CN107098970A - 结合细胞内prl‑1多肽或prl‑3多肽的抗体 - Google Patents

结合细胞内prl‑1多肽或prl‑3多肽的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明人提供了一种能够结合至细胞内PRL‑1多肽或PRL‑3多肽的抗体，其中所述抗体能够结合至与抗体269、抗体223或抗体318结合的表位。这样的抗‑PRL抗体能够结合至细胞内PRL‑1或PRL‑3。它们可以适合被用作抗癌症或癌症转移的治疗剂，或者在临床诊断中来鉴定PRL‑3或PRL‑1阳性的患者。

Description

结合细胞内PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗体
本申请是申请日为2008年5月3日，申请号为201210272198.X，发明名称为“结合细胞内PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医学领域、细胞生物学领域、分子生物学领域及生物化学领域。本发明还涉及医学领域。
具体而言，本发明涉及疾病尤其是癌症的治疗和诊断，以及用于这样的用途的组合物。
背景技术
癌症是全世界的一个严重健康问题。在2007年，据估计全世界有760万人死于癌症。例如在英国，癌症每年造成126,000人死亡。四分之一的人死于癌症。
已知用于癌症的治疗法包括外科手术、化学疗法和放射疗法。如果发现地够早，许多癌症可以被治愈。
100年之前，德国化学家保罗·奥利克(Paul Ehrlich)提出了抗体作为“魔方”的观念。抗体能够以特殊的方式识别及结合它们的抗原，因此是用于经免疫系统识别及破坏恶性细胞的理想制剂。由于这个原因，抗体构成了一类发展最为快速的人类癌症疗法。
大量潜在的癌症或肿瘤标记物以及癌症抗原已经在文献中被鉴定，并且已经开发出对抗它们中的一些的抗体治疗物。
例如，已知的癌症治疗物赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(Trastuzumab))是一种能杀死HER2阳性癌细胞的单克隆抗体。赫赛汀可结合癌细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)抗原。同样，贝伐单抗(Bevacizumab)(阿瓦斯汀TM(AvastinTM))是一种靶向血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，VEGF是一种参与新血管形成的生长因子。通过抑制血管发生，贝伐单抗可阻止肿瘤细胞接收稳定的血液供应，从而防止接收肿瘤存活需要的氧和营养物。
然而，抗体治疗对于不同癌症的适应性不是普遍的。妨碍抗体治疗普遍应用的一个限制是抗体分子较大的体积，并因此不能通过质膜或细胞膜。在不进行改良的情况下，抗体(包括单克隆抗体)通常仅适宜于靶向位于宿主细胞表面或外部的癌症抗原14-15。在以上的实例中，HER2受体位于细胞表面，因此是赫赛汀进行抗体结合可及的。同样，VEGF被分泌到血液中，能够被贝伐单抗结合。
PRL是一类细胞内C末端异戊二烯化的蛋白质。缺乏异戊二烯化信号的PRL突变形式一般位于核内16-17。通过EM免疫金标记显示PRL-1和PRL-3定位于质膜和早期内体的内叶(inner leaflet)18。PRL-3和PRL-1的过表达已被表明与多种人癌症相关3-12,19。PRL-1和PRL-3已知与肿瘤转移相关。已经知道，大多数癌症患者死于转移，而非死于他们的原发疾病。
迫切需要防止癌症转移的有效方法。迄今为止抗体还没有被用于靶向细胞内抗原或癌症标记物，这是因为抗体无法通过细胞膜，因而无法接近抗原。
发明内容
本发明人现已证明，针对PRL-1和PRL-3的抗体可意外地结合至它们的细胞内靶标。
根据文献中的提示，以前从未认为可能用抗体靶向细胞内PRL以消除癌细胞和癌症转移，这是因为PRL的细胞内定位。本发明人已表明实际情况不是这样，并提供抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体用作癌症治疗剂，尤其是癌症转移的治疗剂。
Li等人(2005)描述了PRL-1和PRL-3特异性单克隆抗体的产生。然而，这些抗体的序列以及这些抗体的可变区序列还没有被公开。而且，产生这些抗体的杂交瘤在当时并不为公众可及，并且迄今为止也不为公众可及。从而，在Li等人(2005)中描述的抗体迄今为止公众也无法获得。再者，考虑到PRL-1和PRL-3的细胞内定位，没有说明所述抗体可用于治疗癌症。
本发明人公开了两种针对PRL-1的小鼠单克隆抗体(269和223)以及一种针对PRL-3的小鼠单克隆抗体(318)的可变区。本发明人公开了抗-PRL-1抗体269和抗-PRL-3抗体318的结合表位。本发明人还公开了产生这些抗体的方法，以及制备具有与这些抗体相同或相似结合性质的抗体的方法，这些方法的每一种迄今为止均是不可能的。
根据本发明的第1方面，本发明人提供了一种能够结合至PRL-1多肽或PRL-3多肽的抗体，其中所述抗体能够结合与抗体269、抗体223或抗体318或者它们的变体、同系物、衍生物或片段结合的表位。
所述抗体能够结合至与抗体269结合的PRL-1多肽上的表位。所述抗体可包括能够结合至表位TYKNMR和/或TLNKFI的抗-PRL1抗体，或者它的变体、同系物、衍生物或片段。
所述抗体能够结合至与抗体223或抗体318结合的PRL-3多肽上的表位。所述抗体可包括能够结合至表位KAKFYN和/或HTHKTR的抗-PRL3抗体，或者它的变体、同系物、衍生物或片段。
所述抗体可包含单克隆抗体269的可变区(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4)、单克隆抗体223的可变区(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8)或单克隆抗体318的可变区(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12)。
根据本发明的第2方面，提供了一种抗体，所述抗体包含单克隆抗体269的可变区(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4)或者它的能结合PRL-1的变体、同系物、衍生物或片段。
根据本发明的第3方面，本发明人提供了一种抗体，所述抗体包含单克隆抗体223的可变区(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8)或者它的能结合PRL-1的变体、同系物、衍生物或片段。
根据本发明的第4方面，本发明人提供了一种抗体，所述抗体包含单克隆抗体318的可变区(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12)或者它的能结合PRL-3的变体、同系物、衍生物或片段。
所述抗体能够结合至细胞内PRL-1多肽或PRL-3多肽。所述抗体能够通过细胞质膜。
所述抗体能够结合并抑制PRL-1或PRL-3的生物活性，优选蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。
所述抗体能够防止癌症转移，所述癌症优选结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、子宫颈癌、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑色素瘤。所述癌症可包括表达PRL-1或PRL-3的癌症。
所述抗体可包括单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
作为本发明的第5方面，提供了一种包含如前述的抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体的结合物。
根据本发明的第6方面，本发明人提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含这样的抗体或结合物，以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明在第7方面中提供了一种能够结合至PRL-1或PRL-3的抗体，用于一种癌症或癌症转移的治疗方法或预防方法中，所述抗体可包括如前述的抗体、如上文列出的结合物或如上文列出的药物组合物。
所述方法可包括将癌细胞暴露于所述抗体或结合物。所述方法可包括将治疗有效量的所述抗体、结合物或组合物给予患有或疑似患有癌症的个体。所述癌症可包括转移癌。所述癌症可为表达PRL-1或PRL-3的癌症。
所述癌症可包括结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、子宫颈癌、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑色素瘤。
治疗个体中的转移瘤数目与未治疗个体相比可减少至少50％。它可减少至少60％。它可减少低至少70％。它可减少至少80％。治疗个体中的转移瘤数目与未治疗的个体相比可减少至少90％。
根据本发明的第8方面，提供了一种如上文列出的抗体、一种如所述的结合物或一种如所述的药物组合物，用于癌症或癌症转移的诊断方法中。
根据本发明的第9方面，本发明人提供了一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含这样的抗体、这样的结合物或这样的药物组合物以及在癌症或癌症转移的诊断中使用的说明书。
根据本发明的第10方面，本发明人提供了一种多肽，所述多肽包含选自以下的序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12，或者它们能够结合PRL的变体、同系物、衍生物或片段。
根据本发明的第11方面，提供了一种核酸，所述核酸包含能够编码如上文列出的分子的序列，例如选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11或者它们能够编码具有PRL结合活性的多肽的变体、同系物、衍生物或片段。
作为本发明的第12方面，本发明人提供了一种包含或转化有这样的核酸序列的细胞，或者这样的细胞的后代。
根据本发明的第13方面，本发明人提供了一种产生如所述的抗体的方法，所述方法包括提供一种这样的细胞并从所述细胞表达所述抗体。
根据本发明的第14方面，本发明人提供了一种在个体中诊断癌症例如转移癌的方法，所述方法包括将来自所述个体的生物样品暴露于如上文列出的抗体，并检测所述抗体和PRL-1多肽或PRL-3多肽的结合情况。
根据本发明的第15方面，提供了一种在患有或疑似患有癌症的个体中治疗或者预防癌症例如转移癌的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效量的如所述的抗体、如所述的结合物或如所述的组合物。
所述方法可包含如上述任一段中列出的特征。
根据本发明的第16方面，本发明人提供了一种在患有或疑似患有癌症的个体中治疗或预防癌症例如转移癌的方法，所述方法包括通过如所述的方法在所述个体中诊断癌症，并通过如所述的方法治疗所述个体。
根据本发明的第17方面，本发明人提供了一种检测转移细胞的方法，所述方法包括将候选细胞暴露于如上述的抗体，并检测所述细胞的PRL-1多肽或PRL-3多肽表达情况。
根据本发明的第18方面，本发明人提供了一种产生转移瘤动物模型的方法，所述方法包括：(a)将多个转移癌细胞例如表达PRL-1或PRL-3的癌细胞给予第一动物；(b)使所述细胞在所述第一动物中发展成转移瘤；(c)从所述第一动物提取转移瘤并从所述转移瘤获得细胞系；并(d)将所述细胞系的多个细胞给予第二动物。
根据本发明的第19方面，本发明人提供了一个通过一种这样的方法得到的动物模型。
根据本发明的第20方面，本发明人提供了通过一种这样的方法产生的动物模型或者如上文列出的动物模型作为转移瘤模型的用途。
根据本发明的第21方面，本发明人提供了一种包括以下步骤的方法：提供如所述的抗体，并使所述抗体结合至PRL-1多肽或PRL-3多肽。
可使所述抗体结合至表达PRL-1多肽或PRL-3多肽的细胞。所述PRL-1可包括细胞内PRL-1多肽。所述PRL-3多肽可包括细胞内PRL-3多肽。
除非另外指出，否则本发明的实施将运用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些是本领域普通技术人员的能力所能及的。这些技术在文献中有说明。例如，参见J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning：ALaboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley andJ.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,DavidLane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of DrugScreening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,NewYork,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0-87969-630-3。这些一般性文本的每一篇都通过引用的方式纳入本文。
附图说明
图1.快速形成侵袭性(aggressive)肺肿瘤转移的七步动物模型。1.如以前的描述8，产生50％细胞表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO稳定混合池。2.经尾静脉将1×106的这种细胞注射至裸鼠的循环系统中。3.在注射后3周时分离单个的EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1肺肿瘤。4.在培养皿中切割并剁碎所述肿瘤以产生同质的表达EGFP-PRL的细胞系(AT-3或AT-1)。5.将1×106个AT-3细胞或AT-1细胞经裸鼠的尾静脉注射至循环系统中。6.未处理组：未处理、PBS或无关小鼠抗体。7.将以AT-3细胞注射的小鼠用腹水或纯IgG形式的PRL-3mAb克隆#223或#318处理，而将以AT-1细胞注射的小鼠以PBS处理或者以PRL-1mAb克隆269腹水处理。
图2.PRL-3和PRL-1mAb特异性地抑制它们各自的转移性肺肿瘤形成。A.将1×106个AT3细胞(图1中描述)经尾静脉注射至裸鼠中。小鼠是未处理的(a，n＝10)或PBS-处理的(b，n＝10)，或者被以两种无关抗体处理(c，n＝5；d，n＝5)。PRL-3mAb 223是以纯IgG(e)或腹水(g)的形式经尾静脉给予；PRL-3mAb 318是以纯IgG(f)或腹水(h)的形式经尾静脉给予。在接种AT3细胞后第3、6和9天注射所述不同的抗体。在注射后第15天切下肺并在荧光显微镜下照相以显示GPF-阳性的转移瘤。图像a、b、e和f为雌性小鼠的肺。图像c、d、g和h为雄性小鼠的肺。B.A中的肿瘤总数目被认为是每组肿瘤损害的平均数(Y轴)，X轴显示经不同处理的不同组小鼠。以AT-3细胞注射的小鼠的结果显示于第1-7列。以AT-1细胞注射的小鼠以PBS或以抗PRL-1的mAb 269处理(第8-9列)。n＝每组中的小鼠数目。
图3.PRL-1mAb特异性地抑制PRL-1转移瘤，但不抑制PRL-3转移瘤；而PRL-3mAb特异性地抑制PRL-3转移瘤，但不抑制PRL-1转移瘤。在第1天，本发明人将表达EGFP-PRL-1或EGFP-PRL-3的一百万个癌细胞(AT-1或AT-3)经其尾静脉注射至每只小鼠中。然后将小鼠分组，在注射癌细胞后第3、6和9天经它们的尾静脉分别接受PBS、兔PRL抗体、PRL-1mAb或PRL-3mAb。在第15天，将来自携带表达EGFP-PRL-1的AT-1癌细胞的小鼠的肺(图：a-d)或来自携带表达EGFP-PRL-3的AT-3癌细胞的小鼠的肺(e-h)切下并拍照。肺中的PRL-1和PRL-3转移瘤不能被模拟品PBS处理阻断(a、e)，但都可以被兔抗体(b、f)有效阻断。PRL-1mAb可抑制PRL-1过表达的肿瘤的形成(c)，但当PRL-3过表达时不抑制肿瘤的形成(g)。类似地，PRL-3mAb可抑制PRL-3过表达的转移瘤的形成(h)，但在PRL-1过表达时不抑制转移瘤的形成(d)。因此，这些各个PRL-mAb分别在对表达其靶抗原的细胞的肺转移瘤形成进行阻断中是特异性的。
图4.PRL-3mAb可有效地阻断A2780PRL-3-阳性癌细胞的转移瘤形成；但对于CT26PRL-3阴性癌细胞的转移瘤形成没有效应。A.A2780细胞而非CT26细胞表达内源的PRL-3。通过蛋白质印迹法分析从CT26小鼠结肠癌细胞系和A2780人卵巢癌细胞系制备的细胞裂解物，以检测PRL-3。将GAPDH用作上样对照。B.PRL-3抗体处理不影响接种癌细胞后2周时CT26PRL-3阴性细胞的肺肿瘤形成。对所有主要组织检查肿瘤形成情况。对处理小鼠(图a)和未处理小鼠(图b)的动物总体形态以及切下的肺拍照。在所有肺中观测到了广泛的肿瘤形成，由黑色箭头标出。C.PRL-3抗体处理可抑制接种癌细胞后1个月时实验性转移测定中的病理表观及A2780PRL-3阳性细胞的肿瘤形成。对所有主要组织检查肿瘤形成情况。对动物总体形态以及从未处理动物切下的肿瘤(由黑色箭头标出)拍照。在处理小鼠中没有观测到肿瘤。
图5.通过间接免疫荧光法显示AT-3癌细胞和亲本CHO细胞中的抗体摄取。A.EGFP-PRL-3在所有非透化AT-3细胞中表达，这是通过EGFP检测的(a、d)。一些细胞被PRL-3mAb完全标记19(图b、e中白色箭头标出)；40％的非透化细胞被PRL-3mAb部分地标记为红色；所述被内化的抗体似乎以极化的方式分布于细胞端部(f中单头箭头标出)并且一些分布在膜突出物中(f中双头箭头标出)；而剩下的细胞保持未标记(c和f，仅绿色的细胞)。B.To-pro-3碘化物被用于将每个亲本CHO细胞的DNA染色为蓝色。能够摄取小鼠抗-GS28抗体的活细胞(10-20％)呈现绿色(a、b和c)。血清过夜饥饿的大多数活细胞(60-70％)能够摄取小鼠抗-GS28抗体，呈现为绿色(d、e和f)。白色箭头标出不能摄取抗体的一些细胞(或许处于细胞周期的某些阶段)。尺度条，20μm。
图6.正常细胞和癌细胞中一般的抗体摄取现象通过双染色的间接免疫荧光法显示：A.将小鼠抗-GS28抗体(红色)和兔抗-PTEN抗体(绿色)添加至非透化MCF-10A正常细胞。B.将小鼠抗-GS28抗体(红色)和兔抗-p53抗体(绿色)添加至非透化MCF-7癌细胞。C.将小鼠抗-GS28抗体(红色)和兔抗-p53抗体(绿色)添加至16小时血清饥饿的非透化MCF-7细胞。将To-pro-3碘化物用于染色DNA(蓝色)。尺度条，20μm。
图7.PRL-3和PRL-1在多种人癌症中过表达。A.将PRL-3mAb(克隆223或318)用于检查PRL-3在多个人癌症样品中的表达情况。PRL-3过表达的实例出现于人结肠(26/158例，a)、乳腺(19/96例，b)、食道(2/13例，c)、肺(d，虚线右手边上方的吸烟沉淀物被染色为黑色)、阴茎(e)和宫颈癌(f)。所述PRL-3阳性信号通过用3,3'-二氨基联苯胺色原(DAB)的免疫组织化学法被显示为褐色。所有图像的放大倍数都是×400。B.将PRL-1mAb(克隆269)用于检查PRL-1在多个人癌症样品中的表达情况。显示了PRL-1在人结肠(8/128例，a，×200放大倍数)、脑(5/20例，b，×200)和食道(1/13例，c，×400)中过表达的实例。
图8.PRL-3和PRL-1嵌合mAb仅特异性地与它们各自的抗原作用。A.所示的模型显示了构建嵌合mAb的主要步骤梗概。B.通过IF，在过表达EGFP-PRL-3的DLD-1细胞上测试了PRL-3嵌合mAb(#318)(a)，并表明所述PRL-3嵌合mAb能识别这些细胞中的EGFP-PRL-3(b)。合并的图像显示于c中。类似地，还在过表达EGFP-PRL-1的DLD-1人结肠直肠癌细胞上测试了PRL-1嵌合mAb(#269)(d)，并表明所述PRL-1mAb能识别这些细胞中的EGFP-PRL-1(e)。合并的图像显示于f中。尺度条，20μm。C.通过蛋白质印迹分析，在源自过表达EGFP-PRL-3的DLD-1细胞(第1道)、过表达myc-PRL-3(第2道)、myc-PRL-1(第3道)或myc-PRL-2(第4道)的CHO细胞的4份细胞裂解物上评估了所述PRL-3嵌合mAb。PRL-3嵌合mAb仅与EGFP-PRL-3和myc-PRL-3作用，而不与myc-PRL-1和myc-PRL-2作用。D.在3种GST-PRL蛋白质上评估了所述PRL-1嵌合mAb：GST-PRL-1(第1道)、GST-PRL-2(第2道)和GST-PRL-3(第3道)。PRL-1嵌合mAb仅与GST-PRL-1作用，但不与GST-PRL-2和GST-PRL-3作用。
图9.PRL-3嵌合mAb显著地抑制表达内源性PRL-3的A2780细胞和HCT116细胞的转移瘤形成，但不抑制不表达内源性PRL-3的DLD-1细胞的转移瘤形成。A.从过表达EGFP-PRL-3的HCT116、A2780、DLD-1癌细胞和DLD-1细胞提取总细胞裂解物。所述内源性PRL-3蛋白在HCT116和A2780被检测到，但未在在DLD-1细胞中被检测到。所述外源性EGFP-PRL-3仅在第4道被检测到。对于B、C和D：在第1天经尾静脉以1×106个癌细胞注射裸鼠。所述小鼠被给予PRL-3嵌合mAb(处理的)或PBS(未处理的)。当未处理小鼠严重患病时，每个实验的时长被确定并结束。在每次实验结束时拍照片。B.HCT116细胞的处理，左为处理的小鼠，右为未处理的小鼠。C.A2780细胞的处理，左为处理的小鼠，右为未处理的小鼠。D.a.DLD-1细胞的处理，左为处理的小鼠，右为未处理的小鼠；b.表达EGFP-PRL-3的DLD-1细胞的处理，左为未处理的小鼠，右为处理的小鼠。
图10.PRL-3可增强肺转移瘤形成和血液循环中的癌细胞存活。A.显示了来自处理小鼠和未处理小鼠的肺切片。在荧光显微镜下，多个微肿瘤(以Micro-T标出)出现在来自未处理小鼠的肺切片中，但很少出现在来自处理小鼠的肺切片中。B.将从处理小鼠和未处理小鼠的尾静脉得到的血液样品涂于载玻片上，并在荧光显微镜下检查EGFP-PRL-3癌细胞。箭头标示出了EGFP-PRL-3阳性的癌细胞。
