウスモノクローナル抗体の１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域を組換えによって公知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組み合わせて、付加的な、組換え構築された本発明のヒト化抗ＧＴ４６８抗体を作製する。
抗原発現細胞への結合
ＧＴ４６８に結合する抗体の能力は、実施例で述べるような標準結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光法及びフローサイトメトリー分析）を用いて測定することができる。
抗体の単離と特徴づけ
抗ＧＴ４６８抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。あるいは、抗ＧＴ４６８抗体を透析バイオリアクターで生産し得る。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインＧ−セファロース又はプロテインＡ−セファロースによるアフィニティークロマトグラフィーに供することができる。純度を保証するために、溶出したＩｇＧをゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーによって検査することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０による濃度を測定できる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
選択した抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを調べるために、部位指定又は多部位指定突然変異誘発が使用できる。
アイソタイプの決定
精製抗体のアイソタイプを決定するために、様々な市販のキット（例えばＺｙｍｅｄ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるアイソタイプＥＬＩＳＡが実施できる。マイクロタイタープレートのウエルを抗マウスＩｇで被覆し得る。ブロックした後、プレートをモノクローナル抗体又は精製アイソタイプ対照と周囲温度で２時間反応させる。次に、ウエルをマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３、ＩｇＡ又はマウスＩｇＭ特異的ペルオキシダーゼ結合プローブのいずれかと反応させ得る。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開させ、４０５−６５０のＯＤで分析することができる。あるいは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４９３０２７）を、製造者によって述べられているように使用してもよい。
フローサイトメトリー分析
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、フローサイトメトリーが使用できる。天然に又はトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞株とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照（標準増殖条件下で増殖させる）を、ハイブリドーマ上清中又は１％ＦＢＳを含むＰＢＡＳ中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、４℃で３０分間培養し得る。洗浄後、ＡＰＣ又はＡｌｅｘａ６４７標識ＩｇＧ抗体を、一次抗体染色と同じ条件下でＧＴ４６８結合モノクローナル抗体に結合することができる。光散乱及び側方散乱特性を使用して単一生細胞にゲートをかけるＦＡＣＳ装置でのフローサイトメトリーによって試料を分析し得る。１つの測定においてＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体と区別するために、同時トランスフェクションの方法が使用できる。ＧＴ４６８と蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色し得る。トランスフェクトした細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合するのに対し、非特異的抗体は同等の比率で非トランスフェクト細胞に結合する。フローサイトメトリーアッセイに加えて又はその代わりに、蛍光顕微鏡検査を用いる選択的アッセイを使用し得る。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡によって検査することができる。
免疫蛍光顕微鏡検査
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡検査による分析が使用できる。例えば、自然に又は形質転換後にＧＴ４６８を発現する細胞株とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で標準増殖条件下にチャンバースライドガラスにおいて増殖させる。その後細胞をメタノール又はパラホルムアルデヒドで固定するか又は未処置のままに放置し得る。次に、細胞をＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体と２５℃で３０分間反応させ得る。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させ得る。その後、免疫蛍光顕微鏡によって細胞を検査することができる。
細胞中の総ＧＴ４６８レベルは、細胞をメタノール固定又はパラホルムアルデヒド固定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した場合に観察できる。生細胞及び透過処理していないパラホルムアルデヒド固定細胞においてＧＴ４６８の表面局在化が検査できる。加えて、密着結合へのＧＴ４６８のターゲティングは、ＺＯ−１などの密着結合マーカーとの共染色によって分析できる。さらに、抗体結合及び細胞膜内のＧＴ４６８局在化の影響が検査できる。
ウエスタンブロット法
抗ＧＴ４６８ ＩｇＧは、ウエスタンブロット法によってＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験できる。簡単に述べると、ＧＴ４６８を発現する細胞からの細胞抽出物と適切な陰性対照を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを用いてＩｇＧ結合を検出し、ＥＣＬ基質で展開させ得る。
免疫組織化学
抗ＧＴ４６８マウスＩｇＧを、当業者に周知の方法で免疫組織化学によって、例えば、通常の外科手術の間に患者から得た非癌組織若しくは癌組織試料からの、又は自然に若しくは形質転換後にＧＴ４６８を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスからの、パラホルムアルデヒド若しくはアセトン固定凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を使用して、ＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。免疫染色のために、ＧＴ４６８に対して反応性の抗体をインキュベートし、次いで供給者の指示に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体又はヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートし得る。
試験管内での抗体の食作用及び細胞死滅化活性
ＧＴ４６８に特異的に結合することに加えて、抗ＧＴ４６８抗体を、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用及び死滅を媒介するそれらの能力に関して試験することができる。試験管内でのモノクローナル抗体活性の試験は、細胞内モデルにおける試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞（ＰＭＮ）、ＮＫ細胞、単球、単核細胞又は他のエフェクター細胞をＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離、次いで夾雑赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清あるいは５％熱不活化ヒト血清を添加したＲＰＭＩに懸濁し、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする５１Ｃｒ標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で混合し得る。あるいは、標的細胞を蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドを有するユーロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定し得る。もう１つの選択的手法は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは生細胞によってのみ酸化され得る。次に精製抗ＧＴ４６８ ＩｇＧを様々な濃度で添加し得る。無関係なヒトＩｇＧが陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して３７℃で４〜２０時間実施し得る。試料を、５１Ｃｒ放出又は培養上清中のＥｕＴＤＡキレートの存在を測定することにより、細胞溶解に関して検定することができる。あるいは、ルシファーイエローの酸化から生じるルミネセンスは生細胞の尺度であり得る。
抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体はまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で増強されるかどうかを調べるために様々な組合せで試験できる。
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）：
モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体は、様々な公知の技術を用いてＣＤＣを媒介するそれらの能力に関して試験できる。例えば、補体用の血清は、当業者に公知の方法で血液から入手できる。ｍＡｂのＣＤＣ活性を測定するために種々の方法が使用できる。例えば５１Ｃｒ放出を測定することができ、又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価することができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、５×１０５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと共に室温又は３７℃で１０−３０分間インキュベートし得る。次に、血清又は血漿を２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し、細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし得る。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液に添加し得る。その後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙを用いたフローサイトメトリー分析によって混合物を直ちに分析できる。
選択的アッセイでは、ＣＤＣの誘導を接着細胞に関して測定できる。この分析の１つの実施形態では、分析の２４時間前に細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４／ウエルの密度で接種する。その翌日、増殖培地を除去し、細胞を抗体と共に３組重複してインキュベートする。対照細胞は、それぞれバックグラウンド溶解及び最大溶解の測定のために増殖培地又は０．２％サポニンを含有する増殖培地と共に培養する。室温で２０分間の培養後、上清を取り出し、ＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿又は血清（あらかじめ３７℃に温めておく）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間培養する。各々の試料からのすべての細胞をヨウ化プロピジウム溶液（１０μｇ／ｍｌ）に添加する。次に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有するＰＢＳに交換し、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅを用いて５２０ｎｍでの励起後の蛍光放出を６００ｎｍで測定する。特異的溶解のパーセントを以下のように計算する：特異的溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。
モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害：
アポトーシスを開始させる能力に関して試験するために、モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体を、例えば、ＧＴ４６８陽性腫瘍細胞又はＧＴ４６８を形質転換した腫瘍細胞と共に３７℃で約２０時間インキュベートし得る。細胞を採取し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄して、ＦＩＴＣ又はＡＰＣと結合したアネキシンＶ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に暗所で１５分間培養し得る。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）に添加し、フローサイトメトリーによって直ちに評価し得る（上記のように）。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の全般的阻害は市販のキットを用いて検出できる。ＤＥＬＦＩＡ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖中の細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みの測定に基づく非同位体免疫検定法である。組み込まれたＢｒｄＵは、ユーロピウム標識モノクローナル抗体を使用して検出される。抗体検出を可能にするために、Ｆｉｘ溶液を使用して細胞を固定し、ＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導剤を添加して標識抗体からユーロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中で前記イオンはＤＥＬＦＩＡ誘導剤の成分と高度蛍光キレートを形成する。検出において時間分解蛍光光度法を使用して測定した蛍光は、各ウエルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
前臨床試験
ＧＴ４６８に結合するモノクローナル抗体はまた、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞増殖を制御する上でのそれらの効果を測定するために細胞内モデルにおいても（例えば、場合によりトランスフェクション後に、ＧＴ４６８を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウスにおいて）試験できる。
ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞を免疫無防備状態マウス又は他の動物に異種移植した後の細胞内試験を、本発明の抗体を使用して実施できる。腫瘍のないマウスに抗体を投与し、次いで腫瘍細胞を注射して、腫瘍の形成又は腫瘍関連症状を予防する抗体の作用を測定し得る。抗体を腫瘍担持マウスに投与して、腫瘍の成長、転移又は腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を測定し得る。抗体適用は、相乗効果及び併用の潜在的毒性を調べるために細胞増殖抑制薬、増殖因子阻害剤、細胞周期遮断薬、血管新生阻害剤又は他の抗体のような他の物質の適用と組み合わせることができる。本発明の抗体によって媒介される毒性副作用を分析するために、動物に抗体又は対照試薬を接種し、ＧＴ４６８抗体治療に関連する可能性がある症状に関して詳細に検討することができる。ＧＴ４６８抗体の細胞内適用の起こり得る副作用は、特に、胎盤を含むＧＴ４６８発現組織における毒性を包含する。ヒト及び他の種、例えばマウスにおいてＧＴ４６８を認識する抗体は、ヒトにおけるモノクローナルＧＴ４６８抗体の適用によって媒介される潜在的副作用を予測するために特に有用である。
エピトープマッピング
本発明の抗体によって認識される抗原決定基のマッピングは、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９による「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）及びＯｌｗｙｎ Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ Ｃ．Ｈａｙによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２４８において詳述されているように実施できる。
Ｉ．ＧＴ４６８に結合する二重特異性／多重特異性分子
本発明のさらにもう１つの実施形態では、ＧＴ４６８に対する抗体は、複数の結合部位又は標的抗原決定基に結合する二重特異性又は多重特異性分子を生成するために、誘導体化するか又はもう１つ別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に連結することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、ペプチド又は結合ミメティックのような１つ又はそれ以上の他の結合分子に機能的に連結できる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合等によって）。
