ES2846400T3 - Anticuerpos que se unen a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 intracelular - Google Patents

Anticuerpos que se unen a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 intracelular

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Abstract

Un anticuerpo anti-PRL-1 que es capaz de inhibir la actividad de la proteína tirosina fosfatasa de PRL-1 para su uso en un método de tratamiento o de prevención del cáncer o de metástasis del mismo, implicando el método la administración del anticuerpo a un individuo que tiene un cáncer que expresa PRL-1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que se unen a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 intracelular
Campo
La presente invención se refiere a los campos de la medicina, biología celular, biología molecular y bioquímica. La presente invención también se refiere al campo de la medicina.
En particular, se refiere al tratamiento y diagnóstico de enfermedades, en particular, cáncer, así como composiciones para tal uso.
Antecedentes
El cáncer es un problema de salud grave en todo el mundo. Se estima que 7,6 millones de personas en el mundo murieron de cáncer en 2007. En el Reino Unido, por ejemplo, el cáncer es responsable de 126.000 muertes al año. Una de cada cuatro personas muere de cáncer.
Los tratamientos conocidos para el cáncer incluyen la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia. Muchos cánceres se pueden curar si se detectan a tiempo.
100 años atrás, el concepto de anticuerpos como "balas mágicas" fue propuesto por el químico alemán Paul Ehrlich. Los anticuerpos son capaces de reconocer y unirse a sus antígenos de una manera específica y, por lo tanto, son agentes ideales para reconocer y destruir células malignas a través del sistema inmunológico. Por este motivo, constituyen la clase de agente terapéutico humano contra el cáncer de crecimiento más rápido.
En la bibliografía se han identificado varios posibles marcadores de cáncer o tumorales y antígenos del cáncer y se han desarrollado terapias con anticuerpos contra algunos de ellos.
Por ejemplo, La conocida terapia contra el cáncer Herceptin (Trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal que puede destruir las células cancerosas positivas para HER2. Herceptin se une al antígeno HER2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano) en la célula cancerosa. Del mismo modo, Bevacizumab (Avastin™) es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), uno de los factores de crecimiento implicados en la formación de nuevos vasos sanguíneos. Al inhibir la angiogénesis, Bevacizumab evita que las células tumorales reciban un suministro constante de sangre para recibir el oxígeno y los nutrientes que el tumor necesita para sobrevivir.
Sin embargo, la aplicabilidad de los agentes terapéuticos de anticuerpos a diferentes cánceres no es universal. Una de las limitaciones que ha impedido el uso generalizado de agentes terapéuticos con anticuerpos es el gran tamaño de las moléculas de anticuerpos y su consiguiente incapacidad para atravesar el plasma o la membrana celular. En ausencia de modificación, los anticuerpos (incluidos los anticuerpos monoclonales) solo son generalmente adecuados para atacar antígenos cancerosos ubicados en la superficie o el exterior de las células hospedadoras14 15 En los ejemplos anteriores, el receptor HER2 está ubicado en la superficie celular y, por lo tanto, es accesible para la unión de anticuerpos por Herceptin. Del mismo modo, el VEGF se secreta en el torrente sanguíneo y puede unirse al bevacizumab.
Las PRL son proteínas intracelulares preniladas en el extremo C-terminal. Las formas mutantes de PRL que carecen de la señal de prenilación a menudo se localizan en núcleos16-17. La localización de PRL-1 y PRL-3 en la capa interna de la membrana plasmática y en los endosomas tempranos fue revelada por el marcaje EM immunogold18. Se ha demostrado que la sobreexpresión de PRL-3 y PRL-1 está asociada con varios cánceres humanos 3-12^ 19. Se sabe que PRL-1 y PRL-3 están asociados con metástasis tumorales. Li et al. (2006) desvela que la eliminación de microARN específico de PRL3 reduce la metástasis peritoneal de las células de cáncer gástrico in vivo. Se utilizan un anticuerpo de conejo anti PRL3 humano y un antisuero policlonal anti PRL1 para detectar las proteínas respectivas en el análisis por transferencia de Western. Se sabe que la mayoría de los pacientes con cáncer mueren por metástasis y no por su enfermedad primaria.
Existe una necesidad urgente de encontrar formas eficaces de prevenir la metástasis del cáncer. Hasta ahora no se han utilizado anticuerpos para dirigirse a antígenos intracelulares o marcadores de cáncer debido a la incapacidad de los anticuerpos para atravesar la membrana celular y la consecuente inaccesibilidad del antígeno.
Deng et al., (Int. Immunol. 2000; 12 (4) 415-423) describe autoanticuerpos antinucleares anti-Sm y anti-La que son un sello distintivo de la enfermedad autoinmune.
Sumario
La invención proporciona un anticuerpo anti-PRL-1 o anti-PRL-3 que es capaz de inhibir la actividad de la proteína tirosina fosfato de PRL-1 o PRL-3 para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer o metástasis del mismo, implicando el método la administración del anticuerpo a un individuo que tiene un cáncer que expresa PRL-1 o PRL-3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.
En la actualidad, los presentes inventores han demostrado que los anticuerpos contra PRL-1 y PRL-3 se pueden unir sorprendentemente a sus dianas intracelulares.
De acuerdo con la expectativa en la bibliografía, nunca antes se había pensado que fuera posible atacar las PRL intracelulares con anticuerpos para eliminar las células cancerosas y la metástasis del cáncer debido a su ubicación intracelular. Los presentes inventores han demostrado que este no es el caso y proporcionan anticuerpos anti-PRL-1 y anti-PRL-3 como terapias contra el cáncer, particularmente terapias para la metástasis del cáncer.
Li et al (2005) describen la generación de anticuerpos monoclonales específicos de PRL-1 y PRL-3. Sin embargo, las secuencias de estos anticuerpos y las secuencias de las regiones variables de estos anticuerpos no se han publicado. Asimismo, los hibridomas que producen estos anticuerpos no han sido ni son hasta ahora accesibles al público.
En consecuencia, los anticuerpos descritos en Li et al (2005) hasta ahora no se han puesto a disposición del público. Asimismo, no hay ninguna sugerencia de que los anticuerpos se puedan usar para la terapia del cáncer, en vista de la ubicación intracelular de PRL-1 y PRL-3.
Los presentes inventores desvelan las regiones variables de dos anticuerpos monoclonales de ratón contra PRL-1 (269 y 223) y un anticuerpo monoclonal de ratón contra PRL-3 (318). Los presentes inventores describen epítopos unidos por el anticuerpo anti-PRL-1 269 y el anticuerpo anti-PRL-3 318. Los presentes inventores describen adicionalmente métodos para producir estos anticuerpos, así como métodos para producir anticuerpos que tienen propiedades de unión iguales o similares a las de estos anticuerpos, cada uno de los cuales hasta ahora no ha sido posible.
Los presentes inventores describen un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido PRL-1 o PRL-3, en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo unido por el anticuerpo 269, anticuerpo 223 o anticuerpo 318, o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo.
El anticuerpo puede ser capaz de unirse a un epítopo en un polipéptido PRL-1 unido por el anticuerpo 269. El anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-PRL 1 capaz de unirse a un epítopo TYKNMR o TLNKFI, o ambos, o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo.
El anticuerpo puede ser capaz de unirse a un epítopo en un polipéptido PRL-3 unido por el anticuerpo 223 o el anticuerpo 318. El anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-PRL3 capaz de unirse a un epítopo KAKFYN o HTHKTR, o ambos, o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo.
El anticuerpo puede comprender la región variable del anticuerpo monoclonal 269 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4), la región variable del anticuerpo monoclonal 223 (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8) o la región variable del anticuerpo monoclonal 318 (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12).
También se describe un anticuerpo que comprende la región variable del anticuerpo monoclonal 269 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4), o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo que es capaz de unirse a PRL-1.
En el presente documento se describe un anticuerpo que comprende la región variable del anticuerpo monoclonal 223 (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8), o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo que es capaz de unirse a PRL-1.
También se describe un anticuerpo que comprende la región variable del anticuerpo monoclonal 318 (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12), o una variante homóloga, derivado o fragmento del mismo que es capaz de unirse a PRL-3. El anticuerpo puede ser capaz de unirse a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 intracelular. El anticuerpo puede ser capaz de atravesar la membrana plasmática de una célula.
El anticuerpo puede ser capaz de unirse e inhibir una actividad biológica de PRL-1 o PRL-3, preferentemente actividad de proteína tirosina fosfatasa (PTP).
El anticuerpo puede prevenir la metástasis de un cáncer, preferentemente cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de pene, cáncer de cuello de útero, cáncer cerebral, cáncer esofágico, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renales del riñón, linfoma de ovario y melanoma de piel. El cáncer puede comprender cáncer que expresa PRL-1 o PRL-3.
El anticuerpo puede comprender un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal humanizado.
Se proporciona una combinación que comprende un anticuerpo anti-PRL-1 y un anticuerpo anti-PRL-3, cada uno tal como se describe.
Los presentes inventores proporcionan una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o combinación, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable. También se describe un anticuerpo capaz de unirse a PRL-1 o PRL-3, que puede comprender un anticuerpo tal como se describe, una combinación tal como se establece anteriormente o una composición farmacéutica tal como se establece anteriormente para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer o metástasis del mismo.
El método puede comprender exponer una célula cancerosa al anticuerpo o combinación. El método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, combinación o composición a un individuo que padece o se sospecha que padece cáncer. El cáncer puede comprender un cáncer metastásico. El cáncer puede ser un cáncer que exprese PRL-1 o PRL-3.
El cáncer puede comprender cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de pene, cáncer de cuello de útero, cáncer cerebral, cáncer esofágico, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renales del riñón, linfoma de ovario y melanoma de piel.
El número de tumores metastásicos en un individuo tratado se puede reducir en al menos un 50 % en comparación con un individuo no tratado. Se puede reducir al menos en un 60 %. Se puede reducir al menos en un 70 %. Se puede reducir al menos en un 80 %. El número de tumores metastásicos en un individuo tratado se puede reducir en al menos un 90 % en comparación con un individuo no tratado.
También se describe un anticuerpo tal como se indicó anteriormente, una combinación tal como se describe o una composición farmacéutica tal como se describe para su uso en un método de diagnóstico de un cáncer o metástasis del mismo.
También se describe un kit de diagnóstico que comprende tal anticuerpo, tal combinación o tal composición farmacéutica junto con instrucciones para su uso en el diagnóstico de un cáncer o metástasis del mismo.
Los presentes inventores describen un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12, o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo que es capaz de unirse a PRL.
Los presentes inventores describen un ácido nucleico que comprende una secuencia capaz de codificar una molécula tal como se estableció anteriormente, tal como una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11, o una variante, homólogo, derivado o fragmento del mismo que es capaz de codificar un polipéptido que tiene actividad de unión a PRL.
Los presentes inventores describen una célula que comprende o se transforma con tal secuencia de ácido nucleico o un descendiente de tal célula.
Los presentes inventores describen un método de producción de un anticuerpo tal como se describe, comprendiendo el método proporcionar dicha célula y expresar el anticuerpo de la célula.
Los presentes inventores describen un método de diagnóstico de cáncer, tal como el cáncer metastásico, en un individuo, comprendiendo el método exponer una muestra biológica del individuo a un anticuerpo tal como se ha expuesto anteriormente y detectar la unión entre el anticuerpo y un polipéptido PRL-1 o PRL-3.
Los presentes inventores describen un método de tratamiento o prevención del cáncer, tal como el cáncer metastásico, en un individuo que padece o se sospecha que padece cáncer, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo tal como se describe, una combinación tal como se describe o una composición tal como se describe, al individuo.
El método puede comprender una característica tal como se establece en cualquiera de los párrafos anteriores. Los presentes inventores describen un método de tratamiento o prevención del cáncer, tal como el cáncer metastásico, en un individuo que padece o se sospecha que padece cáncer, comprendiendo el método diagnosticar el cáncer en el individuo mediante un método tal como se describe y tratar al individuo mediante un método tal como se describe.
Los presentes inventores describen un método para detectar una célula metastásica, comprendiendo el método exponer una célula candidata a un anticuerpo tal como se describió anteriormente y detectar la expresión del polipéptido PRL-1 o PRL-3 por la célula.
Los presentes inventores describen un método para producir un modelo animal para tumores metastásicos, comprendiendo el método: (a) administrar una pluralidad de células cancerosas metastásicas, tales como células cancerosas que expresan PRL-1 o PRL-3, en un primer animal; (b) permitir que las células se desarrollen en tumores metastásicos en el primer animal; (c) extraer un tumor metastásico del primer animal y obtener una línea celular del tumor metastásico; y (d) administrar una pluralidad de células de la línea celular a un segundo animal. Los presentes inventores describen un modelo animal que se puede obtener mediante dicho método.
Los presentes inventores describen el uso de un modelo animal producido por dicho método o tal como se establece anteriormente como modelo para tumores metastásicos.
Los presentes inventores describen un método que comprende las etapas de proporcionar un anticuerpo tal como se describe y permitir que el anticuerpo se una a un polipéptido PRL-1 o PRL-3.
Se puede permitir que el anticuerpo se una a una célula que exprese un polipéptido PRL-1 o un polipéptido PRL-3. El PRL-1 puede comprender un polipéptido PRL-1 intracelular. El polipéptido PRL-3 puede comprender un polipéptido PRL-3 intracelular.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto en la materia. Dichas técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley y Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press, M.J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Editado por Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Modelo animal de siete etapas para la formación rápida de metástasis de tumores pulmonares agresivos 1. Generación de grupos estables de CHO con el 50 % de células que expresan EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 tal como se describió anteriormente8.2. Inyección de 1x106 de estas células a través de la vena de la cola en la circulación de ratones desnudos. 3. Aislamiento de un solo tumor de pulmón EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 3 semanas después de la inyección. 4. Disección y picado del tumor en placas de cultivo para generar líneas celulares homogéneas que expresan EGFP-PRL (AT-3 o AT-1). 5. Inyección de 1x106 células AT-3 o AT-1 en la circulación a través de la vena de la cola de ratones desnudos. 6. Grupos no tratados: sin tratamiento, PBS o anticuerpos de ratón no relacionados. 7. Los ratones inyectados con células AT-3 se tratan con los clones n.° 223 o n.° 318 de los mAb de PRL-3 en forma de líquido ascítico o IgC purificada; mientras que los ratones inyectados con células AT-1 se tratan con PBS o se tratan con fluido ascítico del clon 269 de mAb PRL-1.
Figura 2. Los mAb de PRL-3 y PRL-1 inhiben específicamente las formaciones de sus respectivos tumores pulmonares metastásicos. A. Se inyectan 1x106 células AT3 (descritas en la Figura 1) en ratones desnudos a través de la vena de la cola. Los ratones no se tratan (a, n=10) o se tratan con PBS (b, n=10), o se tratan con dos anticuerpos no relacionados (c, n=5; d, n=5). El mAb de PRL-3223 está en forma de IgG (e) purificada o líquido ascítico (g); El mAb de PRL-3318 está en forma de IgG purificada (f) o líquido ascítico (h) administrado a través de la vena de la cola. Los diferentes anticuerpos se inyectan los días 3, 6 y 9 después de la inoculación de las células AT3. Los pulmones se diseccionan el día 15 después de la inyección y se fotografían bajo microscopía de fluorescencia para mostrar los tumores metastásicos positivos para GPF. Las imágenes a, b, e y f son pulmones de ratones hembra. Las imágenes c, d, g y h son pulmones de ratones macho. B. El número total de tumores en A se cuantifica en el eje Y como el promedio de lesiones tumorales de cada grupo, mientras que el eje X muestra los diversos grupos de ratones con diferentes tratamientos. Los resultados de los ratones inyectados con células AT-3 se muestran en las columnas 1 - 7. Los ratones inyectados con células AT-1 se tratan con PBS o con mAb 269 contra PRL-1 (columnas 8-9). n = número de ratones en cada grupo.
Figura 3. El mAb de PRL-1 bloquea específicamente tumores metastásicos de PRL-1 pero no de PRL-3; mientras que el mAb de PRL-3 bloquea específicamente tumores metastásicos de PRL-3 pero no de PRL-1. Los presentes inventores inyectaron un millón de células cancerosas (AT-1 o AT-3) ya sea EGFP-PRL-1 o -PRL-3 en cada ratón a través de la vena de la cola el día 1. Luego, los ratones se dividen en grupos que reciben respectivamente PBS, anticuerpos PRL de conejo, mAb de PRL-1 o mAb de PRL-3 a través de las venas de la cola los días 3, 6 y 9 después de las inyecciones de células cancerosas. Los pulmones (paneles: a-d) que provienen de ratones que portan células cancerosas AT-1 que expresan EGFP-PRL-1 o los pulmones (e-h) que provienen de ratones que portan células cancerosas aT-3 que expresan EGFP-PRL-3 se diseccionan y fotografían el día 15. Los tumores metastásicos PRL-1 y PRL-3 en los pulmones no se bloquean con el tratamiento simulado con PBS (a, e), pero ambos se bloquean eficazmente con anticuerpos de conejo (b, f). El mAb de PRL-1 inhibe la formación de tumores en los que se sobreexpresa PRL-1 (c) pero no cuando se sobreexpresa PRL-3 (g). De forma similar, el mAb de PRL-3 bloquea la formación de tumores metastásicos en los que se sobreexpresa PRL-3 (h) pero no cuando se sobreexpresa PRL-1 (d). Por lo tanto, estos mAb de PRL individuales son específicos para bloquear la formación de tumores metastásicos pulmonares de células que expresan el antígeno diana, respectivamente.
Figura 4. Los mAb de PRL-3 bloquean eficazmente la formación de tumores metastásicos por las células cancerosas A2780 PRL-3 positivas; pero no tienen ningún efecto sobre la formación de tumores metastásicos por células cancerosas CT26 PRL-3 negativas. A. Las células A2780, pero no CT26, expresan PRL-3 endógeno. Los lisados celulares preparados a partir de la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 y la línea celular de cáncer de ovario humano A2780 se analizan mediante análisis por transferencia de Western para detectar PRL-3. Se usa GADPH como control de carga. B. El tratamiento con anticuerpos de PRL-3 no afecta a la formación de tumores pulmonares de células CT26 PRL-3 negativas a las 2 semanas posteriores a la inoculación de células cancerosas. Todos los tejidos principales se examinan para determinar la formación de tumores. Se toman imágenes de los aspectos generales de los animales, así como de los pulmones disecados de los ratones tratados (panel a) y de los ratones no tratados (panel b). Se observa una extensa formación de tumores en todos los pulmones, como indican las flechas negras. C. El tratamiento con anticuerpos contra PRL-3 inhibe los aspectos patológicos y la formación de tumores de células positivas para A2780 PRL-3 en un ensayo de metástasis experimental 1 mes después de la inoculación de células cancerosas. Todos los tejidos principales se examinan para determinar la formación de tumores. Se obtienen imágenes del aspecto macroscópico de los animales y tumores (indicados por flechas negras) disecados de animales no tratados. No se encuentran tumores en ratones tratados.
Figura 5. La captación de anticuerpos en las células cancerosas AT-3 y las células CHO parentales se revela por inmunofluorescencia indirecta. A, EGFP-PRL-3 se expresa en todas las células aT-3 no permeabilizadas detectadas por EGFP (a, d). Algunas células están completamente marcadas con mAb de PRL-319 (flechas blancas indicadas en los paneles b, e); El 40 % de las células no permeabilizadas están parcialmente marcadas en rojo con los mAb de PRL-3; el anticuerpo internalizado parece estar distribuido de manera polarizada en los bordes de las células (flechas de una sola cabeza indicadas en f) y algo en las protuberancias de la membrana (flechas de dos cabezas indicadas en f); mientras que el resto de las células permanecieron sin marcar (células c y f en verde solamente). B. El yoduro de to-pro-3 se utiliza para teñir de azul el ADN de cada célula CHO parental. Las células vivas (10-20 %) capaces de absorber anti-GS28 de ratón se muestran en verde (a, b y c). La mayoría (60-70 %) de las células vivas que se privan de suero durante la noche pueden absorber anti-GS28 de ratón que se muestra en verde (d, e y f). Las flechas blancas indican algunas células (quizás en algunas etapas del ciclo celular) que no pueden absorber anticuerpos. Barras, 20 pm.
Figura 6. El fenómeno general de captación de anticuerpos en células normales y cancerosas se revela por inmunofluorescencia indirecta con doble tinción: A, se añaden anticuerpos anti-GS28 de ratón (en rojo) y anti-PTEN de conejo (en verde) a células normales MCF-10A no permeabilizadas. B. Se añaden anticuerpos anti-GS28 de ratón (en rojo) y anti-p53 de conejo (en verde) a células cancerosas MCF-7 no permeabilizadas. C. se añaden anticuerpos anti-GS28 de ratón (en rojo) y anti-p53 de conejo (en verde) a células MCF-7 no permeabilizadas, privadas de suero durante 16 h. El yoduro de To-pro-3 se usa para teñir el ADN (azul). Barras, 20 pm.
Figura 7. PRL-3 y PRL-1 se sobreexpresan en múltiples cánceres humanos. A. Se utilizan mAb de PRL-3 (clon 223 o 318) para examinar la expresión de PRL-3 en diversas muestras de cáncer humano. Se muestran ejemplos de sobreexpresión de PRL-3 en cánceres de colon humano (26/158 casos, a), mama (19/96 casos, b), esófago (2/13 casos, c), pulmón (d, los depósitos de humo en la parte superior derecha de la línea de puntos teñidos de negro), pene (e) y cuello uterino (f). Las señales positivas de PRL-3 se muestran en marrón mediante inmunohistoquímica con cromógeno de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Los aumentos de todas las imágenes son x400. B. Se usa mAb de PRL-1 (clon 269) para examinar la expresión de PRL-1 en diversas muestras de cáncer humano. Se muestran ejemplos de sobreexpresión de PRL-1 en colon humano (8/128 casos, a, aumento x200), cerebro (5/20 casos, b, x200) y esófago (1/13 casos, c, x400).
Figura 8. Los mAb quiméricos de PRL-3 y PRL-1 reaccionan específicamente solo a sus respectivos antígenos.
A. Se muestra un modelo para ilustrar un esquema de las principales etapas para la construcción quimérica de mAb B. Mediante IF, el mAb quimérico de PRL-3 (n.° 318) se prueba en células DLD-1 que sobreexpresan EGFP-PRL-3 (a) y demostró que el mAb quimérico de PRL-3 podría reconocer EGFP-PRL-3 en estas células (b). La imagen fusionada se muestra en c. De manera similar, el mAb quimérico de PRL-1 (n.° 269) también se prueba en células de cáncer colorrectal humano DLD-1 que sobreexpresan EGFP-PRL-1 (d) y mostró que el mAb de PRL-1 podría reconocer EGFP-PRL-1 en estas células (e). La imagen combinada se muestra en f. Barras: 20 pm. C. Por análisis por transferencia de western, el mAb quimérico de PRL-3 se evalúa en 4 lisados celulares que provienen de células DLD-1 que sobreexpresan EGFP-PRL-3 (carril 1) y células CHO que sobreexpresan myc-PRL-3 (carril 2), myc-PRL-1 (carril 3) o myc-PRL-2 (carril 4). El mAb quimérico PRL-3 solo reacciona con EGFP-PRL-3 y myc-PRL-3, pero no con myc-PRL-1 y myc-PRL-2. D. el mAb quimérico de PRL-1 se evalúa en 3 proteínas GST-PRL: GST-Pr L-1 (carril 1), GST-PRL-2 (carril 2) y GST-PRL-3 (carril 3). El mAb quimérico de PRL-1 reacciona solo con GST-PRL-1 pero no con GST-p Rl-2 y GST-PRL-3.
Figura 9. El mAb quimérico de PRL-3 inhibe considerablemente la formación de tumores metastásicos por las células A2780 y HCT116 que expresan PRL-3 endógeno; pero no las células DLD-1 que no expresan PRL-3 endógeno. A. Los lisados celulares totales se preparan a partir de células cancerosas HCT116, a 2780, DLD-1 y células DLD-1 que sobreexpresan EGFP-PRL-3. La proteína PRL-3 endógena se detecta en HCT116 y A2780 pero no en células DLD-1. El EGFP-PRL-3 exógeno solo se detecta en el carril 4. Para B, C, y D: A los ratones desnudos se les inyectan 1x106 células cancerosas a través de las venas de la cola el día 1. A los ratones se les administra mAb quimérico de PRL-3 (tratados) o PBS (sin tratar). El período de tiempo de cada experimento se determina y finaliza cuando los ratones no tratados están demasiado enfermos. Las fotos se toman al final de cada experimento. B. tratamiento para células HCT116, ratones tratados a la izquierda y ratones no tratados a la derecha. C. tratamiento para células A2780, ratones tratados a la izquierda y ratones no tratados a la derecha. D. a. tratamiento para células DLD-1, ratones tratados a la izquierda y ratones no tratados a la derecha. b. tratamiento para células DLD-1 que expresan EGFP-PRL-3, ratones no tratados a la izquierda y ratones tratados a la derecha.
Figura 10. PRL-3 potencia la formación de tumores metastásicos de pulmón y la supervivencia de las células cancerosas en la circulación sanguínea. A. Se muestran secciones de pulmón de ratones tratados y no tratados. Se observan múltiples microtumores (indicados con Micro-T) bajo microscopio de fluorescencia en la sección de pulmón de ratones no tratados, pero se encuentran menos en secciones de pulmón de ratones tratados. B. Las muestras de sangre obtenidas de las venas de la cola de ratones tratados y no tratados se untan en los portaobjetos de vidrio y se examinan en busca de células cancerosas EGFP-PRL-3 bajo un microscopio de fluorescencia. Las flechas indican las células cancerosas EGFP-PRL-3 positivas.
Figura 11. El anticuerpo quimérico PRL-3 inhibe eficazmente la formación de tumores metastásicos por las células B16F0 que expresan PRL-3 endógeno; pero no las células B16F10 que no expresan PRL-3 endógeno. A.
Los lisados de células totales se preparan a partir de células cancerosas B16F0 y B16F10. La proteína PRL-3 endógena se detecta solo en células B16F0 pero no en células B16F10. B. A los ratones desnudos se les inyecta 1x106 células B16F0 el día 1 seguido de tratamiento con mAb quimérico. Se muestran los ratones tratados a la izquierda y los ratones no tratados a la derecha. Los tumores se encuentran en las glándulas suprarrenales, el hígado, los huesos y el abdomen en ratones no tratados. El mAb de PRL-3 podría eliminar las formaciones de tumores en la mayoría de los tejidos de los ratones tratados. C. A los ratones desnudos se les inyecta 1x106 células B16F10 el día 1. Se muestran los ratones tratados en la parte superior y los ratones no tratados en la parte inferior. Se encuentran docenas de tumores metastásicos pulmonares en ratones tratados y no tratados. Figura 12. El anticuerpo 318 anti-PRL3 se une al polipéptido PRL-3 tanto intracelular como externo/secretado. A. PRL3 intracelular, B. Control de GAPDH, C. Polipéptido PRL-3 externalizado/secretado.