图11.PRL-3嵌合抗体可有效地抑制表达内源性PRL-3的B16F0细胞的转移瘤形成，但不抑制不表达内源性PRL-3的B16F10细胞的转移瘤形成。A.从B16F0和B16F10癌细胞制备总细胞裂解物。所述内源性PRL-3蛋白仅在B16F0细胞被检测到，但未在B16F10细胞中被检测到。B.在嵌合mAb处理后第1天以1×106个B16F0细胞注射裸鼠。左侧显示处理的小鼠，右侧显示未处理的小鼠。肿瘤出现于未处理的小鼠的肾上腺、肝、骨和腹部中。PRL-3mAb可消除处理小鼠大多数组织中的肿瘤形成。C.在第1天以1×106个B16F10细胞注射裸鼠。上图显示处理的小鼠，下图显示未处理的小鼠。数十个肺转移瘤出现于处理小鼠中和未处理小鼠中。
图12.抗-PRL3抗体318可结合细胞内的和外部化的/分泌的PRL-3多肽。A.细胞内PRL3，B.GAPDH对照，C.外部化的/分泌的PRL-3多肽。
图13.抗-PRL1抗体269和抗-PRL3抗体318的表位作图。A.通过蛋白质印迹显示的抗-PRL1抗体269结合的肽。B.通过蛋白质印迹显示的抗-PRL3抗体318结合的肽。
具体实施方式
抗-PRL抗体
本文实施例描述了抗PRL蛋白的抗体(即抗-PRL抗体)的形成和生产。这些抗-PRL抗体能够结合PRL-1或PRL-3，优选细胞内PRL-1或PRL-3。
单克隆抗体和人源化单克隆抗体两者以及它们的性质都详述于本文和实施例。所述抗体包括能够结合至PRL-1的单克隆抗体269。所述抗体还包括能够结合至PRL-3的单克隆抗体223和单克隆抗体318。这些抗体中每一种的人源化形式也被公开。
为了避免歧义，除非在上下文中另外指出，否则在本文中如果提及一个特别的抗体命名，那么将认为这包括提及了小鼠单克隆抗体(由一种杂交瘤分泌)以及它的人源化形式。因此，例如，如果抗体269被提及，则这包括单克隆抗体269(即小鼠杂交瘤分泌的被命名为269的抗体)以及人源化单克隆抗体269。
本领域技术人员通过本文中公开的信息并应用本发明人亦详述的分子生物学技术，可产生本文中描述的特定抗体。
基于此目的，本发明人公开了单克隆抗体269、单克隆抗体223和单克隆抗体318的可变区序列。本发明人还公开了这些可变区的变体、同系物、片段和衍生物。本领域技术人员使用这些序列信息可产生包含这些可变区或它们的变体、同系物、片段和衍生物的抗体。
本发明人还公开了用于表达这些单克隆抗体的核酸构建体的序列。这些构建体的序列能够产生具有与269、223或318相同的序列的单克隆抗体。本发明人还公开了269、223和318的变体、同系物、片段和衍生物。
最后，本发明人公开了能够表达所述人源化单克隆抗体269、223或318的构建体的序列。本发明人描述了从以所述构建体以及这些人源化构建体的变体、同系物、片段和衍生物转染的细胞表达所需抗体的方法。
本领域技术人员使用这些序列和表达方法可容易地转染相关的宿主细胞，并使它们表达整个单克隆的或者人源化的抗-PRL-1抗体和抗-PRL3抗体，或者它们的变体、同系物、片段和衍生物。
本发明人还提供了一般具有PRL结合活性的多肽。这些多肽包括抗-PRL抗体，例如抗-PRL-1抗体和抗-PRL3抗体。所述PRL结合多肽可具有与所述单克隆抗体269、223和318相同或相似的一种或多种性质。为了方便之目的，所述多肽将被统称为“抗-PRL抗体”。
读者有能力构建这样的结合分子，即这些分子可以不是(或者可以不被记述为)抗体或免疫球蛋白，但具有如本文所述的抗-PRL结合活性。因此，只要前后文允许，术语“抗-PRL抗体”应被认为包括任何分子，只要这种分子能够结合PRL。这些分子不仅可包括抗体和免疫球蛋白，还可包括多肽、小分子，并且可通过本领域中已知的多种方法进行鉴定，例如通过就PRL结合活性筛选合适的文库进行鉴定。
所述抗-PRL抗体(包括PRL结合分子)可具有与所述单克隆抗体269、223和318相似或相同的性质。这些相似或相同的性质可具体包括结合性质。所述抗-PRL抗体一般能够结合至PRL多肽，例如PRL-1和PRL-3。
因此，术语“抗-PRL抗体”将被认为包括单克隆抗体269、223和318(以及它们的人源化对应物)。还包括包含抗体269、223或318的可变区或者其变体、同系物、片段和衍生物的多肽。如果上下文允许，该术语还应被认为包括是指抗-PRL抗体的变体、同系物、片段和衍生物。
PRL1和PRL3表位
所述抗-PRL抗体可具有与269、223或318相同或相似的结合特异性、结合亲和性和/或结合亲和性。所述抗-PRL抗体可特异性地结合至抗体269结合的表位、抗体223结合的表位或抗体318结合的表位。
确定具体抗体结合的表位的方法在本领域中是已知的。这种表位作图方法记载于例如Hanson et al.,(2006).Respiratory Research,7:126中。此外，本领域技术人员将能够形成抗体并就具体的性质对其进行筛选。一种这样的方法的详细描述显示于实施例27中。因此，本领域技术人员将能容易鉴定可结合于与269、223和318所结合表位相同的表位的抗-PRL抗体。
实施例27显示，抗-PRL1抗体269可结合于表位TYKNMR和TLNKFI。因此，本发明人提供了诸如能结合序列TYKNMR的抗-PRL1抗体的抗-PRL抗体。本发明人还提供了诸如能够结合TLNKFI的抗-PRL1抗体的抗-PRL抗体。所述抗-PRL抗体可以有能力同时结合这两个序列。
再者，实施例27显示，抗-PRL3抗体可结合表位KAKFYN和HTHKTR。因此，本发明人提供了诸如能结合序列KAKFYN的抗-PRL3抗体的抗-PRL抗体。本发明人还提供了诸如能够结合HTHKTR的抗-PRL3抗体的抗-PRL抗体。所述抗-PRL抗体可以有能力同时结合这两个序列。
所述抗-PRL抗体可包含抗体269的可变区、抗体223的可变区或抗体318的可变区，它们中的每个均在下文中详述。它们可以在单个抗体分子中包含相同的或不同的可变区。它们可包含一个可变区，或者多于一个可变区。因此，本发明人使得本领域技术人员有能力产生具有与抗体269、223或318有相同或相似结合反应性的任何数目的抗体。
这种抗体可包括序列完整或基本完整的抗体(即重链和轻链)，或者它们可以包括完整抗体的片段(例如Fv、F(ab')和F(ab')2片段，或者单链抗体(scFv))。所述抗体还可包括包含所述抗体的抗原结合位点的融合蛋白或合成蛋白，如下文中的详述。还显而易见的是，可以就所需的性质例如降低的宿主反应性、减少的排斥反应等设计这些抗体。
所述设计可包括“人源化”，本发明人使用该术语指在抗体序列例如小鼠抗体序列中纳入(或替换)有一个或多个人残基或序列。“人源化”在本文上下文中包括“嵌合”抗体，其中所述抗体包含不连续部分的小鼠和人序列，例如所述可变区中的一个或两个都包含小鼠序列，而所述抗体分子的剩余部分(例如恒定区)包含人序列。在这些嵌合抗体中，例如小鼠抗体或大鼠抗体的完整可变区可以同人恒定区一起表达。这提供了这样一种具有人效应物功能的嵌合抗体，并且还降低了由鼠Fc区引起的免疫原性(HAMA)。
一般而言，“嵌合抗体”可以指这样的一种抗体，即该抗体具有由源自鼠免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链或轻链，以及由源自人免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链或轻链。
“人源化”还包括CDR移植的或重构的抗体。因此，它包括更不连续水平的设计，例如其中小鼠可变区已被突变来包括人残基从而降低免疫原性的抗体。在这样的抗体中，仅来自啮齿动物抗体V区的互补决定区可以与来自人V区的框架区结合。这样的抗体与嵌合抗体相比应该更加人源化，并且免疫原性更低。
通常，所述抗-PRL抗体在许多状态下都能够结合至PRL多肽。
在一个实施方案中，所述结合环境包括细胞内状态。也就是说，所述抗-PRL抗体能够结合至完整细胞或非透化细胞中的PRL多肽。这样的非透化细胞可包括这样的细胞，即所述细胞未暴露于或者基本未暴露于透化剂例如洗涤剂(如Triton X-100)或毛地黄皂苷(digitonin)中。
如本文描述的抗-PRL-3抗体能够结合至以下情况下的PRL-3，即所述PRL-3在细胞内、细胞膜内或者被包裹在细胞中。类似地，如本文大体描述的，PRL-1多肽在细胞内部组成的环境中可被抗-PRL-1抗体结合。所述抗-PRL-1抗体和抗-PRL3抗体具体地能够结合至细胞内PRL-1多肽或PRL-3多肽。所述细胞内PRL多肽可以与一种或多种细胞结构相关联，所述细胞结构例如细胞膜的内叶、细胞器、细胞骨架结构、核膜等。所述PRL多肽可位于核内。在这其中的每种情况中，所述抗-PRL抗体能够结合至细胞内环境中的PRL多肽。
所述抗-PRL抗体能够以多种方式结合至细胞内环境中的PRL多肽。所述抗-PRL抗体能够通过质膜。它能够以别的方式接近所述PRL多肽的结合区，例如通过细胞摄取。它可以通过任何方式被内化或被易位或者另外被送递至细胞中。
在另一个实施方案中，所述结合条件包括细胞外条件。所述抗-PRL抗体因此能够在细胞外环境中结合至它的同系PRL多肽。
所述抗-PRL抗体因此能够在细胞外结合至PRL多肽。换句话说，本文描述的抗-PRL-1抗体能够在PRL-1在细胞外时与之结合。类似地，如本文大体描述的，PRL-3多肽在细胞内部之外的环境中可被抗-PRL-3抗体结合。所述抗-PRL抗体能够结合至分泌的PRL-1多肽或PRL-3多肽(视情况而定)。所述PRL-1多肽或PRL-3多肽可包括循环的PRL-1多肽或PRL-3多肽。
所述抗-PRL抗体能够结合至外部的或外化的PRL多肽。它们可结合至血液循环中的分泌的PRL多肽。
所述抗-PRL抗体及其靶标之间的结合可以是更强的或更弱的、短暂的、半永久的或永久性的。
所述抗-PRL抗体与所述PRL多肽的结合可发生在细胞内。这样的结合可使所述PRL多肽的活性失活、被抑制或降低。所述结合可中和PRL的活性。所述活性可包括由所述PRL多肽引起的或与之相关的任何生物活性。所述活性可包括与另一种蛋白例如下游蛋白或因子的结合。抗-PRL抗体与PRL多肽的结合可使下游蛋白或因子的活性失活、被抑制或降低。所述活性可包括与其他细胞的通讯，所述细胞例如循环系统中的转移癌细胞。因此，所述抗-PRL抗体可中和血液循环中的PRL多肽，以阻止PRL-磷酸酶与下游因子结合，或者阻止它们与循环系统中的其他细胞通讯。
所述活性可包括生物化学活性或病原性活性。所述生物化学活性可包括催化活性。所述催化活性可包括磷酸酶活性。所述活性可包括生长调节活性、癌活性、致癌活性或转移活性。
所述单克隆抗体269、223和318可用于治疗人或其他动物中的疾病。本发明人在实施例中表明这些抗-PRL抗体具有抗癌活性。具体地，实施例表明，所述抗-PRL抗体能够阻止癌肿瘤的转移扩散。
实施例9记载了PRL过表达肿瘤在小鼠中的生成，并提供了一个用于转移和癌症治疗的动物模型。实施例10-12表明，与未用抗-PRL抗体处理的动物相比，以抗-PRL抗体处理的动物显示了显著更低的转移性肺肿瘤。具体地，所述处理动物显示出比未处理动物少约90％的肿瘤。所述抗-PRL抗体能够结合PRL多肽并阻断其活性，尽管该PRL多肽定位在细胞内。本发明人的研究代表了通过使用抗各自的磷酸酶(尽管它们定位于细胞内)的单克隆抗体可有效地(约90％)阻断转移的首批例证。
本发明人还表明，抗-PRL-3单克隆抗体可有效地阻断表达内源性PRL-3蛋白的人卵巢癌细胞系A2780的转移瘤形成。
因此，本发明人提供了抗-PRL抗体在疾病例如癌症治疗或预防中的用途。所述癌症可包括转移癌。所述抗-PRL抗体可被用作药物或治疗剂以治疗癌症例如已形成肿瘤的转移。它们可被用于预防癌症或癌症转移。
可治愈或可预防的癌症可包括这样的癌症，即该癌症与PRL蛋白的表达或过表达有关。所述PRL蛋白可以是其家族的一个相关成员。本发明人以此表示，通过抗-PRL-1抗体例如269或具有相似或相同性质的抗体，与PRL-1蛋白的表达或过表达相关的癌症是可以治愈的或可以预防的。类似地，通过抗-PRL-3抗体例如223或318或者具有相似或相同性质的抗体，与PRL-3的表达或过表达相关的癌症是可以治愈的或可以预防的。
所述癌症可包括多种癌症的任一种，例如结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、子宫颈癌、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑色素瘤。
所述治疗通常可包括将癌细胞或疑似为癌细胞的细胞与抗-PRL抗体相接触。可将所述细胞暴露于抗-PRL-1抗体。可将它暴露于或另外暴露于抗-PRL-3抗体。可将它同时暴露于抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体。在这种情况下，可将所述细胞同时暴露于两种抗体，或者依次暴露于各抗体。可将该暴露重复数次。可以使用任何的量或相对量及任何的暴露时间的任何组合的抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体。
因此，本发明人提供了如上述的抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体的结合物在治疗疾病例如癌症中的用途。
所述细胞可是单个细胞，或者它可以在细胞块例如癌细胞块或肿瘤细胞块中。所述细胞可位于生物体的体内。所述生物体可以是已知患有癌症的生物体，或者可能是疑似患有癌症的生物体。所述治疗可包括将所述一种或多种抗体给予所述生物体。如上文，可给予单独一种抗体，或者可给予抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体的结合物。如上述，所述给予可以是同时的或序贯的。因此，所述治疗可包括将抗-PRL-1抗体与抗-PRL-3抗体同时地或序贯地给予所述个体。
如下文中更详述的，所述抗-PRL抗体通常包括能够结合至PRL分子的任何免疫球蛋白。
PRL-1
下文从OMIM条目601585修改而来。
PRL-1也被称为蛋白酪氨酸磷酸酶，4a型，1；PTP4A1，肝再生磷酸酶1，PTP(CAAX1)。PRL-1的染色体定位在基因图谱座位6q12。
涉及生长、分化和代谢的细胞过程经常部分地被蛋白质磷酸化和脱磷酸化调节。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)水解酪氨酸残基的磷酸单酯，全都共有一个活性位点基序，并被分成3类。
这3类包括受体样PTP、细胞内PTP和双特异性PTP，所述双特异性PTP不但可以脱去酪氨酸的磷酸，而且可以脱去丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸。
Diamond et al.1994,Cell.Biol.14:3752-3762描述了一种来自再生的大鼠肝的PTP，这种PTP是第四类的一成员。该基因被命名为Prl1，是许多立即早期基因中的一种，主要在核内表达。Prl1在稳定转染的细胞中的过表达导致了表型的转变，这表明它可能在肿瘤发生中起到某些作用。
通过使用体外异戊二烯化筛查，Cates et al.,1996,Cancer Lett.110:49-55分离了2种编码PRL1同系物的cDNA(被命名为PTP(CAAX1)和PTP(CAAX2)(PRL2；601584))，所述PRL1同系物被哺乳动物的法尼基:蛋白质转移酶体外法尼基化。这些PTP在上皮细胞中的过表达引起培养细胞的表型转变和裸鼠中的肿瘤生长。这些作者得出结论，PTP(CAAX1)和PTP(CAAX2)代表异戊二烯化的致瘤PTP的一个新类。
Peng et al.1998,J.Biol.Chem.273:17286-17295报道，人PTP(CAAX1)基因(即PRL1)包含6个外显子并含有2个启动子。预测的小鼠、大鼠和人PRL1蛋白是相同的。Zeng etal.1998,Biochem.Biophys.Res.Commun.244:421-427确定，人PRL1和PRL2蛋白具有87％的氨基酸序列同一性。Peng et al.(1998)通过FISH将PRL1基因定位至6q12。
如果使用术语“PRL-1”，那么它将被认为是指任何的PRL-1序列，包括PRL-1蛋白或PRL-1核酸，以及它们的任何片段、变体同系物、衍生物或变体。
PRL-1的性质和活性被记载于本文中，例如在参考文献中。
[从OMIM修改的内容结束]
小鼠和人PRL-1蛋白被记载于Zeng et al(1998)，见上文。
PRL-1序列
本文描述的方法和组合物利用了PRL-1多肽，所述PRL-1多肽在下文中详述。如本文中使用的，术语“PRL-1”意欲指如下表D1中列出的序列。
表D1.PRL-1序列
“PRL-1多肽”可包括人PRL-1多肽或者由人PRL-1多肽组成，例如具有Unigene登记号NM_003463.3的序列。
还包括了任一、一些或全部的这些多肽的同系物变体和衍生物。例如，PRL-1可包括登记号U84411.1的Unigene。
PRL-3
下文从OMIM条目606449修改而来。
PRL-3也被称为蛋白酪氨酸磷酸酶，4a型，3；PTP4A3。PRL-3的染色体定位在基因图谱座位8q24.3。
蛋白激酶在心脏中调节收缩、离子转运、代谢和基因表达。磷酸酶除了在脱磷酸化中起作用外，还参与至心脏肥大和心脏功能障碍中。
通过数据库搜索和对心脏cDNA库的筛查，Matter et al.2001,Biochem.Biophys.Res.Commun.283:1061-1068鉴定了一种编码PTP4A3的cDNA，他们将其命名为PRL3。该推定的PRL3蛋白与PRL1(PTP4A1；601585)是76％相同的，与小鼠Prl3是96％相同的。RNA印迹分析显示了大约2.3kb的PRL3转录物主要在心脏和骨骼肌中表达，在胰脏中表达较低。这种表达模式不同于PRL1和PRL2(PTP4A2；601584)的更广泛表达。原位杂交分析将PRL3的表达定位于心肌细胞。Tris甘氨酸凝胶分析表明PRL3表达为22-kD的蛋白。功能和突变分析表明，磷酸切割依赖于PRL3的cys104。PRL3的过表达导致了细胞生长的提高。蛋白质印迹分析显示了p130Cas(BCAR1；602941)响应血管紧张素Ⅱ(106150)脱磷酸化，这表明了PRL3在调节由血管紧张素Ⅱ诱导的短暂细胞内钙中起作用。
为了了解转移的分子基础，Saha et al.2001,Science 294:1343-1346比较了转移结肠直肠癌和原发癌、良性结肠直肠肿瘤和正常结肠直肠上皮的全基因表达谱。PRL3在所研究的18个癌症转移中的每个中均以高水平表达，但在非转移肿瘤和正常结肠直肠上皮中以较低水平表达。在所检查的12个转移的3个中，多拷贝的PRL3基因出现在位于染色体8q24.3处的小扩增子中。Saha等人(2001)得出这样的结论，PRL3基因对于结肠直肠癌症转移是重要的。
使用斯坦福G3辐射杂交板(Stanford G3radiation hybrid panel)和数据库序列分析，Saha等人(2001)将PRL3基因作谱于标记物145.20附近。PRL3基因还紧密连接于标记物SHGC-22154，SHGC-22154位于8q24.3，距8q端粒大约3Mb。
[从OMIM修改的内容结束]
小鼠和人PRL-3蛋白被详细记载于Li et al(2005),Clin Cancer Res；11:2195-204。
PRL-3序列
本文描述的方法和组合物利用了PRL-3多肽，所述PRL-3多肽在下文中详述。如本文中使用的，术语“PRL-3”意欲是指如下表D2中列出的序列。
“PRL-3多肽”可包括人PRL-3多肽或者由人PRL-3多肽组成，例如具有Unigene登记号AF041434.1的序列。
还包括了任一、一些或全部的这些多肽的同系物变体和衍生物。例如，PRL-3可包括登记号BC066043.1的Unigene。
PRL-1多肽和PRL-3多肽
PRL-1多肽和PRL-3多肽可被用于多种方法中，例如用于产生或筛查抗-PRL-1剂和抗-PRL-3剂，例如特异性PRL-1结合剂和PRL-3结合剂，尤其是抗-PRL抗体。这些在下文中进一步详述。可以检测PRL-1多肽和PRL-3多肽的表达，用于诊断或检测癌症，尤其是乳腺癌。
“多肽”是指包含通过肽键或修饰肽键即肽电子等排体彼此连接的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”既指通常称为肽、寡肽或寡聚物的短链，也指通常称为蛋白质的较长链。多肽可包含20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”包括通过自然过程如翻译后加工，或者通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这样的修饰被详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及分卷的研究文献中。修饰可发生在多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应理解相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定多肽的数个位点处。而且，给定多肽可包含多种类型的修饰。
多肽可由于遍在蛋白化作用而具有分支，而且它们也可以是具有或没有分支的环状。环状、分支和分支环状多肽可以由翻译后自然过程或者通过合成方法产生。修饰可包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒酰基化、硫酸盐化、转运RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加诸如精氨酰化及遍在蛋白化。参见例如Proteins-Structure and Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993and Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects,pgs.1-12inPosttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,New York,1983；Seifter et al.,"Analysis for protein modifications andnonprotein cofactors",Meth Enzymol(1990)182:626-646and Rattan et al,"ProteinSynthesis:Posttranslational Modifications and Aging",Ann NYAcad Sci(1992)663:48-62。
术语“多肽”包括本领域中已知的多种合成肽变体，例如反向释放D肽(retroinverso D peptide)。所述肽可以是抗原决定簇和/或T细胞表位。所述肽可以在体内是免疫原性的。所述肽能够在体内诱导抗体被中和。
