CN104497140B - 一种全人源her2抗体、其编码基因及应用 - Google Patents
一种全人源her2抗体、其编码基因及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物化学领域,具体涉及一种全人源HER2抗体、其编码基因及应用。本发明提供了一种全人源HER2抗体,其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。全人源HER2抗体可降低输液反应和免疫原性,提高药物安全性,具有更好的药物动力学特征。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体涉及一种全人源HER2抗体、其编码基因及应用。
背景技术
HER2/neu(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,人表皮生长因子受体2),又称erbB-2,是生长因子受体家族成员之一。该受体蛋白通常只在胎儿时期表达,成年以后只在极少数正常组织内低水平表达,然而在多种人类肿瘤组织中(如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、原发性肾细胞癌、子宫内膜癌等)却过度表达,并提示预后不良。HER2/neu的过度表达可导致肿瘤细胞过度增殖和新生血管的形成,造成肿瘤高复发率、高转移率和高死亡率。研究表明,HER2/neu的过度表达会出现在约30%的乳腺癌和16%的胃癌患者中,是乳腺癌患者预后差的指征,同时在胃癌的发生、发展和侵袭性/转移性上也发挥着重要作用。
针对HER2/neu靶点的单克隆抗体药物治疗是继手术和放、化疗后较为有效的治疗手段。赫赛汀(Herceptin)是美国Genentech公司(现属Roche公司)研制,于1998年上市的以HER2/neu为靶点的拮抗性人源化单克隆抗体药物,被批准用于HER2/neu高表达的乳腺癌和胃癌的治疗。该抗体抑制了HER2/neu的信息传递活性,从而阻断了下游信号传导,导致癌细胞增殖停滞和新生血管形成的抑制。赫赛汀作为一线用药在乳腺癌术后与化疗合用已在临床中被证实可使病人生存期延长,并使复发率下降50%。
赫赛汀的分子药理机制通常被认为是通过抑制HER2磷酸化、阻断细胞增殖周期、加速受体内化及抗体Fc段诱导的效应器作用(如抗体介导的细胞杀伤作用,ADCC)的共同结果。
尽管相当多的HER2阳性乳腺癌病人在赫赛汀治疗的起始阶段对抗体药物有良好的反应,但最终疾病还会进展和恶化,有约70%病例对赫赛汀治疗无效和产生耐药状况。因此,寻求更为有效的抗HER2/neu抗体是目前临床迫切需要解决的问题。
赫赛汀的耐药机制目前尚不完全清楚,有HER2受体以下信号传递通路异常,如持续激活的PI3K途径、磷酸化PTEN失去作用等。针对HER2分子上不同的表位产生的可抑制HER2和HER3形成异源性二聚体的单克隆抗体帕妥珠单抗(Pertuzumab)与赫赛汀联合应用,在最近的临床实验中被证实与单用赫赛汀相比其对病人生存期的延长有更加明显的作用,说明抗体通过赫赛汀表位以外的结合位点可以产生不同于赫赛汀的拮抗机制,从而与赫赛汀产生相加或协同效应。T-DM1是免疫抗体结合物(antibody-drug conjugate,ADC),是将高效价细胞毒素DM1与单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab,即赫赛汀)通过共价键结合,利用抗体结合HER2后的受体内吞作用,将毒素带入HER2阳性的肿瘤细胞,从而起到对肿瘤细胞的杀伤作用。在之前接受过赫赛汀和化疗的HER2阳性晚期或转移性乳腺癌病人中,与标准治疗联合使用,T-DM1可显著延长无进展生存期。该临床实验数据表明,利用HER2抗体对HER2阳性肿瘤细胞的特异免疫反应性,携载细胞毒素进入癌细胞,可能是克服赫赛汀药效不足的有效途径。临床前实验还显示,利用细胞工程方法制备的去岩藻糖的曲妥珠单抗,通过加强与效应器细胞上Fc受体的结合,获得了更强的抗体介导的细胞杀伤作用,在相关动物模型中展示了比赫赛汀更强的抑制肿瘤的效果。该项研究结果提示,加强抗体介导的细胞杀伤作用,也可能是优化抗HER2抗体的可能途径之一。
赫赛汀是人源化的抗体药产品,受到技术发展的制约。患者接受抗体治疗后产生的抗药抗体,可能是抗体耐药的机制之一。人源化抗体临床常见的副作用是输液反应。高容量全人源抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体展示文库,是近十几年来被国际各大生物制药公司利用来筛选全人源抗体的平台之一。过去十几年来,有利用该文库筛选得到高亲和力全人源抗体的先例(如Abbott公司的阿达木单抗(Humira))及丰富经验。全人源抗体可降低输液反应和免疫原性,提高药物安全性,具有更好的药代动力学特征。
发明内容
本发明提供了一种全人源的HER2抗体,其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的全人源HER2抗体,其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv的形式。所述Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv具有本领域所惯常理解的含义。
本发明的全人源HER2抗体,还可以包括人IgG的重链恒定区和轻链恒定区。在一个具体的实施方案中,所述人IgG为IgG1。在一个具体的实施方案中,所述人IgG重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5,所述人IgG轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本发明提供了编码本发明全人源HER2抗体的核苷酸序列。
在一个具体的实施方案中,编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3,编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。在一个具体的实施方案中,当本发明的全人源HER2抗体为全长抗体时,在本发明的核苷酸序列中,编码所述重链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7,编码所述轻链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
本发明提供了一种表达载体,其中本发明的核苷酸序列与表达载体的表达控制序列可操作地连接。在具体的实施方案中,所述表达载体是pGEM-T载体或293载体。
本发明提供了一种细胞,其包含本发明的表达载体。所述细胞可以是原核或真核的。在具体的实施方案中,所述细胞可以哺乳动物细胞,例如FreeStyle 293F细胞。
本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明的全人源HER2抗体和可药用载体。
此外发明人还发现,本发明的全人源HER2抗体与赫赛汀的作用机制不同,因此本发明的全人源HER2抗体可用于对赫赛汀耐药或对赫赛汀无反应的患者。
本发明提供了一种联合药物,其包含本发明的全人源HER2抗体和赫赛汀。
本发明提供了一种试剂盒,其包含本发明的全人源HER2抗体。所述试剂盒可用于检测样品中的HER2蛋白。所述试剂盒还可包含本领域检测HER2试剂盒中的其他常用组分。
本发明提供了本发明的全人源HER2抗体用于制备用于治疗受试者中的HER2阳性肿瘤的药物的用途。