Figura 13. Mapeo de epítopos del anticuerpo anti-PRL1 269 y del anticuerpo anti-PRL3318. A. Péptidos unidos por el anticuerpo anti-PRL1 269 como se muestra por análisis por transferencia de Western. B. Péptidos unidos por el anticuerpo anti-PRL3318 como se muestra por análisis por transferencia de Western.
Descripción detallada
ANTICUERPOS ANTI-PRL
Los ejemplos describen la generación y producción de anticuerpos contra las proteínas PRL, es decir, anticuerpos anti-PRL. Dichos anticuerpos anti-PRL pueden ser capaces de unirse a PRL-1 o PRL-3, preferentemente PRL-1 o PRL-3 intracelular.
Tanto los anticuerpos monoclonales como los anticuerpos monoclonales humanizados y sus propiedades se describen en detalle en el presente documento y en los Ejemplos. Los anticuerpos incluyen el anticuerpo monoclonal 269, capaz de unirse a PRL-1. También incluyen el anticuerpo monoclonal 223 y el anticuerpo monoclonal 318, capaz de unirse a PRL-3. También se desvelan versiones humanizadas de cada uno de estos anticuerpos.
Para disipar cualquier duda, cuando en el presente documento se hace referencia a una designación de anticuerpo específico, esto se debe considerar para incluir una referencia tanto al anticuerpo monoclonal de ratón (segregado por un hibridoma), así como a su versión humanizada, a menos que el contexto dicte lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se hace referencia al anticuerpo 269, esto incluye tanto el anticuerpo monoclonal 269 (es decir, el anticuerpo secretado por hibridoma de ratón designado 269) como un anticuerpo monoclonal humanizado 269.
Los anticuerpos específicos descritos en el presente documento se pueden producir por un experto en la técnica a partir de la información desvelada en el presente documento, y empleando técnicas de biología molecular que también describen en detalle los presentes inventores.
Para este fin, los presentes inventores desvelan las secuencias de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 269, el anticuerpo monoclonal 223 y el anticuerpo monoclonal 318. Además, los presentes inventores desvelan variantes, homólogos, fragmentos y derivados de estas regiones variables. Usando esta información de secuencia, un experto en la materia puede producir anticuerpos que comprendan estas regiones variables o sus variantes, homólogos, fragmentos y derivados.
Además, los presentes inventores desvelan las secuencias de construcciones de ácido nucleico para expresar estos anticuerpos monoclonales. Las secuencias de estas construcciones permiten la producción de anticuerpos monoclonales que tienen secuencias idénticas a 269, 223 o 318. Además, los presentes inventores desvelan variantes, homólogos, fragmentos y derivados de 269, 223 y 318.
Finalmente, los presentes inventores desvelan las secuencias de construcciones capaces de expresar los anticuerpos monoclonales humanizados 269, 223 o 318. Los presentes inventores describen métodos para expresar los anticuerpos de interés a partir de células transfectadas con las construcciones, así como variantes, homólogos, fragmentos y derivados de estas construcciones humanizadas.
Usando tales secuencias y los métodos de expresión, el experto en la materia puede transfectar fácilmente células hospedadoras relevantes y hacer que expresen los anticuerpos anti-PRL-1 y anti-PRL3 monoclonales o humanizados completos, o variantes, homólogos, fragmentos y derivados de los mismos.
Además, los presentes inventores proporcionan polipéptidos que en general tienen actividad de unión a PRL. Dichos polipéptidos incluyen anticuerpos anti-PRL tales como anticuerpos anti-PRL-1 y anticuerpos anti-PRL3. Los polipéptidos de unión a PRL pueden comprender una o más propiedades iguales o similares a las de los anticuerpos monoclonales 269, 223 y 318. Los polipéptidos se denominarán generalmente por conveniencia "anticuerpos anti-PRL".
Está dentro de la habilidad de un lector construir moléculas de unión que pueden no ser (o no describirse como) anticuerpos o inmunoglobulinas pero que comprenden actividad de unión anti-PRL tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, y cuando el contexto lo permita, la expresión "anticuerpos anti-PRL" se debe considerar para incluir cualquier molécula siempre que sea capaz de unirse a PRL. Tales moléculas pueden incluir polipéptidos, moléculas pequeñas, así como anticuerpos e inmunoglobulinas, y pueden identificar a través de varios medios conocidos en la técnica, por ejemplo, seleccionando una biblioteca adecuada para la actividad de unión a PRL.
Los anticuerpos anti-PRL (que incluyen moléculas de unión a PRL) pueden comprender propiedades similares o idénticas a las de los anticuerpos monoclonales 269, 223 y 318. Tales propiedades similares o idénticas pueden incluir en particular propiedades de unión. Los anticuerpos anti-PRL pueden, en general, ser capaces de unirse a polipéptidos PRL, por ejemplo, PRL-1 y PRL-3.
Por lo tanto, se considerará que la expresión "anticuerpo anti-PRL" incluye los anticuerpos monoclonales 269, 223 y 318 (así como sus homólogos humanizados). También se incluyen polipéptidos que comprenden las regiones variables de los anticuerpos 269, 223 o 318 o variantes, homólogos, fragmentos y derivados de los mismos. Este término también debe tomarse para incluir referencias a variantes, homólogos, fragmentos y derivados de los anticuerpos anti-PRL, tal como se describe a continuación, cuando el contexto lo permita.
Epítopos PRL1 y PRL3
Los anticuerpos anti-PRL pueden tener la misma o similar especificidad de unión, afinidad de unión y/o afinidad de unión que 269, 223 o 318. Los anticuerpos anti-PRL se pueden unir específicamente a un epítopo unido por el anticuerpo 269, un epítopo unido por el anticuerpo 223 o un epítopo unido por el anticuerpo 318.
Se conocen en la técnica métodos para determinar un epítopo que está unido por un anticuerpo particular. Dichos métodos de mapeo de epítopos se describen, por ejemplo, en Hanson. et al., (2006). Respiratory Research, 7:126. Asimismo, un experto en la materia podrá generar anticuerpos y cribarlos en busca de propiedades particulares. En el ejemplo 27 se muestra una descripción detallada de dicho método. En consecuencia, un experto en la materia podrá identificar fácilmente anticuerpos anti-PRL que se unen a los mismos epítopos que 269, 223 y 318.
El Ejemplo 27 muestra que el anticuerpo 269 anti-PRL 1 se une a los epítopos TYKNMR y TLNKFI. En consecuencia, los presentes inventores proporcionan un anticuerpo anti-PRL tal como un anticuerpo anti-PRL 1 capaz de unirse a una secuencia TYKNMR. Además, los presentes inventores proporcionan un anticuerpo anti-PRL tal como un anticuerpo anti-PRL 1 capaz de unirse a una secuencia TLNKFI. El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a ambas secuencias.
Asimismo, el ejemplo 27 muestra que el anticuerpo anti-PRL3 se une a los epítopos KAKFYN y HTHKTR. Por lo tanto, los presentes inventores proporcionan un anticuerpo anti-PRL tal como un anticuerpo anti-PRL3 capaz de unirse a una secuencia KAKFYN. Además, los presentes inventores proporcionan un anticuerpo anti-PRL tal como un anticuerpo anti-PRL3 capaz de unirse a una secuencia HTHKTR. El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a ambas secuencias.
Los anticuerpos anti-PRL pueden comprender la región variable del anticuerpo 269, o la región variable del anticuerpo 223 o la región variable del anticuerpo 318, cada una de las cuales se describe en detalle a continuación. Pueden comprender regiones variables iguales o diferentes en una única molécula de anticuerpo. Pueden comprender una región variable o más de una región variable. En consecuencia, los presentes inventores proporcionan al experto en la materia la capacidad de producir cualquier número de anticuerpos que comprendan la misma reactividad de unión o similar a la del anticuerpo 269, 223 o 318.
Dichos anticuerpos pueden comprender las secuencias completas o sustancialmente completas de un anticuerpo (es decir, cadena pesada y cadena ligera), o pueden comprender un fragmento de un anticuerpo completo (tal como los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2 o anticuerpos monocatenarios (scFv)). Los anticuerpos pueden comprender además proteínas de fusión o proteínas sintéticas que comprenden el sitio de unión al antígeno del anticuerpo, tal como se describe en detalle a continuación. También será evidente que dichos anticuerpos se pueden diseñar para obtener propiedades deseables, tales como una menor reactividad del hospedador, un rechazo reducido, etc.
La ingeniería podría incluir la "humanización", con cuyo término los presentes inventores se refieren a la inclusión de (o sustitución con) uno o más restos o secuencias humanas en una secuencia de anticuerpo tal como una secuencia de anticuerpo de ratón. "Humanización" en el contexto del presente documento, incluye anticuerpos "quiméricos", en donde el anticuerpo comprende secciones discretas de secuencias humanas y de ratón, por ejemplo, donde una o ambas regiones variables comprenden secuencias de ratón y el resto de la molécula de anticuerpo (tal como la región constante) comprende secuencias humanas. En tales anticuerpos quiméricos, el conjunto de las regiones variables de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón o de rata se puede expresar junto con regiones constantes humanas. Esto proporciona tal anticuerpo quimérico con funciones efectoras humanas y también reduce la inmunogenicidad (HAMA) causada por la región Fc murina.
Generalmente, un "anticuerpo quimérico" puede referirse a un anticuerpo que tiene una cadena ligera y pesada codificada por una secuencia de nucleótidos derivada de un gen de inmunoglobulina murina y una cadena pesada y ligera codificada por una secuencia de nucleótidos derivada de un gen de inmunoglobulina humana.
"Humanización" también incluye anticuerpos injertados o reformados con CDR. Por los tanto, incluye la ingeniería a un nivel más discreto, por ejemplo, anticuerpos en los que se ha mutado la región variable de ratón para incluir restos humanos para reducir la inmunogenicidad. En tal anticuerpo, solo las regiones determinantes de complementariedad de las regiones V del anticuerpo de roedor se pueden combinar con las regiones marco de las regiones V humanas. Tales anticuerpos deberían ser más humanos y menos inmunogénicos que los anticuerpos quiméricos.
El anticuerpo anti-PRL generalmente puede ser capaz de unirse al polipéptido PRL en varias condiciones.
En una realización, el entorno de unión comprende una condición intracelular. Es decir, el anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a un polipéptido PRL en una célula intacta o no permeabilizada. Tal célula no permeabilizada puede comprender una célula que no ha sido expuesta, o que no ha sido expuesta sustancialmente, a un agente de permeabilización tal como un detergente (por ejemplo, Tritón X-100) o digitonina.
Un anticuerpo anti-PRL-3 tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de unirse a PRL-3 cuando está dentro de la célula, dentro de la membrana celular o encapsulado dentro de la célula. De forma similar, un polipéptido PRL-1 puede estar unido por un anticuerpo anti-PRL-1, tal como se describe generalmente en el presente documento, en el contexto de un entorno que comprende el interior de una célula. Los anticuerpos anti-PRL-1 y anti-PRL3 pueden, en particular, ser capaces de unirse a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 intracelular. El polipéptido PRL intracelular puede estar asociado con una o varias estructuras celulares, por ejemplo, la capa interna de la membrana celular, un orgánulo, una estructura citoesquelética, la membrana nuclear, etc. El polipéptido PRL puede estar ubicado dentro del núcleo. En cada uno de estos casos, el anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse al polipéptido PRL dentro del entorno intracelular.
El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a un polipéptido PRL en un entorno intracelular de varias formas. El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de atravesar la membrana plasmática. Puede ser capaz de obtener acceso de otra manera a una región de unión del polipéptido PRL, por ejemplo, por captación celular. Se puede internalizar o translocar o administrar de otro modo a la célula por cualquier medio.
En otra realización, la condición de unión comprende una condición extracelular. Por lo tanto, el anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a su polipéptido PRL afín en un entorno extracelular.
Por lo tanto, el anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse extracelularmente a un polipéptido PRL. En otras palabras, un anticuerpo anti-PRL-1 tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de unirse a PRL-1 cuando está fuera de la célula. De forma similar, un polipéptido PRL-3 puede estar unido por un anticuerpo anti-PRL-3, tal como se describe generalmente en el presente documento, en el contexto de un entorno que es externo al interior de una célula. El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse a un polipéptido PRL-1 o PRL-3 secretado, según sea el caso. El polipéptido PRL-1 o PRL-3 puede comprender un polipéptido PRL-1 o PRL-3 en circulación.
El anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de unirse para unirse a polipéptidos PRL externos o externalizados. Se pueden unir a polipéptidos PRL secretados en la circulación sanguínea.
La unión entre el anticuerpo anti-PRL y su diana puede ser más o menos fuerte o débil, transitoria, semipermanente o permanente.
La unión del anticuerpo anti-PRL al polipéptido PRL puede tener lugar dentro de la célula. Tal unión puede inactivar, inhibir o reducir una actividad del polipéptido PRL. La unión puede neutralizar la actividad de PRL. La actividad puede comprender cualquier actividad biológica causada por o asociada con el polipéptido PRL. La actividad puede comprender la unión a otra proteína, por ejemplo, una proteína o factor aguas abajo. La unión del anticuerpo anti-PRL al polipéptido PRL puede inactivar, inhibir o reducir la actividad de una proteína o factor aguas abajo. La actividad puede comprender la comunicación con otras células, por ejemplo, células tales como las células cancerosas metastásicas en circulación. Por lo tanto, los anticuerpos anti-PRL pueden neutralizar los polipéptidos PRL en la circulación sanguínea para evitar que las PRL-fosfatasas se unan a factores aguas abajo o que se comuniquen con otras células en circulación.
La actividad puede comprender una actividad bioquímica o una actividad patógena. La actividad bioquímica puede comprender una actividad catalítica. La actividad catalítica puede comprender actividad fosfatasa. La actividad puede comprender actividad reguladora del crecimiento, actividad del cáncer, actividad carcinogénica o actividad metastásica.
Los anticuerpos monoclonales 269, 223 y 318 se pueden usar para el tratamiento de enfermedades en humanos u otros animales. Los presentes inventores muestran en los ejemplos que dichos anticuerpos anti-PRL tienen actividad anticancerígena. Específicamente, los Ejemplos muestran que los anticuerpos anti-PRL son capaces de prevenir la diseminación metastásica de tumores cancerosos.
El Ejemplo 9 describe la generación de tumores que sobreexpresan PRL en ratones y proporciona un modelo animal para la metástasis y la terapia del cáncer. Los ejemplos 10 a 12 muestran que los animales tratados con anticuerpos anti-PRL muestran significativamente menos tumores pulmonares metastásicos en comparación con los animales no tratados con anticuerpos anti-PRL. Específicamente, los animales tratados muestran aproximadamente un 90% menos de tumores que los animales no tratados. Los anticuerpos anti-PRL son capaces de unirse para bloquear la actividad del polipéptido PRL, a pesar de su localización intracelular. Los estudios de los presentes inventores representan los primeros ejemplos de bloqueo eficaz (~ 90 %) de la metástasis mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra sus respectivas fosfatasas a pesar de su localización intracelular.
Los presentes inventores también muestran que los anticuerpos monoclonales anti-PRL-3 bloquean eficazmente la formación de tumores metastásicos por una línea celular de cáncer de ovario humano A2780 que expresa la proteína PRL-3 endógena.
En consecuencia, los presentes inventores proporcionan el uso de anticuerpos anti-PRL en el tratamiento o prevención de enfermedades, tal como cáncer. El cáncer puede comprender un cáncer metastásico. Los anticuerpos anti-PRL se pueden usar como medicamentos o terapias para tratar la metástasis de un cáncer, tal como un tumor establecido. Se pueden usar para prevenir el cáncer o metástasis del mismo.
El cáncer que se puede tratar o prevenir puede incluir uno que esté asociado con la expresión o sobreexpresión de una proteína PRL. La proteína p Rl puede ser un miembro relevante de la familia. Con esto, los presentes inventores quieren decir que un cáncer que está asociado con la expresión o sobreexpresión de PRL-1 se puede tratar o prevenir con un anticuerpo anti-PRL-1 como 269, o un anticuerpo que tenga propiedades similares o idénticas. De forma similar, un cáncer que está asociado con la expresión o sobreexpresión de PRL-3 se puede tratar o prevenir con un anticuerpo anti-PRL-3 como 223 o 318, o un anticuerpo que tenga propiedades similares o idénticas.
El cáncer puede incluir cualquiera de varios cánceres, tal como el cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de pene, cáncer de cuello de útero, cáncer cerebral, cáncer esofágico, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renales del riñón, linfoma de ovario y melanoma de piel.
El tratamiento puede comprender generalmente poner en contacto una célula cancerosa, o una célula sospechosa de ser una célula cancerosa, con un anticuerpo anti-PRL. La célula se puede exponer a un anticuerpo anti-PRL-1. Puede o además estar expuesto a un anticuerpo anti-PRL-3. Puede estar expuesto tanto a un anticuerpo anti-PRL-1 como a un anticuerpo anti-PRL-3. Cuando esto es así, la célula se puede exponer a ambos anticuerpos juntos o individualmente en secuencia. La exposición se puede repetir varias veces. Cualquier combinación de anticuerpo anti-PRL-1 y un anticuerpo anti-PRL-3 en cualquier cantidad o cantidad relativa, en cualquier momento de exposición, se puede usar.
Por lo tanto, los presentes inventores proporcionan el uso de combinaciones de anticuerpos anti-PRL-1 y anticuerpos anti-PRL-3, tal como se describe anteriormente, en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer.
La célula puede ser una célula individual o puede estar en una masa celular, tal como un cáncer o una masa de células tumorales. La célula puede estar dentro del cuerpo de un organismo. El organismo puede ser uno del que se sabe que padece cáncer, o podría ser uno en el que se sospecha cáncer. El tratamiento puede comprender la administración del anticuerpo o anticuerpos al organismo. Como anteriormente, se puede administrar un solo anticuerpo, o se puede administrar una combinación de anticuerpo anti-PRL-1 y un anticuerpo anti-PRL-3. La administración puede ser simultánea o secuencial, tal como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, el tratamiento puede comprender administrar un anticuerpo anti-PRL-1 de forma simultánea o secuencial con un anticuerpo anti-PRL-3 al individuo.
El anticuerpo anti-PRL generalmente puede comprender cualquier inmunoglobulina capaz de unirse a una molécula de PRL, como se describe con mayor detalle a continuación.
PRL-1
El siguiente texto está adaptado de la entrada OMIM 601585.
PRL-1 también se conoce como proteína-tirosina fosfatasa, Tipo 4a, 1; PTP4A1, fosfatasa de regeneración hepática 1, PTP (CAAX1). La ubicación cromosómica de PRL-1 se encuentra en el locus 6q12 del mapa de genes.
Los procesos celulares que involucran el crecimiento, la diferenciación y el metabolismo a menudo se regulan en parte por la fosforilación y desfosforilación de proteínas. Las proteínas tirosina fosfatasas (PTP), que hidrolizan los monoésteres de fosfato de residuos de tirosina, comparten todas un motivo de sitio activo común y se clasifican en 3 grupos.
Estos incluyen las PTP similares a receptores, las PTP intracelulares y las PTP de especificidad dual, que pueden desfosforilar en restos de serina y treonina, así como en tirosinas.
Diamond et al.1994, Cell. Biol. 14: 3752-3762, describió una PTP de la regeneración del hígado de rata que es miembro de una cuarta clase. El gen, que designaron Prl1, fue uno de los muchos genes tempranos inmediatos y se expresó principalmente en el núcleo. La sobreexpresión de Prl1 en células transfectadas de forma estable dio como resultado un fenotipo transformado, lo que sugirió que puede desempeñar algún papel en la tumorigénesis.
Usando un cribado de prenilación in vitro, Cates et al., 1996, Cancer Lett. 110: 49-55, aislaron 2 ADNc humanos que codifican homólogos de PRL1, designados PTP (CAAX1) y PTP (CAAX2) (PRL2; 601584), que están farnesilados in vitro por farnesil de mamífero: proteína transferasa. La sobreexpresión de estos PTP en células epiteliales provocó un fenotipo transformado en células cultivadas y crecimiento tumoral en ratones desnudos. Los autores concluyeron que PTP(CAAX1) y PTP(CAAX2) representan una nueva clase de PTP isoprenilados, oncogénicos.
Peng et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 17286-17295, informó que el gen humano PTP(CAAX1), o PRL1, está compuesto por 6 exones y contiene 2 promotores. Las proteínas PRL1 de ratón, rata y humano predichas son idénticas. Zeng et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 421-427, determinó que las proteínas PRL1 y PRL2 humanas comparten una identidad de secuencia de aminoácidos del 87 %. Por FISH, Peng et al. (1998) mapearon el gen PRL1 en 6q12.
Cuando se utiliza el término "PRL-1", esto se debe tomar para referirse a cualquier secuencia de PRL-1, incluyendo una proteína PRL-1 o un ácido nucleico PRL-1 y cualquier fragmento, variante, homólogo, derivado, variantes de los mismos.
Las propiedades y actividades de PRL-1 se describen en el presente documento, por ejemplo, en las referencias. [Fin del texto adaptado de OMIM]
Las proteínas PRL-1 humanas y de ratón se describieron en detalle en Zeng et al (1998), citado anteriormente. SECUENCIAS DE PRL-1
Los métodos y composiciones descritas en el presente documento hacen uso de polipéptidos PRL-1, que se describen con detalle a continuación. Como se utiliza en el presente documento, el término "PRL-1" pretende hacer referencia a una secuencia establecida en la Tabla D1 a continuación.
Tabla D1. Secuencias de PRL-1
Unigene Descripción
NM_003463.3 Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 1 (PTP4A1), clon de ADNc de ARNm de longitud completa CS0DK012YJ03 de células HeLa Cot 25 normalizado de Homo sapiens
CR602427.1 (humano)
clon de ADNc de longitud completa CL0BB007ZF05 de neuroblastoma de Homo sapiens (humano) clon de ADNc de longitud completa CS0DK010YM06 de células HeLa Cot 25 CR599216.1 normalizado de Homo sapiens
CR596545.1 (humano)
CR749458.1 ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp779M0721 (del clon DKFZp779M0721)
Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 1, ARNm (clon de ADNc MGC: BC045571.1 57320 IMAGEN: 4826233), cds completos
AJ420505.1 inserto de ARNm de longitud completa de Homo sapiens clon de ADNc EUROIMAGE 2096405 AK312526.1 ADNc de Homo sapiens, FLJ92892
Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 1, ARNm (clon de ADNc MGC: BC023975.2 1659 IMAGEN: 2960001), cds completos
U69701.1 ARNm de proteína tirosina fosfatasa hPRL-1N humana, cds parciales
ARNm de la proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens PTPCAAX 1 (hPTPCAAX1), cds U48296.1 completas
ADNc de cabeza embrionaria de Mus musculus de 16 días, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon:C130021 B01 producto: proteína tirosina fosfatasa 4a1, secuencia AK081491.1 de inserción completa
ADNc del bulbo raquídeo masculino adulto de Mus musculus, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: 6330521 E 18 producto: proteína tirosina fosfatasa 4a1, AK078120.1 secuencia de inserción completa
Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a1, ARNm (clon de ADNc MGC:62623 IMAGEN: BC055039.1 6396041), cds completos
ADNc de Mus musculus, clon Y1G0132L24, hebra:menos, referencia: ENSEMBL: transcito de AK199907.1 ratón ENST: ENSMUST00000061959, basado en la búsqueda BLAT
ADNc de Mus musculus, clon Y1G0129D05, hebra:más, referencia: ENSEMBL: transcrito de AK198788.1 ratón ENST: ENSMUST00000061959, basado en la búsqueda BLAT
ADNc de Mus musculus, clon Y1G0109N22, hebra:más, referencia: ENSEMBL: transcito de AK192767.1 ratón ENST: ENSMUST00000055216, basado en la búsqueda BLAT
ADNc de Mus musculus, clon Y0G0140O11, hebra:más, referencia: ENSEMBL: transcito de AK187266.1 ratón ENST: ENSMUST00000061959, basado en la búsqueda BLAT
Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a1, ARNm (clon de ADNc MGC:102117 IMAGEN: BC086787.1 30538771), cds completos
Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a1, ARNm (clon de ADNc MGC:102501 IMAGEN: BC094447.1 3990529), cds completos
ADNc de macrófagos de la médula ósea de Mus musculus, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto I830008L20:proteína tirosina fosfatasa 4a1, secuencia de AK150506.1 inserción completa
ADNc de células de Mus musculus B16 F10Y, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon:G370079M23 producto: proteína tirosina fosfatasa 4al, secuencia de inserción AK148288.1 completa
ADNc de macrófagos de la médula ósea de Mus musculus, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto I830031H07:proteína tirosina fosfatasa 4a1, secuencia de AK151533.1 inserción completa
U84411.1 ARNm de proteína tirosina fosfatasa (PRL-1) de Mus musculus, cds completas NM_011200.2 Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a1 (Ptp4a1), ARNm
BC003761.1 Mus musculus, proteína tirosina fosfatasa 4al, clon IMAGEN:3590144, ARNm
BC031734.1 Mus musculus, proteína tirosina fosfatasa 4al, clon IMAGEN:3157812, ARNm
Un "polipéptido PRL-1" puede comprender o consistir en un polipéptido PRL-1 humano, tal como la secuencia que tiene el número de referencia de Unigene NM_003463.3.
Las variantes homólogas y derivados de las mismas de cualquiera, algunos o todos estos polipéptidos también se incluyen. Por ejemplo, PRL-1 puede incluir el número de referencia de Unigene U84411.1.
PRL-3
El siguiente texto está adaptado de la entrada OMIM 606449.
PRL-3 también se conoce como proteína-tirosina fosfatasa, Tipo 4A, 3; PTP4A3. La ubicación cromosómica de PRL-3 se encuentra en el locus 8q24.3 del mapa de genes.
En el corazón, las proteínas quinasas regulan la contractilidad, el transporte de iones, el metabolismo y la expresión génica. Las fosfatasas, además de su papel en la desfosforilación, están involucradas en la hipertrofia y disfunción cardíaca.
Mediante la búsqueda en la base de datos y el cribado de una biblioteca de ADNc de corazón, Matter et al. 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 283: 1061-1068 identificó un ADNc que codifica PTP4A3, que denominaron PRL3. La proteína PRL3 deducida es idéntica al 76 % a PRL1 (PTP4A1; 601585) e idéntica al 96 % a Prl3 de ratón. El análisis por transferencia de Northern reveló la expresión de una transcrito de PRL3 de aproximadamente 2,3 kb predominantemente en el corazón y el músculo esquelético, con menor expresión en el páncreas. Este patrón de expresión es distinto de la expresión más amplia de PRL1 y PRL2 (PTP4A2; 601584). El análisis de hibridación in situ localizó la expresión de PRL3 en cardiomiocitos. El análisis en gel de Tris-glicina mostró que PRL3 se expresa como una proteína de 22 kD. Los análisis funcionales y de mutación indicaron que la escisión del fosfato depende de cys104 de PRL3. La sobreexpresión de PRL3 dio como resultado un aumento del crecimiento celular. El análisis por transferencia de Western mostró desfosforilación de p130cas (BCAR1; 602941) en respuesta a la angiotensina II (106150), lo que sugiere un papel de PRL3 en la modulación de los calcios transicionales intracelulares inducidos por la angiotensina II.