正如适用于PRL-1和PRL-3那样，所产生的氨基酸序列可具有一种或多种活性，例如与PRL-1多肽或PRL-3多肽(如人PRL-1多肽或PRL-3多肽)相同的生物活性。例如，与在正常乳腺细胞中相比，PRL-1或PRL-3同系物在癌细胞中的表达水平可升高。具体而言，术语“同系物”意在涵盖结构和/或功能方面的同一性，前提是所得到的氨基酸序列具有PRL-1或PRL-3活性。就序列同一性(即相似性)而言，可有至少70％，例如至少75％，例如至少85％，例如至少90％的序列同一性。可有至少95％，例如至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖由为所述PRL-1核酸或PRL-3核酸序列的等位基因变异体的氨基酸得到的多肽。
在提及多肽诸如PRL-1和PRL-3的“活性”或“生物学活性”时，这些术语意指PRL-1和PRL-3的代谢或生理功能，包括类似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的这些活性。还包括PRL-1和PRL-3的抗原性和免疫原性活性。这些活性的实例以及测定和定量这些活性的方法在本领域中是已知的，并且被详细记载于本文的其他地方。
抗体
如果上下文允许，本文中使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。这些术语包括抗体分子的这样的蛋白水解切割部分或重组制备部分的片段，即这些片段能够选择性地与PRL-1或PRL-3或者它们的表位相互作用，或者识别之，所述表位例如被269结合的PRL-1的表位或被223或318结合的PRL-3的表位。
PRL-1的表位包括TYKNMR和TLNKFI。PRL-3的表位包括KAKFYN和HTHKTR。
这种水解和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv片段，以及包含通过肽连接子结合的VL和VH区的单链抗体(scFv)。这些Fv可以共价地或非共价地连接，以形成具有两个或多个结合位点的抗体。
本发明人以“ScFv分子”表示VH和VL配对区通过灵活的寡肽连接的分子。涉及保持了其特异性结合位点的抗体片段合成的一般性技术综述见Winter&Milstein(1991)Nature349,293-299。
完整抗体和F(ab')2片段是“二价物”。本发明人以“二价物”表示所述抗体和F(ab')片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb是仅具有一个抗原结合位点的一价物。
所述抗-PRL抗体可包括解离速率(off rate)为10-2s-1-10-4s-1的高亲和性抗体。所述解离速率可以为约2×10-4s-1。
本文中使用的术语“解离速率”是指抗体例如本文公开的抗-PRL抗体的离解速率(koff)。解离速率可使用BIAevaluation软件(Pharmacia)测量。低解离速率是需要的，这是因为它可反映Fab片段对于抗原的亲和性。
术语“亲和性”以抗体例如抗-PRL抗体的离解速率或解离速率(koff)定义。所述解离速率越低，则抗体例如抗-PRL抗体具有的对抗原例如PRL-1或PRL-3的亲和性就越高。
所述抗-PRL抗体可包括肽本身或者可形成融合蛋白的一部分。
本文描述的抗-PRL抗体包括任何具有PRL-1或PRL-3结合活性的抗体，所述结合活性为例如结合至细胞内PRL-1或PRL-3的能力，或者结合至与269、223或318结合的相同表位(包括TYKNMR、TLNKFI、KAKFYN和HTHKTR)(视情况而定)的能力。
所述抗-PRL抗体还包括小鼠的、人源化的或人的整个或完整抗体，例如抗体衍生物和生物学活性片段。它们可包括这样的具有PRL-1或PRL-3结合活性的抗体片段，即所述抗体片段具有氨基酸置换或者具有糖分子或其他分子粘附于氨基酸官能团等。
所述抗-PRL抗体可包括分离的抗体或纯化的抗体。它可以从任何合适的天然源或非天然源得到或由其产生，或者它可以是合成的抗-PRL抗体、半合成的抗-PRL抗体、衍生的抗-PRL抗体或重组抗-PRL抗体。
如果所述抗-PRL抗体为非天然的抗-PRL抗体，那么它可包括至少一部分通过重组DNA技术制备的抗-PRL抗体，或者通过化学合成技术产生的抗-PRL抗体，或者它们的组合。
本文中使用的术语“衍生物”包括经化学修饰的抗-PRL抗体。例如，示例性的这种修饰可以是以烷基、酰基或氨基替换氢。所述抗-PRL抗体的序列可以与天然存在形式的序列相同，或者它可以是其变体、同系物、片段或衍生物。
抗体可变区
本文使用的术语“可变区”是指轻链(VL)和重链(VH)的可变区或域，所述可变区或域可包含所述抗体对PRL-1或PRL-3(或者变体、同系物、片段或衍生物)(视情况而定)的结合识别特异性决定簇和总亲和性决定簇。
每对轻链(VL)和重链(VH)的可变域参与至抗原识别并形成抗原结合位点。轻链域和重链域具有相同的整体结构，并且每个域具有4个框架(FR)区，所述框架区的序列相对保守，由3个互补决定区(CDR)连接。所述FR区保持可变域的结构完整性。所述CDR是可变域中介导抗原结合的多肽区段。
本文使用的术语“恒定区”是指抗体(或者变体、同系物、片段或衍生物)这样的轻链域(CL)和重链域(CH)，即所述轻链域(CL)和重链域(CH)提供了结构稳定性和其他生物学功能，例如抗体链关联、分泌、经胎盘移动性和互补结合，但不参与结合PRL-1或PRL-3表位。恒定区基因的氨基酸序列和相应外显子序列将依赖于它所源自的物种。然而，对于一物种中的具体恒定区来说，导致同种异型的氨基酸序列的变化是相对有限的。“同种异型”是可区分等位基因的抗原决定簇(或者表位)。
每条链的可变区通过连接性多肽序列与恒定区相接。所述连接序列由轻链基因中的“J”序列以及重链基因中的“D”序列和“J”序列的联合序列编码。
抗体269、223和318：可变区序列
抗体269
单克隆抗体269可变区重链的核酸序列如下(SEQ ID NO：1)：
GGGAATTCATGAAATGCAGCTGGGTTATTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGTTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTTACTAGTTATCGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGCTATGGTAACTTCGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTAAGCTTGGGA
单克隆抗体269可变区重链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：
EFMKCSWVILFLFSVTAGVHSQVQFQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYRMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYGNFGYWGQGTTLTVSSESQSFPNVFPLVSLG
单克隆抗体269可变区轻链的核酸序列如下(SEQ ID NO：3)：
CTGTCTACTGCTCTCTGGTGAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGAAAGCAGATGGAACCATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCTCACTGGAGATCCTGCAGATCACGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
单克隆抗体269可变区轻链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：4)：VYCSLVRVSLTCRASQDIGSSLNWLQQKADGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPWTFGGGTKLEIKRADAAPHWRSCRSRELWLHHLSSSSRHLMSS
抗体223
单克隆抗体223可变区重链的核酸序列如下(SEQ ID NO：5)：
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTGAGTACAATGAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCACCCGTCTATCCCTTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
单克隆抗体223可变区重链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：6)：EFMEWSWVILFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTEYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEERNYPWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPPVYPLVPGSLG
单克隆抗体223可变区轻链的核酸序列如下(SEQ ID NO：7)：
TGGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGAAGATGATGGTGAAAATTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG
单克隆抗体223可变区轻链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：8)：
WEFMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVEDDGENYMNWYQQKPGQSPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
抗体318
单克隆抗体318可变区重链的核酸序列如下(SEQ ID NO：9)：
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTTATTACAATGAGAAGTTCAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCCGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
单克隆抗体318可变区重链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：10)：EFMEWSWVFLFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNYYMHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTYYNEKFRARPH.LQTNPPAQPTCSSAA.PLRTLRSISVQVRRELPLVCLLGPRDSGHCLCSQNDTPIRLSPGPWKLG
单克隆抗体318可变区轻链的核酸序列如下(SEQ ID NO：11)：
ACTAGTCGACATGGAGTCAGACACACTGCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATAAGCTTGGGA
单克隆抗体318可变区轻链的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：12)：LVDMESDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK
根据本文描述的方法和组合物，可通过本领域中已知的方法从这些可变区序列生成抗-PRL1抗体和抗-PRL3抗体。例如，通过本领域技术人员已知的重组基因工程技术，可将所述重链和轻链序列重组成为选择抗体的恒定序列。
恒定区序列是本领域中已知的，并且可从多个数据库获得，所述数据库例如IMGT/LIGM-DB数据库(记载于Giudicelli et al，2006，NucleicAcids Research 34(DatabaseIssue)：D781-D784and LeFranc et al(1995)LIGM-DB/IMGT：An Integrated Database ofIg and TcR，Part of the Immunogenetics Database.Annals of the New York Academyof Sciences 764(1)，47-47doi：10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x)和IMGT/GENE-DB数据库(记载于Giudicelli et al，2005，Nucleic Acids Res.2005Jan 1；33(Databaseissue)：D256-61)。IMGT/LIGM-DB和IMGT/GENE-DB是位于www.ebi.ac.uk/imgt/的ImMunoGeneTics Database的一部分。
用于将可变区与给定序列和恒定区结合以产生完整抗体的方法是本领域中已知的，并被记载于例如实施例16和Hanson et al.，(2006).Respiratory Research，7：126中。完整抗体的片段例如Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段或者单链抗体(scFv)可通过本领域中已知的方法产生。
例如，使用文献中公开的序列和方法，可将具有上文所示序列的抗体318可变区的重链和轻链转基因地融合至小鼠IgG恒定区序列，以产生小鼠单克隆抗-PRL-3抗体。类似地，318可变区可与人IgG抗体的恒定区重组地表达，以产生一种人源化的抗-PRL-3抗体。223抗体和269抗体的可变区可以被设计来与小鼠或人IgG恒定区在一起，以产生能够结合至PRL-1多肽的小鼠单克隆抗体或人源化抗体。
检测和诊断方法
对PRL-1和PRL-3表达的检测
PRL-1和PRL-3在癌症组织中的表达与正常组织相比是上调的。
因此，本发明人提供了一种诊断癌症包括转移性、侵袭性或侵入性(invasive)癌症的方法，包括在个体的细胞或组织中检测PRL-1和PRL-3的表达调节，例如PRL-1和PRL-3表达的上调。
所述方法可包括使用本文中描述的抗-PRL抗体。所述抗-PRL抗体可用于免疫测定中，以检测和测定生物样品中PRL-1或PRL-3的量，从而提供PRL-1或PRL-3在所述样品所来源的细胞、组织、器官或个体中的表达水平的指标。免疫测定包括ELISA、蛋白质印迹等，并且应用它们评估PRL-1和PRL-3表达的方法是本领域技术人员已知的。
对PRL-1和PRL-3表达、活性和量的检测可用于提供一种确定细胞增殖状态的方法。因此，增殖细胞与正常细胞相比具有较高水平的PRL-1和PRL-3表达、活性或量。类似地，非增殖细胞与正常细胞相比具有低水平的PRL-1和PRL-3表达、活性或量。
这样的检测还可用于确定细胞是否会变成侵入性的或侵袭性的。因此，在细胞中检测到高水平的PRL-1和PRL-3表达、量或活性可指示所述细胞可能是或者可变成侵袭性的、转移性的或侵入性的。类似地，如果细胞具有低水平的PRL-1和PRL-3表达、量或活性，那么所述细胞不是或者可能不是侵袭性的、转移性的或侵入性的。
应了解，由于PRL-1和PRL-3的水平会随肿瘤的侵袭性变化，因此对PRL-1和PRL-3表达、量或活性的检测还可用于预测癌症个体的存活率，即高水平的PRL-1和PRL-3指示较低的存活率或几率，低水平的PRL-1和PRL-3指示较高的存活率或几率，这两种情况均是与具有正常水平PRL-1和PRL-3的个体或同类种群相比较。对PRL-1和PRL-3的表达、量或活性的检测因此可用作一种癌症患者的预后方法。
对PRL-1和PRL-3表达、量或水平的检测可用于确定一种具体的疗法在癌症个体中成功的可能性。它可用于一种确定肿瘤在个体中是否是或者是否可能是一种侵入瘤或转移瘤的方法中。
本文中描述的诊断方法可与所述治疗方法结合。因此，本发明人提供了一种在个体中治疗、预防或缓解癌症的方法，所述方法包括在所述个体的细胞中检测PRL-1和PRL-3的表达、量或活性的调节，并基于所述肿瘤的侵袭性将合适的治疗物给予所述个体。
一般而言，将物理检查X-射线用于检测癌症。一般采取肿瘤的活检组织，用于诊断癌症的组织病理学检查。对PRL-1和PRL-3表达、量或活性的检测可与标准组织病理学方法一块用于诊断癌症，或者进一步确认癌症的诊断。这在组织病理学分析不能产生一个清晰的结果时可能是特别有用的。
如下文进一步详述的，可检测PRL-1和PRL-3多肽及PRL-1和PRL-3核酸在样品中的存在和量。因此，通过包括以下步骤的方法可诊断与PRL-1和PRL-3相关的疾病(包括癌症)：从源自受试者的样品确定PRL-1和PRL-3多肽或者PRL-1和PRL-3mRNA表达、量或活性的非正常降低或升高，例如表达、量或活性的升高。
所述样品可包括来自患有或疑似患有这样的疾病的生物体或个体的细胞样品或组织样品，即该疾病与升高的、降低的或者要不然异常的PRL-1和PRL-3表达、量或活性有关，包括表达、量或活性的水平或模式的空间变化或时间变化。PRL-1和PRL-3的表达、量或活性在患有或疑似患有这种疾病的生物体中的水平或模式可用于与表达、量或活性在正常生物体中的水平或模式比较，作为一种诊断疾病的方法。
所述样品可包括来自患有或疑似患有癌症的个体的细胞样品或组织样品，例如相关的组织样品或细胞样品。
在一些实施方案中，在所述样品中检测到水平升高的PRL-1和PRL-3的表达、量或活性。PRL-1和PRL-3的水平与正常细胞或已知不是癌症的细胞相比可提高至一个显著的程度。这种细胞可获自被试验的个体或其他个体，例如那些与所述试验个体在年龄、体重、生活方式等上匹配的个体。
在一些实施方案中，PRL-1和PRL-3的表达、量或活性的水平升高10％、20％、30％或40％，或者升高更多。在一些实施方案中，PRL-1和PRL-3的表达、量或活性的水平升高45％或更多，例如50％或更多，这通过cDNA杂交判断。
如本领域中已知的以及下文中进一步详述的，PRL-1和PRL-3的表达、量或活性可以多种方式检测。一般而言，在来自个体的组织样品中测量PRL-1和PRL-3的量，并将该量与来自未感染个体的样品比较。除了可以检测PRL-1和PRL-3多肽的水平，还可以检测PRL-1和PRL-3核酸的水平。
对PRL-1和PRL-3的量、活性或表达的检测可用于对癌症分级。例如，高水平的PRL-1和PRL-3量、活性或表达可指示一种侵袭性的、侵入性的或转移性的癌。类似地，低水平的PRL-1和PRL-3量、活性或表达可指示一种非侵袭性的、非侵入性的或非转移性的癌。这种分级体系可与已确立的分级体系结合使用。
可使用多种不同技术确定PRL-1和PRL-3基因表达的水平。
对RNA水平的PRL-1和PRL-3表达的测量
可以在RNA水平检测PRL-1和PRL-3的基因表达。
因此在一个实施方案中，本发明人公开了一种通过以下方式在一个样品中检测包括PRL-1和PRL-3核酸的核酸存在情况的方法：将所述样品与对所述PRL-1和PRL-3核酸特异的至少一种核酸探针接触，并对所述样品监测PRL-1和PRL-3核酸的存在情况。例如，所述核酸探针可特异性地结合至PRL-1和PRL-3核酸或其一部分，并且还可检测两种被检测物之间的结合情况和所述复合物自身的存在情况。
PRL-1和PRL-3表达的RNA检测可用于补充多肽表达测定，如下文所述，所述多肽表达测定可应用本文所述的抗-PRL抗体。
因此，在一个实施方案中，可以在一个样品中测量PRL-1和PRL-3mRNA形式的PRL-1和PRL-3核酸的量。PRL-1和PRL-3mRNA的测定可通过原位杂交、RNA印迹和反转录酶-聚合酶链式反应。核酸序列的鉴定可通过原位杂交、DNA印迹、单链构象多态性分析、使用特异性引物的PCR扩增和DNA芯片分析。(Kawasaki,1990；Sambrook,1992；Lichter et al,1990；Orita et al,1989；Fodor et al.,1993；Pease et al.,1994)。
可以使用RNA提取技术从细胞提取PRL-1和PRL-3RNA，所述RNA提取技术包括例如酸性酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)或者RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen)。利用核糖核酸杂交的一般性测定形式包括核连缀分析(nuclear run-on assay)、RT-PCR和RNA酶保护测定(Melton et al.,Nuc.Acids Res.12:7035)。可被应用的检测方法包括放射性标记、酶标记、化学发光标记、荧光标记和其他合适的标记。
这些方法中的每种均允许进行定量测定，并且这些方法是本领域中熟知的。因此，可使用任何本领域中熟知的多核苷酸定量方法测量RNA水平的PRL-1和PRL-3表达、量或活性的降低或升高。来自PRL-1和PRL-3序列的任何合适探针例如合适的人PRL-1和PRL-3序列的任何部分可用作探针。用于设计PRL-1和PRL-3探针的序列可包括登记号NM_015472的序列或其部分。
一般而言，使用RT-PCR来扩增RNA靶标。在该方法中，使用反转录酶来将RNA转换成互补DNA(cDNA)，然后可扩增cDNA以有利于检测。
许多DNA扩增方法是已知的，它们中的大多数依赖于酶链式反应(例如聚合酶链式反应、连接酶链式反应或自主序列复制)或者来自对其中克隆它的载体的全部或部分的复制。
许多靶标和信号扩增方法已在文献中有记载，例如这些方法的一般性综述见Landegren,U.et al.,Science 242:229-237(1988)和Lewis,R.,Genetic EngineeringNews 10:1,54-55(1990)。
例如，聚合酶链式反应可应用于检测PRL-1和PRL-3mRNA。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是一种核酸扩增方法，记载于美国专利4,683,195、4,683,202等。在诊断中，PCR可用于扩增任何已知的核酸(Mok et al.,1994,GynaecologicOncology 52:247-252)。自主序列复制(3SR)是TAS的一种变化形式，它涉及经以下途经的核酸模板等温扩增：由酶混合物和合适的寡核苷酸引物介导的反转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性的连续循环(Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874)。连接扩增反应或连接扩增体系使用DNA连接酶和4种寡核苷酸——每条靶链2种。该技术记载于Wu,D.Y.and Wallace,R.B.,1989,Genomics 4:560。在Qβ复制酶技术中，将复制单链RNA的噬菌体Qβ的RNA复制酶用于扩增靶DNA，如Lizardi et al.,1988,Bio/Technology 6:1197所记载的。
PCR过程基本包括：(1)处理提取的DNA以形成单链的互补链；(2)添加一对寡核苷酸引物，其中该对引物的一个引物与所述序列有义链的一部分基本互补，每对引物的另一个引物与同一序列互补反义链的不同部分基本互补；(3)使所述配对的引物与所述互补序列退火；(4)同时从每个引物的3'端延伸所述退火引物，以合成一个与同每个引物退火的链互补的延伸产物，其中所述延伸产物在从所述互补物分离后作为模板，用于为每对引物的另一个引物合成延伸产物；(5)从所述模板分离所述延伸产物，以产生单链的分子；及(6)通过重复至少一次所述退火、延伸和分离步骤扩增所述单链分子。
可应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。还可使用定量RT-PCR。这些PCR技术在本领域中是熟知的，并且可应用来自PRL-1和PRL-3序列的任何合适的引物。
还可利用另一种扩增技术。例如，滚环扩增技术(Lizardi et al.,1998,NatGenet 19:225)是一种商业化的扩增技术(RCATTM)，该技术由DNA聚合酶驱动并且可在等温条件下以线性动力学或几何动力学复制环形的寡核苷酸探针。另一种技术——链置换扩增(SDA；Walker et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:392)开始于特定靶标所特有的明确确定的序列。
对多肽水平的PRL-1和PRL-3表达的测量
可以在多肽水平检测PRL-1和PRL-3的表达。
因此，在又一个实施方案中，可以通过在一个样品中检测PRL-1和PRL-3多肽的存在或量而检测PRL-1和PRL-3表达、量或活性。这一点可通过使用结合PRL-1和PRL-3多肽的分子实现。直接或间接结合于PRL-1和PRL-3多肽以检测其存在情况的合适分子/制剂包括天然存在的分子例如肽和蛋白质(例如抗体)，或者它们可以是合成的分子。
因此，本发明人公开了一种通过以下方式检测PRL-1和PRL-3多肽存在情况的方法：将一个细胞样品与一种能够结合所述多肽的抗体接触，及监测所述样品的所述多肽的存在情况。
例如，可以使用本文描述的抗-PRL-1抗体和抗-PRL-3抗体检测所述PRL-1和PRL-3多肽。这样的抗体可通过本文中详述的方法制备。在一个具体的实例中，抗-PRL-1抗体可包括能够结合至与单克隆抗体269所结合表位相同的表位的抗体。这可包括单克隆抗体269本身、包含抗体269可变区的抗体或者人源化的单克隆抗体269。
类似地，抗-PRL-3抗体可包括能够结合至与单克隆抗体223或318所结合表位相同的表位的抗体。这可包括单克隆抗体223或318本身、包含抗体223或318可变区的抗体或者人源化的单克隆抗体223或318。
该测定可方便地通过以下方式取得：监测所述抗体和所述多肽之间形成的复合物的存在情况，或者监测所述多肽和所述抗体之间的结合情况。检测两个实体之间的结合情况的方法在本领域中是已知的，包括FRET(荧光共振能量转移)、表面等离子体共振等。
标准的实验室技术例如上述的免疫印迹可用于检测与相同细胞群中未处理的细胞相比PRL-1和PRL-3蛋白的水平改变。
基因表达的确定还可通过检测PRL-1和PRL-3多肽翻译后加工或PRL-1和PRL-3核酸转录后修饰的变化。例如，可测量PRL-1和PRL-3多肽的差异磷酸化、PRL-1和PRL-3多肽的切割情况，或者PRL-1和PRL-3RNA的可变剪接等。可使用专有的蛋白测定或技术例如2D聚丙烯酰胺凝胶电泳检测基因产物例如PRL-1和PRL-3多肽的表达水平以及它们的翻译后修饰水平。
可用于确定来自宿主的样品中的PRL-1和PRL-3蛋白水平的测定技术是本领域技术人员熟知的。通过本领域中已知的任何方法可测定抗体的免疫特异性结合。
可使用的免疫测定包括但不限于使用例如以下技术的竞争性和非竞争性测定体系：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、夹心免疫测定(sandwich immunoassays)、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射性测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。这些测定在本领域中是常规的(例如，见Ausubel et al.,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,New York，该文献通过引用的方式全文纳入本文)。
对标本测定多肽/蛋白可通过免疫组织化学染色和免疫细胞化学染色(通常见Stites and Terr,Basic and Clinical Immunology,Appleton and Lange,1994)、ELISA、RIA、免疫印迹、蛋白质印迹法、免疫沉淀、功能测定和蛋白截短检测。其他测定方法包括放射免疫测定、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。
ELISA测定是本领域技术人员熟知的。多克隆抗体和单克隆抗体都可用于所述测定中。如本领域技术人员已知的，只要合适，可以使用其他免疫测定，例如放射免疫测定(RIA)。可用的免疫测定广泛地记载于专利和科学文献中。例如，见美国专利3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521，以及Sambrook et al,1992。
诊断试剂盒
本发明人还提供了用于在个体中检测癌症或者在个体中检测癌症易感性的诊断试剂盒。
所述诊断试剂盒可包含通过本文中描述的任何方法检测PRL-1或PRL-3在所述个体中的表达、量或活性的工具。因此，所述诊断试剂盒可包含以下抗体中的一种或多种：抗-PRL抗体、能够结合至与单克隆抗体269、223或318所结合表位相同的表位的抗体、单克隆抗体269、包含抗体269可变区的抗体或人源化的单克隆抗体269；单克隆抗体223、包含抗体223可变区的抗体或人源化的单克隆抗体223；单克隆抗体318、包含抗体318可变区的抗体或人源化的单克隆抗体318。
所述诊断试剂盒可包含使用说明书或其他指示物。所述诊断试剂盒还可包含用于治疗或预防乳腺癌的工具例如本文中描述的任一组合物，或者本领域中已知用于治疗乳腺癌的任何工具。具体而言，所述可包含如所述的抗-PRL1抗体或抗-PRL3抗体(例如通过筛查得到的)。
预防和治疗方法
本发明人公开了一种治疗与过量的PRL-1和PRL-3表达或活性有关的异常病症例如癌症的方法。防止癌症(即预防)的方法也适当地采用相同或相似的方法。
通常而言，本发明人的方法涉及通过调节(例如下调)细胞中PRL-1和PRL-3的表达、量或活性而操作癌细胞。所述方法可涉及破坏或消除癌细胞。所述癌细胞可包括表达PRL-1和/或PRL-3的癌细胞。所述癌细胞可以是与非癌细胞相比过表达PRL-1和/或PRL-3的细胞。本发明人的方法可包括将一名患者暴露于抗-PRL抗体，例如抗-PRL-1抗体和/或抗-PRL-3抗体。所述抗-PRL-1抗体可包括人源化的抗-PRL-1抗体；同样所述抗-PRL-3抗体可包括人源化的抗-PRL-3抗体。
所述癌细胞可来自PRL-1和/或PRL-3阳性癌症患者。因此，本发明人的方法可包括从PRL-3/-1阳性癌症患者消除过表达PRL-1和/或PRL-3的癌细胞。
因此，本发明人的方法可包括，使用人源化的RL-3/-1抗体从PRL-3/-1阳性癌症患者消除过表达PRL-1和/或PRL-3的细胞。
在所述操作步骤之前或之后可进行一个步骤，即在细胞中检测受调节的PRL-1和PRL-3表达、量或活性。所述检测步骤可检测上调的或下调的PRL-1和PRL-3表达、量或活性。如本文别处详述的，可使用任何调节或下调PRL-1和PRL-3的方法。
具体地，所述方法可包括将所述细胞暴露于能够特异性地结合至PRL-1或PRL-3的抗-PRL-1抗体或抗-PRL-3抗体。抗-PRL抗体及给予它们的方法详细记载于本文的别处。
根据本发明人的方法，由于所述操作，所述癌细胞变成非癌性的，或者所述侵入或转移癌细胞变成非侵入的或非转移的。所述癌症可具体地包括选自以下的诸如侵入癌或转移癌等的癌症：结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、子宫颈癌、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑色素瘤。
由于PRL-1和PRL-3与癌症的侵袭性和侵入性相关，因此可以在患有癌症的个体的细胞中、在癌细胞或非癌细胞中检测PRL-1和PRL-3的水平，并评估所述癌症的侵袭性。与正常细胞相比高水平的PRL-1和PRL-3的量、表达或活性指示侵袭性癌或侵入性癌，因此需要并可选用更强或更激烈的疗法。类似地，低水平可指示一种更低侵袭性或侵入性的疗法。
本文描述的所述方法可用于任何PRL-1和PRL-3相关疾病的一般性治疗。PRL-1和PRL-3相关疾病包括增殖性疾病，特别包括癌症。例如，PRL-1和PRL-3相关疾病可包括转移性癌、侵入性癌或侵袭性癌。
本文描述的方法和组合物适宜于使得实施治疗的个体中的一个可测量的判据与没有接受所述治疗的个体相比得到提高。
为此，可指定多种判据，这些判据可反映患者的癌症的进展或健康。有用的判据可包括肿瘤大小、肿瘤尺寸、肿瘤的最大尺寸、肿瘤数目、肿瘤标记物的存在(例如甲胎蛋白)、转移的程度或数目等。
因此，作为一个实例，所治疗的个体可显示肿瘤大小或数目的减小或减少，这可通过合适的测定或试验测得。例如，所治疗的个体与没有被治疗的个体相比，可显示在以下方面减小或减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高：具体肿瘤的肿瘤大小和/或肿瘤数目。
例如，如果与疾病相关的病症相对于对照被显著抑制(即50％或更高)，那么PRL-1和PRL-3相关疾病可被定义为“得到治疗”。所述抑制可以是相对于对照至少75％，例如相对于对照90％、95％或100％。所述病症可包括细胞增殖，或者可包括细胞周期时间、细胞数目、细胞迁移、细胞侵袭力、肿瘤形成、肿瘤转移、肿瘤扩散等。本发明人使用术语“治疗”是指，还包括预防或缓解癌症。
术语增殖障碍以广义应用于本文中，包括任何需要控制细胞周期的障碍。具体而言，增殖障碍包括恶性障碍和肿瘤前期障碍。本文描述的方法和组合物涉及治疗或诊断诸如以下的腺癌时特别有用：小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、前列腺癌(prostrate cancer)、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，可治愈的恶性肿瘤包括急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌(bronchogenic carcinoma)、绒毛膜癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、精原细胞瘤、胚胎癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
涉及使用抗-PRL抗体进行治疗的抗体方法可与用于治疗这样的障碍的其他方法结合，所述其他方法包括表达抗本文所述PRL-1和PRL-3多核苷酸的反义构建体，并将它们给予肿瘤细胞以抑制基因功能并阻止肿瘤细胞的生长或发展。
反义构建体可用于抑制基因功能，以阻止增殖细胞的生长或发展。与有义核酸或mRNA互补的反义构建体——即核酸例如RNA构建体——详细记载于美国专利6,100,090(Monia et al.)和Neckers et al.,1992,Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231中，这些文本的教导通过引用的方式具体地纳入本文。
在一个具体的实例中，可通过完全或部分地降低PRL-1和PRL-3的量、表达或活性(例如通过能够结合并破坏PRL-1和PRL-3mRNA的siRNA)治疗或预防癌症。
RNA干扰(RNAi)是一种由直接引入双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且作为在多种生物体中敲除特定基因的表达的有用工具出现。RNAi记载于Fireet al.,Nature 391:806-811(1998)。其他PTGS方法是已知的，包括例如导入转基因或病毒。一般而言，在PTGS中，沉默的基因的转录物被合成但不积聚，这是因为它被快速地降解。PTGS方法包括RNAi记载于例如Ambion.com万维网网站的目录“/hottopics/”中的在“rnai”文件中。
合适的RNAi方法在本文中有描述。一种这样的方法涉及导入siRNA(小干扰RNA)。现在的模型表明，这些21-23个核苷酸的dsRNA可诱导PTGS。用于设计有效siRNA的方法记载于例如上述的Ambion网站。RNA前体例如短发夹RNA(shRNA)也可以由全部或部分的所述PRL-1和PRL-3核酸序列编码。
或者，双链(ds)RNA是一种在多种生物中干扰基因表达的有力方式，最近已表明其可应用于哺乳动物(Wianny and Zernicka-Goetz,2000,Nat Cell Biol 2:70-75)。可将与PRL-1和PRL-3多肽的序列对应的双链RNA导入至候选生物的卵母细胞和细胞或者在这样的细胞中表达，以干扰PRL-1和PRL-3的活性。
调节PRL-1和PRL-3基因表达的其他方法是本领域技术人员已知的，包括显性负突变方法。同时，这些方法可与使用抗-PRL抗体的抗体疗法结合。因此，另一种方法是使用这样的本文中PRL-1和PRL-3多肽的无功能变体，即该变体与内源性基因产物竞争，导致功能抑制。
PRL-1和PRL-3基因表达还可以通过以下方式调节：引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子。这样的肽或小分子可与抗-PRL抗体结合给予，用于治疗癌症例如转移癌。
因此，可将通过测定被鉴定为结合至PRL-1和PRL-3多肽或调节例如下调PRL-1和PRL-3多肽的量、活性或表达的化合物给予肿瘤细胞或增殖细胞，以阻止PRL-1和PRL-3多肽的功能。这种化合物可以这样的量与一种可药用的载体同时给药，即该量可有效下调PRL-1和PRL-3的表达或活性，或者通过激活或下调控制PRL-1和PRL-3的表达、活性或量的第二信号，从而缓解所述异常病症。
或者，基因疗法还可被应用于控制受试者中相关细胞例如癌细胞的PRL-1和PRL-3的内源性产生。例如，可设计一种编码PRL-1和PRL-3siRNA或其一部分的多核苷酸，用于在复制缺陷性反转录病毒载体中表达，如下文详述。然后可将所述反转录病毒表达构建体分离，并导入至一种转导有包含编码抗-PRL-1和PRL-3siRNA的RNA的反转录病毒质粒载体的包装细胞中，使得所述包装细胞在此时可产生包含所需序列的感染性病毒颗粒。可将这些生产细胞给予一名受试者，用于在体内设计细胞，并在体内调节PRL-1和PRL-3多肽的表达。基因疗法的综述见Human Molecular Genetics,T Strachan and A P Read,BIOSScientific Publishers Ltd(1996)中第20章Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches(及其中引用的参考文献)。
在一些实施方案中，PRL-1和PRL-3的水平在癌细胞中是降低的。而且，在这样的实施方案中，治疗可靶向或者专门针对这样的癌细胞。PRL-1和PRL-3的表达可仅特异性地在疾病细胞(即那些癌性细胞)中降低，而在其他非疾病细胞中不显著。在这些方法中，PRL-1和PRL-3的表达在其他细胞(即不是癌细胞的细胞)中不显著降低。因此，在这样的实施方案中，PRL-1和PRL-3的水平在处理过程中或之后与非癌细胞中的保持相同或相似。
多肽序列
应理解本文公开的多肽序列不限于本文中列出的具体序列，而且视情况还包括从任何来源得到的同源序列，例如相关细胞的同系物、来自其他物种的同系物以及它们的变体或衍生物，条件是它们具有抗-PRL抗体的至少一种所述生物活性。
本公开内容因此涵盖了本文列出的氨基酸序列的变体、同系物或衍生物，以及由本文公开的核苷酸序列编码的氨基酸序列的变体、同系物或衍生物。这样的序列统称为“抗-PRL抗体”序列。
生物活性
在一些实施方案中，视情况所述序列具有抗-PRL抗体的至少一种生物活性。
所述生物活性可包括免疫学活性。所述抗-PRL抗体可具有与抗体269、223或318或者它们的人源化形式相同或相似的免疫学活性。本发明人以“免疫学活性”指抗-PRL抗体的这样的能力，即在合适的动物或细胞中与PRL-1或PRL-3抗原结合时诱导特异性免疫反应。
所述生物活性可包括抗原结合活性。所述抗-PRL抗体可结合至PRL-1或它的表位。所述抗-PRL抗体可结合至抗体269结合的相同表位。所述抗-PRL抗体可结合至PRL-3或它的表位。所述抗-PRL抗体可结合至抗体223结合的相同表位或抗体318结合的相同表位。
所述抗-PRL抗体可以相同、降低或升高的亲和力或亲合力结合至所述抗原或表位。例如，所述抗-PRL抗体视情况可以与同族抗体(cognate antibody)(例如269、223或318或者它们人源化的对应物)相比以至少10％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的亲和力或亲合力结合至所述抗原或表位。
所述活性可包括抑制癌症活性，这例如通过肿瘤大小或肿瘤数目的减少测量；或者包括抑制转移活性，例如通过实施例中描述的测定测量。所述减少或抑制可通过以下途径方便地测定：在一个测验动物中引起肿瘤发生，将所述抗-PRL抗体给予所述动物并与没有被治疗的相似对照动物比较确定所述抗-PRL抗体的效应。实施例详细描述了这种测定。
所述抗-PRL抗体所具有的肿瘤抑制活性或转移抑制活性与所述同族抗体的相同，或者较之更低或更高。例如，所述抗-PRL抗体的效果视情况可以为所述同族抗体(例如269、223或318或者它们人源化的对应物)的至少10％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。本发明人以此表示，如果所述同族抗体能够将肿瘤数目减少90％(见实施例)(与未治疗的动物相比)，那么所述抗-PRL抗体能够将肿瘤数目减少90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％等。
还可以使用检测抗体事件的其他测定来替代本文所述测定，或者除此之外，还可使用检测抗体事件的其他测定。
同系物
所公开的抗-PRL抗体多肽包括从任何来源得到的同源序列，所述任何来源例如相关的病毒蛋白/细菌蛋白、细胞同系物和合成多肽，以及它们的变体或衍生物。因此，多肽还包括那些编码来自其他物种的抗-PRL抗体的同系物的多肽，所述其他物种包括诸如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或兔)等的动物，特别是人。
在本文的上下文中，同源序列或同系物被认为包括这样的氨基酸序列，即该氨基酸序列与相关多肽序列例如本文中列出的序列在至少30，例如50、70、90或100个氨基酸的氨基酸水平上是至少60、70、80或90％相同的，例如是至少95或98％相同的。在本文的上下文中，同源序列被认为包括这样的氨基酸序列，即该氨基酸序列与相关多肽的序列在例如至少15、25、35、50或100，例如200、300、400或500个氨基酸的氨基酸水平上是至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90％相同的，例如是至少95或98％相同的。虽然还可以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本文的上下文中，同源性可以序列同一性表示。例如，序列同一性可针对相关序列的全长即针对相关基因的整个长度的或全长的序列确定。
同源性比较可通过肉眼进行，或者更通常借助容易获得的序列比较程序。这些市售的计算机程序可计算两个或多个序列之间的同源性百分比。
可以对连续序列计算同源性百分比，即将一个序列与另一个序列进行比对，并将一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列的对应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称作“无缺口”比对。一般，这种无缺口比对只针对相对短数目的残基(例如少于50个连续氨基酸)进行。
虽然这是非常简单且可靠的方法，但它没有考虑到以下问题，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将使后面的氨基酸残基被比对出局，从而有可能在整体比对时造成同源性百分比大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生这样的最佳比对，即所述比对考虑到可能的插入和缺失，而不过度处罚整体同源性得分。这一点可通过在序列对比中插入“缺口”使得局部同源性最大化实现。
然而，这些更复杂的方法给存在于比对中的每个缺口分配“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对——反映两个比较序列之间有更高相关性——较具有许多缺口的比对，将获得更高的分数。通常使用“仿射缺口分值(affine gap cost)”，它对缺口的存在处以相对高的分值，并对该缺口中的每个后续残基处以较低的罚分。这是最常用的缺口评分体系。较高的缺口罚分理所当然将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，在利用这种软件进行序列比较时，可以使用缺省值。例如，在利用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是一个缺口-12分及每个延伸-4分。
对最大同源性百分比的计算因此首先需要在考虑缺口罚分的情况下产生最佳比对。适于实施这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。能实施序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel et al.,1999ibid-Chapter 18)、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS的比较工具套件。BLAST和FASTA都能进行脱机和在线搜索(见Ausubel et al.,1999ibid,第7-58至7-60页)。可使用GCG Bestfit程序。
虽然最终的同源性百分比可就同一性进行测量，但比对过程本身通常并不是以全或无配对比较为基础的。实际上，通常使用分级相似性得分矩阵(scaled similarityscore matrix)，它基于化学相似性或进化距离给每个成对比较分配得分。这种矩阵的一种常用实例是BLOSUM62矩阵——BLAST程序组的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用的缺省值或定制符号比较表(如果有提供)(进一步详情见用户手册)。对于GCG程序包，可使用公用缺省值；而在其他软件的情况下，可使用缺省矩阵，例如BLOSUM62。
一旦该软件产生了最佳比对，就使得计算同源性百分比例如序列同一性百分比成为可能。该软件通常将此作为序列比较的一部分，并产生数字化的结果。
变体和衍生物
术语“变体”或“衍生物”在述及本文所述的氨基酸序列时包括一个(或多个)氨基酸对所述序列的任何置换、变异、修饰、替代，一个(或多个)氨基酸从所述序列的任何缺失或者向所述序列的任何添加。所产生的氨基酸序列可基本保持与未改变序列相同的活性，例如至少具有与显示于本文例如序列表中的抗-PRL抗体多肽相同的活性。因此，可保持所述序列的关键特征——即如别处所述的，结合于PRL多肽的能力或减少肿瘤的活性。
具有显示于实施例中的氨基酸序列的多肽或其片段或同系物可被修饰，用于本文所述的方法和组合物中。一般地，进行修饰而保持所述序列的生物学活性。可进行例如从1、2或3至10、20或30个取代的氨基酸取代，条件是所述修饰的序列保持未改变序列的生物学活性。氨基酸取代可包括非天然类似物的使用，例如是为了提高治疗性给予的多肽的血浆半衰期。
抗-PRL抗体的天然变体可能包含保守的氨基酸置换。保守置换可根据例如下表定义。在第二列同一格中的氨基酸例如在第三列同一行中的氨基酸可以互相置换：
片段
本文公开并用作标记物的多肽还包括上述全长多肽或其变体的片段，包括序列表中所列序列的片段。
多肽还包括任何抗-PRL抗体多肽全长序列的片段。片段可包含至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域中熟知的。片段一般包含至少6个氨基酸，例如至少10、20、30、50或100，或者更多个氨基酸。
所述抗-PRL抗体蛋白及其等位基因变体和物种变体的多肽片段可包含一个或多个(例如5、10、15或20)置换、缺失或插入，包括保守置换。如果发生置换、缺失和/或插入，那么例如在不同物种中，改变了序列表中显示的例如至少50％、40％或20％的氨基酸残基。
可通过重组的方式制备抗-PRL抗体及它们的片段、同系物、变体和衍生物。然而，还可以通过使用本领域技术人员熟知技术的合成方式例如固相合成制备它们。所述蛋白还可被产生为融合蛋白，例如是为了帮助提取和纯化。融合蛋白配对物的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6×His、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。还可方便地在所述融合蛋白配对物和所需蛋白序列之间包括一个蛋白水解切割位点，以使得融合蛋白序列可被去除。所述融合蛋白可以是这样的，即它不阻碍所需序列蛋白的功能。蛋白还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物得到。
本文公开的抗-PRL抗体多肽、变体、同系物、片段和衍生物可以是基本分离的形式。需理解的是，这样的多肽可与不干扰所述蛋白的预定目的的载体或稀释剂混合，并且这样的多肽仍被认为是基本分离的。抗-PRL抗体变体、同系物、片段或衍生物还可以是基本纯化的形式，在这种情况下一般将在一个制剂中包含所述蛋白，其中所述制剂中的所述蛋白超过90％例如95％、98％或99％。
本公开的抗-PRL抗体多肽、变体、同系物、片段和衍生物可以一种显示标记物标记。所述显示标记物可以是可检测所述多肽等的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素例如125I、酶、抗体、多核苷酸和连接子例如生物素。标记的多肽可用于诊断方法例如免疫测定中，以确定样品中多肽的量。还可使用标准方案将多肽或标记多肽用于血清或细胞介导的免疫测定中，用于检测与动物和人中的所述多肽的免疫反应性。
本文公开的抗-PRL抗体多肽、变体、同系物、片段和衍生物(任选被标记的)还可被固定于一种固相物，例如免疫测定孔或量杆(dipstick)的表面。可将这样的标记的和/或固定的多肽与合适的试剂、对照物、说明书等包装于合适容器中的试剂盒中。这样的多肽和试剂盒可用于通过免疫测定检测针对所述多肽或它们的等位基因变体或物种变体的抗体的方法中。
免疫测定方法是本领域中熟知的，并通常包括：(a)提供一种包含可被所述蛋白的抗体结合的表位的多肽；(b)将一个生物样品与所述多肽在可形成抗体-抗原复合物的条件下与所述多肽孵育；及(c)确定包含所述多肽的抗体-抗原复合物是否形成。
本文公开的抗-PRL抗体多肽、变体、同系物、片段和衍生物可用于体外或体内细胞培养体系中，以研究它们对应的基因及其同系物在细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可将截短的或修饰的多肽导入细胞，以破坏细胞中正常出现的功能。可通过由重组表达载体原位表达所述多肽将所述多肽导入所述细胞(见下文)。所述表达载体任选可携带一个可诱导的启动子，以控制所述多肽的表达。
预计使用合适的宿主细胞例如昆虫细胞或哺乳动物细胞可提供这样的翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化(lapidation)及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，因为这可能是赋予重组表达产物最佳的生物活性所需的。其中表达本文公开的抗-PRL抗体多肽、变体、同系物、片段和衍生物的这样的细胞培养体系可用于测定体系中，以鉴定干扰或增强所述细胞中的所述多肽的功能的候选物质。
多核苷酸序列
可变区、单克隆抗体序列和人源化抗体序列可包括多核苷酸。这些可包括DNA或RNA。
它们可以是单链的或双链的。它们还可以是其中包含合成核苷酸或修饰核苷酸的多核苷酸。多种不同类型的寡核苷酸修饰在本领域中是已知的。这些可包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架，在该分子的3’端和/或5’端添加吖啶或聚赖氨酸链。基于本文的目的，需要理解可通过本领域中已有的任何方法修饰本文描述的多核苷酸。进行这样的修饰的目的是增强多核苷酸的体内活性或生命周期。
如果所述多核苷酸是双链的，那么所述双链体的两条链、任一条链或其结合物可被本文公开的方法和组合物涵盖。如果所述多核苷酸是单链的，需要理解还包括该多核苷酸的互补序列。
变体、衍生物和同系物
本文使用的术语“变体”、“同系物”或“衍生物”在述及本文描述的核苷酸序列时，包括一个(或多个)核苷酸对所述序列的任何置换、变异、修饰、替代，一个(或多个)核苷酸从所述序列的任何缺失或者像所述序列的任何添加。所产生的序列能够编码本文别处描述的具有PRL结合活性的多肽。
如上文指出的，就序列同一性而言，“同系物”与一条相关序列具有例如至少5％的同一性、至少10％的同一性、至少15％的同一性、至少20％的同一性、至少25％的同一性、至少30％的同一性、至少35％的同一性、至少40％的同一性、至少45％的同一性、至少50％的同一性、至少55％的同一性、至少60％的同一性、至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。
可有至少95％的同一性，例如至少96％的同一性，例如至少97％的同一性，例如至少98％的同一性，例如至少99％的同一性。可如上述进行核苷酸同源性比较。诸如上文所述的GCG Wisconsin Bestfit程序的序列比较程序可基于这一目的使用。在缺省得分矩阵中，每个相同核苷酸的匹配分值为10，每个错配的分值为-9。对于每个核苷酸而言，缺省缺口形成罚分为-50，缺省缺口延伸罚分为-3。
杂交
本发明人还描述了这样的核苷酸序列，即所述核苷酸序列能够选择性杂交本文给出的任一序列例如269、223和318可变区、抗体和人源化抗体或者它们的任何变体、片段或衍生物，或者能够选择性杂交上述任一序列的互补序列。核苷酸序列的长度可为至少15个核苷酸，例如长度为至少20、30、40或50个核苷酸。
本文使用的术语“杂交”不仅包括如聚合酶链式反应技术中进行的扩增过程外，还包括“核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程”。
能够与本文给出的核苷酸序列或者与它们的互补序列选择性杂交的多核苷酸通常与本文给出的相应核苷酸序列在至少20，例如至少25或30，如至少40、60或100或者更多个连续核苷酸的区域上是至少70％，例如至少80％或90％且例如至少95％或98％同源的。
术语“可选择性杂交的”是指用作探针的多核苷酸在靶多核苷酸以显著高于背景的水平与所述探针杂交的条件下使用。背景杂交的出现是由于存在于例如被筛选的cDNA或基因组DNA文库中的其他多核苷酸。在该事件中，背景是指由所述探针和所述文库的非特异性DNA成员之间的互相作用产生的信号水平，该水平与用靶DNA出现的特异性相互作用的强度相比小10倍，例如小100倍。例如，可通过用32P放射性标记探针测量相互作用的强度。
杂交条件是基于核酸结合复合物的熔解温度(Tm)，如Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,AcademicPress,San Diego CA)中所教导，并且赋予如下文说明的一个确定“严格度”。
最大严格度一般出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格度在Tm下约5℃-10℃；中等严格度在Tm下约10℃-20℃；并且低严格度在Tm下约20℃-25℃。如本领域技术人员应理解的，最大严格度杂交可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而中等(或低)严格度杂交可用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
本发明人公开了一种在严格条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0})下可杂交核酸或者它的片段、同系物、变体或衍生物的核苷酸序列。
如果多核苷酸是双链的，那么所述双链体的两条链、任一条链或其结合物被本公开涵盖。如果所述多核苷酸是单链的，需要理解该多核苷酸的互补序列也被公开和涵盖。
可以多种方式得到与本文公开的序列非100％同源但落入本公开范围内的多核苷酸。本文描述的序列的其他变体可通过例如探测从一组个体例如来自不同人群的个体制备的DNA文库得到。另外，可得到其他的病毒/细菌或细胞同系物特别是出现于哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中的细胞同系物，并且这样的同系物及其片段通常能够选择性地与本发明序列表中所示的序列杂交。这样的序列的得到可通过探测从其他动物物种制备的cDNA文库或来自其他动物的基因组DNA文库，或者在中至高严格度下以包含所公开序列的全部或一部分的探针探测这样的文库。
本文描述的多核苷酸可用于产生一种引物，例如PCR引物、另一扩增反应的引物、通过例如使用放射性或非放射性标记物的常规方式以显示标记物标记的探针，或者可将所述多核苷酸克隆至载体中。这样的引物、探针和其他片段的长度为至少15，例如至少20，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也被本文中使用的术语多核苷酸所涵盖。片段的长度可少于500、200、100、50或20个核苷酸。
多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可重组地、合成地或者通过本领域技术人员可用的任何方法产生。还可通过标准的技术克隆它们。
引物通常通过合成的方式产生，涉及每次一个核苷酸逐步制造所需的核酸序列。使用自动化技术实现这一点的技术在本领域中是容易获得的。
一般使用重组方法例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术产生较长的多核苷酸。这涉及，制备针对需要克隆的序列侧翼区的一对引物(例如约15-30个核苷酸)；将所述引物与从动物细胞或人细胞得到的mRNA或cDNA接触；在扩增目标区域的条件下进行聚合酶链式反应；分离扩增片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化所述反应混合物)；以及回收所扩增的DNA。可将引物设计成包含合适的限制酶识别位点，使得可将所扩增的DNA克隆至合适的克隆载体中。
PRL多肽和核酸
如前文段落列出的，可类似地定义PRL-1和PRL-3多肽的同系物、变体、衍生物和片段。
如果上下文允许，那么提及PRL-1多肽将认为包括提及PRL-1多肽的同系物、变体、衍生物或片段。类似地，提及PRL-3多肽将认为包括提及PRL-3多肽的同系物、变体、衍生物或片段。
类似地，如果上下文允许，那么提及PRL-1核酸将认为包括提及PRL-1核酸的同系物、变体、衍生物或片段。类似地，提及PRL-3核酸将认为包括提及PRL-3核酸的同系物、变体、衍生物或片段。
抗-PRL抗体的产生
可通过本领域普通技术人员熟知的重组DNA方法或合成肽化学方法产生所述抗-PRL抗体。
作为示例，可通过本领域中熟知的技术合成所述抗-PRL抗体，作为示例的有"Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach"E.Atherton andR.C.Sheppard,IRL Press,Oxford England。类似地，可合成多个片段，然后将它们连接以形成较大的片段。还可以在特定位点对这些合成的肽片段进行氨基酸置换，以在体外和体内测试活性。
可在标准的微量化学设备中合成所述抗-PRL抗体，并以HPLC和质谱检验纯度。肽合成的方法、HPLC纯化和质谱是本领域技术人员公知的。
所述抗-PRL抗体还可以在体外和体内条件下在这样的转化宿主细胞中表达，即在该细胞中纳入有本文描述的DNA序列(例如可变区序列(variable sequence))或其等位基因变体，并且该细胞可用于癌症相关疾病的预防和/或治疗。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。术语“表达载体”是指一种能够在体内或体外表达的构建体。术语“转化载体”是指一种能够从一个物种转移至另一个物种的构建体。
可用于表达的载体包括重组病毒载体，尤其是重组反转录病毒载体(RRV)例如慢病毒载体、腺病毒载体，包括反转录病毒载体的组合。
术语“重组反转录病毒载体”(RRV)所指的载体具有足够的反转录病毒遗传信息，以在存在包装组件的情况下使RNA基因组包装成能够感染靶细胞的病毒颗粒。对所述靶细胞的感染包括反转录及整合进入所述靶细胞基因组中。RRV可携带待通过该载体送递至所述靶细胞中的非病毒的编码序列。RRV在终靶细胞中不能独立复制而产生感染性反转录病毒颗粒。RRV通常缺少功能性gag pol和/或env基因和/或其他复制必需基因。可使用的载体包括重组痘病毒载体例如禽痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒、疫苗病毒例如NYVAC、金丝雀痘病毒、MVA或其他非复制病毒载体体系，例如WO9530018中所述的那些。
可设计痘病毒用于重组基因表达及在双免疫治疗方法中用作重组活疫苗。使用减毒活病毒例如作为送递运载体和/或以载体为基础的候选疫苗的病毒的基本原理来自它们诱导细胞介导的免疫反应的能力。如上文列出的，所述病毒载体能够被应用为送递运载体和以载体为基础的候选疫苗，这是因为它们的组成性蛋白的免疫原性，所述组成性蛋白可作为佐剂来增强免疫反应，从而使得所需的核苷酸序列(NOI)例如编码抗-PRL抗体的核苷酸序列有更大免疫原性。
痘病毒疫苗接种策略已使用重组技术以将NOI引入痘病毒基因组中。如果NOI整合至病毒DNA中非病毒生命周期必需的位点，那么新产生的重组痘病毒有可能是感染性的，也就是说感染外来细胞，从而表达所整合的NOI。以该方式制备的重组痘病毒可用作活疫苗，用于预防和/或治疗病理性和感染性疾病和/或癌症。
痘病毒载体送递体系的其他要求包括好的免疫原性和安全性。MVA是一种具有良好的安全记录的复制受损疫苗株。在大多数细胞类型和正常的人组织中，MVA不复制。有限的MVA复制出现在少量转化细胞类型例如BHK21细胞中。Carroll等人(1997Vaccine 15:387-394)已表明，重组MVA在产生保护性CD8+T细胞反应方面与传统的重组疫苗载体同样好，并且可有效地替代更常使用的可复制性疫苗病毒。源自MVA的疫苗病毒株或者具有使MVA特别适宜用于疫苗中的MVA性质的独立开发的毒株同样适宜用作送递运载体。
所需核苷酸序列和需要其表达的核苷酸序列可被可操作地连接至转录单元。本文所述的术语“转录单元”是这样的核酸区域，即其包含编码序列及用于实现这些编码序列独立于任何其他编码序列表达的信号。因此，每个转录单元通常至少包含一个启动子、一个任选的增强子和一个多腺苷酸化信号。以本领域的正常含义使用术语“启动子”，例如RNA聚合酶结合位点。启动子可包含增强子元件。术语“增强子”包括这样的DNA序列，即该DNA序列可结合于转录起始复合体的其他蛋白组件，并因此有利于它关联的启动子所指向转录的起始。术语“细胞”包括任何适合的生物。所述细胞可包括哺乳动物细胞，例如人细胞。
术语“转化细胞”是指一种具有修饰的基因结构的细胞。例如，如本文中所述的，在将一种载体例如表达载体导入至一个细胞中时，该细胞具有修饰的基因结构。术语“生物”包括任何适合的生物。所述生物包括哺乳动物，例如人。
本文的术语“转基因生物”是指一种包含修饰的基因结构的生物。例如，在将一种载体例如表达载体导入至一个生物中时，该生物具有修饰的遗传结构。
抗体表达
本发明人还描述了一种方法，包括以本文描述的一条或多条(a or the)核苷酸序列转化一种宿主细胞，所述核苷酸序列例如269、223或318可变区；抗体序列；或者人源化的抗体序列。
本发明人还提供了一种方法，包括在适合由一条或多条这样的核苷酸序列编码的抗-PRL抗体表达的条件下培养一种转化的宿主细胞——该细胞转化有所述核苷酸序列。
本发明人还提供了一种方法，包括在适合由一条或多条这样的核苷酸序列编码的抗-PRL抗体表达的条件下培养一种转化的宿主细胞——该细胞转化有所述核苷酸序列；然后从所述转化的宿主细胞培养物回收所述抗-PRL抗体。
因此，编码抗-PRL抗体、融合蛋白或其功能性等价物的核苷酸序列可用于产生指导其在合适的宿主细胞中表达的重组DNA分子。
作为示例，可在重组的大肠杆菌、酵母或哺乳动物表达体系中产生抗-PRL抗体，并以柱色谱法纯化。
在某些情况下，使用抗体片段比使用整个抗体有优势。大小较小的片段使得可快速清除，并且可导致肿瘤与非肿瘤比率的改善。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌分泌，因此使得可产生大量这样的片段。
编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列可被可操作地连接至一条能够在适合的宿主细胞中指导编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列表达的启动子序列。在插入至所述宿主细胞时，可在适合的条件下培养所述转化的宿主细胞，直到所述抗-PRL抗体达到足够的水平，然后可将所述细胞裂解并分离所述抗-PRL抗体。
可在适宜由所述细胞培养物表达所述抗-PRL抗体并从此细胞培养物回收所述抗-PRL抗体的的条件下培养以编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列转化的宿主细胞。依赖于所使用的序列和/或载体，由重组细胞产生的蛋白可以被分泌或者可以被包含在细胞内。如本领域技术人员可理解的，包含的表达载体
编码抗-PRL抗体的核苷酸序列可被设计来具有信号序列，所述信号序列指导编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列分泌通过具体的原核生物或真核生物细胞膜。其他重组构建法可将编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列连接至编码有助于可溶性蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列(Kroll DJ et al(1993)DNA Cell Biol 12:441-453，亦见下文对包含融合蛋白的载体的讨论)。
所述抗-PRL抗体还可表达为一种添加一个或多个另外的多肽域以促进蛋白纯化的重组蛋白。这样的纯化促进域包括但不限于金属螯合肽，例如使得可在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3:263-281)、使得可在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A域和在FLAGS延伸/亲和纯化体系中使用的域(Immunex Corp,Seattle,WA)。在纯化域和所述抗-PRL抗体之间包含可切割连接子序列例如因子XA或肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)可用于促进纯化。
可设计本文描述的核苷酸序列，以基于多种原因改变一条或者多条编码抗-PRL抗体的序列，包括但不限于这样的改变，即修饰所述基因产物的克隆、加工和/或表达。例如，可以使用本领域中熟知的技术例如定点诱变引入突变，以插入新限制性位点、以改变糖基化模式或者以改变密码子偏好。
在另一个实施方案中，可将一条或者多条编码天然的、修饰的或重组的抗-PRL抗体的核苷酸序列连接至一条异源序列，以编码一种融合蛋白。作为示例，可产生这样的融合蛋白，即该融合蛋白包含所述抗-PRL抗体或其酶活性片段或衍生物，其连接有一种亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、生物素、His6、ac-myc标签(见Emrich et al 1993BiocemBiophys Res Commun 197(1):21220)、血凝素(HA)(如Wilson et al 1984Cell 37 767中所述)或FLAG表位(Ford et al 1991Protein Expr Purif Apr；2(2):95-107)。
所述融合的重组蛋白可包含抗原性辅蛋白，例如GST、β-半乳糖苷酶或脂蛋白D(来自流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)，是相对较大的辅蛋白)，它们可增溶(solubilise)并有利于融合蛋白的产生和纯化。或者，所述融合蛋白可包含载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。在某些实施方案中，所述标记物序列可包含一个6组氨酸肽，这提供在pQE载体(Qiagen Inc)中并记载于Gentz et al(1989PNAS 86:821-824)。这样的融合蛋白易于在酵母培养物中表达(如Mitchell et al 1993Yeast 5:715-723中所述的)，并可容易地通过亲和色谱法纯化。还可将融合蛋白设计成包含位于编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列和所述异源蛋白序列之间的切割位点，使得所述抗-PRL抗体可从异源部分切割及纯化。在另一个实施方案中，可使用结合的整个融合蛋白进行靶蛋白的测定。或者，从提供对免疫系统的一般性刺激的意义上说，所述辅蛋白可作为一种佐剂。所述辅蛋白可连接至第一蛋白的氨基端或羧基端。
虽然标记基因表达的存在/不存在均可表明抗-PRL抗体的核苷酸序列也存在，但是应确认它的存在和表达。例如，如果将编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列插入至标记基因序列中，那么可通过不存在所述标记基因的功能对包含所述抗-PRL抗体编码区的重组细胞进行鉴定。或者，可将标记基因与编码抗-PRL抗体的核苷酸序列串联放置，并受控于单个启动子。
标记基因针对诱导或选择的表达通常还指示所述抗-PRL抗体的表达。
定量具体分子表达的其他方法包括放射性标记核苷酸(Melby PC et al 1993 JImmunol Methods 159:235-44)或生物素标记核苷酸(Duplaa C et al 1993Anal Biochem229-36)、对照核酸的共扩增及实验结果可插入其上的标准曲线。
通过以ELISA形式进行测定可加速多个样品的定量，其中所需的抗-PRL抗体以多个稀释度呈现，并且光谱光度测量反应或热测量反应可快速地给出定量值。
可以进行或使用的抗-PRL抗体核苷酸序列改变包括不同核苷酸残基的缺失、插入或置换，结果生成了编码相同的或功能等价的抗-PRL抗体的核苷酸序列。作为示例，所表达的抗-PRL抗体可具有产生沉默变化并形成功能等价抗-PRL抗体的氨基酸残基缺失、插入或置换。基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性，可谨慎地进行氨基酸置换，条件是所述抗-PRL抗体的结合亲和性被保持。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；及具有类似亲水值且具有不带电荷极性头部的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
还可应用藉此可在体内调节本文所述编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列的基因治疗。例如，表达调节可通过给予这样的化合物实现，即这些化合物可结合于编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列或者与编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列相关的控制区或其相应的RNA转录物，以改变转录或翻译的速率。
作为示例，本文所述的编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列可处于表达调节元件(通常为启动子或者启动子和增强子)的表达控制之下。所述增强子和/或启动子可优先在缺氧、缺血或低葡萄糖环境下有活性，使得编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列优先在具体所需的组织中表达，例如在肿瘤细胞或肿瘤块的环境中表达。因此，可减少或消除编码所述抗-PRL抗体的核苷酸序列对被治疗个体的任何显著生物学效应或有害效应。赋予表达调节的增强子元件或其他元件可以多拷贝出现。
启动子和/或增强子可有组成性效果，或者它们的活性可以是限制于组织或时间的。限制于组织的合适启动子/增强子的实例有那些在肿瘤细胞中有高度活性的启动子/增强子，例如来自MUC1基因、CEA基因或STV抗原基因的启动子/增强子。限制于时间的启动子/增强子的实例有那些对缺血和/或缺氧反应的启动子/增强子，例如缺氧反应元件或agrp78和agrp94基因的启动子/增强子。甲胎蛋白(AFP)启动子也是一种肿瘤特异性启动子。另一个启动子-增强子组合为人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(major immediate early)(MIE)启动子/增强子组合。
启动子可以是组织特异的。也就是说，它们可以是能够在一种组织中驱动编码抗-PRL抗体的核苷酸序列转录，而在其他组织类型中基本保持“沉默”。
术语“组织特异的”所指启动子的活性并不是局限于单一组织类型，而是仍然显示以下选择性：该启动子可在一组组织中是有活性的，并且在另一组中是低活性的或沉默的。这样的启动子的一个所需特征是，它们在不存在激活的缺氧调节增强子元件的条件下，乃至在靶组织中也具有相对低的活性。实现这一点的方式是，使用在缺氧情况下抑制所选启动子活性的“沉默”元件。
术语“缺氧”是指这样的状态，即在该状态下一个具体的器官或组织接受到不足的氧气供给。
通过操作启动子区，可对受具体启动子控制且一条或多条编码抗-PRL抗体的核苷酸序列进行表达水平的调节。例如，启动子区中的不同域可具有不同的基因调节活性。这些不同区功能的评估一般使用这样的载体构建体，即这些构建体具有特定区域缺失的所述启动子的不同变体(即缺失分析)。例如，该方法可用于鉴定能够赋予组织特异性的最小区域或者赋予缺氧敏感性的最小区域。
可使用上述的许多组织特异性启动子。在大多数情况下，可将这些启动子分离为适合克隆至选择载体中的常规限制消化片段。或者，可使用聚合酶链式反应分离启动子片段。可通过在引物的5'端整合限制位点而促进所扩增片段的克隆。
结合治疗
本文所述的抗-PRL抗体可与用于疾病的治疗的其他组合物和步骤结合使用。
作为示例，所述抗-PRL抗体还可以与疾病例如癌症的常规治疗结合使用。例如，可以外科手术、放射或化学疗法与一种抗-PRL抗体结合治疗肿瘤，或者可在随后对患者给予一种抗-PRL抗体，以扩大微转移的休眠并稳定任何残余的原发肿瘤。
可将所述抗-PRL抗体与一种治疗有效的制剂同时送递至相同位置。或者，可将所述抗-PRL抗体与所述治疗有效的制剂在不同时刻送递至不同位置。甚至可将所述抗-PRL抗体和所述治疗有效的制剂在相同送递载体中送递，用于癌症的预防和/或治疗。
抗-PRL抗体可与细胞毒性剂结合使用，用于血管发生和/或癌症的预防和/或治疗。连接至抗-PRL抗体、抗-PRL抗体抗血清、抗-PRL抗体受体激动剂和拮抗剂的细胞毒性剂例如蓖麻毒蛋白可提供一种破坏表达PRL-1或PRL-3的细胞的工具。这些细胞可出现在许多部位，包括但不限于微转移和原发肿瘤。
抗-PRL抗体可在基因治疗中与前药激活酶结合使用。除了在靶组织中选择性表达之外或者替代在靶组织中选择性表达，所述抗-PRL抗体(还)可与其他分子结合使用，例如这样的一种或多种前药激活酶，即该一种或多种前药激活酶在所述个体被以所述一种或多种酶所作用的一种或多种前药治疗之前没有显著效应或无有害效应。在存在所述前药激活酶的情况下，以所述合适前药对个体的有效治疗可引起肿瘤生长或存活减少的增加。
可将前药激活酶送递至肿瘤部位，用于癌症的治疗。在每种情况下，将合适的前药与所述合适的前药激活酶结合用于治疗患者。将合适的前药与载体联合给予。前药的实例包括：磷酸依托泊甙(与碱性磷酸酶，Senter et al 1988Proc Natl Acad Sci 85:4842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶，Mullen et al 1994 Cancer Res 54:1503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧乙酰胺(与青霉素V酰胺酶，Kerr et al 1990 Cancer ImmunolImmunother 31:202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(与羧肽酶G2)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(与β-内酰胺酶)；SR4233(与P450还原酶)；更昔洛韦(Ganciclovir)(与HSV胸苷激酶，Borrelli et al 1988Proc Natl Acad Sci 85:7572-7576)；芥前药与硝基还原酶(Friedlos el al 1997J Med Chem 40:1270-1275)和环磷酰胺(与P450，Chen etal 1996 Cancer Res 56:1331-1340)。
前药激活酶的实例包括可激活5-氟-脲嘧啶前药希罗达(capcetabine)和氟铁龙(furtulon)的胸苷磷酸化酶；来自单纯疱疹病毒的可激活更昔洛韦的胸苷激酶；可激活一种前药例如环磷酰胺成DNA损伤剂的细胞色素P450；及可激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脱氨酶。可使用一种人来源的酶。
其他合适的分子包括那些应用于治疗和/或诊断的分子，例如但不限于以下物质的编码序列：细胞因子、趋化因子、激素、抗体、设计的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的反式显性负突变体、毒素、有条件的毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它们的衍生物(例如与一种相关的报告物组)。当被包括时，这样的编码序列一般可以被可操作地连接至例如一个或多个特定细胞类型中的合适的启动子(它可以是驱动核酶表达的启动子)，或者一个或多个不同启动子。
所述分子可以是一种从细胞分泌的蛋白。或者，所述分子不被分泌，而在细胞内有活性。在任何一种情况下，所述分子均可被证明为一种旁观者效应物或一种远程旁观者效应物；即在一个细胞中产生所述表达产物会导致具有共同表型的其他相关细胞被杀死，不管邻近的还是远距离的(例如转移的)。
在癌症的治疗或预防中使用的合适分子包括这样的蛋白(或编码蛋白的核酸)，即它们可破坏靶细胞(例如核糖体毒素)，作为肿瘤抑制剂(例如野生型p53)、抗肿瘤免疫机制的激活剂(例如细胞因子、共刺激分子和免疫球蛋白)、血管发生的抑制剂；或者它们可提供升高的药物敏感性(例如前药激活酶)，通过天然效应细胞间接地刺激靶细胞破坏(例如，刺激免疫系统的强抗原)或将前体物质转换成可破坏靶细胞的毒性物质(例如前药激活酶)。编码的蛋白还可以破坏旁观者肿瘤细胞(例如与分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒素融合蛋白)，间接地刺激旁观者肿瘤细胞的破坏(例如刺激免疫系统的细胞因子或引起局部血管阻塞的促凝血蛋白)或者将前体物质转换成可破坏旁观者肿瘤细胞的毒性物质(例如一种可将一种前药活化成分散性药物的酶)。
可将干扰肿瘤持久性细胞基因的表达的反义转录物或核酶(例如在伯基特淋巴瘤中抗异常myc的转录物，或者在慢性髓细胞样白血病中抗bcr-abl的转录物)送递，以增强抗-PRL抗体的癌细胞杀伤功能或转移阻止功能。还考虑到这样的分子的结合使用。
可缺氧调节的治疗分子的实例见PCT/GB95/00322(WO-A-9521927)。
抗-PRL抗体缀合物
以本文所述的抗-PRL抗体靶向表达PRL-1或PRL-3抗原的细胞可有利于开发调节表达PRL-1或PRL-3的细胞的活性的药物。
可合成不同的抗-PRL抗体用于多项应用中，所述应用包括但不限于将一种抗-PRL抗体与细胞毒性剂连接用于靶向杀伤可结合抗-PRL抗体的细胞。
可使用标准方法将本文所述的抗-PRL抗体与其他分子偶联。可以多种技术将所述抗-PRL抗体的氨基端和羧基端进行同位素标记和非同位素标记，例如使用常规技术的放射性标记(酪氨酸残基-氯胺T.iodogen.乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些偶联技术是本领域技术人员熟知的。偶联技术的选择是基于氨基酸上可用的功能基团，包括但不限于氨基、巯基(sulfhydral)、羧基、酰胺、酚和咪唑。用于实现这些偶联的多种制剂包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺、对苯醌等。
基于多项应用，可将所述抗-PRL抗体化学地偶联至同位素、酶、载体蛋白、细胞毒性剂、荧光分子及其他化合物。使用适合于特异性反应的不同技术可确定偶联反应的效力。例如，使用高度特异性活性的氯胺T和Na125I可完成以125I对PRL-1多肽或PRL-3多肽进行放射性标记。以偏硫代硫酸钠(sodium metabisulfite)终止该反应，并将该混合物在一次性柱上脱盐。从所述柱洗脱所述标记的抗体，并收集流分。从每个流分取等份样品，在伽玛计数仪(gamma counter)中测量放射性。通过这种方式，未反应的Na125I可与所述标记的PRL-1多肽或PRL-3多肽分离。储存具有最高特异性放射性的肽流分，用于后续的应用，例如分析与抗-PRL抗体结合的能力。
通过如下技术，使用以具有短生命期同位素标记的抗-PRL抗体使得可在体内定量地显示PRL-1或PRL-3结合部位：放射自显影技术、现代放射显影技术或其他膜结合技术例如正电子成像术，目的是以抗-PRL抗体结合部位定位肿瘤。该应用可提供重要的诊断和研究工具。
在其他实施方案中，可将所述抗-PRL抗体偶联至闪烁显像放射性标记物、细胞毒性化合物或放射性同位素、用于将非毒性前药转换成细胞毒性药物的酶、用于为将所形成的缀合物靶向至结肠肿瘤而活化免疫系统的化合物或者细胞刺激性化合物。这样的缀合物具有一个由抗-PRL抗体组成的“结合部分”和一个由放射性标记物、毒素或酶组成的“功能部分”。
另外可单独使用所述抗体，目的只是阻断所述PRL-1或PRL-3抗原的活性，尤其是通过物理地干涉它对另一种化合物的结合。
可将所述缀合物的结合部分和功能部分(如果也是肽或多肽)通过任何交联多肽的常规方式连接在一块，所述方式例如那些已在O'Sullivan et al(Anal.Biochem 1979:100,100-108)中大体描述的。例如，一个部分可富含硫醇基团，并且另一个部分与能够与这些硫醇基团反应的双功能剂反应，所述双功能剂例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)。以例如间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯得到的酰胺和硫醚键在体内一般比二硫键更稳定。
或者，如果所述结合部分包含糖(例如对于抗体或某些抗体片段情况将如此)，那么可使用EP 0088695中的连接技术经该糖部分将所述功能部分连接。
所述缀合物的功能部分可以是一种用于将非毒性前药转换成毒性药物的酶，例如Bagshawe及其同事的缀合物(Bagshawe(1987)Br.1.Cancer 56,531；Bagshawe et al(Br.1.Cancer 1988:58,700)；WO 88/07378)或氰化物释放体系(WO 91/11201)。
当将所述抗-PRL抗体缀合物用于诊断时，它的功能部分可包含一种用于闪烁显像研究的放射性原子或者可由这样的原子组成，例如锝99m(99mTc)或碘-123(123I)，或者一种用于核磁共振(nmr)成像(也被称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如碘-123、碘-313、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆锰或铁。
当被用于一种用于选择性破坏肿瘤的化合物中时，所述抗-PRL抗体可包含一种发出足够破坏邻近细胞的能量的高放射性原子例如碘-131、铼-186、铼-188、钇-90或铅-212，或者一种细胞毒化合物例如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、柔红霉素或其他插入剂。
放射性标记物或其他标记物可以已知的方式整合于所述抗-PRL抗体缀合物中。例如，所述肽可以被生物合成，或者可通过使用合适氨基酸前体例如包括氟-19替换氢的化学氨基酸合成法进行合成。标记物例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In可经肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可经赖氨酸残基连接。可用IODOGEN法(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)整合碘-123。"Monoclonal Antibodies inImmunoscinigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
可能不需要整个酶都存在于所述缀合物中，但理所当然必须存在催化部分。可使用所谓的“抗体酶(abzyme)”，其中抗-PRL抗体被制成一种参与人们希望催化的反应中的化合物，通常为反应中间体状态。然后，所形成的抗体可对所述反应发挥酶的功能。
可通过尺寸排阻色谱法或亲和色谱法纯化所述缀合物，并测试其双生物活性。可使用一种采用固定抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)并在一种活细胞放射免疫测定中测量所述抗原免疫反应性。可使用针对β-葡萄糖苷酶的酶测定，使用吸光度在葡萄糖水解时会变化的底物，例如oNPG(对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，其释放可在405nm以光谱光度计测量的2-硝基酚。
可以通过以下方式测试所述缀合物在体外的稳定性：先在37℃的血清中孵育，然后进行尺寸排阻FPLC分析。通过在注入所述缀合物后多个时间分析血清，可在小鼠中以相同方式测试在体内的稳定性。另外，可以在缀合之前以125I放射性标记所述抗-PRL抗体并以131I放射性标记所述酶，并且可以确定所述缀合物、游离抗-PRL抗体和游离酶在动物例如小鼠中的生物分布。
或者，可通过重组DNA技术将所述缀合物产生为一种融合化合物，藉此DNA段包含编码所述缀合物两部分的各自区域，这两个区域相互毗连或者被编码不破坏所述缀合物的所需性质的连接子肽的区域隔开。
可预见地，所述化合物的两个功能部分可全部地或部分地重叠。然后，将该DNA在合适的宿主中以已知的方式表达。
诊断试剂盒
本发明人还公开了用于在生物流体和组织中检测及测量PRL-1或PRL-3以及用于在组织中定位PRL-1或PRL-3的诊断方法和试剂盒。
还可将抗-PRL抗体用于诊断方法和试剂盒中，以检测及定量能够结合PRL-1或PRL-3的抗体。这些试剂盒使得可检测PRL-1或PRL-3，PRL-1或PRL-3在某些情况下可指示原位原发肿瘤的微转移的扩散。具有这样的循环抗-PRL-1抗体或抗-PRL-3抗体的患者更可能形成肿瘤和癌症，并且更可能在治疗后或在缓解期后复发癌症。
还考虑了用于测量PRL-1或PRL-3的试剂盒。具有高效价和特异性的抗-PRL抗体可用于开发使用简单的用于快速、可靠、敏感和特异地测量及定位血浆、尿、组织提取物中及在细胞培养物中的PRL-1或PRL-3的试剂盒。
这些测定试剂盒包括但不限于以下技术：竞争性及非竞争性测定，放射免疫测定，生物发光及化学发光测定，荧光测定，夹心测定，免疫放射测定，斑点印迹，酶联测定包括ELISA，用于快速监测尿或血液的微滴定板、抗体包被的条带或量杆，以及免疫细胞化学法。对于每个试剂盒，确立测定的范围、敏感性、精度、可靠性、特异性和再现性。在位移或活性的标准曲线上20％、50％和80％的点处建立测定内差异和测定间差异。
在研究中和临床中通常使用的测定试剂盒的一个实例是放射免疫测定(RIA)试剂盒。在成功进行抗-PRL抗体的放射性碘标记和纯化后，将具有最高效价的抗血清以多个稀释度添加至这样的试管中，即这些试管包含在合适的缓冲剂体系中相对恒定量的放射性，例如10,000cpm。其他试管中包含缓冲剂或免疫前血清，用于确定非特异性结合。在4℃下孵育24小时后，添加蛋白A并将这些试管摇晃，在室温下孵育90分钟并在4℃下以大约2000-2500×g离心，以沉淀抗血清与标记抗-PRL抗体结合的复合物。通过抽吸除去上清并在伽玛计数仪中对沉淀物的放射性进行计数。将这样的抗血清稀释液进一步表征，即在减去非特异性结合后该抗血清稀释液结合大约10-40％的标记抗-PRL抗体。
免疫组织化学试剂盒还可用于在组织和细胞中定位PRL-1或PRL-3。该免疫组织化学试剂盒提供说明书、抗-PRL抗体以及可能的封闭血清和连接至荧光分子例如异硫氰酸荧光素或连接至用于显示第一抗血清的某一其他试剂的第二抗血清。免疫组织化学技术是本领域技术人员熟知的。
该免疫组织化学试剂盒使得可使用光学显微术和电子显微术定位组织切片和培养细胞中的PRL-1或PRL-3。这可基于研究目的和临床目的使用。例如，对肿瘤进行活检，或者将其收集并以切片机切成组织切片，以检查产生PRL-1或PRL-3的部位。基于诊断和可能的治疗目的，这些信息可用于癌症的检测和治疗中。
药物组合物
所述抗-PRL抗体可有效地治疗癌症相关疾病。
本发明人公开了一种以有效量的本文所述的抗-PRL抗体治疗癌症相关疾病的方法。使用本领域普通技术人员已知的配制方法，可将所述抗-PRL抗体提供为可药用的组合物中的分离的和基本上纯化的蛋白和蛋白片段。
可以药物组合物的形式给予所述抗-PRL抗体。这样的药物组合物可包括治疗有效量的抗-PRL抗体和合适的赋形剂、稀释剂或载体。
具体而言，可通过例如注射(经例如静脉)至患者体内，将所述抗-PRL抗体导入患者的循环系统中。
适宜于非消化道给药的制剂包括水性的及非水性的无菌注射溶液，所述溶液可包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预定受者的血液等渗的溶质；并且所述制剂还包括可包含助悬剂和增稠剂的水性的及非水性的无菌悬浮液。所述制剂可以存在于单剂量或多剂量的包装体中，例如密封的安瓿和玻璃小瓶中，并且可以被保存于冷冻干燥(冻干的)条件下，仅需要在临使用前加入无菌的液体载体例如注射用水。可从前述类别的无菌粉剂、颗粒剂和片剂即兴制备注射溶液和悬液。
可通过标准途径给予这些组合物。所述途径包括但不限于：口服、直肠途径、眼部途径(包括玻璃体内或前房内)、鼻部途径、局部途径(包括含服和舌下途径)、子宫内途径、阴道途径或非消化道途径(包括皮下途径、腹膜内途径、肌内途径、静脉内途径、真皮内途径、颅内途径、气管内途径和硬脑膜外途径)、透皮途径、腹膜内途径、颅内途径、脑室内途径、脑内途径、阴道内途径、子宫内途径或非消化道途径(例如静脉内途径、椎管内途径、皮下途径或肌内途径)。
所述抗-PRL抗体制剂可以方便地为以单位剂量形式给出，并可通过常规的制药技术制备。这样的技术包括这样的步骤，即建立活性成分和一种或多种药物载体或赋形剂的联系。通常，所述制剂的制备可通过使活性成分与液体载体和/或固体载体微细粉末建立均一密切的联系，然后如果需要则将产品定型。
另外，可将所述抗-PRL抗体整合至可生物降解的聚合物中，使得可持续释放所述化合物，所述聚合物被植入至需要送递药物的区域附近例如肿瘤部位附近，或者所述聚合物被植入使得所述抗-PRL抗体全身性地缓慢释放。可生物降解的聚合物及其应用详细记载于例如Brem et al(1.Neurosurg 199174:441-446)。还可将渗透性微泵用于控制高浓度的抗-PRL抗体从插管送递至所需部位，例如直接至转移生长部位或至供给该肿瘤血液的血管。
所述抗-PRL抗体可与这样的细胞毒性剂连接，即这些细胞毒性剂以被设计成最大送递的方式注入至所需部位。例如，连接蓖麻毒蛋白的高亲和性抗-PRL抗体被从插管送递至供给靶部位血液的血管或直接至靶位。这样的制剂还可以通过偶联于注入插管的渗透泵的受控方式被送递。
优选的单位剂量制剂包含被给予成分的每日剂量或单位、每日亚剂量(如本文上文所述)或其一个合适部分。应理解除了所述成分(尤其上文提及的)外，本文所述的制剂还可包含在本领域中常规的考虑到所关注制剂类型的其他制剂。
可以任何合适的方式给予所述抗-PRL抗体缀合物，通常在标准的稀释剂和载体的无菌、无热源制剂例如等渗盐水(在静脉注射时)中以非消化道途径给予，例如以静脉内或腹膜内途径给予。一旦所述抗-PRL抗体缀合物已结合至靶细胞并且(根据需要)被从血流中清除(这通常会花一天左右)，给予前药(通常以单注入剂量)，或者对肿瘤进行成像。如果需要，因为所述抗-PRL抗体缀合物可能是免疫原性的，所以可加入环孢菌素或其他免疫抑制药，以为治疗提供更长的时间，但通常情况下不需要这样做。
本文所述的抗-PRL抗体的剂量将依赖于疾病状态或者正在治疗的病症和其他临床因素，例如人或动物的体重和状况以及给予所述化合物的途径。
依赖于所述抗-PRL抗体在具体动物或人中的半衰期，可以在一日数次至一周一次之间给予所述抗-PRL抗体。需要理解本文所述的方法和组合物可人用和兽用。本文所述的方法考虑单次给药，以及同时的或经延长时间的多次给药。
可以常规的方式优化给予所述抗-PRL抗体缀合物和前药的时机，这是因为缀合物的肿瘤/正常组织比值(至少在静脉内送递后)在约4-6天后最高，然而在此时结合于肿瘤的缀合物的绝对量(以注入剂量每克的百分数表示)低于前期。
因此，给予所述抗-PRL抗体缀合物和前药之间的最佳间隔将是酶的肿瘤浓度峰值与肿瘤和正常组织之间最大分布比之间的折中值。所述抗-PRL抗体缀合物的剂量可由医生根据通常的标准选择。至少在应用靶向的酶例如β-葡萄糖苷酶及静脉内苦杏仁苷作为毒性前药的方法的情况下，每平方米体表面积1-50次0.1-10.0克的日剂量，优选1.0-5.0g/m2可能是合适的。对于口服治疗，每日3次0.05-10.0g，优选1.0-5.0g的剂量进行1-50天可能是合适的。可依照正常的标准类似地选择所述抗-PRL抗体缀合物的剂量，尤其是参考肿瘤的类型、阶段和部位，以及患者体重。治疗的持续时间将部分地依赖于任何对所述抗-PRL抗体缀合物的免疫反应的速度和范围。
疾病
例如以药物组合物形式的本文描述的抗-PRL抗体可用于癌症的治疗。
对于本文而言，术语“癌症”可包含以下的任何一种或多种：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、女性生殖系统的癌症、男性生殖系统的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞样白血病(CML)、结肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金病(Hodgkin’s disease)、喉咽癌、卡波氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经系统癌症、神经母细胞瘤、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌症、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统癌、Waldenstrom氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)。
例如以药物组合物形式的本文描述的抗-PRL抗体可用于癌症相关障碍的治疗。
这样的障碍包括但不限于：实体瘤；血液生肿瘤例如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；类风湿关节炎；银屑病；眼部血管发生疾病例如糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生、虹膜红变；奥斯勒-韦伯综合征(Osler-WeberSyndrome)；心肌血管发生；斑块新生血管形成；毛细血管扩张症；血友病关节病变(hemophiliac joint)；血管纤维瘤；伤口肉芽形成；冠状动脉侧枝；脑部侧支动静脉畸形；缺血性肢血管发生；新生血管性青光眼；晶状体后纤维组织增生；糖尿病新生血管形成；螺杆菌相关疾病；骨折；血管发生；造血作用；排卵；月经；以及胎盘形成。
实施例
实施例1.细胞系：CHO-K1、A2780和CT26
CHO-K1细胞、A2780人卵巢癌细胞和CT26小鼠结肠癌细胞购自ATCC(Manassas,VA)。
实施例2.稳定表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO细胞混合池的生成
稳定表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO细胞混合池的生成如以前的研究中的描述8。简而言之，将细胞在补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养并在1mg/ml G418中选择20-30天。然后将细胞(106个细胞/ml)通过FACS Vantage,SE mode(BectonDickinson)进行EGFP分拣，并在培养物中再培养以建立稳定的细胞混合池。
实施例3.稳定表达EGFP-PRL-3的AT-3细胞或稳定表达EGFP-PRL-1的AT-1细胞的生成
为了得到EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1肿瘤，将每只8周龄裸鼠(Jackson Labs,USA)经尾静脉注入表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的细胞(5×105)。在尾静脉注入3周后将小鼠处死。取出携带EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1肿瘤的肺。在荧光显微镜(Zeiss,M2Bio Quad)下将各个EGFP-PRL肿瘤切开。为了生成源自这些肿瘤的细胞系，在无菌条件下将每个EGFP-PRL肿瘤在PBS中洗涤2次。将肿瘤切成小块并在37℃和5％CO2下培养于RPMI1640、10％FBS和1％抗生素(Sigma)中。AT-3肿瘤细胞系源自EGFP-PRL-3肿瘤；而AT-1肿瘤细胞系源自EGFP-PRL-1肿瘤。将细胞进行胰蛋白酶处理并以1:3的比例分至新的培养皿中。通过间接免疫荧光法确认同质表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的肿瘤细胞系。
实施例4.特异性PRL-3mAb克隆223、318和PRL-1mAb克隆269的生成
这些抗体的生成如下(亦见参考文献19)：使用来自Stemcell Technologies,Inc.(Vancouver,British Columbia,Canada)的ClonaCell-HY克隆试剂盒生成杂交瘤。步骤依照厂商的说明书。简而言之，进行以下步骤：(a)分别以GST-小鼠全PRL-1或PRL-3融合蛋白免疫BALB/c小鼠；(b)培养BALB/c亲代骨髓瘤细胞SP2/0；(c)从免疫的小鼠制备BALB/c小鼠脾细胞；(d)融合脾细胞与SP2/0细胞；及(e)选择并表征杂交瘤克隆。
两个对照腹水：1.来自抗人血型糖蛋白A的杂交瘤6A7M的腹水(获自ATCC)。2.抗GS28高尔基复合体标记物的腹水。
实施例5.实验性转移测定
参考了参考文献20。所有动物研究都得到了新加坡分子和细胞生物学研究所审查委员会(Review Board of the Institute of Molecular and Cell Biology,Singapore)的批准。本发明人遵照Animal Facility Center of The Agency for Science,Technology and Research(A*STAR),Singapore的方针5,8,19。在第1天通过其尾静脉以1百万个癌细胞注射裸鼠。处理小鼠每周2次经尾静脉给予PRL-mAb。
实施例6.蛋白质印迹分析
详细步骤记载于参考文献19中。
实施例7.表达EGFP-PRL-3的癌细胞的共聚焦显微镜成像和分析
将AT-3、AT-1或亲代CHO细胞在盖玻片上培养并以PBSCM(包含1mM MgCl2和1mMCaCl2的PBS)洗涤一次。然后在室温下(RT，24℃)将细胞在2.7％低聚甲醛中固定20分钟。在以PBSCM洗涤2次后，将细胞以PBSCM中的0.12％皂苷透化15分钟(对于非透性化细胞省略该步骤)，并与PRL-3mAb孵育。将细胞以PBSCM轻轻洗涤3次，并在RT下以与得克萨斯红(TexasRed)(Sigma)缀合的抗-小鼠IgG抗体孵育4小时。以荧光显微镜直接观察AT-3或AT-1细胞为绿色。为了检查摄入活的亲代CHO细胞中的抗体，首先在4℃下将细胞与小鼠抗-GS28抗体孵育2小时。将细胞以PBSCM轻轻洗涤3次，然后在室温下(RT，24℃)在0.6％低聚甲醛中固定20分钟。将所述细胞在RT下以与FITC(Sigma)缀合的抗小鼠IgG抗体孵育4小时。将To-pro-3碘化物用于将每个亲代CHO细胞的DNA染色成蓝色。以Zeiss LSM 510image Browser进行共聚焦成像。
实施例8.免疫组织化学法(IHC)
本发明人使用单克隆的小鼠抗-PRL-3抗体(克隆223或318)或小鼠抗-PRL-1抗体(克隆269)(1:300的稀释度)和VECTASTAIN ABC试剂盒-过氧化物酶兔IgG PK-4001(OrtonSouthgate,Peterborough,England)进行IHC实验，研究了来自Cybrdi(Frederick,Maryland)的人结肠癌标本和乳腺癌标本中的PRL-3和PRL-1蛋白表达。人低密度和高密度多恶性肿瘤阵列(TS42040704)和(TS43040303)购自BioGenex(San Ramon,CA)。将福尔马林固定、石蜡包埋的切片在54℃下烘烤10分钟，然后在新鲜二甲苯中除蜡5分钟(2×)。将切片依次用100％、95％、80％和75％乙醇、PBS(每次变化维持2分钟)再水化，然后于0.01M柠檬酸钠(pH6.0)缓冲物中处理，之后由抗原提取2100-Retriever Pick Cell Laboratories(Amsterdam,North Holland,1098SM,NL)处理15分钟。将切片在冷却器中冷却4个小时。以PBS洗涤切片3次(每次5分钟)，转移至0.6％H2O2的PBS中避光20分钟。将切片以PBS洗涤数次，并在24℃下在PBS-0.2％吐温20中处理20分钟。依照厂商的说明书进行封闭步骤和抗体孵育。
实施例9.可使侵袭性转移性肺肿瘤快速形成的动物模型
本实施例描述了小鼠中过表达PRL的肿瘤的生成，并提供了用于后续PRL癌症治疗的动物模型。
参照图1。
首先，将裸鼠用作体内“细胞分选器”以选择具有高转移活性的细胞。将1×106个表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的CHO细胞经尾静脉注入至裸鼠的循环系统。在注入后3周在每只裸鼠的肺中形成了数十个转移瘤或病灶。
第二，然后将单个的这种肺转移EGFP-PRL肿瘤切下并在培养皿中切碎，以建立更富有侵袭性和更同质的表达EGFP-PRL-3的转移细胞系(被称作AT-3)或表达EGFP-PRL-1的肿瘤细胞系(被称作AT-1)。
第三，将1×106个AT3或AT1细胞经尾静脉再次注入至裸鼠中。
第四，本发明人将小鼠分为非治疗组或治疗组，在接种所述肿瘤细胞后第3、6和9天经尾静脉注射给予不同的抗体。
设计这样的一种动物模型，即其中过表达PRL-3或PRL-1的细胞快速地形成转移瘤。以这样的侵袭性转移瘤作为背景，如果以抗-PRL-mAb的治疗有效，那么能够观察到对致肿瘤性的任何抑制。
本发明人的动物模型再现了表达PRL的细胞的侵袭性转移活性，并可用于剖析在侵入或内渗后出现的转移事件。
实施例10.PRL-3mAb或PRL-1mAb在小鼠中可以约90％的效力阻断EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1转移性肺肿瘤的形成
在注入细胞后第15天，4组对照小鼠(图2A，a，未处理的；b，PBS-处理的；c&d，两种无关抗体)在它们的肺中显示了大量广泛分布的EGFP-PRL-3转移瘤(约140-150个部位)。
显著地，接受以来自杂交瘤克隆223(图2A e和g)或克隆318(图2A f和h)的纯化IgG或未纯化腹水形式的3个剂量PRL-3mAb的其他4组小鼠在其肺中显示了显著减少的表达EGFP-PRL-3的肿瘤(约15-20部位)。
类似地，PRL-1mAb显著降低了源自接种表达EGFP-PRL-1的AT-1细胞的转移瘤形成(图2B，第9道)。总的来说，以PRL单克隆抗体处理的小鼠(n＝40)与对照小鼠(n＝40)相比出现转移性肺肿瘤被抑制约90％。已在心脏中检测到了PRL-3mRNA(但非蛋白)5。
就这一点而言，有必要强调的是，以PRL-3mAb处理的动物没有表现出明显的心脏毒性或其他不良副作用。
实施例11.PRL-1mAb可特异性地阻断PRL-1(但非PRL-3)转移瘤的形成，而PRL-3mAb可特异性地阻断PRL-3(但非PRL-1)转移瘤的形成
该实施例证明了所述抗体效应是特异性的。
参考图3。
本发明人表明，表达PRL-1和PRL-3的细胞的肺转移瘤形成不被模拟品PBS处理阻断(a、e)，但可被兔PRL抗体有效地阻断(b、f)，这是由于所述兔抗体可与所有3种PRL(PRL-1、PRL-2和PRL-3)反应。
本发明人表明，PRL-1mAb可阻断其中过表达PRL-1(c)但非过表达PRL-3(g)的肺转移瘤形成。
类似地，PRL-3mAb可抑制(减少肿瘤数目)其中过表达PRL-3(h)但非过表达PRL-1(d)的肺转移瘤形成。
实施例12.PRL-3mAb可有效抑制表达内源性PRL-3的A2780细胞但非不表达内源性PRL-3的CT26细胞的转移瘤形成
到目前为止，PRL-mAb治疗的显著有效性依赖于靶向具有高水平EGFP-PRL蛋白表达的细胞。
然后，本发明进行关键的实验，以评估所述抗体是否能够阻断天然表达PRL-3蛋白的癌细胞的转移。理想的用于本实验中的候选癌细胞系应具有两个性质：1.天然表达的PRL-3蛋白；2.能够在小鼠中快速地导致转移瘤形成。
本发明人发现A2780人卵巢癌细胞系具有这两个性质，并确认了A2780细胞天然地表达PRL-3蛋白(图4A，第2道)，这在以前被报道过9。
同时，本发明人鉴定了一个不表达PRL-3蛋白的小鼠结肠癌细胞系CT26(图4A，第1道)。CT26癌细胞系被选为本实验的阴性对照，这是因为在接种所述癌细胞后2周它在裸鼠肺中具有强的转移活性(图4B)。
可预计地，在接受CT26细胞的小鼠的处理组(图4B，a)和未处理组(图4B，b)不会有差异，都显示体重减轻的病理表观。
与来自未处理小鼠的肺(图4B，下图b)相比，CT26细胞的侵袭性肺转移瘤的快速形成不受PRL-3mAb的抑制(图4B，下图a)，这表明PRL-mAb不抑制其中不天然表达PRL-3磷酸酶的肺转移瘤的形成。
相反，在接种表达内源性PRL-3蛋白的A2780人癌细胞后1个月，在处理的和未处理的小鼠之间出现了显著差异。病理表观(不健康及极瘦)以及A2780PRL-3阳性细胞形成的多个肿瘤仅出现在未处理的小鼠中(图4C，右侧)，而不出现在处理的小鼠中(图4C，左侧)。所述处理的小鼠在更长的时间里保持健康。
这些结果表明，PRL-3mAb能够阻断天然表达PRL-3的癌细胞的转移瘤形成，而对不表达内源性PRL-3的癌细胞没有效应。
实施例13.摄取各自的PRL-抗体的表达PRL-3或PRL-1的细胞
需要进一步研究抗-PRL抗体通过什么精确机制抑制肿瘤形成。为了确定肿瘤细胞是否摄取PRL mAb，本发明人使用间接免疫荧光法在过表达EGFP-PRL-3的非透化AT-3细胞中检查了PRL-3mAb染色。
一些非透化AT-3细胞表现出被PRL-3mAb完全染色(图5A，图b&e中白色箭头指出)。40％的这些细胞被部分地染色为红色，但>50％的所述细胞完全未被标记(图5A，b、e)，不同于透化AT-3细胞100％呈现被抗-PRL-3mAb染色为红色(图5A、h)。
这些数据表明，大的PRL mAb仍能够部分地或完全地穿透至非透化癌细胞中。
使用PRL-1mAb(克隆#269)和过表达EGFP-PRL-1的CHO细胞得到类似的结果(数据未显示)。
为了进一步确认所述抗体能够进入细胞内，本发明人选择高尔基器标记物(GS28)的抗体，并表明GS28mAb可穿透至培养物中的CHO活细胞中(图5B，a-c)。再者，血清饥饿过夜的多数活细胞(60-70％)显示通过未知机制摄取小鼠抗-GS28抗体摄取的更高效力(图5Bd-f中绿色所示)。
为了研究所述抗体的摄取是否是普遍的细胞现象，在2个其他细胞系上试验了3种PRL-无关抗体。这些试验是小鼠抗-GS28抗体和兔抗-PTEN抗体在非透性化人乳房上皮细胞(MCF-10A)上的试验；以及小鼠抗-GS28抗体和兔抗-p53抗体在人乳腺癌细胞(MCF-7)上的试验。
同时，本发明人发现不管所述抗体来源是兔还是小鼠，都有一部分非透化细胞(约10％)显示两种抗体在同一细胞中的有效摄取(图6A、B)。如果MCF-7细胞是血清饥饿过夜的，那么所述非透化MCF-7细胞能够高效地摄取GS28抗体和p53抗体(图6C)。
间接免疫荧光双染色可显示在正常细胞和癌细胞中的抗体摄取是普遍现象。抗体可被非透化细胞摄取，并且这一点可以被细胞的血清饥饿加强。这些结果表明，使用单克隆抗体疗法也可以靶向细胞内蛋白。
实施例14.PRL-3和PRL-1的过表达与多种转移癌有关
为了评价PRL-mAb作为抗PRL-3或PRL-1相关癌症的潜在药物的临床重要性及预后重要性，本发明人尝试另外评估已知PRL介导的癌症的谱，所述癌症包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、黑色素瘤和胃癌3-12,19。
本发明人使用PRL-3mAb在人多种癌症组织阵列上进行免疫组织化学测定，发现PRL-3蛋白在15％(26/158例)的结肠癌中上调，在16.5％(19/96例)的乳腺癌中上调，并在15％(2/13例)的食道癌中上调。
PRL-3的过表达与肺中的鳞状细胞癌、阴茎癌和宫颈癌紧密相关。选择的样品显示于图7A中。
PRL-1蛋白在6.2％(8/128例)的结肠癌中、在20％(5/20例)的脑癌中及在7.6％(1/13例)的食道癌中过表达(图7B)。在这些癌症样品中，PRL-阳性信号主要位于质膜和细胞质。
实施例15.讨论(实施例1-实施例14)
转移是癌症最为可怕的特征。本发明人和其他人已发现PRL-3和PRL-1的过量表达与人多种癌症相关3-12,19。在本研究中，本发明人进一步证明了PRL-3蛋白在结肠癌、乳腺癌和食道癌中是上调的。PRL-3的过表达与肺中的鳞状细胞癌、阴茎癌和宫颈癌紧密相关。PRL-1蛋白也在结肠癌、脑癌和食道癌中过表达。
通过外源性试剂靶向过表达细胞内PRL的癌细胞以防止癌症转移是一项富有挑战性的工作。单克隆抗体(mAb)构成了一类发展最为快速的人类疗法，并且被证明是用于识别及破坏恶性细胞的制剂。为了阻断PRL介导的癌症转移，本发明人需要消除表达PRL的癌细胞以阻止它们的进一步扩散。本发明人尝试在小鼠中用单克隆抗体治疗实现这个富有挑战性的目标。将培养的PRL-肿瘤细胞经小鼠尾直接导入至每只小鼠中，本发明人使用这样的实验性转移测定在体内检查了癌细胞的生长和肿瘤形成。癌症转移的过程有4个主要的步骤。第一，癌细胞必须增强迁移能力，以脱离原发肿瘤并与其分离。第二，癌细胞需要进入血液循环(内渗)并在其中存活。第三，癌细胞应该从血管中出来(外渗)，以到达新的器官。第四，癌细胞(种子)需要在所述远端器官(土壤)中存活，以成长为转移瘤。本发明人通过将一百万个EGFP-PRL-癌细胞经尾静脉直接注入至血管中，在所述内渗步骤开始我们的转移测定(图1)。癌症转移过程是一漫长而艰难的进程；据估计仅约0.01％的癌细胞(约100个肿瘤来自1×106个癌细胞)可成功地到达其最终目的地。在该实验结束之前，本发明人在未处理小鼠中观察到约100-150个转移性肺肿瘤(图2A，a-d)，在以PRL特异性mAb处理的小鼠中观察到约10-15个转移性肺肿瘤(图2A，e-h)。本发明人的研究代表了通过使用抗各自磷酸酶(尽管它们定位于细胞内)的mAb在小鼠中有效阻断(约90％)实验性转移的首批例证。本发明人另外表明，PRL-mAb对其自己的抗原是特异性的。PRL-1mAb可特异性地阻断PRL-1但非PRL-3转移瘤的形成；PRL-3mAb可特异性地阻断PRL-3但非PRL-1转移瘤的形成(图3)。此外，本发明人证明，PRL-3mAb不阻断其中不表达内源性PRL-3磷酸酶的CT26小鼠结肠癌细胞的肿瘤形成(图4A、B)。有意义的是，本发明人表明，PRL-3mAb可有效地阻断表达内源性PRL-3蛋白的人卵巢癌细胞系A2780的转移瘤形成。有效抑制PRL-3阳性的天然人癌细胞的转移瘤形成是重要的，这是因为这表明PRL-3mAb或其人源化的抗体可为治疗与PRL-3过表达相关的人癌症的候选物。虽然比较PRL-3抗体对A2780人卵巢癌细胞的抑制效应与其对小鼠CT26结肠癌细胞的无抑制效应可表明所述抗体可靶向内源表达PRL-3的癌细胞，但是需要应用仅PRL-3表达水平不同的同基因癌细胞的后续研究，以令人信服地证明这一点。
有多种可能的机制可造成实验性转移测定中PRL-3抗体介导的肿瘤形成的抑制。
第一，所述抗体有可能进入表达PRL-3的细胞，以靶向细胞内PRL-3并中和其功能。培养物中部分表达PRL-3的癌细胞对抗-PRL-3抗体的摄取及在血清饥饿时的抗体摄取增加似乎可支持这种作用模式。第二，少部分的PRL-3可能被外部化并呈现于所述表达PRL-3的细胞表面。抗体结合于暴露于表面的PRL-3可触发免疫反应例如补体介导的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDCC)，以破坏癌细胞。第三，细胞内PRL-3可能被水解处理，并且抗原片段可能通过I类主要组织相容性抗原呈现于细胞表面，使得所述癌细胞变成细胞毒性T细胞的靶标。
为了了解这些PRL-mAb怎样抑制由它们各自的细胞内抗原驱动的癌症转移的第一种可能性，本发明人提供了这样的证据，即表达PRL-3或PRL-1的细胞对它们各自的PRL抗体的摄取可能是一个普遍现象，原因是本发明人还发现PRL无关的高尔基标记物GS28的抗体可穿透至培养物的活CHO细胞中，并且所述抗体的摄取可被所述细胞的血清饥饿增强(图5B)。
一个重要的问题是，所述抗体穿透是否特异性地出现在癌细胞中，或者还出现在未转化的细胞类型中，以及其他类型的抗体是否也能进入细胞。在2个另外的细胞系上试验了三种PRL无关抗体。这些试验是小鼠抗-GS28抗体和兔抗-PTEN抗体在非透化人乳房上皮细胞(MCF-10A)上的试验；以及小鼠抗-GS28抗体和兔抗-p53抗体在人乳腺癌细胞(MCF-7)上的试验。
同时，本发明人发现不管所述抗体来源是兔还是小鼠，都有一部分非透化细胞(约10％)显示两种抗体在相同细胞中的有效摄取(图6A、B)。如果MCF-7细胞是血清饥饿过夜的，那么所述非透化MCF-7细胞能够高效地摄取GS28抗体和p53抗体(约70％，图6C)。
血清饥饿可用于将细胞阻止在G1期和G0期21。可能的情况是具体的细胞周期阶段可加强细胞摄取抗体的能力。在体内，癌细胞处于缺氧应激和血清饥饿下，这些条件可能增强癌细胞摄取抗体的能力。
这些结果表明了一个至今尚未认识的普遍现象，即细胞能够摄取抗体以中和细胞内抗原。具体而言，本发明人已证明，在这些动物中PRL-3和PRL-1抗体能够特异性地靶向它们各自的细胞内蛋白，并且在无可察觉副作用的情况下消除肿瘤形成。虽然在实验性转移测定中PRL-3抗体抑制肿瘤形成的具体步骤仍需要后续研究来确定，但是本发明人的结果表明，撒播于肺或其他二级组织的单细胞(或由细胞簇组成的微转移)可能是PRL-3抗体的靶，这一点可由显著减少的肿瘤团数目反映。由于癌细胞撒播于二级组织中及从微转移发展成宏转移是癌症扩散中的主要限制步骤，所以以PRL-3抗体靶向这些阶段在临床上可能与防止癌症转移关联。
在本文中，本发明人提供证据证明，PRL-3mAb可正确地靶向有内源性PRL-3表达的肿瘤。最后，本发明人的数据表明，细胞内蛋白也可以使用单克隆抗体治疗进行靶向，以消除转移瘤形成。本发明人建议癌症研究人员可考虑将大量的细胞内癌蛋白作为抗癌症治疗中mAb可能的靶标来再次进行评价。
实施例16.特异性PRL-3和PRL-1小鼠/人嵌合mAb(克隆#318、269)的生成
对于PRL-3嵌合mAb，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,cat#74104)从6×106个杂交瘤细胞(克隆#318)提取总RNA。在RNA提取过程中使用DNAse。然后使用SuperscriptⅡRNaseH(Invitrogen,Cat 18064-014)将RNA反转录成cDNA。将所产生的总cDNA用作模板使用Ig-Prime Kits(Novagen,cat#69831-3)进行30个循环的PCR(95℃，54℃，72℃)，以生成“通用可变区”。以TA克隆试剂盒(Invitrogen,part#45-0640)将PCR片段克隆至PCRⅡ-TOPO-Vector中。将PCR片段以MfeI和XhoI切割，然后插入至人IgG1恒定区表达载体-pCMV-人IgG1的各自位点中(18)，以将小鼠重链可变区(克隆#318)与人IgG1恒定区连接起来。对于小鼠轻链可变区进行类似的PCR过程，以包含ApaLI和PstI限制位点，用于PCR小鼠可变轻链(克隆#318)。将PCR片段以ApaLI和PstI切割，然后插入至包含克隆#318重链可变区的人IgG1恒定区表达载体的各自位点中。将该完全构建体短暂地转染至以超低IgG FBS(Gibco，16250-078)培养的293T细胞中。从所述培养上清液中收获所述嵌合mAb，并以离心过滤装置(Millipore，cat#UFC900596)浓缩最高达40倍。通过间接免疫荧光法(IF)和蛋白质印迹分析试验嵌合mAb的特异性。类似地，为了生成PRL-1(克隆#269)轻链可变区的PCR片段，从杂交瘤细胞#269提取mRNA，然后将所述mRNA反转录成用于回收重链和轻链可变区编码序列的cDNA。为了生成PRL-1轻链可变区的PCR片段，进行如上述的类似步骤。
实施例17.DLD-1-EGFP-PRL-3肿瘤细胞系的生成
DLD-1结肠癌细胞来自ATCC CCL-221(Mannassas,VA)。使用Invitrogen(Carlsbad,CA)的Lipofectamine 2000将EGFP-PRL-3表达构建体转染至DLD-1细胞中。为了得到EGFP-PRL-3肿瘤，将每只8周龄裸鼠(Jackson Labs,USA)在裸鼠臀部注射以形成外植的肿瘤。在癌细胞接种后3周将小鼠处死。取出肿瘤并在荧光显微镜(Zeiss,M2Bio Quad)下检查。为了生成DLD-1-EGFP-PRL-3肿瘤细胞系，将EGFP-肿瘤在无菌条件下在PBS中洗涤2次；切成小块并在37℃和5％CO2下培养于RPMI 1640、10％FBS和1％抗生素(Sigma)中。将细胞进行胰蛋白酶处理并以1:3的比例分至新的培养皿中。通过间接免疫荧光法确认同质表达EGFP-PRL-3或EGFP-PRL-1的肿瘤细胞系。
实施例18.细胞系：HCT116(CCL-247)、DLD-1(CCL-221)、B16F0(CRL-6475)、B16F10(CRL-6322)和A2780
HCT116(CCL-247)为人结肠直肠癌细胞系。DLD-1(CCL-221)为人结肠直肠腺癌细胞系。B16F0(CRL-6475)和B16F10(CRL-6322)为两个小鼠黑色素瘤细胞系。所有四个细胞系都购自ATCC。A2780为人卵巢癌细胞系，购自ECACC(Cat#93112519UK)。
实施例19.实验动物
参照文献A19。所有动物研究经本发明人研究所审查委员会批准。本发明人遵照Animal Facility Center of The Agency for Science,Technology and Research(A*STAR),Singapore的方针。使用8周的裸鼠(Jackson Labs,USA)。在第1天通过尾静脉以1×106个癌细胞注入裸鼠的循环系统中。在第3天将嵌合mAb给予处理小鼠尾静脉中，或者将PBS给予非处理小鼠尾静脉中。
实施例20.特异性PRL-3小鼠/人嵌合mAb(克隆#318)的生成
本发明人受到这样的事实鼓励，即PRL-1和PRL-3的小鼠mAb可特异性地靶向它们各自的细胞内PRL磷酸酶，并抑制实验动物中的癌症转移(参考文献A16)。在将实验室工作应用于临床的尝试中，本发明人设计了一种抗PRL-3的小鼠/人嵌合mAb，以降低小鼠mAb在人中可能的抗原性。成功地开发了所述PRL-3嵌合mAb，其中通过以重组DNA技术进行的对免疫球蛋白基因的转基因融合(图8A)，将人IgG分子的恒定区(参考文献A18)与小鼠PRL-3mAb克隆#318的可变区(重链和轻链)结合。将该表达构建体转染至表达猴病毒40T抗原的人胚胎肾细胞(293T)细胞中，以产生嵌合的PRL-3mAb，然后从培养基中收获所述PRL-3mAb并进一步浓缩40倍。
实施例21.特异性PRL-1小鼠-人嵌合mAb(克隆#269)的生成
本发明人以类似策略生成小鼠PRL-1的重链和轻链可变区，然后分别插入至人IgG表达载体的恒定区中(参考A18)，以生成嵌合的PRL-1mAb。
实施例22.PRL-3和PRL-1嵌合mAb可特异性地靶向它们的抗原
通过进行间接免疫荧光(IF)(图8B)和蛋白质印迹分析(图8C和图8D)，确认所述PRL-3和PRL-1嵌合mAb对其抗原的特异性。这些数据表明，PRL-3嵌合mAb仅识别PRL-3蛋白，但不识别PRL-1蛋白和PRL-2蛋白；而PRL-1嵌合mAb仅结合PRL-1蛋白，但不识别PRL-2蛋白和PRL-3蛋白。
实施例23.PRL-3嵌合抗体可有效抑制表达内源性PRL-3的A2780细胞和HCT116但不抑制不表达内源性PRL-3的DLD-1细胞的转移瘤形成
进行决定性实验以评估PRL-3嵌合mAb是否能靶向并阻断源自天然表达PRL-3蛋白的癌细胞的转移瘤形成。通过蛋白质印迹分析就PRL-3的表达对数十种癌细胞进行了筛查。理想的用于本实验中的候选癌细胞系应具有两个性质：1.天然表达的PRL-3蛋白；2.能够快速地导致转移瘤形成。本发明人发现A2780人卵巢癌细胞系和HCT116人结肠直肠癌细胞系具有这两个性质，并确认了A2780细胞和HCT116细胞天然地表达PRL-3蛋白(图9A，第1、2道)。A2780细胞以前被报道为PRL-3阳性细胞系(参考文献A4)。值得注意的，在接种HCT116(n＝5)或A2780(n＝8)细胞后1个月，在PRL-3嵌合mAb处理的和未处理的小鼠之间出现了显著差异。病理表观(不健康及极瘦)仅出现在未处理的小鼠中(图9B和图9C，左侧)，而不出现在处理的小鼠中(图9B和图9C，右侧)。所述处理的小鼠在更长的时间里保持健康。这些结果表明，PRL-3嵌合mAb能够阻断天然表达PRL-3的癌细胞的转移瘤形成。相反，本发明人鉴定了一个不表达PRL-3蛋白的人结肠癌细胞系DLD-1(图9A，第3道)。DLD-1细胞被作为本实验的阴性对照。可以预计，在接受DLD-1细胞的小鼠的处理组(图9D，左侧)和未处理组(图9D，右侧)之间不会有差异，在接种DLD-1细胞后3.5个月都显示健康表观。明显地，被设计来过表达EGFP-PRL-3的DLD-1细胞在接种所述细胞后2个月能在小鼠中导致病理表型。多个微转移瘤出现于携带这些表达外源性PRL-3的癌细胞的裸鼠的肺中。EGFP-PRL-3阳性细胞在此时还出现在未处理小鼠的血液涂片中(图10A，n＝5)；表明PRL-3能延长血流中的细胞存活。相反，接受PRL-3嵌合mAb治疗的小鼠在延长的时间中显示了显著不同的大小和健康表观。微转移瘤未出现在携带这些表达外源性PRL-3的癌细胞的处理裸鼠的肺中。EGFP-PRL-3阳性细胞很少出现在所述处理小鼠的血液涂片(图10B，n＝5)。这些结果表明，PRL-3嵌合mAb能够阻断天然表达内源性PRL-3或者表达外源设计的PRL-3的癌细胞的转移瘤形成。重要地，所述抗体对不表达内源性PRL-3的癌细胞无效应。
实施例24.PRL-3嵌合抗体可有效地抑制表达内源性PRL-3的B16F0细胞但不抑制不表达内源性PRL-3的B16F10细胞的转移瘤形成
本发明人已证明，所述抗体能阻断人癌细胞形成的转移瘤。现在本发明人使用两个小鼠黑色素瘤细胞系B16F0和B16F10，以进行另外的mAb处理。两个细胞系在小鼠中都可快速地形成多个转移瘤。对于携带表达内源性PRL-3蛋白的B16F0癌细胞的未处理小鼠(图11A)，转移瘤出现于肾上腺(箭头指示)、肝、骨和腹部(图11B，右侧)。同时，本发明人表明，所述嵌合mAb能在处理小鼠的多个组织中有效消除转移瘤形成(图11B，左侧)。在平行对照实验中，数十个转移瘤出现于携带不表达内源性PRL-3蛋白的B16F10癌细胞的未处理或处理的小鼠肺中(图11A)，如可观察到的，处理小鼠(图11上图)和未处理小鼠(下图)之间的肺转移瘤数目无显著差异。到目前为止，从PRL-3嵌合mAb对数个PRL-3阳性及阴性癌细胞系治疗得到的结果可表明，该治疗有效性与所述转移瘤形成是否由PRL-3过表达导致是高度相关的。如果癌细胞的转移性质不是由于PRL-3过表达引起(B16F10细胞)，给予PRL-3嵌合mAb对阻断肿瘤形成无效应(图11C)。
实施例25.讨论(实施例15-24)
大多数癌症患者死于转移，而非死于其原发疾病。癌症转移是一种多步骤过程。癌症转移的第一个重要步骤涉及新生上皮细胞失去细胞-细胞粘附并获得运动性，这些可驱动癌细胞从肿瘤的原发位点脱离，并侵入至邻近组织。第二个步骤需要癌细胞获得进入宿主血液循环(内渗)的能力。这两个最初的步骤可能会花很长时间来酝酿和完成。在这里，本发明人使用实验性转移测定(参考文献A19)并以这样的内渗步骤开始我们的实验，即将1百万个癌细胞通过小鼠尾静脉直接注射至血液循环中(在第1天)，这可模拟剩余的转移步骤。在第3天本发明人以PRL-3嵌合mAb处理所述动物，然后每周两次给予该mAb。综合以前的(参考文献A16)和现在的抗体治疗的结果，本发明人的发现表明：1.癌症转移过程是一个漫长而艰难的进程；以1百万个癌细胞(种子)起始；在实验结束时，本发明人在未处理小鼠中观察到约100个转移性肺肿瘤，在以PRL特异性mAb处理的小鼠中观察到约10-15个转移性肺肿瘤(参考文献A16)，这些数据反映出，估计仅约0.01％的癌细胞可成功地到达其最终目的地。2.同时在该研究中，与未处理小鼠的肺切片相比，本发明人发现来自处理小鼠的肺切片中的微肿瘤数量更少(图10A)；表明所述mAb能起到减少肿瘤数目但非大小的作用。3.治疗有效性还与本发明人什么时间开始引入所述嵌合mAb高度相关。如果处理不足够早地开始，而是在接种癌细胞后延后1周，那么效果不如早处理(第3天)；这些结果暗示出，当所述PRL-3癌细胞仍在循环系统中移动和流动时，PRL-3mAb可能起到将之中和并清除的作用。延迟的治疗可使癌细胞有机会通过血管(外渗)并达到远端器官进行撒播；所述mAb可能有很少的机会阻止PRL-3阳性癌细胞外渗和撒播。这种假设被以下现象支持：DLD-1-EGFP-PRL-3细胞更长时间地存在于未处理小鼠的循环系统中，以及这些细胞在接受mAb处理的小鼠中的明显减少。4.最重要地，PRL-3嵌合抗体仅能有效地阻断源自表达内源性PRL-3的癌细胞但不阻断不表达内源性PRL-3的癌细胞的转移瘤形成。因此，本发明人的PRL-3mAb处理对其自己的抗原是非常特异的。值得注意的，所述mAb较好地通过血流、但不通过局部反应发挥功能，本发明人通过在裸鼠臀部区域局部地注入1百万个PRL-3癌细胞生成外植肿瘤，然后从第3天开始每周2次在类似区域注入mAb，本发明人发现所述mAb无减小局部外植肿瘤大小的效应(数据未显示)。
PRL-3mAb在实验性转移测定中抑制PRL-3介导的转移瘤形成的详细细胞和分子机制现在是未知的，需要以后的研究来确定。PRL-3嵌合mAb在小鼠中能消除表达PRL-3的癌细胞的转移瘤，这些结果是令人兴奋的，并且提出一个在临床中针对其他细胞内靶标的概念。本发明人的研究可能开启使用抗细胞内癌基因产物的mAb来治疗多种癌症和癌症转移的抗体治疗的巨大的新机会。由于PRL-1、PRL-2和PRL-3在多种癌中是过表达的，因此本发明人预计会广泛需要可能作为对抗多种PRL细胞内磷酸酶相关肿瘤的新型医药先驱的PRL嵌合mAb。本发明人能够选择并治疗在最先诊断出原发癌症时将在短时间内复发-再现的一些类型的癌症患者(例如：患胰腺癌的患者)。处理组和未处理组的患者之间的差异能够揭示所述嵌合mAb在短时间内是否具有效应。
实施例26.抗-PRL3抗体318可结合细胞内PRL3多肽及外化或分泌PRL3多肽
一个实验以如下进行：
1.在10cm培养皿中培养A2780、HCT116、B16F0、B16F10细胞，每皿均至80％的汇合；
2.PBS洗涤数次；
3.将培养基(8ml)变成无FBS过夜；
4.*第二天，收获培养基并3K离心，弃沉淀，14K再次离心并保留上清液(*裂解来自所述皿的细胞，检测每个细胞系的PRL-3表达，图12A)；
5.使用GAPDH作为细胞裂解物的蛋白上样对照(图12B)；
6.在显微镜下检测所述培养基，以确证没有细胞在培养基中；
7.浓缩培养基并对培养基中的分泌或外化PRL-3跑SDS凝胶(图12C)。
结果显示于图12中。
图12A.蛋白质印迹证明，A2780、HCT116和B16F0为3个表达内源性PRL-3蛋白的癌细胞系，而B16F10为不表达PRL-3的癌细胞。
图12B.GAPDH被用作蛋白上样对照物。
图12C.对从4个癌细胞系收获的4种培养基的蛋白质印迹分析。PRL-3磷酸酶被发现从B16F0细胞分泌至培养基中，而没有发现PRL-3磷酸酶从剩下的3种细胞中分泌出，这表明PRL-3磷酸酶的分泌可能相关于细胞类型特异的现象。这些数据表明，PRL-3在癌症患者体内可分泌于血流中。磷酸酶分泌在本发明人的文献中从没有被报道。
实施例27.抗-PRL1抗体和抗-PRL3抗体的表位作图
对针对所述每种抗-PRL抗体269和318的表位进行如下的作图。
第一，本发明人排除在所有3种PRL都相同的大多数氨基酸。第二，本发明人选择在3种PRL中不同的氨基酸序列。第三，针对这些特异性区域专门设计28条肽，这些肽之间因它们各自的抗体可结合于其自己的特异性抗原而可以彼此区分。
本发明人专门设计28个PRL-1、PRL-2和PRL-3特异性多肽斑点，并从GenemedSynthesis,Inc.(www.genemedsyn.com)订购。所述28个肽斑点如以下表E1排列，该表E1还显示将这些斑点对应于图13A和13B的每条多肽序列。
参考编号 A B C D E f
1 TYKNMR TLNKFI NKFIEE VCEATY DTTLVE KEGIHV
2 PSNQIV KDSNGH NGHRNN SYENMR TLNKFT NKFTEE
3 VCDATY DKAPVE KEGIHV PPNQIV RDTNGH SYRHMR
4 TLSTFI STFIED VCEVTY DKTPLE KDGITV KAKFYN
5 PPGKVV YNDPGS KDPHTH HTHKTR
表E1.就对抗-PRL1抗体和抗-PRL3抗体的表位结合情况测试的28条肽。该表显示的图谱代表每个斑点的排布。显示了与图13A和图13B中斑点对应的多肽序列。
PVDF斑点印迹膜的步骤
封闭膜
1)以100％甲醇将膜预湿数秒钟，直至它完全湿透时从不透明白色变成均匀半透明灰色。2)将所述膜在水中孵育45分钟，以洗脱甲醇。3)在4℃下于3％BSA中摇晃封闭过夜。
免疫染色
1)在4℃下与PRL-1抗体(图13A中#269)或者与PRL-3抗体(图13B中#318)摇晃孵育过夜。2)以PBS吐温-20洗涤4次，每次10分钟。3)在室温下与1∶1000的抗小鼠HRP抗体摇晃孵育2小时。4)以PBS吐温-20洗涤4次，每次10分钟。
ECL显像
1)在室温下与检测剂孵育5分钟。2)排空剩余的缓冲物，置于塑料/丝龙的套中。3)在暗室中显像。
结果
结果显示于图13A和图13B中。
图13A显示了对PRL-1(克隆#269)mAb进行表位作谱的蛋白质印迹分析结果。两个阳性斑点表明PRL-1mAb优先结合于两条多肽(1a，TYKNMR；1b，TLNKFI)。
图13B显示了对PRL-3(克隆#318)mAb进行表位作谱的蛋白质印迹分析结果。两个阳性斑点表明PRL-3 mAb优先结合于两条多肽(4f，KAKFYN；5d，HTHKTR)。
这些结果表明PRL-1mAb(克隆#269)和PRL-3mAb(克隆#318)可结合于由非线性序列形成的表位。
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本文件中提及的每件申请和专利(包括处于申请和审查过程中的每件申请和专利)，上述每件申请和专利中引用或参考的每个文件(“申请引用文件”)，以及在每件申请和专利中以及在任何申请引用文件中引用或提及的任何产品的任何厂商说明书或目录，均通过引用纳入本文。再者，本文中引用的所有文件，本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或提及的任何产品的任何厂商说明书或目录，通过引用纳入本文。
只要不偏离本发明的范围和主旨，本发明所述方法和系统的多种修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然本发明是结合具体优选的实施方案来描述的，但应理解所要求保护的发明不应被不适当地局限于这些具体的实施方案。事实上，对所述用于实现本发明的模式的多种这样的修改意欲被包括在权利要求的范围内，即所述修改对分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的。

Claims (9)

1.抗PRL-1的抗体在制备用于治疗或预防癌症或癌症转移的药物中的用途，所述治疗或预防包括以所述抗体靶向细胞内PRL-1以消除癌症细胞和癌症转移。
2.权利要求1的用途，其中所述抗体选自：
(a)可结合PRL-1的抗体，其包括包含SEQ ID NO:2的重链可变区序列及包含SEQ IDNO:4的轻链可变区序列；
(b)能够结合至细胞内PRL-1多肽的(a)的抗原结合片段；以及
(c)包含这样的序列的抗体，所述序列与(a)或(b)至少90％相同，并且能够结合至细胞内PRL-1多肽。
3.权利要求1或2的用途，其中所述抗体结合并抑制细胞内PRL-1的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。
4.前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体包括单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
5.抗PRL-1的抗体和抗PRL-3的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症或癌症转移的方法中。
6.编码抗PRL-1的抗体的核酸在制备用于治疗或预防癌症或癌症转移的药物中的用途，所述治疗或预防包括以所述核酸编码的抗体靶向细胞内PRL-1以消除癌症细胞和癌症转移。
7.权利要求6的用途，其中所述核酸为编码权利要求2的抗体(a)的核酸，并且所述核酸包括序列SEQ ID NO:1和序列SEQ ID NO:3。
8.前述权利要求任一项的用途，其中所述治疗或预防包括将治疗有效量的所述抗体给予患有或疑似患有癌症的个体。
9.前述权利要求任一项的用途，其中所述癌症包括表达PRL-1的癌症、转移癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、子宫颈癌、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑色素瘤。
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