所述“HER2阳性肿瘤”是指如果IHC〔免疫组化法〕检查结果为3个加号(+++),即,大于30%的肿瘤细胞的胞膜呈现完整的强着色,就表明为HER2阳性;如果是2个加号(++),即,至少10%的肿瘤细胞呈现弱至中度完整的胞膜染色,那么进一步做FISH〔荧光原位杂交法〕或CISH〔显色原位杂交法〕检查,倘若结果为阳性〔发生基因扩增〕,就可以确诊为HER2阳性。优选地,HER2阳性肿瘤检测结果是使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒(IHC,FISH和CISH检测试剂盒)获得的结果。执业医师熟知如何判定肿瘤是否为HER2阳性肿瘤。
所述HER2阳性的肿瘤可以选自HER2阳性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、结肠癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆囊癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)癌、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞瘤和垂体腺瘤。
优选地,所述受试者是人。
优选地,所述受试者是对赫赛汀耐药或对赫赛汀无反应的人。
附图说明
图1A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049重链表达载体(293-VH-CH)的结构示意图;图1B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049轻链表达载体(293-VL-CL)的结构示意图。以PCR方法,利用相应模板和引物(详见实施例5)分别获得含5’端EcoRI酶切位点的信号肽、重链可变区(VH)、含TGA终止密码子和3’端BamH I酶切位点的重链恒定区(CH)基因片段,并以over-lapping PCR方法将三段联接,获得GB235-049抗体的重链全长基因片段。以相同方法获得GB235-049抗体含信号肽、轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)的轻链全长基因片段。利用EcoRI和BamH I酶切形成的粘性末端分别将重链和轻链全长基因片段克隆至pGEM-T载体。
图2显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049的SDS-PAGE电泳结果图。将纯化得到的GB235-049抗体和赫赛汀对照样品在50mM二硫苏糖醇还原条件下经10%聚丙烯酰氨凝胶电泳解析,结果显示GB235-049抗体和赫赛汀均呈现分子量为50KDa和25KDa的两条带,分别为抗体的重链和轻链。
图3显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与人HER2抗原的结合结果图。以重组人HER2抗原包被ELISA板,以不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合,并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样,GB235-049抗体可结合于人HER2,并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
图4A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与猴HER2抗原的结合结果图。以猴HER2抗原包被ELISA板,以不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合,并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示GB235-049与赫赛汀一样,GB235-049抗体可结合于猴HER2,并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
图4B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与小鼠HER2抗原的结合结果图。在用ELISA测定GB235-049抗体与猴HER2免疫反应性的同时,以重组小鼠HER2抗原被ELISA板,以不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合,并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示GB235-049抗体、赫赛汀与小鼠HER2均无交叉反应。
图5显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与人HER家族其它成员人HER1、HER3、HER4抗原的结合实验结果图。以重组人HER1、HER2、HER3和HER4抗原分别包被ELISA板,以GB235-049抗体和赫赛汀(均为10μg/mL)与包被于板上的抗原分子结合,并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样,GB235-049抗体可结合于人的HER2,并且与其他HER家族成员分子没有免疫反应性。
图6显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与赫赛汀表位竞争的结果图。用ELISA方法,以重组人HER2抗原包被ELISA板,以不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀分别与生物素标记的赫赛汀(0.005μg/mL固定浓度)共同室温孵育2小时后和HER2包被的板结合,并用HRP标记的抗生物素抗体检测结合的抗体。结果显示,随赫赛汀浓度增加,生物素标记的赫赛汀在HER2抗原上的结合受到抑制;而GB235-049抗体即使是在实验涉及的最高浓度(10μg/mL)时,仍对生物素标记的赫赛汀在HER2上的结合无抑制作用。
图7显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049与BT-474细胞的结合曲线结果图。将表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌细胞在96-孔U型板中分别与不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀孵育,在充分洗涤后,以HRP标记的羊抗人Fc抗体检测结合抗体。结果显示,GB235-049抗体和赫赛汀一样可结合于表达HER2的细胞表面,且呈现出浓度依赖性和可饱和性,提示GB235-049抗体对HER2有高度选择性。
图8显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049体外抑制BT-474细胞增殖活性的实验结果。将表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌细胞在96-孔平底型板中分别与2和10μg/mL的GB235-049抗体和赫赛汀孵育72小时后用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示,两个抗体在两种浓度下均能明显抑制BT-474细胞增殖。