Para comprender mejor la base molecular de la metástasis, Saha et al. 2001, Science 294: 1343-1346 comparó el perfil de expresión génica global del cáncer colorrectal metastásico con el de los cánceres primarios, tumores colorrectales benignos y epitelio colorrectal normal. PRL3 se expresó en niveles altos en cada una de las 18 metástasis de cáncer estudiadas, pero en niveles más bajos en tumores no metastásicos y epitelio colorrectal normal. En 3 de 12 metástasis examinadas, se encontraron múltiples copias del gen PRL3 dentro de un pequeño amplicón ubicado en el cromosoma 8q24.3. Saha et al. (2001) concluyeron que el gen PRL3 es importante para la metástasis del cáncer colorrectal.
Usando el panel híbrido de radiación Stanford G3 y el análisis de secuencia de la base de datos, Saha et al. (2001) mapearon el gen PRL3 en el marcador circundante 145.20. El gen PRL3 también está estrechamente ligado al marcador SHGC-22154, que se encuentra en 8q24.3, aproximadamente a 3 Mb del telómero 8q.
[Fin del texto adaptado de OMIM]
Las proteínas PRL-3 humanas y de ratón se describieron en detalle en Li et al (2005), Clin Cancer Res;11:2195-204.
SECUENCIAS DE PRL-3
Los métodos y composiciones descritas en el presente documento hacen uso de polipéptidos PRL-3, que se describen con detalle a continuación. Como se utiliza en el presente documento, el término "PRL-3" pretende hacer referencia a una secuencia establecida en la Tabla D2 a continuación.
Unigene Descripción
ARNm de la proteína tirosina fosfatasa hPRL-3 de Homo sapiens potencialmente prenilada, AF041434.1 cds completas
BT007303.1 Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, ARNm miembro 3, cds completas AK128380.1 ADNc FLJ46523 fis de Homo sapiens, clon THYMU3034099
Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 3 (PTP4A3), variante de NM_007079.2 transcrito 2, ARNm
AY819648.1 ARNm de proteína 2 de Homo sapiens transregulada por p7 del VHC, cds completas Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 3, ARNm (clon de ADNc BC003105.1 MGC: 1950 IMAGEN: 3357244), cds completos
Proteína tirosina fosfatasa de Homo sapiens tipo IVA, miembro 3 (PTP4A3), variante de NM 032611.1 transcrito 1, ARNm
AK311257.1 ADNc de Homo sapiens, FLJ18299
U87168.1 ARNm de hPRL-R homólogo de proteína tirosina fosfatasa humana, cds parciales AJ276554.1 ARNm de Homo sapiens para la proteína tirosina fosfatasa hPRL-3, forma corta
Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a3, ARNm (clon de ADNc MGC:90066 IMAGEN: BC066043.1 6415021), cds completos
ADNc de Mus musculus, clon Y1G0102103, hebra:más, referencia: ENSEMBL: transcito de AK190358.1 ratón ENST: ENSMUST00000053232, basado en la búsqueda BLAT
Clon de ADNc de marco de lectura abierto completo de Mus musculus RZPDo836H0950D para el gen Ptp4a3, proteína tirosina fosfatasa 4a3; cds completas, incl. codón de parada CT010215.1
ADNc de LÍNEA CELULAR INDEFINIDA_ de cerebro de Mus musculus macho, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon:M5C1053F14 producto: proteína tirosina AK147489.1 fosfatasa 4a3, secuencia de inserción completa
ADNc de bazo activado de Mus musculus, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto F830102P03:proteína tirosina fosfatasa 4a3, secuencia de inserción AK172192.1 completa
ADNc de bazo de Mus musculus neonato de 6 días, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto F430011C20:proteína tirosina fosfatasa 4a3, secuencia AK143702.1 de inserción completa
ARNm de proteína tirosina fosfatasa mPRL-3 (Prl3) potencialmente prenilada de Mus AF035645.1 musculus, cds completas
NM_008975.2 Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a3 (Ptp4a3), ARNm
ADNc de piel de Mus musculus neonato de 0 días, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto 4632430E19:proteína tirosina fosfatasa 4a3, secuencia AK014601.1 de inserción completa
ADNc de pulmón de Mus musculus macho adulto, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto 1200003F10:proteína tirosina fosfatasa 4a3, secuencia AK004562.1 de inserción completa
ADNc de cuerpo entero de embrión de Mus musculus de 18 días, Biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: Producto 1110029E17:proteína tirosina fosfatasa 4a3, AK003954.1 secuencia de inserción completa
Mus musculus proteína tirosina fosfatasa 4a3, ARNm (clon de ADNc MGC:36146 IMAGEN: BC027445.1 4482106), cds completos
Un "polipéptido PRL-3" puede comprender o consistir en un polipéptido PRL-3 humano, tal como la secuencia que tiene el número de referencia de Unigene AF041434.1.
Las variantes homólogas y derivados de las mismas de cualquiera, algunos o todos estos polipéptidos también se incluyen. Por ejemplo, PRL-3 puede incluir el número de referencia de Unigene BC066043.1.
POLIPÉPTIDOS PRL-1 Y PRL-3
Los polipéptidos PRL-1 y PRL-3 se pueden usar para varios medios, por ejemplo, para la producción o selección de agentes anti-PRL-1 y anti-PRL-3 tales como agentes aglutinantes específicos de PRL-1 y PRL-3, en particular, anticuerpos anti-PRL. Esto se describe con más detalle a continuación. La expresión de los polipéptidos PRL-1 y PRL-3 se puede detectar para el diagnóstico o la detección de cáncer, en particular cáncer de mama.
Un "polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, habitualmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes.
Los "polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácidos modificadas mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en este campo. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones.
Los polipéptidos pueden ramificarse como resultado de la ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos postraduccionales naturales o pueden realizarse mediante métodos de síntesis. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, Proteins -Structure and Molecular Properties, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pág. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 y Rattan et al, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62.
El término "polipéptido" incluye las diversas variaciones de péptidos sintéticos conocidas en la técnica, tales como péptidos retroinverso D. El péptido puede ser un determinante antigénico y/o un epítopo de linfocitos T. El péptido puede ser inmunogénico in vivo. El péptido puede ser capaz de inducir anticuerpos neutralizantes in vivo.
Aplicado a PRL-1 y PRL-3, la secuencia de aminoácidos resultante puede tener una o más actividades, tales como actividades biológicas en común con un polipéptido PRL-1 o PRL-3, por ejemplo, un polipéptido PRL-1 o PRL-3 humano. Por ejemplo, un homólogo de PRL-1 o PRL-3 puede tener un mayor nivel de expresión en las células cancerosas en comparación con las células de mama normales. En particular, el término "homólogo" abarca la identidad con respecto a la estructura y/o función siempre que la secuencia de aminoácidos resultante tenga actividad PRL-1 o PRL-3. Con respecto a la identidad de secuencia (es decir, similitud), puede haber al menos el 70 %, tal como al menos el 75 %, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 % de identidad de secuencia. Puede haber al menos el 95 %, tal como al menos el 98 %, de identidad de secuencia. Estos términos también abarcan polipéptidos derivados de aminoácidos que son variaciones alélicas de la secuencia de ácido nucleico de PRL-1 o PRL-3.
Cuando se hace referencia a la "actividad" o "actividad biológica" de un polipéptido tal como PRL-1 y PRL-3, estos términos están destinados a hacer referencia a la función metabólica o fisiológica de PRL-1 y PRL-3, incluyendo actividades similares o actividades mejoradas o estas actividades con efectos secundarios indeseables disminuidos. También se incluyen las actividades antigénicas e inmunogénicas de PRL-1 y PRL-3. Ejemplos de tales actividades y métodos de ensayo y cuantificación de estas actividades, son conocidos en la técnica y se describen en detalle en otra parte en el presente documento.
ANTICUERPOS
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina", tal como se usan en el presente documento, se pueden emplear indistintamente cuando el contexto lo permita. Estos términos incluyen fragmentos de porciones de una molécula de anticuerpo escindidas proteolíticamente o preparadas de forma recombinante que son capaces de reaccionar selectivamente con o reconocer PRL-1 o PRL-3 o un epítopo de los mismos, tal como un epítopo de PRL-1 unido por 269 o un epítopo de PRL-3 unido por 223 o 318.
Los epítopos de PRL-1 incluyen TYKNMR y TLNKFI. Los epítopos de PRL-3 incluyen KAKFYN y HTHKTR.
Los ejemplos no limitantes de tales fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen los fragmentos Fab, F(ab')2, Fab', Fv y anticuerpos monocatenarios (scFv) que contienen un dominio VL y VH unidos por un enlazador peptídico. Estos Fv pueden estar unidos covalentemente o no covalentemente para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de unión.
Por "moléculas ScFv" nos referimos a moléculas en las que los dominios asociados VH y VL están enlazados mediante un oligopéptido flexible. En Winter y Milstein (1991) Nature 349, 293--299 se encuentra una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de unión específicos.
Los anticuerpos completos y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalente" se entiende que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab') tienen dos sitios de combinación de antígenos. Por el contrario, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes y tienen solo un sitio de combinación de antígeno.
El anticuerpo anti-PRL puede comprender un anticuerpo de alta afinidad con una tasa de disociación de 10'2s_1 a 10' V . La tasa de disociación puede ser de aproximadamente 2 x 10‘4s’1.
El término "tasa de disociación" tal como se usa en este documento se refiere a la tasa de disociación (koff) de un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-PRL desvelado en el presente documento. Se puede medir utilizando el programa informático BIAevaluation (Pharmacia). Es deseable una baja tasa de disociación, ya que refleja la afinidad de un fragmento Fab por un antígeno.
El término "afinidad" se define en términos de la tasa de disociación (koff) de un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-PRL. Cuanto menor sea la tasa de disociación, mayor será la afinidad que tiene un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-PRL por un antígeno tal como PRL-1 o PRL-3.
El anticuerpo anti-PRL puede comprender un péptido per se o formar parte de una proteína de fusión.
Los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento incluyen cualquier anticuerpo que comprenda actividad de unión a PRL-1 o PRL-3, tales como capacidad de unión a PRL-1 o p RL-3 intracelular o unión al mismo epítopo unido por 269, 223 o 318, según sea el caso, incluyendo TYKNMR, TLNKFI, KAKFYN y HTHKTR.
Los anticuerpos anti-PRL también incluyen el anticuerpo entero o completo, ya sea ratón, humanizado o humano, derivados de tales anticuerpos y fragmentos biológicamente activos. Estos pueden incluir fragmentos de anticuerpos con actividad de unión a PRL-1 o PRL-3 que tienen sustituciones de aminoácidos o tienen azúcares u otras moléculas unidas a grupos funcionales de aminoácidos, etc.
El anticuerpo anti-PRL puede comprender un anticuerpo aislado o un anticuerpo purificado. Se puede obtener o producir mediante cualquier fuente adecuada, ya sea natural o no, o puede ser un anticuerpo anti-PRL sintético, un anticuerpo anti-PRL semisintético, un anticuerpo anti-PRL derivatizado o un anticuerpo anti-PRL recombinante. Cuando el anticuerpo anti-PRL es un anticuerpo anti-PRL no natural, puede incluir al menos una parte del cual se ha preparado mediante técnicas de ADN recombinante o un anticuerpo anti-PRL producido mediante técnicas de síntesis química o combinaciones de las mismas.
El término "derivado", tal como se usa en el presente documento, incluye la modificación química de un anticuerpo anti-PRL. Ilustrativo de tales modificaciones sería el reemplazo de hidrógeno por un alquilo, acilo o grupo amino, por ejemplo. La secuencia del anticuerpo anti-PRL puede ser la misma que la de la forma natural o puede ser una variante, homólogo, fragmento o derivado de los mismos.
REGIONES VARIABLES DE ANTICUERPOS
La expresión "región variable", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las regiones variables, o dominios, de las cadenas ligeras (VL) y cadenas pesadas (VH) que contienen los determinantes de la especificidad de reconocimiento de la unión y de la afinidad general del anticuerpo contra PRL-1 o PRL-3 (o variante, homólogo, fragmento o derivado), según sea el caso.
Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) participan en el reconocimiento del antígeno y forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada dominio tiene cuatro regiones marco (FR), cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectados por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las regiones FR mantienen la integridad estructural del dominio variable. Las CDR son los segmentos polipeptídicos dentro del dominio variable que median la unión del antígeno.
La expresión "región constante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a los dominios de la cadena ligera (CL) y pesada (CH) del anticuerpo (o variante, homólogo, fragmento o derivado) que proporcionan estabilidad estructural y otras funciones biológicas tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria y unión del complemento, pero que no están implicados en la unión de un epítopo PRL-1 o PRL-3. La secuencia de aminoácidos y las secuencias de exón correspondientes en los genes de la región constante dependerán de la especie de la que proviene. Sin embargo, las variaciones en la secuencia de aminoácidos que conducen a los alotipos son relativamente limitadas para regiones constantes particulares dentro de una especie. Un "alotipo" es un determinante antigénico (o epítopo) que distingue genes alélicos.
La región variable de cada cadena está unida a la región constante por una secuencia polipeptídica de enlace. La secuencia de enlace está codificada por una secuencia "J" en el gen de la cadena ligera y una combinación de una secuencia "D" y una secuencia "J" en el gen de la cadena pesada.
ANTICUERPOS 269, 223 Y 318: SECUENCIAS DE REGIONES VARIABLES
Anticuerpo 269
La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 269 es la siguiente (SEQ ID NO: 1):
GGGAATTCATGAAATGCAGCTGGGTTATTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACT
CCCAGGTCCAGTTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGT
CCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTTACTAGTTATCGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTG
GACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGA
AGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGA
GCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGCTATGGTAACTTCGGCTACT
GGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCC
TCGTAAGCTTGGGA
La secuencia de aminoácido de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 269 es la siguiente (SEQ ID NO: 2):
EFMKCSWVILFLFSVTAGVHSQVQFQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYRMHWVKQRPG
QGLEW IGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYGNFGYW
GQGTTLTVSSESQSFPNVFPLVSLG
La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 269 es la siguiente (SEQ ID NO: 3):
CTGTCTACTGCTCTCTGGTGAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTA
GCTTAAACTGGCTTCAGCAGAAAGCAGATGGAACCATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCA
GTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCA
CCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTC
CGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCTCACTGGA
GATCCTGCAGATCACGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA
GCAGTTGAAATCT
La secuencia de aminoácido de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 269 es la siguiente (SEQ ID NO: 4):
VYCSLVRVSLTCRASQDIGSSLNW LQQKADGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLT
ISSLESEDFVDYYCLQYASSPW TFGGGTKLEIKRADAAPHW RSCRSRELW LHHLSSSSRHLMS
S
Anticuerpo 223
La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 223 es la siguiente (SEQ ID NO: 5):
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATT
GCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATAT
CCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG
GACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTGAGTACAATGAGA
AGTTCAGGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA
GCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGGAATTACCCCT
GGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCAC
CCGTCTATCCCTTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
La secuencia de aminoácido de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 223 es la siguiente (SEQ ID NO: 6):
EFMEW SW VILFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHW VKQRPG
QGLEW IGW IYPGNVNTEYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEERNYPW
FAYWGQGTLVTVSAAKTTP P PVY PLVPGSLG
La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 223 es la siguiente (SEQ ID NO: 7):
TGGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCC
ACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCC
ACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGAAGATGATGGTGAAAATTATATGAACTGGTAC
CAACAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGG
ATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTG
GAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGC
TCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCA
TCCAGTAAGCTTGGG
La secuencia de aminoácido de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 223 es la siguiente (SEQ ID NO: 8):
WEFMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVEDDGENYMNWY
QQKPGQSPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFG
SG TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
Anticuerpo 318
La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 318 es la siguiente (SEQ ID NO: 9):
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATT
GCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATAT
CCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG
GACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTTATTACAATGAGA
AGTTCAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAG
CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGAATTACCCCTGG
TTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCC
GTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
La secuencia de aminoácido de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo monoclonal 318 es la siguiente (SEQ ID NO: 10):
EFMEWSWVFLFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNYYMHWVKQRPG
QGLEWIGWIY PGNVNTYYNEKFRAR PH. LQTNPPAQPTCSSAA. PLRTLRSISVQ VRREL PLV
CLLGPRDSGHCLCSQNDTPIRLSPGPWKLG
La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 318 es la siguiente (SEQ ID NO: 11):
ACTAGTCGACATGGAGTCAGACACACTGCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTC
CACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGC
CACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAA
CCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGG
GGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGT
GGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGG
GGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCC
ATAAGCTTGGGA
La secuencia de aminoácido de la cadena ligera de la región variable del anticuerpo monoclonal 318 es la siguiente (SEQ ID NO: 12):
LVDMESDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWN
QQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEG
GPSWK
Los anticuerpos anti-PRL1 y anti-PRL3, de acuerdo con los métodos y composiciones descritas en el presente documento, se pueden generar a partir de estas secuencias de regiones variables mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de cadena pesada y ligera se pueden recombinar en una secuencia constante para un anticuerpo elegido, mediante técnicas de ingeniería genética recombinante que son conocidas por los expertos.
Las secuencias de regiones constantes son conocidas en la técnica y están disponibles en varias bases de datos, tales como la base de datos IMGT/LIGM-DB (descrita en Giudicelli et al, 2006, Nucleic Acids Research 34(Database Issue):D781-D784 y LeFranc et al (1995) LiGM-DB/IMGT: An Integrated Database of Ig and TcR, Part of the Immunogenetics Database. Annals of the New York Academy of Sciences 764 (1), 47-47 doi:10.11 11/j.1749-6632.1995.tb55805.x) y la base de datos IMGT/GENE-DB (descrita en Giudicelli et al, 2005, Nucleic Acids Res. 1 de enero de 2005; 33 (edición de base de datos): D256-61). iMg T/LIGM-DB e IMGT/GENE-d B forman parte de la base de datos ImMunoGeneTics ubicada en www.ebi.ac.uk/imgt/.
Los métodos para combinar regiones variables con secuencias dadas y regiones constantes para producir anticuerpos completos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el Ejemplo 16 y en Hanson. et al., (2006). Respiratory Research, 7:126. Los fragmentos de anticuerpos completos tales como los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2 o los anticuerpos monocatenarios (scFv) se pueden producir por medios conocidos en la técnica.
Usando las secuencias desveladas y los métodos descritos en las referencias, por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de la región variable del anticuerpo 318, que tienen las secuencias que se muestran arriba, se puede fusionar transgénicamente a una secuencia de región constante de IgG de ratón para producir un anticuerpo monoclonal anti-PRL-3 de ratón. De forma similar, la región variable 318 se puede expresar de manera recombinante con la región constante de un anticuerpo IgG humano para producir un anticuerpo anti-PRL-3 humanizado. Las regiones variables de los anticuerpos 223 y 269 se pueden diseñar con regiones constantes de IgG de ratón o humano para producir anticuerpos monoclonales o humanizados de ratón capaces de unirse al polipéptido PRL-1.
MÉTODOS DE DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO
Detección de expresión de PRL-1 y PRL-3
La expresión de PRL-1 y PRL-3 en el tejido canceroso se regula positivamente en comparación con el tejido normal.
En consecuencia, los presentes inventores proporcionaron un método de diagnóstico de cáncer, incluyendo el cáncer metastásico, agresivo o invasivo, que comprende detectar la modulación de la expresión de PRL-1 y PRL-3, tal como la regulación positiva de la expresión de PRL-1 y PRL-3 en una célula o tejido de un individuo.
El método puede comprender el uso de los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento. Los anticuerpos anti-PRL se pueden usar en inmunoensayos para detectar y analizar la cantidad de PRL-1 o PRL-3 en una muestra biológica y, por lo tanto, proporcionar una indicación del nivel de expresión de PRL-1 o PRL-3 en una célula, tejido, órgano o individuo del que se obtiene la muestra. Los inmunoensayos incluyen ELISA, análisis por transferencia de Western, etc., y el lector experto conoce los métodos para emplearlos para evaluar la expresión de PRL-1 y PRL-3.
La detección de la expresión, actividad o cantidad de PRL-1 y PRL-3 se puede usar para proporcionar un método para determinar el estado proliferativo de una célula. Por lo tanto, una célula proliferativa es aquella con altos niveles de expresión, actividad o cantidad de PRL-1 y PRL-3, en comparación con una célula normal. De forma similar, una célula no proliferativa puede ser una con niveles bajos de expresión, actividad o cantidad de PRL-1 y PRL-3, en comparación con una célula normal.
Tal detección también se puede usar para determinar si una célula se volverá invasiva o agresiva. Por lo tanto, la detección de un alto nivel de expresión de PRL-1 y PRL-3, la cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 en la célula puede indicar que es probable que la célula sea o se vuelva agresiva, metastásica o invasiva. De forma similar, si una célula tiene un nivel bajo de expresión, cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3, la célula no es o no es probable que sea agresiva, metastásica o invasiva.
Se apreciará que como el nivel de PRL-1 y PRL-3 varía con la agresividad de un tumor, esa detección de expresión, cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 también se puede usar para predecir la tasa de supervivencia de un individuo con cáncer, es decir, niveles altos de PRL-1 y PRL-3 que indican una tasa o probabilidad de supervivencia más baja y niveles bajos de PRL-1 y PRL-3 que indican una tasa o probabilidad de supervivencia más alta, ambos en comparación con individuos o poblaciones afines con niveles normales de PRL-1 y PRL-3. La detección de la expresión, la cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 se puede usar, por lo tanto, como un método de pronóstico de un individuo con cáncer.
La detección de la expresión, la cantidad o el nivel de PRL-1 y PRL-3 se puede usar para determinar la probabilidad de éxito de una terapia particular en un individuo con cáncer. Se puede usar en un método para determinar si un tumor en un individuo es, o es probable que sea, un tumor invasivo o metastásico.
Los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento se pueden combinar con los métodos terapéuticos descritos. Por lo tanto, los presentes inventores proporcionan un método de tratamiento, profilaxis o alivio del cáncer en un individuo, comprendiendo el método detectar la modulación de la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 en una célula del individuo y administrar una terapia adecuada al individuo en función de la agresividad del tumor.
Normalmente, el examen físico con rayos X se utiliza para la detección de cáncer. Por lo general, se toma una biopsia del tumor para un examen histopatológico para el diagnóstico de cáncer. La detección de la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 se puede utilizar para diagnosticar o confirmar aún más el diagnóstico de, cáncer, junto con los procedimientos histopatológicos convencionales. Esto puede resultar especialmente útil cuando el análisis histopatológico no arroja un resultado claro.
La presencia y cantidad de polipéptidos y ácidos nucleicos de PRL-1 y PRL-3 se pueden detectar en una muestra tal como se describe con más detalle a continuación. Por lo tanto, las enfermedades asociadas a PRL-1 y PRL-3, incluyendo cáncer, se pueden diagnosticar mediante métodos que comprenden determinar a partir de una muestra obtenida de un sujeto una expresión, cantidad o actividad anormalmente disminuida o aumentada, tal como una expresión, cantidad o actividad aumentada, del polipéptido PRL-1 y PRL-3 o ARNm de PRL-1 y PRL-3.
La muestra puede comprender una muestra de células o tejidos de un organismo o individuo que padece o se sospecha que padece una enfermedad asociada con una expresión, cantidad o actividad aumentada, reducida o de otra forma anómala de PRL-1 y PRL-3, incluyendo cambios espaciales o temporales en el nivel o patrón de expresión, cantidad o actividad. El nivel o patrón de expresión, cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 en un organismo que padece o se sospecha que padece dicha enfermedad se puede comparar de manera útil con el nivel o patrón de expresión, cantidad o actividad en un organismo normal como medio de diagnóstico de la enfermedad. La muestra puede comprender una muestra de células o tejidos de un individuo que padece o se sospecha que padece cáncer, tal como una muestra de tejido o célula relevante.
En algunas realizaciones, un mayor nivel de expresión, cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 se detecta en la muestra. El nivel de PRL-1 y p RL-3 puede aumentar en un grado significativo en comparación con las células normales o células que se sabe que no son cancerosas. Estas células se pueden obtener del individuo que se está probando, o de otro individuo, como los que coinciden con el individuo evaluado por edad, peso, estilo de vida, etc. En algunos métodos descritos en el presente documento, el nivel de expresión, la cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 aumenta en un 10 %, 20 %, 30 % o 40 % o más. En algunos métodos, el nivel de expresión, la cantidad o actividad de PRL-1 y PRL-3 aumenta en un 45 % o más, tal como del 50 % o más, según se juzga por hibridación de ADNc.
La expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 se puede detectar de varias formas, tal como se conoce en la técnica, y tal como se describe con más detalles a continuación. Normalmente, se mide la cantidad de PRL-1 y PRL-3 en una muestra de tejido de un individuo y se compara con una muestra de un individuo no afectado. Tanto el ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3, así como los niveles de polipéptido PRL-1 y PRL-3 pueden aumentar.
La detección de la cantidad, la actividad o la expresión de PRL-1 y PRL-3 se puede usar para clasificar el cáncer. Por ejemplo, un alto nivel de cantidad, actividad o expresión de PRL-1 y PRL-3 puede indicar un cáncer agresivo, invasivo o metastásico. De forma similar, un bajo nivel de cantidad, actividad o expresión de PRL-1 y PRL-3 puede indicar un cáncer no agresivo, no invasivo o no metastásico. Dicho sistema de clasificación se puede utilizar junto con los sistemas de clasificación establecidos.
Los niveles de expresión génica de PRL-1 y PRL-3 se pueden determinar usando varias técnicas diferentes.
Medición de la expresión de PRL-1 y PRL-3 a nivel de ARN
La expresión de los genes PRL-1 y PRL-3 se puede detectar a nivel de ARN.
En un método, por lo tanto, los presentes inventores divulgaron un método para detectar la presencia de un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico PRL-1 y PRL-3 en una muestra, poniendo en contacto la muestra con al menos una sonda de ácido nucleico que es específica para el ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3 y controlando dicha muestra para detectar la presencia del ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico se puede unir específicamente al ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3, o una parte de él, y se detecta la unión entre los dos; también se puede detectar la presencia del propio complejo.
La detección de ARN de la expresión de PRL-1 y PRL-3 se puede usar para complementar los ensayos de expresión de polipéptidos, tal como se describe a continuación, que pueden emplear los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento.
Por lo tanto, en un método, la cantidad de ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3 en forma de ARNm de PRL-1 y PRL-3 se puede medir en una muestra. El ARNm de PRL-1 y PRL-3 se puede analizar mediante hibridación in situ, análisis por transferencia de Northern y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden identificar mediante hibridación in situ, análisis por transferencia de Southern, polimorfismo conformacional monocatenario, amplificación por PCR y análisis de microplacas de ADN utilizando cebadores específicos. (Kawasaki, 1990; Sambrook, 1992; Lichter et al, 1990; Orita et al, 1989; Fodor et al., 1993; Pease et al., 1994).