従って、本発明は、ＧＴ４６８に対する少なくとも１つの第一結合特異性部分と２番目の標的抗原決定基に対する第二結合特異性部分を含む二重特異性及び多重特異性分子を包含する。本発明の特定実施形態では、２番目の標的抗原決定基は、Ｆｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）若しくはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）、又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３である。それ故、本発明は、ＦｃγＲ、ヒトＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ））と、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする標的細胞の両方に結合することができる二重特異性及び多重特異性分子を包含する。これらの二重特異性及び多重特異性分子は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞をエフェクター細胞に標的し、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性、例えばＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、又はスーパーオキシドアニオンの生成を開始させ得る。
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＧＴ４６８結合特異性部分に加えて、第三の結合特異性部分をさらに含み得る。１つの実施形態では、第三結合特異性部分は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原又は受容体に結合し、それによってＦｃ受容体又は標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強を生じさせる抗体、機能性抗体フラグメント又はリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原に結合し得る。あるいは、抗増強因子部分は、第一及び第二結合特異性部分が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞に結合できる（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１又は標的細胞に対する免疫応答増強を生じさせる他の免疫細胞を介して）。
１つの実施形態では、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、結合特異性部分として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体を含有する。前記抗体はまた、軽鎖若しくは重鎖二量体であり得るか、又はＦｖ若しくはＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている一本鎖構築物のようなその何らかの最小フラグメントであり得る。抗体はまた、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号及び同第２００３／０１３３９３９号に開示されている結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。
１つの実施形態では、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃγＲ又はヒトＦｃαＲに対する結合特異性部分、及び標的細胞抗原、例えばＧＴ４６８に対する第二結合特異性部分を含む。
１つの実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書で使用される、「ＩｇＧ受容体」という用語は、第１染色体に位置する８個のγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類される、合計１２の膜貫通型又は可溶性受容体アイソフォームをコードする。１つの好ましい実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。
これらの好ましいモノクローナル抗体の作製と特徴づけは、国際公開第８８／０００５２号及び米国特許第４，９５４，６１７号においてＦａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．によって記述されている。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩの抗原決定基に結合し、それ故、それらの結合は生理的レベルのＩｇＧによって実質的にブロックされない。本発明において有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２及びｍＡｂ１９７である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト化形態（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の作製と特徴づけは、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２及び国際公開第９４／１０３３２号に記載されている。Ｈ２２抗体を産生する細胞株は、１９９２年１１月４日にＨＡ０２２ＣＬ１の名称でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
さらなる他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合が、好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によってブロックされない、ヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって提供される。「ＩｇＡ受容体」という用語は、第１９染色体に位置する１個のα遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を包含することが意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数個の選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをコードすることが公知である。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。ＦｃαＲＩはＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方に対して中等度の親和性を有し、前記親和性は、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露後に上昇する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩに結合する、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２及びＡ７７と同定された４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体が記述されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。
ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩは、それらが、（１）主として免疫エフェクター細胞上で、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージ及び樹状細胞上で発現される、（２）高レベル（例えば５，０００〜１００，０００／細胞）で発現される、（３）細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ、食作用）のメディエーターである、（４）それらに標的される、自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するため、本発明における使用のための好ましいトリガー受容体である。
もう１つの実施形態では、二重特異性分子は、一方の抗体が主としてＣＤＣを誘導することによって働き、他方の抗体が主としてアポトーシスを誘導することによって作用するような、補完的機能活性を有する本発明に従った２つのモノクローナル抗体からなる。
本明細書で使用される「エフェクター細胞特異的抗体」は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する抗体又は機能性抗体フラグメントを指す。本発明における使用のための好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンによって結合されない部位でエフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する。
本明細書で使用される、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期及び活性化期ではなく、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系又はリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞並びに好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。好ましい実施形態では、エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えば好中球はＡＤＣＣを誘導できる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞を特異的に死滅させる及び抗原を免疫系の他の成分に提示すること、又は抗原を提示する細胞に結合することに関与する。他の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞又は微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上での特定ＦｃＲの発現は、サイトカインのような体液性因子によって調節され得る。例えば、ＦｃγＲＩの発現はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方調節されることが認められている。この発現増強は、標的に対するＦｃγＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を上昇させる。エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食するか又は溶解することができる。
「標的細胞」は、本発明の抗体によって標的され得る、被験者（例えばヒト又は動物）における何らかの好ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞は、ＧＴ４６８を発現するか又は過剰発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞である。ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞は、典型的には腫瘍細胞を含む。
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、化学的手法（例えばＤ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５８０７参照）、「ポリドーマ」技術（例えばＲｅａｄｉｎｇへの米国特許第４，４７４，８９３号参照）、又は組換えＤＮＡ技術を用いて作製できる。
特に、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、当分野で公知の方法を用いて、成分を結合特異性部分、例えば抗ＦｃＲ及び抗ＧＴ４６８結合特異性部分に結合することによって作製できる。例えば、二重特異性及び多重特異性分子の各々の結合特異性部分を別々に作製し、その後互いに結合し得る。結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング剤又は架橋剤が共有結合のために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：２３６７−２３７５）によって述べられているものを含む。好ましい結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）より入手可能である。
結合特異性部分が抗体である場合は、それらを２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合し得る。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域を、結合の前に、奇数、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。
あるいは、両方の結合特異性部分を同じベクター内にコードし、同じ宿主細胞において発現し、構築することができる。この方法は、二重特異性及び多重特異性分子がＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性及び多重特異性分子、例えば二重特異性分子は、一本鎖二重特異性抗体のような一本鎖分子、１つの一本鎖抗体と１つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性及び多重特異性分子はまた、一本鎖分子であり得るか又は少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性及び多重特異性分子を作製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；及び同第５，４８２，８５８号に記載されている。
二重特異性及び多重特異性分子の、それらの特異的標的への結合は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物学的検定法（例えば増殖阻害）、又はウエスタンブロット法によって確認できる。これらの解析法の各々は、一般に、特定対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を、対象複合体に特異的な標識試薬（例えば抗体）を使用することによって検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば酵素結合抗体又は抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する抗体フラグメントを用いて検出できる。あるいは、複合体は様々な他の免疫測定法のいずれかを用いて検出できる。例えば、抗体を放射性標識し、放射免疫測定法（ＲＩＡ）において使用することができる（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６参照）。放射性同位体は、ガンマカウンター若しくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって又はオートラジオグラフィーによって検出できる。
ＩＩ．免疫複合体
もう１つの態様では、本発明は、細胞毒、薬剤（例えば免疫抑制剤）又は放射性同位体などの治療成分又は物質に結合した抗ＧＴ４６８抗体を特徴とする。そのような複合体を本明細書では「免疫複合体」と称する。１つ又はそれ以上の細胞毒を含有する免疫複合体は「免疫毒素」と称する。細胞毒又は細胞傷害性物質は、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させるあらゆる物質を包含する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又は同族体を含む。
本発明の免疫複合体を形成するための適切な治療薬は、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は細胞傷害性物質又は放射性毒性物質である。もう１つの実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらにもう１つの実施形態では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド又はリシンＡである。
本発明の抗体はまた、癌などのＧＴ４６８関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性薬剤を生成するために、放射性同位体、例えばヨウ素−１３１、イットリウム−９０又はインジウム−１１１に結合することができる。本発明の抗体複合体は所与の生物学的応答を改変するために使用でき、薬剤成分は古典的化学治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤成分は、所望生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素若しくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子若しくはインターフェロンγなどのタンパク質；又は、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）若しくは他の増殖因子などの生物学的応答調節剤を含み得る。
そのような治療成分を抗体に結合するための技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）参照。
さらなる実施形態では、本発明による抗体は、抗体を放射性同位体に結合することを可能にする、リンカー−キレート化剤、例えばチウキセタンに結合される。
ＩＩＩ．医薬組成物
もう１つの態様では、本発明は、本発明の抗体の１つ又は抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているような従来技術に従って医薬的に許容される担体又は希釈剤並びに何らかの他の公知の佐剤及び賦形剤と共に製剤され得る。１つの実施形態では、組成物は、異なる機構によって作用する本発明の複数の（例えば２つ又はそれ以上の）単離抗体の組合せ、例えば、主としてＣＤＣを誘導することによって働く１つの抗体と主としてアポトーシスを誘導することによって作用する別の抗体の組合せを含む。
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗炎症薬又は少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明の組成物を含み得る。１つの実施形態では、そのような治療薬は、ステロイド系薬剤又はＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの１つ又はそれ以上の抗炎症薬を含む。好ましい薬剤は、例えば、アスピリン及び他のサリチル酸塩、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）及びセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）などのＣｏｘ−２阻害剤、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ、Ａｄｖｉｌ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）及びインドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）などのＮＳＡＩＤを含む。