图9显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049体外抑制BT-474细胞增殖活性可被可溶性人HER2抗原翻转。将HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞在96-孔平底板中分别与不同浓度的GB235-049抗体和赫赛汀孵育72小时,或在各抗体浓度条件下加入100μg/mL的重组人HER2抗原,并孵育72小时,用Alamar Blue测定细胞活性。结果显示,与空白对照相比,两个抗体在两种浓度下均能明显抑制BT-474细胞增殖。在存在可溶性HER2抗原的条件下,高浓度赫赛汀抗体对细胞增殖的抑制作用部分被翻转,低浓度赫赛汀抗体对细胞增殖的作用完全被翻转,而GB235-049抗体无论是在高浓度还是低浓度条件下均被翻转,提示抗体对肿瘤细胞增殖的抑制作用是HER2特异性的。
图10A、图10B、图10C分别显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-049体外作用BT-474细胞2小时、24小时、72小时后的P-HER2、P-Akt、P-ERK1/2蛋白表达结果图。将表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的BT-474在含10%胎牛血清培养基中与2和20μg/mL赫赛汀和GB235-049抗体孵育,并分别于2、24和72小时取样。以细胞裂解液做免疫印迹,以相应抗体分别探测全部和磷酸化的HER2、ERK1/2和Akt。图10A的结果显示,在抗体作用2小时的情况下,与对照组相比,20μg/ml和2μg/ml的赫赛汀均可引起P-HER2和P-Akt的下调,而GB235-049抗体对P-HER2和P-Akt的下调作用均不明显,对P-HER2有轻微的上调作用。图10B的结果显示,在24小时的作用条件下,赫赛汀对P-HER2和P-Akt的下调作用与2小时的一致,而GB235-049抗体对P-HER2有上调作用,但对P-Akt无明显作用。图10C的结果显示,在作用72小时的条件下,20μg/ml和2μg/ml的赫赛汀对P-HER2、P-Akt和P-ERK1/2都产生了明显的下调作用,而GB235-049抗体主要活性体现在对P-ERK1/2的下调作用上,无论是在20μg/ml还是2μg/ml,其下调作用都很明显。
具体实施方式
本文所用的术语“抗体”是能够通过至少一个抗原识别位点,和靶分子(包括糖、多聚核酸、脂类、多肽等)特异结合的免疫球蛋白。完整的抗体由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键和重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区和重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区和重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变区”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包括四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR区相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类,主要有5类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些还可进一步分为亚类(同类型),如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白重链恒定区分别称为α、β、ε、μ、γ。不同免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
本文所用的“全人源抗体”是指抗体基因来源于人类的抗体。
本文中,所谓“抗体”不但包括完整的多克隆或者单克隆抗体,也包括各种抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv),单链抗体(scFv),由抗体片段形成的多特异性抗体,含有抗体片段的融合蛋白,以及任何经过改造但包含所需特异性识别位点的免疫球蛋白分子。抗体的来源或者制备方法并不受限制,例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明,然而应该理解,列举这些实施例只是为了说明本发明,而不是用来限制本发明。下列实施例中未特别指明的浓度为质量百分比浓度;未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,《分子克隆实验指南》(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 从全人源scFv噬菌体文库中筛选scFv的阳性克隆
人HER2(胞外域)-Fc融合蛋白(下文称为hHER2-Fc)抗原(购自Sino Biological公司,货号:10004-H02H)用磷酸盐缓冲液PBS(0.01M Na2HPO4·12H2O+0.002MKH2PO4+0.14MNaCl+0.002M KCl,pH=8.6)稀释至5μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST(含0.05%吐温20的PBS缓冲液)洗板4次后加入5%BSA(牛血清白蛋白,货号:A7030,购自Sigma公司)300μl/孔,37℃封闭1小时。再用PBST洗板2次。将含有7×1010个独立克隆的全人源scFv噬菌体抗体文库(此抗体库由优瑞科(北京)生物技术有限公司以多个健康人淋巴细胞的抗体可变区基因与人工合成的重链CDR3基因组合构建而成)的悬液按照100μl/孔加入酶标板中,在37℃条件下孵育2小时。吸出噬菌体悬液,加入PBST充分吹打5分钟。在第一轮淘选过程中,PBST吹打一遍,在第二轮和第三轮淘选中,PBST分别进行五遍和十遍的吹打,以去除非特异性的结合。加入含0.1%BSA的0.2M甘氨酸-盐酸(pH=2.2)洗脱液,室温孵育10分钟后,充分地吹打,洗脱阳性克隆的噬菌体。将洗脱下的阳性克隆的噬菌体悬液用1MTris-HCL(pH=9.1)缓冲液中和至中性,感染对数期的大肠杆菌(购自Lucigen公司,货号:60502-1)并扩增,用于下一轮淘选(第一、二轮)。第三轮淘选时,需将洗脱液进行梯度稀释并感染对数期宿主菌,在带氨苄(Amp)抗性的LB琼脂培养皿上分离出单克隆来,用于单克隆鉴定及质粒保存。
实施例2 scFv噬菌体阳性克隆的酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定
hHER2-Fc抗原用PBS(pH=8.6)稀释至2μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5%BSA 300μl/孔,37℃封闭1小时。再用PBST洗板2次,加入100μl/孔噬菌体阳性克隆悬液,在37℃条件下孵育2小时。PBST洗板4次,加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗M13噬菌体抗体(购自GE公司,货号:27-9421-01,用PBST1:5000稀释,100μl/孔),室温孵育1小时。PBST洗板4次,加入100μl/孔显色液(可溶型单组分TMB底物溶液,购自Tiangen公司,货号:PA107-01),室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液(1M硫酸),在多功能酶标仪(Model 680Micro reader,购自Bio-Rad公司)上450/630nm的波长下读出吸光值。
结果显示,经过三轮筛选,共获得1312种全人源scFv,可与hHER2-Fc抗原特异性结合的scFv噬菌体阳性克隆有499种。经DNA测序,这些阳性克隆中有102种核苷酸/氨基酸序列均不相同的scFv(如表1所示)。
表1.
实施例3 ELISA法检测102个scFv噬菌体阳性克隆与猴HER2-Fc(下文称为mkHER2-Fc,购自Sino Biological公司,货号:90295-C02H)、小鼠HER2-Fc(下文称为moHER2-Fc,购自Sino Biological公司,货号:50714-M02H)、人HER1-Fc(下文称为hHER1-Fc,购自SinoBiological公司,货号:10001-H02H)、人HER3-Fc(下文称为hHER3-Fc,购自SinoBiological公司,货号:10201-H05H)和人HER4-Fc(下文称为hHER4-Fc,购自SinoBiological公司,货号:10363-H02H)抗原的交叉反应。
方法同实施例2,仅将包被的hHER2-Fc抗原分别换成mkHER2-Fc、moHER2-Fc、hHER1-Fc、hHER3-Fc和hHER4-Fc抗原。
结果显示,有96个scFv噬菌体的阳性克隆与mkHER2-Fc抗原有交叉反应,有20个scFv噬菌体的阳性克隆与moHER2-Fc抗原有交叉反应,所有的102个阳性克隆与hHER1-Fc、hHER3-Fc和hHER4-Fc抗原均无交叉反应(如表2所示)。
表2
抗原 | mkHER2-Fc | moHER2-Fc | hHER1-Fc | hHER3-Fc | hHER4-Fc |
克隆数 | 96 | 20 | 0 | 0 | 0 |
实施例4 102个scFv噬菌体阳性克隆的亲和力排序(ELISA法)
将hHER2-Fc抗原用PBS缓冲液从25μg/ml开始十倍比稀释共8个梯度,分别与阳性克隆的噬菌体悬液在室温孵育4小时以达到平衡;将所得到的混合液加入事先以2μg/mlhHER2-Fc抗原(pH=8.6 PBS,4℃过夜,100μl/孔)包被的酶标板,以结合未被捕获的scFv抗体。加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(1:5000稀释,100μl/孔),以与实施例2相同的方法检测。以半数抑制浓度IC50的值对102个阳性克隆的亲和力进行排序(IC50值越低,亲和力越高)。
表3 的结果显示了102个scFv噬菌体阳性克隆的IC50值分布范围。
表3.
IC50(nM) | ≤2.0 | 2.0-10.0 | 10.0-100.0 | >100.0 | 未测出 |
克隆数 | 4 | 21 | 37 | 25 | 15 |
实施例5 GB235-049重组全长IgG1型抗体的真核表达载体的构建
在从全人源scFv噬菌体文库筛选得到的阳性克隆中,基于命名为WG1-049的单链抗体阳性克隆(IC50为0.768μg/ml)构建GB235-049重组全长IgG1型抗体的真核表达载体。WG1-049单链抗体阳性克隆的测序(该单链抗体阳性克隆scFv的核苷酸序列为SEQ ID NO:22,其氨基酸序列为SEQ ID NO:23)。结果表明,该单链抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:9)为:MELGLSWIFLLAILKGVQC;核苷酸序列(SEQ IDNO:10)为:
ATGGAGTTGGGACTGTCTTGGATTTTCCTGTTGGCTATTCTGAAAGGTGTGCAGTGT(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。
重链和轻链恒定区核苷酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 (由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。
设计引物用于构建GB235-049重组全长IgG1型抗体重链和轻链的真核表达载体,引物序列如下:
1-a(SEQ
ID NO:11):5’-GAATTCGCGGCCGCATGGAGTTGGGACTG-3’
1-b(SEQ ID NO:12):5’-GTACCAGCTGGACCTGACACTGCACACCTTTC-3’
2-a(SEQ ID NO:13):5’-GAAAGGTGTGCAGTGTCAGGTCCAGCTGGTAC-3’
2-b(SEQ ID NO:14):
5’-GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTCAC-3’
3-a(SEQ ID NO:15):5’-ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3’
3-b(SEQ ID NO:16):
5’-GTTTAAACGGATCCTCATTTACCGGGAGACAGGGAG-3’
4-a(SEQ ID NO:17):5’-CTGGGTCACCACAGTCTGACACTGCACACCTTTC-3’
5-a(SEQ ID NO:18):5’-GAAAGGTGTGCAGTGTCAGACTGTGGTGACCCAG-3’
5-b(SEQ ID NO:19):
5’-GATGGTGCAGCCACAGTACCTAGGACGGTCAGCTTG-3’
6-a(SEQ ID NO:20):5’-ACCGTCCTAGGTACTGTGGCTGCACCATC-3’
6-b(SEQ ID NO:21):5’-GTTTAAACGGATCCCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’
以合成的信号肽序列为模板,1-a和1-b为引物,由PCR(聚合酶链式反应)方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段,命名为“SPH”;以合成的重链可变区序列SEQ ID NO:3为模板,2-a和2-b为引物,PCR法扩增获得重链可变区基因片段,命名为“VH”; 同时以合成的重链恒定区序列SEQ ID NO:7为模板,3-a和3-b为引物,PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamH I酶切位点的重链恒定区基因片段,命名为“CH”。以SPH、VH、CH基因片段为模板,1-a和3-b为引物,通过over-lapping PCR方法(Higuchi R, et al. A general method of invitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of proteinand DNA interactions. Nucleic Acids Research,1988,16(15):7351-67.)扩增获得GB235-049抗体的重链全长基因片段。
同样的方法,以合成的信号肽序列为模板,1-a和4-a为引物,由PCR方法扩增获得含EcoR I酶切位点的基因片段,命名为“SPL”;以合成的轻链可变区序列SEQ ID NO:4为模板,5-a和5-b为引物,PCR法扩增获得轻链可变区基因片段,命名为“VL”;同时以合成的轻链恒定区序列SEQ ID NO:8为模板,6-a和6-b为引物,PCR法扩增获得含TGA终止密码子和BamHI酶切位点的轻链恒定区基因片段,命名为“CL”。以SPL、VL、CL基因片段为模板,1-a和6-b为引物,通过over-lapping PCR方法扩增获得GB235-049抗体的轻链全长基因片段。
将以上重链和轻链全长基因片段克隆分别至pGEM-T载体(购自Promega公司,货号:A3600),使所述基因片段5’端含有EcoR I酶切位点,3’端含有TGA终止密码子和BamH I酶切位点。经DNA测序后,将测序正确的克隆用EcoR I(购自NEB公司,货号:R0101S)和BamHI(购自NEB公司,货号:R0136S)双酶切消化(37℃,4小时),回收目的基因片段。同时将293载体(购自Invitrogen公司,货号:K8300-01)用EcoR I和BamH I双酶消化(37℃,4小时),回收293-EcoRI/BamHI载体片段。
将上述酶切获得的抗体重链全长基因片段和轻链全长基因片段分别与293-EcoRI/BamHI载体片段用T4 DNA连接酶(购自NEB公司,货号:M0202S)进行连接(16℃,16小时),热休克法(42℃,90秒)转化大肠杆菌,铺板(Amp+LB培养基),挑取克隆,EcoRI/BamHI双酶消化(37℃,2小时)进行鉴定筛选,筛选得到含有构建成功的全长抗体重链真核表达载体(293-VH-CH)或全长抗体轻链真核表达载体(293-VL-CL)的克隆。
图1A为重组全长抗人HER2抗体重链(293-VH-CH)表达载体的结构示意图;图1B为重组全长抗人HER2抗体轻链(293-VL-CL)表达载体的结构示意图。
实施例6 GB235-049重组全长IgG1型抗体的真核细胞瞬时转染表达及纯化
实施例5中所构建的GB235-049重组载体的表达,可采用共转染FreeStyle 293F细胞(购自Invitrogen公司,货号:R790-07)的方法。
转染前24小时,将FreeStyle 293F细胞按6×105个细胞/ml传代,于恒温摇床135转/分,37℃,8%CO2条件下培养,使得转染当天的细胞密度(血球板计数法)为1.2-1.5×106个细胞/ml。用FreeStyle 293培养基(购自Invitrogen公司,货号:12338-018)稀释细胞,至密度为1×106个细胞/ml。为确保最佳转染效果,细胞活力(台盼蓝染色法)应大于95%。
将转染用试剂FreeStyle Max Reagent(购自Invitrogen公司,货号:16447-500)轻度颠倒混匀4次。将各315μg重链和轻链表达载体质粒分别加入转染用培养液OptiPROSFM(购自Invitrogen公司,货号:12309-050)中,并用OptiPRO SFM补充体积至10ml,混匀。另取一支离心管,用OptiPRO SFM稀释625μl FreeStyle Max Reagent至10ml,轻度颠倒混匀。将稀释的质粒与稀释的FreeStyle Max Reagent混匀,室温孵育15分钟。将所得的20ml混合液缓慢加入装有500ml FreeStyle 293F培养基(购自Invitrogen公司,货号:12338-018)的摇瓶中。摇瓶于恒温摇床培养7天(135转/分,37℃,8%CO2)。冷冻离心机9000转/分离心20分钟,收集上清液进行下一步蛋白纯化。
上述含GB235-049抗体的FreeStyle 293F细胞上清液,经离心后使用蛋白A(ProteinA)柱(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司,货号:17-5080-02)捕获IgG1型抗体,用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.3)洗脱,收集洗脱物(0.5ml),加入100μl1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液(pH=11.0)中和至中性,经10K透析膜(购自上海捷瑞生物工程有限公司,货号:M1915)在磷酸盐缓冲液PBS(0.01MNa2HPO4·12H2O+0.002MKH2PO4+0.14M NaCl+0.002M KCl,pH=7.2)中透析后,OD280nm测定蛋白含量。经0.22μm滤器(购自Millipore公司,货号:GVHP01300)过滤除菌后-80℃保存。
实施例7 重组全长抗人HER2抗体GB235-049的SDS-PAGE电泳检测