El ARN de PRL-1 y PRL-3 se puede extraer de las células utilizando técnicas de extracción de ARN que incluyen, por ejemplo, el uso de extracción con isotiocianato de fenol/guanidina ácido (RNAzol B; Biogénesis) o kits de preparación de ARN RNeasy (Qiagen). Los formatos de ensayo típicos que utilizan hibridación de ácido ribonucleico incluyen ensayos de ejecución nuclear, ensayos de protección de RT-PCR y ribonucleasa (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035. Los métodos de detección que se pueden emplear incluyen marcadores radiactivos, marcadores enzimáticos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores fluorescentes y otros marcadores adecuados.
Cada uno de estos métodos permite realizar determinaciones cuantitativas y son bien conocidos en la técnica. La disminución o el aumento de la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 se puede medir a nivel de ARN usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos. Cualquier sonda adecuada de una secuencia PRL-1 y PRL-3, por ejemplo, cualquier parte de una secuencia de PRL-1 y PRL-3 humana adecuada se puede usar como sonda. Las secuencias para diseñar las sondas de PRL-1 y PRL-3 pueden incluir una secuencia que tenga el número de referencia NM_015472, o una parte de la misma.
Normalmente, la RT-PCR se utiliza para amplificar dianas de ARN. En este proceso, la enzima transcriptasa inversa se utiliza para convertir ARN en ADN complementario (ADNc) que luego se puede amplificar para facilitar la detección.
Se conocen muchos métodos de amplificación de ADN, la mayoría de los cuales se basan en una reacción enzimática en cadena (tal como una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción en cadena de la ligasa o una replicación de secuencia autosostenida) o de la replicación de todo o parte del vector en el que se ha clonado. En la bibliografía se han descrito muchos métodos de amplificación de señales y dianas, por ejemplo, revisiones generales de estos métodos en Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988) y Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990).
Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se puede emplear para detectar ARNm de PRL-1 y PRL-3. La "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" es un método de amplificación de ácido nucleico descrito, entre otros, en la patente de EE.UU. N.° 4.683.195 y 4.683.202. La PCR se puede utilizar para amplificar cualquier ácido nucleico conocido en un contexto de diagnóstico (Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252). La replicación de secuencia autosostenida (3SR) es una variación de TAS, que implica la amplificación isotérmica de un molde de ácido nucleico mediante rondas secuenciales de transcriptasa inversa (RT), actividades de polimerasa y nucleasa que están mediadas por un cóctel de enzimas y cebadores de oligonucleótidos apropiados (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:1874). La reacción de amplificación por ligadura o el sistema de amplificación por ligadura utiliza ADN ligasa y cuatro oligonucleótidos, dos por hebra diana. Esta técnica está descrita por Wu, D. Y. y Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560. En la técnica de Qp Replicasa, la ARN replicasa para el bacteriófago Qp, que replica el ARN monocatenario, se utiliza para amplificar el ADN diana, tal como lo describe Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197.
Un procedimiento de PCR básicamente implica: (1) tratar el ADN extraído para formar hebras complementarias monocatenarias; (2) agregar un par de cebadores de oligonucleótidos, en donde un cebador del par es sustancialmente complementario a parte de la secuencia en la hebra sentido y el otro cebador de cada par es sustancialmente complementario a una parte diferente de la misma secuencia en la hebra complementaria antisentido; (3) hibridar los cebadores emparejados con la secuencia complementaria; (4) extender simultáneamente los cebadores hibridados desde un extremo 3' de cada cebador para sintetizar un producto de extensión complementario a las hebras hibridadas a cada cebador en el que dichos productos de extensión después de la separación del complemento sirven como moldes para la síntesis de un producto de extensión para el otro cebador de cada par; (5) separar dichos productos de extensión de dichos moldes para producir moléculas monocatenarias; y (6) amplificar dichas moléculas monocatenarias repitiendo al menos una vez dichas etapas de hibridación, ampliación y separación.
Se puede emplear la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). También se puede usar la RT-PCr cuantitativa. Tales técnicas de PCR son bien conocidas en la técnica y pueden emplear cualquier cebador adecuado de una secuencia de PRL-1 y PRL-3.
También se puede aprovechar la tecnología de amplificación alternativa. Por ejemplo, la amplificación en círculo rodante (Lizard et al., 1998, Nat Genet 19:225) es una tecnología de amplificación disponible comercialmente (RCAT™) que está impulsada por la ADN polimerasa y puede replicar sondas de oligonucleótidos circulares con cinética lineal o geométrica en condiciones isotérmicas. Una técnica adicional, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Walker et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 80:392) comienza con una secuencia específicamente definida única para una diana específica.
Medición de la expresión de PRL-1 y PRL-3 a nivel de polipéptido
La expresión de PRL-1 y PRL-3 se puede detectar a nivel de polipéptido.
En un método adicional, por lo tanto, la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 se puede detectar detectando la presencia o cantidad de polipéptido PRL-1 y PRL-3 en una muestra. Esto se puede lograr usando moléculas que se unen al polipéptido PRL-1 y PRL-3. Las moléculas/agentes adecuados que se unen directa o indirectamente al polipéptido PRL-1 y PRL-3 para detectar su presencia incluyen moléculas de origen natural tales como péptidos y proteínas, por ejemplo anticuerpos, o pueden ser moléculas sintéticas.
Por lo tanto, los presentes inventores desvelan un método para detectar la presencia de un polipéptido PRL-1 y PRL-3 poniendo en contacto una muestra de células con un anticuerpo capaz de unirse al polipéptido y monitoreando dicha muestra para detectar la presencia del polipéptido.
Por ejemplo, el polipéptido PRL-1 y PRL-3 se puede detectar usando un anticuerpo anti-PRL-1 y anti-PRL-3 tal como se describe en el presente documento. Dichos anticuerpos se pueden fabricar mediante los medios descritos en detalle en el presente documento. En un ejemplo específico, un anticuerpo anti-PRL-1 puede comprender un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 269. Esto puede incluir el propio anticuerpo monoclonal 269, un anticuerpo que comprende una región variable del anticuerpo 269, o un anticuerpo monoclonal humanizado 269.
De forma similar, un anticuerpo anti-PRL-3 puede comprender un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 223 o 318. Esto puede incluir el propio anticuerpo monoclonal 223 o 318, un anticuerpo que comprende una región variable del anticuerpo 223 o 318, o un anticuerpo monoclonal humanizado 223 o 318.
El ensayo se puede lograr convenientemente controlando la presencia de un complejo formado entre el anticuerpo y el polipéptido, o controlando la unión entre el polipéptido y el anticuerpo. Los métodos para detectar la unión entre dos entidades son conocidos en la técnica e incluyen FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia), resonancia del plasmón superficial, etc.
Se pueden utilizar técnicas convencionales de laboratorio, tales como la inmunotransferencia, tal como se describe anteriormente, para detectar niveles alterados de la proteína PRL-1 y PRL-3, en comparación con las células no tratadas de la misma población celular.
La expresión génica también se puede determinar detectando cambios en el procesamiento postraduccional de los polipéptidos PRL-1 y PRL-3 o modificación postranscripcional de los ácidos nucleicos de PRL-1 y PRL-3. Por ejemplo, se puede medir la fosforilación diferencial de los polipéptidos PRL-1 y PRL-3, la escisión de los polipéptidos PRL-1 y PRL-3 o el corte y empalme alternativo del ARN de PRL-1 y PRL-3, y similares. Los niveles de expresión de productos génicos tales como los polipéptidos PRL-1 y PRL-3, así como su modificación postraduccional, se pueden detectar mediante técnicas o ensayos de proteínas patentados, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida 2D.
Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar los niveles de proteína PRL-1 y PRL-3 en una muestra obtenida de un hospedador son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los anticuerpos se pueden ensayar para determinar la unión inmunoespecífica mediante cualquier método conocido en la técnica.
Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como análisis por transferencia de Western, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos en sándwich, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos de radiometría inmunológica, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Tales ensayos son rutinarios en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York.
La muestra se puede analizar para detectar polipéptidos/proteínas mediante tinción inmunohistoquímica e inmunocitoquímica (véase, en general, Stites y Terr, Basic and Clinical Immunology, Appleton y Lange, 1994), ELISA, RIA, inmunotransferencias, análisis por transferencia de Western, inmunoprecipitación, ensayos funcionales y prueba de truncamiento de proteínas. Otros métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis por transferencia de Western y ensayos ELISA.
Los expertos en la técnica conocen bien los ensayos ELISA. En los ensayos se pueden usar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. En su caso, otros inmunoensayos, tales como radioinmunoensayos (RIA) son conocidos por los expertos en la técnica. Se describen ampliamente inmunoensayos disponibles en la bibliografía científica y de patentes. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521 así como Sambrook et al, 1992.
Kits de Diagnóstico
Los presentes inventores también proporcionan kits de diagnóstico para detectar el cáncer en un individuo o la susceptibilidad al cáncer en un individuo.
El kit de diagnóstico puede comprender medios para detectar la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 o PRL-3 en el individuo, mediante cualquier medio tal como se describe en el presente documento. Por lo tanto, el kit de diagnóstico puede comprender uno o más de los siguientes: un anticuerpo anti-PRL, un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 269, 223 o 318, anticuerpo monoclonal 269, un anticuerpo que comprende una región variable del anticuerpo 269 o un anticuerpo monoclonal humanizado 269; anticuerpo monoclonal 223 un anticuerpo que comprende una región variable del anticuerpo 223, o un anticuerpo monoclonal humanizado 223; anticuerpo monoclonal 318, un anticuerpo que comprende una región variable del anticuerpo 318, o un anticuerpo monoclonal humanizado 318.
El kit de diagnóstico puede comprender instrucciones de uso u otras indicaciones. El kit de diagnóstico puede comprender además medios para el tratamiento o la profilaxis del cáncer de mama, tales como cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, o cualquier medio conocido en la técnica para tratar el cáncer de mama. En particular, el kit de diagnóstico puede comprender un anticuerpo anti-PRL1 o anti-PRL3 tal como se describe, por ejemplo, obtenido por cribado.
MÉTODOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS
Los presentes inventores desvelan métodos para tratar afecciones anómalas, tales como cáncer, relacionados con cantidades excesivas de expresión o actividad de PRL-1 y PRL-3. Los métodos para prevenir el cáncer (es decir, profilaxis) también emplean adecuadamente los mismos enfoques o enfoques similares.
En términos generales, los métodos de los presentes inventores implican la manipulación de células cancerosas, modulando (tal como regulando negativamente) la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 en la célula. Los métodos pueden implicar la destrucción o erradicación de células cancerosas. Las células cancerosas pueden comprender células cancerosas que expresan PRL-1 y/o PRL-3. Las células cancerosas pueden ser las que sobreexpresan PRL-1 y/o PRL-3, en comparación con las células no cancerosas. Los métodos de los presentes inventores pueden comprender exponer a un paciente a un anticuerpo anti-PRL, tal como un anticuerpo anti-PRL-1 o un anticuerpo anti-PRL-3, o ambos. El anticuerpo anti-PRL-1 puede comprender un anticuerpo anti-PRL-1 humanizado; del mismo modo, el anticuerpo anti-PRL-3 puede comprender un anticuerpo anti-PRL-3 humanizado. Las células cancerosas pueden ser de pacientes con cáncer positivos para PRL-1 y/o PRL-3. Por lo tanto, los métodos de los presentes inventores pueden comprender erradicar las células cancerosas que sobreexpresan PRL-1 y/o PRL-3 de pacientes con cáncer positivos para PRL-3/-1.
Por lo tanto, los métodos de los presentes inventores pueden comprender erradicar las células que sobreexpresan PRL-1 y/o PRL-3 de pacientes con cáncer positivos para PRL-3/-1 utilizando anticuerpos humanizados PRL-3/-1. Una etapa para detectar la expresión, la cantidad o la actividad modulada de PRL-1 y PRL-3 en una célula se puede realizar antes o después de la etapa de manipulación. La etapa de detección puede detectar la expresión, la cantidad o la actividad de PRL-1 y PRL-3 regulada positivamente o regulada negativamente. Se puede usar cualquiera de los métodos para modular o regular negativamente PRL-1 y PRL-3, tal como se describe en detalle en otra parte del presente documento.
En particular, el método puede comprender exponer la célula a un anticuerpo anti-PRL-1 o anti-PRL-3 capaz de unirse específicamente a PRL-1 o p RL-3. Los anticuerpos anti-PRL y los métodos para administrarlos se describen en detalle en otra parte del presente documento.
Según los métodos de los presentes inventores, la célula cancerosa se vuelve no cancerosa o la célula cancerosa invasiva o metastásica se vuelve no invasiva o no metastásica como resultado de la manipulación. En particular, el cáncer puede comprender un cáncer tal como un cáncer invasivo o metastásico seleccionado del grupo que consiste en: cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de pene, cáncer de cuello de útero, cáncer cerebral, cáncer esofágico, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renales del riñón, linfoma de ovario y melanoma de piel.
Como PRL-1 y PRL-3 se asocian con la agresividad e invasividad del cáncer, el nivel de PRL-1 y PRL-3 se puede detectar en una célula de un individuo con cáncer, en una célula cancerosa o no cancerosa, y se evalúa la agresividad del cáncer. Un alto nivel de cantidad, expresión o actividad de PRL-1 y PRL-3 en comparación con una célula normal indica un cáncer agresivo o invasivo y, por lo tanto, se puede requerir y elegir una terapia más fuerte o más dura. De forma similar, un nivel más bajo puede indicar una terapia menos agresiva o invasiva.
Los enfoques descritos en el presente documento se pueden usar para la terapia de cualquier enfermedad relacionada con PRL-1 y PRL-3 en general. Las enfermedades relacionadas con PRL-1 y PRL-3 incluyen enfermedades proliferativas y en particular incluyen cáncer. Por ejemplo, una enfermedad relacionada con PRL-1 y PRL-3 puede incluir cáncer metastásico, cáncer invasivo o cáncer agresivo.
Los métodos y composiciones descritas en el presente documento permiten de forma adecuada una mejora en un criterio medible en un individuo al que se aplica el tratamiento, en comparación con uno que no ha recibido el tratamiento.
Para este fin, se pueden designar varios criterios, que reflejan el progreso del cáncer o el bienestar del paciente. Los criterios útiles pueden incluir el tamaño del tumor, la dimensión del tumor, la dimensión más grande del tumor, el número de tumores, la presencia de marcadores tumorales (tal como la proteína alfa-feto), el grado o el número de metástasis, etc.
Por lo tanto, como un ejemplo, un individuo tratado puede mostrar una disminución en el tamaño o el número de tumores medidos por un ensayo o prueba apropiados. Un individuo tratado puede, por ejemplo, mostrar una disminución del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en el tamaño del tumor de un tumor en particular, o disminución del número de tumores, o ambos, en comparación con un individuo que no ha sido tratado.
Por ejemplo, una enfermedad relacionada con PRL-1 y PRL-3 puede definirse como "tratada" si una afección asociada con la enfermedad se inhibe significativamente (es decir,, en un 50 % o más) en relación con los controles. La inhibición puede ser de al menos un 75 % con respecto a los controles, tal como en un 90 %, en un 95 % o en un 100 % en relación con los controles. La afección puede comprender la proliferación celular o puede comprender el tiempo del ciclo celular, el número de células, la migración celular, la invasión celular, la formación de tumores, la metástasis tumoral, la diseminación del tumor, etc. Por el término "tratamiento" los presentes inventores quieren incluir también la profilaxis o el alivio del cáncer.
El término trastorno proliferativo se usa en el presente documento en un sentido amplio para incluir cualquier trastorno que requiera el control del ciclo celular. En particular, un trastorno proliferativo incluye trastornos malignos y preneoplásicos. Los métodos y composiciones descritos en el presente son especialmente útiles en relación con el tratamiento o diagnóstico de adenocarcinomas tales como: cáncer de pulmón microcítico y cáncer de riñón, útero, próstata, vejiga, ovario, colon y mama. Por ejemplo, las neoplasias que se pueden tratar incluyen leucemias agudas y crónicas, linfomas, mielomas, sarcomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, linfangioendoteliosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, linfangiosarcoma, sinovioma, mesotelioma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de mama, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma broncogénico, coriocarcinoma, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, seminoma, carcinoma embrionario, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neurinoma del acústico, meduloblastoma, craneofaringioma, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neutroblastoma y retinoblastoma.
El enfoque de anticuerpos para la terapia que implica el uso de anticuerpos anti-PRL se puede combinar con otros enfoques para la terapia de dichos trastornos, incluida la expresión de construcciones antisentido dirigidas contra los polinucleótidos PRL-1 y PRL-3 tal como se describe en el presente documento, y su administración a las células tumorales, para inhibir la función de los genes y evitar que la célula tumoral crezca o progrese.
Se pueden usar construcciones antisentido para inhibir la función génica para prevenir el crecimiento o la progresión en una célula proliferativa. Las construcciones antisentido, es decir, ácido nucleico, tales como ARN, construcciones complementarias al ácido nucleico sentido o ARNm, se describen en detalle en el documento US 6.100.090 (Monia et al.) y Neckers et al., 1992, Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231.
En un ejemplo particular, el cáncer se puede tratar o prevenir reduciendo la cantidad, la expresión o la actividad de PRL-1 y PRL-3 en su totalidad o en parte, por ejemplo, mediante ARNip capaces de unirse y destruir el ARNm de PRL-1 y PRL-3.
La interferencia del ARN (ARNi) es un método postranscripcional de silenciamiento génico (PTGS) inducido por la introducción directa de ARN bicatenario (ARNbc) y ha surgido como una herramienta útil para eliminar la expresión de genes específicos en varios organismos. Se describe el ARNi por Fire et al., Nature 391:806-811 (1998). Se conocen otros métodos de PTGS e incluyen, por ejemplo, introducción de un transgén o virus. Generalmente, en PTGS, el transcrito del gen silenciado se sintetiza pero no se acumula porque se degrada rápidamente. Los métodos para PTGS, incluido el ARNi, se describen, por ejemplo, en el sitio web Ambion.com, en el directorio "/hottopics/", en el fichero "rnai".
Los métodos adecuados para el ARNi in vitro se describen en el presente documento. Uno de estos métodos implica la introducción de ARNip (ARN de interferencia pequeño). Los modelos actuales indican que esos ARNbc de 21-23 nucleótidos pueden inducir PTGS. Se describen métodos para diseñar ARNip eficaces, por ejemplo, en el sitio web de Ambion descrito anteriormente. Los precursores de ARN, tales como los ARN en horquilla corta (ARNhc), también pueden estar codificados por la totalidad o una parte de la secuencia de ácido nucleico de PRL-1 y PRL-3. Como alternativa, el ARN bicatenario (ds) es una forma poderosa de interferir con la expresión génica en varios organismos que recientemente ha demostrado ser exitosa en mamíferos (Wianny y Zernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2:70-75). El ARN bicatenario correspondiente a la secuencia de un polinucleótido PRL-1 y PRL-3 se puede introducir o expresar en ovocitos y células de un organismo candidato para interferir con la actividad de p RL-1 y PRL-3.
Los expertos en la técnica conocen otros métodos para modular la expresión génica de PRL-1 y PRL-3 e incluyen enfoques negativos dominantes. De nuevo, éstos se pueden combinar con terapia de anticuerpos usando anticuerpos anti-PRL. Por lo tanto, otro enfoque es usar variantes no funcionales de polipéptidos PRL-1 y PRL-3 en el presente documento que compiten con el producto génico endógeno que da como resultado la inhibición de la función.
La expresión de los genes PRL-1 y PRL-3 también se puede modular introduciendo péptidos o moléculas pequeñas que inhiben la expresión génica o la actividad funcional. Dichos péptidos o moléculas pequeñas se pueden administrar en combinación con anticuerpos anti-PRL para el tratamiento de un cáncer tal como el cáncer metastásico.
Por lo tanto, los compuestos identificados por ensayos como que se unen a o modulan, tal como la regulación negativa, la cantidad, la actividad o la expresión del polipéptido PRL-1 y PRL-3 se puede administrar a células tumorales o proliferativas para prevenir la función de los polipéptidos PRL-1 y PRL-3. Dicho compuesto se puede administrar junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para regular negativamente la expresión o actividad de PRL-1 y PRL-3, o activar o regular negativamente una segunda señal que controla la expresión, la actividad o la cantidad de PRL-1 y PRL-3, aliviando así la condición anómala.
Como alternativa, la terapia génica se puede emplear para controlar la producción endógena de PRL-1 y PRL-3 por las células relevantes tales como las células cancerosas en el sujeto. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un ARNip de PRL-1 y PRL-3 o una parte de éste se puede diseñar para expresión en un vector retrovírico defectuoso en la replicación, tal como se analiza a continuación. La construcción de expresión retrovírica se puede aislar e introducir en una célula de empaquetamiento transducida con un vector de plásmido retrovírico que contiene ARN que codifica un ARNip anti-PRL-1 y PRL-3 de manera que la célula de empaquetamiento ahora produce partículas víricas infecciosas que contienen la secuencia de interés. Estas células productoras se pueden administrar a un sujeto para diseñar genéticamente células in vivo y regular la expresión del polipéptido PRL-1 y PRL-3 in vivo. Para obtener una descripción general de la terapia génica, véase el Capítulo 20, Terapia génica y otros enfoques terapéuticos basados en la genética molecular, (y las referencias citadas en ese documento) en Human Molecular Genetics, T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996).
En algunas realizaciones, el nivel de PRL-1 y PRL-3 está reducido en una célula cancerosa. Asimismo, en dichas realizaciones, el tratamiento puede estar dirigido a o ser específico para, dichas células cancerosas. La expresión de PRL-1 y PRL-3 se puede reducir específicamente solo en células enfermas (es decir, aquellas células que son cancerosas) y no sustancialmente en otras células no enfermas. En estos métodos, la expresión de PRL-1 y PRL-3 puede no reducirse sustancialmente en otras células, es decir, células que no son células cancerosas. Por lo tanto, en dichas realizaciones, el nivel de PRL-1 y PRL-3 permanece sustancialmente igual o similar en células no cancerosas en el trascurso o después del tratamiento.
SECUENCIAS DE POLIPÉPTIDO
Se entenderá que las secuencias de polipéptidos desveladas en el presente documento no se limitan a las secuencias particulares establecidas en el presente documento, sino que también incluyen secuencias homólogas obtenidas de cualquier fuente, por ejemplo homólogos celulares relacionados, homólogos de otras especies y variantes o derivados de las mismas, siempre que tengan al menos una de las actividades biológicas de un anticuerpo anti-PRL, según sea el caso.
Por lo tanto, la presente divulgación abarca variantes, homólogos o derivados de las secuencias de aminoácidos establecidas en el presente documento, así como variantes, homólogos o derivados de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento. Estas secuencias se denominan generalmente secuencia de "anticuerpo anti-PRL".
Actividades biológicas
En algunas realizaciones, las secuencias comprenden al menos una actividad biológica de un anticuerpo anti-PRL, según sea el caso.
La actividad biológica puede comprender una actividad inmunológica. El anticuerpo anti-PRL puede comprender una actividad inmunológica idéntica o similar en comparación con el anticuerpo 269, 223 o 318, o sus versiones humanizadas. Por "actividad inmunológica" los presentes inventores se refieren a la capacidad del anticuerpo anti-PRL, para inducir una respuesta inmunitaria específica en animales o células apropiados al unirse con un antígeno PRL-1 o PRL-3.
La actividad biológica puede comprender actividad de unión a antígeno. El anticuerpo anti-PRL se puede unir a PRL-1 o un epítopo del mismo. El anticuerpo anti-PRL se puede unir al mismo epítopo unido por el anticuerpo 269. El anticuerpo anti-PRL se puede unir a PRL-3 o un epítopo del mismo. El anticuerpo anti-PRL se puede unir al mismo epítopo unido por el anticuerpo 223 o al mismo epítopo unido por el anticuerpo 318.
El anticuerpo anti-PRL se puede unir al antígeno o epítopo con la misma, elevada o reducida afinidad o avidez. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PRL se puede unir al antígeno o epítopo con al menos un 10 %, tal como un 20 %, tal como un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, de afinidad o avidez en comparación con el anticuerpo afín, por ejemplo, 269, 223 o 318 o sus homólogos humanizados, según sea el caso.
La actividad puede incluir la inhibición de la actividad del cáncer como, por ejemplo, medida por la reducción del tamaño del tumor o el número de tumores, o la inhibición de la actividad metastásica, tal como, por ejemplo, medida mediante los ensayos descritos en los Ejemplos. La reducción o inhibición se puede ensayar convenientemente provocando carcinogénesis en un animal de prueba, administrando el anticuerpo anti-PRL al animal y determinando un efecto del anticuerpo anti-PRL en comparación con un animal de control similar que no ha sido tratado de este modo. Los ejemplos describen un ensayo de este tipo en detalle.
El anticuerpo anti-PRL puede tener una actividad de inhibición tumoral o de inhibición de metástasis que es la misma que, o reducida del o elevada del anticuerpo afín. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PRL puede ser al menos el 10 %, tal como un 20 %, tal como un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, eficaz en comparación con el anticuerpo afín, por ejemplo, 269, 223 o 318 o sus homólogos humanizados, según sea el caso. Con esto, los presentes inventores quieren decir que, digamos, si el anticuerpo afín es capaz de reducir el número de tumores en un 90 % (véase los ejemplos), el anticuerpo anti-PRL puede ser capaz de reducir el número de tumores en un 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, etc., en comparación con un animal no tratado.
También se pueden usar otros ensayos que detectan eventos de anticuerpos, en lugar de, o además de, los ensayos descritos.
Homólogos
Los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL descritos incluyen secuencias homólogas obtenidas de cualquier fuente, por ejemplo proteínas víricas/bacterianas relacionadas, homólogos celulares y péptidos sintéticos, así como variantes o derivados de los mismos. Por lo tanto, los polipéptidos también incluyen aquellos que codifican homólogos de anticuerpos anti-PRL de otras especies, incluidos animales tales como mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas o conejos), en particular, seres humanos.
En el contexto del presente documento, una secuencia homóloga u homólogo se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60, 70, 80 o 90 % idéntica, tales como al menos 95 o 98 % idénticos en el nivel de aminoácidos sobre al menos 30, tal como 50, 70, 90 o 100 aminoácidos con una secuencia polipeptídica relevante, por ejemplo, tal como se muestra en el listado de secuencias del presente documento. En el contexto del presente documento, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% idéntica, tal como al menos el 95 o el 98 % idéntica a nivel de aminoácidos, tal como más de al menos 15, 25, 35, 50 o 100, tales como 200, 300, 400 o 500 aminoácidos con la secuencia de un polipéptido relevante. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto del presente documento, la homología se puede expresar en términos de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede determinar en relación con la totalidad de la longitud de la secuencia relevante, es decir, en toda la longitud o en la secuencia de longitud completa del gen relevante, por ejemplo.
Se pueden realizar comparaciones de identidad a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto a la vez. Esto se llama un alineamiento "sin hueco". Normalmente, tales alineamientos sin huecos se realizan solo sobre un número relativamente corto de restos (por ejemplo, menos de 50 aminoácidos contiguos).
Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción hará que los siguientes restos de aminoácidos queden fuera de alineamiento, lo que podría generar una gran reducción en el % de homología cuando se produce el alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología general. Esto se logra al insertar "huecos" en el alineamiento de la secuencia para tratar de maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en el alineamiento, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con la menor cantidad de huecos posible -reflejando una mayor relación entre las dos secuencias comparadas- puede lograr una puntuación más alta que una con muchos huecos. Los "costes de huecos de afinidad" se utilizan normalmente y cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más utilizado. Por supuesto, las altas penalizaciones por huecos producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por huecos. Sin embargo, los valores predeterminados se pueden usar cuando se usa dicho programa informático para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo del % máximo de homología, por lo tanto, requiere primero la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por huecos. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otros programas informáticos que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 misma referencia -Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 misma referencia, páginas 7-58 a 7-60). Se puede utilizar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí no suele basarse en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se utiliza una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o en la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo utilizada comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas de GCG Wisconsin generalmente usan los valores públicos predeterminados o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se proporciona (consulte el manual del usuario para obtener más detalles). Los valores públicos predeterminados para el paquete GCG, o en el caso de otro programa informático, la matriz predeterminada, tales como BLOSUM62, se puede usar. Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, tal como el % de identidad de secuencia. El software normalmente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Variantes y derivados
Los términos "variante" o "derivado" en relación con las secuencias de aminoácidos tal como se describen en el presente documento incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos de o en la secuencia. La secuencia de aminoácidos resultante puede conservar sustancialmente la misma actividad que la secuencia no modificada, de tal manera que tiene al menos la misma actividad que los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL mostrados en el presente documento, por ejemplo, en los listados de secuencias. Por lo tanto, la característica clave de las secuencias, a saber, la capacidad de unión a polipéptidos PRL o la actividad de reducción de tumores, tal como se describe en otra parte - se puede conservar. Los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en los Ejemplos, o fragmentos u homólogos de los mismos, se pueden modificar para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Normalmente, se realizan modificaciones que conservan la actividad biológica de la secuencia. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10, 20 o 30 sustituciones siempre que la secuencia modificada conserve la actividad biológica de la secuencia no modificada. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos de origen no natural, por ejemplo, para aumentar la semivida en plasma sanguíneo de un polipéptido administrado terapéuticamente.
Es probable que las variantes naturales de anticuerpos anti-PRL comprendan sustituciones conservativas de aminoácidos. Se pueden definir sustituciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla a continuación. Los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna tales como aquellos de la misma línea de la tercera columna se pueden sustituir entre sí:
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Fragmentos
Los polipéptidos desvelados en el presente documento y útiles como marcadores también incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados anteriormente y variantes de los mismos, incluidos fragmentos de las secuencias establecidas en los listados de secuencias.
Los polipéptidos también incluyen fragmentos de la secuencia de longitud completa de cualquiera de los polipéptidos del anticuerpo anti-PRL. Los fragmentos pueden comprender al menos un epítopo. Los métodos para identificar epítopos son bien conocidos en la técnica. Los fragmentos comprenderán normalmente al menos 6 aminoácidos, tal como al menos 10, 20, 30, 50 o 100 aminoácidos o más.
Los fragmentos polipeptídicos de las proteínas del anticuerpo anti-PRL y las variantes alélicas y de especies de los mismos pueden contener una o más (por ejemplo, 5, 10, 15 o 20) sustituciones, deleciones o inserciones, incluyendo sustituciones conservativas. Cuando se producen sustituciones, deleciones y/o inserciones, por ejemplo en diferentes especies, tal como menos de un 50 %, 40 % o 20 % de los restos de aminoácidos representados en los listados de secuencias están alterados.
El anticuerpo anti-PRL y sus fragmentos, homólogos, variantes y derivados, se pueden preparar por medios recombinantes. Sin embargo, también se pueden preparar por medios de síntesis usando técnicas bien conocidas por los expertos, tales como síntesis en fase sólida. Las proteínas también se pueden producir como proteínas de fusión, por ejemplo, para ayudar en la extracción y purificación. Ejemplos de miembros de proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de activación transcripcional y/o de unión al ADN) y p-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre la proteína de fusión asociada y la secuencia de la proteína de interés para permitir la eliminación de las secuencias de la proteína de fusión. La proteína de fusión puede ser tal que no obstaculice la función de la secuencia de la proteína de interés. Las proteínas también se pueden obtener mediante la purificación de extractos celulares de células animales.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL, variantes, homólogos, fragmentos y derivados desvelados en el presente documento pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entenderá que tales polipéptidos se pueden mezclar con vehículos o diluyentes que no interferirán con el propósito pretendido de la proteína y aún se considerarán sustancialmente aislados. Una variante de anticuerpo anti-PRL, homólogo, fragmento o derivado también puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá la proteína en una preparación en la que más del 90 %, por ejemplo, el 95 %, el 98 % o el 99 % de la proteína en la preparación es una proteína.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL, variantes, homólogos, fragmentos y derivados desvelados en el presente documento se pueden marcar con un marcador revelador. El marcador revelador puede ser cualquier marcador adecuado que permita que el polipéptido, etc sea detectado. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, por ejemplo 125I, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazadores tales como biotina. Los polipéptidos marcados se pueden usar en procedimientos de diagnóstico tales como inmunoensayos para determinar la cantidad de un polipéptido en una muestra. Los polipéptidos o polipéptidos marcados también se pueden usar en ensayos inmunológicos serológicos o mediados por células para la detección de reactividad inmunitaria a dichos polipéptidos en animales y seres humanos usando protocolos convencionales.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL, variantes, homólogos, fragmentos y derivados desvelados en el presente documento, opcionalmente marcados, también se pueden fijar a una fase sólida, por ejemplo, la superficie de un pozo de inmunoensayo o una tira reactiva. Dichos polipéptidos marcados y/o inmovilizados se pueden empaquetar en kits en un recipiente adecuado junto con los reactivos adecuados, controles, instrucciones y similares. Dichos polipéptidos y kits se pueden usar en métodos de detección de anticuerpos contra los polipéptidos o sus variantes alélicas o de especie mediante inmunoensayo.
Los métodos de inmunoensayo son bien conocidos en la técnica y generalmente comprenderán: (a) proporcionar un polipéptido que comprende un epítopo enlazable por un anticuerpo contra dicha proteína; (b) incubar una muestra biológica con dicho polipéptido en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se forma el complejo anticuerpo-antígeno que comprende dicho polipéptido.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-PRL, variantes, homólogos, fragmentos y derivados desvelados en el presente documento se pueden usar en sistemas de cultivo celular in vitro o in vivo para estudiar el papel de sus genes correspondientes y sus homólogos en la función celular, incluida su función en la enfermedad. Por ejemplo, se pueden introducir polipéptidos truncados o modificados en una célula para alterar las funciones normales que se producen en la célula. Los polipéptidos se pueden introducir en la célula mediante expresión del polipéptido in situ a partir de un vector de expresión recombinante (véase a continuación). El vector de expresión lleva opcionalmente un promotor inducible para controlar la expresión del polipéptido.
El uso de células hospedadoras adecuadas, tales como células de insectos o células de mamíferos, se espera que proporcione tales modificaciones postraduccionales (por ejemplo, miristolación, glucosilación, truncamiento, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinantes. Tales sistemas de cultivo celular en los que los polipéptidos del anticuerpo anti-PRL, variantes, homólogos, fragmentos y derivados desvelados en el presente documento se expresan se pueden usar en sistemas de ensayo para identificar sustancias candidatas que interfieren o mejoran las funciones de los polipéptidos en la célula.
SECUENCIAS DE POLINUCLEÓTIDOS
Las regiones variables, las secuencias de anticuerpos monoclonales y las secuencias de anticuerpos humanizados pueden comprender polinucleótidos. Estos pueden comprender ADN o ARN.
Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Además, pueden ser polinucleótidos que incluyan dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos distintos de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. A los efectos del presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden modificar por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividad in vivo o la vida útil de polinucleótidos de interés.
Cuando el polinucleótido es bicatenario, ambas hebra del dúplex, ya sea individualmente o en combinación, están abarcadas por los métodos y composiciones descritas en el presente documento. Cuando el polinucleótido es monocatenario, debe entenderse que también se incluye la secuencia complementaria de ese polinucleótido.
Variantes, derivados y homólogos
Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) nucleótidos de o en la secuencia. La secuencia resultante puede ser capaz de codificar un polipéptido que tiene actividad de unión a PRL tal como se describe en otra parte del presente documento.
Tal como se indica anteriormente, con respecto a la identidad de secuencia, un "homólogo" tiene al menos un 5 % de identidad, al menos un 10 % de identidad, al menos un 15% de identidad, al menos un 20% de identidad, al menos un 25 % de identidad, al menos un 30 % de identidad, al menos un 35 % de identidad, al menos un 40 % de identidad, al menos un 45 % de identidad, al menos un 50 % de identidad, al menos un 55 % de identidad, al menos un 60 % de identidad, al menos un 65 % de identidad, al menos un 70 % de identidad, al menos un 75 % de identidad, al menos un 80 % de identidad, al menos un 85 % de identidad, al menos un 90 % de identidad, o al menos un 95 % de identidad con una secuencia relevante.
Puede haber al menos un 95 % de identidad, tal como al menos un 96 % de identidad, tal como al menos un 97 % de identidad, tal como al menos un 98 % de identidad, tal como al menos un 99 % de identidad. Las comparaciones de homología de nucleótidos se pueden realizar tal como se describió anteriormente. Un programa de comparación de secuencias tal como el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente se puede utilizar para este propósito. La matriz de puntuación predeterminada tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleótido idéntico y -9 para cada desajuste. La penalización por creación de huecos por defecto es -50 y la penalización por extensión de hueco por defecto es -3 para cada nucleótido.
Hibridación
Los presentes inventores describen además secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar selectivamente con cualquiera de las secuencias presentadas en el presente documento, tales como la región variable 269, 223 y 318, el anticuerpo y el anticuerpo humanizado o cualquier variante, fragmento o derivado del mismo, o al complemento de cualquiera de los anteriores. Las secuencias de nucleótidos pueden tener al menos 15 nucleótidos de longitud, tal como de al menos 20, 30, 40 o 50 nucleótidos de longitud.
El término "hibridación", tal como se usa en el presente documento, incluirá "el proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través del emparejamiento de bases" así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa.
Los polinucleótidos capaces de hibridar selectivamente con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento, o con su complemento, serán generalmente al menos el 70 %, tal como al menos el 80 o el 90 % y tal como al menos el 95 % o el 98 % homólogas a las correspondientes secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento en una región de al menos 20, tal como al menos 25 o 30, por ejemplo al menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos.
La expresión "hibridable selectivamente" significa que el polinucleótido usado como sonda se usa en condiciones en las que se descubre que un polinucleótido diana hibrida con la sonda a un nivel significativamente superior al de fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir debido a la presencia de otros polinucleótidos, por ejemplo, en la biblioteca de ADNc o ADN genómico que se está cribando. En este suceso, el fondo implica un nivel de señal generado por la interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la biblioteca que es menos de 10 veces, tal como menos de 100 veces más intensa que la interacción específica observada con el ADN diana. La intensidad de la interacción se puede medir, por ejemplo, mediante radiomarcaje de la sonda, por ejemplo, con 32P. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión del ácido nucleico, tal como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una "rigurosidad" definida tal como se explica a continuación. La rigurosidad máxima ocurre normalmente a aproximadamente una Tf de -5 °C (5 °C por debajo de la Tf de la sonda); la alta rigurosidad a aproximadamente 5 °C a 10 °C por debajo de la Tf; la rigurosidad intermedia a aproximadamente 10 °C a 20 °C por debajo de la Tf; y la rigurosidad baja a aproximadamente 20 °C a 25 °C por debajo de la Tf. Como entenderán los expertos en la materia, se puede usar una hibridación de rigurosidad máxima para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas idénticas, mientras que se puede usar una hibridación de rigurosidad intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas. Los presentes inventores desvelan secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con un ácido nucleico, o un fragmento, homólogo, variante o derivado del mismo, en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65 °C y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, Na3 Citrato 0,015 M a pH 7,0}).
Cuando un polinucleótido es bicatenario, ambas hebra del dúplex, ya sea individualmente o en combinación, están abarcados por la presente divulgación. Cuando el polinucleótido es monocatenario, debe entenderse que también se desvela y abarca la secuencia complementaria de ese polinucleótido.
Los polinucleótidos que no son 100 % homólogos a las secuencias desveladas en el presente documento pero que se encuentran dentro de la divulgación se pueden obtener de varias formas. Se pueden obtener otras variantes de las secuencias descritas en el presente documento, por ejemplo, sondeando bibliotecas de ADN elaboradas a partir de varios individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, se pueden obtener otros homólogos víricos/bacterianos o celulares, particularmente homólogos celulares que se encuentran en células de mamíferos (por ejemplo, células de rata, ratón, bovinas y de primates), y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en la lista de secuencias del presente documento. Dichas secuencias se pueden obtener sondeando bibliotecas de ADNc preparadas a partir de bibliotecas de ADN genómico de otras especies animales, y sondeando dichas bibliotecas con sondas que comprenden todas o parte de las secuencias descritas en condiciones de rigurosidad media a alta. Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden usar para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador revelador por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos serán de al menos 15, tal como al menos 20, por ejemplo, de al menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también están abarcados por el término polinucleótidos tal como se usa en el presente documento. Los fragmentos pueden tener menos de 500, 200, 100, 50 o 20 nucleótidos de longitud.
Los polinucleótidos, tales como los polinucleótidos de ADN y las sondas, se pueden producir de forma recombinante, sintéticamente o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También se pueden clonar mediante técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por medios de síntesis, que implican una fabricación por etapas de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido a la vez. Las técnicas para lograr esto usando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la materia.
Los polinucleótidos más largos generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, utilizando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará la fabricación de un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanqueen una región de la secuencia que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de modo que el ADN amplificado se pueda clonar en un vector de clonación adecuado.
POLIPÉPTIDOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS DE PRL
Los homólogos de polipéptidos PRL-1 y PRL-3, variantes, derivados y fragmentos se pueden definir de manera similar, tal como se ha establecido en párrafos anteriores.
Cuando el contexto lo permita, se debe tomar una referencia al polipéptido PRL-1 para incluir una referencia a un homólogo del polipéptido PRL-1, variante, derivado o fragmento. De forma similar, se debe tomar una referencia al polipéptido PRL-3 para incluir una referencia a un homólogo del polipéptido PRL-3, variante, derivado o fragmento. De forma similar, cuando el contexto lo permita, se debe tomar una referencia al ácido nucleico de PRL-1 para incluir una referencia a un homólogo de ácido nucleico PRL-1, variante, derivado o fragmento. De forma similar, se debe tomar una referencia al polipéptido PRL-3 para incluir una referencia a un homólogo de ácido nucleico PRL-3, variante, derivado o fragmento.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-PRL
El anticuerpo anti-PRL se puede producir mediante métodos de ADN recombinante o métodos químicos de péptidos sintéticos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
A modo de ejemplo, el anticuerpo anti-PRL se puede sintetizar mediante técnicas bien conocidas en la materia, como se ejemplifica en "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton y R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Inglaterra. De forma similar, se pueden sintetizar múltiples fragmentos que posteriormente se unen entre sí para formar fragmentos más grandes. Estos fragmentos de péptidos sintéticos también se pueden preparar con sustituciones de aminoácidos en ubicaciones específicas para probar la actividad in vitro e in vivo.
El anticuerpo anti-PRL se puede sintetizar en una instalación microquímica estándar y comprobar su pureza con HPLC y espectrofotometría de masas. Los métodos de síntesis de péptidos, purificación por HPLC y espectrofotometría de masas son comúnmente conocidos por los expertos en estas técnicas.
El anticuerpo anti-PRL también se puede expresar en condiciones in vitro e in vivo en una célula hospedadora transformada en la que se han incorporado las secuencias de ADN descritas en el presente documento (tales como secuencias variables) o variaciones alélicas de las mismas y que se pueden usar en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el cáncer.
El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación. El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de la expresión in vivo o in vitro. El término "vector de transformación" significa una construcción capaz de ser transferida de una especie a otra.
Los vectores que se pueden usar para la expresión incluyen vectores víricos recombinantes, en particular vectores retrovíricos recombinantes (RRV) tales como los vectores lentivíricos, vectores adenovíricos que incluyen una combinación de vectores retrovíricos.
El término "vector retrovírico recombinante" (RRV) se refiere a un vector con suficiente información genética retrovírica para permitir el empaquetamiento de un genoma de ARN, en presencia de componentes de empaquetamiento, en una partícula vírica capaz de infectar una célula diana. La infección de la célula diana incluye la transcripción inversa y la integración en el genoma de la célula diana. El RRV lleva secuencias codificantes no víricas que se deben administrar por el vector a la célula diana. Un RRV es incapaz de una replicación independiente para producir partículas retrovíricas infecciosas dentro de la célula diana final. Por lo general, el RRV carece de un gen gag pol y/o env funcional y/u otros genes esenciales para la replicación. Los vectores que se pueden usar incluyen vectores víricos de viruela recombinantes tales como el virus de la viruela aviar (FPV), el virus de la viruela en insectos, el virus vaccinia como NYVAC, virus de la viruela del canario, MVA u otros sistemas de vectores víricos no replicantes tales como los descritos, por ejemplo, en el documento WO9530018.
Los virus de la viruela se pueden diseñar para la expresión de genes recombinantes y para su uso como vacunas vivas recombinantes en un enfoque inmunoterapéutico dual. El principal motivo para utilizar virus vivos atenuados, tales como virus, como vehículos de administración y/o candidatos a vacunas basadas en vectores, proviene de su capacidad para provocar respuestas inmunitarias mediadas por células. Los vectores víricos, tal como se describen anteriormente, son capaces de emplearse como vehículos de administración y como candidatos a vacunas basadas en vectores debido a la inmunogenicidad de sus proteínas constitutivas, que actúan como adyuvantes para mejorar la respuesta inmunitaria, haciendo así una secuencia de nucleótidos de interés (NDI) tal como una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-PRL más inmunogénico.
Las estrategias de vacunación contra el virus de la viruela han utilizado técnicas recombinantes para introducir NDI en el genoma del virus de la viruela. Si el NDI está integrado en un sitio del ADN vírico que no es esencial para el ciclo vital del virus, es posible que el virus de la viruela recombinante recién producido sea infeccioso, es decir, infectar células extrañas y así expresar el NDI integrado. El virus de la viruela recombinante preparado de esta manera se puede usar como vacunas vivas para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades patológicas e infecciosas y/o cáncer.
Otros requisitos para los sistemas de administración de vectores víricos de la viruela incluyen una buena inmunogenicidad y seguridad. El MVA es una cepa de vaccinia con replicación alterada con un buen historial de seguridad. En la mayoría de los tipos de células y tejido humano normal, el MVA no se replica. Se observa una replicación limitada de MVA en unos pocos tipos de células transformadas, tales como las células BHK21. Carroll et al (1997 Vaccine15: 387-394) han demostrado que el MVA recombinante es tan bueno como los vectores de vaccinia recombinantes convencionales para generar una respuesta protectora de linfocitos T CD8+ y es una alternativa eficaz al virus vaccinia competente en replicación usado más comúnmente. Las cepas de virus vaccinia obtenidas del MVA, o cepas desarrolladas independientemente que tienen las características del MVA que hacen que el MVA sea particularmente adecuado para su uso en una vacuna, también es adecuado para su uso como vehículo de administración.
La secuencia de nucleótidos de interés, y cuya expresión se desea, puede estar operativamente enlazada a una unidad de transcripción. La expresión "unidad de transcripción", tal como se describe en el presente documento, son regiones de ácido nucleico que contienen secuencias codificantes y las señales para lograr la expresión de esas secuencias codificantes independientemente de cualquier otra secuencia codificante. Por lo tanto, cada unidad de transcripción generalmente comprende al menos un promotor, un potenciador opcional y una señal de poliadenilación. El término "promotor" se utiliza en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión de la ARN polimerasa. El promotor puede contener un elemento potenciador. El término "potenciador" incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes proteicos del complejo de inicio de la transcripción y, por tanto, facilita el inicio de la transcripción dirigida por su promotor asociado. El término "célula" incluye cualquier organismo adecuado. La célula puede comprender una célula de mamífero, tal como una célula humana.
La expresión "célula transformada" significa una célula que tiene una estructura genética modificada. Por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, una célula tiene una estructura genética modificada cuando se ha introducido en la célula un vector tal como un vector de expresión. El término "organismo" incluye cualquier organismo adecuado. El organismo puede comprender un mamífero tal como un ser humano.
En el presente documento, la expresión "organismo transgénico" significa un organismo que comprende una estructura genética modificada. Por ejemplo, el organismo puede tener una estructura genética modificada si se ha introducido en el organismo un vector tal como un vector de expresión.
EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS
Además, los presentes inventores describen un método que comprende transformar una célula hospedadora con una o las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento, tal como las regiones variables 269, 223 o 318, las secuencias de anticuerpos o las secuencias de anticuerpos humanizados.
Los presentes inventores también proporcionan un método que comprende cultivar una célula hospedadora transformada, cuya célula se ha transformado con una o dichas secuencias de nucleótidos en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-PRL codificado por dichas secuencias de nucleótidos.
Los presentes inventores proporcionan además un método que comprende cultivar una célula hospedadora transformada, cuya célula se ha transformado con una o dichas secuencias de nucleótidos en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-PRL codificado por dichas secuencias de nucleótidos; y luego recuperar dicho anticuerpo anti-PRL del cultivo de células hospedadoras transformadas.
Por lo tanto, los anticuerpos anti-PRL que codifican secuencias de nucleótidos, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, se pueden usar para generar moléculas de ADN recombinante que dirijan la expresión de las mismas en células hospedadoras apropiadas.
A modo de ejemplo, el anticuerpo anti-PRL se puede producir en sistemas de expresión recombinante de E. coli, de levaduras o de mamíferos, y se puede purificar con cromatografía en columna.
En ciertas circunstancias, existen ventajas derivadas del uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede llevar a mejorar las proporciones de tumor frente a no tumor. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar a partir de E. coli, permitiendo de esta manera la producción de grandes cantidades de dichos fragmentos. Las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL se pueden unir operativamente a una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL en una célula hospedadora adecuada. Cuando se inserta en la célula hospedadora, la célula hospedadora transformada se puede cultivar en condiciones adecuadas hasta que se alcancen niveles suficientes del anticuerpo anti-PRL, después de lo cual las células se pueden lisar y se aísla el anticuerpo anti-PRL.
Las células hospedadoras transformadas con el anticuerpo anti-PRL que codifica las secuencias de nucleótidos se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación del anticuerpo anti-PRL del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante se puede secretar o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como entenderán los expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL se pueden diseñar con secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL a través de una membrana celular procariota o eucariota particular.
Otras construcciones recombinantes pueden unir la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-PRL a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12:441-5 3', véase también la discusión a continuación sobre vectores que contienen proteínas de fusión).
El anticuerpo anti-PRL también se puede expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Dichos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales como los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación de metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3-26328 1), dominios de proteína A que permiten la purificación de inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema FLAGS de purificación por extensión/afinidad (Immunex Corp, Seattle, WA). La inclusión de una secuencia enlazadora escindible como el Factor XA o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el anticuerpo anti-PRL es útil para facilitar la purificación.
Las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento se pueden diseñar para alterar las secuencias que codifican el anticuerpo anti-PRL por varias razones, incluidas, entre otras, las alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir usando técnicas que son bien conocidas en la materia, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glucosilación o para cambiar la preferencia de codones.
En otra realización, un o el anticuerpo anti-PRL natural, modificado o recombinante que codifica secuencias de nucleótidos se puede unir a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. A modo de ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión que comprenden el anticuerpo anti-PRL o un fragmento enzimáticamente activo o derivado del mismo unido a un marcador de afinidad tal como glutatión-S-transferasa (GST), biotina, His6, marcador ac-myc (véase Emrich et al 1993 BiocemBiophys Res Commun 197(1): 21220), hemaglutinina (HA) (tal como se describe en Wilson et al (1984 Cell 37767) o un epítopo FLAG (Ford et al 1991 Protein Expr Purif Abr; 2 (2):95-107).
La proteína recombinante fusionada puede comprender una coproteína antigénica tal como GST, beta-galactosidasa o la lipoproteína D de Haemophillls influenzae que son co-proteínas relativamente grandes, que solubilizan y facilitan su producción y purificación. Como alternativa, la proteína fusionada puede comprender una proteína de vehículo tal como albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). En determinadas realizaciones, la secuencia marcadora puede comprender un péptido de hexahistidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen Inc) y se describe en Gentz et al (1989 PNAS 86: 821-824). Dichas proteínas de fusión se pueden expresar fácilmente en cultivo de levadura (tal como se describe en Mitchell et al. 1993 Yeast 5:715-723) y se purifican fácilmente mediante cromatografía de afinidad. También se puede diseñar genéticamente una proteína de fusión para que contenga un sitio de escisión ubicado entre la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-PRL y la secuencia de la proteína heteróloga, de modo que el anticuerpo anti-PRL se pueda escindir y purificar del resto heterólogo. En otra realización, se puede realizar un ensayo para la proteína diana usando la proteína de fusión unida completa. Como alternativa, la coproteína puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunológico. La coproteína se puede unir al extremo amino o carboxilo de la primera proteína.
Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen marcador sugiere que la secuencia de nucleótidos del anticuerpo anti-PRL también está presente, debe confirmarse su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-PRL se inserta dentro de una secuencia de gen marcador, las células recombinantes que contienen las regiones codificantes del anticuerpo anti-PRL se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, se puede colocar un gen marcador junto con una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-PRL bajo el control de un solo promotor.
La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección suele indicar también la expresión del anticuerpo anti-PRL.
Los métodos adicionales para cuantificar la expresión de una molécula particular incluyen el radiomarcaje (Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235-44) o la biotinilación (Duplaa C et al 1993 Anal Biochem229-36) de nucleótidos, la coamplificación de un ácido nucleico de control y curvas estándar en las que se interpolan los resultados experimentales.
La cuantificación de múltiples muestras se puede acelerar ejecutando el ensayo en un formato ELISA donde el anticuerpo anti-PRL de interés se presenta en varias diluciones y una respuesta espectrofotométrica o calorimétrica proporciona una cuantificación rápida.
Las secuencias de nucleótidos del anticuerpo anti-PRL alteradas que se pueden preparar o usar incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos que dan como resultado una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo o un anticuerpo anti-PRL funcionalmente equivalente. A modo de ejemplo, el anticuerpo anti-PRL expresado también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan lugar a un anticuerpo anti-PRL funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos, siempre que se conserve la afinidad de unión del anticuerpo anti-PRL. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico: los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos de grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
También se puede emplear la terapia génica mediante la cual se regula in vivo el anticuerpo anti-PRL que codifica las secuencias de nucleótidos tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la regulación de la expresión se puede lograr administrando compuestos que se unen a las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL, o regiones de control asociadas con la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-PRL o su correspondiente transcripción de ARN para modificar la velocidad de transcripción o traducción.
A modo de ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PRL descritas en el presente documento pueden estar bajo el control de la expresión de un elemento regulador de la expresión, generalmente un promotor o un promotor y potenciador. El potenciador y/o promotor puede ser preferentemente activo en un entorno hipóxico o isquémico o bajo en glucosa, de manera que el anticuerpo anti-PRL que codifica las secuencias de nucleótidos se exprese preferentemente en los tejidos particulares de interés, tal como en el entorno de una célula o masa tumoral. Por lo tanto, se puede reducir o eliminar cualquier efecto biológico significativo o efecto deletéreo del anticuerpo anti-PRL que codifica las secuencias de nucleótidos en el individuo que está siendo tratado. El elemento potenciador u otros elementos que confieren expresión regulada pueden estar presentes en múltiples copias.
El promotor y/o potenciador puede ser constitutivamente eficaz, o puede estar restringido al tejido o temporalmente en su actividad. Ejemplos de promotores/potenciadores restringidos al tejido adecuados son aquellos que son muy activos en células tumorales tales como un promotor/potenciador de un gen MUC1, un gen CEA o un gen de antígeno STV. Ejemplos de promotores/potenciadores temporalmente restringidos son aquellos que responden a isquemia y/o hipoxia, tales como elementos de respuesta a hipoxia o el promotor/potenciador del gen agrp78 o agrp94. El promotor de alfafetoproteína (AFP) también es un promotor específico de tumor. Otra combinación de promotor-potenciador es una combinación de promotor/potenciador principal inmediato temprano (PIT) de citomegalovirus humano (hCMV).
Los promotores pueden ser específicos de tejido. Esto es, pueden ser capaces de impulsar la transcripción de un anticuerpo anti-PRL que codifica secuencias de nucleótidos en un tejido mientras permanecen en gran parte "silenciosas" en otros tipos de tejidos.
El término "específico de tejido" significa un promotor que no está restringido en actividad a un solo tipo de tejido pero que, sin embargo, muestra selectividad porque pueden ser activos en un grupo de tejidos y menos activos o silenciosos en otro grupo. Una característica deseable de tales promotores es que poseen una actividad relativamente baja en ausencia de elementos potenciadores activados regulados por hipoxia, incluso en el tejido diana. Un medio de lograr esto es utilizar elementos "silenciadores" que suprimen la actividad de un promotor seleccionado en ausencia de hipoxia.
El término "hipoxia" significa una condición bajo la cual un órgano o tejido particular recibe un suministro inadecuado de oxígeno.
El nivel de expresión de un anticuerpo anti-PRL que codifica secuencias de nucleótidos bajo el control de un promotor particular puede modularse manipulando la región del promotor. Por ejemplo, diferentes dominios dentro de una región promotora pueden poseer diferentes actividades reguladoras de genes. Las funciones de estas diferentes regiones se evalúan normalmente usando construcciones de vector que tienen diferentes variantes del promotor con regiones específicas delecionadas (es decir, análisis de deleción). Este enfoque se puede utilizar para identificar, por ejemplo, la región más pequeña capaz de conferir especificidad tisular o la región más pequeña que confiere sensibilidad a la hipoxia.
Se pueden usar varios promotores específicos de tejido descritos anteriormente. En la mayoría de los casos, estos promotores se pueden aislar como fragmentos de digestión de restricción convenientes adecuados para la clonación en un vector seleccionado. Como alternativa, los fragmentos de promotor se pueden aislar usando la reacción en cadena de la polimerasa. La clonación de los fragmentos amplificados se puede facilitar incorporando sitios de restricción en el extremo 5' de los cebadores.
TERAPIA DE COMBINACIÓN
Los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento se pueden usar en combinación con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades.
A modo de ejemplo, los anticuerpos anti-PRL también se pueden usar en combinación con tratamientos convencionales de enfermedades como el cáncer. Por ejemplo, un tumor se puede tratar convencionalmente con cirugía, radiación o quimioterapia combinada con un anticuerpo anti-PRL o se puede administrar posteriormente al paciente un anticuerpo anti-PRL para prolongar la latencia de las micrometástasis y estabilizar cualquier tumor primario residual.
El anticuerpo anti-PRL se puede administrar con un agente terapéuticamente eficaz en el mismo momento y en el mismo sitio. Como alternativa, el anticuerpo anti-PRL y el agente terapéuticamente eficaz se pueden administrar en un momento diferente y en un sitio diferente. El anticuerpo anti-PRL y el agente terapéuticamente eficaz se pueden administrar incluso en el mismo vehículo de administración para la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
Los anticuerpos anti-PRL se pueden usar en combinación con agentes citotóxicos para la prevención y/o el tratamiento de la angiogénesis y/o el cáncer. Los agentes citotóxicos tales como ricina, unidos a anticuerpos anti-PRL, antisueros de anticuerpos anti-PRL, agonistas y antagonistas del receptor de anticuerpos anti-PRL proporcionan una herramienta para la destrucción de células que expresan PRL-1 o PRL-3. Estas células se pueden encontrar en muchos lugares, incluyendo, pero sin limitación, micrometástasis y tumores primarios.
Los anticuerpos anti-PRL se pueden usar en combinación con una enzima activadora de profármacos en terapia génica. En lugar de, o además de expresarse selectivamente en tejidos diana, el anticuerpo anti-PRL se puede usar en combinación con otra molécula, tal como una enzima de activación de profármacos o enzimas que no tienen un efecto significativo o ningún efecto deletéreo hasta que el individuo se trata con uno o más profármacos sobre los que actúan la enzima o las enzimas. En presencia de la enzima de activación del profármaco, el tratamiento activo de un individuo con el profármaco apropiado lleva a una mayor reducción en el crecimiento o supervivencia del tumor.
Se puede administrar una enzima activadora de profármacos al sitio de un tumor para el tratamiento de un cáncer. En cada caso, se usa un profármaco adecuado en el tratamiento del paciente en combinación con la enzima activadora del profármaco apropiado. Se administra un profármaco apropiado junto con el vector. Los ejemplos de profármacos incluyen: fosfato de etopósido (con fosfatasa alcalina, Senter et al. 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 48424846); 5-fluorocitosina (con citosina desaminasa, Mullen et al 1994 Cancer Res 54: 1503-1506); Doxorrubicina-N-p-hidroxifenoxiacetamida (con penicilina-V-amidasa, Kerr et al 1990 Cancer Immunol Immunother 31: 202-206); Para-N-bis(2-cloroetil) aminobenzoil glutamato (con carboxipeptidasa G2); Carbamatos de cefalosporina nitrogenada de mostaza (con betalactamasa); SR4233 (con reductasa P450); Ganciclovir (con timidina quinasa de HSV, Borrelli et al. 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 7572-7576); profármacos de mostaza con nitrorreductasa (Friedlos et al. 1997 J Med Chem 40: 1270-1275) y ciclofosfamida (con P450 Chen et al. 1996 Cancer Res 56: 1331-1340).
Ejemplos de enzimas de activación de profármacos incluyen una timidina fosforilasa que activa los profármacos de 5-fluoro-uracilo capcetabina y furtulón; timidina quinasa del virus del herpes simple que activa el ganciclovir; un citocromo P450 que activa un profármaco tal como ciclofosfamida a un agente que daña el ADN; y citosina desaminasa que activa la 5-fluorocitosina. Se puede usar una enzima de origen humano.
Otras moléculas adecuadas incluyen aquellas que son de aplicación terapéutica y/o diagnóstica tales como, pero sin limitación: secuencias que codifican citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas de tipo inmunoglobulina diseñadas genéticamente, un anticuerpo monocatenario, proteínas de fusión, enzimas, moléculas coestimuladoras inmunes, moléculas inmunomoduladoras, ARN antisentido, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno, una proteína supresora de tumores y factores de crecimiento, proteínas de membrana, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas y ribozimas antivíricas y derivados de las mismas (tal como con un grupo reportero asociado). Cuando se incluye, tales secuencias codificantes pueden estar normalmente unidas operativamente a un promotor adecuado, que puede ser un promotor que promueve la expresión de una(s) ribozima(s), o un promotor o promotores diferentes, tal como en uno o más tipos de células específicas.
Las moléculas pueden ser proteínas secretadas por la célula. Como alternativa, las moléculas no se secretan y están activas dentro de la célula. En cualquier caso, las moléculas pueden demostrar un efector de vecindad o un efecto de vecindad distante; que es la producción del producto de expresión en una célula que lleva a la muerte de células adicionales relacionadas, ya sean vecinas o distantes (por ejemplo, metastásicas), que poseen un fenotipo común.
Las moléculas adecuadas para su uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer incluyen proteínas (o ácidos nucleicos que codifican proteínas) que: destruyen la célula diana (por ejemplo, una toxina ribosómica), actúan como: supresores de tumores (tal como p53 de tipo silvestre); activadores de mecanismos inmunes antitumorales (tales como citocinas, moléculas coestimuladoras e inmunoglobulinas); inhibidores de la angiogénesis; o que proporcionan una mayor sensibilidad a los fármacos (tal como las enzimas de activación de profármacos); estimulan indirectamente la destrucción de la célula diana por las células efectoras naturales (por ejemplo, un antígeno fuerte para estimular el sistema inmunológico o convertir una sustancia precursora en una sustancia tóxica que destruye la célula diana (por ejemplo, una enzima activadora de profármacos). Las proteínas codificadas también podrían destruir las células tumorales vecinas (por ejemplo, con la proteína de fusión secretada anticuerpo antitumoral-toxina ribosómica), estimulan indirectamente la destrucción de las células tumorales vecinas (por ejemplo, citocinas para estimular el sistema inmunológico o proteínas procoagulantes que causan oclusión vascular local) o convierten una sustancia precursora en una sustancia tóxica que destruye las células tumorales vecinas (por ejemplo, una enzima que activa un profármaco en un fármaco difusible).
Se pueden administrar transcritos antisentido o ribozimas que interfieren con la expresión de genes celulares para la persistencia del tumor (por ejemplo, contra transcritos myc anómalos en el linfoma de Burkitt o contra transcritos bcrabl en la leucemia mieloide crónica) para mejorar la función de eliminación de células cancerosas o la función de prevención de metástasis de los anticuerpos anti-PRL. También se prevé el uso de combinaciones de tales moléculas.
Se pueden encontrar ejemplos de moléculas terapéuticas regulables por hipoxia en el documento PCT/GB95/00322 (WO-A-9521927).
CONJUGADOS DE ANTICUERPOS ANTI-PRL
El direccionamiento de células que expresan el antígeno PRL-1 o PRL-3 con los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento facilita el desarrollo de fármacos para modular la actividad de las células que expresan PRL-1 o PRL-3.
Se pueden sintetizar diferentes anticuerpos anti-PRL para su uso en varias aplicaciones que incluyen pero no se limitan a la unión de un anticuerpo anti-PRL a agentes citotóxicos para la destrucción dirigida de células que se unen al anticuerpo anti-PRL.
El anticuerpo anti-PRL descrito en el presente documento se puede acoplar a otras moléculas usando métodos convencionales. Los extremos amino y carboxilo terminal del anticuerpo anti-PRL se pueden marcar isotópicamente y no isotópicamente con muchas técnicas, por ejemplo, radiomarcaje utilizando técnicas convencionales (restos de tirosina-cloramina T, iodógeno, lactoperoxidasa; restos de lisina-reactivo de Bolton-Hunter). Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los expertos en la técnica. La técnica de acoplamiento se elige basándose en los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos, incluidos, pero sin limitación, amino, sulfhidral, carboxilo, amida, fenol e imidazol. Diversos reactivos utilizados para efectuar estos acoplamientos incluyen, entre otros, glutaraldehído, bencidina diazotizada, carbodiimida y p-benzoquinona.
Los anticuerpos anti-PRL se pueden acoplar químicamente a isótopos, enzimas, proteínas de vehículo, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes y otros compuestos para varias aplicaciones. La eficacia de la reacción de acoplamiento se determina usando diferentes técnicas apropiadas para la reacción específica. Por ejemplo, el radiomarcaje de un polipéptido PRL-1 o PRL-3 con 125I se logra usando cloramina T y Na125I de alta actividad específica. La reacción se detiene con metabisulfito de sodio y la mezcla se desala en columnas desechables. El anticuerpo marcado se eluye de la columna y se recogen las fracciones. Se extraen alícuotas de cada fracción y se mide la radiactividad en un contador gamma. De esta manera, el Na125I sin reaccionar está separado del polipéptido PRL-1 o PRL-3 marcado. Las fracciones de péptidos con la radiactividad específica más alta se almacenan para su uso posterior, tal como el análisis de la capacidad para unirse a un anticuerpo anti-PRL.
El uso de anticuerpos anti-PRL marcados con isótopos de vida corta permite la cuantificación de la visualización de los sitios de unión de PRL-1 o PRL-3 in vivo utilizando autorradiografía, radiografía moderna u otras técnicas de unión a membranas tales como la tomografía por emisión de positrones para localizar tumores con sitios de unión de anticuerpos anti-PRL. La presente solicitud proporciona importantes herramientas de diagnóstico e investigación. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PRL se puede acoplar a un radiomarcaje gammagráfico, un compuesto citotóxico o radioisótopo, una enzima para convertir un profármaco no tóxico en un fármaco citotóxico, un compuesto para activar el sistema inmunológico con el fin de dirigir el conjugado resultante a un tumor de colon, o un compuesto estimulante de células. Tales conjugados tienen una "porción de unión", que consta del anticuerpo anti-PRL y una "porción funcional", que consiste en el radiomarcador, la toxina o la enzima.
Como alternativa, el anticuerpo se puede usar solo para bloquear simplemente la actividad del antígeno PRL-1 o PRL-3, particularmente al interferir físicamente con su unión de otro compuesto.
La porción de unión y la porción funcional del conjugado (si también es un péptido o polipéptido) se pueden unir mediante cualquiera de las formas convencionales de reticulación de polipéptidos, tales como las descritas de forma general en O'Sullivan et al (Anal. Biochem 1979: 100, 100-108). Por ejemplo, una porción puede enriquecerse con grupos tiol y la otra porción puede reaccionar con un agente bifuncional capaz de reaccionar con esos grupos tiol, por ejemplo el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido yodoacético (NHIA) o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Los enlaces amida y tioéter, por ejemplo conseguidos con éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, son generalmente más estables in vivo que los enlaces disulfuro.
Como alternativa, si la porción de unión contiene carbohidratos, como sería el caso de un anticuerpo o algunos fragmentos de anticuerpos, la porción funcional se puede unir a través de la parte de carbohidrato usando la tecnología de unión en el documento EP 0088695.
La porción funcional del conjugado puede ser una enzima para convertir un profármaco no tóxico en un fármaco tóxico, por ejemplo, los conjugados de Bagshawe y sus colegas (Bagshawe (1987) Br. 1. Cancer 56, 531; Bagshawe et al (Br. 1. Cancer 1988: 58, 700); documento WO 88/07378) o sistemas de liberación de cianuro (documento WO 91/11201).
La porción funcional del conjugado de anticuerpos anti-PRL, cuando se usa el conjugado de anticuerpos anti-PRL para el diagnóstico, puede comprender o consistir en un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tecnecio 99m (99mTc) o yodo-123 (123I) o un marcador de spin para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (rmn) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, irm), tales como nuevamente, yodo-123, yodo-313, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Cuando se usa en un compuesto para la destrucción selectiva del tumor, la porción funcional del anticuerpo anti-PRL puede comprender un átomo altamente radiactivo, tal como yodo-131, renio-186, renio-188, itrio-90 o plomo-212, que emite suficiente energía para destruir las células vecinas, o un compuesto químico citotóxico tal como el metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), daunorrubicina u otros agentes intercalantes.
Los marcadores radioactivos u otros marcadores pueden incorporarse al conjugado de anticuerpo anti-PRL según modos conocidos. Por ejemplo, el péptido se puede sintetizar de manera biológica o se puede sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que incluyen, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores tales como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh y 111In se pueden unir a través de un resto de cisteína en el péptido. Puede unirse itrio-90 a través de un resto de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede usar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscinigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Puede que no sea necesario que toda la enzima esté presente en el conjugado, pero, por supuesto, la porción catalítica debe estar presente. Se pueden utilizarse las denominadas "abzimas", cuando se genera un anticuerpo anti-PRL contra un compuesto involucrado en la reacción que se desea catalizar, generalmente el estado intermedio reactivo. El anticuerpo resultante puede entonces funcionar como una enzima para la reacción.
El conjugado se puede purificar por exclusión de tamaño o cromatografía de afinidad y se puede probar para actividades biológicas duales. La inmunorreactividad del antígeno se puede medir usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) con antígeno inmovilizado y en un radioinmunoensayo de células vivas. Se puede utilizar un ensayo enzimático para la p-glucosidasa utilizando un sustrato que cambia de absorbancia cuando se hidrolizan los restos de glucosa, tal como oNPG (o-nitrofenil-p-D-glucopiranósido), liberando 2-nitrofenol que se mide espectrofotométricamente a 405 nm.
Se puede probar la estabilidad del conjugado in vitro inicialmente mediante incubación a 37 °C en suero, seguido de análisis FpLC de exclusión por tamaño. La estabilidad in vivo se puede probar de la misma manera en ratones analizando el suero en varios momentos después de la inyección del conjugado. Además, es posible radiomarcar el anticuerpo anti-PRL con 125I, y la enzima con 131I antes de la conjugación, y determinar la biodistribución del conjugado, anticuerpo anti-PRL libre y enzima libre en un animal, por ejemplo, un ratón.
Como alternativa, el conjugado se puede producir como un compuesto de fusión mediante técnicas de ADN recombinante mediante las cuales una longitud de ADN comprende regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
Posiblemente, dos de las porciones funcionales del compuesto se pueden solapar total o parcialmente. A continuación, el ADN se expresa en un hospedador adecuado de formas conocidas.
KITS DE DIAGNÓSTICO
Los presentes inventores también divulgan métodos y kits de diagnóstico para la detección y medición de PRL-1 o PRL-3 en tejidos y fluidos biológicos, y para la localización de PRL-1 o PRL-3 en tejidos.
Los anticuerpos anti-PRL también se pueden usar en un método y kit de diagnóstico para detectar y cuantificar anticuerpos capaces de unirse a PRL-1 o PRL-3. Estos kits pueden permitir la detección de PRL-1 o pRL-3 que, en determinadas situaciones, puede indicar la diseminación de micrometástasis por tumores primarios in situ. Los pacientes que tienen tales anticuerpos anti-PRL-1 o PRL-3 en circulación pueden tener más probabilidades de desarrollar tumores y cánceres, y pueden tener más probabilidades de tener recurrencias del cáncer después de tratamientos o períodos de remisión.
También se contemplan kits para medir la PRL-1 o la PRL-3. Los anticuerpos anti-PRL que poseen un alto título y especificidad se pueden utilizar para establecer kits fáciles de usar para mediciones rápidas, fiables y sensibles y localización específica de PRL-1 o PRL-3 en extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivo celular.
Estos kits de ensayo incluyen, pero no se limitan a, las siguientes técnicas; ensayos competitivos y no competitivos, radioinmunoensayo, ensayos de bioluminiscencia y quimioluminiscencia, ensayos fluorométricos, ensayos de tipo sándwich, ensayos inmunorradiométricos, análisis por transferencia de puntos, ensayos ligados a enzimas, incluido ELISA, placas de microtitulación, tiras o tiras reactivas recubiertas de anticuerpos para un control rápido de la orina o la sangre e inmunocitoquímica. Para cada kit se establecen el rango, sensibilidad, precisión, fiabilidad, especificidad y reproducibilidad del ensayo. La variación intraensayo e interensayo se establece en puntos del 20 %, 50 % y 80 % en las curvas estándar de desplazamiento o actividad.
Un ejemplo de un kit de ensayo comúnmente utilizado en la investigación y en la clínica es un kit de radioinmunoensayo (RIA). Después de la radioyodación y la purificación con éxito de un anticuerpo anti-PRL, el antisuero que posee el título más alto se añade en varias diluciones a tubos que contienen una cantidad relativamente constante de radiactividad, tal como 10.000 cpm, en un sistema tampón adecuado. Otros tubos contienen tampón o suero preinmune para determinar la unión no específica. Después de incubación a 4 °C durante 24 horas, se añade proteína A y los tubos se agitan vorticialmente, se incuban a temperatura ambiente durante 90 minutos y se centrifugan a aproximadamente 2000-2500 veces g a 4 °C para precipitar los complejos de antisuero unidos al anticuerpo anti-PRL marcado. El sobrenadante se elimina por aspiración y la radiactividad de los gránulos se cuenta en un contador de gamma. Se caracteriza adicionalmente la dilución de antisuero que se une aproximadamente del 10 al 40 % del anticuerpo anti-PRL marcado después de la sustracción de la unión no específica.
También se puede utilizar un kit de inmunohistoquímica para la localización de PRL-1 o PRL-3 en tejidos y células. Este kit de inmunohistoquímica proporciona instrucciones, un anticuerpo anti-PRL, y posiblemente suero bloqueante y antisuero secundario unido a una molécula fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína, o a algún otro reactivo usado para visualizar el antisuero primario. Las técnicas de inmunohistoquímica son bien conocidas por los expertos en la materia.
Este kit de inmunohistoquímica permite la localización de PRL-1 o PRL-3 en cortes de tejido y células cultivadas utilizando microscopía óptica y electrónica. Se utiliza tanto para fines clínicos como de investigación. Por ejemplo, se toma una biopsia de los tumores o se recogen y las secciones de tejido se cortan con un microtomo para examinar los sitios de producción de PRL-1 o PRL-3. Tal información es útil para fines de diagnóstico y posiblemente terapéuticos en la detección y el tratamiento del cáncer.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Los anticuerpos anti-PRL pueden ser eficaces en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el cáncer.
Los presentes inventores desvelan un método para tratar enfermedades relacionadas con el cáncer con una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PRL descrita en el presente documento. Los anticuerpos anti-PRL se pueden proporcionar como proteínas y fragmentos de proteínas aislados y sustancialmente purificados en composiciones farmacéuticamente aceptables usando métodos de formulación conocidos por los expertos en la materia.
El anticuerpo anti-PRL se puede administrar en forma de composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede incluir una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo anti-PRL, junto con un excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
En particular, el anticuerpo anti-PRL se puede introducir en la circulación de un paciente, por ejemplo, inyectándolo en un paciente a través de, por ejemplo, una vena.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosas y no acusas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hagan que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en un estado criodesecado (liofilizado) que solo requiere la adición del transportador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.
Estas composiciones se pueden administrar por vías convencionales. Éstas incluyen, pero sin limitación: las vías oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosas, intradérmica, intracraneal, intratraqueal y epidural), transdérmica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramedular, subcutánea o intramuscular).
Las formulaciones de anticuerpo anti-PRL se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar el principio activo y los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el principio activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, si es necesario, dando forma al producto.
Además, los anticuerpos anti-PRL se pueden incorporar en polímeros biodegradables que permitan la liberación sostenida del compuesto, estando los polímeros implantados cerca de donde se desea la administración del fármaco, por ejemplo, en el sitio de un tumor o implantado de modo que el anticuerpo anti-PRL se libere lentamente de forma sistémica. Se describen los polímeros biodegradables y su uso, por ejemplo, en detalle en Brem et al (1. Neurosurg 1991 74:441-446). También se pueden utilizar minibombas osmóticas para proporcionar una administración controlada de altas concentraciones de anticuerpos anti-PRL a través de cánulas al sitio de interés, tal como directamente en un crecimiento metastásico o en el suministro vascular de ese tumor.
Los anticuerpos anti-PRL se pueden unir a agentes citotóxicos que se infunden de una manera diseñada para maximizar la administración a la ubicación deseada. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PRL de alta afinidad unidos a ricina se administran a través de una cánula a los vasos que suministran el sitio objetivo o directamente en la diana.
Dichos agentes también se administran de manera controlada a través de bombas osmóticas acopladas a cánulas de infusión.
Las formulaciones farmacéuticas unitarias preferidas son las que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, tal como se ha citado anteriormente en el presente documento, o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente administrado. Debe entenderse que además de los ingredientes, particularmente mencionado anteriormente, las formulaciones descritas en el presente documento pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.
Los conjugados de anticuerpo anti-PRL se pueden administrar de cualquier forma adecuada, generalmente por vía parenteral, por ejemplo por vía intravenosa o intraperitoneal, en formulaciones estándar, estériles, apirógenas de diluyentes y vehículos, por ejemplo solución salina isotónica (cuando se administra por vía intravenosa). Una vez que el conjugado de anticuerpo anti-PRL se haya unido a las células diana y se haya eliminado del torrente sanguíneo (si es necesario), que suele tardar un día aproximadamente, se administra el profármaco, generalmente como una sola dosis infundida, o se obtienen imágenes del tumor. Si es necesario, dado que el conjugado de anticuerpo anti-PRL puede ser inmunogénico, se puede administrar ciclosporina o algún otro inmunosupresor para proporcionar un período más prolongado de tratamiento, pero por lo general esto no será necesario.
La dosificación del anticuerpo anti-PRL descrita en el presente documento dependerá de la enfermedad o afección que se esté tratando y de otros factores clínicos tales como el peso y la condición del ser humano o animal y la vía de administración del compuesto.
Dependiendo de la semivida del anticuerpo anti-PRL en el animal o humano en particular, el anticuerpo anti-PRL se puede administrar entre varias veces al día y una vez a la semana. Debe entenderse que los métodos y composiciones descritos en el presente documento tienen aplicación tanto para uso humano como veterinario. Los métodos descritos en el presente documento contemplan tanto administraciones únicas como múltiples, dadas simultáneamente o durante un período de tiempo prolongado.
El tiempo entre las administraciones del conjugado de anticuerpo anti-PRL y el profármaco se puede optimizar de forma rutinaria, ya que las proporciones de conjugado de tumor/tejido normal (al menos después de la administración intravenosa) son más altas después de aproximadamente 4-6 días, mientras que en este momento la cantidad absoluta de conjugado unido al tumor, en términos de porcentaje de dosis inyectada por gramo, es menor que en momentos anteriores.
Por lo tanto, el intervalo óptimo entre la administración del conjugado de anticuerpo anti-PRL y el profármaco será un compromiso entre la concentración máxima de enzima en el tumor y la mejor proporción de distribución entre el tumor y los tejidos normales. La dosis del conjugado de anticuerpo anti-PRL será elegida por el médico de acuerdo con los criterios habituales. Al menos en el caso de métodos que emplean una enzima dirigida como p-glucosidasa y amigdalina intravenosa como profármaco tóxico, es probable que sea apropiada de 1 a 50 dosis diarias de 0,1 a 10,0 gramos por metro cuadrado de superficie corporal, preferentemente 1,0-5,0 g/m2 Para la terapia oral, pueden ser apropiadas tres dosis por día de 0,05 a 10,0 g, preferentemente de 1,0-5,0 g, durante uno a cincuenta días. La dosis del conjugado de anticuerpo anti-PRL se elegirá de manera similar de acuerdo con los criterios normales, particularmente con referencia al tipo, el estadio y la ubicación del tumor y el peso del paciente. La duración del tratamiento dependerá en parte de la rapidez y del grado de cualquier reacción inmune al conjugado de anticuerpo anti-PRL.
ENFERMEDADES
Los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento, por ejemplo en forma de composiciones farmacéuticas, se puede utilizar en el tratamiento del cáncer.
Para los propósitos del presente documento, el término "cáncer" puede comprender uno o más de los siguientes: leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), cáncer adrenocortical, cáncer de ano, cáncer de vejiga, cáncer de sangre, cáncer de hueso, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer del sistema genital femenino, cáncer del sistema genital masculino, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello de útero, rabdomiosarcoma infantil, sarcoma infantil, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mieloide crónica (CML), cáncer de colon y recto, cáncer de colon, cáncer de endometrio, sarcoma endometrial, cáncer esofágico, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer del tracto gastrointestinal, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, histiocitoma fibroso maligno, timoma maligno, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, mieloma, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer del sistema nervioso, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de la cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, tumor de la pituitaria, neoplasia de células plasmáticas, linfoma primario del SNC, cáncer de próstata, cáncer rectal, del sistema respiratorio, retinoblastoma, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer del sistema urinario, sarcoma uterino, cáncer de vagina, del sistema vascular, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Los anticuerpos anti-PRL descritos en el presente documento, por ejemplo en forma de composiciones farmacéuticas, también se puede utilizar en el tratamiento de trastornos relacionados con el cáncer.
Tales trastornos incluyen pero no se limitan a: tumores sólidos; tumores de origen sanguíneo tales como leucemias; metástasis tumoral; tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracoma y granulomas piógenos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de la placa; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; colaterales coronarias; malformaciones arteriovenosas colaterales cerebrales; angiogénesis isquémica de la extremidad; glaucoma neovascular; fibroplasia retrolental; neovascularización diabética; enfermedades relacionadas con helicobacter, fracturas, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación y placentación.
Ejemplos
Ejemplo 1. Líneas celulares: CHO-K1, A2780 y CT26
Las células CHO-K1, las células de cáncer de ovario humano A2780 y las células de cáncer de colon de ratón CT26 se adquieren de ATCC (Manassas, VA).
Ejemplo 2. Generación de grupos de células CHO que expresan de manera estable EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1
Los grupos de células CHO que expresan de forma estable EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 se generan tal como se describe en un estudio anterior8. Brevemente, las células se cultivan en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % y se seleccionan en 1 mg/ml de G418 durante 20-30 días. Las células (106 células/ml) luego se someten a clasificación EGFP por FACS Vantage, modo SE (Becton Dickinson) y se vuelven a cultivar en cultivo para establecer grupos de células estables.
Ejemplo 3. Generación de células AT-3 que expresan de forma estable EGFP-PRL-3 o células AT-1 que expresan de forma estable EGFP-PRL-1
Para obtener tumores EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1, se inyecta a cada uno de ratones desnudos de 8 semanas (Jackson Labs, EE. UU.) a través de la vena de la cola con células que expresan EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 (5x105). Los ratones se sacrifican 3 semanas después de la inyección en la vena de la cola. Se extraen los pulmones que portan tumores EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1. Los tumores EGFP-PRL se diseccionan individualmente bajo el microscopio fluorescente (Zeiss, M2 Bio Quad). Para generar líneas celulares que provienen de estos tumores, cada tumor EGFP-PRL se lava dos veces en PBS en condiciones estériles. El tumor se corta en trozos diminutos y se cultiva a 37 °C con CO2 al 5 %, con RPMI 1640, FBS al 10 % y antibióticos al 1 % (Sigma). La línea de células tumorales AT-3 proviene del tumor EGFP-PRL-3; mientras que la línea celular tumoral AT-1 proviene del tumor EGFP-PRL-1. Las células se tripsinizan y se dividen en una proporción de 1:3 en nuevas placas. Las líneas de células tumorales EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 expresadas de manera homogénea se confirman mediante inmunofluorescencia indirecta.
Ejemplo 4. Generación de clones 223,318 de mAb específicos de PRL-3 y clon 269 de mAb de PRL-1 Estos anticuerpos se generan de la siguiente manera (véase también la referencia 19): Los hibridomas se generan usando el kit de clonación de hibridomas ClonaCell-HY de Stemcell Technologies, Inc. (Vancouver, Columbia Británica, Canadá). Los procedimientos se siguen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se hace lo siguiente: (a) inmunización de ratones BALB/c con proteína de fusión GST-PRL-1 o PRL-3 entera de ratón, respectivamente; (b) crecimiento de células de mieloma parental BALB/c SP2/0; (c) preparación de ratones BALB/c para esplenocitos de ratones inmunizados; (d) fusión de esplenocitos con células SP2/0; y (e) selección y caracterización de los clones de hibridoma.
Dos ascitis de control: 1. Líquido ascítico que proviene del hibridoma 6A7M contra glucoforina A humana (obtenido de ATCC). 2. Líquido ascítico frente al marcador del complejo de Golgi GS28.
Ejemplo 5. Ensayo experimental de metástasis
Se hace referencia a la referencia 20. Todos los estudios en animales han sido aprobados por la Junta de Revisión del Instituto de Biología Celular y Molecular, Singapur. Los presentes inventores siguen las políticas del Animal Facility Center de The Agency for Science, Technology and Research (A* STAR), Singapur5819. A los ratones desnudos se les inyecta un millón de células cancerosas a través de la vena de la cola el día 1. A los ratones tratados se les administra PRL-mAb a través de la vena de la cola dos veces por semana.
Ejemplo 6. Análisis por transferencia de Western
Las etapas detalladas se describen en la referencia 19.
Ejemplo 7. Microscopía confocal y análisis de células cancerosas que expresan EGFP-PRL-3
Las células AT-3, AT-1 o CHO parentales se cultivan en cubreobjetos y se lavan una vez con PBSCM (PBS que contiene MgCh 1 mM y CaCh 1 mM). A continuación, las células se fijan en paraformaldehído al 2,7 % durante 20 min a temperatura ambiente (TA, 24 °C). Después de dos lavados más con PBSCM, las células se permeabilizan durante 15 min con saponina al 0,12 % en PBSCM (esta etapa se omite para las células no permeabilizadas) y se incuban con mAb anti-PRL-3. Las células se lavan suavemente tres veces con PBSCM y se incuban con anti-IgG de ratón conjugado con Texas Red (Sigma) durante 4 horas a TA. Las células AT-3 o AT-1 se visualizan directamente con microscopía de fluorescencia en verde. Para examinar los anticuerpos captados en las células CHO parentales vivas, las células se incuban primero con anticuerpo anti-GS28 de ratón a 4 °C durante 2 h. Las células se lavan suavemente tres veces con PBSCM y luego se fijan en paraformaldehído al 0,6 % durante 20 min a temperatura ambiente (TA, 24 °C). Las células se incuban con anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Sigma) durante 4 horas a TA. El yoduro de to-pro-3 se utiliza para teñir de azul el ADN de cada célula CHO parental. Las imágenes confocales se realizan con un navegador de imágenes Zeiss LSM 510.
Ejemplo 8. Inmunohistoquímica (IHC)
Utilizando anticuerpos monoclonales de PRL-3 de ratón (clon 223 o 318) o de PRL-1 de ratón (clon 269) (dilución a 1:300) y el kit VeCtASTAIN ABC kit-Peroxidases Rabbit IgG PK-4001 (Orton Southgate, Peterborough, Inglaterra) para realizar experimentos de IHC, los presentes inventores investigaron las expresiones de las proteínas PRL-3 y PRL-1 en muestras de cáncer de mama y colon humano de Cybrdi (Frederick, Maryland). Las matrices de tumores múltiples malignos humanos de baja y alta densidad (TS42040704) y (TS43040303) se adquieren de BioGenex (San Ramon, CA). Los portaobjetos embebidos en parafina y fijados con formalina se hornean a 54 ° C durante 10 min y luego se desparafinan en xileno fresco durante 5 min (2x). Los portaobjetos se someten a rehidratación secuencial con etanol al 100 %, 95 %, 80 % y 75 %, PBS (2 min por cada cambio), luego en tampón de citrato de sodio 0,01 M a pH 6,0, seguido de la recuperación de antígenos 2100-Retriever Pick Cell Laboratories (Ámsterdam, North Holland, 1098SM, NL) durante 15 min. Los portaobjetos se enfrían durante 4 h en el horno. Los portaobjetos se lavan tres veces con PBS (5 min cada uno) y se transfieren a PBS con H2O2 al 0,6 % en la oscuridad durante 20 min. Los portaobjetos se lavan en PBS varias veces y se tratan en PBS-Tween 20 al 0,2% durante 20 min a 24 °C. La etapa de bloqueo y las incubaciones de anticuerpos se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 9. Un modelo animal permite la rápida formación de tumores pulmonares metastásicos agresivos Este Ejemplo describe la generación de tumores que sobreexpresan PRL en ratones y la provisión de un modelo animal para la futura terapia del cáncer con PRL.
Se hace referencia a la Figura 1.
En primer lugar, los ratones desnudos se utilizan como "clasificador de células" in vivo para seleccionar células con alta actividad metastásica. Se inyectan 1x106 células CHO que expresan EGFP-PRL-3- o EGFP-1 en la circulación de ratones desnudos a través de la vena de la cola. Se forman docenas de tumores o focos metastásicos en el pulmón de cada ratón desnudo tres semanas después de la inyección.
En segundo lugar, un solo tumor de EGFP-PRL metastásico de pulmón se disecciona y se pica en placas de cultivo para establecer una línea celular metastásica que expresa EGFP-PRL-3 más agresiva y homogénea denominada AT-3 o una línea celular tumoral que expresa EGFP-PRL-1 denominada AT-1.
En tercer lugar, 1x106 células AT3 o AT1 se inyectan de nuevo en ratones desnudos a través de la vena de la cola. En cuarto lugar, los presentes inventores dividieron los ratones en grupos tratados o no tratados con diferentes anticuerpos administrados mediante inyección en la vena de la cola los días 3, 6 y 9 después de la inoculación de las células tumorales.
Se diseña un modelo animal en el que las células que sobreexpresan PRL-3 o PRL-1 formaron rápidamente tumores metastásicos. Con tumores metastásicos tan agresivos como antecedentes, se debe poder observar cualquier supresión de la tumorigenicidad si el tratamiento con mAb anti-PRL es eficaz.
El modelo animal de los presentes inventores recapitula las actividades metastásicas agresivas de las células que expresan PRL y es útil en la disección de eventos metastásicos que ocurren después de la invasión o intravasación.
Ejemplo 10. El mAb PRL-3 o el mAb PRL-1 bloquea la formación de tumores pulmonares metastásicos EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 con una eficacia del -90 % en ratones
Cuatro grupos de ratones de control (Figura 2A, a, sin tratar; b, tratado con PBS; c y d, dos anticuerpos no relacionados) mostraron tumores metastásicos EGFP-PRL-3 masivos y generalizados (~ 140-150 loci) en sus pulmones el día 15 después de la inyección de células.
Sorprendentemente, los otros cuatro grupos de ratones que recibieron tres dosis de mAb de PRL-3 en forma de IgG purificada o líquido ascítico no purificado del clon 223 de hibridoma (Figura 2A e y g) o el clon 318 (Figura 2A f y h) mostraron una reducción considerable de tumores que expresan EGFP-PRL-3 (-15-20 loci) en sus pulmones.
De forma similar, el mAb de PRL-1 redujo significativamente la formación de tumores metastásicos derivados de la inoculación de células AT-1 que expresan EGFP-PRL-1 (Figura 2B, carril 9). De forma general, los ratones (n=40) tratados con anticuerpos monoclonales PRL mostraron una inhibición de los tumores pulmonares metastásicos en un -90 % en comparación con los ratones de control (n=40). Se ha detectado ARNm de PRL-3 (pero no proteína) en el corazón5.
En este sentido, vale la pena enfatizar que los animales tratados con el mAb PRL-3 no exhibieron cardiotoxicidad apreciable u otros efectos secundarios indeseables.
Ejemplo 11. El mAb PRL-1 bloquea específicamente la formación de tumores metastásicos PRL-1 (pero no PRL-3) mientras que el mAb p RL-3 bloquea específicamente la formación de tumores metastásicos PRL-3 (pero no PRL-1)
Este ejemplo demuestra que los efectos de los anticuerpos son específicos.
Se hace referencia a la Figura 3.
Los presentes inventores demostraron que la formación de tumores metastásicos pulmonares por las células que expresan PRL-1 y PRL-3 no se bloquea con el tratamiento simulado con PBS (a, e), sino que se bloquea eficazmente con anticuerpos contra PRL de conejo (b, f), ya que los anticuerpos de conejo reaccionan con las tres PRL (PRL-1, PRL-2 y PRL-3).
Los presentes inventores demostraron que el mAb de PRL-1 bloquea la formación de tumores metastásicos pulmonares en los que se sobreexpresa PRL-1 (c) pero no se sobreexpresa PRL-3 (g).
De forma similar, el mAb de PRL-3 inhibe (reduciendo el número de tumores) la formación de tumores metastásicos de pulmón en los que se sobreexpresa PRL-3 (h) pero no se sobreexpresa PRL-1 (d).
Ejemplo 12. Los mAb de PRL-3 inhiben eficazmente la formación de tumores metastásicos por las células A2780 que expresan PRL-3 endógeno, pero no las células CT26 que no expresan PRL-3 endógeno
La eficacia considerable de las terapias con PRL-mAb depende de que se dirijan a las células que tienen niveles altos de expresión de las proteínas EGFP-PRL hasta ahora.
Luego, los presentes inventores realizaron un experimento crucial para evaluar si los anticuerpos podrían bloquear la metástasis de las células cancerosas que expresan la proteína PRL-3 de forma natural. Las líneas celulares de cáncer candidatas que son ideales para su uso en este experimento deben tener dos propiedades: 1. proteína PRL-3 expresada de forma natural. 2. ser capaces de provocar rápidamente la formación de tumores metastásicos en ratones.
Los presentes inventores descubrieron que la línea celular de cáncer de ovario humano A2780 tiene estas dos propiedades y confirmaron que las células A2780 expresan la proteína PRL-3 de forma natural (Figura 4A, carril 2), que se documentó anteriormente9.
Mientras tanto, los presentes inventores identificaron una línea de células de cáncer de colon de ratón CT26 que no expresa la proteína PRL-3 (Figura 4A, carril 1). La línea celular de cáncer CT26 se selecciona como control negativo para este experimento, ya que tiene una fuerte actividad metastásica en pulmones de ratones desnudos a las 2 semanas de la inoculación de las células cancerosas (Figura 4B).
De manera esperada, no se encuentran diferencias entre los grupos de ratones tratados (Figura 4B, a) y no tratados (Figura 4B, b) que reciben células CT26, que todos muestran apariencia patológica en la pérdida de peso.
La formación rápida de tumores metastásicos pulmonares agresivos por las células CT26 no es inhibida por los mAb de PRL-3 (Figura 4B, parte inferior a) en comparación con los pulmones (Figura 4B, parte inferior b) de ratones no tratados, sugiriendo que los PRL-mAb no inhiben la formación de tumores metastásicos pulmonares en los que la PRL-3 fosfatasa no se expresa de forma natural.
Por el contrario, se descubren diferencias significativas entre ratones tratados y no tratados 1 mes después de la inoculación de células cancerosas humanas A2780 que expresan la proteína PRL-3 endógena. Las apariencias patológicas (enfermizas y delgadas), así como los tumores múltiples formados por células A2780 PRL-3 positivas se observan solo en ratones no tratados (Figura 4C, lado D) pero no en ratones tratados (Figura 4C, lado I). Los ratones tratados permanecen sanos durante un período de tiempo prolongado.
Estos resultados sugieren que los mAb de PRL-3 pueden bloquear la formación de tumores metastásicos de células cancerosas que expresan PRL-3 de forma natural, pero no tienen ningún efecto sobre las células cancerosas que no expresan PRL-3 endógeno.
Ejemplo 13. Células que expresan PRL-3 o PRL-1 que absorben sus respectivos anticuerpos de PRL
El mecanismo preciso por el cual los anticuerpos anti-PRL inhiben la formación de tumores necesita ser investigado más a fondo. Para determinar si las células tumorales pueden absorber los mAb de PRL, los presentes inventores examinaron la tinción de mAb de PRL-3 usando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta en células AT-3 no permeabilizadas que sobreexpresan EGFP-PRL-3.
Algunas células AT-3 no permeabilizadas aparecieron completamente teñidas con el mAb anti-PRL-3 (Figura 5A, flechas blancas indicadas en los paneles b y e). El 40 % de estas células están parcialmente teñidas de rojo, pero > 50 % de las células están completamente sin marcar (Figura 5A, b, e) en comparación con células AT-3 permeabilizadas que muestran un 100 % de tinción en rojo con mAb anti-PRL-3 (Figura 5A, h).
Los datos indican que los mAb de PRL grandes todavía pueden penetrar parcial o completamente en las células cancerosas no permeabilizadas.
Se obtienen resultados análogos usando un mAb anti-PRL-1 (clon n.° 269) con células CHO que sobreexpresan EGFP-PRL-1 (datos no mostrados).
Para confirmar aún más que el anticuerpo puede acceder a las células internamente, los presentes inventores seleccionaron un anticuerpo contra el marcador del aparato de Golgi (GS28) y mostraron que el mAb GS28 puede penetrar en células vivas CHO en cultivo (Figura 5B a-c). Asimismo, la mayoría (60-70%) de las células vivas que se privan de suero durante la noche muestran una mayor eficacia en la absorción de anti-GS28 de ratón por mecanismos desconocidos (mostradas en verde en la Figura 5B d-f).
Para investigar si la absorción del anticuerpo es un fenómeno celular general o no, se prueban tres anticuerpos no relacionados con PRL en otras dos líneas celulares. Se trata de anticuerpos anti-GS28 de ratón y anti-PTEN de conejo en células epiteliales mamarias humanas no permeabilizadas (MCF-10A); y anti-GS28 de ratón y anti-p53 de conejo en células de cáncer de mama humano (MCF-7).
De nuevo, los presentes inventores descubrieron que independientemente de si la fuente de anticuerpos es de conejo o de ratón, una fracción de células no permeabilizadas (aproximadamente el 10 %) mostró una captación eficaz de ambos anticuerpos en las mismas células (Figura 6A, B). Cuando las células MCF-7 se privan de suero durante la noche, las células MCF-7 no permeabilizadas son capaces de absorber tanto los anticuerpos GS28 como los p53 con alta eficacia (Figura 6C).
La doble tinción de inmunofluorescencia indirecta revela un fenómeno general de captación de anticuerpos en células normales y cancerosas. Los anticuerpos pueden ser absorbidos por células no permeabilizadas, y esto se ve reforzado por la privación de suero de las células. Los resultados sugieren que las proteínas intracelulares también se pueden direccionar mediante terapias con anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 14. La sobreexpresión de PRL-3 y PRL-1 se asocia con varios cánceres metastásicos
Para evaluar la importancia clínica y pronóstica de los mAb-PRL como posibles fármacos contra los cánceres relacionados con PRL-3 o PRL-1, los presentes inventores buscaron evaluar adicionalmente un espectro de cánceres conocidos mediados por PRL que incluyen los cánceres de colon, mama, pulmonar, cerebral, ovario, melanoma y gástrico3'1219.
Usando un mAb PRL-3 para realizar inmunohistoquímica en matrices de tejido de cáncer múltiple humano, los presentes inventores descubrieron que la proteína PRL-3 está regulada positivamente en el 15 % (26/158 casos) de los cánceres de colon, el 16,5 % (19/96 casos) de los cánceres de mama y el 15 % (2/13 casos) de cánceres de esófago.
La sobreexpresión de PRL-3 está estrechamente relacionada con el carcinoma de células escamosas en el pulmón, los cánceres de pene y de cuello uterino. Las muestras seleccionadas se muestran en la Figura 7A.
La proteína PRL-1 está sobreexpresada en el 6,2 % (8/128 casos) de los cánceres de colon; en el 20 % (5/20 casos) de los cánceres de cerebro y en el 7,6 % (1/13 casos) de los cánceres de esófago (Figura 7B). En estas muestras de cáncer, las señales PRL positivas se localizan principalmente en la membrana plasmática y el citoplasma.
Ejemplo 15. Discusión (ejemplo 1 al ejemplo 14)
La metástasis es el aspecto más temible del cáncer. Los presentes inventores y otros han demostrado que la sobreexpresión de PRL-3 y PRL-1 está asociada con varios cánceres humanos3-1219. En el presente estudio, los presentes inventores demostraron además que la proteína PRL-3 está regulada positivamente en los cánceres de colon, mama y esófago. La sobreexpresión de PRL-3 está estrechamente relacionada con el carcinoma de células escamosas en el pulmón, los cánceres de pene y de cuello uterino. La proteína PRL-1 también se sobreexpresa en los cánceres de colon, cerebro y esófago.
El direccionamiento a las células cancerosas que sobreexpresan la PRL intracelular para prevenir la metástasis del cáncer mediante reactivos exógenos es una tarea desafiante. Los anticuerpos monoclonales (mAb) constituyen la clase de agente terapéutico humano de crecimiento más rápido y son agentes probados para reconocer y destruir células malignas. Para bloquear las metástasis cancerosas mediadas por PRL, los presentes inventores necesitan extirpar las células cancerosas que expresan PRL para evitar que se propaguen más. Los presentes inventores intentaron abordar este desafiante objetivo con la terapia con anticuerpos monoclonales en ratones. Usando un ensayo de metástasis experimental en el que las células tumorales de PRL cultivadas se introducen directamente en cada ratón a través de su cola, los presentes inventores examinaron el crecimiento in vivo y la formación de tumores de células cancerosas. Hay cuatro etapas principales en el proceso de metástasis del cáncer. En primer lugar, las células cancerosas tienen que mejorar la capacidad migratoria para escapar y disociarse del tumor primario. En segundo lugar, las células cancerosas necesitan ingresar y sobrevivir en la circulación sanguínea (intravasación). En tercer lugar, las células cancerosas deben salir de los vasos sanguíneos (extravasación) para aterrizar en un nuevo órgano. En cuarto lugar, las células cancerosas (semillas) necesitan sobrevivir en los órganos distantes (suelos) para convertirse en tumores metastásicos. Los presentes inventores comenzaron su ensayo metastásico en la etapa de la intravasación inyectando un millón de células cancerosas EGFP-PRL directamente en los vasos sanguíneos a través de la vena de la cola (Figura 1). El proceso de metástasis del cáncer es un viaje largo y difícil; se estima que solo alrededor del 0,01 % (~ 100 tumores de 1x106 células cancerosas) de las células cancerosas llega a su destino final con éxito. Al final del experimento, los presentes inventores observaron aproximadamente 100-150 tumores pulmonares metastásicos en ratones no tratados (Figura 2A, a-d) y aproximadamente 10-15 tumores pulmonares metastásicos en ratones tratados con mAb específicos de PRL (Figura 2A, e-h). Los estudios de los presentes inventores representan los primeros ejemplos de bloqueo eficaz (~ 90 %) de la metástasis experimental en ratones mediante el uso de mAb contra sus respectivas fosfatasas a pesar de su localización intracelular. Además, los presentes inventores demostraron que el PRL-mAb es específico de su propio antígeno. El mAb de PRL-1 bloquea específicamente la formación de tumores metastásicos de PRL-1 pero no de PRL-3; mientras que el mAb de p RL-3 bloquea específicamente la formación de tumores metastásicos de PRL-3 pero no de PRL-1 (Figura 3). Asimismo, los presentes inventores demostraron que los mAb de PRL-3 no bloquean la formación de tumores por las células de cáncer de colon de ratón CT26 en las que no se expresa la fosfatasa PRL-3 endógena (Figura 4A, B). De manera significativa, los presentes inventores demostraron que los mAb de PRL-3 bloquean eficazmente la formación de tumores metastásicos por una línea celular de cáncer de ovario humano A2780 que expresa la proteína PRL-3 endógena. La inhibición eficaz de la formación de tumores metastásicos por células cancerosas humanas de origen natural positivas para PRL-3 es importante ya que indica que el mAb PRL-3 o sus anticuerpos humanizados pueden ser candidatos para tratar cánceres humanos asociados con la sobreexpresión de PRL-3. Aunque la comparación del efecto inhibidor del anticuerpo PRL-3 sobre las células de cáncer de ovario humano A2780 con el efecto no inhibitorio sobre las células de cáncer de colon CT26 de ratón indica que el anticuerpo se dirige a las células cancerosas que expresan de forma endógena PRL-3, se requieren estudios futuros que empleen células cancerosas isogénicas que solo difieran en los niveles de expresión de PRL-3 para demostrar de manera convincente este punto.
Hay varios mecanismos posibles responsables de la inhibición de la formación de tumores mediada por anticuerpos contra PRL-3 en el ensayo de metástasis experimental
En primer lugar, el anticuerpo puede entrar potencialmente en células que expresan PRL-3 para dirigirse a PRL-3 intracelular y neutralizar su función. La captación de anticuerpos contra PRL-3 por una fracción de células cancerosas que expresan PRL-3 en cultivo y la potenciación de la captación de anticuerpos tras la inanición de suero parecen apoyar este modo de acción. En segundo lugar, una pequeña fracción de PRL-3 puede externalizarse y mostrarse en la superficie de las células que expresan PRL-3. La unión del anticuerpo al PRL-3 expuesto a la superficie puede desencadenar respuestas inmunitarias como la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC) para destruir las células cancerosas. En tercer lugar, el PRL-3 intracelular podría procesarse proteolíticamente y los fragmentos antigénicos podrían presentarse en la superficie celular mediante el antígeno principal de histocompatibilidad de clase I de modo que las células cancerosas se conviertan en dianas de los linfocitos T citotóxicos.
Para abordar la primera posibilidad de cómo estos PRL-mAb inhiben la metástasis del cáncer impulsada por sus respectivos antígenos intracelulares, los presentes inventores proporcionaron evidencia de que la captación por las células que expresan PRL-3- o PRL-1 de sus respectivos anticuerpos PRL podría ser un fenómeno general, ya que también descubrieron que un anticuerpo no relacionado con PRL para el marcador de Golgi-GS28 puede penetrar en células CHO vivas en cultivo y la captación de anticuerpos se ve reforzada por la inanición de suero de las células (Figura 5B).
Una cuestión importante es si la penetración de anticuerpos se produce específicamente en las células cancerosas o también en tipos de células no transformadas, y si otras clases de anticuerpos también pueden entrar en las células. Se prueban tres anticuerpos no relacionados con PRL en otras dos líneas celulares. Se trata de anticuerpos anti-GS28 de ratón y anti-PTEN de conejo en células epiteliales mamarias humanas no permeabilizadas (MCF-10A); y anti-GS28 de ratón y anti-p53 de conejo en células de cáncer de mama humano (MCF-7).
De nuevo, los presentes inventores descubrieron que independientemente de si la fuente de anticuerpos es de conejo o de ratón, una fracción de células no permeabilizadas (aproximadamente el 10 %) mostró una captación eficaz de ambos anticuerpos en las mismas células (Figura 6A, B). Cuando las células MCF-7 se privan de suero durante la noche, las células MCF-7 no permeabilizadas son capaces de absorber tanto los anticuerpos GS28 como los p53 con alta eficacia (aproximadamente el 70 % en la Figura 6C).
La inanición de suero se utiliza para detener las células en las fases G1 y G021. Es posible que etapas particulares del ciclo celular puedan contribuir a la capacidad de las células para absorber los anticuerpos. In vivo, las células cancerosas están bajo estrés hipóxico e inanición de suero, condiciones que pueden mejorar la capacidad de las células cancerosas para absorber anticuerpos.
Los hallazgos sugieren un fenómeno general hasta ahora no reconocido en el que las células pueden absorber anticuerpos para neutralizar los antígenos intracelulares. En particular, los presentes inventores han demostrado que los anticuerpos PRL-3 y PRL-1 se dirigen específicamente a sus respectivas proteínas intracelulares y eliminan la formación de tumores sin efectos secundarios detectables en estos animales. Aunque las etapas específicas de la formación de tumores en el ensayo de metástasis experimental inhibido por el anticuerpo PRL-3 quedan por definir en estudios futuros, los resultados de los presentes inventores indican que las células individuales (o micrometástasis que consisten en células agrupadas) sembradas en el pulmón u otros tejidos secundarios son probablemente las dianas del anticuerpo PRL-3 tal como se refleja en la reducción considerable en el número de nódulos tumorales. Dado que la siembra de células cancerosas en tejidos secundarios y la progresión de micrometástasis a macrometástasis son etapas importantes que limitan la propagación del cáncer, el direccionamiento a estas etapas con anticuerpos PRL-3 es de posible relevancia clínica para prevenir la metástasis del cáncer.
En el presente documento, los presentes inventores proporcionan evidencia para demostrar que los mAb de PRL-3 se dirigen correctamente a tumores con expresión endógena de PRL-3. Los datos de los presentes inventores finalmente sugieren que las proteínas intracelulares también pueden direccionarse utilizando terapias de anticuerpos monoclonales para eliminar la formación de tumores metastásicos. Los presentes inventores proponen que los investigadores del cáncer consideren reevaluar un amplio espectro de oncoproteínas intracelulares como posibles dianas de los mAb para la terapia contra el cáncer.
Ejemplo 16. Generación de mAb quiméricos de ratón/humanos específicos de PRL-3 y PRL-1 (clon n.° 318, 269)
Para el mAb quimérico de PRL-3, el ARN total se extrae de 6x106 células de hibridoma (clon n.° 318) usando el kit RNeasy Mini Kit (QIAGEN, n.° de cat 74104). La desoxirribonucleasa se utiliza durante la extracción de ARN. A continuación, los ARN se transcriben de forma inversa en ADNc usando el SuperScript II RNase H (Invitrogen, Cat 18064-014). Los ADNc totales resultantes se utilizan como moldes para generar una 'región variable universal' utilizando kits de Ig-cebador (Novagen, n.° de cat 69831-3) para pCr (95 °C, 54 °C, 72 °C) con 30 ciclos. El fragmento de PCR se clona en PCRII-TOPO-Vector con el kit de clonación TA (Invitrogen, parte n.° 45-0640). El fragmento de PCR se corta con Mfe1 y Xho1 y luego se inserta en los sitios respectivos de un vector de expresión de región constante de IgG1 humana-pCMV-IgG1 humana (18) para unir la región variable de cadena pesada de ratón (clon n.° 318) con la región constante de IgG1 humana. Se realizan procedimientos de PCR similares para la región variable de la cadena ligera de ratón con extremos que contienen sitios de restricción para ApaLI y se utilizan Pst 1 para realizar la PCR de la cadena ligera variable de ratón (clon n.° 318). El fragmento de PCR se corta con ApaLI y Pst I y luego se inserta en los sitios respectivos de un vector de expresión de región constante de IgG1 humana que contiene la región variable de la cadena pesada del clon n.° 318. La construcción completa se transfecta transitoriamente en células 293T que se cultivan con FBS de IgG ultrabaja (Gibco, 16250-078). El mAb quimérico se recolecta del sobrenadante del cultivo y se concentra hasta 40 veces con dispositivos de filtro centrífugo (Millipore, n.° de cat UFC900596). El mAb quimérico se prueba para determinar su especificidad mediante inmunofluorescencia indirecta (IF) y análisis por transferencia de Western. Para generar un fragmento de PCR para la región variable de cadena ligera PRL-1 (clon n.° 269), de forma similar, los ARNm se extraen de las células de hibridoma n.° 269 y luego los ARNm se transcriben de forma inversa en ADNc que se utilizan para recuperar la secuencia codificante de la región variable de cadenas pesadas y ligeras. Para generar un fragmento de PCR para la región variable de PRL-1 de la cadena ligera, se llevan a cabo procedimientos similares como se mencionó anteriormente.
Ejemplo 17. Generación de la línea celular tumoral DLD-1-EGFP-PRL-3
Células de carcinoma de colon DLD-1 de ATCC CCL-221 (Mannassas, VA). La construcción de expresión de EGFP-PRL-3 se transfecta en células DLD-1 usando Lipofectamina 2000 de Invitrogen (Carlsbad, CA). Para obtener tumores EGFP-PRL-3, se inyecta a cada uno de ratones desnudos de 8 semanas (Jackson Labs, EE.UU.) en las caderas de ratones desnudos para formar un tumor de xenoinjerto. Los ratones se sacrifican 3 semanas después de la inoculación de células cancerosas. Los tumores se extraen y examinan bajo el microscopio fluorescente (Zeiss, M2 Bio Quad). Para generar la línea celular tumoral DLD-1-EGFP-PRL-3, el tumor-EGFP se lava dos veces en PBS en condiciones estériles; se corta en trozos diminutos y se cultiva a 37 °C con CO2 al 5 % con RPMI 1640, FBS al 10 % y antibióticos al 1 % (Sigma). Las células se tripsinizan y se dividen en una proporción de 1:3 en nuevas placas. Las líneas de células tumorales EGFP-PRL-3 o EGFP-PRL-1 expresadas de manera homogénea se confirman mediante inmunofluorescencia indirecta.
Ejemplo 18. Líneas celulares: HCT116 (CCL-247), DLD-1(CCL-221), B16F0 (CRL-6475), B16F10 (CRL-6322), A2780
HCT116 (CCL-247) es una línea celular de carcinoma colorrectal humano. DLD-1 (CCL-221) es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano. B16F0 (CRL-6475) y B16F10 (CRL-6322) son dos líneas celulares de melanoma de ratón. Las cuatro líneas celulares se compran de ATCC. A2780 es una línea celular de cáncer de ovario humano y se adquiere de ECACC (n.° de Cat 93112519 UK).
Ejemplo 19. Animales experimentales
Se hace referencia al documento A19. Todos los estudios en animales han sido aprobados por la Junta de Revisión de nuestro Instituto. Los presentes inventores siguen las políticas del Animal Facility Center de The Agency for Science, Technology and Research (A* STAR), Singapur. Se utilizan ratones desnudos de ocho semanas (Jackson Labs, EE.UU.). Se inyectan 1x106 células cancerosas en la circulación de ratones desnudos a través de la vena de la cola el día 1. Se administra mAb quimérico para ratones tratados o PBS para ratones no tratados en la vena de la cola el día 3.
Ejemplo 20. Generación de mAb quimérico de ratón/humano PRL-3 específico (clon n.° 318)
A los presentes inventores les anima el hecho de que los mAb de ratón PRL-1 y PRL-3 podrían direccionarse específicamente a sus respectivas PRL fosfatasas intracelulares e inhibir las metástasis del cáncer en animales de experimentación (referencia A16). En un intento de llevar el trabajo de laboratorio a la clínica, los presentes inventores diseñaron genéticamente un mAb quimérico de ratón/humano contra PRL-3 para reducir la antigenicidad potencial del mAb de ratón en humanos. Se desarrolla con éxito el mAb quimérico de PRL-3 en el que los dominios constantes de la molécula de IgG humana (referencia A18) se combinan con las regiones variables de ratón (cadenas pesadas y ligeras) del clon n.° 318 del mAb de PRL-3 mediante fusión transgénica de genes de la inmunoglobulina (Figura 8A) que se realiza mediante una tecnología de ADN recombinante. La construcción de expresión se transfecta en células de riñón embrionario humano que expresan células del antígeno del virus del simio 40 T (293T) para producir el mAb quimérico de PRL-3 que luego se recoge del medio de cultivo y se concentra 40 veces más.
Ejemplo 21. Generación de mAb quimérico de ratón-humano específico de PRL-1 (clon n.° 269)
Los presentes inventores llevaron a cabo una estrategia similar para generar regiones variables de ratón PRL-1 de cadenas pesadas y ligeras, y luego se interesaron respectivamente en los dominios constantes del vector de expresión de IgG humana (referencia A18) para generar mAb quimérico de PRL-1.
Ejemplo 22. Los mAb quiméricos de PRL-3 y PRL-1 se dirigen específicamente a sus antígenos
Los mAb quiméricos de PRL-3 y PRL-1 se confirman para sus especificidades de antígeno realizando análisis de inmunofluorescencia indirecta (iF) (Figura 8B) y análisis por transferencia de Western (Figura 8C y Figura 8D). Los datos muestran que el mAb quimérico de PRL-3 reconoce solo las proteínas PRL-3 pero no las proteínas PRL-1 y PRL-2; mientras que el mAb quimérico de PRL-1 se une solo a PRL-1 pero no a las proteínas PRL-2 y PRL-3.
Ejemplo 23. El anticuerpo quimérico PRL-3 inhibe eficazmente la formación de tumores metastásicos por las células A2780 y HCT116 que expresan PRL-3 endógeno; pero no células DLD-1 que no expresan PRL-3 endógeno
Se realiza un experimento crucial para evaluar si el mAb quimérico de PRL-3 podría dirigirse y bloquear la formación de tumores metastásicos que provienen de células cancerosas que expresan la proteína PRL-3 de forma natural. Se seleccionan docenas de células cancerosas para determinar la expresión de PRL-3 mediante análisis por transferencia de Western. Las líneas celulares de cáncer candidatas que son ideales para su uso en este experimento deben tener dos propiedades: 1. proteína PRL-3 expresada de forma natural. 2. ser capaces de provocar rápidamente la formación de tumores metastásicos. Los presentes inventores descubrieron que la línea celular de cáncer de ovario humano A2780 y la línea celular de cáncer colorrectal humano HCT116 tienen estas dos propiedades y confirmaron que las células A2780 y las células HCT116 expresan la proteína PRL-3 de forma natural (Figura 9A, carril 1, 2). Las células A2780 se documentaron previamente como línea celular PRL-3 positiva (referencia A4). Notablemente, se encuentran diferencias significativas entre los ratones tratados con mAb quimérico de PRL-3 y los ratones no tratados 1 mes después de la inoculación de células HCT116 (n=5) o A2780 (n=8). Los aspectos patológicos (enfermizos y delgados) se observan solo en ratones no tratados (Figura 9B y Figura 9C, lado L) pero no en ratones tratados (Figura 9B y Figura 9C, lado D). Los ratones tratados permanecen sanos durante un período de tiempo prolongado. Estos resultados sugieren que el mAb quimérico de PRL-3 es capaz de bloquear la formación de tumores metastásicos de células cancerosas que expresan PRL-3 de forma natural. Por el contrario, los presentes inventores identificaron una línea celular de cáncer de colon humano DLD-1 que no expresa la proteína PRL-3 (Figura 9A, carril 3). Las células DLD-1 se mantienen como control negativo para este experimento. De manera esperada, no se encuentran diferencias entre los grupos tratados (Figura 9D, lado I) y no tratados (Figura 9D, lado D) (n=5) de ratones que reciben células DLD-1, que presentan un aspecto saludable a los 3,5 meses después de la inoculación de células DLD-1. Sorprendentemente, las células DLD-1 diseñadas para sobreexpresar EGFP-PRL-3 podrían causar un fenotipo patológico en ratones 2 meses después de la inoculación de las células. Se encuentran múltiples tumores micro-metastásicos en los pulmones de ratones desnudos que portan estas células cancerosas que expresan PRL-3 exógeno. Las células EGFP-PRL-3 positivas también se encuentran en el frotis de sangre de los ratones no tratados (Figura 10A n=5) en este momento; lo que sugiere que PRL-3 podría prolongar la supervivencia celular en el torrente sanguíneo. Por el contrario, los ratones que recibieron tratamiento con mAb quimérico de PRL-3 mostraron diferencias significativas en sus tamaños y aspecto saludable durante un período prolongado de tiempo. No se encuentran tumores micro-metastásicos en los pulmones de ratones desnudos tratados que portan estas células cancerosas que expresan PRL-3 exógeno. Las células positivas para EGFP-PRL-3 se encuentran menos en el frotis de sangre de los ratones tratados (Figura 10B n=5). Los resultados sugieren que el mAb quimérico de PRL-3 es capaz de bloquear la formación de tumores metastásicos de células cancerosas que expresan PRL-3 endógeno de forma natural o expresan PRL-3 genomanipulado de forma exógena. Notablemente, el anticuerpo no tiene ningún efecto sobre las células cancerosas que no expresan PRL-3 endógeno.
Ejemplo 24. El anticuerpo quimérico PRL-3 inhibe eficazmente la formación de tumores metastásicos por las células B16F0 que expresan PRL-3 endógeno; pero no células B16F10 que no expresan PRL-3 endógeno
Los presentes inventores habían demostrado que el anticuerpo podía bloquear tumores metastásicos formados por células cancerosas humanas. Actualmente, los presentes inventores utilizan dos líneas celulares de melanoma de ratón: B16F0 y B16F10 para realizar tratamientos adicionales de mAb. Ambas líneas celulares forman rápidamente múltiples tumores metastásicos en ratones. Para los ratones no tratados que portan células cancerosas B16F0 que expresan la proteína PRL-3 endógena (Figura 11A), se encuentran tumores metastásicos en las glándulas suprarrenales (flechas indicadas), los hígados, los huesos y el abdomen (Figura 11B, lado D). De nuevo, los presentes inventores demuestran que el mAb quimérico podría eliminar eficazmente la formación de tumores metastásicos en muchos tejidos de los ratones tratados (Figura 11B, lado I). En un experimento de control paralelo, se encuentran docenas de tumores metastásicos en los pulmones de ratones no tratados o tratados que portan células cancerosas B16F10 que no expresan la proteína p RL-3 endógena (Figura 11A), ya que se puede ver que no hay diferencias significativas en el número de tumores metastásicos pulmonares entre los ratones tratados (Panel superior de la Figura 11) y los ratones sin tratar (panel inferior). Hasta el momento, los resultados obtenidos del tratamiento con mAb quimérico de PRL-3 varias líneas celulares de cáncer PRL-3 positivas y negativas sugieren que la eficacia del tratamiento está estrechamente correlacionada con si la formación de tumor metastásico es causada por la sobreexpresión de PRL-3. Si la propiedad metastásica de las células cancerosas no se debe a la sobreexpresión de PRL-3 (células B16F10), la administración de mAb quimérico de PRL-3 no tiene ningún efecto en el bloqueo de la formación de tumores (Figura 11C).
Ejemplo 25. Discusión (Ejemplos 15 a 24)
La mayoría de los pacientes con cáncer mueren por metástasis y no por su enfermedad primaria. La metástasis del cáncer es un proceso de varias etapas. El primera etapa importante de la metástasis del cáncer implica que las células epiteliales neoplásicas pierdan la adhesión entre células y ganen movilidad, lo que impulsa a las células cancerosas a disociarse del sitio primario del tumor e invadir el tejido adyacente. La segunda etapa requiere que las células cancerosas adquieran la capacidad de ingresar a la circulación sanguínea (intravasación) del hospedador. Estas dos etapas iniciales pueden llevar mucho tiempo para incubar y lograr. En este caso, los presentes inventores utilizaron un ensayo de metástasis experimental (referencia A19) y comenzaron su experimento en la etapa de la intravasación inyectando directamente un millón de células cancerosas en la circulación sanguínea a través de la vena de la cola de los ratones (el día 1) que imita el resto del proceso metastásico. Los presentes inventores trataron al animal con mAb quimérico de PRL-3 el día 3, seguido por administraciones de mAb dos veces por semana. Tomados en conjunto de los resultados de los tratamientos de anticuerpos anteriores (referencia A16) y actuales, los hallazgos de los presentes inventores sugieren: 1. el proceso de metástasis del cáncer es un viaje largo y difícil; que comienza con un millón de células cancerosas (semilla), al final del experimento; los presentes inventores observaron alrededor de 100 tumores pulmonares metastásicos en ratones no tratados y alrededor de 10-15 tumores pulmonares metastásicos en ratones tratados con mAb específicos de PRL (referencia A16), los datos reflejan que se estima que solo alrededor del 0,01 % de las células cancerosas llegan a su destino final con éxito. 2. En el presente estudio, de nuevo, los presentes inventores descubrieron un menor número de microtumores en secciones de pulmón de ratones tratados en comparación con los de ratones no tratados (Figura 10A); lo que sugiere que el mAb podría actuar reduciendo el número pero no el tamaño de los tumores. 3. La eficacia del tratamiento también está altamente asociada con el momento en el que los presentes inventores comenzaron a introducir los mAb quiméricos. Si el tratamiento no se inicia lo suficientemente temprano, sino que se retrasa hasta 1 semana después de la inoculación de las células cancerosas, los resultados no serían tan buenos como el tratamiento temprano (día 3); estos hallazgos implican que el mAb de PRL-3 podría desempeñar un papel en la neutralización y erradicación de las células cancerosas de PRL-3 cuando todavía se mueven y fluyen en el torrente sanguíneo. El tratamiento retardado podría permitir que las células cancerosas tengan la oportunidad de atravesar el vaso sanguíneo (extravasación) y aterrizar en el órgano distal para la siembra; el mAb podría tener menos posibilidades de detener las células cancerosas PRL-3 positivas más allá de la extravasación y la siembra. Esta hipótesis está respaldada por la presencia prolongada de células DLD-1-EGFP-PRL-3 en la circulación de ratones no tratados y la reducción clara de estas células en ratones que recibieron tratamiento con mAb. 4. Lo que es más importante, el anticuerpo quimérico de PRL-3 solo podría bloquear eficazmente la formación de tumores metastásicos que provienen de las células cancerosas que expresan PRL-3 endógeno; pero no las células cancerosas que no expresan PRL-3 endógeno. Por lo tanto, el tratamiento de los presentes inventores con mAb de PRL-3 es muy específico para su propio antígeno. De manera destacable, el mAb actúa mejor a través del torrente sanguíneo pero no a través de la respuesta local, los presentes inventores generaron tumores de xenoinjerto inyectando un millón de células cancerosas con PRL-3 localmente en el área de la cadera de los ratones desnudos, luego inyectaron mAb en áreas similares dos veces por semana a partir del día 3, y descubrieron que el mAb no tiene ningún efecto en la reducción del tamaño de los tumores de xenoinjerto local (datos no mostrados).
Los mecanismos celulares y moleculares detallados responsables de mAb de PRL-3 para inhibir la formación de tumores metastásicos mediada por PRL-3 en el ensayo de metástasis experimental se desconocen actualmente y se deben definir en futuros estudios. Los resultados de que el mAb quimérico de PRL-3 podría extirpar tumores metastásicos de células cancerosas que expresan PRL-3 en ratones son alentadores y sugieren un concepto para otras dianas intracelulares en la clínica. El estudio de los presente inventores podría abrir nuevas y enormes oportunidades para la terapia de anticuerpos utilizando mAb contra productos oncogénicos intracelulares para tratar varios cánceres y metástasis de cáncer. Como PRL-1, PRL-2 y PRL-3 se sobreexpresan en diversos cánceres; los presentes inventores anticiparían las amplias necesidades de los mAb quiméricos de PRL que podrían ser los precursores de la medicina novedosa para combatir diversos tumores asociados a fosfatasas intracelulares PRL. Los presentes inventores podrían seleccionar y tratar algunos tipos de pacientes con cáncer (por ejemplo: los que padecen cáncer de páncreas) que recaerían o tendrían recurrencia en un período corto de tiempo cuando se diagnostica por primera vez el cáncer primario. Las diferencias entre los grupos de pacientes tratados y no tratados podrían revelar si los mAb quiméricos tienen efectos o no en un corto período de tiempo.
Ejemplo 26. El anticuerpo 318 anti-PRL3 se une al polipéptido PRL3 tanto intracelular como externo o secretado
Se realiza un experimento de la siguiente manera:
1. Cultivar células A2780, HCT116, B16F0, B16 F10 en placas de cultivo de 10 cm cada una hasta un 80 % de confluencia.
2. Lavar con PBS varias veces.
3. Cambiar el medio (8 ml) a libre de FBS durante la noche.
4. *al día siguiente, recolectar el medio y centrifugar a 3K, desechar el sedimento, centrifugar a 14K de nuevo y conservar el sobrenadante (*lisa las células de las placas, verificar cada línea celular para la expresión de PRL-3 en la Figura 12A)
5. usar GAPDH como control de carga de proteínas para lisados celulares (Figura 12B)
6. Revisar el medio bajo microscopía para asegurarse de que no haya células en el medio.
7. Se concentró el medio y se ejecutó el gel SDS para PRL-3 secretada o externalizada en medio de cultivo (Figura 12C).
Los resultados se muestran en la Figura 12.
Figura 12A. El análisis por transferencia de Western demuestra que A2780, HCT116 y B16F0 son tres líneas de células cancerosas que expresan la proteína PRL-3 endógena, mientras que B16F10 es una célula cancerosa que no expresa PRL-3.
Figura 12B. El GAPDH se utiliza como control de carga de proteínas.
Figura 12C. Análisis por transferencia de Western en cuatro medios de cultivo que se recogen de las cuatro líneas de células cancerosas. Se descubrió que la fosfatasa PRL-3 se secreta desde las células B16F0 al medio de cultivo, mientras que no se descubrió que la fosfatasa PRL-3 se secretara del resto de las tres células, lo que sugiere que la secreción de la fosfatasa PRL-3 podría relacionarse con fenómenos específicos del tipo celular. Los datos sugieren que in vivo, se puede secretar PRL-3 al torrente sanguíneo en pacientes con cáncer. La secreción de fosfatasa nunca se ha descrito en la bibliografía de los presentes inventores.
Ejemplo 27. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-PRL1 y anti-PRL3
Los epítopos para cada uno de los anticuerpos anti-PRL 269 y 318 se mapean como sigue.
En primer lugar, los presentes inventores excluyeron la mayoría de los aminoácidos que son idénticos entre las tres PRL. En segundo lugar, los presentes inventores seleccionaron las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre las tres PRL. En tercer lugar, 28 péptidos están especialmente diseñados para estas regiones específicas que podrían distinguirse entre sí por la unión de sus respectivos anticuerpos a sus propias regiones específicas.
Los presentes inventores diseñaron especialmente 28 puntos polipeptídicos específicos de PRL-1, PRL-2 y PRL-3 y se solicitaron de Genemed Synthesis, Inc. (www.genemedsyn.com). Los 28 puntos de péptidos están organizados como un mapa en la Tabla EI a continuación que también indica cada secuencia de polipéptidos correspondiente a los puntos de la Figura 13A y 13B.
Figure imgf000050_0001
Tabla E1. 28 péptidos probados para la unión del epítopo contra el anticuerpo anti-PRL1 y el anticuerpo anti-PRL3. La tabla muestra un mapa que representa una disposición para cada punto. Se muestran las secuencias de polipéptidos correspondientes a los puntos en la Figura 13A y la Figura 13B.
Protocolo para la membrana PVDF de análisis por transferencia de puntos
Membrana de bloqueo
1) Humedecer previamente la membrana con metanol al 100% durante unos segundos hasta que cambie de un blanco opaco a un gris translúcido uniforme cuando esté completamente mojada. 2) Incubar la membrana en agua durante 45 minutos para eluir el metanol. 3) Bloquear en BSA al 3 % durante la noche a 4 °C con agitación.
Inmunotinción
1) Incubar con PRL-1 (n.° 269 en la Figura 13A) o con anticuerpos PRL-3 (n.° 318 en la Figura 13B) durante la noche a 4 °C con agitación. 2) Lavar con PBS tween-20 cuatro veces, 10 minutos cada una. 3) Incubar con anti-HRP de ratón 1:10002 horas a temperatura ambiente con agitación. 4) Lavar con PBS Tween-20 cuatro veces, 10 minutos cada una.
Desarrollo de ECL
1) Incubar con agente de detección 5 minutos a temperatura ambiente. 2) Drenar el exceso de tampón, colocarlo en una envoltura de plástico/saran. 3) Desarrollar en una habitación oscura.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 13A y la Figura 13B.
La Figura 13A muestra los resultados de un análisis por transferencia de Western para mapear epítopos para mAb de PRL-1 (clon n.° 269). Dos puntos positivos indican que el mAb de PRL-1 se une preferentemente a dos polipéptidos (1a, TYKNMR; 1b, TLNKFI).
La Figura 13B muestra los resultados de un análisis por transferencia de Western para mapear epítopos para mAb de PRL-3 (clon n.° 318). Los dos puntos indican que el mAb de PRL-3 se une preferentemente a dos polipéptidos (4f, KAKFYN; 5d, HTHKTR).
Los resultados muestran que el mAb de PRL-1 (clon n.° 269) y el mAb de PRL-3 (clon n.° 318) se pueden unir a epítopos que están formados por secuencias no linealizadas.
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-PRL-1 que es capaz de inhibir la actividad de la proteína tirosina fosfatasa de PRL-1 para su uso en un método de tratamiento o de prevención del cáncer o de metástasis del mismo, implicando el método la administración del anticuerpo a un individuo que tiene un cáncer que expresa PRL-1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.
2. El anticuerpo anti-PRL-1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende:
(a) un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo TYKNMR o TLNKFI, o ambos;
(b) un anticuerpo que se une a PRL-1, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 2 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 4;
(c) un anticuerpo que comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a (b) y que es capaz de unirse a un polipéptido PRL-1 intracelular.
3. Un anticuerpo anti-PRL-3 que es capaz de inhibir la actividad de la proteína tirosina fosfatasa de PRL-3 para su uso en un método de tratamiento o de prevención del cáncer o de metástasis del mismo, implicando el método la administración del anticuerpo a un individuo que tiene un cáncer que expresa PRL-3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.
4. El anticuerpo anti-PRL-3 para su uso según la reivindicación 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo KAKFYN o HTHKTR o a ambos.
5. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal humanizado.
6. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde el cáncer comprende, un cáncer metastásico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de pene, cáncer de cuello de útero, cáncer cerebral, cáncer esofágico, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renales del riñón, linfoma de ovario y melanoma de piel.
7. El anticuerpo anti-PRL1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el método implica además poner en contacto el cáncer con un anticuerpo anti-PRL3.
8. El anticuerpo anti-PRL3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el método implica además poner en contacto el cáncer con un anticuerpo anti-PRL1.
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