CN107556369A - 一种抗原肽和用于检测肿瘤细胞的抗体制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种抗原肽，所述抗原肽具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(b)含有(a)中所示氨基酸序列或其中4个以上氨基酸序列的多肽或蛋白质分子，并且所述多肽或蛋白质分子具有与(a)中多肽相同的免疫原性。将该抗原肽作为抗原可制备包括单克隆抗体和多克隆抗体的抗体。单克隆抗体和多克隆抗体均可通过与肿瘤细胞中的过表达蛋白结合用于检测肿瘤细胞。本发明通过制备有效的抗体来检测肿瘤中的过表达蛋白，对于检测肿瘤抗体具有重要意义。

Description

一种抗原肽和用于检测肿瘤细胞的抗体制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗原肽和将该抗原肽作为抗原制备的抗体，具体而言，涉及一种用于检测肿瘤细胞的抗体的制备方法及其应用。

背景技术

肿瘤细胞中的过表达的蛋白包括蛋白酶活化受体-1、泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白等。其中蛋白酶活化受体-1(PAR-1)由425个氨基酸组成，含7个疏水跨膜域，为典型的G蛋白偶联受体，PAR-1广泛分布在各种组织细胞上，包括上皮细胞，血小板，内皮细胞，成纤维细胞，单核细胞，T淋巴细胞，成骨细胞，平滑肌细胞，神经细胞，神经胶质细胞及某些癌细胞系等，在恶性肿瘤如乳腺癌中高表达，指导乳腺癌治疗的疗效和预后关系。其在恶性肿瘤的侵袭转移和血管生成过程中扮演着重要的角色。

泛素连接酶体组成亚基异常表达可促进肿瘤发生，而泛素连接酶E3决定底物蛋白的特异性，开发针对特定E3泛素连接酶的靶向抑制剂来阻断部分蛋白底物降解，而不影响其他蛋白的降解，将增加药物选择性和降低药物毒副作用，目前已经成为泛素-蛋白酶体系统靶向治疗药物的主要研究方向。此外锌指蛋白在人脑胶质瘤中过表达；mdm2结合蛋白是含491个氨基酸的核蛋白，是一个环状区域的E3泛素连接酶，也是调节P53的肿瘤抑制基因，mdm结合到P53上，使P53的转录功能失活，抑制P53的乙酰化，促进P53泛素化，促进P53的降解，它还参与细胞周期反应，参与上皮性肿瘤的发生，包括乳腺癌，其在乳腺癌中高表达。PAR-1、泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白都具有广泛的生物学效应，参与诸多疾病的发生发展。

但是目前，现有技术中并未报道可以与肿瘤细胞中多个过表达蛋白相结合的抗体，也未报道通过肿瘤细胞中的过表达蛋白与肿瘤细胞检测之间的相互关系。

因此，我们设计并制备多肽序列，合成人工抗原，制备有效的抗体检测肿瘤中的过表达蛋白，具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计多肽序列并制备出针对该序列的抗体。该抗体可以与肿瘤细胞中过表达蛋白相结合，从而对肿瘤细胞进行检测。

根据本发明的一个实施例，提供了一种抗原肽，所述抗原肽具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)含有(a)中所示氨基酸序列或其中4个以上氨基酸序列的多肽或蛋白质分子，并且所述多肽或蛋白质分子具有与(a)中多肽相同的免疫原性。

根据本发明的另一个实施例，提供了上述抗原肽作为抗原在制备用于检测肿瘤细胞的抗体及抗体片段中的应用。

在上述应用中，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组表达的抗体或抗体片段

在上述应用中，肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌或脑胶质瘤。

根据本发明的另一个实施例，提供了一种抗体的制备方法，包括：合成如SEQ IDNO.1所示的多肽序列或包括于该序列中的多肽序列片段；将所述多肽序列与大分子载体偶联或直接合成制备出多抗原肽(Multiple-Antigen peptide,MAP)以制备抗原；以及使用所述抗原作为免疫原制备所述抗体。其中，多抗原肽是一个由赖氨酸核和多个由同一多肽分子构成的具有免疫原性的大分子。这个大分子的多肽部分组成了造成动物免疫应答的多个相同抗原决定簇，而赖氨酸核部分只起连接多肽的作用，它本身没有免疫原性。在本发明中，多抗原肽和佐剂配合使用会引起动物强烈的免疫应答。