将纯化得到的GB235-049抗体在终浓度为50mM的二硫苏糖醇还原条件下,经10%聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小。
图2的结果显示,在完全还原的条件下,GB235-049抗体呈现分子量为50KDa和25KDa的两条带,其分别为抗体的重链和轻链条带(赫赛汀为阳性对照,购自Roche公司)。这些结果表明,所构建的GB235-049抗体结构正确,其分子量大小与理论值一致。
实施例8 重组全长抗人HER2抗体GB235-049的免疫学活性鉴定
用ELISA结合实验验证GB235-049抗体与人HER2抗原的结合能力。方法如下:将人HER2抗原(简称为hHER2,购自Sino Biological公司,货号:10004-H08H)用PBS缓冲液稀释至1μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5%BSA 300μl/孔,室温封闭1小时。PBST洗板4次后,将GB235-049抗体和赫赛汀(购自Roche公司)分别从10μg/ml开始五倍比稀释共7个梯度,按照100μl/孔加入酶标板中,在室温条件下孵育1小时。PBST洗板4次,将HRP标记的羊抗人IgGFc抗体(购自CalBiochem公司,货号:AP113A-K)用PBS缓冲液以1:10000稀释,按照100μl/孔加入酶标板中,室温孵育1小时。PBST洗板4次,加入100μl/孔显色液,室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液,在M5多功能酶标仪上450/630nm波长下读出吸光值。
图3的结果显示,与赫赛汀一样,GB235-049抗体可结合人HER2,并呈显出浓度依赖性和可饱和性。
用实施例8的ELISA方法验证GB235-049抗体的跨种属免疫反应性,即与猴HER2(购自Sino Biological公司,货号:90295-C08H)、小鼠HER2(购自Sino Biological公司,货号:50714-M08H)抗原的交叉反应。方法如下:猴HER2或小鼠HER2抗原用PBS稀释至1μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5%BSA 300μl/孔,室温封闭1小时。PBST洗板4次后,将GB235-049抗体和赫赛汀分别用PBS缓冲液从10μg/ml开始五倍比稀释共7个梯度,按照100μl/孔加入酶标板中,在室温条件下孵育1小时。PBST洗板4次,将HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体用PBS缓冲液以1:10000稀释,按照100μl/孔加入酶标板中,室温孵育1小时。PBST洗板4次,加入100μl/孔显色液,室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液,在M5多功能酶标仪上450/630nm波长下读出吸光值。
图4A的结果显示,GB235-049抗体与猴HER2抗原具有交叉反应;而图4B的结果则显示,GB235-049抗体与小鼠HER2抗原未呈现出交叉反应。
在家族成员选择性实验上,ELISA方法如下:人HER1(购自Sino Biological公司,货号:10001-H08H)、人HER3(购自Sino Biological公司,货号:10201-H08H-10)或人HER4(购自Sino Biological公司,货号:10201-H08H)抗原和人HER2抗原(购自Sino Biological公司,货号:10004-H08H,作为阳性对照)用PBS稀释至1μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5%BSA 300μl/孔,室温封闭1小时。PBST洗板4次后,将GB235-049抗体和赫赛汀分别用PBS缓冲液稀释至10μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,室温条件下孵育1小时。PBST洗板4次,将HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自CalBiochem公司,货号:AP113A-K)用PBS缓冲液以1:10000稀释,按照100μl/孔加入酶标板中,室温孵育1小时。PBST洗板4次,加入100μl/孔显色液,室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液,在M5多功能酶标仪上450/630nm波长下读出吸光值。
图5的结果显示,GB235-049抗体与人HER家族其它成员,包括人HER1、人HER3和人HER4抗原均无交叉反应。
实施例9 竞争ELISA法鉴定重组全长抗人HER2抗体GB235-049与赫赛汀的表位竞争结果
将人HER2抗原(购自Sino Biological公司,货号:10004-H08H)用PBS缓冲液稀释至1μg/ml,按照100μl/孔加入酶标板中,4℃包被过夜。PBST洗板4次后加入5%BSA 300μl/孔,室温封闭1小时。将GB235-049抗体和赫赛汀从10μg/ml开始十倍比稀释共8个梯度,分别与0.005μg/ml生物素标记(由上海友科生物科技有限公司标记)的赫赛汀在室温孵育2小时,按照100μl/孔加入酶标板中,室温孵育1小时;PBST洗板4次,将HRP标记的抗生物素抗体(购自Invitrogen公司,货号:SA100-01)用PBS缓冲液以1:10000稀释,按照100μl/孔加入酶标板中,室温孵育1小时。PBST洗板4次,加入100μl/孔显色液,室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液,在M5多功能酶标仪上450/570nm波长下读出吸光值。
图6的结果显示,未标记赫赛汀抗体在1至10μg/mL浓度范围内显示出对生物素标记的赫赛汀在HER2上的结合有明显抑制作用,且有浓度依赖关系。GB235-049抗体与生物素标记的赫赛汀即使是在实验涉及的最高浓度(10μg/mL)仍未显示抑制作用,提示其结合表位在赫赛汀的结合表位之外。
实施例10 重组全长抗人HER2抗体GB235-049的体外细胞结合活性测定
人乳腺癌细胞BT-474表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2(购自美国典型培养物保藏中心,登录号:HTB-20)以2.0×105细胞/孔(100μl)接种96孔U型板。同时将本发明的抗体GB235-049从10μg/ml开始,用PBS缓冲液进行四倍比稀释共7个梯度。
96孔U型板的细胞离心后弃上清,按照100μl/孔加入稀释后的GB235-049抗体,在4℃孵育2小时。再次离心后弃上清,用200μl PBS缓冲液洗涤2次,加入HRP标记的羊抗人Fc抗体(购自CalBiochem公司,货号:AP113A-K),100μl/孔(1:10000稀释),并在4℃孵育45分钟。细胞离心后,用200μl/孔PBS缓冲液洗涤3次,加入100μl/孔显色液,室温孵育15分钟显色,加入50μl/孔终止液,在450/570nm下读出吸光值。
图7的结果显示,本发明的GB235-049抗体和赫赛汀一样,可结合于表达HER2的BT-474细胞表面,且呈浓度依赖关系和可饱和性,提示GB235-049抗体对HER2有高度选择性。
实施例11 重组全长抗人HER2抗体GB235-049的体外BT-474细胞增殖抑制活性测定
人乳腺癌细胞BT-474表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2(购自美国典型培养物保藏中心,登录号:HTB-20)。BT-474细胞以2.0×104细胞/孔(100μl)接种于96孔细胞培养板,37℃培养过夜。将抗体用1640培养基(购自Invitrogen公司,货号:A10491)含10%胎牛血清(购自Invitrogen公司,货号:10099-141)稀释成终浓度分别为10μg/ml和2μg/ml,对照孔为样品稀释液。细胞弃上清,按100μl每孔加入样品稀释液,37℃孵育72小时。按照10μl/孔加入检测试剂Alamar blue(购自Invitrogen公司,货号:DAL1100),37℃孵育2.5小时,M5多功能酶标仪读数(Flu544/590)。
图8的结果显示,GB235-049抗体和赫赛汀在两种浓度下均能明显抑制BT-474细胞的增殖。
实施例12 可溶性HER2抗原对GB235-049抗体在体外对BT-474细胞增殖抑制活性的翻转作用
方法同实施例11,BT-474细胞以2.0×104细胞/孔(100μl)接种于96孔细胞培养板,37℃培养过夜。将抗体用1640培养基(购自Invitrogen公司,货号:A10491)含10%胎牛血清(购自Invitrogen公司,货号:10099-141)稀释成终浓度分别为10μg/ml和2μg/ml,对照孔为样品稀释液。细胞弃上清,按100μl每孔加入样品稀释液;在翻转实验的孔板中,10μg/ml和2μg/ml的抗体中均加入终浓度为100μg/ml的hHER2抗原蛋白(购自Sino Biological公司,货号:10004-H08H)。37℃孵育72小时。按照10μl/孔加入检测试剂Alamar blue(购自Invitrogen公司,货号:DAL1100),37℃孵育2.5小时,M5多功能酶标仪读数(Flu544/590)。
图9的结果显示,与空白对照相比,两个抗体在两种浓度下均能明显抑制BT-474细胞增殖。在有可溶性HER2抗原存在的条件下,高浓度赫赛汀抗体对细胞增殖的抑制作用部分被翻转,低浓度赫赛汀抗体对细胞增殖的作用完全被翻转,而GB235-049抗体无论是在高浓度还是低浓度条件下均被翻转,提示抗体对HER2表达肿瘤细胞增殖的抑制作用是HER2特异性的。
实施例13 重组全长抗人HER2抗体GB235-049对BT-474细胞信号通路抑制作用研究
将BT-474细胞接种至6孔板,37℃培养过夜使其贴壁。用PBS配制赫赛汀和GB235-049抗体母液,加入细胞中,各使其终浓度为20μg/ml和2μg/ml(两种抗体均设该两个浓度,对照组只加PBS),37℃分别作用2小时、24小时和72小时以观察细胞信号通路途径上磷酸化HER2(P-HER2)、磷酸化Akt(P-Akt)以及磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)蛋白的含量。
抗体作用结束后,将细胞培养板放至冰上,用预冷的PBS洗涤两次,加入170μl细胞裂解液(RIPA+PMSF+Phosphatase Inhibitor Cocktail 2,其中RIPA和PMSF购自Beyotime公司,Phosphatase Inhibitor Cocktail 2购自Sigma公司,货号:P5726),孵育20分钟以裂解细胞。用细胞刮将裂解后的细胞悬液转移至1.5ml离心管,13,000转/分4℃离心10分钟,上清转移至新的离心管,-80℃保存待用。
OD280nm蛋白定量后,将等量的蛋白加入还原剂终浓度为50mM的二硫苏糖醇(购自Sangon公司,货号:D0281),样品煮沸5分钟,13,000转/分离心10分钟,各取8μg作为电泳样品。