もう１つの実施形態では、そのような治療薬は、低用量シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ２又は抗ＩＬ２受容体抗体のような、制御性Ｔ細胞の枯渇又は機能的不活性化を導く物質を含む。
さらにもう１つの実施形態では、そのような治療薬は、タキソール誘導体、タキソテール、ゲンシタビン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ、Ｎｅｏｓａｒ）などの、１つ又はそれ以上の化学療法剤を含む。もう１つの実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは乳癌、肺癌、胃癌及び／又は卵巣癌、又は、例えば本明細書で述べるような他の癌型に罹患している患者において治療効果を示す、化学療法剤と組み合わせて投与し得る。
さらにもう１つの実施形態では、本発明の抗体は、放射線治療及び／又は自己末梢幹細胞移植若しくは骨髄移植と組み合わせて投与し得る。
さらにもう１つの実施形態では、本発明の抗体は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＣＤ４０抗体から選択される１つ又はそれ以上の抗体と組み合わせて投与し得る。
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、補体活性化を増強するために抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体と組み合わせて投与し得る。
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」は、生理的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を包含する。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に適する。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性及び多重特異性分子は、酸の作用及び化合物を不活性化し得る他の自然条件から化合物を保護するために物質で被覆され得る。
「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性作用も与えない塩を指す（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような非毒性無機酸から、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等のような非毒性有機酸から誘導されるものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属から、並びにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような非毒性有機アミンから誘導されるものを含む。
本発明の組成物は、当分野で公知の様々な方法によって投与できる。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は方式は所望の結果に依存して異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のような、急速な放出から化合物を保護する担体と共に製造され得る。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用できる。そのような製剤の製造のための方法は一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
特定投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物の不活性化を防ぐ物質で化合物を被覆するか又は化合物を前記物質と同時投与する必要があり得る。例えば、化合物を適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤中で被験者に投与し得る。医薬的に許容される希釈剤は、生理食塩水及び水性緩衝液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルション並びに従来のリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
医薬的に許容される担体は、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。医薬活性物質のためのそのような媒質及び物質の使用は当分野において公知である。従来の媒質又は物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補足活性化合物も組成物に組み込むことができる。
治療組成物は、典型的には製造及び保存条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬剤濃度に適した他の秩序構造体として製剤できる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合は必要なの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによって達成できる。
滅菌注射用溶液は、上記に列挙した成分の１つ又は成分の組合せと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、その後滅菌精密ろ過することによって製造できる。
一般に、分散液は、基本分散媒及び上記に列挙したものの中から必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって製造される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から有効成分プラス任意の付加的な所望の成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
投薬療法は、最適所望応答（例えば治療応答）を与えるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与し得るか、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって求められるのに比例して用量を増減し得る。投与の容易さ及び用量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態で製剤することは特に好都合である。本明細書で使用される投与単位形態は、単一投与量として治療される被験者に適した、物理的に分離した単位を表す；各々の単位は、必要な医薬担体と協力して所望の治療効果を生じさせるように計算された、あらかじめ定められた量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態についての詳細は、（ａ）活性化合物の独自の特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を配合することの当分野に固有の限界によって決定され、直接それらに依存する。
医薬的に許容される抗酸化剤の例は：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；及び（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。
治療組成物に関して、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含む）、経直腸、経膣及び／又は非経口投与に適するものを含む。製剤は、単位投与形態で好都合に提供され得、薬学の技術分野において公知の任意の方法によって製造され得る。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、治療される被験者及び特定の投与方式に依存して異なる。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる組成物の量である。
一般に、１００％のうち、この量は約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の有効成分にわたる。
経膣投与に適する本発明の製剤はまた、適切であることが当分野において公知である担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤を含む。本発明の組成物の局所又は経皮投与用の剤型は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性化合物は、無菌条件下で、医薬的に許容される担体、及び必要とされ得る何らかの防腐剤、緩衝剤又は噴射剤と混合し得る。
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与方式を意味し、限定されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含む。
本発明の医薬組成物において使用し得る適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの佐剤を含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含有することの両方によって確保され得る。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含めることも望ましいと考えられる。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる物質を含めることにより、注射用医薬形態の持続的吸収を生じさせ得る。
１つの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、皮下注射によって結晶形態で投与される。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ，１００（１２）：６９３４−６９３９参照。本発明の化合物が薬剤としてヒト及び動物に投与される場合、それらは、単独で、又は医薬的に許容される担体と組み合わせて、例えば０．０１〜９９．５％（より好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与され得る。
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容される投与形態に製剤される。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者への毒性を伴わずに、特定の患者、組成物及び投与方式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量が得られるように変化させ得る。選択される用量レベルは、様々な薬物動態因子、例えば使用される本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与の時間、使用される特定化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定組成物と併用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康及び以前の病歴、並びに医学技術分野において周知の同様の因子に依存する。
当分野における通常技術を有する医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医は、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最小用量である化合物の量である。そのような有効用量は、一般に上述した因子に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下経路であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。所望する場合は、治療組成物の有効１日用量を、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６又はそれ以上の分割用量として、場合により単位投与形態で投与し得る。本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、医薬製剤（組成物）として本発明の化合物を投与することが好ましい。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒性副作用を低減するために注入によって、好ましくは２４時間超のような長期間にわたる緩徐な持続注入によって投与し得る。投与はまた、２〜２４時間、例えば２〜１２時間にわたる持続注入によって実施し得る。そのようなレジメンは、必要に応じて１回又はそれ以上、例えば６ヵ月後又は１２ヵ月後に反復し得る。投与量は、抗ＧＴ４６８抗体を標的する抗イディオタイプ抗体を使用することにより、生物学的試料において投与後の循環モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体の量を測定することによって決定するか又は調整することができる。
さらにもう１つの実施形態では、抗体は、例えば週に１回、６ヶ月又はそれ以上の期間にわたるような、維持療法によって投与される。
さらにもう１つの実施形態では、本発明による抗体は、ＧＴ４６８に対する抗体の１回注入、次いで放射性同位体に結合したＧＴ４６８に対する抗体の注入を含むレジメンによって投与し得る。上記レジメンは、例えば７−９日後に反復し得る。
治療組成物は、当分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；又は同第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような、無針皮下注射装置で投与できる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、制御された速度で薬剤を供給するための移植可能な微量注入ポンプを開示する、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する、米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；持続的薬剤送達のための可変流量移植可能注入装置を開示する、米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４７５，１９６号に記載されているものを含む。
多くの他のそのような移植、送達システム及びモジュールが当業者に公知である。ある実施形態では、本発明の抗体は、細胞内での適切な分布を確実にするように製剤され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを越えることを確実にするために（所望する場合）、それらを、例えばリポソーム中に製剤することができる。リポソームを製造するための方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；及び同第５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定細胞又は器官内に選択的に輸送され、それ故標的化薬剤送達を促進する１つ又はそれ以上の成分を含有し得る（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的成分は、葉酸塩又はビオチン（例えばＬｏｗ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｔｈｅｒ．３９：１８０）；及び界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）を含む。
本発明の１つの実施形態では、本発明の治療化合物はリポソームに製剤される。より好ましい実施形態では、リポソームは標的成分を含有する。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療化合物は、所望の領域、例えば腫瘍の部位に近位の部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されねばならない。
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、それらの胎盤を横切る輸送を防止するか又は低減するように製剤され得る。これは、当分野で公知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によって又はＦ（ａｂ'）２フラグメントの使用によって実施され得る。さらに、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ Ｃ，Ｚｈｕｏ Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：１７７−１９０」；及び「Ｌａｎｄｏｒ Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：２７９−２８３」が参照できる。
腫瘍治療のための「治療有効用量」は、完全又は部分的のいずれかであり得る、客観的腫瘍応答によって測定できる。完全応答（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線医学的又は他の証拠がないことと定義される。部分応答（ＰＲ）は、凝集腫瘍サイズの５０％超の縮小から生じる。進行までの平均時間は、客観的腫瘍応答の持続性を特徴づける尺度である。
腫瘍治療のための「治療有効用量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定できる。癌を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデル系において評価できる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知の試験管内での分析により、細胞増殖又はアポトーシスを阻害する化合物の能力を検査することによって評価できる。治療化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを縮小させるか又はさもなければ被験者において症状を改善することができる。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重症度、及び選択される特定組成物又は投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができる。
組成物は無菌でなければならず、また組成物が注射器によって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、並びにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含有することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることによって達成され得る。
上述したように、活性化合物が適切に保護されている場合、化合物は、例えば不活性希釈剤又は同化性食用担体と共に、経口投与され得る。
ＩＶ．本発明の用途及び方法
本発明の抗体（本明細書で述べる免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子、組成物及び他の誘導体を含む）は、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患の治療を含む、数多くの治療上の有用性を有する。例えば、前記抗体は、本明細書で述べるような様々な疾患を治療するか又は予防するために、例えば試験管内若しくは生体外で培養下の細胞に、又は例えば生体内でヒト被験者に投与することができる。本明細書で使用される、「被験者」という用語は、ＧＴ４６８に対する抗体に応答するヒト及び非ヒト動物を包含することが意図されている。好ましい被験者は、疾患細胞、特に正常細胞と比較して変化したＧＴ４６８の発現パターン及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の変化した結合パターンによって特徴づけられる細胞を死滅させることによって矯正又は改善できる疾患を有するヒト患者を含む。
例えば、１つの実施形態では、本発明の抗体は、例えば乳癌を含む、腫瘍形成性疾患、例えばＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる疾患を有する被験者を治療するために使用できる。治療及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態を含む、ＧＴ４６８を発現するすべての癌及び腫瘍実体を包含する。これらの癌は、早期、中間期又は末期、例えば転移であり得る。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
本発明に従って述べる医薬組成物及び治療方法はまた、本明細書で述べる疾患を予防するための免疫又はワクチン接種のためにも使用し得る。
もう１つの実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８若しくは特定形態のＧＴ４６８のレベル、又はそれらの膜表面にＧＴ４６８を含む細胞のレベルを検出するために使用でき、その後、それらのレベルを上述したような特定の疾患又は疾患症状に結びつけることができる。あるいは、抗体を使用して、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の機能を低下させるか又は前記細胞の機能と相互作用させて、それによりこれらの細胞を疾患の重要なメディエーターとして関係づけることができる。これは、抗体とＧＴ４６８との間で複合体の形成を許容する条件下で、試料及び対照試料を抗ＧＴ４６８抗体と接触させることによって達成できる。抗体とＧＴ４６８との間で形成された何らかの複合体を検出し、試料と対照試料、すなわち標準試料において比較する。
本発明の抗体は、最初に、試験管内での治療又は診断用途に関連するそれらの結合活性に関して試験できる。例えば、本明細書で述べるフローサイトメトリーアッセイを用いて抗体を試験できる。
さらに、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害すること及び／又は前記細胞を死滅させることを含む、少なくとも１つのエフェクター媒介性エフェクター細胞活性を開始させる抗体の活性を検定することができる。例えば、ＣＤＣ及び／又はアポトーシスを開始させる抗体の能力が検定できる。ＣＤＣ、同型接着、分子クラスタリング又はアポトーシスを検定するためのプロトコールを本明細書で述べる。
本発明の抗体は、以下の生物活性：ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖及び／又は分化を阻害すること；ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させること；エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の食作用又はＡＤＣＣを媒介すること；補体の存在下でＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のＣＤＣを媒介すること；ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞のアポトーシスを媒介すること；同型接着を誘導すること；並びに／又はＧＴ４６８に結合したとき脂質ラフトへの転位を誘導することの１つ又はそれ以上を生体内又は試験管内で誘発するために使用できる。
特定実施形態では、本発明の抗体は、様々なＧＴ４６８関連疾患を治療する、予防するか又は診断するために生体内又は試験管内で使用される。ＧＴ４６８関連疾患の例は、中でも特に、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態などの癌を含む。１つの実施形態では、癌疾患は肺の転移性癌である。
本発明の抗体組成物を生体内又は試験管内で投与する適切な経路は当分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
上述したように、本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、１つ又はそれ以上の他の治療薬、例えば細胞傷害性物質、放射性毒性物質、抗血管新生薬及び／又は本発明の抗体に対する免疫応答の誘導を低減する免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、治療薬に結合し得るか（免疫複合体として）又は治療薬とは別に投与し得る。後者（別途投与）の場合、抗体は、薬剤の前、後又は薬剤と同時に投与できるか、又は他の公知の治療法、例えば抗癌療法、例えば放射線と同時投与できる。そのような治療薬は、中でも特に、上記で列挙したような抗腫瘍薬を含む。化学療法剤と本発明の抗ＧＴ４６８抗体の同時投与は、腫瘍細胞に細胞傷害作用を生じさせる異なる機構によって働く２つの抗癌剤を提供する。そのような同時投与は、薬剤に対する耐性の発現又は腫瘍細胞を抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決できる。
本発明のもう１つの特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを標的する抗体及び血管新生を阻害する１つ又はそれ以上の化合物を含む、抗血管新生薬で付加的に治療される。これらの薬剤による前処置又は並行適用は、バルク腫瘍への抗体の浸透を改善し得る。
本発明のもう１つの特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＥＧＦＲ受容体に結合するモノクローナル抗体並びにＥＧＦＲ、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体によって開始されるシグナル伝達を阻害する化合物を含む、増殖因子受容体シグナル伝達を阻害する化合物で付加的に治療される。
標的特異的エフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞も、治療薬として使用できる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球又は単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞及び他のＩｇＧ受容体又はＩｇＡ受容体担持細胞を含む。所望する場合は、治療される被験者からエフェクター細胞を得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与できる。投与される細胞の数は約１０８〜１０９であり得るが、治療目的に依存して異なる。一般に、その量は、標的細胞、例えばＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする腫瘍細胞における局在化を得るため、及び、例えば食作用によって細胞の死滅を生じさせるのに十分である。投与経路も多様であり得る。
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の技術と併用して実施できる。例えば、本発明の組成物及び／又はこれらの組成物を装備したエフェクター細胞を使用する抗腫瘍治療は、化学療法と共に使用することができる。加えて、併用免疫療法は、２つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞の排除に向かわせるために使用し得る。例えば、抗ＦｃＲＩ又は抗ＣＤ３に連結した抗ＧＴ４６８抗体は、ＩｇＧ受容体又はＩｇＡ受容体特異的結合物質と共に使用し得る。
本発明の二重特異性及び多重特異性分子はまた、細胞表面上の受容体にキャップ形成して除去することなどにより、エフェクター細胞上のＦｃγＲ又はＦｃαＲレベルを調節するために使用できる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこのために使用できる。
補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＭからの部分のような、補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子並びに免疫複合体）は、補体の存在下で使用できる。１つの実施形態では、本発明の結合物質及び適切なエフェクター細胞による、標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体又は補体を含有する血清の添加によって補足され得る。本発明の結合物質で被覆された標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善され得る。もう１つの実施形態では、本発明の組成物で被覆された標的細胞はまた、補体によって溶解され得る。さらにもう１つの実施形態では、本発明の組成物は補体を活性化しない。
本発明の組成物はまた、補体と共に投与することができる。従って、抗体、多重特異性又は二重特異性分子と血清又は補体を含有する組成物は本発明の範囲内である。これらの組成物は、補体が抗体、多重特異性又は二重特異性分子にごく近接して位置するという点で有利である。
あるいは、本発明の抗体、多重特異性又は二重特異性分子と補体又は血清は、別々に投与することができる。標的細胞への本発明の組成物の結合は、細胞膜の脂質ラフトへのＧＴ４６８抗原−抗体複合体の転位を生じさせ得る。そのような転位は、ＣＤＣを効率的に活性化及び／又は増強し得る高密度の抗原−抗体複合体を形成する。
また、本発明の抗体組成物（例えば抗体及び免疫複合体）と使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性物質若しくは放射性毒性物質などの１若しくはそれ以上の付加的な試薬、又は１若しくはそれ以上の付加的な本発明の抗体（例えば補完的活性を有する抗体）をさらに含み得る。
従って、本発明の抗体組成物で治療される患者は、本発明の抗体の治療効果を高めるか又は増大させる、細胞傷害性物質又は放射性毒性物質などのもう１つ別の治療薬を付加的に投与され得る（本発明の抗体の投与前に、抗体の投与と同時に又は抗体の投与後に）。
他の実施形態では、被験者は、例えば被験者をサイトカインで治療することにより、Ｆｃγ又はＦｃα受容体の発現又は活性を調節する、例えば増強するか又は阻害する物質で付加的に治療され得る。好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。本明細書で述べる抗体及び医薬組成物の治療効果を高めるための他の重要な物質は、分枝グルコース残基のホモ多糖であり、様々な植物及び微生物、例えば細菌、藻類、真菌、酵母及び穀物によって産生されるβ−グルカンである。生物によって産生されるβ−グルカンのフラグメントも使用し得る。好ましくは、β−グルカンは、骨格グルコース単位の少なくとも一部、例えば骨格グルコース単位の３〜６％がβ（１，６）分枝のような分枝を有する、β（１，３）グルコースのポリマーである。
特定の実施形態では、本発明は、被験試料と対照試料を、抗体又はその部分とＧＴ４６８との間で複合体の形成を許容する条件下で、ＧＴ４６８に特異的に結合する抗体と接触させることを含む、試料中のＧＴ４６８抗原の存在を検出する、又はＧＴ４６８抗原の量を測定するための方法を提供する。その後、複合体の形成を検出し、対照試料と比較した被験試料との間での複合体形成の差が被験試料中のＧＴ４６８抗原の存在を示す。
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、生体内又は試験管内でＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の存在を検出するか又は前記細胞の量を測定するための方法を提供する。その方法は、（ｉ）検出マーカーに結合した本発明の組成物を被験者に投与すること；及び（ｉｉ）被験者を、前記検出マーカーを検出するための手段に暴露して、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を含む領域を同定することを含む。
上述した方法は、特に、癌疾患などのＧＴ４６８関連疾患を診断するため及び／又はＧＴ４６８関連疾患の局在化のために有用である。好ましくは、対照試料中のＧＴ４６８の量よりも高い被験試料中のＧＴ４６８の量が、試料が由来する被験者、特にヒトにおけるＧＴ４６８関連疾患の存在についての指標となる。
上述した方法において使用される場合、本明細書で述べる抗体は、（ｉ）検出可能なシグナルを与える；（ｉｉ）第一若しくは第二標識によって与えられる検出可能なシグナルを変化させるように第二標識と相互作用する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状若しくは他の物理的パラメータによって運動性、例えば電気泳動運動度に影響を及ぼす、又は（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原若しくはイオン錯体形成をもたらすように機能する標識と共に提供され得る。蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定な同位体標識、等圧標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁気粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンなどの低分子有機分子、受容体のリガンド又は細胞接着タンパク質若しくはレクチンなどの結合分子、結合物質の使用によって検出できる核酸及び／又はアミノ酸残基を含む標識配列等のような構造体は、標識として適切である。標識は、非限定的に、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、並びにフッ素−１８及び炭素−１１などの陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１及びインジウム−１１１などのガンマ線放射体、フッ素及びガドリニウムなどの核磁気共鳴のための核種を含む。
さらにもう１つの実施形態では、本発明の免疫複合体を使用して、化合物（例えば治療薬、標識、細胞毒、放射性毒素、免疫抑制剤等）を抗体に連結することにより、ＧＴ４６８がそれらの表面と結合している細胞にそのような化合物を標的することができる。それ故本発明はまた、循環腫瘍細胞などの、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を生体外又は試験管内で局在化するための方法を提供する。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例１ 試験材料及び方法
本明細書で言及する技術及び方法は、それ自体公知の方法で、及び例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように、又は以下で述べるように実施される。キット及び試薬の使用を含むすべての方法は、製造者の情報に従って実施される。
組織及び細胞株
組換えＤＮＡ作業は、当局の許可を得て、Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ州政府の規則に従って実施した。組織は、常套的な診断又は治療処置の間にヒト余剰物質として入手し、使用時まで−８０℃で保存した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＢＴ５４９をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの抽出、第一鎖ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを先に記述されているように実施した（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。エンドポイント分析のためにＧＴ４６８特異的オリゴヌクレオチド（順方向 ５'−ＡＡＡ ＴＴＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＡＣ−３'；相補鎖方向 ５'−ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＡＣ−３'、６０℃でアニーリング）を３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲで使用した。リアルタイム定量的発現分析を４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて三重に実施した。ＨＰＲＴ（順方向 ５'−ＴＧＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＣＡ−３'；相補鎖方向 ５'−ＧＧＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＣＴ−３'、６２℃でアニーリング）に対して基準化した後、腫瘍試料中のＧＴ４６８転写産物を、ΔΔＣＴ算出法を用いて正常組織と比較して定量した。任意に選択した試料からの増幅産物のクローニングと配列決定によってＰＣＲ反応の特異性を確認した。
バイオインフォマティクス
栄養膜特異的分子のインシリコクローニングのために、別のところで詳述されているデータマイニング法を修正し、適合させた（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。簡単に述べると、ＧｅｎＢａｎｋの階層的キーワード検索をデジタルｃＤＮＡライブラリーサブトラクションと組み合わせた。
キーワード検索のために、ＥＮＴＲＥＺ Ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）を使用して、胎盤又は栄養膜組織で特異的に発現されると注釈されている遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋの塩基配列ファイルにアクセスした。配列相同性検索プログラムＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を、冗長性を防ぐためにヒトヌクレオチド配列のすべてに対し、各々のヌクレオチド配列について連続的に実施した。２番目のフィルターとして電子ノーザン（ｅＮｏｒｔｈｅｒｎ）を、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＥＳＴデータベースに対し、対象とする各々のＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ検索によるキーワード検索によって得たすべてのクローンについて実施した。公知となっているいくつかのｃＤＮＡライブラリーは適切に注釈されていないことを考慮に入れた（Ｓｃｈｅｕｒｌｅ，Ｄ．，ＤｅＹｏｕｎｇ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｎｎｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｐａｇｅ，Ｈ．，Ｊａｈａｎｚｅｂ，Ｍ．＆Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０，４０３７−４０４３）。
デジタルサブトラクションのために、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｉｓｓｕｅｓ／ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ）の癌ゲノム解剖プロジェクト（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ）のｃＤＮＡ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒツールを使用した。これは、各々のプールが単一ライブラリー又は数個のライブラリーのいずれかであり得る、ｃＤＮＡライブラリーの２つのプール（ＡとＢ）の間で遺伝子発現を比較する。ｄｂＥＳＴにおけるすべてのｃＤＮＡライブラリーを検索するために、プールＡとプールＢについての検索オプションを生物については「ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）」、ライブラリー群については「すべてのＥＳＴライブラリー」に設定した。検索オプション設定にマッチする胎盤及び栄養膜組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリーを、混合組織ライブラリーを除いてプールＡに割り当てた。プールＢについては、胎盤、栄養膜、精巣、卵巣及び胎児の全身以外の正常組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリーを選択した。
ＧＴ４６８プロモーター領域の分析のために、ＥＭＢＯＳＳ ＣｐＧＰｌｏｔ（Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．＆Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６，２７６−２７７）ソフトウエアを使用した。さらに、ＧＴ４６８タンパク質配列の解析をＭＥＭＳＡＴ３（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，３０３８−３０４９）、ＴＭｐｒｅｄ（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｗ．（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４，１６６）、及びＧＯＲ ＩＶ（Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．＆Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０，９７−１２０）で実施した。
抗血清、免疫蛍光法及び免疫化学
ＧＴ４６８のアミノ酸１１７−１２７に対して惹起されるポリクローナル抗血清は、抗体受託生産サービス（Ｓｑｕａｒｉｘ，Ｍａｒｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって作製された。免疫組織化学は、ＶＥＣＴＯＲ ＮｏｖａＲＥＤ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して組織凍結切片に関して実施した。ウエスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した総タンパク質３０μｇを使用した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）に電気転写した。ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、サイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及びβ−アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に対して反応性の抗体で免疫染色を実施し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて一次抗体を検出した。
ｓｉＲＮＡ二本鎖
ＧＴ４６８ ｓｉＲＮＡ二本鎖（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（順方向 ５'−ｒ（ＣＣＡ ＵＧＡ ＧＡＧ ＵＡＧ ＣＣＡ ＧＣＡ）ｄＴｄＴ−３'、相補鎖方向 ５'−ｒ（ＵＵＧ ＣＵＧ ＧＣＵ ＡＣＵ ＣＵＣ ＡＵＧ Ｇ）ｄＡｄＧ−３'）は、ＧＴ４６８ ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０２１７９６．３）のヌクレオチド６７０〜６９０を標的した。対照として、スクランブルｓｉＲＮＡ二本鎖（順方向 ５'−ｒ（ＵＡＡ ＣＵＧ ＵＡＵ ＡＡＵ ＣＧＡ ＣＵＡ Ｇ）ｄＴｄＴ−５'、相補鎖方向 ５'−ｒ（ＣＵＡ ＧＵＣ ＧＡＵ ＵＡＵ ＡＣＡ ＧＵＵ Ａ）ｄＧｄＡ−３'）を使用した。ＧＴ４６８サイレンシング試験のために、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、細胞に１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ二本鎖を形質転換した。すべての結果を、ヌクレオチド３４２〜３６２を標的する２番目のセットのＧＴ４６８ ｓｉＲＮＡ二本鎖（順方向 ５'−ｒ（ＧＧＵ ＵＣＡ ＧＧＡ ＣＡＡ ＡＧＵ ＣＣＡ Ａ）ｄＴｄＴ−３'、相補鎖方向 ５'−ｒ（ＵＵＧ ＧＡＣ ＵＵＵ ＧＵＣ ＣＵＧ ＡＡＣ Ｃ）ｄＧｄＧ−３'）で再現した。
ｓｉＲＮＡを形質転換した後の細胞増殖分析
ｓｉＲＮＡ二本鎖を形質転換した２４時間後に、１０％ＦＣＳを添加した培地で１×１０４細胞を４８時間培養した。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を分析した。
細胞周期分析
様々な濃度の１０％ＦＣＳを添加した培地で細胞を培養した。ｓｉＲＮＡ二本鎖を形質転換した７２時間後に細胞を採集し、ＥｔＯＨで固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析を行った。細胞周期の種々の期にある細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）及びＦｌｏｗＪｏ（商標）（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）フローサイトメトリー解析ソフトウエアを使用して定量した。アポトーシス細胞にｓｉＲＮＡを形質転換した４８時間後及び７２時間後アネキシンＶ染色によって定量した。
細胞移動及び試験管内浸潤分析
実験前に１２時間無血清培地で培養した細胞に関して、８．０μｍ細孔膜を有するトランスウエルチャンバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において細胞移動分析を実施した。ｓｉＲＮＡ実験のために、上述したｓｉＲＮＡ二本鎖を形質転換した２４時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培地４００μｌ中の４×１０４細胞を上部チャンバーに加えた。下部チャンバーは、化学誘引物質として５％ＦＣＳを添加した培地８００μｌを含んだ。２４時間後、膜の下側に移動していた細胞を氷冷メタノールで固定した；膜を切り出し、顕微鏡スライドに載せて、蛍光顕微鏡検査のためにＨｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で標本作製した。５つのランダムな視野内の細胞（倍率１００倍）を各々の膜について計数した。すべての実験を三重に実施した。細胞のケモキネシスへの作用を、上部と下部の両チャンバーに化学誘引物質を添加して同じ実験設定を用いて分析した。試験管内浸潤分析のために、無血清培地中で１ｍｇ／ｍｌに希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＮＪ）１００μｌで上部チャンバーを作製した。ゲル化のためにチャンバーを３７℃で５時間インキュベートした。
抗体との培養後における細胞増殖分析
内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＤＭＥＭ細胞培養培地で１：２に希釈したハイブリドーマ上清と共に７２時間培養した。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を分析した。
あるいは、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＣＦ−７を、それぞれ、指示されている濃度で７２時間又は１２０時間、ＤＭＥＭ細胞培養培地で希釈したＨＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清と共に培養した。上述したように増殖を分析した。
あるいは、内因性にＧＴ４６８を発現している癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及び対照としてＧＴ４６８陰性黒色腫細胞株ＭｅｌＨｏを、ＤＭＥＭ（ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）又はＲＰＭＩ（ＭｅｌＨｏ）細胞培養培地で希釈したＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（１０μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養した。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を分析した。
免疫蛍光顕微鏡検査
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、免疫蛍光顕微鏡検査分析を使用した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰを形質転換したＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的な増殖条件下でチャンバースライドにおいて増殖させた。次に細胞をメタノール又はパラホルムアルデヒド／０．１％サポニンで固定した。細胞をＧＴ４６８に対する抗体と共に２５℃で６０分間培養した。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に培養した。
ＧＴ４６８ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐ又はＭｉｃｒｏｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ）を適切なＧＴ４６８ペプチド（５又は１０μｇ／ｍｌ）により３７℃で１時間被覆した。ＰＢＳ／３％ＢＳＡを用いて４℃で一晩ブロックした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートにハイブリドーマ上清（ＰＢＳ／３％ＢＳＡで１：５若しくは１：１０に希釈、又は２×ＰＢＳ／６％ＢＳＡ、ｐＨ７．３で１：２に希釈）又は精製抗体（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ、ｐＨ７．３で１μｇ／ｍｌに希釈）を負荷し、室温で１時間インキュベートした（９０ｒｐｍで軌道振とう）。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ、ｐＨ７．３中の二次抗体（ＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、９０ｒｐｍで軌道振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの最終洗浄工程後、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中の１ｍＭ又は１．５ｍＭ ＡＢＴＳからなる基質溶液を添加した。使用の直前に、基質溶液に０．３μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を添加した。３０〜６０分後に４０５ｎｍでの吸収はＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定した。
ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
マウス脾細胞は、以下で述べる種々の免疫プロトコールを使用してあらかじめ免疫しておいた動物から単離し、標準プロトコールに基づきＰＥＧでマウス骨髄腫細胞株に融合した。生じたハイブリドーマを、次に、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ、ＧＴ４６８ ＣｒＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光法（ＩＦ）によるＧＴ４６８−ｅＧＦＰを形質転換したＣＨＯ細胞を使用して、ＧＴ４６８特異性を有する免疫グロブリンの産生に関してスクリーニングした。
免疫マウスからの脾リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ ７３８６４１）を使用して２：１の比率でＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５９７）（又は５６−４Ａ−２及び６２−９Ｂ−１の場合はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０））と融合した。細胞は平底マイクロタイタープレートに約３×１０４／ウエルで塗布し、次に１０％ウシ胎仔血清、２％ハイブリドーマ融合物及びクローニング用添加剤（ＨＦＣＳ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ １ ３６３ ７３５）プラス１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ Ｈ０２６２）を含有する選択培地において約２週間インキュベートした。１０〜１４日後、個々のウエルをペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレートし、スクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングした。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのために組織培養培地中で少量の抗体を作製した。親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡ及びＩＦによって）、各々のハイブリドーマから少なくとも１個のクローンを選択した。
ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の精製
抗体は、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）を使用した一段階アフィニティークロマトグラフィーを実施することによってハイブリドーマ上清から作製した。抗体アイソタイプに依存してｐＨ３．０〜ｐＨ４．０の１００ｍＭクエン酸塩で溶出した後、収集した画分を直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。さらなる実験のために抗体製剤はＰＢＳ ５Ｌに対して２回透析し、滅菌ろ過して（０．２μｍ）、４℃で保存した。
アイソタイピング
ハイブリドーマ上清のアイソタイピングのために、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者によって述べられているように使用した。
ＧＴ４６８発現細菌の粗溶解産物を使用したＣｒＥＬＩＳＡ手順
・抗原の調製
大腸菌ＸＬＯＬＲ細菌をＧＴ４６８ ｐＱＥプラスミド又はインサートなしｐＱＥ（「標準」と称する）のいずれかで形質転換し、ＬＢ培地でＡ６００ｎｍ〜０，３５Ｅに増殖させた。２ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導し、細胞を３７℃で４時間増殖させた。タンパク質発現の適切な誘導とその動態をクマシーゲル分析によって観測した。細菌を遠心沈殿させ、０．２ｍＭのプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ塩酸塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有する少量のＰＢＳ、ｐＨ７．２に再懸濁した。細胞を氷上に置き、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ａ Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）によって破砕した。ＧＴ４６８及び標準溶解産物を、０．２ｍＭ ＡＥＢＳＦ及び２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度に希釈した。アリコートは窒素中で衝撃凍結し、使用時まで−７０℃で保存した。
・固相酵素免疫検定法の実施
使用前に、ＧＴ４６８並びに標準溶解産物は被覆緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７で希釈し、次に平底Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロウエルプレート（５０μｌ／ウエル、Ｎｕｎｃ）に移して、３７℃で２時間吸着させた。
抗原の固定化後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でプレートを２回洗浄し、その後界面活性剤なしで２回洗浄した。１：１００希釈したヒト血清５０μｌ／ウエルを添加し、周囲温度にて軌道振とう機上で１時間インキュベートした。一部の実験では、ヒト血清を、アッセイに供する前に前処理した。
各々個々の血清試料を、ＧＴ４６８又は標準溶解産物で被覆したウエルで並行して二重に試験した。プレートは上述したように再び洗浄し、３％（ｗ／ｖ）粉乳を含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で１：５０００希釈した５０μｌ／ウエルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを１００μｌ／ウエルの基質溶液［ＡＬＰ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１ｍｌにつき４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｍｅｒｃｋ）２ｍｇ］で室温にて３０分間展開し、直ちにマイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｗａｌｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）において４０５ｎｍの吸光度を読み取った。
フローサイトメトリー分析
ＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又はインサートなしプラスミド（モック）を形質転換したＨＥＫ２９３細胞を採集し、氷冷メタノールで固定して、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで３０分間ブロックした。細胞をハイブリドーマ上清と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／１ ＦＣＳで１０分間２回洗浄して、ヤギ抗マウスＣｙ３二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。
さらに、ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡ又はインサートなしプラスミド（モック）を形質転換したＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＮＵＧ−Ｃ４細胞又はＨＥＫ２９３細胞を採集し、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムでブロックした。細胞はハイブリドーマ上清と共に又はＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで希釈した５μｇ／ｍｌの精製抗体と共に１時間培養し、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで５分間３回洗浄して、ヤギ抗マウスＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＦＡＣＳａｒｒａｙを用いて細胞を分析した。
クローン形成法
クローン形成法又はコロニー形成法は、単一細胞がコロニーへと成長する能力を分析する試験管内での細胞生存検定法である。この分析は、コロニーを形成する能力へのＧＴ４６８抗体の有効性を調べるために実施した。ＧＴ４６８を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞を４８穴プレートに接種した（２０００細胞／ウエル）。ハイブリドーマ上清からのＦＰＬＣ精製抗体の存在下で（４５μｇ／ｍｌ）細胞を２週間増殖させ、すべてのアッセイを三重に実施した。コロニーを固定し、６％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）及び０．５％クリスタルバイオレット（ｗ／ｖ）で染色した。染色して乾燥したプレートから、Ｏｌｙｍｐｕｓデジタルコンパクトカメラ（Ｃ−７５０ Ｕｌｔｒａ Ｚｏｏｍ）を用いて写真を撮影し、目視で分析した。
ウエスタンブロット法
ＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又はインサートなしプラスミド（モック）を形質転換したＨＥＫ２９３細胞の全細胞溶解産物は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘベースの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＦ）を用いて調製した。抽出物は還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ）で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に電気転写した。ＧＴ４６８（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００７）又はハイブリドーマ上清からのＦＰＬＣ精製抗体（５μｇ／ｍｌ）に反応性のポリクローナル抗体で免疫染色を実施し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて一次抗体を検出した。
早期処置異種移植モデル
５×１０６のＧＴ４６８陽性ＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍細胞の接種の３日後に動物を精製モノクローナル抗体で処置した（２００μｇ静脈内、８動物／群）。抗体は週に２回２週間にわたって投与した。カリパスを用いて腫瘍の成長を観測した。
実験的転移アッセイ
エストロゲン依存性ＭＣＦ−７細胞の注射の１週間前に、１７β−エストラジオール持続放出ペレット（１ｍｇ、６０日放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の皮下移植によって無胸腺ヌードマウスを作製した。１×１０６ ＭＣＦ−７の静脈内注射後、動物を精製モノクローナル抗体（２００μｇ）で週に２回処置した。リアルタイムＰＣＲは、細胞の注射の５週間後に無胸腺マウス（５〜８動物／群）の肺における腫瘍量の定量のために使用した。肺組織からのＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、ヒト第１７染色体のαサテライト領域の２２６ｂｐフラグメント（順方向 ５'−ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＡＧ−３'；相補鎖方向 ５'−ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＣＡ Ｇ−３'）をＤＮＡ ２００ｎｇから増幅した。腫瘍量（ＤＮＡコピー数）を、健常対照マウスからの正常肺に関して定量した。
実施例２ ＧＴ４６８は様々な腫瘍において異常に活性化され、高発現される
胎盤特異的栄養膜遺伝子を同定するため、ゲノム全体でのデータマイニング法を適合させた。この方法はもともと、発明人が生殖細胞特異的分子の生体内での同定のために開発したものである（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。原則として、真正に胎盤特異的な遺伝子の予測のためにＧｅｎＢａｎｋの階層的キーワード検索は、デジタルｃＤＮＡライブラリーサブトラクションと組み合わせた。ＧＴ４６８はこの手法によって同定された。
ＧＴ４６８ ｍＲＮＡは、正常及び腫瘍組織標本の包括的な組み合わせにおいてエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検討した。ＧＴ４６８発現が胎盤に限定されることが確認された。すべての他の正常組織標本では、転写産物の量は、高感度ＲＴ−ＰＣＲのちょうど検出限界であるか又はそれ以下である（図１Ａ、Ｂ、Ｃ、表１）。唯一の例外は精巣であるが、転写産物レベルは胎盤で認められたものよりも対数で３から４低い。
種々の癌型にわたる原発性腫瘍標本の３８％（８６／２２５）及び腫瘍細胞株の５５％ （２２／４０）において、しかしながら、さもなければ転写が厳密に制御されるこの遺伝子の異常な活性化が認められた。ＧＴ４６８の保有率及び転写産物レベルは、乳癌及び乳癌細胞株において最も高かった（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。６２の原発性乳癌のうち４４（８２％）はＧＴ４６８発現に関して陽性（非栄養膜正常組織におけるバックグラウンドを少なくとも１００倍上回ると定義される）と評価され、２４％（１５／６２）は低発現（１００−１０００倍）、４０％（２５／６２）は中発現（１０００−１０，０００倍）、そして１７％（１１／６２）は高発現（＞１０，０００倍）を示した（図１Ｂ）。さらに、５０の肺癌試料のうち２１（４２％）並びに胃癌及び卵巣癌においてＧＴ４６８転写を認めた（表１）。ＧＴ４６８の誘導は、組織学的サブタイプ、腫瘍の病期又は腫瘍悪性度と相関しなかった。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、微量のＧＴ４６８転写産物だけが４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ後に正常組織において検出できた。発現カットオフ値（点線、すべての正常組織の平均発現＋３ＳＴＤ（９９％パーセンタイル値））を越える正常組織は胎盤と精巣だけであった（図２０Ａ）。乳癌に加えて、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌及び頭頸部癌からの試料においてＧＴ４６８の高発現が認められた（図２０Ｂ）。
ＧＴ４６８発現プラスミド（陽性対照）、ＳＫ−ＢＲ−３（乳癌）、ＢＥＷＯ（胎盤性絨毛癌）、ＪＡＲ（胎盤性絨毛癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＬｎＣａＰ（前立腺癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＪＥＧ−３（胎盤性絨毛癌）、ＪＩＭＴ−１（乳癌）、ＬＡ１−５５ｎ（神経芽細胞腫）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＢＴ−２０（乳癌）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（骨髄腫）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＴ４６８発現のウエスタンブロット分析は、これらの癌細胞株におけるＧＴ４６８の発現を明らかにした（図２１）。ＭｅｌＨＯ（悪性黒色腫）及びＮＵＧＣ４（胃癌）は試験陰性であった。
実施例３ ＧＴ４６８は癌細胞の表面上に位置し、抗体にとってアクセス可能である
ＧＴ４６８特異的ペプチドエピトープ（配列番号：２のアミノ酸１１７〜１２７）に対するポリクローナルウサギ抗体（ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端）を惹起した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＧＴ４６８の遺伝子サイレンシングによって抗体の特異性を検証した。ｓｉＲＮＡを排除するために、２組のＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖、スクランブル非サイレンシングオリゴヌクレオチド及び非トランスフェクト細胞に関して標的活性実験を実施した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９をこれらのｓｉＲＮＡ二本鎖でトランスフェクトすることにより、対照と比較して８０〜９０％の構成的ＧＴ４６８ ｍＲＮＡ発現の安定で再現可能な低下が達成された（図１Ｄ）。この所見と一致して、ウエスタンブロット法においてＧＴ４６８の予測サイズに従って検出された２６ｋＤａのバンドは、両細胞株においてほぼ完全に消失し（図１Ｅ）、ＧＴ４６８タンパク質発現の堅固なノックダウンと抗体の特異性を証明した。
ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端での一次ヒト組織試料におけるＧＴ４６８タンパク質のウエスタンブロット染色は、この遺伝子が、それが発現される唯一の正常組織である胎盤と同等のレベルで乳癌標本において検出可能であることを確認した（図１Ｆ）。ヒト乳癌組織切片でのウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端による免疫組織化学は、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＴ４６８ ｍＲＮＡ発現に関して陽性と分類された標本において特異的免疫反応性を示した。染色は腫瘍細胞集団に限定され、隣接間質細胞及び非腫瘍性上皮細胞並びにマッチする患者の正常組織は反応性ではなかった（図１Ｇ）。腫瘍細胞の免疫染色は形質膜において顕著であり、ＧＴ４６８が細胞表面タンパク質であることの証拠を提供した。
ＧＴ４６８タンパク質における配列のトポロジーのコンピュータ解析は、アミノ酸５〜２２にわたる疎水性ドメイン、続いてアミノ酸２３−２１２によって構成される大きな細胞外ドメインを予測した。ＧＴ４６８の細胞外部分のアミノ酸２９〜１１９は、末端が欠乏した透明帯（ＺＰ）ドメインである。ＺＰドメインは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型、ウロモジュリン、糖タンパク質ＧＰ２並びに精子受容体ＺＰ２及びＺＰ３を含む、様々な細胞外に露出された受容体様タンパク質において認められ（Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３００，２３７−２４０）、重合に関与する（Ｊｏｖｉｎｅ，Ｌ．，Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｌｉｔｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．（２００６）ＢＭＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７，１１）。構成的に発現されるＧＴ４６８の細胞内局在は、おそらくこのタンパク質の細胞外部分にその抗原決定基（アミノ酸１１７−１２７）を有する、ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端で染色したＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞の免疫蛍光顕微鏡検査によって評価した。両細胞株は細胞膜において明確な染色を示した（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡで誘導したＧＴ４６８発現のノックダウン時のシグナルの喪失は染色の特異性を確認した。最も重要な点として、特異的膜染色はメタノール固定細胞だけでなく非固定天然細胞でも認められ（図２Ｂ）、抗体のエピトープが細胞膜の透過処理なしでもアクセス可能であることを示唆し、それ故カルボキシ末端の細胞外局在という予測されたトポロジーを裏付けた。
実施例４ ＧＴ４６８のｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングは癌細胞の運動性、移動及び浸潤を阻害し、増殖をブロックする
腫瘍細胞におけるＧＴ４６８の生物学的重要性を調べるため、基本的細胞機能へのそのｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングの影響を検討した。
最初に、トランスウエル移動アッセイにおける乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９の成績を検討した。５％ＦＣＳを化学誘引物質としてシステムの上部及び下部の両チャンバーに添加することによって評価した両細胞株の基線運動性（ケモキネシス）は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によって実質的に阻害された（図３Ａ）。その結果として、細胞の指向性走化性移動能力の著明な低下も認められた（図３Ｂ）。さらに、細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌの障壁を突破することによって化学誘引物質勾配に沿って移動することができなかったので、細胞の化学浸潤活性もＧＴ４６８ ｓｉＲＮＡ処理によって大きく影響された（図３Ｃ）。
次に、ＤＮＡへのＢｒｄＵの組込みによって測定した腫瘍細胞増殖は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖により両細胞株において８０−９０％低下することが認められた（図４Ａ）。細胞周期分析は、増殖ブロックのための基礎となる要因として、ＧＴ４６８ ｓｉＲＮＡを形質転換した細胞における明確なＧ１／Ｓ停止を明らかにした（図４Ｂ）。細胞の生命力は影響を受けず、アネキシンＶでの染色はアポトーシス細胞死についての兆候を示さなかった（図４Ｃ）。
実施例５ 抗ＧＴ４６８抗体による癌細胞の処理は細胞増殖を阻害する
ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端及び非反応性対照抗体と共に培養したＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の増殖を測定した。ＧＴ４６８のターゲティングは、濃度依存的に両細胞株の増殖の効率的な阻害を生じさせた（図５）。
実施例６ ｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシングの下流への作用及び抗体誘導性のＧＴ４６８の機能的拮抗作用
真核細胞の増殖と細胞周期進行は、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって支配される。個々のサイクリンは、一連のＣＤＫの活性を刺激することによって細胞周期の異なる段階に作用する。制限点制御はサイクリンＤ及びサイクリンＥ依存性キナーゼファミリーによって媒介される（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．Ｏ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３，２６１−２９１；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０，３６８９−３６９５）。ＧＴ４６８サイレンシングが、サイクリン発現の変化を介して認められた細胞周期調節不全を誘導するのか否かを検討するため、ＧＴ４６８ ｓｉＲＮＡで処理したＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びサイクリンＥの発現を測定した。
興味深いことに、リアルタイムＰＣＲによって測定したサイクリンＤ１転写産物（図６Ａ）及びウエスタンブロット法におけるサイクリンＤ１タンパク質レベル（図６Ｂ）の有意の低下がＧＴ４６８ノックダウンの結果として起こった。分析した他のサイクリンに関しては転写レベルの変化を認めなかった。
サイクリンＤ１は、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行の主要調節因子であることが知られている。興味深いことに、散発性乳癌の腫瘍形成においては、サイクリンＤ１の過剰発現が初期事象とみなされる（Ｃａｌｄｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７，２６１−２７４；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４）。Ｄ型サイクリンは不安定であり、それらの誘導、合成及び触媒パートナーとの集合はすべて持続的な細胞増殖シグナル伝達に依存する。それ故、Ｄ型サイクリンは増殖因子センサーとして働き、細胞外因子に応答して活性なキナーゼを形成する（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３，１０５９−１０６５）。乳癌では、サイクリンＤ１発現がホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ依存性経路を介して制御されることが示されている（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｄ'Ａｍｉｃｏ，Ｍ．，Ｈｕｌｉｔ，Ｊ．，Ａｍａｎａｔｕｌｌａｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｚａｆｏｎｔｅ，Ｂ．Ｔ．，Ａｌｂａｎｅｓｅ，Ｃ．，Ｂｏｕｚａｈｚａｈ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｍ．，Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ，Ｌ．Ｈ．，Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｔａｋｅｍａｒｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３２６４９−３２６５７；Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｒｉｍｅｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ，Ａ．，Ｍａｌｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｅ．，Ｔｓｉｃｈｌｉｓ，Ｐ．Ｎ．＆Ｒｏｓｅｎ，Ｎ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９８６４−２９８７２）。ＡＫＴはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）を不活性化し、それによってサイクリンＤ１の転写並びにそのタンパク質分解による代謝回転と核内のそのタンパク質レベルを上昇させる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｄｉｅｈｌ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．＆Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２，３４９９−３５１１；Ｒａｄｕ，Ａ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｖ．，Ａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｈａｎａｆｕｓａ，Ｈ．＆Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ，Ｍ．Ｍ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３，６１３９−６１４９）。加えて、ＡＫＴ経路は、おそらくＧＴ４６８が関与する２つの他の細胞機能である、癌細胞の運動性と移動の重要な調節因子である（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，１６５５−１６５７；Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．＆Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４，２５７−２６２）。このことが本発明者らに、ＧＴ４６８がＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞におけるＡＫＴキナーゼの調節に影響を及ぼすか否かを分析することを促した。
ＰＩ３Ｋの過剰活性化に続くＡＫＴの構成的リン酸化及び過剰活性化が腫瘍細胞において頻繁に認められる。ｓｉＲＮＡ技術によるＧＴ４６８のサイレンシング後のＡＫＴのＳｅｒ４７３リン酸化（ｐＡＫＴ）のレベルの定量及び抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体によるその機能的拮抗作用はどちらも、特にＭＣＦ−７細胞においてｐＡＫＴレベルの著明な低下を生じさせ（図６Ｃ、Ｄ）、ＡＫＴキナーゼの活性化がＧＴ４６８の下流作用の遂行に関与することを示唆した。興味深いことに、ＰＴＥＮを欠き、それ故より高いレベルのＰＩ３Ｋ過剰活性化を有するＢＴ−５４９細胞において、ｐＡＫＴの下方調節はあまり顕著ではなかった。
実施例７ ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６マウスをＫＬＨ結合ペプチドで免疫した。ペプチド５０μｇ及びアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ ５０μｌを１、１５、４５及び８６日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在を２４、５７及び９２日目にペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって観測した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
配列番号：３−１０に従った配列を有するペプチドを、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製のために使用した。例えば、配列番号：３のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ４Ｅ９−１Ｈ９及び９Ｂ６−２Ａ９を生じ、配列番号：４のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ５９Ｄ６−２Ｆ２を生じ、配列番号：６のペプチドを使用した免疫はハイブリドーマ６１Ｃ１１−２Ｂ５及び７８Ｈ１１−１Ｈ６を生じた。
モノクローナル抗体の特異的結合を確実にするためにペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清を、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して１：５又は１：１０希釈液中で試験した。対照として、すべてのハイブリドーマ上清を２つの無関係なペプチドに対して試験した。すべてのモノクローナル抗体は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図７）。
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡検査によって分析した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰを形質転換した２４時間後にＣＨＯ細胞をハイブリドーマ上清（１：５希釈）で染色した。ｅＧＦＰシグナルと二次抗マウス抗体（Ａｌｅｘａ５５）のシグナルの併合は、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰ形質転換体の染色だけを示し、非形質転換体は陰性であった（図８）。
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１をハイブリドーマ上清（１：２希釈）と共に７２時間培養した。ＤＮＡへのＢｒｄＵの組込みによって細胞の増殖を測定した。モノクローナル抗体４Ｅ９ １Ｈ９は使用した濃度で細胞の増殖を変化させなかったが、抗体９Ｂ６ ２Ａ９及び５９Ｄ６ ２Ｆ２は、分析したすべての癌細胞株の増殖を明らかに低下させた（図９）。
それ故、細胞によって発現されるＧＴ４６８を選択的に標的するモノクローナル抗体を作製できることが示された。さらに、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖を阻害する、ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体を作製できることが示された。
実施例８ ＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでの免疫とそれに続くペプチド／タンパク質注射から得たＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６マウスを、１及び１５日目にＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド及びアジュバントとしてＰＥＩマンノースにより筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で免疫した。その後、ペプチド５０μｇ及びアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ ５０μｌ（腹腔内）、又はタンパク質１５０μｇ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（皮下）を３０及び４５日目に注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在をペプチド特異的ＥＬＩＳＡ又はＣｒＥＬＩＳＡによって観測した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
ＧＴ４６８ ＤＮＡを使用した２倍の筋肉内免疫及びそれに続く組換えＧＴ４６８タンパク質の２倍の皮下投与は、ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１を生じさせた。ＧＴ４６８ ＤＮＡを使用した２倍の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号：１０に従ったペプチドの２倍の腹腔内投与は、ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２を生じさせた。ＧＴ４６８ ＤＮＡを使用した２倍の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号：３に従ったペプチドの２倍の腹腔内投与は、ハイブリドーマ４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０及び４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４を生じさせた。
以下の表は、得られた抗体及びそれらのアイソタイプを列記する。
ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするために粗溶解産物（ＣｒＥＬＩＳＡ）を実施した。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８ ｐＱＥ発現ベクターで形質転換した大腸菌の溶解産物に対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を、インサートなし（モック）ｐＱＥプラスミドを形質転換した大腸菌の溶解産物に関して試験した。すべてのモノクローナル抗体は、特異的ＧＴ４６８溶解産物とのみ特異的に反応した（図１０Ａ）。
ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０及び４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするためにペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を無関係なペプチドに対して試験した。モノクローナル抗体は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図１０Ｂ）。
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を上述したフローサイトメトリー分析によって分析した。モノクローナル抗体４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４のフローサイトメトリー分析のために、約４０％の形質転換効率で一過性に形質転換したＨＥＫ細胞を使用した。すべてのハイブリドーマ上清はＧＴ４６８形質転換体の特異的染色を示し、偽の形質転換体では染色を認めなかった（図１１）。
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合は、ウエスタンブロット法によって分析した。すべてのハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８ ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを形質転換したＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示したが、偽の形質転換体の溶解産物はシグナルを示さなかった（図１２；モック溶解産物中のハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ ＧＴ４６８溶解産物のスピルオーバーから生じると考えられる）。
モノクローナル抗体が結合するＧＴ４６８タンパク質内の抗原決定基を同定するためにペプチドＥＬＩＳＡを実施した。完全なＧＴ４６８タンパク質配列は、１１アミノ酸のオーバーラップを有する５１のオーバーラップペプチド（１５量体）のセットとして合成した。すべてのハイブリドーマ上清はこれらのペプチドへの特異的結合に関してＥＬＩＳＡで試験した。対照として、無関係なペプチドを使用した。すべての上清はＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示した。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１は各々、ＧＴ４６８の線状抗原決定基への反応性を示唆する２つのオーバーラップペプチドへの結合を示した。２２−２Ａ−１及び２２−９Ｂ−１の結合パターンはより複雑であり、ＧＴ４６８タンパク質の配座抗原決定基に対する反応性を示唆した。
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０）又はＭＣＦ−７（４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４）を、図１４に示されている濃度で精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間又は１２０時間培養した。ＤＮＡへのＢｒｄＵの組込みによって細胞の増殖を測定した。無関係な対照モノクローナル抗体は細胞の増殖を変化させなかったが、モノクローナル抗体４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０及び４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４は、明らかに濃度依存的に細胞の増殖を低下させた（図１４）。
実施例９ 種々の免疫法を使用して得られたＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６マウスを表３に示すように免疫した。ペプチド：ペプチド５０μｇ及びアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ ５０μｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＤＮＡ：ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡ及びアジュバントとしてＰＥＩマンノースを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。組換えタンパク質：ＧＴ４６８タンパク質１５０μｇ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。細胞：ＧＴ４６８プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした１〜２×１０７ ＨＥＫ２９３細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。一般に、免疫原を２週間ごとに投与した。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出術の３日前に追加免疫した。
以下の表は、得られた抗体及びそれらのアイソタイプを列記する。
これらの抗体並びにそれぞれ実施例７及び８で得られた２つのさらなる抗体７８Ｈ１１ １Ｈ６（アイソタイプ：ＩｇＧ１）及び２２−１Ａ−１（アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ）をさらなる試験のために使用した。
図１３及び２５に示す、１１アミノ酸のオーバーラップを有する５１のオーバーラップペプチド（１５量体）のセットを使用したペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施して、モノクローナル抗体が結合しているＧＴ４６８タンパク質の抗原決定基を同定した。各々の精製ハイブリドーマ上清をすべてのペプチドへの特異的結合に関してＥＬＩＳＡで試験した。対照として無関係なペプチドを使用した。
表５に示すように、１５の上清はＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示した。１５の上清のうちで、１３の上清は１個のペプチド又は２若しくは３個の隣接ペプチドに結合してＧＴ４６８の線状抗原決定基の認識を示唆し、２つの上清は、少なくとも部分的に、隣接していないペプチドに結合して抗原決定基の線状／配座の定義付けを示唆した。９つの上清は、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡにおいてＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示さなかったが、ＦＡＣＳ又はＩＦでは結合を示し、ＧＴ４６８の非線状配座抗原決定基に対する反応性を示唆した。
ＧＴ４６８タンパク質への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の特異的結合をフローサイトメトリー分析によって分析した。ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＧＴ４６８ａａ１１６−２１２で安定に形質転換した天然の固定していないＨＥＫ２９３細胞又は偽の形質転換体をＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）で染色した。プラスミドｐＤｉｓｐｌａｙ−ＧＴ４６８ａａ１１６−２１２において、ＧＴ４６８のアミノ酸１１６〜２１２をＣ末端でＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインに融合する。この構築物は、細胞の形質膜上でのＧＴ４６８ａａ１１６−２１２の安定な発現を確実にする。細胞を、その天然配座のＧＴ４６８への結合を検出する非固定状態の上清で染色した。ハイブリドーマ上清はＧＴ４６８形質転換体の特異的染色を示したが、偽の形質転換体では染色を認めなかった（図１５）。
内因性にＧＴ４６８を発現する非固定腫瘍細胞への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の特異的結合をフローサイトメトリー分析によって分析した。ＭＣＦ−７ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を、内因性にＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞として使用し、ＧＴ４６８を発現しないＮＵＧ−Ｃ４胃癌細胞を陰性対照として使用した。天然の非固定細胞をＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）で染色した。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の特異的染色を様々な程度に示した。上清の一部については細胞集団が有意に染色されるが（４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２、２２−１Ａ−１、３５−５０Ａ−２ａ、５４−４Ｂ−２）、別の上清では亜集団（細胞の約５％）だけが陽性である（図１６）。これは、強発現亜集団への結合を示唆する。これらの結果は、抗体がＧＴ４６８発現腫瘍細胞に結合できることを明らかにする。
完全長ＧＴ４６８タンパク質への、ハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体の特異的結合はウエスタンブロット法によって分析した。ＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（５μｇ／ｍｌ）は、ＧＴ４６８発現プラスミドを形質転換したＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示したが、偽の形質転換体の溶解産物はシグナルを示さず、ＧＴ４６８への結合が特異的であることを明らかにした（図１７、２３）。
ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の増殖阻害活性を増殖アッセイにおいて分析した（図１８、２２）。内因性にＧＴ４６８を発現する乳癌細胞（ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）及びＧＴ４６８陰性ＭｅｌＨｏ黒色腫細胞又はＮＵＧＣ４胃癌細胞を９６穴プレートに接種し（５０００細胞／ウエル）、指示されている濃度のＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清と共に培養した。７２時間後にＤＮＡへのＢｒｄＵの組込みによって細胞の増殖を測定した。すべての値を、ハイブリドーマ上清と共にインキュベートしていない対照細胞に対して基準化する。ＭｅｌＨｏ又はＮＵＧＣ４対照細胞では増殖阻害を認めなかった。ハイブリドーマ上清は、濃度依存的に様々な程度でＧＴ４６８発現乳癌細胞への特異的増殖阻害活性を示した。抗体の一部（３５−４８Ｂ−１、４８−３Ｂ−１、５１−１Ａ−１、５６−４Ａ−２）は、試験したＧＴ４６８陽性細胞株すべてに対して有意の作用を示した。
内因性にＧＴ４６８を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞のコロニー形成への、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の阻害活性を分析するためにクローン原性アッセイを実施した。細胞は４８穴プレートに接種し（３０００細胞／ウエル）、ＦＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清（４５μｇ／ｍｌ）と共に培養した。１４日間にわたって増殖させたコロニーをグルタルアルデヒドで固定し、目視評価のためにクリスタルバイオレットで染色した。細胞を抗体と共に培養することは、コロニー形成を低減又は阻害した（図１９）。コロニー形成は、個々の腫瘍細胞が器官に定着した場合の転移の形成に関して重要である。抗体の阻害活性は、転移の形成を抑制する上でのそれらの潜在能を示す。
実施例１０ 抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体による処置はヌードマウスにおいて異種移植腫瘍の増殖を減弱させる
ＧＴ４６８陽性ＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌細胞をヌードマウスに皮下注射し、動物を精製抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置した。図２４は、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体による処置がヌードマウスにおいてＢＥＷＯ胎盤性絨毛癌異種移植腫瘍の増殖を減弱させることを明らかにする。
実施例１１ 抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体による処置はヌードマウスの肺における転移性腫瘍量を減少させる
ＭＣＦ−７細胞を、１７β−エストラジオール持続放出ペレットの皮下移植によって前処置した無胸腺ヌードマウスに静脈内注射し、動物を精製抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置した。細胞の注射の５週間後に無胸腺マウスの肺における腫瘍量の定量のために用いたリアルタイムＰＣＲは、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体で処置したマウスの肺における転移性腫瘍量の有意の減少を明らかにした（図２６）。

Claims (23)

  1. ＧＴ４６８に結合する能力を有し、且つ以下の１つ又はそれ以上の活性を有する抗体：
    （ｉ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞の死滅化、
    （ｉｉ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞の増殖の阻害、
    （ｉｉｉ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞のコロニー形成の阻害、及び
    （ｉｖ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞の転移の阻害。
  2. 前記１つ又はそれ以上の活性が、前記細胞によって発現されるＧＴ４６８の細胞外ドメインへの前記抗体の結合によって誘導される請求項１に記載の抗体。
  3. ＧＴ４６８を発現する前記腫瘍細胞が癌細胞である請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 前記癌細胞が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態、並びに肺の転移性癌からなる群より選択される癌に由来する請求項３に記載の抗体。
  5. モノクローナル、キメラ、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントである請求項１乃至４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. ＧＴ４６８が配列番号：２に従ったアミノ酸配列を有する請求項１乃至５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記抗体がＧＴ４６８に特異的に結合する請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. ＧＴ４６８の天然抗原決定基に結合する請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 配列番号：２−１０及び３５−８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、あるいは前記タンパク質若しくはペプチド又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体を発現する核酸又は宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって得られる請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. （ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２）又はＤＳＭ ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１）の下で寄託されたクローンによって産生されるか又は前記クローンから得られる抗体、
    （ｉｉ）（ｉ）の下にある抗体のキメラ又はヒト化形態である抗体、
    （ｉｉｉ）（ｉ）の下にある抗体の特異性を有する抗体、及び
    （ｉｖ）（ｉ）の下にある前記抗体の前記抗原結合部分又は抗原結合部位を含む前記抗体
    からなる群より選択される抗体。
  11. （ｉ）の下にある前記抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位が、（ｉ）の下にある前記抗体の可変領域を含む、請求項１０に記載の抗体。
  12. 請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の前記抗体を産生することができるハイブリドーマ。
  13. アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２ ２Ｄ４ １Ａ１０）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９ １Ｄ１２ ２Ｄ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６１（４２Ｈ１１ １Ｃ１１ ２Ｂ２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６２（５１Ｇ６ ２Ｈ３ ２Ｂ４）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４３（１６−５Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５６（２０−１１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４７（２９−１Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６４（２９−８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５９（３５−４８Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６３（３５−５０Ａ−２ａ）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５７（３８−１０Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５８（３８−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４８（４４−３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４９（４５−２Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５０（４５−８Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５１（４８−３Ｂ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５２（４８−４Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４６（４９−３Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４５（４９−８Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９４４（５１−１Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５３（５３−１３Ａ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５５（５３−２９Ａ−１）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９６０（５４−４Ｂ−２）、ＤＳＭ ＡＣＣ２９５４（５６−４Ａ−２）又はＤＳＭ ＡＣＣ３００１（６２−９Ｂ−１）の下で寄託されたハイブリドーマ。
  14. 治療薬に結合した請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体を含む複合体。
  15. 前記治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質である請求項１４に記載の複合体。
  16. 請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１４または１５に記載の複合体、並びに医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
  17. ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１４または１５に記載の複合体と接触させることを含む方法。
  18. ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞を死滅させる方法であって、前記細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１４または１５に記載の複合体の有効量と接触させることを含む方法。
  19. ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞の転移拡大を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１４または１５に記載の複合体の有効量と接触させることを含む方法。
  20. 被験者においてＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合を特徴とする細胞が関与する疾患又は障害を治療するか又は予防する方法であって、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１４または１５に記載の複合体、または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与することを含む方法。
  21. 前記疾患又は障害が腫瘍関連疾患である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記腫瘍関連疾患が癌である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記癌が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸癌及び甲状腺癌、並びにそれらの転移形態、並びに肺の転移性癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
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