在上述制备方法中，所述大分子载体包括BSA、KLH、OVA中的一种或者其他大分子物质。

在上述制备方法中，使用所述抗原作为免疫原制备的所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组表达的抗体或抗体片段。

根据本发明的另一个实施例，还提供了通过上述制备方法制得的抗体及抗体片段在检测肿瘤细胞中的应用。

在上述应用中，肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌或脑胶质瘤。

有益效果：本发明实施例提供了一种抗体的制备方法，抗体包括通过免疫大耳白兔产生的多克隆抗体以及通过免疫小鼠、细胞融合、杂交瘤细胞株的筛选与克隆、体外诱生法得到的单克隆抗体。本发明实施例制备的抗体通过与肿瘤细胞中的过表达蛋白结合来对其进行检测，可用于检测各种肿瘤细胞，本发明通过制备有效的抗体来检测肿瘤中的过表达蛋白，对于检测肿瘤疾病具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了鼠单克隆抗体的纯度鉴定结果。

图2示出了鼠单抗与PLC/PRF/5细胞反应激光共聚焦显微镜观察图。

图3示出了兔多抗与PLC/PRF/5细胞反应激光共聚焦显微镜观察图。

图4示出了鼠单抗鉴定人肿瘤细胞的Western blot结果。

图5示出了鼠单抗鉴定人正常细胞的Western blot结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的抗体的制备方法，包括：

合成如SEQ ID NO.1所示的多肽序列；将所述多肽序列与大分子载体连接以制备抗原，所述大分子载体包括BSA、KLH、OVA或者其他大分子物质；以及使用所述抗原作为免疫原制备所述抗体。

使用所述抗原作为免疫原制备的所述抗体包括多克隆抗体，所述多克隆抗体的制备方法包括：以所述抗原免疫大耳白兔，收集血清，经纯化，即得。使用所述抗原作为免疫原制备的所述抗体包括单克隆抗体，所述单克隆抗体的制备方法包括：以所述抗原免疫小鼠取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；进行杂交瘤细胞株的筛选与克隆；以及小鼠腹腔注射所述杂交瘤细胞株，待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，离心，取上清，经纯化，即得。其中，抗体的纯化方法可以采用饱和硫酸铵盐析法或通过白纯化仪。

本发明制备的抗体通过与肿瘤细胞中的过表达蛋白结合来对其进行检测，可用于检测包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、脑胶质瘤的肿瘤细胞。本发明提供制备廉价、有效的抗体来检测肿瘤中的过表达蛋白，对于检测肿瘤抗体具有重要意义。

实验材料：

实验药品：设计多肽序列SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Gly-Ser-Asp-Trp-Gln-Phe-Gly-Ser-Glu-Cys。

sulfo-SMCC购于Thermo公司，KLH和弗氏佐剂购于sigma公司，BSA购于上海生物工程有限公司。

试剂：PEG1450、HAT培养液、HT培养液，购自美国Sigma；胎牛血清购自Exbiology；羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠IgG-TRITC购于凯基生物，其余常用试剂均为国产分析纯。

实验仪器：日本岛津ΜV-1800紫外分光光度计，上海天河环境技术有限公司；AR2202CN电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；涡漩混匀器，QZ-861涡旋混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Centrifuge离心机5702，Eppendorf；Milli-Q超纯水系统、ECL和化学发光底物，Millipore；CO₂恒温培养箱IL-161HI，日本三洋；激光共聚焦显微镜，尼康；BCD-192KJ4度冰箱，青岛海尔股份有限公司。

实验动物：SPF级6～8周龄balb/c雌性小鼠18～22g；3个月龄雄性日本大耳白兔2～3kg，购于天津实验动物中心。

建立实验动物模型：分别将日本大耳白兔和balb/c小鼠在标准化动物房环境中适应7天，给予标准灭菌动物饲料，饮用高压灭菌水，并及时更换垫料(每周2-3次)。标号，适应性饲养一周后进行实验。