电泳方法按照实施例7中标准的操作流程进行。将电泳后的胶通过电转移(300mA,80分钟)的方法转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉(购自Sangon公司,货号:NB0669)室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合,加入P-HER2(购自Cell Signal Technology公司,货号:2247)、P-Akt(购自Cell Signal Technology公司,货号:4060)及P-ERK1/2(购自CellSignal Technology公司,货号:4376)抗体(均为1:1000稀释),4℃孵育过夜。PBST(含0.05%吐温20的PBS缓冲液)洗膜两遍。此时,加入HRP标记的二抗(购自Cell SignalTechnology公司,货号:401215,1:10000稀释),室温孵育1小时。化学发光法ECL(购自PerkinElmer公司,货号:NEL104001EA)检测。
图10A(GB235-049抗体作用BT474细胞2小时对HER2信号通路的影响)的结果显示,在抗体作用2小时的情况下,与对照组相比,20μg/ml和2μg/ml的赫赛汀均可引起P-HER2和P-Akt的下调,而GB235-049抗体对P-Akt的下调作用不明显,对P-HER2有轻微的上调作用。
图10B(GB235-049抗体作用BT474细胞24小时对HER2信号通路的影响)的结果显示,在24小时的作用条件下,赫赛汀对P-HER2和P-Akt的下调作用与2小时的一致,而GB235-049抗体对P-HER2有上调作用,但对P-Akt无明显作用。
图10C(GB235-049抗体作用BT4-7472小时对HER2信号通路的影响)的结果显示,在作用72小时的条件下,20μg/ml和2μg/ml的赫赛汀对P-HER2、P-Akt和P-ERK1/2都产生了明显的下调作用,而GB235-049抗体主要活性体现在对P-ERK1/2的下调作用上,无论是在20μg/ml还是2μg/ml,其下调作用都很明显。
综上结果,赫赛汀的分子作用机制通常被认为是通过抑制HER2磷酸化(下调磷酸化的HER2)、阻断细胞增殖周期(下调磷酸化的ERK1/2)和促进细胞凋亡(下调磷酸化的Akt)。根据与赫赛汀表位竞争的结果,GB235-049抗体与赫赛汀的表位不同;根据体外与BT-474细胞结合的结果,GB235-049抗体与BT-474细胞的结合能力和赫赛汀相当;根据体外抑制BT-474细胞增殖活性的结果,GB235-049抗体具有明显的抑制BT-474细胞增殖的能力,其作用与赫赛汀相当。进一步的根据抗体对细胞信号通路的抑制研究发现,GB235-049抗体对P-ERK1/2有明显的下调作用,其与BT-474细胞增殖抑制的结果一致(P-ERK1/2是细胞增殖通路上的重要信号途径);GB235-049抗体对P-HER2具有轻微的上调作用(与赫赛汀的作用相反),而在P-Akt上没有作用(P-Akt是细胞凋亡通路上的重要信号途径)。这些结果提示,本发明的抗体因结构与赫赛汀不同,表位与赫赛汀不同,由此产生的抑制BT-474细胞增殖的机制亦与赫赛汀有所不同。
本发明通过全人源scFv噬菌体抗体库筛选得到并构建的赫赛汀表位以外的全长抗体GB235-049,其单用或与赫赛汀联合应用,预期会产生与赫赛汀相加或协同的效应。该抗体将产生对HER2阳性肿瘤的治疗作用,预期会对赫赛汀不敏感或耐药的病例有作用。
Claims (16)
1.一种全人源的HER2抗体,其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.权利要求1的全人源HER2抗体,其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv的形式。
3.权利要求1的全人源HER2抗体,还包括人IgG的重链恒定区和轻链恒定区。
4.权利要求3的全人源HER2抗体,其中所述人IgG为IgG1。
5.权利要求3的全人源HER2抗体,其中所述人IgG重链恒定区的氨基酸序列为SEQ IDNO:5,所述人IgG轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
6.编码权利要求1-5任一项的全人源HER2抗体的核苷酸序列。
7.权利要求6的编码全人源HER2抗体的核苷酸序列,在所述核苷酸序列中,编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3,编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
8.权利要求6或7的编码全人源HER2抗体的核苷酸序列,其中当所述全人源HRE2抗体包含重链恒定区和轻链恒定区时,编码所述重链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7,编码所述轻链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
9.一种包含权利要求6-8任一项的核苷酸序列的表达载体,其中所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
10.权利要求9的表达载体,其中所述表达载体为pGEM-T载体或293载体。
11.一种药物组合物,其包含权利要求1-5任一项的全人源HER2抗体和可药用载体。
12.一种联合药物,其包含权利要求1-5任一项的全人源HER2抗体和赫赛汀。
13.一种检测人HER2的试剂盒,其包含权利要求1-5任一项的全人源HER2抗体。
14.权利要求1-5任一项的全人源HER2抗体用于制备用于治疗受试者中的HER2阳性乳腺癌的药物的用途。
15.权利要求14的用途,其中所述受试者是人。
16.权利要求14的用途,其中所述受试者是对赫赛汀耐药或对赫赛汀无反应的人。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |