CN105722855A - 恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体 - Google Patents

恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN105722855A
CN105722855A CN201480051238.5A CN201480051238A CN105722855A CN 105722855 A CN105722855 A CN 105722855A CN 201480051238 A CN201480051238 A CN 201480051238A CN 105722855 A CN105722855 A CN 105722855A
Authority
CN
China
Prior art keywords
binding molecule
target
igm
polyspecific
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480051238.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105722855B (zh
Inventor
B.基特
F.张
L.G.普雷斯塔
R.约希穆拉
Original Assignee
KeyBioscience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KeyBioscience AG filed Critical KeyBioscience AG
Publication of CN105722855A publication Critical patent/CN105722855A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105722855B publication Critical patent/CN105722855B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/528—CH4 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及具有五聚或六聚环结构的结合分子，诸如像具有五个或六个双特异性结合单元的分离的IgM抗体，以及用于制备和使用所述结合分子的方法和方式。本发明还涉及具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，诸如像具有五个或六个双特异性结合单元的分离的IgM抗体，以及用于制备和使用所述结合分子的方法和方式。

Description

恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体
发明领域
本发明涉及具有五聚或六聚结构的结合分子。
具体来说，本发明涉及具有五聚或六聚环结构的结合分子，其包含五个或六个双特异性结合单元。在本发明结合分子中，所述双特异性结合单元各自结合两个不同结合靶标或相同结合靶标上的不同结合区(例如表位)，并且所述五个或六个双特异性结合单元各自具有相同结合特异性(结合至相同的两个结合靶标)。在具体实施方案中，本发明涉及具有五聚或六聚结构的双特异性抗体，其包含五个或六个双特异性结合单元。
在不同方面中，本发明包括包含五个或六个单特异性结合单元的结合分子，其中(i)所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。本发明还包括包含五个或六个双特异性结合单元的结合分子，其中(i)所述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，并且(ii)至少两个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。在具体实施方案中，所述结合分子是多特异性IgM抗体。
背景技术
由于人源化抗体的出现，诸如(利妥昔单抗(rituximab))、(曲妥珠单抗(trastuzumab))和(贝伐单抗(bevacizumab))的抗体的治疗用途已使医学领域发生巨大变化，包括肿瘤学、炎症性病症(诸如类风湿性关节炎)的治疗和许多其他适应症。在美国，超过30种人类或人源化抗体已批准用于临床用途，并且超过600种新抗体或抗体样分子处于发展的不同阶段。一些抗体对诸如血管内皮生长因子(VEGF)或肿瘤坏死因子(TNF)的可溶性靶标分子具有拮抗功能，它们的作用是疾病的病理性过程的一部分。或者，抗体可结合、阻断和/或诱导诸如癌症的某些疾病中病理性细胞的破坏。这些治疗性抗体的主要功能是通过Fab区的结合和经由Fc域的效应子功能的募集(这也介导抗体的长循环半衰期)。抗体相较于小分子药物的主要优点之一可在于它们的强烈的特异性。抗体可非常准确地靶向选择的蛋白抗原(诸如癌基因)，排除非常相似的同源物，从而允许良性的安全特性。因此，良好地表征抗体的特异性单一靶向功能。
随着领域的进步，抗体功能已得到增强，其通过蛋白质工程的创造性手段诸如提供较高的亲和力、较长的半衰期和/或较好的组织分布，以及组合小分子和大分子技术来实现对经由毒性有效载荷递送破坏细胞的提高的关注(例如抗体-药物缀合物)。改良抗体功能的另一种方法利用免疫球蛋白G(IgG)结构的二价结合，从而允许一个IgG分子结合两个抗原。事实上，在某些应用中存在不对称抗体通过同时结合两个不同靶标抗原来发挥有用功能的良好可能性。为了解决这种需要，已产生多种构建体以得到可结合两个不同抗原的单一分子，从而允许之前从未在自然界中见到的功能。这种双特异性方法的实例是结合分别在T细胞和B细胞上的CD3和CD19受体的“布利莫单抗(blinatumumab)”(MT103)。细胞毒性T细胞对癌性B细胞的这种束缚允许有效治疗B细胞白血病。
但是，在双特异性抗体的构建、表达和产生中仍然存在相当大的技术难度。尽管双特异性抗体由于它们同时结合两个不同抗原的能力而被视为有前景的治疗剂，但是它们的实用性由于稳定性和制造复杂性的问题受到限制。
各种形式的蛋白质工程改造已用于匹配异源重链，加上重链和轻链的适当成对匹配，以有效得到双特异性IgG。此外，各种双特异性抗体型式，包括四价体瘤、化学异缀合物、使用选择的异二聚化域的重组构建体和由两种最小抗原结合位点组成的最小大小的重组构建体。
但是，所有这些努力都存在困难。
因此，除了针对开发双特异性治疗性抗体的努力，仍然存在对开发可引起更有效并灵活地产生双特异性和多特异性抗体的更有效平台的极大需要，从而使此类治疗剂的发现与临床引入之间的时间线变短并且实现具有多种特异性和/或化合价的新类型抗体型式的设计和产生。
发明内容
本发明涉及具有五聚或六聚环结构的结合分子，诸如像具有五个或六个双特异性结合单元的分离的IgM抗体，以及用于制备和使用所述结合分子的方法和方式。
在一个方面中，本发明涉及一种具有五聚或六聚环结构的结合分子，其包含五个或六个双特异性结合单元，其中所述双特异性结合单元各自具有相同的两种结合特异性并且包含第一链和第二链，所述第一链至少包含与第一结合靶标的第一结合区缀合的IgM重链恒定区的Cμ4域，所述第二链至少包含IgM重链恒定区的Cμ4域和第二结合靶标的第二结合区，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标不同，并且其中所述第一链和所述第二链经过组装以由于它们个别IgM重链恒定区之间所产生的不对称界面而产生双特异性结合单元。
在一个实施方案中，所述双特异性结合单元是相同的。
在另一实施方案中，所述结合分子还包含IgMJ链。
在又另一实施方案中，所述结合分子具有五聚环结构。
在另一实施方案中，所述结合分子具有六聚环结构。
在又另一实施方案中，在所述结合分子中，所述第一链和所述第二链还包含IgM重链恒定区的Cμ3域。
在另一实施方案中，所述第一链和所述第二链还包含IgM重链恒定区的Cμ2域。
在其他实施方案中，所述第一结合靶标和所述第二结合靶标选自肽、多肽、糖蛋白、核酸分子以及有机小分子和非有机小分子，包括但不限于可溶性多肽、细胞表面受体、配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
在又另一实施方案中，所述第一结合靶标和所述第二结合靶标是相同可溶性靶标上的两个位点、相同细胞表面受体靶标上的两个位点、两个不同可溶性靶标、两个细胞表面受体靶标、一个可溶性靶标和一个细胞表面受体靶标、一个可溶性靶标或细胞表面受体靶标和一个长停留时间靶标、一个可溶性靶标和一个基质蛋白靶标或底物靶标、一个可溶性靶标或受体靶标和一个分子转运蛋白靶标，或两个不同细胞类型。
将结合区缀合至分子的其余部分可采取融合。因此，例如，第一结合区和第二结合区可分别融合至第一IgM重链恒定区和第二IgM重链恒定区的N末端。
在具体实施方案中，所述第一结合区和所述第二结合区是抗体的可变区。
在另一实施方案中，所述第一结合靶标和所述第二结合靶标是两个不同抗原。
在又另一实施方案中，所述第一结合靶标和所述第二结合靶标是相同抗原上的不同表位。
在另外实施方案中，所述第一结合区和所述第二结合区可以是结合至两个结合靶标或相同结合靶标上的不同表位的两个不同抗体重链可变区。
在本发明结合分子中，抗体重链可变区可来自IgG、IgA、IgE和/或IgM抗体，优选来自IgM抗体。优选地，本文结合分子是双特异性IgM分子，所述分子可(但不需要)还包含与两个不同IgM重链可变区中的一个缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
在具体实施方案中，在本发明结合分子中，在结合单元的两条链的IgM重链恒定区之间，至少一些不对称界面由盐桥产生，所述盐桥由所述结合单元的两条链的Cμ2、Cμ3和/或Cμ4域中的至少一个中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
因此，盐桥可在结合单元的两条链的Cμ2-Cμ2、Cμ4-Cμ4和Cμ2-Cμ3-Cμ4域中的至少一个之间形成。
在一个实施方案中，成对开关选自由以下组成的组：E→K、K→E；R→E、E→R；D→K、K→D；和R→D、D→R。
在另一实施方案中，结合分子可包含Cμ4-Cμ4域中的至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关，其中开关可例如选自由以下组成的组： 和
在另一实施方案中，Cμ2-Cμ2域之间的至少一个带成对电荷的氨基酸开关并且可例如选自由和组成的组。
在又另一实施方案中，至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关在Cμ2-Cμ3-Cμ4域中，并且可例如选自由以下组成的组： 和
在另一实施方案中，在本发明结合分子中，在结合单元的两条链的IgM重链恒定区之间，至少一些不对称界面通过钮-孔(knobs-into-holes)连接产生，所述钮-孔连接可例如通过选自由以下组成的组的突变产生：钮：T350→Y,F,W；和H395→Y,F；和孔：L352→G,A,V,I,M,S,T；H395→A,V,I,L,M,F,Y；F393→W,Y；I397→A,V,S,T；T350→S,A,V；和T348→S。
在特定实施方案中，在本发明结合分子中，轻链可变区序列(若存在)通过在轻链与重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。
在其他实施方案中，不对称界面通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来产生。
本发明结合分子可包含共同轻链和/或可缀合至毒素或化疗剂。优选地，缀合是通过融合，但通过化学连接子的缀合也包括在本发明范围内。
本文结合分子可以是具有五聚或六聚结构的双特异性抗体，所述抗体可以是嵌合的或人源化的。
在不同方面中，本发明涉及一种组合物，其包含至少约70％、或至少80％、或至少90％或至少95％、至少98％、或至少99％如上文中定义的结合分子。
在具体实施方案中，组合物是药物组合物。
本发明进一步涉及一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其包含五个或六个单特异性结合单元，其中(i)所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，其各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标，并且(iii)外部不对称界面在结合至不同结合靶标的邻近单特异性结合单元的重链恒定区之间产生。
在一个实施方案中，至少三个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。
在另一实施方案中，至少四个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。
在又另一实施方案中，结合分子具有五聚环结构并且所有五个单特异性结合单元结合至不同靶标。
在另一实施方案中，结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述单特异性结合单元结合至不同靶标。
在又另一实施方案中，所有六个单特异性结合单元结合至不同靶标。
在另一方面中，本发明涉及一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其包含五个或六个双特异性结合单元，其中(i)所述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，其各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个双特异性结合单元结合至不同结合靶标，(iii)内部不对称界面在各双特异性结合单元的两个IgM重链恒定区之间产生，并且(iv)外部不对称界面在结合至不同靶标的邻近双特异性结合单元的重链恒定区之间产生。
在一个实施方案中，至少三个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
在另一实施方案中，至少四个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
在又另一实施方案中，结合分子具有五聚环结构并且所有五个双特异性结合单元结合至不同靶标。
在另一实施方案中，结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述双特异性结合单元结合至不同靶标。
在又另一实施方案中，所有六个双特异性结合单元结合至不同靶标。
在不同实施方案中，多特异性结合分子还包含IgMJ链。
在各种实施方案中，多特异性结合分子可具有五聚或六聚环结构。
不管本发明多特异性结合分子的结合特异性的数目和性质，以下特定实施方案适用：
在一个实施方案中，在至少一个结合单元中，IgM重链恒定区还包含Cμ2域。在又另一实施方案中，在所有结合单元中，IgM重链恒定区还包含Cμ2域。在各种实施方案中，本发明多特异性结合分子可结合至选自以下的结合靶标：肽、多肽、糖蛋白、核酸分子以及有机小分子和无机小分子。
在其他实施方案中，本发明多特异性结合分子结合至选自以下的结合靶标：可溶性多肽、细胞表面受体、配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
在另外实施方案中，结合至不同靶标的本发明多特异性结合分子选自由结合至以下的结合单元组成的组：相同可溶性靶标上的位点；相同细胞表面受体靶标上的位点；不同可溶性靶标；不同细胞表面受体靶标；可溶性靶标和细胞表面受体靶标；可溶性靶标或细胞表面受体靶标和长停留时间靶标；可溶性靶标和基质蛋白靶标或底物靶标；可溶性靶标或受体靶标和分子转运蛋白靶标，和不同细胞类型。
在具体实施方案中，在本发明结合分子内的结合单元中，IgM重链恒定区与结合靶标的结合区之间的缀合是通过融合。因此，例如，结合区可融合至IgM重链恒定区的N末端。
在一个实施方案中，至少一个结合区是抗体的可变区。
在另一实施方案中，所有结合区是抗体重链可变区。
在又另一实施方案中，至少两个结合靶标是不同抗原。
在又另一实施方案中，至少两个结合靶标是相同抗原上的不同表位。
在所有方面和实施方案中，抗体重链可变区可来自IgG、IgA、IgE或IgM抗体，优选来自IgM抗体。
在优选实施方案中，本发明多特异性结合分子是多特异性IgM抗体。
在一个实施方案中，本发明多特异性IgM抗体还包含与至少一个结合单元中的IgM重链可变区缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
在另一实施方案中，多特异性IgM抗体还包含与IgM重链可变区中的每一个缔合的IgM轻链可变区序列。
在所有方面和实施方案中，外部不对称界面通过Cμ3域内的变化产生。在一个实施方案中，变化由盐桥产生，所述盐桥由Cμ3域中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
在各种实施方案中，提供外部不对称界面的盐桥由Cμ3-Cμ3域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关形成，所述氨基酸残基开关可例如是邻近μ链中的或
在所有方面和实施方案中，在本发明多特异性结合分子(例如多特异性IgM抗体)中，内部不对称界面由盐桥产生，所述盐桥由Cμ2、Cμ3和/或Cμ4域中的至少一个中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
在一个实施方案中，盐桥在所述结合单元的两条链的Cμ2-Cμ2、Cμ4-Cμ4和Cμ2-Cμ3-Cμ4域中的至少一个之间形成。
在另一实施方案中，成对开关选自由以下组成的组：E→K、K→E；R→E、E→R；D→K、K→D；和R→D、D→R。
在另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含Cμ4-Cμ4域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关，所述开关可例如选自由以下组成的组： 和
在又另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含Cμ2-Cμ2域之间至少一个带成对电荷的氨基酸开关，所述开关可例如选自由和组成的组。
在另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含Cμ2-Cμ3-Cμ4域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关，所述开关可例如选自由以下组成的组：和
在所有方面和实施方案中，IgM重链恒定区之间的至少一些外部不对称界面和/或内部不对称界面可通过钮-孔连接产生。例如，至少一个钮-孔连接由选自由以下组成的组的突变产生：钮：T350→Y,F,W；和H395→Y,F；和孔：L352→G,A,V,I,M,S,T；H395→A,V,I,L,M,F,Y；F393→W,Y；I397→A,V,S,T；T350→S,A,V；和T348→S。
在包含轻链可变区序列的多特异性IgM抗体中，此类轻链可变区序列可通过在轻链与重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。在各种实施方案中，不对称界面可通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来产生。在另一实施方案中，多特异性结合分子的结合单元包含共同轻链。
在所有方面和实施方案中，多特异性结合分子可缀合至毒素或化疗剂，其中缀合可例如通过融合和/或通过化学连接子。
本发明多特异性IgM抗体可以是嵌合的或人源化的。
在另一方面中，本发明涉及一种组合物，其包含至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％本文的多特异性结合分子。所述组合物可例如是包含至少一种药学上可接受的成分的药物组合物。
附图说明
图1说明包含J链的IgM五聚体的结构，其中链A和B在天然IgM中是相同的。
图2A说明具有两种结合特异性的五元IgM分子，其中指定为A和B的重(μ)链是不同的。
图2B说明包含五个或六个单特异性结合单元的多特异性IgM抗体，其中(i)单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ4域，(ii)至少两个单特异性结合单元结合至不同结合靶标。
图2C说明包含五个或六个双特异性结合单元的多特异性IgM抗体，其中(i)双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ4域，并且(ii)至少两个双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
图3为如CzajkowskyD.M,ShaoZ,PNAS2009；106:14960-14965中公开的IgM分子的A重链和B重链的结构模型。
图4A示出人类IgG1、IgE和IgM的分别CG1、CE1和CM1恒定域的比对。
图4B示出人类IgE和IgM的分别CE2和CM2恒定域的比对。
图4C示出人类IgG1、IgE和IgM的分别CG2、CE3和CM3恒定域的比对。
图4D示出人类IgG、IgE和IgM的分别CG3、CE4和CM4恒定域的比对。
在图4A至4D中：
人类IgE序列来自GenBankJ00222.1；残基编号来自PDB2WQR；螺旋(h)和折叠(s)分配来自PDB2WQR；
人类IgG1序列来自GenBankJ00228.1；残基编号来自PDB1OQO；螺旋(h)和折叠(s)分配来自PDB1OQO；
人类IgM序列来自GenBankX14940.1；残基编号从CM1域开始依序；人类IgM序列中的报告变化在GenBankCAB37838.1、CAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1和J00260.1的IgM序列下方指出
图5示出实施例1中制备的异二聚体的结构。
图6示出野生型和工程改造IgMFc对2a和2b的非还原SDS-PAGE凝胶。
泳道1：野生型Rtx:Fc。
泳道2：Rtx2a:Fc2b的混合物，其中Rtx2a主要由与具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成；并且Fc2b是人类μ链CH2至CH4并且具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失。
泳道3：Rtx2b:Fc2a的混合物，其中Rtx2b主要由与具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成；并且Fc2a由具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链CH2至CH4组成。箭头指示异二聚体。
图7示出野生型和工程改造IgMFc对1a和2b的还原SDS-PAGE凝胶，其中名称与图6中相同。
图8示出野生型和工程改造IgMFc对的非还原SDS-PAGE凝胶：
泳道1：野生型Okt:Fc。Okt，主要由与人类μ链的CM2至CM4融合的OKT3(抗CD3抗体)scFv组成。
泳道2：Okt2a:Fc2b的混合物，其中Okt2a主要由与具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链的CM2至CM4融合的OKT3(抗CD3抗体)scFv组成；
泳道3：Okt2b:Fc2a的混合物，其中Okt2b主要由与具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失的人类μ链的CM2至CM4融合的OKT3(抗CD3抗体)scFv组成。箭头指示异二聚体。
泳道4-6：野生型Okt:Rtx组合；工程改造Okt2a:Rtx2b组合；和Okt2b:Rtx2a组合，其中Rtx2a主要由与具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成，并且Rtx2b主要由与具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成。箭头指示异二聚体。
图9示出与图8中所示相同的构建体的293F细胞转染子的SDS-PAGE凝胶上的还原样本。
图10说明Cμ3区中的四个盐桥如何稳定本发明多特异性结合分子中二硫桥键周围的两个邻近(A.B)μ链。
表A列举钮-孔位置中和用于潜在的电荷引入的人类IgMCM4域界面残基。
表B列举用于潜在的电荷交换的人类IgMCM4域界面残基。
表C列举用于潜在的电荷引入的人类IgMCM2域界面残基。
表D列举用钮-孔位置中的人类IgMCM2域界面残基。
表E列举用于潜在的电荷交换的人类IgMCM2域界面残基。
表F列举用于电荷交换的人类IgMCM2、CM3和CM4域界面残基。
发明详述
I.定义
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、单链分子，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文可与“抗体”互换使用。基本的4链抗体单元是主要由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚糖蛋白。
就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，同时两条H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。各H链和L链还具有规律间隔的链内二硫桥键。各H链在N末端具有一个可变域(VH)，接着α和γ链各自的三个恒定域(CH)和μ和ε同种型的四个CH域。各L链在N末端具有一个可变域(VL)，接着在其另一端具有一个恒定域。将VL与VH比对并且将CL与重链的第一恒定域(CH1)比对。据悉，具体的氨基酸残基形成了轻链可变域与重链可变域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单一抗原结合位点。
IgM形成多个免疫球蛋白用二硫键共价连接在一起的聚合物。IgM主要以五聚体的形式存在，但还以六聚体的形式存在，并且因此含有10个或12个抗原结合位点。五聚体形式任选含有额外的多肽，称为J链，但也可在J链不存在的情况下制备。五聚IgM分子具有大致970kDa的分子量。IgM由于它的聚合性质而拥有高亲合力并且在补体活化中是尤其有效的。不同于IgG，IgM单体中的重链主要由一个可变域和四个恒定域组成。IgM恒定域在本文指定为CM1或Cμ1、CM2或Cμ2、CM3或Cμ3、和CM4或Cμ4，其中“CM”和“Cμ”名称可互换使用。
IgA抗体以单体形式存在但也可聚合。在它们的分泌形式中，IgA包含2-5个由J链和分泌组分连接的基本的4链单元。
IgE以单体形式存在，并且具有四个恒定域，在本申请中称为CE1、CE2、CE3和CE4。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定域的氨基酸序列指定为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一者。
一些抗体类型还可分成各种子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
关于不同类别抗体的结构和性质的进一步细节，参见例如，BasicandClinicalImmunology,第8版,DanielP.Stites,AbbaI.TerrandTristramG.Parslow(编),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。
除非上下文说明，否则术语“抗体”明确地包括天然人类和非人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。因此，例如，人类IgM序列可以GenBank登录号X14940.1购得，同时变体已报告为GenBankCAB37838.1、CAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1和J00260.1。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指示抗体是从实质上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature256:495描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。还可以使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中所描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及所述抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。
“人源化”形式的非人类(例如，鼠类)抗体是含有源于非人类免疫球蛋白的最小序列的抗体。人源化抗体大部分是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基经来自如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，所述人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基也由相应非人类残基置换。另外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或在供体抗体中没有见到的残基。进行这些改性以进一步精制抗体性能。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的基本全部，其中全部或基本全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环且全部或基本全部的FR区为人免疫球蛋白序列的那些FR区。所述人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。更多细节参见Jones等(1986)Nature321:522-525；Riechmann等(1988)Nature332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
“物种依赖性抗体”是对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力比对来自第二哺乳动物物种的所述抗原的同源物的结合亲和力强的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”至人类抗原(即具有不超过约1x10-7M，优选地不超过约1x10-8M并且最优选地不超过约1x10-9M的结合亲和力(Kd)值)，但是对来自第二哺乳动物物种的所述抗原的同源物具有结合亲和力，所述结合亲和力比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任何一种，但优选地是人源化抗体或人类抗体。
如本文所用的“抗体突变体”或“抗体变体”是指参考抗体的氨基酸序列变体，其中参考抗体的一个或多个氨基酸残基被修饰。参考抗体可例如是天然抗体，但还可以是天然抗体的已知变体。所述突变体必然与参考抗体具有小于100％序列同一性或相似性。在优选实施方案中，抗体突变体将具有与参考抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％并且最优选地至少95％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。关于所述序列的同一性或相似性在本文定义为在比对序列并且引入间隙(必要时)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与参考抗体残基相同(即相同的残基)或相似(即基于共同侧链性质来自相同组的氨基酸残基)的百分比。N末端、C末端、或内部延伸、缺失、或插入到可变区外的抗体序列中都不应被认为影响序列同一性或相似性。
本文中“分离的”双特异性或多特异性结合分子，诸如双特异性或多特异性抗体，是已被鉴定且与它在重组宿主细胞中的天然环境的组分分离和/或从所述天然环境的组分回收的抗体。它的天然环境的污染物组分是可干扰分子(例如抗体)的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质，以及生产的非所需副产物，诸如像单特异性结合单元(就包含AB结合单元的双特异性分子而言的AA和/或BB)或具有小于五个双特异性结合单元的分子。在优选实施方案中，双特异性结合分子，诸如抗体，将(1)被纯化至如通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法所测定，大于95重量％、或大于98重量％、或大于99重量％，(2)被纯化至足以通过使用氨基酸测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过使用考马斯蓝(Coomassieblue)或优选地银染色法，在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE被纯化至均质。通常，分离的多特异性(例如双特异性)结合分子(例如抗体)将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”是指结合分子(诸如抗体)对靶标分子(例如具体多肽或具体多肽上的表位、肽或其他靶标(例如糖蛋白靶标))的结合，并且意谓可测量地不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可结合至牛血清白蛋白或酪蛋白)的结合。特异性结合可例如通过相较于抗体对对照分子的结合测定抗体对靶标分子的结合来测量。例如，特异性结合可通过与类似于标靶(例如，过量未标记靶标)的对照分子的竞争来测定。就此而言，若标记靶标对探针的结合受到过量未标记靶标的竞争抑制，则指示为特异性结合。如本文所使用的术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”具体多肽或具体多肽靶标上的表位可例如由对靶标具有至少约200nM、或者至少约150nM、或者至少约100nM、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约10nM、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约1nM或更大的Kd的分子来展现。在某些情况下，术语“特异性结合”是指分子结合至具体多肽或具体多肽上的表位，而不实质上结合至任一其他多肽或多肽表位的结合。
“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更强。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的)加以测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合时间更长。测量结合亲和力的多种方法在本领域是已知的。
如本文所用的“Kd”或“Kd值”是指通过适用于抗体和靶标对的技术，例如使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore公司,Piscataway,N.J.)，在25℃下，用固定抗原CM5芯片在约10反应单位(RU)下，例如使用表面等离子体共振测定来测量的解离常数。
如本文所用的术语“双特异性结合单元”是指包含一对IgM重链恒定区多肽的分子，所述IgM重链恒定区多肽各自至少包含CM4域，并且各自缀合至不同结合靶标的结合区。优选地，缀合通过融合，优选地至IgM重链恒定区多肽序列的N末端。术语“双特异性结合单元”明确地涵盖但不限于“双特异性IgM抗体结合单元”，如在下文中定义。本发明结合分子具有五聚或六聚环结构并且包含五个或六个双特异性结合单元。
术语“缀合”是指共价或非共价键的任何和所有形式，且包括但不限于直接基因融合或化学融合、通过连接子或交联剂偶联和非共价缔合。
术语“双特异性IgM抗体结合单元”是以最广泛的意义使用并且明确涵盖一对融合至可变域序列(VH)的IgM抗体重链恒定区多肽(至少包含CM4恒定域)，各可变域序列结合至不同靶标，与抗体轻链可变域(VL)序列缔合或不缔合。在一个实施方案中，双特异性IgM抗体涵盖两个VHVL抗原结合区，各抗原结合区能够结合至一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgM抗体结合单元可以是单一物种的全长结合单元，或可以被嵌合或人源化。本发明双特异性IgM抗体具有五聚或六聚环结构，其包含五个或六个双特异性IgM结合单元。
“全长IgM抗体重链”是在N末端向C末端方向上由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定重链恒定域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定域3(CM3或Cμ3)和抗体重链恒定域4(CM4或Cμ4)组成的多肽。根据本发明的双特异性全长IgM抗体包含五个或六个各自具有两个抗原结合位点的单体(结合单元)，所述单体特异性结合至两个不同结合靶标(表位)。全长抗体的重链或轻链的C末端表示重链或轻链的C末端处的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N末端表示重链或轻链的N末端处的第一个氨基酸。
如本文所用的术语“价”表示抗体中存在特定数目的结合位点。因而，术语“二价”、“三价”和“六价”分别表示存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在根据本发明的双特异性IgM抗体中，各结合位点是二价的。因此，本文双特异性IgM抗体具有10个或12个化合价。所述定义同样适用于作为非抗体的结合分子。
术语“表位”包括能够特异结合至抗体的任何分子决定子。在某些实施方案中，表位决定子包括如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面集合，且在某些实施方案中可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗原中由抗体结合的区域。“结合区”是靶标上由结合分子结合的区。
“多表位特异性”是指特异性结合至相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指结合仅一个表位的能力。根据一个实施方案，双特异性IgM抗体结合至各表位，其中亲和力为至少10-7M、或10-8M或更好。
术语“靶标”是以最广泛的意义使用并且明确包括多肽、核酸、碳水化合物、脂质和具有当它们在自然界中存在时的生物功能的其他分子。“靶标”可例如是细胞，其中双特异性结合单元靶向两个不同细胞类型、相同细胞类型的不同亚群(例如不同B细胞种群)或单一细胞上的两个不同实体。
本发明抗体的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常含有六个互补决定区(CDR)，所述互补决定区以不同程度促成结合位点对抗原的亲和力。存在三个重链可变域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FR)的范围通过比较汇编的氨基酸序列数据库来确定，在所述数据库中所述区已根据序列之间的变化性和/或抗体/抗原复合物的结构信息来定义。本发明范围内还包括由较少CDR组成(即，结合特异性通过三个、四个或五个CDR来确定)的功能抗原结合位点。少于一组完整的6个CDR可足够结合至一些结合靶标。因此，在一些情况下，单独VH或VL域的CDR将是足够的。此外，某些抗体可具有针对抗原的非CDR缔合结合位点。所述结合位点确切地包括在本定义内。
如文本所使用，术语“界面”用于指代包含第一IgM重链恒定区中与第二IgM重链恒定区中一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用的那些“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，诸如像碳水化合物基团)的区。
术语“不对称界面”用于指代在两个抗体链诸如第一IgM重链恒定区与第二IgM重链恒定区之间和/或IgM重链恒定区与它的匹配轻链之间形成的界面(如在上文中定义)，其中第一链和第二链中的接触残基在设计上不同，其包含互补接触残基。不对称界面可通过钮/孔相互作用和/或盐桥偶联(电荷交换)和/或本领域已知的其他技术，诸如像通过用于将μ重链偶联至它的匹配轻链的CrossMab方法来产生。
“腔”或“孔”是指至少一个从第二多肽的界面凹入并且因此容纳第一多肽的相邻界面上的相应突起(“钮”)的氨基酸侧链。腔(孔)可存在于原始界面中或可经过化学方式引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸经过改变来编码腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应理解，可存在超过一个原始残基和相应输入残基。经过置换的原始残基的数目的上限是第二多肽的界面中残基的总数。形成腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，最优选的是丙氨酸。在优选实施方案中，形成突起的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
“原始”氨基酸残基是由可具有比原始残基更小或更大侧链体积的“输入”残基置换的氨基酸残基。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选的是前者。
“非天然存在的”氨基酸残基意谓不由遗传密码子编码，但能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如Ellman等,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中所述的氨基酸。为产生这些非天然存在氨基酸残基，可使用Noren等Science244:182(1989)和Ellman等(如上)的程序。简言之，所述程序涉及用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制因子tRNA，接着体外转录和翻译RNA。在某些实施方案中，本发明方法涉及置换IgM重链中的至少一个原始氨基酸残基，但可置换超过一个原始残基。通常，第一多肽或第二多肽的界面中至多总体残基将包含经过置换的原始氨基酸残基。针对置换优选的原始残基是“包埋的”。“包埋的”意谓残基基本上难以接近溶剂。优选的输入残基不是半胱氨酸以防止可能的氧化或二硫键的错配。
突起“可定位”在腔中意谓，分别第一多肽和第二多肽的界面上的突起和腔的空间位置以及突起和腔的大小是这样的，即突起可位于腔中而不显著扰乱界面处第一多肽和第二多肽的正常缔合。因为诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，所以突起与相应腔的对准依赖于基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)建模突起/腔对。这可使用本领域广泛接受的技术，包括分子建模技术来实现。
“原始核酸”意谓编码所关注多肽的核酸，所述核酸可经过“改变”(即基因工程改造或突变)以编码突起或腔。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸或可包含经历之前变化的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸意谓通过插入、缺失或置换至少一个编码所关注氨基酸残基的密码子使原始核酸突变。通常，编码原始残基的密码子由编码输入残基的密码子置换。以这种方式基因修饰DNA的技术已回顾于Mutagenesis:aPracticalApproach,M.J.McPherson编,(IRLPress,Oxford,UK.(1991)中，并且包括例如定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。
突起或腔可通过合成手段“引入”到第一多肽或第二多肽的界面中，例如通过重组技术、体外肽合成、先前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶或化学偶联或这些技术的一定组合。因此，“引入”的突起或腔是“非天然存在的”或“非原生的”，这意谓所述突起或腔不存在于自然界中或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
优选地，形成突起的输入氨基酸残基具有相对少量的“旋转异构体”(例如约3-6个)。“旋转异构体”是氨基酸侧链的在能量上有利的构象。各种氨基酸残基的旋转异构体的数目回顾于Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中。
如本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被工程改造以产生根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞。
如本文使用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换地使用，并且全部这些名称均包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞以及源自其的培养物，而不考虑转移次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。包括了与经过筛选用于初始转化细胞具有相同功能或生物活性的变体子代。
当核酸与另一核酸序列处于功能性关系中时，所述核酸为“可操作地连接”的。举例来说，序列前体或分泌前导序列的DNA在其表达为参与多肽的分泌的蛋白质前体的情况下可操作地连接于多肽的DNA；启动子或强化子在其影响编码序列的转录的情况下可操作地连接于所述编码序列；或核糖体结合位点在其位置促进翻译的情况下可操作地连接于编码序列。一般来说，“可操作地连接”是指所连接的DNA序列是连续的，且在分泌性前导序列的情况下是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过连接于适宜的限制位点处来达成。如果所述位点不存在，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸转接头或接头。
详述
IgM是由B细胞响应于抗原的刺激所产生的第一免疫球蛋白，并且以约1.5mg/ml存在于血清中，其中半衰期是5天。IgM是五聚或六聚分子。正如IgG，IgM单体由两条轻链和两条重链组成。但是，尽管IgG含有三个重链恒定域(CH1、CH2和CH3)，但是IgM的重(μ)链额外含有第四恒定域(CH4)，与IgE中的ε重链相似。这个额外恒定域替代IgG和IgA富含脯氨酸的铰链区来定位，所述铰链区负责抗原结合Fab域相对于IgG和IgA抗体的Fc域的旋转灵活性。
五个IgM单体与额外小多肽链(J链)形成复合物以形成天然IgM分子。J链被认为在IgM从抗体产生的细胞分泌之前促进μ链的聚合。尽管IgM的结晶已证明是异常具有挑战性的，但是Czajkowsky和Shao(PNAS106(35):14960-14965,2009)最近基于IgEFc域的结构和已知的二硫键配对公开了IgM的基于同源性的结构模型。作者报告了人类IgM五聚体是具有弯曲偏差的蘑菇形分子。
在自然五聚或六聚IgM抗体分子中，所有重(μ)链是相同的，并且轻链也是相同的。本发明允许两条μ链彼此不同的IgM分子的产生。
在一个方面中，本发明涉及对两个不同结合区具有结合特异性的双特异结合分子，其具有五聚或六聚结构，其由五个或六个双特异性结合单元形成，其中所述双特异性结合单元各自具有相同的两种结合特异性并且包含第一链和第二链，所述第一链至少包含与第一结合靶标的第一结合区缀合的IgM重链恒定区的CM4域，所述第二链至少包含IgM重链恒定区的CM4域和第二结合靶标的第二结合区，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标不同，并且其中所述第一链和所述第二链经过组装以由于它们个别IgM重链恒定区之间所产生的不对称界面而产生双特异性结合单元。
在各种实施方案中，IgM重链恒定区额外地包含CM2域和CM3域中的一个或两个或其片段，和潜在地其他IgM重链恒定域序列。在一个实施方案中，本发明结合分子含有完整的IgM重(μ)链恒定域，和用来在两条重链之间产生不对称界面的一个或多个修饰。
为了产生具有两条不同μ重链(链A和B)的IgM分子，必须找到用于将具有两种不同结合特异性的两条匹配μ重链(A和B)彼此偶联的解决方案。此外，若需要轻链形成结合区，则必须找到将各重链与其匹配轻链偶联的解决方案以提供所需结合特异性。
偶联可通过某些残基之间的盐桥对电荷切换(也称为电荷交换或电荷逆转)和/或通过在两条链之间产生钮-孔相互作用来实现。重链还可通过使用CrossMab技术来与它们的匹配轻链配对。为了实现最佳结果，还可将不同方法组合。
在另一方面中，本发明涉及对两个或更多个不同的结合靶标具有结合特异性的多特异性结合分子，其具有五聚或六聚结构。本发明包括包含五个或六个单特异性结合单元的结合分子，其中(i)所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。本发明还包括包含五个或六个双特异性结合单元的结合分子，其中(i)所述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，并且(ii)至少两个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。在具体实施方案中，所述结合分子是多特异性IgM抗体。
在各种实施方案中，IgM重链恒定区额外地包含Cμ2域或其片段，和潜在地其他IgM重链恒定域序列。在一个实施方案中，本发明结合分子含有完整的IgM重(μ)链恒定域，和用来在两条重链之间产生不对称界面的一个或多个修饰。
在含有至少一个双特异性结合单元的本发明多特异性结合分子中，为了产生具有两条不同μ重链(链A和B)的IgM分子，必须找到用于将具有两种不同结合特异性的两条匹配μ重链(A和B)经由内部不对称界面彼此偶联的解决方案。此外，若需要轻链形成结合区，则必须找到将各重链与其匹配轻链偶联的解决方案以提供所需结合特异性。
此外，必须找到在结合至不同靶标的邻近单特异性结合单元的重链恒定区之间产生外部不对称界面的解决方案。
用于产生内部和外部不对称界面的技术包括但不限于某些残基之间的盐桥对电荷切换(也称为电荷交换或电荷逆转)和在两条链之间产生钮-孔相互作用。重链还可通过使用CrossMab技术来与它们的匹配轻链配对。为了实现最佳结果，还可将不同方法组合。
1.钮-孔技术
为了改进本发明五聚或六聚双特异性或多特异性结合分子的产率，IgM重链恒定区(例如CM4、CM2和/或CM3域)可通过用例如WO96/027011,Ridgway,J.,B.等,ProteinEng9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等,NatBiotechnol16(1998)677-681中的若干实施例详细描述的“钮-孔”技术来改变。在这种方法中，两个IgM重链恒定域的相互作用表面经过改变以提高具有不同结合特异性的两条重链和/或重链与其匹配轻链之间的异二聚化。两个重链域中的每一个，例如CM4-CM4、CM2-CM2和/或CM2-CM3-CM4/CM2-CM3-CM4可以是“钮”，同时另一个是“孔”。二硫桥键的引入使异二聚体稳定(Merchant,A.M.等,NatureBiotech16(1998)677-681；Atwell,S.等,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且提高产率。同样，匹配重链和轻链可通过这种技术彼此偶联Zhu,Z.；Presta,L.G.；Zapata,G.；Carter,P.Remodelingdomaininterfacestoenhanceheterodimerformation.Prot.Sci.6:781-788(1997)。
按照这种方法，就双特异性IgM结合分子而言，在一条重链的CH4、CH2和/或CH3域的原始界面(其与双特异性IgM结合分子(例如抗体)内另一重链的相应域的原始界面相接)内，可将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，从而在界面内产生突起，所述突起可定位于另一IgM重(heaving)链恒定区中相应域的界面内的腔中。同样，第二IgM重链可通过将具有第一IgM重链恒定区中相应域的界面内的氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸残基置换来改变，从而在两个重链区之间的界面内产生孔(腔)。
在钮-孔位置中的人类IgMCM4和CM2域界面残基示出于表A和D中。表根据图4D和图4B中所示的编号鉴别分别图4D中所示的CM4序列和图4B中所示的CM2序列的指示位置处的天然残基，以及鉴别可用于产生钮-孔对的潜在突变。因此，例如，在CM4域中，位置350中的天然苏氨酸(T)残基可突变成酪氨酸(Y)以产生钮，其可与针对天然CM4序列(第1组)的残基352、393和395列举的潜在突变的任何组合进行组合。可与第1组任选组合的位置254和397处其他突变示出于第2组和第3组中)。同样，第4组举例说明与位置352、393、395和397中一个或多个位置处的孔突变组合的位置350和395处的钮突变。与第4组组合的其他突变列举于第5组和第6组中。表A的其余部分可以相似方式读取。一些组还包括电荷引入，即从不带电残基改变成带电残基(与以下讨论的表C相似)。
应强调，第1-30组中列举的钮-孔突变可如表A中所述用于各种组合中。此外，列举的突变可与表的其余部分中列举的其他钮-孔和/或电荷交换和/或电荷引入突变组合。因此，表A中所述的钮-孔突变中的一个或多个可与表D中所示钮-孔突变中的一个或多个以任何组合进行组合，和/或与表B、C、E和F中列举的电荷交换/电荷引入突变中的一个或多个如下文中讨论进行组合。因此，可选择表A的任何组并且将其以任何顺序或组合，与表B的任何组混合，与表C的任何组混合等。
2.盐桥对电荷切换(电荷交换)
相反电荷彼此吸引，并且相似电荷彼此排斥。氨基酸分子的电荷是pH依赖性的并且可以pK值来表征，测定游离氨基酸的α氨基(N)、α羧基(C)和侧链的pK值。当氨基酸是蛋白质或肽的一部分时，局部环境可改变侧链的pKa。
氨基酸分子的电荷性质还可以等电点(pI)来表征，其为分子的总电荷为中性时的pH。因为氨基酸在它们的侧链中彼此不同，所以pI反映出侧链pK的差异。
大部分氨基酸(15/20)具有接近于6的pI，所以将它们视为具有中性总电荷。Asp和Glu带负电荷，并且His、Lys、Arg带正电荷。
在蘑菇形IgM复合物中的两个结合单元之间的界面中，在连接单体的二硫桥键上方和下方存在四个盐桥。涉及这些相互作用(Lys-238、Lys-268、Asp-293和Asp294)的残基在两个单体中是相同的，但是由于IgMFc结构中CM3域的不对称，它们在这个界面中的相对排列是不同的。
电荷交换或电荷引入突变的位置和氨基酸残基列举于表A、B、D、E和F中。如上文所讨论，一个或多个(ormoreof)这些突变或突变组可与一组或多组钮-孔突变组合以在两条不同IgM重链之间和/或IgM重链与它的匹配轻链之间提供所需不对称界面。
优选地，两个不同IgM重链恒定区之间的不对称界面由一条IgM重链中的至多8个，诸如像1-8个、或1-7个、或1-6个、或1-5个、或1-4个、或1-3个、或1-2个突变，或两条IgM重链中的2-10个、或2-9个、或2-8个、或2-7个、或2-6个、或2-5个、或2-4个、或2-3个组合突变产生。
对于本文多特异性结合分子，外部不对称界面由Cμ3域中的变化产生。具体来说，为了产生外部不对称界面，盐桥由Cμ3域中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。在各种实施方案中，提供外部不对称界面的盐桥由Cμ3-Cμ3域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关形成，所述氨基酸残基开关可例如是邻近μ链中的或
3.CrossMab技术
如上文所讨论，钮-孔技术或电荷交换实现抗体重链的异二聚化。轻链和它们同源重链的正确缔合可通过将一半双特异性抗体结合单元的抗原结合片段(Fab)内的重链和轻链域进行交换来实现。交叉可以在IgM抗体的一半双特异性结合单元内完整VH-CM和VL-CL域的交叉、仅VH和VL域的交叉或CM和CL域的交叉的形式发生。这种“交叉”保留了抗原结合亲和力，但使两个臂不同，使得轻链错配可不再发生。在IgG抗体方面，更多细节参见例如Schaeffer等,(2011)ProcNatlAcadSciUSA108(27):11187-11192。
4.双特异性和多特异性IgM结合分子的产生
具有所需突变(根据钮-孔、电荷交换和/或Cross-Mab技术)的双特异性IgM抗体结合单元的重链的编码序列可通过将适当核苷酸改变引入到抗体DNA中或通过核苷酸合成来产生。抗体可然后通过重组方式产生。
用于重组产生的方法在现有技术状态中广泛已知且包含在原核和真核细胞中进行蛋白质表达，并随后分离抗体且通常纯化至药学上可接受的纯度。为在宿主细胞中表达抗体，通过标准方法将编码个别修饰重链和任选轻链的核酸插入表达载体中。在适当原核或真核宿主细胞(如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞)中进行表达，且自细胞(溶解后的上清液或细胞)回收抗体。用于抗体的重组产生的一般方法描述于例如以下综述文章中：Makrides,S.C.,ProteinExpr.Puriif.17(1999)183-202；Geisse,S.等,ProteinExpr.Puriif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880。
双特异性和多特异性抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序，如蛋白质羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱与培养基分离。
尽管由于其复杂结构，重组IgM的大规模生产是困难的，但是已报告使用非淋巴细胞的IgM的若干重组产生系统，包括C6胶质瘤细胞、CHO细胞和HeLa细胞中IgM重(H)链和轻(L)链的共表达。尽管共表达成功地导致聚合物的形成，但是产率通常是低的(参见例如，W089/01975和Wood等,J.Immunol.145,3011-3016(1990)，对于CHO细胞中的表达)，并且五聚或六聚分子的精确聚合结构不容易确定。表达腺病毒的E1A和E1B蛋白质的永生化人类视网膜细胞系中IgM的产生描述于美国申请公布号20060063234中。本发明双特异性IgM抗体产生的其他细节提供于以下实施例中。
本发明方法将导致一种组合物，其包含双特异性或多特异性IgM结合分子(诸如双特异性或多特异性IgM抗体)作为主要组分，以及制造过程的各种副产物，诸如单特异性抗体、抗体片段、双特异性结合单元的单体、二聚体、三聚体和/或四聚体，而不是所需五聚或六聚结构。产生的组合物一般含有至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约92％、或至少约95％所需五聚或六聚双特异性结合分子，例如抗体，其将通过本领域已知的方法进一步纯化以产生具有至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％、或至少约99.5％、或至少约99.9％的纯度的产物。
5.双特异性和多特异性IgM结合分子的应用
本发明双特异性和多特异性IgM结合分子，例如抗体，具有广泛的治疗和诊断应用。
在一个实施方案中，本文双特异性结合分子结合至相同可溶性靶标(诸如像VEGF、TNFα或IL6)上的两个位点。目的可例如为拮抗蛋白质上的多个位点和/或提高对给定靶标的亲合力。
在另一实施方案中，本文双特异性或多特异性结合分子结合相同细胞表面(受体)靶标(诸如EGFR或HER2(ErbB2))上的两个或更多个位点。因此，例如，双特异性或多特异性结合分子可靶向HER2分子上的4D5和2C4表位。这种方法可提高对给定靶标的生物效能和/或亲合力。
在又另一实施方案中，本发明双特异性或多特异性结合分子结合两个或更多个不同可溶性靶标(球状蛋白质或肽)，例如TNFα和IL6、VEGFα和Ang2，或两个细胞因子。这种方法可导致对特定途径的更完全的阻断；所谓的“细胞因子风暴”的阻断，或协调酶和它的底物，例如因子IXa和因子X。
在另一实施方案中，本文双特异性或多特异性结合分子可结合可溶性靶标和细胞表面受体靶标，诸如血管生成因子和非血管特异性受体。这种方法的目的还可在于特定位点或组织处提高的递送和阻断。
在又另一实施方案中，本文双特异性结合分子被设计成结合两个不同细胞表面受体靶标，诸如像HER2(ErbB2)和HER3(ErbB3)。同样，本文多特异性结合分子被设计成结合两个或更多个不同细胞表面受体靶标，诸如像HER1、HER2(ErbB2)和HER3(ErbB3)。这可导致增加的特异性和选择性和/或导致对给定路径的更完全的阻断。
本发明双特异性和多特异性结合分子，诸如抗体，还可被设计成结合一个可溶性靶标或细胞表面受体靶标和一个长停留时间靶标，诸如像TNFα和血清白蛋白，或VEGF和血清白蛋白。预期这些分子具有比不具有白蛋白特异性的结合分子更长的循环半衰期。
在另一实施方案中，本文双特异性结合分子可结合一个可溶性靶标和一个基质蛋白或底物，诸如像VEGFα和透明质酸。同样，本文多特异性结合分子可结合一个或多个可溶性靶标和一个或多个基质蛋白和/或底物，诸如像VEGFα和透明质酸。所得双特异性或多特异性结合分子由于它们在眼内空间中停留时间增加，可发现例如在眼部病状(诸如年龄相关的黄斑变性(AMD))的抗血管生成治疗中的实用性。
双特异性分子，例如结合一个可溶性靶标或受体靶标，加上转运蛋白受体(即转铁蛋白受体)的抗体，例如成胶质细胞瘤中发现并且与抗转铁蛋白特异性组合的抗EGFRvIII(外显子III缺失的突变体形式)可发现在跨血脑屏障的抗体递送中的实用性。
同样，多特异性分子，例如结合一个或多个可溶性靶标或受体靶标，加上一个或多个转运蛋白受体(即转铁蛋白受体)的抗体，例如成胶质细胞瘤中发现并且与抗转铁蛋白特异性组合的抗EGFRvIII(外显子III缺失的突变体形式)可发现在跨血脑屏障的抗体递送中的实用性。
6.组合物、药物组合物和治疗方法
在一个方面中，本发明涉及包含纯化双特异性或多特异性IgM结合分子，诸如本文双特异性或多特异性IgM抗体的组合物。所述组合物一般含有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约92％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％所需双特异性或多特异性IgM结合分子，例如抗体。组合物可以是药物组合物，其中双特异性或多特异性结合分子，例如抗体，与至少一种药学上可接受的载剂混合。
本发明的药物组合物可以利用本领域中已知的多种方法施用。如本领域技术人员所了解，施药途径和/或模式将视目标疾病或病状和所需结果而变化。为通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必需将所述化合物用防止其失活的物质涂布或者所述化合物与防止其失活的物质共同施用。例如，化合物可以在适当载剂(例如脂质体)或稀释剂中施用于受试者。药学上可接受的稀释剂包括生理食盐水和水性缓冲溶液。药学载剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。所述介质和试剂用于医药活性物质在本领域中是已知的。
所述组合物也可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和/或分散剂。防止存在微生物可通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等)两者来确保。还可合乎需要的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。
本发明的医药组合物中活性成分的实际剂量浓度可以改变以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效达成所要治疗效果而不会对患者造成毒性的量的活性成分。选择的剂量水平取决于多种药动学因素，包括使用的本发明的具体组合物的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状态和先前的病史和在医学领域众所周知的类似因素。
组合物必须是无菌的，并且流动性达到组合物可利用注射器递送的程度。除了水，载剂优选是等渗缓冲盐水溶液。
提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在随附权利要求书中阐述。应理解，可在阐述的程序中进行修改，而不背离本发明的精神。
本公开通篇引用的所有专利和科学参考文献都以引用方式明确地并入本文中。
实施例1
1.具有设计突变的DNA构建体的产生
材料和方法
a.DNA构建体合成
具有设计突变的所有DNA构建体都由商业供应商(Genewiz公司)，使用本领域中熟知的技术，利用在两端处用于亚克隆到个别表现载体中的相容性限制位点来合成。
b.表现载体的构建
将合成DNA构建体以1μg/ml再悬浮于Tris-EDTA缓冲液中。使DNA(1μg)经历酶消化并且将合成基因通过电泳与载体质粒DNA分离。将消化DNA通过标准分子生物技术连接至预消化质粒DNA(μ链为pFUSEss-CHIg-hM*03；κ链为pFUSE2ss-CLIg-hk，InvivoGen)。将连接DNA转化成胜任细菌并且接种在具有多种选择性抗生素的LB板上。挑选若干细菌菌落，并且通过标准分子生物技术进行DNA制备。所制备的DNA通过测序验证。仅DNA序列与设计DNA100％匹配的细菌菌落用于质粒DNA制备并且随后用于细胞转染。
c.不同大小的μ链
为了证明具有或不具有CM4相互作用界面突变(A和B)的两条不同μ链能够彼此偶联，在不同分子量和配体特异性的情况下，构建两组不同大小的μ链。
i.Rtx链由与具有C291S突变和尾部段缺失的人类IgM抗体μ链的CM1区融合的嵌合抗CD20抗体Rituxan(利妥昔单抗)Vh区的μ链组成：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVD
(SEQIDNO:1)
Rtx链具有约60kD(无糖基化)和66kD(具有4个N糖基化位点)的计算分子量并且能够结合至CD20阳性B细胞，诸如Raji细胞。
ii.Fc链包含人类IgMμ链CM2至CM4区，携带cMyc标签并且其尾部段由6His标签置换并且具有C291S突变：
GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKGGGSEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
(SEQIDNO:2)
Fc链具有约39kD(无糖基化)和43kD(具有3个N糖基化位点)的分子量并且能够结合至抗myc单克隆抗体9E4或其他抗myc抗体。
iii.Okt链由与具有C291S和尾部段缺失的人类μ链的CM2融合的OKT3(抗CD3)的单链Fv形式组成：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVD
(SEQIDNO:3)
Okt链具有约61kD(无糖基化)和67kD(包括4个N糖基化位点)的计算分子量，并且能够结合至CD3阳性T细胞。
d.轻链偶联
i.天然嵌合Rituxanκ链
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQIDNO:4)
κ链具有约23kD的计算分子量并且能够连接至RituxanIgM重链。
e.界面突变
将钮和孔、静电电荷偶联不对称的引入到CM3相互作用界面中以使两条μ链的异二聚化最大。产生两对CM3相互作用界面突变体。
i.Fc1a是具有C291S和T350Y突变和尾部段缺失的人类μ链CH2至CH4区：
GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATIYCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:5)
Fc1a链具有约36kD(无糖基化)和41kD(若包括3个N糖基化位点)的计算分子量。
ii.Fc1b是人类μ链CH2至CH4并且具有C291S、L352S和H395V突变和尾部段缺失：
GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCSVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAVSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:6)
Fc1b链具有约36kD(无糖基化)和41kD(包括3个N糖基化位点)的计算分子量。
iii.Fc2a由具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链CH2至CH4区组成：
GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATIYCLVEGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:7)
Fc2a链具有约36kD(无糖基化)和41kD(包括3个N糖基化位点)的计算分子量。
iv.Fc2b是人类μ链CH2至CH4并且具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失。
GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCSVKGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAVSKLTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:8)
Fc2b链具有约36kD(无糖基化)和41kD(包括3个N糖基化位点)的计算分子量。
f.界面突变
将具有钮、孔和静电电荷偶联的Fc2a链和Fc2b链通过分子克隆进一步连接至Rituxan和OKT3(抗CD3抗体)scFv两者以实现两条μ链的不对称异二聚化。
i.Rtx2a由与具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成。
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATIYCLVEGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:9)
Rtx2a链具有约61kD(无糖基化)和67kD(具有4个N糖基化位点)的计算分子量。
ii.Rtx2b由与具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失的人类μ链的CM1至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh区的μ链组成。
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCSVKGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAVSKLTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:10)
Rtx2b链具有约61kD(无糖基化)和67kD(包括4个N糖基化位点)的计算分子量。
iii.Okt2a由与具有C291S、T350Y、T354E和I397E突变和尾部段缺失的人类μ链的CM2至CM4融合的OKT3(抗CD3抗体)scFv组成。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATIYCLVEGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:11)
Okt2a链具有约62kD(无糖基化)和68kD(包括4个N糖基化位点)的计算分子量。
iv.Okt2b由与具有C291S、L352S、T354K、H395V和I397K突变和尾部段缺失的人类μ链的CM2至CM4融合的OKT3(抗CD3抗体)scFv组成。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCSVKGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAVSKLTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK
(SEQIDNO:12)
Okt2b链具有约62kD(无糖基化)和68kD(包括4个N糖基化位点)的计算分子量。
2.蛋白质表达、纯化和表征
a.转染
通过将相等摩尔比的若干不同表达载体共转染到哺乳动物细胞(诸如293F细胞(Invitrogen))中来制备IgM。在室温下在2mlOpti-MEM(Invitrogen)中将10μg表达载体的混合DNA与20μl293Fectin(Invitrogen)混合30分钟，然后添加到107个293F细胞中。在转染后，在收获上清液之前，将具有293F细胞的转染液孵育72小时。
b.通过免疫沉淀的蛋白质纯化.
i.CaptureSelectIgM(目录号2890.05,BAC,ThermoFisher)
通过在2,000G下离心10分钟来收获转染上清液。通过免疫沉淀，利用亲和力CaptureSelectIgM亲和基质来纯化IgM蛋白。将100μlCaptureSelectIgM浆液添加到15ml收获上清液中。在室温下将上清液和亲和基质混合物在摇座上孵育2小时。然后将亲和基质在300g下离心2分钟，倾析溶液。将亲和基质用PBS加上0.05％Tween进一步洗涤3次。最后，通过在室温下将20μl4xLSD样本装载缓冲液(Invitrogen)孵育5分钟，接着在10,000g下离心来将纯化IgM蛋白从亲和基质中洗出。将亲和基质用60μlPBS进一步洗涤并且通过凝胶电泳将上清液集合用于分析。
c.凝胶电泳
i.非还原SDSPAGE
非还原SDSPAGE用于分离不同分子量的各种突变体IgM蛋白。Novex4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)与NovexMESSDS运行缓冲液(LifeTechnologies)一起使用。
ii.还原SDS-PAGE
将NuPageLDS样本缓冲液(LifeTechnologies)和NuPage还原剂二硫苏糖醇(LifeTechnologies)添加到IgM蛋白样本中并且在装载于NuPageNovex4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies,目录号NP0322)上之前加热到80℃持续10分钟。NuPageMESSDS运行缓冲液(LifeTechnologies,目录号NP0002)用于凝胶电泳。在电泳完成之后，将凝胶从设备除去并且使用胶体蓝染色(LifeTechnologies,手册#LC6025来进行染色。
iii.凝胶条带定量
将蛋白质凝胶干燥，然后使用图像扫描仪进行数字化。将凝胶图像用图像J程序处理，并且特定条带中蛋白质的量使用凝胶定量功能来确定。
iv.SDS-PAGE凝胶的分析
Rtx:Fc包括野生型和工程改造IgMFc对2a和2bSDS-PAGE凝胶。非还原SDS-PGE凝胶上的泳道1、2和3(图6)示出针对单独Rtx2a、单独Rtx2b和野生型Rtx，上部条带是同二聚Rtx(H2L2，预期MW168-180kDa)并且下部条带是半抗体(HL，预期MW84-90kDa)。非缔合Fc(预期MW36-41kDA)的条带存在于所有三个泳道中；缔合Fc(预期MW72-82kDa)也可以是80-90kDa条带的组分。泳道2示出Rtx2a:Fc2b的混合物，并且泳道3示出Rtx2b:Fc2a的混合物。在两个泳道中，异二聚体(预期MW120-131kDa)用箭头指示。工程改造Rtx2a:Fc2b和Rtx2b:Fc2a组合两者示出显著异二聚体的存在，然而野生型Rtx:Fc组合仅示出少量异二聚体。
如图7中所示的还原SDS-PAGE的泳道1-3中所见，Fc确实存在：顶部条带是Rtx重链(预期MW61-67kDa)，中部条带是Fc(预期MW36-41kDa)，并且底部条带是Rtx轻链(预期MW23kDa)。
Okt:Fc包括野生型和基因改造IgMFc对2a和2b，SDS-PAGE，图8，泳道1-3
野生型Okt:Fc组合(SDS-PAGE，图8，泳道1)示出上部条带是Okt:Fc异二聚体(预期MW98-107kDa)，底部条带是未缔合Fc(预期MW36-41)并且大的中部条带表示缔合Fc(预期MW72-82)。相反，对于Okt2a:Fc2b和Okt2b:Fc2a组合，图8泳道2中所示的SDS-PAGE凝胶示出显著的条带是异二聚体，并且非常轻的条带是上文缔合Fc2b和Okt2a同二聚体并且与Okt2a:Fc2b异二聚体一致。箭头指示异二聚体。
Okt2a和Fc2b两者均存在于还原凝胶中(图9泳道2中所示的SDS-PAGE凝胶)。对于Okt2b:Fc2a对，相似结果见于图8和9的凝胶上。
Okt:Rtx包括野生型和工程改造IgMFc对2a和2bSDS-PAGE凝胶，示出于图8和图9泳道4-6中
野生型Okt:Rtx组合(图8泳道4中所示的SDS-PAGE凝胶)示出wtRtx同二聚体(H2L2，预期MW168-180kDa)的条带，wtRtx半抗体(HL，预期MW84-90kDa)的条带和可以是Okt同二聚体(预期MW124-133kDa)的轻条带。相反，工程改造Okt2a:Rtx2b组合(图8泳道5中所示的SDS-PAGE凝胶)示出显著异二聚体(预期MW146-157)以及Rtx2b同二聚体(预期MW168-180kDa)和半抗体(预期MW84-90kDa)的存在。当还原(图9泳道5中所示的SDS-PAGE凝胶)时，Rtx2b轻链示出在MW23kDa下的条带；60-80kDA之间的重条带可能由Rtx2b重链(预期MW61-67kDa)和Okt2a重链(预期MW62-67kDa)组成。对于Okt2b:Rtx2a对见到相似结果。
结论：
对于测试的所有三个系统--Okt:Rtx、Okt:Fc、Rtx:Fc--工程改造IgMFc变体示出相较于天然(非工程改造)IgMFc的实质上提高的异二聚体形成。测试单对序列(即，Fcs2a和2b)，并且可评估工程改造Fc界面的额外变体以进一步降低同二聚体形成并且优化异二聚体形成。
3.双特异性功能分析
a.两个配体的ELISA分析
通过ELISA分析利用可溶性CD3ε蛋白捕集和抗cMyc(9E10)检测来测定具有OKT3(链A)和cMyc肽(链B)的IgM。将可溶性CD3e蛋白以2mg/ml于150mMNaHCO3中涂布在ELISA板上，接着用3％BSA的PBS溶液阻断。在25C下将含有转染IgM-OKT3-cMyc的上清液(100μl)添加到阻断ELISA板持续4小时。在用PBS洗涤之后，在室温下将9E10抗体添加到ELISA板持续2小时。在用PBS洗涤之后，添加抗小鼠IgG-HRP。在添加HRP底物之后通过在OD450的情况下读取来检测双特异性IgM的存在。
通过ELISA分析利用可溶性CD3ε蛋白捕集和蛋白质-L-HRP检测来测定具有Okt3(链A)和Rituxan(链B)的IgM。将可溶性CD3e蛋白以2mg/ml于150mMNaHCO3中涂布在ELISA板上，接着用3％BSA的PBS溶液阻断。在25C下将含有转染IgM-Okta:Rtxb或Oktb:Rtxa的上清液(100μl)添加到阻断ELISA板持续4小时。在用PBS洗涤之后，在室温下将蛋白质-L-HRP添加到ELISA板持续2小时。在添加HRP底物之后通过在OD450的情况下读取来检测双特异性IgM的存在。
b.靶标结合的FACS分析
通过将抗体结合至T细胞系(Peer，阳性细胞系)和B细胞系(Daudi，阴性对照细胞系)来确认IgM-OKT3-cMyc结合至T细胞。在洗涤之后，将罗丹明标记的9E10添加到细胞悬浮液中。通过具有或不具有CD20抗原的阳性和阴性对照细胞的MFI来检测细胞靶标结合。
c.双特异性结合的荧光显微术测定
通过所设计IgM使两个群体CD3阳性细胞和CD20阳性细胞结合在一起的能力验证其双特异性结合，所述细胞通过在各细胞型上的两种不同活体染料进行预标记。例如：
i.绿色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素绿AM)，其标记CD3阳性细胞系(Peer)
ii.红色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素红色-橙色,AM)，其标记CD20阳性B细胞系(Daudi)
实施例2
1.具有设计突变的DNA构建体的产生
如实施例1中进行DNA构建体合成和表达载体的构建。
a.不同大小的μ链
A链由与人类μ链的CM1融合的嵌合OKT3(抗CD3)Vh区的全长μ链组成：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
(SEQIDNO:13)
A链具有约63kD的分子量并且能够结合至CD3的可溶性ε链(10977-H08H，SinoBiological)或T细胞。
B链具有与人类μ链的CH2融合的cMyc标签。
QVQLGGPEQKLISEEDLNSAVLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
(SEQIDNO:14)
B链具有约41kD的分子量并且能够结合至抗myc单克隆抗体9E4或其他抗myc抗体。
替代B链具有与人类μ链的CH2融合的CrossMabM-CL(VH+CL)利妥昔单抗(抗CD20)的全长μ链：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
(SEQIDNO:15)
B链具有约64kD的分子量并且能够结合至CD20阳性B细胞。
b.不同轻链偶联
天然嵌合OKT3κ链
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQIDNO:16)
利妥昔单抗的CrossMabCM1-CL
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
(SEQIDNO:17)
c.不同表达载体的不同选择标记物
在用于共转染的不同表达载体上使用不同选择标记物。使用多种药物来选择细胞以适应与IgM产生相关的所有必要的表达载体。使用标准分子生物技术来将特定DNA克隆到这些载体中。
i.μ链利用博来霉素选择(ant-zn-1，Invivogen)。博来霉素以100μg/ml的浓度使用。在用含有Shble基因的质粒转染之后，然后将细胞以100μg/ml孵育在含有博来霉素的Opti-CHO培养基中以选择稳定的转染子。
ii.κ链利用杀稻瘟菌素S选择(ant-bl-1，Invivogen)。杀稻瘟菌素S以10μg/ml的浓度使用。在用含有bsr基因的质粒转染之后，然后将细胞以10μg/ml孵育在含有杀稻瘟菌素S的Opti-CHO培养基中以选择稳定的转染子。
d.蛋白质表达、纯化和表征
i.转染
通过将在等摩尔比或可变摩尔比(5至10倍差异)下的若干不同表达载体共转染到哺乳动物细胞(诸如293细胞或CHO细胞)中来制备IgM。将表达载体的DNA与PEI混合，然后添加到CHO-S细胞中。根据确立的技术来用CHO-S细胞进行PEI转染(参见“BiotechnologyandBioengineering,第87卷,553-545”)。
ii.蛋白质纯化
·CaptureSelectIgM(目录号2890.05，BAC，ThermoFisher)
根据制造商的方案通过亲和力CaptureSelectIgM亲和基质来纯化来自转染CHO-S细胞上清液的IgM蛋白。
·Capto-L(目录号17-5478-01，GEHealthcare)
根据制造商的方案通过Capto-L亲和基质来纯化CHO-S细胞上清液中含有κ链的转染IgM蛋白。
iii.凝胶电泳
·非还原SDSPAGE
非还原SDSPAGE根据大小分离天然IgM和它的突变体形式。由同二聚重链(AA)组成的五聚IgM产生大致1,000,000分子量的蛋白质条带。由较短型式的同二聚重链(BB)组成的五聚IgM产生显著较低分子量的蛋白质条带。由异二聚重链(嵌合AB)组成的五聚IgM产生具有大于BB并且小于AA的分子量的多种蛋白质。
在装载到凝胶上之前，在25C下将NuPageLDS样本缓冲液(LifeTechnologies)添加到IgM蛋白样本中持续30分钟。NativePageNovex3-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)与NovexTris-乙酸盐SDS运行缓冲液(LifeTechnologies)一起使用。进行跑胶，直到前侧染料到达凝胶底部。
·还原SDS-PAGE
将NuPageLDS样本缓冲液(LifeTechnologies)和NuPage还原剂二硫苏糖醇(LifeTechnologies)添加到IgM蛋白样本中并且在装载于NuPageNovex4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies,目录号NP0322)上之前加热到80℃持续10分钟。NuPageMESSDS运行缓冲液(LifeTechnologies,目录号NP0002)用于凝胶电泳。进行跑胶，直到前侧染料到达凝胶底部。
在电泳完成之后，从设备除去凝胶并且使用胶体蓝染色(LifeTechnologies，手册#LC6025)将凝胶染色
·凝胶条带定量
将蛋白质凝胶干燥，然后使用图像扫描仪进行数字化。将凝胶图像用图像J程序处理，并且特定条带中蛋白质的量可使用凝胶定量功能来确定
iv.质谱分析，以鉴别/定量双特异性制剂中的各种mAb。
v.使用差示扫描量热法(DSC)的稳定性分析
e.双特异性功能分析
i.两种配体的ELISA分析
通过ELISA分析利用可溶性CD3ε蛋白捕集和抗cMyc(9E10)检测来测定具有OKT3(链A)和cMyc肽(链B)的IgM。将可溶性CD3e蛋白以2mg/ml于150mMNaHCO3中涂布在ELISA板上，接着用3％BSA的PBS溶液阻断。在25C下将含有转染IgM-OKT3-cMyc的上清液(100μl)添加到阻断ELISA板持续4小时。在用PBS洗涤之后，在室温下将9E10抗体添加到ELISA板持续2小时。在用PBS洗涤之后，添加抗小鼠IgG-HRP。在添加HRP底物之后通过在OD450的情况下读取来检测双特异性IgM的存在。
ii.靶标结合的FACS分析
通过将抗体结合至T细胞系(Peer，阳性细胞系)和B细胞系(Daudi，阴性对照细胞系)来确认IgM-OKT3-cMyc结合至T细胞。在洗涤之后，将罗丹明标记的9E10添加到细胞悬浮液中。通过具有或不具有CD20抗原的阳性和阴性对照细胞的MFI来检测细胞靶标结合。
iii.双特异性结合的荧光显微术测定
通过所设计IgM使两个群体CD3阳性细胞和CD20阳性细胞结合在一起的能力验证其双特异性结合，所述细胞通过在各细胞型上的两种不同活体染料进行预标记。例如：
·绿色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素绿AM)，其标记CD3阳性细胞系(Peer)
·红色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素红色-橙色,AM)，其标记CD20阳性B细胞系(Daudi)
可使用本领域中已知的技术(诸如上文描述的那些技术)，以相似的方式进行多特异性结合和多特异性功能分析。

Claims (102)

1.一种具有五聚或六聚环结构的结合分子，其包含五个或六个双特异性结合单元，其中所述双特异性结合单元各自具有相同的两种结合特异性并且包含第一链和第二链，所述第一链至少包含与第一结合靶标的第一结合区缀合的IgM重链恒定区的Cμ4域，所述第二链至少包含IgM重链恒定区的Cμ4域和第二结合靶标的第二结合区，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标不同，并且其中所述第一链和所述第二链经过组装以由于它们个别IgM重链恒定区之间所产生的不对称界面而产生双特异性结合单元。
2.如权利要求1所述的结合分子，其中所述双特异性结合单元是相同的。
3.如权利要求2所述的结合分子，所述结合分子还包含IgMJ链。
4.如权利要求3所述的结合分子，所述结合分子具有五聚环结构。
5.如权利要求2所述的结合分子，所述结合分子具有六聚结构。
6.如权利要求2所述的结合分子，其中所述第一链和所述第二链还包含IgM重链恒定区的Cμ3域。
7.如权利要求2或6所述的结合分子，其中所述第一链和所述第二链还包含IgM重链恒定区的Cμ2域。
8.如权利要求2所述的结合分子，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标选自肽、多肽、糖蛋白、核酸分子以及有机小分子和非有机小分子。
9.如权利要求2所述的结合分子，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标选自可溶性多肽、细胞表面受体、配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
10.如权利要求2所述的结合分子，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标结合至相同可溶性靶标上的两个位点、相同细胞表面受体靶标上的两个位点、两个不同可溶性靶标、两个细胞表面受体靶标、一个可溶性靶标和一个细胞表面受体靶标、一个可溶性靶标或细胞表面受体靶标和一个长停留时间靶标、一个可溶性靶标和一个基质蛋白靶标或底物靶标、一个可溶性靶标或受体靶标和一个分子转运蛋白靶标，或两个不同细胞类型。
11.如权利要求1至10中任一项所述的结合分子，其中缀合是通过融合。
12.如权利要求11所述的结合分子，其中所述第一结合区和所述第二结合区分别融合至所述第一IgM重链恒定区和所述第二IgM重链恒定区的N末端。
13.如权利要求12所述的结合分子，其中所述第一结合区和所述第二结合区是抗体的可变区。
14.如权利要求13所述的结合分子，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标是两个不同抗原。
15.如权利要求13所述的结合分子，其中所述第一结合靶标和所述第二结合靶标是相同抗原上的不同表位。
16.如权利要求13所述的结合分子，其中所述第一结合区和所述第二结合区分别是结合至所述第一结合靶标和所述第二结合靶标的两个不同抗体重链可变区。
17.如权利要求13所述的结合分子，其中所述第一结合区和所述第二结合区是各自结合至相同结合靶标上不同表位的两个不同抗体重链可变区。
18.如权利要求16或17所述的结合分子，其中所述抗体重链可变区来自IgG、IgA、IgE或IgM抗体。
19.如权利要求18所述的结合分子，其中所述抗体重链可变区来自IgM抗体。
20.如权利要求16或17所述的结合分子，所述结合分子是双特异性IgM分子。
21.如权利要求20所述的结合分子，其还包含与所述两个不同IgM重链可变区中的至少一个缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
22.如权利要求20所述的结合分子，其还包含与所述两个不同IgM重链可变区中的每一个缔合的IgM轻链可变区序列。
23.如权利要求1至22中任一项所述的结合分子，其中在结合单元的所述两条链的所述IgM重链恒定区之间，至少一些所述不对称界面由盐桥产生，所述盐桥由所述结合单元的所述两条链的所述Cμ2、Cμ3和/或Cμ4域中的至少一个中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
24.如权利要求23所述的结合分子，其中盐桥在所述结合单元的所述两条链的所述Cμ2-Cμ2、Cμ4-Cμ4和Cμ2-Cμ3-Cμ4域中的至少一个之间形成。
25.如权利要求23所述的结合分子，其中所述成对开关选自由以下组成的组：E→K、K→E；R→E、E→R；D→K、K→D；和R→D、D→R。
26.如权利要求24所述的结合分子，其包含所述Cμ4-Cμ4域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关。
27.如权利要求26所述的结合分子，其中所述开关选自由以下组成的组： 和
28.如权利要求24所述的结合分子，其包含所述Cμ2-Cμ2域之间的至少一个带成对电荷的氨基酸开关。
29.如权利要求28所述的结合分子，其中所述开关选自由和组成的组。
30.如权利要求24所述的结合分子，其包含所述Cμ2-Cμ3-Cμ4域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关。
31.如权利要求29所述的结合分子，其中所述开关选自由以下组成的组：和
32.如权利要求1至22中任一项所述的结合分子，其中在结合单元的所述两条链的所述IgM重链恒定区之间，至少一些所述不对称界面通过钮-孔连接来产生。
33.如权利要求32所述的结合分子，其中至少一个钮-孔连接由选自由以下组成的组的突变产生：钮：T350→Y,F,W；和H395→Y,F；和孔：L352→G,A,V,I,M,S,T；H395→A,V,I,L,M,F,Y；F393→W,Y；I397→A,V,S,T；T350→S,A,V；和T348→S。
34.如权利要求21至23中任一项所述的结合分子，其中所述轻链可变区序列通过在所述轻链与所述重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。
35.如权利要求34所述的结合分子，其中所述不对称界面通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来产生。
36.如权利要求21至35中任一项所述的结合分子，其包含共同轻链。
37.如权利要求1至36中任一项所述的结合分子，其缀合至毒素。
38.如权利要求1至36中任一项所述的结合分子，其缀合至化疗剂。
39.如权利要求37或38所述的结合分子，其中缀合是通过融合。
40.如权利要求37或38所述的结合分子，其中缀合是通过化学连接子。
41.如权利要求20至40中任一项所述的结合分子，其是嵌合的或人源化的。
42.一种组合物，其包含至少约70％根据1至41中任一项所述的结合分子。
43.一种组合物，其包含至少约80％根据1至41中任一项所述的结合分子。
44.一种组合物，其包含至少约95％根据权利要求1至41中任一项所述的结合分子。
45.一种组合物，其包含至少约98％根据权利要求1至41中任一项所述的结合分子。
46.一种组合物，其包含至少约99％根据权利要求1至42中任一项所述的结合分子。
47.如权利要求42至46中任一项所述的组合物，其是药物组合物。
48.一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其包含五个或六个单特异性结合单元，其中(i)所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，其各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标，并且(iii)外部不对称界面在结合至不同靶标的所述邻近单特异性结合单元的所述重链恒定区之间产生。
49.如权利要求48所述的多特异性结合分子，其中至少三个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。
50.如权利要求48所述的多特异性结合分子，其中至少四个所述单特异性结合单元结合至不同结合靶标。
51.如权利要求48所述的多特异性结合分子，其中所述结合分子具有五聚环结构并且所有五个单特异性结合单元结合至不同靶标。
52.如权利要求48所述的多特异性结合分子，其中所述结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述单特异性结合单元结合至不同靶标。
53.如权利要求52所述的多特异性结合分子，其中所有六个单特异性结合单元结合至不同靶标。
54.一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其包含五个或六个双特异性结合单元，其中(i)所述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，其各自至少包含缀合至结合靶标的结合区的Cμ3和Cμ4域，(ii)至少两个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标，(iii)内部不对称界面在各双特异性结合单元的两个IgM重链恒定区之间产生，并且(iv)外部不对称界面在结合至不同靶标的所述邻近双特异性结合单元的所述重链恒定区之间产生。
55.如权利要求54所述的多特异性结合分子，其中至少三个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
56.如权利要求54所述的多特异性结合分子，其中至少四个所述双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
57.如权利要求54所述的多特异性结合分子，其中所述结合分子具有五聚环结构并且所有五个双特异性结合单元结合至不同靶标。
58.如权利要求54所述的多特异性结合分子，其中所述结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述双特异性结合单元结合至不同靶标。
59.如权利要求52所述的多特异性结合分子，其中所有六个双特异性结合单元结合至不同结合靶标。
60.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其还包含IgMJ链。
61.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其具有五聚环结构。
62.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其具有六聚结构。
63.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其中在至少一个所述结合单元中，所述IgM重链恒定区还包含Cμ2域。
64.如权利要求63所述的多特异性结合分子，其中在所有所述结合单元中，所述IgM重链恒定区还包含Cμ2域。
65.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其中在所有所述结合单元中，所述重链恒定区是相同的。
66.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其中所述结合靶标选自肽、多肽、糖蛋白、核酸分子以及有机小分子和非有机小分子。
67.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其中所述结合靶标选自可溶性多肽、细胞表面受体、配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
68.如权利要求48或54所述的多特异性结合分子，其中结合至不同靶标的所述结合单元选自由结合至以下的结合单元组成的组：相同可溶性靶标上的位点；相同细胞表面受体靶标上的位点；不同可溶性靶标；不同细胞表面受体靶标；可溶性靶标和细胞表面受体靶标；可溶性靶标或细胞表面受体靶标和长停留时间靶标；可溶性靶标和基质蛋白靶标或底物靶标；可溶性靶标或受体靶标和分子转运蛋白靶标，和不同细胞类型。
69.如权利要求48至68中任一项所述的多特异性结合分子，其中缀合是通过融合。
70.如权利要求67所述的多特异性结合分子，其中所述结合区融合至所述IgM重链恒定区的N末端。
71.如权利要求70所述的多特异性结合分子，其中至少一个所述结合区是抗体的可变区。
72.如权利要求71所述的多特异性结合分子，其中所有所述结合区是抗体重链可变区。
73.如权利要求72所述的多特异性结合分子，其中至少两个结合靶标是不同抗原。
74.如权利要求72所述的多特异性结合分子，其中至少两个结合靶标是相同抗原上的不同表位。
75.如权利要求71所述的多特异性结合分子，其中所述抗体重链可变区来自IgG、IgA、IgE或IgM抗体。
76.如权利要求75所述的多特异性结合分子，其中所述抗体重链可变区来自IgM抗体。
77.如权利要求76所述的多特异性结合分子，其是多特异性IgM分子。
78.如权利要求77所述的多特异性结合分子，其还包含与至少一个所述结合单元中的IgM重链可变区缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
79.如权利要求78所述的多特异性结合分子，其还包含与所述IgM重链可变区中的每一个缔合的IgM轻链可变区序列。
80.如权利要求48至79中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述内部不对称界面通过由所述Cμ2、Cμ3和/或Cμ4域中的至少一个中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关所形成的盐桥来产生。
81.如权利要求80所述的多特异性结合分子，其中盐桥在所述结合单元的所述两条链的所述Cμ2-Cμ2、Cμ4-Cμ4和Cμ2-Cμ3-Cμ4域中的至少一个之间形成。
82.如权利要求81所述的多特异性结合分子，其中所述成对开关选自由以下组成的组：E→K、K→E；R→E、E→R；D→K、K→D；和R→D、D→R。
83.如权利要求80所述的多特异性结合分子，其包含所述Cμ4-Cμ4域中的至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关。
84.如权利要求83所述的多特异性结合分子，其中所述开关选自由以下组成的组： 和
85.如权利要求80所述的多特异性结合分子，其包含所述Cμ2-Cμ2域之间的至少一个带成对电荷的氨基酸开关。
86.如权利要求85所述的多特异性结合分子，其中所述开关选自由和组成的组。
87.如权利要求80所述的多特异性结合分子，其包含所述Cμ2-Cμ3-Cμ4域中的至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关。
88.如权利要求87所述的多特异性结合分子，其中所述开关选自由以下组成的组：和
89.如权利要求48至88中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述外部不对称界面通过所述Cμ3-Cμ3域中的至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关产生。
90.如权利要求89所述的多特异性结合分子，其中所述带成对电荷的氨基酸开关是或
91.如权利要求48至79中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述IgM重链恒定区之间的至少一些所述外部不对称界面和/或所述内部不对称界面通过钮-孔连接来产生。
92.如权利要求91所述的多特异性结合分子，其中至少一个钮-孔连接由选自由以下组成的组的突变产生：钮：T350→Y,F,W；和H395→Y,F；和孔：L352→G,A,V,I,M,S,T；H395→A,V,I,L,M,F,Y；F393→W,Y；I397→A,V,S,T；T350→S,A,V；和T348→S。
93.如权利要求79至92中任一项所述的多特异性结合分子，其中所述轻链可变区序列通过在所述轻链与所述重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。
94.如权利要求93所述的多特异性结合分子，其中所述不对称界面通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来产生。
95.如权利要求79至94中任一项所述的多特异性结合分子，其包含共同轻链。
96.如权利要求48至95中任一项所述的多特异性结合分子，其缀合至毒素。
97.如权利要求48至95中任一项所述的多特异性结合分子，其缀合至化疗剂。
98.如权利要求96或97所述的多特异性结合分子，其中缀合是通过融合。
99.如权利要求96或97所述的多特异性结合分子，其中缀合是通过化学连接子。
100.如权利要求79至99中任一项所述的多特异性结合分子，其是嵌合的或人源化的。
101.一种组合物，其包含至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％根据48至100中任一项所述的多特异性结合分子。
102.如权利要求101所述的组合物，所述组合物是药物组合物。
CN201480051238.5A 2013-09-05 2014-09-04 恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体 Active CN105722855B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361874284P 2013-09-05 2013-09-05
US201361874277P 2013-09-05 2013-09-05
US61/874,277 2013-09-05
US61/874,284 2013-09-05
PCT/US2014/054079 WO2015053887A1 (en) 2013-09-05 2014-09-04 Constant chain modified bispecific, penta- and hexavalent ig-m antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105722855A true CN105722855A (zh) 2016-06-29
CN105722855B CN105722855B (zh) 2021-04-23