实施例1：多克隆抗体的制备

1、制备人工抗原：通过计算机辅助设计出序列为Phe-Ser-Gly-Ser-Asp-Trp-Gln-Phe-Gly-Ser-Glu-Cys的SEQ ID NO.1多肽序列，然后，将该多肽序列与大分子载体蛋白连接，作为人工抗原。

2、动物免疫

用本实验室合成纯化的人工抗原，将2～3kg的日本大耳白兔背部皮下注射。大耳白兔初次免疫剂量0.25～2.5mg，用生理盐水稀释到适当体积，再加等体积弗式完全佐剂(FCA)，采用注射器推拉法乳化成油包水(W/O)状态免疫14天后加强免疫，剂量减半，佐剂改为弗氏不完全佐剂(FIA)。加强免疫2次后耳缘静脉取血测定效价，以待测孔OD值(P)与阴性对照孔OD值(N)的比值＞2.1即P/N＞2.1的最小值的血清稀释度为待测血清效价。待效价达到1:100000以上，证明大耳白兔免疫成功，取全血。离心低温保存血清。得到的多抗血清用蛋白纯化仪纯化，也可以采用饱和硫酸铵盐析法。其中，免疫佐剂还可以用氢氧化铝佐剂、明矾佐剂、脂质体等替换。

其中，间接ELISA方法检测血清抗体效价：

包被：取包被抗原用缓冲液稀释，混匀后加入96孔酶标板的孔中，0.1～1μg/孔，用密封膜封好，放冰箱中，4℃孵育过夜，洗板，室温封闭1h。洗板后加样：每孔加100μL梯度稀释的待检抗体(阴性对照孔加100μLPBS)，室温孵育1h。洗板后加二抗：每孔加100μL过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白，室温孵育30min。洗板，加显色液TMB100μL/孔，室温孵育20min。然后加入2mol/LH₂SO₄ 50μL中止反应。在波长450nm处用酶标仪读出各孔的OD值。

实施例2：单克隆抗体的制备

1、制备人工抗原：通过计算机辅助设计出序列为Phe-Ser-Gly-Ser-Asp-Trp-Gln-Phe-Gly-Ser-Glu-Cys的SEQ ID NO.1多肽序列，然后，将该多肽序列与大分子载体蛋白连接，作为人工抗原。

2、动物免疫

用本实验室合成纯化的人工抗原，将6～8周龄的雌性Balb/c小白鼠背部皮下注射。Balb/c小鼠的免疫剂量为50～250μg/只，首次免疫用0.9％生理盐水溶解免疫原，再与等量弗式完全佐剂(FCA)混合，完全乳化，颈背部皮下分2～3点注射；加强免疫，佐剂改为弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，小鼠颈背部和腋下皮下免疫，每次间隔14d，第4次免疫后7～10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，用间接ELISA检测小鼠血清，待效价达到1:10000以上，取其脾细胞与骨髓瘤细胞株NS-1进行细胞融合，融合前3d不加佐剂，尾静脉注射抗原50～100μg冲击免疫。融合前小鼠眼眦取血，4000r/min离心10min，-20℃保存备用，其中，免疫佐剂还可以用氢氧化铝佐剂、明矾佐剂、脂质体等替换。

3、细胞融合及杂交瘤细胞的筛选与克隆

常规方法细胞融合，融合一周左右，肉眼观察到小细胞群落，采用间接ELISA法，取培养基上清液检测。选择分泌阳性抗体的孔，用HT培养基扩大培养后，采用有限稀释法接种于96孔培养板内，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100％。

4、单克隆抗体的大量制备：取BALB/c小鼠腹腔注射0.5～1.0mL/只弗氏不完全佐剂。1周后用PBS重悬阳性单克隆杂交瘤细胞株，调密度至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔注射1mL。10d～15d后待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，2000rpm/min离心10min，取上清分装，-80℃保存。当然，以上仅仅是实例，单克隆抗体的大量制备也可以采用体外培养法。

5、单克隆抗体的纯化：通过蛋白纯化仪或者饱和硫酸铵盐析法纯化腹腔接种杂交瘤细胞获取的小鼠腹水。

其中，间接ELISA方法检测血清抗体效价：

包被：取包被抗原用包被液稀释，混匀后加入96孔酶标板的孔中，1μg/孔，用密封膜封好，放冰箱中，4℃孵育过夜，洗板。封闭：各孔加入200μL1％的牛血清白蛋白(BSA)，用密封膜封好，室温1h。洗板，拍干。加样：每孔加100μL梯度稀释的待检抗体(阴性对照孔加100μLPBS)，室温孵育1h。洗板，拍干。加二抗：每孔加100μL过氧化物酶标记羊抗小鼠免疫球蛋白，室温孵育30min。洗板，加显色液TMB100μL/孔，室温20min(避光)。然后加入2MH₂SO₄ 50μL中止反应。在波长450nm处用酶标仪读出各孔的OD值。

实施例3：细胞免疫荧光法鉴定抗体特异性

(1)先在24孔板各孔中加入细胞爬片，取对数生长期的人肝癌细胞PLC，用胰蛋白酶消化计数后使每孔加入3000～10000个细胞，继续培养待细胞完全贴壁后吸去孔中培养基，用室温的PBS洗3遍。

(2)每孔加预冷到-20℃的4％多聚甲醛，室温固定，使细胞固定在细胞爬片上。PBS洗3遍。

(3)每孔加入细胞透化液，室温透化。PBS洗3遍。

(4)每孔加入5％胎牛血清封闭液，室温封闭1h。

(5)用细胞封闭液将在实施例1中制备的多克隆抗体和在实施例2中制备的单克隆抗体，分别稀释到相应稀释倍数，将各种抗体加入到各孔中，混匀。室温孵育1.5小时。吸去液体，用PBS洗3遍。

(6)每孔加入封闭液稀释的羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔IgG-FITC，混匀。室温孵育1h。此步骤注意避光操作。吸去液体，用PBS洗3遍。

(7)在载玻片上滴加DAPI封片剂，避光保存。将激光共聚焦显微镜调好焦距和荧光强度后对各组爬片进行拍摄。

实施例4：Western blot鉴定抗体的特异性

将人肿瘤细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721、MCF-7、MDA-MB-231和人正常细胞HUVEC和HEK-293用裂解液裂解后，Nanodrop2000测蛋白浓度，计算合适的体积，使各细胞蛋白上样量都为100～400μg，然后SDS-PAGE。而后转膜，将蛋白转到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，每个膜条分别与内参GAPDH和单克隆抗体4℃过夜孵育。洗涤后与HRP标记羊抗鼠室温孵育1h，使用HRP-ECL化学发光底物检测信号，X胶片曝光显影。可看到位于82kD的条带首先显现出来，然后74kD、67kD、54kD、47kD、94kD的条带依次显现出来。它们分别是肿瘤细胞中的过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白、蛋白酶活化受体-1和PAR-1的二聚体。

实验结果：

1)杂交瘤细胞的建立

细胞融合共进行2次，经间接筛选和3次有限稀释法克隆化，即可获得可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

2)腹水的制备及纯化

纯化后的抗体通过SDS-PAGE检测，可见杂质蛋白被大量去除，只剩IgG重链和轻链。纯化后测得的单抗的浓度为5mg/mL，如图1所示。

3)抗体特异性鉴定

①鼠单抗以及兔多抗能与人肝癌细胞PLC/PRF/5中的肿瘤过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白和蛋白酶活化受体-1等结合，绿色荧光标记阳性反应物在细胞胞浆内和细胞膜上均可见，如图2和图3所示。②Westernblot分析表明鼠单克隆抗体能与人肿瘤细胞中的肿瘤过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白和蛋白酶活化受体-1等结合，如图4。而在上样量相同的情况下，人正常细胞却没有条带显示，如图5。

实验结论：

1)计算机辅助方法设计出多肽序列并合成多肽序列。由于多肽序列是由12个氨基酸构成的，分子量太小不能作为免疫原，所以我们设计了大分子载体与之连接使其成为人工抗原，并通过一定的方法鉴定多肽序列与载体蛋白是否偶联成功。为多克隆抗体和单克隆抗体的制备打下坚实的基础。

2)免疫日本大白耳兔后获得的血清通过ELISA实验检测到其效价很高1:100000以上，说明我们所设计的人工抗原的免疫原性比较好。

3)在研究中,我们运用杂交瘤技术成功地制备出可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。并通过蛋白纯化仪纯化出单克隆抗体。其亚类均为IgG2b。亲和力测定表明，单抗的亲和力为3.4×10⁷左右。

4)免疫荧光实验结果表明鼠单抗和兔多抗均能与人肝癌细胞PLC胞浆内与细胞膜上的肿瘤过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白和蛋白酶活化受体-1等结合，呈现不同程度的阳性反应。

5)Western blot分析表明鼠单抗和兔多抗均能与肿瘤细胞中的过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白和蛋白酶活化受体-1。其分子量依次是82KD、74KD、67KD、54KD和47KD。其中泛素连接酶的条带比较深，有文献报道泛素连接酶体组成亚基异常表达促进肿瘤发生，而泛素连接酶E3决定底物蛋白的特异性，开发针对特定E3泛素连接酶的靶向抑制剂来阻断部分蛋白底物降解，而不影响其他蛋白的降解，将增加药物选择性和降低药物毒副作用，目前已经成为泛素-蛋白酶体系统靶向治疗药物的主要研究方向。此外锌指蛋白在人脑胶质瘤中过表达；mdm2结合蛋白是491个aa的核蛋白，是一个环状区域的E3泛素连接酶，也是调节P53肿瘤抑制基因，mdm结合到P53上，使P53的转录功能失活，抑制P53的乙酰化，促进P53泛素化，促P53的降解，它还参与细胞周期反应，参与上皮性肿瘤的发生，包括乳腺癌，在乳腺癌中高表达。而位于最上边94KD的条带也存在于购买的商业化的单抗鉴定肿瘤细胞中的PAR-1，有可能是PAR-1的二聚体。

本发明得到的抗体可以通过免疫荧光实验和western blot等方法鉴定肿瘤细胞中过表达蛋白泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白、蛋白酶活化受体-1。western blot得到的条带分别对应肿瘤细胞中的相应蛋白，在正常细胞上样量相同的情况下是不显示条带的。肿瘤患者包括肝癌，乳腺癌，肺癌，胃癌，结直肠癌，胰腺癌，宫颈癌卵巢癌，前列腺癌，鼻咽癌，大肠癌，脑胶质瘤等。因此本发明提供一种未来用于检测肿瘤疾病的抗体的制备方法。

在本发明中，用计算机辅助方法设计出多肽序列并设计了与大分子载体蛋白偶联的方法，合成了人工抗原，通过动物免疫技术与细胞融合技术制备出了多克隆抗体和单克隆抗体。通过western blot、免疫荧光等方法证明该抗体可以与肿瘤细胞中的过表达蛋白，包括泛素连接酶E3、锌指蛋白568亚型5、锌指蛋白568亚型6、mdm2结合蛋白、PAR-1等结合，因此，本发明提供的抗体可用于肿瘤疾病的检测。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗原肽，其特征在于，所述抗原肽具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)含有(a)中所示氨基酸序列或其中4个以上氨基酸序列的多肽或蛋白质分子，并且所述多肽或蛋白质分子具有与(a)中多肽相同的免疫原性。

2.根据权利要求1所述的抗原肽作为抗原在制备用于检测肿瘤细胞的抗体及抗体片段中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组表达的抗体或抗体片段。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌或脑胶质瘤。

5.一种抗体的制备方法，其特征在于，包括：

合成如SEQ ID NO.1所示的多肽序列或包括于所述多肽序列中的多肽序列片段；

将所述多肽序列与大分子载体偶联或直接合成制备出多抗原肽以制备抗原；以及

使用所述抗原作为免疫原制备所述抗体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述大分子载体包括BSA、KLH、OVA中的一种或者其他大分子物质。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，使用所述抗原作为免疫原制备的所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组表达的抗体或抗体片段。

8.权利要求5～7中任一项所述的抗体及抗体片段在检测肿瘤细胞中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌或脑胶质瘤。