Family

ID=51542496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480051238.5A Active CN105722855B (zh) 2013-09-05 2014-09-04 恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10351631B2 (zh)
EP (1) EP3041862B1 (zh)
JP (1) JP6721505B2 (zh)
KR (1) KR102306492B1 (zh)
CN (1) CN105722855B (zh)
AU (1) AU2014332458B2 (zh)
CA (1) CA2922830A1 (zh)
DK (1) DK3041862T3 (zh)
WO (1) WO2015053887A1 (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
BR112013020338A2 (pt) 2011-02-28 2016-10-18 Hoffmann La Roche proteína de ligação de antígeno monovalente, composição farmacêutica, uso da proteína de ligação de antígeno monovalente, método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno monovalente, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
BR112016006929A2 (pt) * 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
WO2015120474A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Igm Biosciences, Inc. Iga multi-specific binding molecules
SG11201608194VA (en) 2014-04-03 2016-10-28 Igm Biosciences Inc Modified j-chain
SG10202001779UA (en) 2015-01-20 2020-04-29 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor (tnf) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
SG11201707144VA (en) * 2015-03-04 2017-09-28 Igm Biosciences Inc Cd20 binding molecules and uses thereof
AU2016238246B2 (en) 2015-03-25 2021-05-13 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent hepatitis B virus antigen binding molecules and uses thereof
CN107847591B (zh) 2015-04-17 2023-07-28 Igm生物科学股份有限公司 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用
EP3356401B1 (en) 2015-09-30 2020-06-24 IGM Biosciences, Inc. Binding molecules with modified j-chain
EP3355913A1 (en) * 2015-09-30 2018-08-08 IGM Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
KR102343742B1 (ko) 2016-05-09 2021-12-24 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 항-pd-l1 항체
EP3607091A4 (en) 2017-04-07 2021-01-20 IGM Biosciences, Inc. MODIFIED HUMAN CONSTANT IGM REGIONS FOR THE MODULATION OF COMPLEMENT-DEPENDENT CYTOLYSIS EFFECTOR FUNCTION
KR20200128391A (ko) 2018-03-01 2020-11-12 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 IgM 혈청 반감기에 영향을 미치는 IgM Fc 및 J-쇄 돌연변이
WO2021216756A2 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Igm Biosciences, Inc. Pd-1 agonist multimeric binding molecules
WO2023196995A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptor multimers and uses thereof
WO2024073482A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Dren Bio, Inc. Multispecific antibodies and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013049254A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Jn Biosciences Llc Hybrid constant regions

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8719963D0 (en) 1987-08-24 1987-09-30 Cattaneo A Recombinant dna products
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU2004240782B2 (en) 2003-05-23 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Production of recombinant IGM in per.C6 cells
RU2398882C2 (ru) 2004-07-22 2010-09-10 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
AU2005304973A1 (en) 2004-11-05 2006-05-18 Palingen, Inc. Antibody induced cell membrane wounding
US8349332B2 (en) * 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
PL2235064T3 (pl) * 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
US9676845B2 (en) * 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
LT2794905T (lt) 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
CA2863714C (en) 2012-02-08 2022-07-05 Igm Biosciences, Inc. Cdim binding proteins and uses thereof
WO2015107126A1 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Mondelli Mario Umberto Francesco Neutralizing human monoclonal antibodies against hepatitis b virus surface antigen
WO2015120474A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Igm Biosciences, Inc. Iga multi-specific binding molecules
SG11201608194VA (en) 2014-04-03 2016-10-28 Igm Biosciences Inc Modified j-chain
SG10202001779UA (en) 2015-01-20 2020-04-29 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor (tnf) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
SG11201707144VA (en) 2015-03-04 2017-09-28 Igm Biosciences Inc Cd20 binding molecules and uses thereof
AU2016238246B2 (en) 2015-03-25 2021-05-13 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent hepatitis B virus antigen binding molecules and uses thereof
CN107847591B (zh) 2015-04-17 2023-07-28 Igm生物科学股份有限公司 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用
EP3356401B1 (en) 2015-09-30 2020-06-24 IGM Biosciences, Inc. Binding molecules with modified j-chain
EP3355913A1 (en) 2015-09-30 2018-08-08 IGM Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
KR102343742B1 (ko) 2016-05-09 2021-12-24 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 항-pd-l1 항체
WO2018017889A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric gitr binding molecules and uses thereof
US20190338040A1 (en) 2016-07-20 2019-11-07 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd137/4-1bb binding molecules and uses thereof
WO2018017888A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric ox40 binding molecules and uses thereof
CA3030640A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd40 binding molecules and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013049254A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Jn Biosciences Llc Hybrid constant regions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN KLEIN等: "Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies", 《MABS》 *
ROGER MÜLLER等: "High-resolution structures of the IgM Fc domains reveal principles of its hexamer formation", 《PNAS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015053887A1 (en) 2015-04-16
BR112016004768A2 (zh) 2017-09-05
CA2922830A1 (en) 2015-04-16
DK3041862T3 (da) 2020-07-27
KR20160077036A (ko) 2016-07-01
EP3041862B1 (en) 2020-05-06
AU2014332458A1 (en) 2016-04-07
JP2016531924A (ja) 2016-10-13
JP6721505B2 (ja) 2020-07-15
KR102306492B1 (ko) 2021-09-29
BR112016004768A8 (pt) 2018-06-12
US20160222132A1 (en) 2016-08-04
EP3041862A1 (en) 2016-07-13
US10351631B2 (en) 2019-07-16
CN105722855B (zh) 2021-04-23
AU2014332458B2 (en) 2020-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105722855A (zh) 恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体
JP7314356B2 (ja) 改変ｊ鎖を有する結合分子
CN104955953B (zh) 高效诱导抗体重链恒定区的异源二聚体形成的ch3域变体对，其制备方法及用途
CN108350084B (zh) 新的间皮素抗体和包含其的组合物
CN110305210A (zh) 新型抗体分子、其制备方法及其用途
CN107921122A (zh) 与cd38结合的抗体治疗剂
CN108473569A (zh) 针对人白介素-2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白
US9840561B2 (en) Human anti-human epidermal growth factor receptor antibody and encoding gene and application thereof
CN110229232B (zh) 双特异性抗体及其用途
JP2023512774A (ja) 抗ｒｏｒ１抗体および組成物
CN108025065A (zh) 与cd123结合的抗体治疗方法
WO2021218684A1 (zh) 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
CN111378044B (zh) 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
JP7365654B2 (ja) 抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体
CN109721656A (zh) 靶向rankl的治疗性抗体
CN108948193A (zh) 针对tim-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途
US20200131263A1 (en) Anti-gitr antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2020253393A1 (zh) 共价多特异性抗体
CN115521377A (zh) 人表皮生长因子受体结合分子及其应用
WO2023041065A1 (zh) 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用
US20220127362A1 (en) Tetravalent bispecific antibody against pd-1/lag-3, preparation method therefor, and use thereof
WO2022267926A1 (zh) 一种抗tnfr2抗体及其制备方法和应用
CN115873114A (zh) Ctla-4结合分子及其应用
CN116284408A (zh) 结合人muc17的抗体、其制备方法及用途
CN117355540A (zh) 抗cd137抗体和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180528

Address after: Danish spirits

Applicant after: IGM BIOSCIENCES INC.

Address before: American California

Applicant before: KEYBIOSCIENCE AG

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180928

Address after: American California

Applicant after: IGM Bioscience, Limited by Share Ltd

Address before: Danish spirits

Applicant before: IGM BIOSCIENCES INC.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant