CN108434440B - 多肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽疫苗。具体而言，本发明提供了用于治疗和预防癌症，尤其是预防癌症转移的多肽疫苗。还提供了治疗或预防癌症的方法，以及包含多肽疫苗的药物组合物。其中，所述多肽疫苗包含细胞内癌蛋白的多肽片段。

Description

多肽疫苗
本申请是申请日为2012年8月29日的题为“多肽疫苗”的中国专利申请号201280054509.3的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞生物学、分子生物学和生物化学的领域。本发明还涉及医药领域。尤其是，本发明涉及疾病尤其是癌症的预防和治疗，以及用于这种用途的组合物。
背景技术
在过去的二十年中，癌症一直是详尽研究的主题。然而，关于负责癌症转移的基本原因却知之甚少并且大多数类型癌症预防仍然受到限制。因此，迫切需要用来预防癌症转移的有效方式。
基于抗体的治疗已证明可有效用于癌症治疗；然而，这种方式已传统上限于由癌细胞表达的细胞外或分泌蛋白1,2。因此，在文献中已确定了若干潜在的癌症或肿瘤标记物和癌抗原并且对于它们中的一些已开发了抗体疗法。
例如，众所周知的癌症疗法赫赛汀(曲妥珠单抗)是单克隆抗体，其可以杀伤HER2-阳性癌细胞。赫赛汀结合于在癌细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)抗原。同样，贝伐珠单抗(AvastinTM)是单克隆抗体，其靶向血管内皮生长因子(VEGF)，其为参与新血管形成的生长因子的一种。通过抑制血管发生，贝伐珠单抗阻止肿瘤细胞接受持续供应的血液，从而阻止接受肿瘤生存所必需的氧和营养物质。
然而，抗体治疗剂对于不同癌症的适用性不是通用的。已阻止抗体治疗剂的一般使用的限制的一种是抗体分子的大尺寸以及它们的随之而来的不能穿过血浆或细胞膜。在没有修饰的情况下，抗体(包括单克隆抗体)仅通常适用于靶向位于宿主细胞的表面或外部的癌抗原14"15。在上述实例中，HER2受体位于细胞表面上，因而可达到通过赫赛汀的抗体结合。同样，VEGF被分泌进入血流，因而能够被贝伐珠单抗结合。
大多数致癌蛋白是细胞内蛋白(如细胞内磷酸酶、细胞内激酶、转录因子等)，并且仍然是抗体疗法的方式未充分开发的。以下长期持有的观点：抗体太大以致不能穿透细胞膜，已阻碍抗体疗法的技术用于靶向细胞内蛋白。
因而，迫切需要用于治疗和预防癌症转移的有效方式。抗体迄今为止还没有用于靶向细胞内抗原或癌症标记物，这是因为抗体不能穿过细胞膜以及随之而来的无法进入抗原。
相比于标准化疗方案，基于抗体的疗法具有更好的特异性，因而具有改善的功效。因为抗体被视为太大以致不能接近细胞内(在细胞内)位置，所以抗体疗法已传统上靶向由癌细胞表达的细胞外(在细胞外或细胞表面)蛋白。然而，大量的致癌蛋白存在于细胞内(如细胞内磷酸酶/激酶和转录因子)，因此没有追求抗体疗法。
我们以前表明，三种不同的抗体可以分别靶向三种细胞内蛋白：PRL-3(肝再生磷酸酶3)，一种癌症相关磷酸酶；EGFP(增强的绿色荧光蛋白)，一种通用报道分子(报告子，reporter)；以及mT(多瘤病毒中T(polyomavirus middle T))，多瘤病毒中T癌蛋白(WO2011/065923)。然而，仅PRL-3细胞内磷酸酶(一种酶)相关于人癌症转移(参见Saha etal.,Science 294；1343(2001)和Wang et al.,Cancer cell 18；52-63(2010))，其它两种细胞内蛋白(EGFP和中T)则用来阐明以下普遍现象：抗体可以靶向细胞内蛋白。然而，癌蛋白用作癌症疫苗是有争议的，因而需要开发改善的癌蛋白癌症疫苗，其是更加特异性的并表现出与同源蛋白的更少的交叉反应以减少副作用，同时实现类似或改善的治疗效果。
致癌突变非常普遍地促进多种人癌症。然而，在细胞内蛋白或细胞表面蛋白的胞内结构域中经常检测到这些致癌突变。我们最近的工作提示一种非常规概念：可以通过治疗性抗体或肽接种疫苗来靶向细胞内癌蛋白。在这种新的考虑中，产生相对于那些特定突变的抗体或利用突变肽的接种疫苗可以特异性地除去表达相应的突变靶的癌细胞，但保留正常组织不受伤害。然而，特别相对于迄今为止发现的无数点突变来体外逐个地制备抗体是非常困难的和不实用的。因此，利用突变肽的接种疫苗可以是一个选择。
发明内容
如本文所描述的，借助于接种疫苗(vaccination)，可以靶向细胞内癌蛋白，以预防癌症和癌症转移。
如本文所描述的，静脉内(i.v.)注射B16F0或B16F10黑素瘤细胞，接着i.v.注射PRL-3单克隆抗体(mAb)的野生型C57BL6小鼠显示，PRL-3mAb可以减小由表达内源性PRL-3细胞内磷酸酶的B16F0黑素瘤细胞形成的肿瘤1，但并不减小由并不表达PRL-3的B16F10黑素瘤细胞形成的那些肿瘤。
i.v.注射EGFP-B 16F0或EGFP-B16F10细胞，其中两种细胞系均被设计以过表达EGFP，接着i.v.注射EGFP单克隆抗体的C57BL6小鼠显示，不管PRL-3表达状态，EGFP mAb可以根除由EGFP-B 16F0和EGFP-B 16F 10黑素瘤细胞系形成的肿瘤。另外，i.v.注射有mT抗体的多瘤病毒中T(Py-mT)-转基因的年轻雌性显示，mT抗体可以有效地减少表达mT的乳腺肿瘤的形成。
此外，和未免疫的小鼠相比，接种有PRL-3或EGFP抗原的C57BL6小鼠显示分别表达PRL-3或EGFP蛋白的转移性肿瘤的形成的显著减少。此外，接种有mT抗原的Py-mT小鼠显著抑制在乳腺中的肿瘤形成。获自194只野生型小鼠的结果表明，借助于抗体疗法和接种疫苗，可以成功阻止由细胞内癌蛋白引起的癌症转移。
如本文说明的，相比于用GST免疫的小鼠(阴性对照)，注射有中T蛋白的片段的年轻的PymT转基因小鼠表现出降低的乳腺肿瘤的发生率。此外，用Her2/neu片段(仅包含胞内结构域的片段)对小鼠进行的免疫会抑制由B16F0黑素瘤癌细胞形成的表达Her2/neu的肿瘤的形成。
另外，相比于用GST免疫的小鼠(阴性对照)，接种有雌激素受体肽或接种有雌激素受体抗体的MMTV-PymT小鼠具有减少的乳腺肿瘤的负担。
因而我们提供了用细胞内癌蛋白的片段来治疗癌症和预防癌症转移的方法。如在本文中所使用的，术语“细胞内癌蛋白”可以包括这样的癌蛋白，其具有胞内区。例如，膜锚定蛋白可以具有细胞外、跨膜、和胞内域(结构域，domain)或区。
片段可以是癌蛋白的区(相比于野生型或非致癌蛋白，其包含突变)的片段。突变可以相关于或导致癌症(即致癌突变)。
按照本发明的一个方面，提供了疫苗疗法的应用，包括用于接种疫苗的细胞内癌蛋白片段以刺激宿主产生其自身抗体以预防肿瘤形成。
还提供了在需要其的主体中用于刺激抗细胞内癌蛋白抗体的生产的方法的多肽，该多肽是细胞内癌蛋白的片段，其具有10至150个氨基酸，优选10至100个氨基酸。还提供了在需要其的主体中刺激抗细胞内癌蛋白抗体的生产的方法，包括给予多肽，其是细胞内癌蛋白的具有10至150个氨基酸的片段。
上述多肽可以是细胞内的癌蛋白的片段，或癌蛋白的胞内区的片段。上述片段可以包含致癌突变。
多肽可以包含多个片段。因此，在一个多肽中可以提供癌蛋白的多于一个的片段。可以将多于一种的多肽给予患者。一些或所有那些多肽可以包含多于一种的癌蛋白片段。一个或多个癌蛋白片段可以是相同癌蛋白的片段，或可以是来自不同癌蛋白的片段。在一些情况下，多肽包含相同片段的多于一个的拷贝。
按照本发明的另一个方面，我们提供了用于在患有或怀疑患有癌症的个体中治疗癌症，优选转移性癌症，的方法。上述方法可以包括将治疗有效量的细胞内癌蛋白的片段给予个体。细胞内癌蛋白可以已被确定为表达在个体正患有的癌症中。
上述片段可以对应于包含突变的癌蛋白的区。即，上述片段可以包含致癌突变。靶向致癌突变，例如利用包含癌蛋白的片段(其包括致癌突变)的肽，的优点在于，可以产生针对癌症具有特异性的免疫反应，而正常细胞则不受伤害。可以给予患者多种癌蛋白片段。可以将多种癌蛋白片段组合成一种或多种肽，其各自包含多个不同肽，各自可选地通过肽接头(peptide linker)加以连接。片段可以来自相同癌蛋白、或不同的癌蛋白。上述方法可以涉及诱导患者产生抗癌抗体，例如相对于癌蛋白或癌蛋白片段的致癌突变的抗体。上述方法可以涉及连同佐剂一起给予片段或肽。
细胞内癌蛋白片段可以是如此以致它并不包含胞外域或跨膜域。细胞内癌蛋白片段可以包含细胞质或细胞核癌蛋白片段。
细胞内癌蛋白片段可以包含一部分的雌激素受体蛋白，例如ER(雌激素受体)，或乙型肝炎病毒蛋白如HBV X蛋白、PRL-3蛋白、VHZ、Her2/neu或多瘤病毒中T(Py-mT)蛋白、Kras、EGFR、B-raf、PI3KCA、β-连环蛋白(beta-catenin)、GNAS、Ret、EZH2或GNAQ。
癌症可以相关于或起因于细胞内癌蛋白(其癌蛋白片段用于免疫)的过表达。癌症可以选自由乳癌、肝细胞癌症如肝细胞癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、宫颈癌、脑癌、食管癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑素瘤组成的组。癌症可以包括转移性癌症。
上述方法可以是如此，以致相比于未治疗个体，在治疗个体中，转移性肿瘤的数目减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些情况下，可以完全防止癌症的转移。
作为本发明的又一个方面，提供了细胞内癌蛋白片段、或其变体、同源物、或衍生物，用于预防癌症如转移性癌症的方法，该方法包括将预防有效量的细胞内癌蛋白片段、其变体、同源物、或衍生物给予患有或怀疑患有癌症的个体。
按照本发明的另一个方面，我们提供了药物组合物，该药物组合物包含(a)细胞内癌蛋白片段、或其变体、同源物或衍生物，以及药用赋形剂、稀释剂或载体。
除非另有指明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其是在本领域技术人员的能力范围内。在文献中解释了这样的技术。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel,F.M.et al.(1995和定期补充；Current Protocols in MolecularBiology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O'D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical AnalysisofDNA Methods in Enzymology,Academic Press；Using Antibodies:A LaboratoryManual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow(1999,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:A LaboratoryManual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring HarborLaboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of Drug Screening,由Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes编辑(2001,New York,NY,MarcelDekker,ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and OtherReference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskams and Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0-87969-630-3。它们各自以引用方式结合于本文。
本发明包括所描述的方面和优选的特点的组合，除非这样的组合是明显地不允许的或明确避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的而不应当被解释为限制所描述的主题。
现将通过举例的方式并参照附图来说明本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，进一步的方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文献以引用方式结合于本文。
附图说明
现将参照附图来讨论说明本发明的原理的实施方式和实验，其中：
图1是示意图，其示出，PRL-3mAb有效地抑制由表达PRL-3的癌细胞所形成的转移性肿瘤的形成。A,总细胞裂解液制备自B16F0和B16F10黑素瘤癌细胞，并利用免疫印迹来确定内源性PRL-3蛋白表达。GAPDH用作加载对照。B,C57BL6小鼠被注射1x 106B16F0细胞(第1天)，接着PRL-3小鼠抗体(mAb，克隆#318)治疗(按照治疗方案)。C.在第17-20天，在未经治疗的小鼠(n＝5)的肺、肝、肾上腺、肾、和骨中经常发现肿瘤，而在治疗小鼠(n＝5)的大多数组织中PRL-3mAb消除了肿瘤的形成。D,在实验的整个持续时间中，PRL-3mAb'治疗'B 16F0受体小鼠的体重不断增加。E,借助于表达非PRL-3的BI 6F10黑素瘤癌细胞系进行平行实验，并且借助于PRL-3mAb治疗没有获得治疗效果。F,在整个实验的持续时间内，治疗和未治疗B16F10受体小鼠的体重均不断降低。
图2是示意图，其表明，在介导抗体治疗事件中B细胞是重要的。A.Kaplan-Meier存活曲线用来比较注射有B16F0细胞的B细胞缺陷muMT小鼠的'治疗'和'未治疗'组。在未治疗(18.5天)和治疗(19天)组的中数(median)生存率之间没有明显差异。B.注射有B16F0的野生型C57BL6小鼠的Kaplan-Meier分析表明，在未治疗(17天)和治疗(21.5天)组的中数存活之间具有统计上的显著差异(.P＝0.0002)。C.注射有B16F10的野生型C57BL6小鼠C57BL6小鼠的Kaplan-Meier分析表明，在未治疗(16.5天)和治疗(17.5天)之间没有统计上的显著差异。D.总结了在治疗和未经治疗的小鼠之间的结果。无效(或携带肿瘤的)小鼠的数目作为分子以及小鼠的总数作为分母。在Y轴上的分数表示在每组中携带肿瘤的小鼠与总小鼠(n)的百分比。在X轴上的柱表示小鼠的类型。
图3是示意图，其说明，mT Ab有效地抑制表达mT癌蛋白的乳腺肿瘤的形成。A,基因分型用来确定转基因MMTV-PymT雌性。小鼠#2、#6、#7、和#10是杂合子转基因雌性(+/-)。B,#2和#6转基因小鼠保持未治疗作为对照以监测乳腺肿瘤的进展。#7和#10转基因小鼠接受mT抗体i.v.注射。在实验结束时(3个月)，处死所有小鼠。测量乳腺组织(肿瘤)的尺寸和重量。在相应下图中表示和显示5对乳腺作为4组。比例尺(bar)：1.5cm。C,在来自未治疗(a)、治疗(b)、和野生型(c)的乳腺中检查了全封固(mount)乳腺组织的形态。E.Kaplan-Meier存活曲线用来比较MMTV-PymT杂合子转基因雌性的'治疗'和'未治疗'组。F.在Y轴上的分数表示在每组中携带肿瘤的小鼠与总小鼠(n)的百分比。在X轴上的柱表示小鼠的类型。
图4是示意图，其说明，用mT抗原对MMTV-PyMT小鼠进行的免疫可以防止形成表达mT细胞内蛋白的乳腺肿瘤。A,用mT抗原进行的接种疫苗的治疗方案。B-D.MMTV-PymT杂合子转基因小鼠(TG)用于实验。用GST蛋白来免疫TG雌性(#43、#44、#45)。通过ELISA分析，这些小鼠在它们的血清中没有mT抗体并显示乳腺肿瘤的引人注目的进展。相比之下，用GST-mT融合蛋白免疫TG雌性(#37、#40、#41)；这些小鼠在它们的血清中具有高水平的mT抗体并显示出乳腺肿瘤的显著抑制。在每个图片的底部，10个乳腺显示为4组。顶部两组乳腺包括顶部三对乳腺，而底部两组则表示底部两对乳腺。测量了总共10个乳腺的重量。野生型小鼠(n＝3)用作对照。比例尺：1.5cm。E,比较了在'免疫'和'未免疫'MMTV-PymT小鼠之间的Kaplan-Meier存活曲线，其中在mT-免疫组(19.5周)与未免疫组(14.5周)中中位存活时间(p＝0.0004)明显地较长。F.在免疫和未免疫小鼠之间的结果总结。N表示每组中小鼠的数目；在每列中的分数表示携带肿瘤的MMTV-PymT小鼠与使用的总TG雌性的比例。
图5是示意图，其说明，PRL-3-、EGFP-或mT-Ab有效地抑制表达PRL-3、EGFP、和mT的肿瘤的形成。A,总细胞裂解液制备自EGFP-FO和EGFP-FIO癌细胞。在两种细胞系中均检测到外源性EGFP蛋白。PRL-3仅表达在EGFP-FO中(但在EGFP-FIO中较低)。GAPDH用作加载对照。B,汇集细胞的EGFP-FO和EGFP-FIO稳定群体显示为EGFP的异质表达。C.治疗方案示出C57BL6小鼠，其经由尾静脉被注射106个癌细胞(第1天)。治疗小鼠被i.v.注射EGFP mAb。未经治疗的小鼠被i.v.注射PBS。D-E,收获、检查和成像器官(在第17-20天)。在未治疗组中在肺、骨、肾上腺、和卵巢中发现肿瘤，但在治疗小鼠中则大大减少。注意，EGFP-Ab特异性地抑制EGFP-肿瘤，但并不特异性地抑制在肺中的非EGFP-肿瘤(图片，e)。F.a.未治疗FVB/N-MMTV-PymT，b.mT mAb有效地抑制在转基因MMTV-PymT小鼠中乳腺肿瘤的形成。c.非转基因小鼠显示作为对照的乳腺组织的正常尺寸。G.在未治疗和治疗小鼠(使用相对于细胞内靶的抗体)之间的结果总结。无效(或携带肿瘤的)小鼠的数目作为分子以及小鼠的总数作为分母。通过相对于它们的相应的细胞内靶的三种不同的抗体疗法，测试了146只小鼠。N表示每组中小鼠的数目；在每列中的分数表示携带重肿瘤的小鼠的比例。
图6是示意图，其示出，用PRL-3、EGFP、或mT细胞内抗原免疫的小鼠可以预防表达PRL-3、EGFP和mT的肿瘤。A,用相应抗原进行接种疫苗的治疗方案。B,然后，经由尾静脉，借助于1百万EGFP-FO或EGFP-F10癌细胞来激发未免疫、PRL-3-免疫或GFP-免疫小鼠。在癌细胞注射3周以后检查所有器官并借助于萤光显微术加以拍照片以显示转移性肿瘤的形态。黑色肿瘤表示表达非EGFP的黑素瘤细胞，而绿色肿瘤则表示那些表达EGFP的黑素瘤细胞。C,MMTV-PymT杂合子转基因雌性的综述：a.未免疫MMTV-PymT小鼠，b.mT-免疫小鼠，其显示减少的乳腺肿瘤。D,在未免疫和用细胞内抗原免疫小鼠之间的结果总结。84只小鼠用于接种疫苗实验。N表示每组中小鼠的数目；在每列中的分数表示携带重肿瘤(heavy tumor)的小鼠的比例。
图7是示意图，其示出PRL-3嵌合mAb的生成，其特异性地与PRL-3抗原反应。A.示意图，其概述嵌合mAb构建的主要步骤。B.通过间接免疫荧光，PRL-3嵌合mAb识别在DLD-l人结肠直肠癌细胞中过表达的EGFP-PRL-3：a,EGFP-PRL-3在固定DLD-l细胞(绿色)中的分布；b,PRL-3嵌合抗体和抗人得克萨斯红以揭示与PRL-3蛋白的结合；c,合并图像。比例尺：20μm。C.通过蛋白质印迹，分析了源自过表达EGFP-PRL-3的DLD-l细胞的细胞裂解液、和源自过表达myc-PRL-3、myc-PRL-1、和myc-PRL-2的CHO稳定细胞系的细胞裂解液。PRL-3嵌合抗体特异性地识别EGFP-PRL-3(48kDa)和myc-PRL-3(20kDa)，但并不与myc-PRL-1和myc-PRL-2起反应。
图8是示意图，其示出，PRL-3嵌合抗体有效地抑制由表达内源性PRL-3的Bl 6F0细胞形成的转移性肿瘤的形成。A.总细胞裂解液制备自F0和F10黑素瘤细胞并通过免疫印迹加以分析。在F0细胞中检测到丰富的内源性PRL-3蛋白，但在Fl0细胞中则几乎检测不到。B.第1天，经由尾静脉，裸鼠(n＝27)被注射lxl06个F0细胞，接着两次静脉内给予PRL-3嵌合mAb/周(第3、6、9、12、15天)。C.在实验结束时(第17天)，对小鼠进行拍照片并切开组织。在未经治疗的小鼠(左)的肾上腺、肝、骨和腹中发现转移性肿瘤，但在治疗小鼠(右)中则没有。D.裸鼠(n＝22)被注射lxl06个F10细胞，用于实验。在实验结束时(第17天)，在未治疗(顶图)和治疗小鼠(底图)中均发现几十个(dozens of)肺转移性肿瘤。E.示出'治疗'和'未治疗'F10受体的Kaplan-Meier存活曲线。
图9是示意图，其示出，PRL-3嵌合mAb抑制由A2780细胞和HCT-1 16细胞(其表达内源性PRL-3)形成的转移性肿瘤的形成。A.总细胞裂解液制备自HCT 1 16-luc2、HCT-1 16、A2780、和NCI-H460癌细胞系。在HCT1\6-luc2、HCT-1 16、和A2780细胞中，检测到内源性PRL-3蛋白，但在H460中则没有。B：第1天，裸鼠(n＝6)被注射lxl06个HCT-1\6-luc2癌细胞并随后在第3天被给予PRL-3嵌合mAb(n＝3，经治疗的)或PBS(n＝3，未治疗的)，接着两次静脉内给予PRL-3嵌合mAb，时间为7周。经由尾静脉来注射癌细胞和抗体。在第7周，I
Figure BDA0001598178050000091
成像系统用来体内跟踪和监测肿瘤发展。C.第1天，裸鼠被注射l xl06个癌细胞并如在B中所描述的加以治疗。当小鼠似乎病得很重时终止成对实验(未经治疗/治疗)。在每个图片的顶部指出实验持续时间。D.在注射有三种人癌细胞系的裸鼠中，小鼠PRL-3(R3-mAb)或嵌合PRL-3(R3-hAb)抗体疗法的治疗效果的总结。携带肿瘤的小鼠的百分比平均自每组(n＝小鼠的数目)并表示在Y轴。在此实验中使用总共101只小鼠。
图10A和图10B是示意图，其说明，在介导PRL-3嵌合抗体的治疗功效中B细胞是重要的。A.'治疗'和'未治疗'HCT-1 16-注射裸鼠和scid小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(a、b)。'治疗'和'未治疗'Bl 6F0-注射裸鼠和scid小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(c、d)。B.在裸鼠和scid小鼠中治疗实验的结果总结(a-d)。携带肿瘤的小鼠的百分比平均自每组(n＝小鼠的数目)并表示在Y轴。在此实验中使用总共151只小鼠。
图11A是示意图，其示出：A.在细胞表面上PRL-3是不可检测的，a.在用EGF-受体抗体温育的A431细胞(黑线)和没有用EGF-受体抗体温育的A431细胞(红线)之间观测到峰移，b.在用PRL-3mAb温育的FO细胞(黑线)和没有用Ab温育的FO细胞(红线)之间没有观测到峰移。c.在用PRL-3mAb温育的F10细胞(黑线)和没有用Ab温育的F10细胞(红线)之间没有观测到峰移。B在基于工作模型的I VIS实时成像以前1小时，静脉内注射标记的抗体：a.治疗小鼠。抗体的早期递送将持续攻击癌细胞以防止它们进一步进展，从而导致在开放阶段中的微转移，因此，在'治疗小鼠'中，荧光标记的PRL-3抗体可以接近并结合于转移性肺肿瘤。我们在治疗小鼠中观测到强荧光标记的肺，b,未经治疗的小鼠。不受控制的癌细胞迅速倍增。它们自由地发展成大转移灶(macro-metastases)并建立防御领地，某种肿瘤微环境，其使得抗体和免疫系统不易进入，因此，荧光标记的PRL-3抗体不能标记在'未经治疗的小鼠'中的转移性肺肿瘤。因而我们在未经治疗的小鼠中不能观测到荧光标记的转移性肺。在H&E染色部分中，黑色箭头示出来自未治疗B 16F0受体的转移性肺肿瘤的清晰边界('围栏(fence)')。比例尺：200μm。红色箭头指示血管。
图12是示意图，其示出，在肺癌和AML中PRL-3蛋白被上调。A.在肺鳞状细胞癌中PRL-3表达的代表性的IHC染色。B.肺腺癌。比例尺：100μm。C.总结了如借助于免疫组化法(IHC)检测的PRL-3阳性肺癌的百分比，按照癌症亚型加以分组。D.通过IHC，检查了AML骨髓样品，在69个样品中有24个样品(35％)显示PRL-3表达。示出三个选择的图像。
图13是示意图，其示出，在治疗中，涉及先天免疫系统中的NK细胞。在实验前24小时，裸鼠被注射(n＝2)和未注射(n＝2)有GM1抗体。在GM1注射小鼠中，在第1天，经由尾静脉，所有小鼠被注射lxl06个F0细胞，接着两次静脉内给予PRL-3嵌合mAb/周(第3、6、9、12、15天)。在第18天，检查治疗功效。相比于GM 1未注射小鼠，GMI注射裸鼠显示在肺、肝、肾上腺、睾丸、和骨中更严重的肿瘤(黑色)承载负担，而不论PRL-3mAb治疗或未治疗。
图14是示意图，其示出，治疗结果高度相关于靶的组织表达模式。A,B.在正常小鼠组织中PRL-3和PRL-2的蛋白质的表达模式(通过蛋白质印迹)，GAPDH用作加载对照。C.HCT-1 16(PRL-2阳性细胞系)受体未能响应PRL-2抗体(该抗体还与PRL-1交叉反应)治疗，最可能是由于以下事实：PRL-2广泛表达在大多数我们已检查的小鼠组织中。
图15示出用VHZ免疫C57BL6小鼠以及监测肿瘤发展的结果。通过腹膜内注射总体积为200ml的弗氏佐剂：在100ml盐水中的20mg的VHZ抗原并混合100ml完全佐剂(Cat#77140,Pierce)，来免疫8周龄C57BL6小鼠。接着的两次免疫是注射总体积为200ml的佐剂：在100ml盐水中20mg的VHZ抗原，并混合100ml不完全佐剂(Cat#77145,Pierce)。每2周给予第二和第三次注射，在肝素涂层毛细管中收集100-200ml尾部出血。血浆制备自血液样品并通过ELISA来测量抗体滴定度。先前描述了ELISA的详细步骤。选择在它们的血清具有高滴定度的VHZ抗体的小鼠且侧尾静脉注射1x106个表达VHZ的癌细胞。在本研究中，未接种疫苗小鼠用作阴性对照。
图16示出在实施例40和41中使用的Her2/neu癌蛋白和mT癌蛋白的片段的序列。Her2a细胞内肽是Her2特有的，并且并不与EGFR(Her1)交叉反应。
图17：用Her2片段免疫的小鼠可以抑制由B16F0黑素瘤癌细胞形成的表达Her2的肿瘤的形成。(A)接种疫苗计划，使用Her2内-、外-、和C-末端片段。(B)在第16周，经由尾静脉，用1百万个B16F0癌细胞来激发未免疫、Her2内免疫、或Her2外免疫小鼠、以及Her2C-末端免疫小鼠。在癌细胞注射以后约17天，检查所有器官并拍照片以显示转移性肿瘤的形态。黑色肿瘤表示B16F0黑素瘤细胞。(C，上部)确认ELISA分析以表明Her2片段免疫(但不是未免疫)小鼠在它们的血清中具有高水平的Her2抗体。(C，下部)。计数并显示来自每只小鼠的肺肿瘤的总数。每组中N＝3。
图18：用Her2a短肽或片段免疫的小鼠可以抑制由B16F0黑素瘤癌细胞形成的表达Her2的肿瘤的形成。(A)接种疫苗计划，使用Her2a短肽、Her2外片段。(B)在第16周，经由尾静脉，用1百万个B16F0癌细胞来激发Her2短肽免疫、Her2外免疫、和未免疫小鼠。在癌细胞注射以后约17天，检查所有器官并拍照片以显示转移性肿瘤的形态。黑色肿瘤表示B16F0黑素瘤细胞。(C，上部)确认ELISA分析以表明Her2短肽免疫、Her2外片段免疫(但不是未免疫)小鼠在它们的血清中具有高水平的Her2抗体。(C，下部)。显示来自每只小鼠的肺肿瘤的总数。每组中N＝3。Her2jp’等同于Her2-外。
图19：接种有mT肽的MMTV-PymT TG年轻雌性会减少乳腺肿瘤的形成。(A)用mT肽进行接种疫苗的治疗方案。(B)相比于GST-免疫小鼠(不相关的免疫小鼠作为阴性对照)，mT肽免疫小鼠显示对肿瘤的显著抑制。(C，上部)10个乳腺被显示为在每个图片的底部的4组。(C，下部)示出来自每只小鼠的乳腺的平均重量，其中利用具有正常尺寸的乳腺的WT小鼠作为对照。
图20示出雌激素受体(ER)和HBV-X蛋白的序列。雌激素受体肽用于实验，其结果详细示于图21。ER-红色和ER-紫色表示两个区(或片段)，其由红色和紫色序列指示。
图21：MMTV-PymT TG年轻雌性接种有雌激素受体肽(ER-紫色和ER-红色)以减少乳腺肿瘤的负荷。(A)接种疫苗的治疗方案，使用雌激素受体肽(ER-紫色或ER-红色)。(B)为了证实靶向肿瘤正表达用于适当治疗的雌激素受体，进行蛋白质印迹以显示，雌激素受体蛋白正表达在来自MMTV-PymT TG成年雌性的肿瘤(乳腺肿瘤和肺部肿瘤)(泳道4-5)组织中。(C)对于阴性对照，使用GST抗原(其并不表达在靶肿瘤中)的免疫小鼠，用ER-紫色肽和ER-红色肽免疫的，相比于GST免疫对照小鼠，上述两组肽显示对肿瘤的显著抑制。
10个乳腺被示为在每个图片的底部的4个组织组。比例尺，1.0cm。(D)连同野生型(wt)小鼠，其作为正常乳腺尺寸(平均值±SD)的对照，示出来自每组小鼠的乳腺的平均重量。
图22：抗体治疗的结果高度相关于靶的组织表达模式。A.通过蛋白质印迹并利用ERa抗体，以及GAPDH用作加载对照，检查了雌激素受体(ERa)在正常小鼠组织以及肿瘤(乳腺肿瘤和肺部肿瘤)组织中的蛋白质表达模式。B.雌激素受体1(ERa)抗体治疗的治疗方案。C.学生t检验分析揭示在未治疗和Era治疗组之间平均乳腺肿瘤重量的显著差异(P＝0.0163)(平均值±SD)。P<0.05被视为统计学上显著的。D.在结束时(13周龄)，杀死并检查所有小鼠。测量乳腺组织(肿瘤)的尺寸和重量。指出和显示5对乳腺作为在相应下图中的4组。
图23：抗体靶向细胞内抗原的三种可能的机制。A.抗体可以潜在地进入表达PRL-3的细胞以靶向细胞内PRL-3并中和它的功能。B.通过非常规分泌，一些细胞内PRL-3可以被外化和展示在癌细胞的表面上。C.可以通过MHCⅠ类分子来呈递细胞内PRL-3的蛋白水解片段以吸引细胞毒T细胞。
图24：在C57BL6小鼠中PRL-3肽(EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC-KLH)的接种疫苗可以阻断由表达PRL-3的癌细胞系(B16F0)形成的肿瘤。
图25：在C57BL6小鼠中，PRL-3肽的接种疫苗可以减少由表达PRL-3的细胞(B16F0)但并不减少由不表达PRL-3的细胞(B16F10)形成的肿瘤。
图26：用Ras突变肽(CMTEYKLVVVGADGVGKSALT)免疫的Balb/c小鼠可以阻断由表达Ras(G12D)突变的CT-26癌细胞形成的肿瘤。
图27：A.包含致癌突变(粗体表示突变)的肽。B.其它致癌突变。
图28.确定自以下的致癌突变
http://share.gene.com/mutation_classification/cancer.variants.txt。
具体实施方式
在以下随附描述中阐述了本发明的一种或多种实施方式的详情，包括由本发明人设想的用于实施本发明的最佳方式的具体详情(通过举例的方式)。对于本领域技术人员将是明显的是，可以实施本发明而不限于这些具体详情。
为了探讨靶向细胞内蛋白的可能性，在本研究中，我们已选择专注于三种代表性的细胞内靶，用于在动物模型中的抗癌疗法。
我们选择癌症相关的-PRL-3细胞内磷酸酶作为用于PRL-3抗体疗法的靶。在PRL(肝再生磷酸酶)家族(其确定于1994年和1998年5,6)中，PRL-3是三个成员(PRL-1、-2。和-3)之一。上述三种PRL形成蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的亚组7。
在2001年首次将PRL-3与结肠直肠癌转移联系起来。随后，报道了，当与它们的正常对应物比较时，单独PRL-PTP的上调相关于许多类型的晚期人转移性癌症9。
PRL磷酸酶是有趣的蛋白组，其被证实为人类癌症的生物标记物和治疗靶10。PRL是细胞内C端异戊烯基化磷酸酶，而缺乏异戊烯基化信号的PRL的突变形式通常定位于细胞核11,12。
通过EM免疫金标记已揭示了PRL-1和PRL-3定位于血浆膜和早期内体的内小叶13。通过外源性试剂靶向PRL以除去PRL-癌细胞，需要它们渗透进入细胞并且是一项具有挑战性的任务。
我们选择细胞溶质增强的绿色荧光蛋白(EGFP)，一种流行的报道蛋白，最初分离自海蜇(维多利亚发光水母，Aequorea victoria)，当暴露于蓝光时其发绿色荧光。EGFP是细胞内蛋白，其有时进入细胞核。作为中性外源性蛋白，EGFP用作在EGFP-B 16F0和EGFP-B16F 10黑素瘤细胞中的人工'癌细胞特异性细胞内蛋白'。
于是，EGFP mAb将靶向过表达这些EGFP的黑素瘤细胞。我们预计，在动物模型中EGFP抗体应具有较小的不受欢迎的副作用，这是因为EGFP并不表达在宿主组织中。
我们选择众所周知的癌蛋白，多瘤病毒中T(mT)细胞内激酶，作为第三靶14。在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子/增强子的转录调控下，我们使用携带mT癌基因的Py-mT转基因杂合子雌性(+/-)的乳腺癌模型。在癌症研究团体中，转基因小鼠已被广泛用作优良的小鼠肿瘤模型几十年，以评估转移性乳腺肿瘤表型的相对贡献15,16。
我们选择众所周知的癌蛋白Her2(还被称为ErbB-2)。我们对C57BL6小鼠注射B16F0黑素瘤细胞，作为癌症转移的模型，并研究Her2片段是否可以抑制表达Her2的肿瘤的形成。
片段和肽接种疫苗正使用设计和选自全癌蛋白序列的较短序列作为抗原来刺激宿主免疫系统，以产生相对于源自全癌蛋白(其正表达在肿瘤细胞中)的特定片段或肽的抗体。预计'片段和肽'接种疫苗是更加特异性的并较少与它们的同一家族的同源成员交叉反应。因而相比于全癌蛋白疫苗，片段或肽疫苗具有较少副作用并且是更加特异性的。可以删除和避免位于全癌蛋白中并与其它家族成员交叉反应的序列。产生的独特的肽对于靶是非常特异性的并且并不与它的相关的靶序列反应。
为了获得更好的理解和将我们以前有前途的临床前数据17扩展到在人类中的未来临床应用，在本文中，我们用野生型动物模型进行全抗体疗法研究，以揭示迄今为止未确认的概念：抗体疗法可以用于靶向细胞内癌蛋白。
致癌突变通常促进人类癌症。因为现代技术可以容易地识别其肿瘤相关于或起因于特定致癌突变的患者，所以我们可以设计对应于这些致癌突变的肽。使用这种特定突变肽的疫苗可以潜在地触发患者的相对于突变蛋白的免疫系统，患者将产生适宜的抗体“药物”和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，用于它们自己的抗癌治疗。因为疫苗可以诱发长期免疫性，所以在消除它们的肿瘤中当正确的抗原(肽或基因片段)用来触发患者的免疫系统以使它们自己的抗体和CTL相对于正确的突变靶时，它们可以实现类似于抗体治疗剂的结果。
因为树突状细胞(DC)是抗原呈递细胞(APC)，其在适应性免疫反应的调节中发挥关键作用，所以大量的DC可以分离和产生自CD34+骨髓前体或CD14+单核细胞(体外)。体外接种疫苗将培养(educate)APC以能够在它们的细胞表面呈递肽抗原。将经培养的APC重新引回到相同宿主以触发B和T细胞对这些肽抗原的反应并产生抗体和CTL以除去表达特异性抗原的癌细胞。
可替换地，可以将加以合成以包含靶抗原的肽，可选地包括致癌突变，给予患者，以体内培养它们的免疫系统。
实施例表明，相对于同源抗原的抗体可以靶向上述细胞内蛋白的每一种。
如果抗体可以识别它的细胞内抗原，则细胞内抗原可以潜在地用于接种疫苗以刺激宿主免疫系统并产生相对于它的抗体。它促使我们探讨相对于表达特定细胞内抗原的肿瘤，用细胞内癌蛋白进行接种疫苗。
接种疫苗是廉价的然而可有效地刺激宿主免疫性。相比于细胞外抗原，在接种疫苗中使用的细胞内蛋白获得的关注就少得多，这是由于它们的细胞内定位。这种接种疫苗的主要目的是人工激活相对于特定细胞内蛋白的免疫系统以在一些个体中引发相对于表达上述细胞内蛋白的某些恶性细胞的抗体，从而在未来预防肿瘤形成。
接着，我们使用相同的三种细胞内抗原(PRL-3、EGFP、和mT)在C57BL6野生型小鼠中进行接种疫苗。我们获得有趣的结果，如在实施例中所示，用细胞内肿瘤抗原免疫的小鼠能够根除这些表达特定肿瘤抗原的癌细胞，从而减少肿瘤的形成。更重要的是，数据表明以下可能性：对于遗传上具有发展某些癌症(由已知的细胞内癌蛋白引起)的高风险的个体，通过接种疫苗来防止疾病进展。癌症的这样的特定的主动免疫疗法，如果成功和有效的话，相比于被动免疫疗法，具有明显的优势。
在本研究中，对于抗体疗法和接种疫苗(使用用于抗癌的细胞内蛋白)我们均使用194只小鼠(图6)。癌症研究正迅速迈向个体化癌症疗法，因为肿瘤学家开始对个别患者使用定制治疗策略。抗体疗法和接种疫苗可以满足个性化治疗的承诺并且可以是个体化用药的未来，因为我们有能力制备用于我们自身恢复的抗体。
目前，疫苗主要用来预防细菌和病毒感染以及用来靶向在癌细胞上的一些胞外蛋白(受体)。我们的数据表明，靶向细胞内癌蛋白的策略对于未来的癌症预防具有巨大的前景。
如本文所描述的癌蛋白是这样的蛋白，其涉及相关于致瘤细胞生长的蛋白的调节或合成。癌蛋白可以是致癌多肽，其涉及正常细胞到癌细胞的转化。相比于在正常细胞中，癌蛋白可以在肿瘤细胞中具有更高表达。癌蛋白是细胞内癌蛋白，这意味着，它们位于细胞内，例如在细胞核或细胞质中，或连接于细胞膜的细胞内表面。优选地，癌蛋白是自体抗原，这意味着，它们是这样的蛋白，其通常存在于动物中，并形成表达自动物的基因组的蛋白群体的一部分，并且并不异源于上述动物，如病毒蛋白。
可替换地，细胞内癌蛋白可以是具有胞内区的癌蛋白。例如它可以是膜锚定蛋白，其具有延伸进入细胞质的区。
癌蛋白可以是非自体抗原，如由感染细胞表达的病毒蛋白。在一些情况下，细胞内癌蛋白不是源自微生物。例如，不是病毒癌蛋白，或不是细菌癌蛋白，或不是真菌癌蛋白。在一些情况下，癌蛋白不是HPV癌蛋白。优选地，癌蛋白是自体抗原。使用细胞内自体抗原的一个潜在的优势在于，相比于胞外自体抗原，它们可以具有激起免疫反应的更好的机会，这是因为在发展(发育，development)期间通常消除靶向胞外自体抗原的免疫细胞。
通过用细胞内癌蛋白进行接种疫苗来预防癌症
先前的治疗性抗体被认为仅接近出现在细胞的外表面上的分子。按照在文献中的预期，用抗体来靶向细胞内PRL和这样的其它细胞内癌蛋白以除去癌细胞和癌症转移以前从来没有被认为是可能的，这是由于它们的细胞内定位。
因此，用细胞内癌蛋白进行接种疫苗以防止癌细胞形成、癌细胞生长和癌症转移以前从来没有被认为是可能的。我们已经表明，并不是这种情况。此外，我们已经表明，用细胞内癌蛋白的片段进行接种疫苗也是可能的，并且相比于胞外癌蛋白的片段，可以具有改善的功效。
用细胞内癌蛋白或其片段进行的接种疫苗，如本文披露的，可以刺激宿主的抗体生产。B细胞可以被刺激以产生对于细胞内癌蛋白或其片段具有特异性的抗体。因此，接种疫苗可以刺激针对细胞内癌蛋白或其片段的B细胞反应。
因此我们一般提供了致癌癌蛋白的片段，其中上述癌蛋白在特性上是细胞内的，作为癌症疫苗，尤其作为相对于癌症转移的疫苗，或用来抑制癌症的扩散或生长。
我们提供了在预防相关于致癌癌蛋白的癌症，包括癌症转移的方法中癌蛋白片段(上述癌蛋白在特性上是细胞内的)的应用。
接种疫苗可以涉及来自特定癌蛋白的单片段(即，相同肽的同源群体)。可替换地，可以使用具有多于一个序列的肽。例如，序列X和序列Y的肽的混合物。肽可以是重叠的，或来自癌蛋白的不同区。在一些情况下，肽并不跨越所有、或基本上所有的癌蛋白。也就是说，肽的混合物仅包含部分的癌蛋白。在一些情况下，可以使用来自多于一种癌蛋白的不同肽的混合物。在使用不同肽的混合物(来自相同癌蛋白的不同肽，或来自不同癌蛋白的肽)的情况下，可以同时或依次地给予它们。优选地，每种肽将能够诱导宿主以产生相对于细胞内癌蛋白的抗体。
按照本发明，仅可以使用单肽。可替换地，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种肽的混合物。
我们提供了用于预防相关于致癌癌蛋白的癌症(包括癌症转移)的方法，上述癌蛋白在特性上是细胞内的，上述方法是通过将预防有效量的细胞内癌蛋白的片段给予对其需要的患者。
我们提供了药物组合物，该药物组合物包含细胞内癌蛋白片段，以及药用赋形剂、稀释剂或载体。我们提供了上述药物组合物的应用，用于预防癌症，包括癌症转移。
因为树突状细胞(DC)是抗原呈递细胞(APC)，其在适应性免疫反应的调节中发挥关键作用，所以我们可以体外自CD34+骨髓前体或自CD14+单核细胞分离和产生大量的DC。体外接种疫苗将培养APC以能够在它们的细胞表面中呈递肽抗原。可以将经培养的APC重新引入返回到相同宿主以触发对这些肽抗原的B和T细胞反应并产生抗体和CTL反应，从而除去表达特定肿瘤抗原的癌细胞。
可替换地，或另外地，可以利用用癌蛋白或片段进行的接种疫苗来直接培养患者的免疫系统。可以确定针对患者的癌症的癌蛋白、抗原和/或突变。这可以包括细胞内或细胞外癌蛋白、抗原和/或突变。然后可以合成包含这些癌蛋白、抗原和/或突变的相关片段的肽并用作疫苗。接种疫苗可以涉及在存在或缺乏一种或多种佐剂的情况下给予肽。例如，弗氏完全佐剂。免疫可以涉及在多个时间或位置来给予肽。例如，每月一次。为了测试免疫的功效，ELISA可以用来确定患者是否已产生肽特异性抗体。
因此，可以将一种或多种不同的肽给予患者。可以选择包含特定癌蛋白、表位或致癌突变(已知其相关于、或引起患者癌症)的片段的肽，用于给予该肽。因此，所选的肽的混合物可以专用于(即个性化于)个别患者。可以选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多种肽的混合物。
因此，治疗方法可以涉及以下步骤：在获自患者的样品中确定特定致癌突变或癌蛋白的存在。样品可以是肿瘤活检、或血液或尿液样品。可以通过任何适宜的方法，例如蛋白质印迹、ELISA或PCT方法，来确定针对肿瘤的抗原。可以设计或选择肽以对应于已知存在于患者中的癌蛋白或致癌突变。
细胞内癌蛋白
细胞内癌蛋白和细胞内抗原在本领域中是已知的并且可以包括(除其它外)以下任何一种或多种，或它们的变体、衍生物、同源物或片段。
适宜的细胞内癌蛋白将是本领域技术人员明了的。在肿瘤形成期间被特异性地上调但不良或不表达在宿主组织中的基因特别有希望作为肿瘤特异性靶。对于显示基因连锁的癌症，用抗原(基于表位的肽疫苗)，其相关于家族性癌症，而进行的有免疫能力的(immune-competent)年轻易感家族成员的免疫可以引发相对于癌蛋白的免疫系统。于是这些内源刺激的抗体可以潜在地对抗表达特定癌蛋白的癌细胞。本文所描述的结果表明，相对于癌症的基于抗体的疗法和接种疫苗可以扩展到各种各样的细胞内癌蛋白作为治疗靶。以前被认为是由治疗性抗体或接种疫苗不可靶向的全部类别的细胞内癌蛋白现在可以扩大用于定制的癌症疗法的范围以及迎来癌症疫苗的新时代。我们预计，使用细胞内自体抗原的一个潜在的优势在于，相比于胞外自体抗原，它们可以具有激起免疫反应的更好的机会，这是因为在发展期间通常会消除靶向胞外自体抗原的免疫细胞。我们发现，相比于外源递送抗体，抗原诱导的抗体疗法可以实现类似的抗肿瘤治疗功效。由于现有的常规临床抗体疗法是昂贵的，所以接种疫苗可以是更有用的和经济的，作为诱导高滴定度的抗原诱导的抗体的方式。“癌症接种疫苗”的这种设想是有希望的和具有挑战性的。
雌激素受体
可用于本发明的癌蛋白是雌激素受体(ER)。癌蛋白可以是人ER。它可以包含在P03372(GI:544257)中阐述的蛋白序列或由其构成。
雌激素受体和其片段将可用于治疗起因于、或相关于雌激素受体(ER)的过表达的乳癌。相对于ER的抗体或利用ER癌蛋白或其片段的接种疫苗可以用来预防扩散。这特别可用于靶向ER阳性乳癌患者，而不管Her2或其它蛋白的表达。
雌激素受体(ER)是配体激活的转录因子，其由对于激素结合、DNA结合、和转录的激活重要的若干域构成。选择性剪接导致若干ER mRNA转录本，其主要差异在于它们的5-引发非翻译区。翻译的受体显示较少的变异性(参见OMIM参考文献133430)。
雌激素受体是众所周知的细胞内受体(参见Ross-Innes CS,Stark R,Holmes KA,et al.Cooperative interaction between retinoic acid receptor α and estrogenreceptor in breast cancer.Genes Dev.2010；24:171-182)。
乙型肝炎病毒(HBV)蛋白
乙型肝炎蛋白可以适用于本发明。HBV存在为8种基因型。
一种适宜的HBV蛋白是HBV X蛋白。HBV X蛋白定位于感染细胞的细胞核内。大多数肝细胞癌(HCC)相关于HBV感染。因此，HBV蛋白可以用于治疗HCC，抗体靶向病毒蛋白以特异性地破坏病毒感染细胞，而正常细胞则不受伤害。
HBV-X蛋白的蛋白序列已被登记在GenBank并且适用于本发明。例如，术语“HBV-X蛋白”可以用来指这样的蛋白，其包含或由在GenBank CBX46805.1(GI:310923520)、或EMBL登记号FR714506.1中阐述的序列组成，或这样的蛋白，其由基因编码，具有如在登记号AB670311.1(GI:371919030)中阐述的序列。
PRL-3
以下文本改编自OMIM条目606449。
PRL-3还被称为蛋白酪氨酸磷酸酶，类型4A,3；PTP4A3。PRL-3的染色体位置是在基因图基因座8q24.3。
在心脏中，蛋白激酶调节收缩性、离子转运、代谢、和基因表达。除它们在去磷酸化中的作用之外，磷酸酶还涉及心脏肥大和功能障碍。
通过心脏cDNA文库的数据库搜索和筛选，Matter et al.2001,Biochem.Biophys.Res.Commun.283:1061-1068，确定了编码PTP4A3(其被称作PRL3)的cDNA。推导的PRL3蛋白是76％相同于PRLl(PTP4A1；601585)以及96％相同于小鼠Prl3。RNA印迹分析揭示了大约2.3-kb PRL3转录本主要表达在心脏和骨骼肌中，并在胰腺中具有较低表达。这种表达模式不同于PRL1和PRL2(PTP4A2；601584)的更宽表达。原位杂交分析将PRL3表达定位于心肌细胞。三甘氨酸凝胶分析显示，PRL3被表达为22-kD蛋白。功能和突变分析表明，磷酸切割取决于PRL3的cysl 04。PRL3的过表达导致增加的细胞生长。蛋白质印迹分析显示响应于血管紧缩素(angiotensin)II(106150)，pl30cas(BCAR1；602941)的去磷酸化，这提示PRL3在由血管紧缩素II诱导的细胞内钙瞬变(transient)的调节中的作用。
为了深入了解转移的分子基础，Saha et al.2001,Science 294:1343-1346比较了转移性结肠直肠癌的全基因表达谱和原发性癌症、良性结直肠肿瘤、以及正常结直肠上皮的全基因表达谱。在所研究的18种癌症转移的每一种中PRL3被高水平表达，但在非转移性肿瘤和正常结直肠上皮中则以较低水平被表达。在检查的12个转移中有3个，在位于染色体8q24.3处的小扩增子内发现PRL3基因的多个拷贝。Saha et al.(2001)得出的结论是，PRL3基因对于结肠直肠癌转移是重要的。
利用Stanford G3辐射杂交板(radiation hybrid panel)和数据库序列分析，Saha et al.(2001)将PRL3基因基因定位于周围标记物145.20。PRL3基因还紧密连锁于标记物SHGC-22154，其位于8q24.3处，离8q端粒大约3Mb。
在Li et al(2005),Clin Cancer Res；l 1:2195-204中详细描述了小鼠和人PRL-3蛋白。
PRL-3序列
本文描述的方法和组合物使用PRL-3多肽，其详细描述于下文。如在本文中所使用的，术语"PRL-3"用来指选自以下的序列。
单基因 描述
Figure BDA0001598178050000201
Figure BDA0001598178050000211
Figure BDA0001598178050000221
"PRL-3多肽"可以包含或由人PRL-3多肽构成，如具有Unigene登记号AF041434.1的序列。
还包括任何、一些或所有这些多肽的同源物、变体和衍生物。例如，PRL-3可以包括Unigene登记号BC066043.1。
VHZ
本文描述的方法和组合物使用VHZ，其详细描述于下文。
VHZ还被称为DUSP23、MOSP、LDP-3、DUSP25、FLJ20442和RP1 1-190A12.1。
如在本文中所使用的，术语"VHZ"可以指多肽序列，其具有GenBank登记号NP_060293.2、NP_081001.1、XP_341 157.1、XP_001 170819.1、XP_001 170835.1、XP_545747.2、NP_001076078.1、NP 00101 1371.1、NP_783859.1、NP_001034709.1、XP_001480730.1、XP_001 1 17253.1或XP 001 1 17256.1。
"VHZ多肽"可以包含或由人VHZ多肽构成，如具有登记号NP 060293的序列。
关于核酸序列，可互换使用术语"VHZ多核苷酸"、"VHZ核苷酸"和"VHZ核酸"，并且应被理解为特别包括cDNA和基因组VHZ序列。这些术语还旨在包括这样的核酸序列，其能够编码VHZ多肽和/或其片段、衍生物、同源物或变体。
在提及VHZ核酸的情况下，这应该被视为提及核酸的VHZ家族的任何成员。特别令人感兴趣的是这样的VHZ核酸，其选自由NM_017823.3、NM_026725.2、XM_341 156.3、XM_001170819.1、XΜ_170835.1、XΜ_545747.2、ΝΜ_001082609.1、ΝΜ_00101 1371.1、Ν_175732.1、ΝΜ_001039620.1、XΜ_001480680.1、XΜ_001 1 17253.1或XΜ001 1 17256.1组成的组。
还包括下文阐述为"其它VHZ核酸序列"的任何一种或多种核酸序列。
例如，VHZ核酸可以包含具有GenBank登记号NM 017823.3的人VHZ序列。
Her2
Her2/neu(还被称为ErbB-2)表示“人表皮生长因子受体2”并且是在乳癌中产生较高攻击性的蛋白质。它是ErbB蛋白家族(更常称为表皮生长因子受体家族)的成员。HER2/neu还已被指定为CD340(分化340的簇)和p185。HER2是细胞膜表面结合受体酪氨酸激酶并且通常涉及导致细胞生长和分化的信号转导途径。
如本文所描述的，HER2可以指多肽序列，其选自GenBank登记号NP_004439.2、NP_001005862.1、NP_001003817.1、AAI67147.1。
如本文中提及的，“Her2多肽”可以包含或由人HER2多肽序列构成，如登记号P04626.1的多肽序列。
Her2多肽描述于US6333169和EP1418235。
可用于本发明的其它癌蛋白包括EGFR(GenBank登记号CAA25240(GI:119533)、ADZ75461.1(GI326467049))、SHP1(GenBank登记号NP002822.2(GI:18104989)、NP536858.1(GI:18104991)、NP536859.1(GI:18104991))、Tiam(GenBank登记号NP003244.2(GI:115583670)、AAA98443.1(GI:897557)、Q13009.2(GI:152031709))、Myc(GenBank登记号AAA59886.1(GI:188975)、AAA59887.1(GI:188977)、CAA25015.2(GI:29839758)、NP002458.2(GI:71774083))、Ras(GenBank登记号AAA34557.1(GI:171374))和Runx-1(GenBank登记号NP001079966.1(GI:148232064))。
优选的细胞内癌蛋白靶包括雄激素受体(AAA51772；GI:178882),Her2(P04626.1；GI:119533，靶向受体的胞内结构域)、突变Ras(GenBank登记号AAA34557.1；GI:171374)、Jak(AAA19626.1；GI:508731)、FLT3(ITD3；CAA81393.1；GI:406323)、Runx1(AAI36381.1；GI:223459612)、Tiam、Gfi(NP_005254.2GI:71037377)、Cot(MAP3K8；CAG47079.1；GI:49457560)、Myc、SHP1、FGF(CAA28027.1；GI:31362)。
其它优选的癌蛋白包括KRas(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物；GenBank P01116.1GI:131875)；EGFR(表皮生长因子受体；P00533.2GI:2811086)；BRaf(P15056.4GI:50403720)；PI3KCA(磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基α；P27986.2GI:118572681)；Β-连环蛋白(CAA61107.1GI:860988)；GNAS(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白；Q5JWF2.2GI:116248089)；Ret(CAA73131.1GI:1946207)和EZH2(组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶；zeste同系物2的增强子；Q15910.2GI:3334180)。
致癌突变包括那些致癌突变，其列于图27和图28，以及可获自http:// share.gene.com/mutation_classification/cancer.variants.txt。
致癌突变
致癌突变是在基因中相关于、或导致癌症的突变。突变可以是单个氨基酸残基的 替换、缺失或添加。可替换地，它可以影响多于一个的氨基酸残基。若干致癌突变在本领域 中是已知的。某些致癌突变列于http://share.gene.com/mutation_classification/ cancer.variants.txt。可以通过比较获自、或相关于癌症的蛋白质的序列和获自不患有癌症的个体的同源蛋白来确定致癌突变。用于比较蛋白序列的方法在本领域中是众所周知的。
蛋白片段和肽
按照本发明，蛋白片段或肽(在本文中可互换使用)是小多肽、肽或肽模拟物，其基于或包含来自细胞内癌蛋白或癌蛋白的细胞内部分的氨基酸残基的相邻序列。蛋白片段和肽并不包含整个致癌蛋白。肽可以包含或由通常位于细胞内的癌蛋白的片段、或对应于通常在细胞内的癌蛋白区的癌蛋白的片段构成。
按照本发明，蛋白片段或肽可以具有150、140、130、120、110或100个氨基酸并小于相应癌蛋白的全长的最大长度。更优选地，最大肽长度是90个氨基酸，仍然更优选80个氨基酸，仍然更优选70个氨基酸，仍然更优选60个氨基酸，仍然更优选50个氨基酸，仍然更优选40个氨基酸，仍然更优选地，最大长度选自以下一种：30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9个氨基酸。例如，肽可以具有150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20或15个氨基酸的最大长度。
按照本发明，蛋白片段或肽可以具有7个氨基酸的最小长度。更优选地，最小长度选自以下一种：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个氨基酸。
按照本发明，肽可以具有在上述最小长度和最大长度之间的任何长度。因此，例如，肽可以具有5至100、7至100、7至80、7至60、7至50、7至40、8至30、10至25、12至20、9至15个氨基酸、8至11个氨基酸、9至11个氨基酸、9至13个氨基酸或9至14个氨基酸的长度。尤其是，肽可以具有选自以下一种的氨基酸长度：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸。
在一些实施方式中，蛋白片段可以是以下一种长度：10至50、10至40、10至30、10至20、15至50、15至40、15至30、15至20、20至50、20至40、20至30、20至25、25至50、25至40、25至30、30至50、30至40、或40至50个氨基酸。
蛋白片段或肽可以具有在上述最小长度和最大长度之间的任何长度。
蛋白片段或肽优选包含癌蛋白的至少一个表位(可选地两个或更多表位)，其被患者的免疫系统所识别，并且优选能够在患者中刺激抗癌蛋白抗体的产生。
在一些实施方式中，片段的氨基酸序列包含或由在相应全长癌蛋白中存在的氨基酸的相邻序列构成。
可以设计蛋白片段或肽以包括致癌突变。也就是说，肽是包括突变的癌蛋白的区的片段。相比于蛋白质的野生型或非致癌形式，突变可以存在于癌蛋白中。因此，肽可以具有针对蛋白质的致癌形式的序列。肽可以在突变的一侧或两侧上具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。肽可以在突变的每侧上具有相同数目的氨基酸，或可以在突变的每侧上具有不同数目的氨基酸。
因为现代技术可以容易地识别其肿瘤相关于、或起因于特定致癌突变的患者，所以我们可以设计对应于这些致癌突变的肽。
在其它实施方式中，相对于在相应全长蛋白中存在的氨基酸的相邻序列，片段具有至少60％氨基酸序列同一性。更优选地，序列同一性的程度是以下的一种：65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
本发明包括来自癌蛋白(其形成蛋白片段)的氨基酸的相邻序列的衍生物和模拟物。
可以合成肽以包括癌蛋白的单表位或单区，并且可以包括致癌突变。可替换地，肽可以包括癌蛋白的多于一个的区或多于一个的表位的组合。例如，在相同肽中可以结合相同或不同癌蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多区或表位。这可以涉及使用短接头肽来连接多于一个的区或表位。接头可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸组成。肽衍生物包括氨基酸的给定序列的变体并且可以包括天然发生的等位变体和合成变体，其相对于如在野生型全长蛋白变应原中确定的肽序列具有显著的氨基酸序列同一性。
肽衍生物可以包括那些肽，其具有至少60％氨基酸序列同一性并且其能够刺激抗癌蛋白抗体的生成。
肽衍生物优选与在癌蛋白中的相应氨基酸序列相差小于5个氨基酸。更优选地，不同氨基酸的数目是4个氨基酸或更少，3个氨基酸或更少，2个氨基酸或更少或仅1个氨基酸。
肽衍生物可以产生自天然变异或多态性，其可以存在于从其衍生肽的蛋白家族的成员之间。所有这样的衍生物包括在本发明的范围内。
肽衍生物可以产生自天然或非天然(例如，合成)干涉，其导致氨基酸序列的添加、置换、缺失或修饰。
在上述多态性中可以发现的保守替换和修饰可以是在在以下组内的氨基酸之间：
(i)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
(ii)谷氨酸和天冬氨酸；
(iii)精氨酸和亮氨酸；
(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺；
(v)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；
(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；
(vii)蛋氨酸和亮氨酸；
(viii)半胱氨酸和缬氨酸。
还可以通过修饰来自癌蛋白的氨基酸序列，例如以抵抗肽的降解，来提供肽衍生物。
肽模拟物
设计已知药物活性化合物的模拟物是开发基于"前导"化合物的药物的已知方式。在活性化合物的合成是困难或昂贵的情况下，或在活性化合物不适用于特定给予方法的情况下，例如，一些肽可以是用于口服组合物的不适当的活性剂，这是因为它们倾向于被消化道中的蛋白酶快速降解，这可能是可取的。模拟物设计、合成和测试通常用来避免为目标性能而随机筛查大量的分子。
在从具有给定目标性能的化合物来设计模拟物中，通常采用若干步骤。首先，确定化合物的特定部分，其在确定目标性能方面是关键的和/或重要的。在肽的情况下，这可以通过系统地改变在肽中的氨基酸残基，例如通过依次替代每个残基，来实现。构成化合物的活性区的这些部分或残基被称作它的"药效团"。
在已发现药效团以后，按照它的物理性能，例如，立体化学、结合、尺寸和/或电荷，并利用来自各种来源的数据，例如光谱技术、X-射线衍射数据和NMR，来建模它的结构。在此建模过程中，可以使用计算分析、相似性映射(其建模药效团的电荷和/或容积，而不是原子之间的键合)和其它技术。
在这种方式的一种变型中，建模配体和它的结合配偶体(伴侣，partner)的三维结构。在配体和/或结合配偶体在结合以后变化构象的情况下，这可以是特别有用的，从而在模拟物的设计中允许模型考虑到这种情况。
然后选择模板分子，在其上可以接枝模拟药效团的化学基团。可以方便地选择模板分子和接枝在它上面的化学基团，以致模拟物易于合成，这可能是药学上可接受的，并且并不体内降解，同时保留前导化合物的生物活性。然后可以筛查通过这种方式发现的一种或多种模拟物，以确定它们是否具有目标性能、或它们具有目标性能的程度。然后可以进行进一步优化或修饰以获得用于体内或临床测试的一种或多种最终模拟物。
对于本发明，肽模拟物是肽衍生物的一种形式。用于确定能够刺激免疫反应的肽衍生物的方法可以包括以下步骤：修饰肽结构以产生肽模拟物。这种肽模拟物可以可选地经受抗体生产测试。根据需要，可以重复肽或肽模拟物的修饰和测试的过程若干次，直到确定对抗癌蛋白抗体增殖具有预期效果、或效应水平的肽。
采用的修饰步骤可以包括截短肽或肽模拟物长度(这可以涉及合成较短长度的肽或肽模拟物)，置换一个或多个氨基酸残基或化学基团，和/或化学修饰肽或肽模拟物，以增加稳定性、抗降解性、转运穿过细胞膜和/或抵抗来自身体的清除。
细胞内癌蛋白表位
抗细胞内癌蛋白抗体可以特异性地结合于在细胞内癌蛋白上的表位。
确定由特定抗体结合的表位的方法在本领域中是已知的。这样的表位定位方法描述于例如Hanson et al.,(2006).Respiratory Research,7:126。此外，本领域技术人员将能够产生抗体和筛查它们的特定性能。
多肽
"多肽"是指任何肽或蛋白，其包含通过肽键或修饰肽键彼此连接的两个或更多氨基酸，即肽电子等排体(peptide isostere)。"多肽"指短链，通常被称为肽、寡肽或低聚体，以及长链，通常被称为蛋白。多肽可以包含不同于20种基因编码氨基酸的氨基酸。
"多肽"包括通过天然过程，如翻译后加工，或通过化学修饰技术(其在本领域中是众所周知的)加以修饰的氨基酸序列。这样的修饰充分描述于基础教科书和更详细描述于专著、以及描述于大量的研究文献。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解的是，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽中的若干位点。此外，给定多肽可以包含许多类型的修饰。
多肽可以是分支的(由于遍在蛋白化(泛素化，ubiquitination)的结果)，并且它们可以是环状的(有或没有分支)。环状、分支和分支环状多肽可以产生自翻译后天然过程或可以通过合成方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、氨基酸到蛋白的转移RNA介导加成如精氨酰化、以及遍在蛋白化。参见，例如，Proteins-Structure andMolecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993和Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives andProspects,pgs.1-12in Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1983；Seifter et al.,"Analysis forprotein modifications and nonprotein cofactors",Meth Enzymol(1990)182:626-646和Rattan et al,"Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging",Ann NY AcadSci(1992)663:48-62。
术语"多肽"包括在本领域中已知的各种合成肽变体，如反向翻转肽D(retroinverso D peptide)。肽可以是抗原决定簇和/或T细胞表位。肽可以是体内免疫原性的。肽可能够体内诱导中和抗体。
当应用于细胞内癌蛋白时，得到的氨基酸序列可以具有一种或多种活性，如和细胞内癌蛋白多肽例如人细胞内癌蛋白一样的生物活性。例如，相比于正常乳腺细胞，在癌细胞中，细胞内癌蛋白同源物可以具有增加的表达水平。尤其是，术语"同源物"包括关于结构和/或功能的同一性，条件是得到的氨基酸序列具有细胞内癌蛋白活性。关于序列同一性(即相似性)，可以存在至少70％，如至少75％，如至少85％，如至少90％序列同一性。可以存在至少95％，如至少98％，的序列同一性。这些术语还包括源自氨基酸的多肽，其是细胞内癌蛋白核酸序列的等位变异(allelic variation)。
在提及多肽如细胞内癌蛋白的"活性"或"生物活性"的情况下，这些术语旨在指细胞内癌蛋白的代谢或生理功能，包括类似的活性或改善的活性或这些具有减少的不希望的副作用的活性。还包括细胞内癌蛋白的抗原和免疫原性活性。上述活性的实例以及测定和量化这些活性的方法在本领域中是已知的，并详细描述于本文件中的其它地方。
预防和治疗方法
我们披露了用于治疗相关于过量的细胞内癌蛋白表达或活性的异常状况如癌症的方法。预防癌症的方法(即，预防法)也适合使用相同或类似的方式。
一般说来，我们的方法涉及癌细胞的操作，其中通过调节(如下调)细胞内癌蛋白在细胞中的表达、量或活性。上述方法可以涉及破坏或根除癌细胞。癌细胞可以包括表达细胞内癌蛋白的癌细胞。癌细胞可以是这样的癌细胞，相比于非癌细胞，其过表达细胞内癌蛋白。我们的方法可以包括使患者暴露于细胞内癌蛋白片段。
癌细胞可以来自细胞内癌蛋白阳性癌症患者。因此，我们的方法可以包括从细胞内癌蛋白阳性癌症患者根除过表达细胞内癌蛋白的癌细胞。
可以在上述操作步骤以前或以后，进行在细胞中检测经调节的细胞内癌蛋白表达、量或活性的步骤。该检测步骤可以检测上调的或下调的细胞内癌蛋白表达、量或活性。可以使用用来调节或下调细胞内癌蛋白的任何方法(如详细描述于本文件中的其它地方，或在本领域中已知的)。
尤其是，上述方法可以包括将细胞暴露于抗细胞内癌蛋白抗体，其能够特异性地结合于细胞内癌蛋白。在个体患有或怀疑患有癌症的情况下，上述方法可以包括将治疗有效量的细胞内癌蛋白片段给予个体。细胞内癌蛋白片段和给予它们的方法详细描述于本文件中的其它地方。
按照我们的方法，由于上述操作的结果，癌细胞变得非癌性的，或侵入性或转移性癌细胞变得非侵入性或非转移性的。上述癌症可以尤其包括这样的癌症如侵入性或转移性癌症，其选自由结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、阴茎癌、宫颈癌、脑癌、食管癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢淋巴瘤和皮肤黑素瘤组成的组。
因为细胞内癌蛋白相关于癌症的攻击性和侵入性，所以可以在患有癌症的个体的细胞中、在癌细胞或非癌细胞中检测细胞内癌蛋白的水平，然后评估癌症的攻击性。相比于正常细胞，细胞内癌蛋白量、表达或活性的高水平表示攻击性或侵入性癌症，因而可以需要和选择更强或更严苛的治疗。类似地，较低水平可以指示较少攻击性或侵入性的治疗。
一般来说，本文描述的方式可以用来治疗任何细胞内癌蛋白相关疾病。细胞内癌蛋白相关疾病包括增生性疾病并且尤其包括癌症。例如，细胞内癌蛋白相关疾病可以包括转移性癌症、侵入性癌症或攻击性癌症。
本发明的方法可用于在还没有发展癌症、或没有表现出癌症的症状或早期症状的个体中治疗或预防癌症的形成。通过评估在家族成员中癌症的患病率，个体可以已被确定为易感或可能患有癌症。例如，在一个或多个家族成员(如同胞、母系或父系亲属)中相关于特定细胞内癌蛋白的癌症的存在则指示此人也可能发展上述癌症。例如，其父母已发展与细胞内癌蛋白相关的癌症的婴儿或年轻成人可以被确定为可能患有、或具有发展相关于上述(细胞内)癌蛋白的癌症的风险。
在发展癌症以前，或在发展相关于癌症的症状以前，可以将一个或多个剂量的基于细胞内癌蛋白片段的疫苗给予其已被确定为可能发展与细胞内癌蛋白相关的癌症的人。可替换地或另外地，可以在人已发展癌症、或已发展相关于癌症的症状以后给予一个或多个剂量。
可以以初步-加强(prime-boost)给予方案来给予基于细胞内癌蛋白片段的疫苗，其中人被给予首次剂量的细胞内癌蛋白片段疫苗，接着一个或更多进一步剂量的细胞内癌蛋白片段疫苗。适宜的初步-加强给予方案将是本领域技术人员众所周知的。例如，可以在时间零点给予首次剂量的基于细胞内癌基因片段的疫苗，并在1周、1个月、3个月、1年、或其它适宜的以后时间给予进一步剂量，其是癌蛋白。在一些情况下，以给予前次剂量以后1周、1个月、3个月、1年或其它时间给予随后剂量。
上述方法可以进一步包括以下步骤：在给予细胞内癌蛋白片段疫苗以后，分析患者是否产生针对细胞内癌蛋白的抗体。
相比于未接受治疗的个体，本文描述的方法和组合物适当地使得能够以可衡量标准来改善接受治疗的个体。
为此目的，可以指定若干标准，其反映癌症的进展或患者的健康。有用的标准可以包括肿瘤大小、肿瘤尺寸、肿瘤的最大尺寸、肿瘤数目、肿瘤标记物(如α-胎儿蛋白)的存在、转移的程度或数目等。
因此，作为实例，经治疗的个体可以显示肿瘤大小或数目的减小，如通过适当的测定或测试所测得的。相比于未治疗的个体，经治疗的个体在特定肿瘤的肿瘤大小、或肿瘤数目、或两者方面，可以例如显示1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的减小。
例如，相对于对照，如果相关于疾病的状况被显著抑制(即，50％或更大)，则细胞内癌蛋白相关疾病可以被定义为被"治疗的"。抑制可以是相对于对照至少75％，如相对于对照90％、95％或100％。上述状况可以包括细胞增殖，或它可以包括细胞周期时间、细胞数目、细胞迁移、细胞侵入性、肿瘤形成、肿瘤转移、肿瘤扩散等。术语"治疗"我们意味着还包括癌症的预防或减轻。
术语增生性疾病在本文中在广义上用来包括需要控制细胞周期的任何疾病。尤其是，增生性疾病包括恶性和肿瘤发生前疾病(pre-neoplastic disorder)。本文描述的方法和组合物尤其可用于腺癌的治疗或诊断，如：小细胞肺癌，以及肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠和乳腺的癌症。例如，可以治疗的恶性疾病包括急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、绒毛膜癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
通过本发明可治疗或可预防的癌症是相关于特定癌蛋白的表达。癌细胞可以表达、或异常表达(例如过表达)特定癌蛋白，或不正确地处理癌蛋白，以致相比于在正常细胞中，它以更高水平存在于癌细胞中。
例如，样品(例如活检)获自患有癌症、或怀疑患有癌症、或具有发展癌症的风险的主体。测试样品以确定所选癌蛋白，优选细胞内癌蛋白，是否被异常表达，或患者是否是相关于癌症发展的高风险的癌蛋白的特定同型(isoform)或突变体的携带者。因此，基于癌蛋白表达分布，主体可以被分级治疗，并且可以利用按照本发明的蛋白片段或肽来开始治疗(其可以是预防性的)。
癌蛋白的过表达包括以高于对于给定类型的细胞或组织通常预期的水平进行的表达。因此，可以通过在细胞之间比较蛋白质的表达水平来确定过表达。例如，可以在相同类型和优选来自相同组织类型(虽然可选地来自不同主体)的癌细胞和非癌性(健康)细胞之间进行比较。在另一个实例中，可以在存在于癌症组织中的细胞类型和存在于非癌性组织中的相应细胞类型(可选地在相同主体中)之间进行比较。
可以定量表达水平，用于绝对比较，或可以进行相对比较。
在一些实施方式中，当相比于在对照样品中在测试样品中的表达水平是至少1.1倍时，则可以认为存在蛋白质的过表达。更优选地，表达水平可以选自以下一种：相比于在对照样品中，至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4、至少2.5、至少2.6、至少2.7、至少2.8、至少2.9、至少3.0、至少3.5、至少4.0、至少5.0、至少6.0、至少7.0、至少8.0、至少9.0、或至少10.0倍。
本文描述的涉及使用细胞内癌蛋白片段的治疗方法可以结合于此类病症的其它治疗方法，包括表达针对细胞内癌蛋白多核苷酸(如本文描述的)的反义构建体，以及将它们给予肿瘤细胞，以抑制基因功能并防止肿瘤细胞生长或进展。
反义构建体可以用来抑制基因功能，从而防止在增殖细胞中的生长或进展。反义构建体，即，核酸，如RNA，互补于正义核酸或mRNA的构建体，详细描述于US 6,100,090(Monia et al.)、和Neckers et al,1992,Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231，上述文献的教导以引用方式结合于本文。
在一个特定实例中，可以通过降低细胞内癌蛋白(全部或部分)的量、表达或活性，例如通过能够结合于并破坏细胞内癌蛋白mRNA的siRNA，来治疗或预防癌症。
RNA干扰(RNAi)是通过直接引入双链RNA(dsRNA)所诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并已成为在各种生物体中敲除特定基因的表达的有用工具。Fire et al,Nature391:806-811(1998)描述了RNAi。PTGS的其它方法是已知的并且包括，例如，转基因或病毒的引入。通常，在PTGS中，沉默基因的转录本被合成但并不累积，这是因为它被迅速降解。PTGS(包括RNAi)的方法，描述于，例如，Ambion.com万维网站，在目录"/hottopics/"下，并在"rnai"文件中。
本文描述了用于体外RNAi的适宜方法。一种这样的方法涉及引入siRNA(小干扰RNA)。目前的模型表明，这些21-23个核苷酸dsRNA可以诱导PTGS。用于设计有效的siRNA的方法描述于，例如，上文描述的Ambion万维网站。RNA前体如短发夹RNA(shRNA)也可以由全部或部分的细胞内癌蛋白核酸序列加以编码。
可替换地，双链(ds)RNA是在一系列的生物体中干涉基因表达的有力方式，其最近已表明在哺乳动物中是成功的(Wianny and Zernicka-Goetz,2000,Nat Cell Biol 2:70-75)。可以将对应于细胞内癌蛋白多核苷酸的序列的双链RNA引入或表达于卵母细胞和候选有机体的细胞，以干扰细胞内癌蛋白活性。
调节细胞内癌蛋白基因表达的其它方法是本领域技术人员已知的并且包括显性负方法(dominant negative approach)。再一次，这些方法可以结合于利用抗细胞内癌蛋白抗体的抗体疗法。因此，另一种方法是使用在此文献中的细胞内癌蛋白多肽的非功能变体，其与内源性基因产物竞争，从而导致功能的抑制。
还可以通过引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子来调节细胞内癌蛋白基因表达。可以连同抗细胞内癌蛋白抗体一起来给予上述肽或小分子，用于治疗癌症如转移性癌症。
因此，通过测定被确定为结合于或调节，如下调，细胞内癌蛋白多肽的量、活性或表达的化合物可以被给予肿瘤或增殖细胞，以防止细胞内癌蛋白多肽的功能。可以连同药用载体一起给予有效量的上述化合物，以下调细胞内癌蛋白的表达或活性，或通过激活或下调第二信号，其控制细胞内癌蛋白表达、活性或量，从而缓解异常状况。
可替换地，通过在主体中的相关细胞如癌细胞，基因疗法可以用来控制细胞内癌蛋白的内源性生产。例如，可以设计编码细胞内癌蛋白siRNA或其部分的多核苷酸，用于在复制缺陷型逆转录病毒载体中的表达(如下文所讨论的)。然后可以分离逆转录病毒表达构建体并引入用包含RNA(其编码抗细胞内癌蛋白siRNA)的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞(packaging cell)，以致包装细胞现可产生包含感兴趣的序列的感染性病毒颗粒。可以将这些生产细胞给予主体，用于体内工程设计细胞和体内调节细胞内癌蛋白多肽的表达。关于基因疗法的综述，参见Chapter 20,Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches,(以及其中引用的参考文献)in HumanMolecular Genetics,T Strachan and A P Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
在一些实施方式中，降低在癌细胞中的细胞内癌蛋白的水平。此外，在这样的实施方式中，治疗可以靶向、或针对这样的癌细胞。可以仅在病变细胞(即，那些癌细胞)中，而基本上不在其它非病变细胞中，特异地降低细胞内癌蛋白的表达。用这些方法，可以在其它细胞，即，非癌细胞中，基本上不降低细胞内癌蛋白的表达。因此，在这样的实施方式中，在非癌细胞中，在治疗过程中或在治疗以后，细胞内癌蛋白的水平保持基本上相同或类似。
患者
待治疗的主体可以是任何动物或人。主体优选是哺乳动物，更优选人。主体可以是非人哺乳动物，但更优选是人。主体可以是雄性或雌性。主体可以是患者。治疗用途可以是用于人或动物(兽医用)。
多肽序列
应当理解的是，本文披露的多肽序列并不限于在本文件中阐述的特定序列，而是包括获自任何来源的同源序列，例如相关的细胞同源物，来自其它物种的同源物以及它们的变体或衍生物，前提是，它们具有抗细胞内癌蛋白抗体的至少一种生物活性(根据具体情况而定)。
因此本发明涵盖在本文件中阐述的氨基酸序列的变体、同源物或衍生物，以及由本文披露的核苷酸序列编码的氨基酸序列的变体、同源物或衍生物。这样的序列通常被称为"细胞内癌蛋白"序列。
生物活性
在一些实施方式中，上述序列包括细胞内癌蛋白片段的至少一种生物活性(根据具体情况而定)。
生物活性可以包括免疫活性。相比于细胞内癌蛋白抗体或它的人源化变体，细胞内癌蛋白片段可以包括相同或类似的免疫活性。"免疫活性"是指，在适当动物或细胞中，在结合于细胞内癌蛋白抗原以后，抗细胞内癌蛋白抗体诱导特异性免疫反应的能力。
上述活性可以包括癌症活性的抑制，如例如通过肿瘤大小或肿瘤数目的减小所测得的，或转移性活性的抑制，如例如通过在实施例中描述的测定所测得的。通过在测试动物中引起癌发生，将细胞内癌蛋白片段给予动物并确定细胞内癌蛋白片段的影响(相比于没有被如此治疗的类似的对照动物)，可以方便地测定上述减小或抑制。实施例详细描述了这样的测定。
细胞内癌蛋白片段可以具有肿瘤抑制或转移抑制活性，其相同于、低于或高于同源(cognate)片段的活性。例如，相比于同源抗体，细胞内癌蛋白片段可以是至少10％，如20％，如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大有效的。借此，我们的意思是说，如果同源片段能够减少肿瘤数目90％(参见实施例)，则相比于未治疗动物，细胞内癌蛋白片段可以能够减少肿瘤数目90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％等。
代替、或除描述的测定之外，还可以使用检测抗体事件的其它测定。
同源物
披露的细胞内癌蛋白片段多肽包括获自任何来源的同源序列，例如相关的病毒/细菌蛋白、细胞同源物和合成肽、以及它们的变体或衍生物。因此，多肽还包括那些多肽，其编码来自其它物种的细胞内癌蛋白片段的同源物，上述其它物种包括动物如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或免)，尤其是人类。
在本文件的上下文中，同源序列或同源物被视为包括氨基酸序列，在氨基酸水平上，相对于至少30，如50、70、90或100个氨基酸，其是至少60、70、80或90％相同于，如至少95或98％相同于相关多肽序列，例如如在本文所列的序列中所示。在本文件的上下文中，同源序列被视为包括氨基酸序列，在氨基酸水平上，如相对于至少15、25、35、50或100，如200、300、400或500个氨基酸，其是至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90％相同于，如至少95或98％相同于相关多肽的序列。虽然还可以依据相似性(即，具有类似的化学性能/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本文件的上下文中，可以依据序列同一性来表示同源性。可以相对于相关序列的整个长度，即，相对于例如相关基因的全长序列的整个长度，来确定序列同一性。
可以通过眼，或更通常地，借助于可容易获得的序列比较程序，来进行同源性比较。这些市售计算机程序可以计算在两个或更多序列之间的％同源性。
可以相对于相邻序列来计算％同源性，即，一个序列对比与另一个序列以及在一个序列中的每个氨基酸直接与在另一序列中的相应氨基酸比较，一次一个残基。这被称为"无间隙"序列对比。通常，仅相对于相对较少数目的残基(例如少于50个相邻氨基酸)进行这样的无间隙序列对比。
虽然这是非常简单和一致的方法，但它未能考虑到，例如，在其它方面相同的序列对，当进行全面序列对比时，一个插入或缺失将引起以后的氨基酸残基被推出序列对比，从而潜在地导致％同源性的较大减小。因此，设计大多数序列比较方法以产生最优序列对比，其考虑到可能的插入和缺失，而没有过度惩罚总体同源性得分。这是通过在序列对比中插入"间隙(gap)"以设法最大化局部同源性来实现。
然而，这些更复杂的方法对发生在序列对比中的每个间隙指定"缺口罚分"，以致，对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的间隙的序列对比(其反映在两个比较序列之间的较高相关性)将比具有许多间隙的序列对比获得更高得分。通常使用"Affine间隙成本(Affine gap costs)"：对于间隙的存在，花费相对较高成本，而对于在间隙中的每个随后的残基则具有较小罚分。这是最常用的间隙评分系统。高间隙(缺口，gap)罚分当然会产生具有较少间隙的优化的序列对比。大多数序列对比程序允许修改间隙罚分。
然而，当使用用于序列比较的上述软件时，可以使用默认值。例如当使用GCGWisconsin Bestfit程序包(见下文)时，对于氨基酸序列的默认间隙罚分是：对于间隙为-12以及对于每个延伸为-4。
因而，最大％同源性的计算首先需要产生最优序列对比，其中考虑到间隙罚分。用于进行这样的序列对比的适宜的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereux et al,1984,Nucleic Acids Research12:387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST程序包(参见Ausubelet al,1999，同上-Chapter 18)、FASTA(Atschul et al,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS成套比较工具。BLAST和FASTA均可通过脱机和联机检索获得(参见Ausubel etal.,1999，同上，第7-58至7-60页)。可以使用GCG Bestfit程序。
虽然可以依据同一性来测量最终％同源性，但序列对比过程本身通常并不基于全有或全无的成对比较。相反，通常使用按比例的相似性得分矩阵，基于化学相似性或进化距离，其对每个成对比较指定得分。通常使用的这样的矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-用于BLAST成套程序的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的详情，参见用户手册)。可以使用用于GCG软件包的公共默认值，或在其它软件的情况下，默认矩阵，如BLOSUM62。
在软件已产生最优序列对比以后，可以计算％同源性，如％序列同一性。软件通常做这项工作作为序列比较的一部分并产生数值结果。
变体和衍生物
如本文描述的相对于氨基酸序列的术语"变体"或"衍生物"包括从或向序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、置换、缺失或添加。得到的氨基酸序列可以基本上保留和未修饰序列相同的活性，如具有和在本文件中例如在序列表中所示的抗细胞内癌蛋白抗体多肽至少相同的活性。因此，可以保留序列的关键特性，即结合于细胞内癌蛋白多肽的能力或肿瘤减少活性(如在别处所描述的)。
可以修饰具有示于实施例中的氨基酸序列的多肽、或其片段或同源物，用于本文描述的方法和组合物。通常进行修饰，其保持序列的生物活性。可以进行氨基酸置换，例如从1、2或3至10、20或30个置换，前提是修饰序列保留未修饰序列的生物活性。氨基酸置换可以包括使用非天然发生的类似物，例如以增加治疗性给予的多肽的血浆半衰期。
细胞内癌蛋白片段的天然变体可能包含保守性氨基酸置换。可以定义保守性置换，例如按照下表。在第二列中并在相同区组中的氨基酸，如那些在第三列中并在同一行的氨基酸可以被彼此取代：
Figure BDA0001598178050000371
Figure BDA0001598178050000381
可以通过重组方式来制备细胞内癌蛋白片段、同源物、变体和衍生物。然而，它们还可以通过合成方式并利用技术人员众所周知的技术如固相合成来制备。蛋白质还可以被产生为融合蛋白，例如以有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便的是，包括在融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白序列之间的蛋白酶剪切位点以允许除去融合蛋白序列。融合蛋白可以是如此以致它将不会阻碍感兴趣序列的蛋白的功能。还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物来获得蛋白质。在目前情况下，融合蛋白可以包含一种或多种癌蛋白的两个或更多片段，可选地进一步包括接头肽。片段可以来自相同癌蛋白或不同癌蛋白。融合蛋白可以包含相同片段的两个或更多拷贝、或相同表位或致癌突变的重叠片段。
本文披露的细胞内癌蛋白多肽、变体、同源物和衍生物可以具有基本上分离形式。应当理解的是，上述多肽可以混合载体或稀释剂，其将不会干扰蛋白质的预期目并且仍然被视为基本上分离的。细胞内癌蛋白片段变体、同源物或衍生物还可以具有基本上纯化形式，在这种情况下，它将通常包含在制备中的蛋白，其中大于90％，例如95％、98％或99％，的在制备中的蛋白是蛋白。
可以用显示标记来标记本文披露的抗细胞内癌蛋白片段多肽、变体、同源物和衍生物。显示标记可以是允许检测多肽等的任何适宜的标记。适宜的标记包括放射性同位素，例如125I，酶，抗体，多核苷酸和接头如生物素。标记的多肽可以用于诊断程序如免疫测定来确定样品中多肽的量。多肽或标记的多肽还可以用于血清学或细胞介导的免疫测定，以用来利用标准协议在动物和人类中检测对所述多肽的免疫反应性。
还可以将本文披露的细胞内癌蛋白片段多肽、变体、同源物、和衍生物(可选地标记的)固定于固相，例如免疫测定孔或浸棒(dipstick)的表面。可以将上述标记的和/或固定的多肽包装到试剂盒中，上述试剂盒是在适宜的容器中并连同适宜的试剂、对照、说明书等。通过免疫测定，上述多肽和试剂盒可以用于相对于多肽或它们的等位基因或物种变体来检测抗体的方法。
免疫测定方法在本领域中是众所周知的并且将通常包括：(a)提供多肽，其包含由相对于所述蛋白的抗体可结合的表位；(b)在便于形成抗体-抗原复合物的条件下，用所述多肽温育生物样品；以及(c)确定是否形成包含所述多肽的抗体-抗原复合物。
本文披露的细胞内癌蛋白片段多肽、变体、同源物、和衍生物可以用于体外或体内细胞培养体系以研究它们的相应基因和其同源物在细胞功能(包括在疾病中的功能)中的作用。例如，可以将截短或修饰多肽引入细胞以破坏发生在细胞中的正常功能。通过从重组表达载体原位表达多肽可以将多肽引入细胞(见下文)。表达载体可选地携带诱导型启动子以控制多肽的表达。
预期，如有需要，适当宿主细胞，如昆虫细胞或哺乳动物细胞，的使用会提供这样的翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，以将最佳的生物活性赋予重组表达产物。这样的细胞培养体系，其中表达本文披露的细胞内癌蛋白多肽、变体、同源物、和衍生物，可以用于测定系统，以确定候选物质，其干扰或增强多肽在细胞中的功能。
多核苷酸序列
可变区、单克隆抗体序列和人源化抗体序列可以包含多核苷酸。它们可以包含DNA或RNA。
它们可以是单链或双链。它们还可以是多核苷酸，其在它们内包括合成或修饰核苷酸。对于寡核苷酸的若干不同类型的修饰在本领域中是已知的。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3'和/或5'端处添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本文件的目的，应当理解的是，可以通过在本领域中可用的任何方法来修饰本文描述的多核苷酸。可以进行上述修饰以增强多核苷酸的体内活性或寿命。
在多核苷酸是双链的情况下，本文描述的方法和组合物涵盖双螺旋的两条链(单独或组合)。在多核苷酸是单链的情况下，应当理解的是，还包括多核苷酸的互补序列。
变体、衍生物和同源物
相对于在此文件中描述的核苷酸序列，术语"变体"、"同源物"或"衍生物"包括从或向序列的一个(或多个)核苷酸的任何置换、变异、修饰、置换、缺失或添加。产生的序列可以能够编码多肽，其具有细胞内癌蛋白结合活性(如在本文件中其它地方所描述的)。
如上所述，关于序列同一性，相对于相关序列，"同源物"具有如至少5％同一性、至少10％同一性、至少15％同一性、至少20％同一性、至少25％同一性、至少30％同一性、至少35％同一性、至少40％同一性、至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性。
可以存在至少95％同一性，如至少96％同一性，如至少97％同一性，如至少98％同一性，如至少99％同一性。可以如上所述进行核苷酸同源性比较。序列比较程序如上文描述的GCG Wisconsin Bestfit程序可以用于此目的。默认评分矩阵对于每个相同的核苷酸具有为10的匹配值以及对于每个错配具有为-9的匹配值。对于每个核苷酸，默认间隙生成罚分是-50以及默认间隙延伸罚分是-3。
杂交
我们进一步描述了这样的核苷酸序列，其能够选择性地杂交于本文提供的任何序列，如269、223和318可变区、抗体和人源化抗体或它们的任何变体、片段或衍生物，或杂交于任何上述的补体。核苷酸序列的长度可以是至少1个核苷酸，如至少20、30、40或50个核苷酸。
如在本文中所使用的，术语"杂交"将包括"这样的过程，借助于此过程并通过碱基配对，将核酸的链连接于互补链"以及扩增过程，如在聚合酶链反应技术中进行的。
能够选择性地杂交于本文提供的核苷酸序列或选择性地杂交于它们的补体的多核苷酸，相对于至少20个相邻核苷酸的区，如至少25或30，例如至少40、60或100或更多个相邻核苷酸，将通常是至少70％，如至少80或90％和如至少95％或98％同源于本文提供的相应核苷酸序列。
术语"选择性地可杂交的"是指，在其中发现靶多核苷酸在显著高于背景的水平下可杂交于探针的条件下，使用多核苷酸作为探针。由于例如在被筛查的cDNA或基因组DNA文库中存在其它多核苷酸，所以可以发生背景杂交。在这种情况下，背景意味着由在探针和文库的非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号的水平，相比于针对靶DNA所观测到的特异性相互作用，其强度小于10倍，如小于100倍。可以，例如，通过放射性标记探针，例如借助于32P，来测量相互作用的强度。
杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如在Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,San Diego CA)中所教导的，并赋予明确的"严格性"(如下文所解释的)。
最高严格性通常发生在约Tm-5℃(5℃低于探针的Tm)；高严格性通常发生在低于Tm约5℃至10℃；中等严格性通常发生在低于Tm约10℃至20℃；以及低严格性通常发生在低于Tm约20℃至25℃。如本领域技术人员将明了的，最高严格性杂交可以用来鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而中等(或代)严格性杂交可以用来确定或检测类似或相关的多核苷酸序列。
我们披露了这样的核苷酸序列，在严格条件下(例如65℃和0.lxSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M Na3柠檬酸盐pH 7.0})，其可以杂交于核酸、或其片段、同源物、变体或衍生物。
在多核苷酸是双链的情况下，本发明涵盖双螺旋的两条链(单独或组合)。在多核苷酸是单链的情况下，应当理解的是，还披露和涵盖上述多核苷酸的互补序列。
可以以若干方式来获得并不100％同源于本文披露的序列并属于本发明的多核苷酸。可以获得本文描述的序列的其它变体，例如通过探查制备自一系列个体的DNA文库，例如来自不同群体的个体。另外，可以获得其它病毒/细菌、或细胞同源物，尤其是在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类动物细胞)中发现的细胞同源物，并且这样的同源物和其片段一般将能够选择性地杂交于在本文序列表中所示的序列。可以通过探查制备自其它动物物种的cDNA文库或基因组DNA文库，并借助于探针在中等至高严格性条件下探查上述文库，其包含所有或部分的所披露的序列，来获得这样的序列。
本文描述的多核苷酸可以用来产生引物，例如PCR引物，用于交替扩增反应(alternative amplification reaction)的引物，探针，例如通过常规方式并利用放射性或非放射性标记，标记有显示标记，或可以将多核苷酸克隆到载体。上述引物、探针和其它片段的长度将是至少15，如至少20，例如至少25、30或40个核苷酸，并且还由如在本文中所使用的术语多核苷酸所包括。片段的长度可以是小于500、200、100、50或20个核苷酸。
可以通过重组方式、合成方式，或通过本领域技术人员可用的任何方式来产生多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。还可以通过标准技术来克隆它们。
一般来说，将通过合成方式来产生引物，其涉及逐步制造所期望的核酸序列：一次1个核苷酸。用于利用自动化技术来完成这项工作的技术在本领域中是容易获得的。
将通常利用重组方式来产生较长的多核苷酸，例如利用PGR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及制备一对引物(例如，具有约15至30个核苷酸)，其侧接期望克隆的序列的区，使引物接触获自动物或人细胞的mRNA或cDNA，在产生所期望的区的扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，及回收扩增DNA。可以设计引物以包含适宜的限制酶识别位点，以致可以将扩增DNA克隆到适宜的克隆载体。
细胞内癌蛋白多肽和核酸
如在前面段落中陈述的，可以类似地定义细胞内癌蛋白多肽同源物、变体、衍生物和片段。
在上下文许可的情况下，提及细胞内癌蛋白多肽应被理解为包括提及细胞内癌蛋白多肽同源物、变体、衍生物或片段。类似地，提及细胞内癌蛋白多肽应被理解为包括提及细胞内癌蛋白多肽同源物、变体、衍生物或片段。
类似地，在上下文许可的情况下，提及细胞内癌蛋白核酸应被理解为包括提及细胞内癌蛋白核酸同源物、变体、衍生物或片段。类似地，提及细胞内癌蛋白多肽应被理解为包括提及细胞内癌蛋白核酸同源物、变体、衍生物或片段。
抗细胞内癌蛋白片段生产
可以通过重组DNA方法或合成肽化学方法，其是本领域技术人员众所周知的，来生产细胞内癌蛋白片段。
通过举例的方式，可以通过在本领域中众所周知的技术来合成细胞内癌蛋白片段，如由"Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach"E.Atherton andR.C.Sheppard,IRL Press,Oxford England所举例说明的。类似地，可以合成多个片段，其随后被连接在一起以形成较大片段。还可以借助于在特定位置处的氨基酸置换来制备这些合成肽片段以测试体外和体内活性。
可以在标准微量化学设备中合成细胞内癌蛋白并借助于HPLC和质谱分光光度法来检查纯度。肽合成的方法、HPLC纯化和质谱分光光度法(mass spectrophotometry)是本领域技术人员众所周知的。
还可以在体外和体内条件下，在转化宿主细胞中，其中已合并本文描述的DNA序列(如可变序列)或其等位变异，来表达细胞内癌蛋白片段，其可以用于预防和/或治疗癌症相关疾病。
术语"载体"包括表达载体和转化载体。术语"表达载体"是指能够体内或体外表达的构建体。术语"转化载体"是指能够被从一个物种转移到另一个物种的构建体。
可以用于表达的载体包括重组病毒载体，尤其是重组逆转录病毒载体(RRV)如慢病毒载体、腺病毒载体，包括逆转录病毒载体的组合。
术语'重组逆转录病毒载体"(RRV)是指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒的遗传信息以允许在有包装成分存在的条件下将RNA基因组包装进入能够感染靶细胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括逆转录和整合进入靶细胞基因组。RRV携带非病毒编码序列，借助于载体，其被递送到靶细胞。RRV不能够独立复制来在最终靶细胞内产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RRV缺乏复制所必需的功能性gag pol和/或env基因和/或其它基因。可以使用的载体包括重组痘病毒载体如鸡痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒(entomopox virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)如NYVAC、金丝雀痘病毒、MVA或其它非复制型病毒载体系统，如例如在WO9530018中描述的那些系统。
痘病毒可被设计用于重组基因表达以及在双重免疫治疗方法中用作重组活疫苗。使用活减毒病毒，如病毒，作为递送载体和/或基于载体的疫苗候选物的主要理由源自它们诱发细胞介导的免疫反应的能力。病毒载体，如上文概述的，能够被用作递送载体和作为基于载体的疫苗候选物，这是由于它们的结构蛋白的免疫原性，上述结构蛋白作为佐剂来增强免疫反应，从而使得感兴趣的核苷酸序列(NOI)如编码细胞内癌蛋白的核苷酸序列更具免疫原性。
痘病毒接种疫苗策略已使用重组技术来将NOI引入痘病毒的基因组。如果在病毒DNA(其对于病毒的生命周期是非必需的)的位点处整合NOI，则新产生的重组痘病毒可能是传染性的，也就是说感染外源细胞并因而表达整合的NOI。以这种方式制备的重组痘病毒可以用作活疫苗来预防和/或治疗病理性和感染性疾病和/或癌症。
对于痘病毒载体递送系统的其它要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是具有良好的安全记录的复制受损的牛痘株。在大多数细胞类型和正常人组织中，MVA并不复制。在若干转化细胞类型如BHK21细胞中观测到MVA的有限复制。Carroll et al(1997Vaccinel5:387-394)已经表明，在产生保护性CD8+T细胞反应方面，重组MVA和常规重组痘苗载体一样好，并且是更通常使用的有复制能力的痘苗病毒的有效替代。源自MVA的痘苗病毒株，或具有MVA的特点(其使得MVA特别适用于疫苗)的自主开发的株，也适合用作递送载体。
感兴趣的以及其表达是所期望的核苷酸序列可以可操作地连接于转录单元。如本文所描述的，术语"转录单元"是包含编码序列以及信号(其用于实现那些独立于任何其它编码序列的编码序列的表达)的核酸的区。因此，每个转录单元通常包含至少启动子、可选的增强子和多腺苷酸化信号。在本技术领域的通常意义上使用术语"启动子"，例如，RA聚合酶结合位点。启动子可以包含增强子元件。术语"增强子"包括DNA序列，其结合于转录起始复合物的其它蛋白成分，因而促进由它的相关启动子指导的转录起始。术语"细胞"包括任何合适的生物体。上述细胞可以包括哺乳动物细胞，如人细胞。
术语"转化细胞"是指具有修饰基因结构的细胞。例如，如本文描述的，当载体如表达载体已被引入细胞时，则细胞具有修饰基因结构。术语"生物体"包括任何合适的生物体。生物体可以包括哺乳动物如人。
在本文中，术语"转基因生物体"是指包含修饰基因结构的生物体。例如，如果载体如表达载体已被引入生物体，则生物体可以具有修饰基因结构。
细胞内癌蛋白片段表达
我们进一步描述了一种方法，其包括用在本文件中描述的核苷酸序列来转化宿主细胞。
我们还提供了一种方法，该方法包括培养转化宿主细胞，其已在适合于表达由所述核苷酸序列编码的细胞内癌蛋白片段的条件下由上述核苷酸序列加以转化。
我们进一步提供了一种方法，该方法包括培养转化宿主细胞，其已在适合于表达由所述核苷酸序列编码的细胞内癌蛋白片段的条件下由上述核苷酸序列加以转化，然后自转化宿主细胞培养物回收所述细胞内癌蛋白片段。
因此，编码细胞内癌蛋白片段、其融合蛋白或功能等效物的核苷酸序列可以用来产生重组DNA分子，其引导其在适当宿主细胞中的表达。
通过举例的方式，可以在重组大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物表达系统中产生细胞内癌蛋白片段，然后借助于柱层析加以纯化。
可以将编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列可操作地连接于启动子序列，其能够引导编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列在适宜的宿主细胞中表达。当插入宿主细胞时，可以在合适的条件下培养转化宿主细胞直到达到细胞内癌蛋白片段的足够水平，其后，可以裂解细胞并分离细胞内癌蛋白片段。
可以在适合于从细胞培养物表达和回收细胞内癌蛋白片段的条件下培养用编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列转化的宿主细胞。可以分泌或可以细胞内包含由重组细胞产生的蛋白，其取决于所使用的序列和/或载体。如本领域技术人员将明了的，可以将包含编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列的表达载体设计有信号序列(其引导通过特定的原核或真核细胞膜分泌编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列)。其它重组结构可以将编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列连接于编码多肽域的核苷酸序列，其将促进可溶性蛋白的纯化(Kroll DJ et al(1993)DNA Cell Biol 12:441-5 3'，还参见下文关于包含融合蛋白的载体的讨论)。
还可以将细胞内癌蛋白片段表达为重组蛋白，其添加有一个或多个另外的多肽域，以促进蛋白纯化。这样的纯化促进域包括但不限于金属螯合肽如组氨酸-色氨酸组件，其允许在固定金属上的纯化(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3-26328 1)，蛋白域A，其允许在固定化免疫球蛋白上的纯化，以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle,WA)中采用的域。在纯化域和细胞内癌蛋白片段之间包括可切割的接头序列如Factor XA或肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)可用来促进纯化。
可以设计本文描述的核苷酸序列以出于各种原因来改变细胞内癌蛋白片段编码序列，包括但不限于这样的改变，其改进基因产物的克隆、加工和/或表达。
例如，可以利用在本领域中众所周知的技术来引入突变，例如，定位诱变以插入新限制位点、改变糖基化模式或改变密码子偏好。
在另一种实施方式中，可以将编码天然、修饰重组细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列连接于异源序列以编码融合蛋白。通过举例的方式，可以产生融合蛋白，上述融合蛋白包含细胞内癌蛋白片段或酶促活性片段或其衍生物，其连接于亲和标记物如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、生物素、His6、ac-myc标记(参见Emrich etal 1993BiocemBiophys Res Commun197(1):21220)、血凝素(HA)(如描述于Wilson et al(1984Cell 37 767)或FLAG表位(Fordetal 1991Protein Expr Purif Apr；2(2):95-107)。
融合重组蛋白可以包含抗原癌蛋白(coprotein)如GST、β-半乳糖苷酶、或来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的脂蛋白D(其是相对较大的癌蛋白)，其增溶和促进其生产和纯化。可替换地，融合蛋白可以包含载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)。在某些实施方式中，标记序列可以包含六组氨酸肽，如提供于pQE载体(Qiagen Inc)并描述于Gentz et al(1989PNAS 86:821-824)。这样的融合蛋白可以容易表达在酵母培养物中(如描述于Mitchell et al 1993Yeast 5:715-723)并通过亲和层析容易加以纯化。还可以设计融合蛋白以包含位于在编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列和异源蛋白序列之间的切割位点，以致可以自异源部分切割和纯化细胞内癌蛋白片段。在另一种实施方式中，可以利用整个、结合的融合蛋白来进行针对靶蛋白的测定。可替换地，在提供免疫系统的广义刺激的意义上，共蛋白可以作为佐剂。可以将癌蛋白连接于第一蛋白的氨基或羧基末端。
虽然标记基因表达的存在/缺乏提示，用于细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列也是存在的，但应确认它的存在和表达。例如，如果将编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列插入标记基因序列内，则可以通过标记基因功能的缺乏来确定包含细胞内癌蛋白片段编码区的重组细胞。可替换地，在单启动的控制下，可以同编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列串联设置标记基因。
响应于诱导或选择的标记基因的表达通常也表明细胞内癌蛋白片段的表达。
用来定量特定分子的表达的另外的方法包括放射性标记(Melby PC etal 1993JImmunol Methods 159:235-44)或生物素化(Duplaa C et al 1993Anal Biochem229-36)核苷酸、控制核酸的共扩增、以及标准曲线，在其上内插(interpolate)实验结果。
可以通过以ELISA形式运行测定来加快多个样品的定量，其中以不同稀释度来呈递感兴趣的细胞内癌蛋白片段以及分光光度响应或量热响应可提供快速的定量。
可以制备或使用的改变的细胞内癌蛋白片段核苷酸序列包括不同核苷酸残基的缺失、插入或置换，从而导致这样的核苷酸序列，其编码相同或功能等效的细胞内癌蛋白片段。通过举例的方式，表达的细胞内癌蛋白片段还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默变化并导致功能等效的细胞内癌蛋白片段。可以基于残基的极性的相似性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲特性来进行有意的氨基酸置换，只要保留抗细胞内癌蛋白片段的结合亲和力。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有不带电荷的极性首基(head group)并具有类似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。
还可以采用基因疗法，借此，体内调节如本文描述的编码抗细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列。例如，可以完成表达调节，其中通过给予这样的化合物，其结合于编码抗细胞内癌蛋白抗体的核苷酸序列，或控制区，其与编码细胞内癌蛋白片段的核苷酸序列或它的相应的RNA转录本相关，以改进转录或翻译的速率。
通过举例的方式，本文描述的细胞内癌蛋白片段编码核苷酸序列可以是在表达调节元件的表达控制下，通常为启动子或启动子和增强子。在缺氧或缺血或低葡萄糖环境下，增强子和/或启动子可以是优先活性的，以致细胞内癌蛋白片段编码核苷酸序列被优先表达在感兴趣的特定组织中，如在肿瘤细胞或肿瘤块(mass)的环境中。因此，可以减小或消除细胞内癌蛋白片段编码核苷酸序列对待治疗个体的任何显著的生物效应或有害效应。赋予调节表达的增强子元件或其它元件可以存在多个拷贝。
启动子和/或增强子在它们的活性方面可以是组成上有效的，或可以是组织或时间上受限的。适宜的组织受限启动子/增强子的实例是那些启动子/增强子，其在肿瘤细胞中是高度活性的，如来自MUC1基因、CEA基因或STV抗原基因的启动子/增强子。时间上受限的启动子/增强子的实例是那些启动子/增强子，其响应缺血和/或缺氧，如缺氧反应元件或agrp78或agrp94基因的启动子/增强子。α胎儿蛋白(AFP)启动子也是肿瘤特异性启动子。另一种启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要即刻早期(major immediate early，MIE)启动子/增强子组合。
启动子可以是组织特异的。也就是说，它们可以能够在一种组织中驱动细胞内癌蛋白片段编码核苷酸序列的转录，同时在其它组织类型中则在很大程度上保持"沉默"。
术语"组织特异的"是指这样的启动子，其活性并不限于单一组织类型，而是显示选择性，因为它们在一组组织中可以是活性的，而在另一组中则是较少活性的或沉默的。上述启动子的所期望的特性在于，在没有激活的缺氧调节增强子元件的情况下，甚至在靶组织中，它们具有相对较低活性。实现此目标的一种方式是使用"沉默子"元件，在没有缺氧的情况下，其抑制所选启动子的活性。
术语"缺氧"是指一种条件，在该条件下，特定器官或组织接受供应不足的氧。
在特定启动子的控制下，通过操作启动子区，可以调节细胞内癌蛋白片段编码核苷酸序列的表达水平。例如，在启动子区内的不同域可以具有不同的基因调节活性。通常利用载体构建体，其具有启动子的不同变体(其中特定区被删除)，来评估这些不同区的作用(即，缺失分析)。这种方式可以用来确定，例如，能够赋予组织特异性的最小区或赋予缺氧敏感性的最小区。
可以使用上文描述的若干组织特异性启动子。在大多数情况下，这些启动子可以被分离为方便的限制酶切消化片段，其适用于在所选载体中的克隆。可替换地，可以利用聚合酶链反应来分离启动子片段。可以通过在引物的5'端加入限制位点来促进扩增片段的克隆。
联合疗法
可以连同用于治疗疾病的其它组合物和程序一起来使用本文描述的方法和组合物(包括细胞内癌蛋白片段疫苗)。
通过举例的方式，还可以连同疾病如癌症的常规治疗一起来使用细胞内癌蛋白片段疫苗。例如，可以常规地借助于手术、放疗或化疗来治疗肿瘤，并可以随后将细胞内癌蛋白片段疫苗给予患者，以延长微转移灶的休眠期以及稳定任何残留的原发性肿瘤。
可以在同一时间并在同一部位，连同治疗有效剂一起来递送细胞内癌蛋白片段疫苗。可替换地，可以在不同时间以及对不同部位递送细胞内癌蛋白片段疫苗和治疗有效剂。甚至可以用相同递送载体来递送细胞内癌蛋白片段疫苗和治疗有效剂，用于预防和/或治疗癌症。
可以连同细胞毒性剂一起来使用细胞内癌蛋白片段疫苗，用于预防和/或治疗血管发生和/或癌症。连接于细胞内癌蛋白片段的细胞毒性剂如篦麻蛋白提供了一种工具来破坏表达细胞内癌蛋白的细胞或细胞内癌蛋白。这些细胞可以存在于许多位置，包括但不限于微转移灶和原发性肿瘤。
在基因疗法中可以连同前药活化酶一起来使用细胞内癌蛋白片段疫苗。代替地或除被选择性地表达在靶组织中之外，可以连同另一种分子一起来使用细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗，如前药活化酶，或这样的酶，其没有显著效应或没有有害效应，直到用一种或多种前药来治疗个体，其后一种或多种酶发挥作用。在有前药活化酶存在的条件下，用适当的前药对个体进行的积极治疗导致肿瘤生长或存活的增强的减少。
可以将前药活化酶递送到肿瘤部位，用于治疗癌症。在每种情况下，连同适当的前药活化酶一起，适宜的前药用于治疗患者。连同载体一起来给予适当的前药。前药的实例包括：磷酸依托泊苷(连同碱性磷酸酶，Senter et al 1988Proc Natl Acad Sci 85:48424846)；5-氟胞嘧啶(连同胞嘧啶脱氨酶，Mullen et al 1994Cancer Res 54:1503-1506)；多柔比星-N-对羟基苯氧基乙酰胺(连同青霉素-V-酰胺酶，Kerr et al 1990CancerImmunol Immunother 31:202-206)；对-N-二(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸酯(连同羧肽酶G2)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(连同β-内酰胺酶)；SR4233(连同P450还原酶)；更昔洛韦(连同HSV胸苷激酶，Borrelli et al 1988Proc Natl Acad Sci 85:7572-7576)；芥子前药，连同硝基还原酶(Friedlos el al 1997 J Med Chem 40:1270-1275)以及环磷酰胺(连同P450，Chen et a/1996 Cancer Res 56:1331-1340)。
前药活化酶的实例包括胸苷磷酸化酶，其激活5-氟-尿嘧啶前药卡培他滨(capcetabine)和氟铁龙；来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶，其激活更昔洛韦；细胞色素P450，其将前药如环磷酰胺激活成DNA损伤剂；以及胞嘧啶脱氨酶，其激活5-氟胞嘧啶。可以使用人源酶。
其它适宜的分子包括那些具有治疗和/或诊断应用的分子如但不限于：编码细胞因子的序列、趋化因子、激素、抗体、工程免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的反式显性负突变体(transdominantnegative mutant)、毒素、条件毒素(condition toxin)、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶、以及它们的衍生物(如具有相关的报道基团)。当被包括时，通常可以将上述编码序列可操作地连接于适宜启动子，其可以是驱动核酶表达的启动子，或不同的一种或多种启动子，如在一种或多种特定细胞类型中。
上述分子可以是分泌自细胞的蛋白质。可替换地，上述分子不是分泌的而是在细胞内活性的。在任何一种情况下，分子可以显示旁观者效应或远处旁观者效应；也就是说，在一个细胞中表达产物的生产导致杀伤邻近或远处的另外的相关细胞(例如转移性的)，其具有常见表型。
用于治疗或预防癌症的适宜分子包括蛋白(或编码蛋白的核酸)，其破坏靶细胞(例如核糖体毒素)，作为：肿瘤抑制剂(如野生型p53)；抗肿瘤免疫机制的活化剂(如细胞因子、共刺激分子和免疫球蛋白)；血管发生的抑制剂；或其提供增强的药物敏感性(如前药活化酶)；通过天然效应细胞来间接刺激靶细胞的破坏(例如，强抗原以刺激免疫系统或将前体物质转化成毒性物质，其破坏靶细胞(例如前药活化酶)。编码的蛋白也可以破坏旁观者肿瘤细胞(例如借助于分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒素融合蛋白)，间接刺激旁观者肿瘤细胞的破坏(例如细胞因子以刺激免疫系统，或促凝蛋白以引起局部血管闭塞)或将前体物质转化成毒性物质，其破坏旁观者肿瘤细胞(例如酶，其将前药激活成可扩散药物)。
可以递送反义转录本或核酶，其干扰用于肿瘤持久性的细胞基因的表达(例如相对于在伯基特淋巴瘤中的异常myc转录本或相对于在慢性髓性白血病中的bcr-abl转录本)，以增强抗细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗的癌细胞杀伤功能或转移预防功能。还设想使用上述分子的组合。
缺氧可调节治疗性分子的实例可以参见PCT/GB95/00322(WO-A-9521927)。
药物组合物
细胞内癌蛋白片段疫苗可以有效地治疗癌症相关疾病。
我们披露了借助于接种疫苗，其中细胞内癌蛋白片段作为疫苗，来预防癌症相关疾病的方法。
利用本领域技术人员已知的配制方法，在药用组合物中，用作疫苗的细胞内癌蛋白片段可以被提供为分离和基本上纯化的蛋白质和蛋白片段。
可以以药物组合物的形式来给予细胞内癌蛋白片段疫苗。上述药物组合物可以包括治疗有效量的抗细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗，以及适宜的赋形剂、稀释剂或载体。
尤其可以将细胞内癌蛋白片段疫苗引入患者的循环，例如经由例如静脉，注射到患者。
适用于胃肠道外给予的剂型包括水性和非水性无菌注射液，该注射液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使得剂型等渗于预期接受者的血液；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包括悬浮剂和增稠剂。可以以单位剂量或多剂量容器来提供剂型，例如，密封安瓿和小瓶，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如，注射用水。临时的注射液和混悬剂可以制备自先前描述各类的无菌散剂(无菌粉末)、颗粒剂和片剂。
可以通过标准途径来给予这些组合物。这些途径包括但不限于：口服途径、直肠途径、眼途径(包括玻璃体内途径或前房内途径)、鼻途径、局部途径(包括颊途径和舌下途径)、子宫内途径、阴道途径或胃肠道外途径(包括皮下途径、腹膜内途径、肌内途径、静脉内途径、皮内途径、颅内途径、气管内、和硬膜外途径)、经皮途径、腹膜内途径、颅内途径、脑室内途径、脑内途径、阴道内途径、子宫内途径、或胃肠道外途径(例如，静脉内途径、脊柱内途径、皮下途径或肌内途径)。
可以以单位剂型方便地提供细胞内癌蛋白片段疫苗剂型并可以通过常规制药技术来制备。这样的技术包括以下步骤：结合活性组分和药物载体或赋形剂。一般来说，通过均匀和紧密结合活性组分和液体载体或细分的固体载体或两者，然后，如果必要的话，使产物成形，来制备剂型。
另外，可以将细胞内癌蛋白片段疫苗加入生物可降解聚合物，以允许化合物的持续释放，其中聚合物被植入在期望递送药物处的附近，例如，在肿瘤部位，或被植入，以致抗细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗被缓慢地全身释放。生物可降解聚合物和它们的应用，例如，详细描述于Brem et af(1.Neurosurg 1991 74:441-446)。渗透性微型泵(osmotic minipump)也可以用来通过插管将高浓度的抗细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗受控递送到感兴趣的部位，如直接进入转移性生长或进入到肿瘤的血管供应。
可以将细胞内癌蛋白片段疫苗连接于细胞毒性剂，其以设计的方式被输注，以最大限度地递送到所期望的位置。例如，通过插管，将篦麻蛋白-连接的高亲和力抗细胞内癌蛋白抗体和/或细胞内癌蛋白疫苗递送进入血管，从而供给靶部位，或直接进入靶。还通过耦接于输注插管的渗透泵并以受控方式来递送上述试剂。
优选的单位剂型是那些单位剂型，其包含给予成分的日剂量或单位剂量、每日亚剂量(如上文所述)或其适当部分。应当理解的是，除上文特别提到的成分之外，本文描述的剂型(制剂，formulation)还可以包括在本领域中常规的其它试剂，其中考虑到谈及的剂型的类型。
可以以任何适宜的方式，通常为胃肠道外方式，例如静脉内方式或腹膜内方式，并以稀释剂和载体的标准无菌、非致热配方，例如等渗盐水(当静脉内给予时)，来给予细胞内癌蛋白片段疫苗结合物。在细胞内癌蛋白片段疫苗结合物已结合于靶细胞并已被清除出血流(如果必要的话)(其通常需要1天左右)以后，给予前药，通常作为单输注剂量，或成像肿瘤。如果需要的话，由于细胞内癌蛋白片段疫苗结合物可以是免疫原性的，可以给予环孢菌素或其它免疫抑制剂以提供较长时间的治疗，但通常这将是没有必要的。
本文描述的细胞内癌蛋白片段疫苗的剂量将取决于待治疗的疾病状态或状况以及其它临床因素如人或动物的体重和病症以及给予化合物的途径。
取决于细胞内癌蛋白片段疫苗在特定动物或人中的半衰期，可以给予细胞内癌蛋白片段疫苗每天几次至一周一次。应当理解的是，本文描述的方法和组合物可以是人用和兽用。本文描述的方法设想单次以及多次给予(同时或通过延长的时间)。
可以以常规方式来优化在给予细胞内癌蛋白片段疫苗结合物和前药之间的时间，这是因为在约4-6天以后，肿瘤/正常组织的结合物比例(至少在静脉内递送以后)是最高的，而在此时，依据注射剂量/克的百分比，相比于在较早的时候，结合于肿瘤的结合物的绝对量是较低的。
因此，在给予细胞内癌蛋白片段疫苗结合物和前药之间的最佳间隔将是在酶的峰值肿瘤浓度和在肿瘤和正常组织之间的最佳分配比率之间的折中(compromise)。细胞内癌蛋白片段疫苗结合物的剂量将由医生并按照通常的标准来选择。至少在有方法采用靶向酶如β-葡糖苷酶和静脉内苦杏仁苷作为毒性前药的情况下，1至50日剂量的0.1至10.0克/平方米体表面积，优选1.0-5.0g/m2可能是合适的。对于口服治疗，每天3个剂量的0.05至10.0g，优选1.0-5.0g，时间为1至50天，可以是适当的。将按照正常标准，尤其是参考肿瘤的类型、阶段和位置以及患者的体重，来类似地选择细胞内癌蛋白片段疫苗结合物的剂量。治疗的持续时间将部分地取决于对细胞内癌蛋白疫苗结合物的任何免疫反应的速度和程度。
本发明进一步提供了治疗方法，其中诱导患者产生相对于细胞内癌蛋白的抗体。上述方法涉及将细胞内癌蛋白的片段给予需要这种治疗的患者。肽可以是包含致癌突变的癌蛋白的片段。上述方法可以包括以下步骤：在给予肽以前，其中上述肽包含癌蛋白的片段，或包含确定为存在于患者中的致癌突变，在获自患者的样品中确定一种或多种癌蛋白或致癌突变的存在。样品可以是肿瘤样品如活检，或可以是另一种样品如组织、尿液、血液、粘液、或其它样品。可以通过蛋白质印迹、或通过ELISA或基于PCT的方法，来确定特定癌蛋白或致癌突变的存在。适宜的方法在本领域中是已知的。
疾病
本文描述的细胞内癌蛋白片段疫苗，例如以药物组合物的形式，可以用于预防和/或治疗癌症。
对于本文件的目的，术语"癌症"可以包括以下任何一种或多种：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(急性髓细胞白血病，AML)、肾上腺皮质癌、直肠癌(analcancer)、膀胱癌、血癌、骨癌、脑肿瘤、乳癌、女性生殖系统癌症、男性生殖系统癌症、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤(childhood rhabdomyosarcoma)、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(慢性髓细胞白血病，CML)、结肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、多毛细胞白血病(hairycell leukemia)、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、下咽癌(hypopharyngeal cancer)、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibroushistiocytoma)、恶性胸腺瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻旁窦癌(nasal cavity and paranasal sinus cancer)、鼻咽癌、神经系统癌、成神经细胞瘤(神经母细胞瘤，neuroblastoma)、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤(plasma cell neoplasm)、原发性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌症(urinary system cancer)、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)和维尔姆斯瘤(Wilm’s tumor)。
本文描述的细胞内癌蛋白疫苗，例如以药物组合物的形式，还可以用于治疗癌症相关疾病。
此类病症包括但不限于：实体瘤；血源性肿瘤(blood born tumor)如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、和化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管源性疾病，例如，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、发红；奥-韦综合征；心肌血管发生；斑块新血管形成；毛细血管扩张；血友病性关节(hemophiliac joint)；血管纤维瘤；伤口肉芽形成；冠状动脉侧支(coronary collateral)；脑侧支动静脉畸形；缺血性肢体血管发生；新生血管性青光眼；晶体后纤维增生症；糖尿病性新血管形成；螺杆菌相关疾病(helicobacterrelated disease)、骨折、血管发生、血细胞生成、排卵、月经和胎盘形成。
实施例
我们的研究结果显示，在肿瘤特异性抗原激发以后，可以刺激宿主免疫性以产生相对于特异性抗原的内源性抗体，从而导致肿瘤抑制。'癌症接种疫苗'的这种设想长期以来一直是有前途的但具有挑战性的前景21。重要的是，我们发现，相比于外源递送抗体，抗原诱导抗体疗法可以实现类似的抗肿瘤治疗功效。除更为经济之外，我们认为前一种方法比后者可以是更有用的，因为在我们自身内我们天然地具有巨大的潜在灵活性来产生高滴定度的抗原诱导的抗肿瘤抗体。虽然癌蛋白用于接种疫苗并没有看到实践的想法，但我们相信，这种方式是值得未来研究的。癌蛋白应相对于它的邻近配偶体适当地位于它的天然的亚细胞定位以获得正确通讯，从而保存在癌细胞信号网络中的致癌功能。当'癌蛋白'分离自它的亚细胞定位的天然的动态复杂性时，它可以失去它的连接并且在这样的'分离'状况下不能履行其正常的生理作用。
我们的体内数据揭示了迄今为止未被认识的现象：免疫疗法不仅可以靶向细胞外癌蛋白而且可以靶向细胞内癌蛋白，以获得抗癌活性。
实施例部分E1(实施例1至18).借助于抗体疗法或接种疫苗用于靶向细胞内癌蛋白的概念验证(proof-of-concept)
部分E1包括实施例1至18。实施例1是部分E1的简介。实施例2至10是用于部分El的材料和方法。实施例11至16是部分E1的结果。实施例17是部分El的讨论，实施例18是部分E1的参考文献。
实施例1.简介(部分E1)
单克隆抗体(mAb)已被证明是相对于一些人类最致命的疾病的有效的和高度特异性的生物试剂1。为了利用抗体特异性地结合于生物靶的能力，显著的研究和开发已集中于开发相对于细胞外/细胞表面致癌靶的单克隆抗体。来自这样的分子靶向癌症疗法的成功的第一波是FDA批准抗血管内皮生长因子抗体贝伐珠单抗(阿伐斯汀(Avastin))和抗HER2/neu抗体曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))分别用于治疗结肠直肠癌和乳癌2。这些是常规地针对胞外蛋白的抗体的实例。不幸的是，大多数细胞蛋白是细胞内蛋白，因而仍然是未通过抗体疗法的方法加以充分开发的3，这是由于一般认为细胞内定位是无法进入抗体的。然而，自从1978年以来，许多实验发现和临床观察已表明不同的情况，免疫学家已经表明自身抗体渗透进入活细胞可以是常见的细胞现象4,5。
为了证明相对于细胞内靶的可能的免疫疗法的设想，在本研究中，我们选择用于癌症治疗的3种细胞内靶，即肝再生磷酸酶3(PRL-3)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、和多瘤病毒中T(mT)癌蛋白。PRL-3是在1994和1998年之间确定的3种PRL-磷酸酶的一种6,7，并且PRL-1、PRL-2、和PRL-3形成蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的亚组8。PRL是细胞内C端异戊烯基化磷酸酶9 10，并且通过EM免疫金标记已揭示了PRL-1和PRL-3定位于质膜和早期内体的内小叶11。PRL磷酸酶是有趣的一组蛋白，其被证实为是人类癌症的生物标记物和治疗靶。在2001年，通过转移性结肠直肠癌、原发性癌症、良性结直肠肿瘤、和正常结直肠上皮的全基因表达谱，并利用基因表达的系列分析(SAGE)技术，首次发现PRL-3mRNA水平的上调紧密相关于结肠直肠癌转移12。还已报道，在平均22.3％的癌症样品中PRL-3蛋白水平升高(n＝1008)13。另外，已报道，当与它们的正常对应物比较时，单独PRL的上调相关于许多类型的晚期人转移性癌症14。因此，选择致癌PRL-3作为用于本研究的理想的细胞内靶。
其次，为了探讨抗体疗法是否可以具有相对于其它细胞内蛋白的一般应用，我们选择流行的报道蛋白(报告蛋白)，细胞溶质增强的绿色荧光蛋白(EGFP)，其最初分离自海蜇(维多利亚发光水母，Aeguorea victoria)。以核质定位模式，EGFP表达自身作为细胞内蛋白。因为EGFP并不表达在宿主组织中，所以当人工过表达在癌细胞中时，EGFP用作癌细胞特异性细胞内蛋白。这使得我们可以检查是否EGFP定向抗体疗法将特异性地根除EGFP表达肿瘤以及显示对宿主的任何非特异性的不受欢迎的副作用。
最后，为了在另一种动物肿瘤模型中测试抗体疗法的原理，我们使用MMTV-PymT转基因小鼠的众所周知的乳腺癌模型15，其携带中T(mT)癌基因并在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子/增强子的转录调控下。在癌症研究团体中，上述转基因小鼠已被广泛用作良好的自发性肿瘤模型几十年，以评估转移性乳腺肿瘤表型的相对贡献16,17。
疫苗是廉价的，然而可有效地治疗现有癌症或预防癌症发展18。癌症的上述特异性的主动免疫疗法，如果成功的话，相对于被动免疫疗法，具有明显的优势。如果抗体可以识别它的细胞内抗原，则我们可以预期，细胞内抗原可以用来触发宿主免疫系统的天然抗体生产，以实现对于癌症的抗体疗法的类似效果。在本文中，我们扩展了我们的研究，以评估用纯化的PRL-3、EGFP和mT蛋白进行接种疫苗以获得抗原诱导的抗体疗法的可靠性。
实施例2.材料和方法(部分E1)：细胞系和细胞培养
Bl 6F0(CRL-6322)和B l 6F10(CRL-6475)小鼠黑素瘤细胞系(源自C57BL/6J株)购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC,马纳萨斯,VA)。在补充有10％胎牛血清和抗生素并保持在供给有5％CO2的37℃培养箱中的RPMI培养基中生长细胞。
实施例3.材料和方法(部分E1)：蛋白质印迹分析
在我们先前的研究22中描述了详细步骤。
实施例4.材料和方法(部分E1)：抗体
如先前描述的22，自制(generate in-house)小鼠单克隆抗体(克隆#318,IgGl)。EGFP小鼠单克隆抗体(sc-9996,IgG2a)和多瘤病毒-中T抗原(PymT)大鼠单克隆抗体(sc-53481,IgG2b)来自Santa Cruz biotechnology,Inc.
实施例5.材料和方法(部分E1)：GST-PRL-3、GST-中T质粒的构造，以及GST融合蛋白的制备
先前描述了用于产生GST-PRL-3融合蛋白的详细步骤。为了制备GST-中T：正向引物5'gcggatecatggatagagttctgagcagagctgac 3'和反向引物5'ctgaattcctagaaatgccgggaacg 3'用于PCR，并利用pXJ40载体(即pXJ40-PyMT)作为模板。用BamHl和EcoRl来消化PCR片段并连接到pGEX-KG载体的相应位点。先前详细描述了GST融合蛋白的制备22。
实施例6.材料和方法(部分E1)：实验转移测定23
所有动物研究得到机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准并按照分子与细胞生物学研究所审查委员会(IRB)(新加坡)的政策进行18。C57BL6和Scid小鼠来自BRC(Biological Resources Centre.Agency for Science,technology and Research，新加坡)；muMT小鼠来自Jackson Laboratory,USA；Rag 2～'～小鼠来自Taconic,USA；Rag T1'小鼠来自Taconic,USA。经它们的尾静脉，对8周龄小鼠注射1百万个癌细胞(第1天)。第3天，经由尾静脉，给予治疗小鼠mAb并随后一周两次给予。将4周龄转基因小鼠(PymT)分为两组，其接受抗mT抗体或PBS，每周两次。处死小鼠并检查所有器官的大转移灶(macroscopicmetastases)的存在。除去转移性肿瘤或器官并固定在4％多聚甲醛中，供组织学分析。在解剖显微镜下，计数肺转移性结节(nodule)。在每个实验中，在抗体疗法中使用的小鼠的数目总结于图5-G。
实施例7.材料和方法(部分E1)：MMTV-PymT小鼠的基因分型
MMTV-PymT小鼠品系购买自人类癌症协会小鼠模型(Mouse Models of HumanCancers Consortium，MMHCC)。雌性未能分泌乳汁，所以通过育种杂合子(Tg/+)雄性和FVB/N(+/+)野生型雌性来保持此品系。用DNA消化缓冲液(12ml:10.08ml，1.2ml的l Ox GB*缓冲剂，0.6ml 10％Triton X-100，0.12ml的2-巯基乙醇)、*Gitschier缓冲液(10ml:3.35ml的2M Tris pH 8.8，1.66ml的1M(NH4)2S04J，34ml的0.5M MgCl2,，l.65ml MQ H2O)来提取尾尖DNA。正向引物P001：5'-cAA ATG TTG cTT GTc TGG TG-3'和反向引物P002：5'-GTc AGTcGA GTG cAc AGT TT-3'用来PCR野生型200bp片段。正向引物POOl：5'-GGA AGc AAG TAcTTc AcA AGG G-3'和反向引物P004：5'-GGA AAG TcA cTA GGA GcA GGG-3用来PCR566bp转基因片段。先前已描述了基因分型程序(http://inouse.ncicrf.gov/pi tocols)。
实施例8.材料和方法(部分E1)：全标本(全标本包埋，whole mount)制备和胭脂红明矾染色(carmine alum stain)
在室温下进行所有以下程序。在尸检期间，切除腹部乳腺，供全标本制备，散布在载玻片上，并固定在Carnoy固定液(6份100％乙醇，3份氯仿，和1份冰乙酸)中4小时。随后，在70％乙醇中洗涤组织15分钟，并将乙醇逐渐改变为蒸馏水，最后用蒸馏水冲洗5分钟。在胭脂红明矾染色剂中进行染色过夜。然后在分级乙醇溶液中(70、95、和100％，各自15分钟)脱水组织并在两次更换的二甲苯中加以清除，封固，并加盖玻片(利用封固胶(Permount))。在Leica解剖显微镜(Leica Microsystems GmbH,Wetzlar，德国)下观察全标本，然后利用SPOT
Figure BDA0001598178050000581
彩色数字相机(Diagnostic Instruments,Inc.Sterling Heights,MI)并利用SPOT软件包(Version 4.5,Diagnostic Instruments,Inc.Sterling Heights,MI)来记录数字图像。
实施例9.材料和方法(部分E1)：C57BL6小鼠和MMTV-PymT转基因小鼠的免疫
弗氏完全佐剂是这样的形式，其包含乳酪分支杆菌的灭活细胞以增强免疫反应。在初次注射中使用完全佐剂。并不包含这种细菌的形式称作弗氏不完全佐剂，其用来在随后注射中加强。通过腹膜内注射总体积为200μl的弗氏佐剂：PRL-3(20μg)或EGFP(20μg)，在100μl盐水中混合100μl完全佐剂(Cat#77140,Pierce)，来免疫8周龄C57BL6小鼠。通过腹膜内注射总体积为200μl的弗氏佐剂:mT(10μg)抗原，在100μl盐水中并混合100μl完全佐剂(Cat#77140,Pierce)，来免疫4周龄MMTV-PymT TG小鼠。通过注射总体积为200μl的不完全佐剂(Cat#77145,Pierce)来进行接着的两次免疫。以2周间隔进行第二次和第三次注射。随后，在肝素涂层毛细管中收集100-200μl尾部出血，血浆制备自血液样品，然后通过ELISA来测量抗体滴定度。先前描述了ELISA的详细步骤22。在它们的血清中具有高滴定度的PRL-3、EGFP、或mT抗体的小鼠被选择用于实验和进一步分析。用于接种疫苗的小鼠的数目总结于图6-D。
实施例10.材料和方法(部分E1)：ELISA测定
在pH 7的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中制备PRL-3和mT抗原原液。将包含50ng适当抗原的100μl溶液加入每个96孔板并在4℃下温育过夜以将抗原涂布(包被)在孔板上。在37℃下用在PBS(包含0.05％吐温20)中的3％BSA阻断(封闭)孔板1小时，然后用PBS洗涤三次。将来自每只小鼠的血清(1.0μl)稀释在100μl封闭溶液中并加入每个孔，然后在37℃下温育2小时。将以1:5000稀释在PBS中的100μl的适当的与HRP(Pierce,USA)共轭的二抗加入每个孔，并在37℃下温育1小时。用包含0.05％吐温20的PBS冲洗孔板三次，接着用无菌水洗涤3次。将底物，100μl的Turbo-TMBTM(Pierce,USA))，加入每个孔并在室温下温育10分钟。通过添加100μl浓H2SO4来停止反应。利用Dynatech MR7000板读取器(Dynatech,USA)，在450nm处，测量吸光度。
实施例11.材料和方法(部分E1)：统计分析
使用Kaplan-Meier方法来估计'治疗'与'未治疗'小鼠的累积存活率。<0.05的p值被认为是统计上显著的。
实施例12.结果(部分E1)：在C57BL6野生型小鼠中，PRL-3mAb(IgGl)有效地延迟表达内源性PRL-3蛋白的转移性肿瘤
我们先前已显示，在免疫减弱的裸鼠转移性肿瘤模型中抗体疗法相对于细胞内PRL蛋白的功效19。为了在更相关模型中检查这种治疗途径用于未来临床应用，我们扩展了该研究以检查抗体治疗是否在免疫活性(immunocompetent)C57BL6野生型小鼠中可以发挥作用。在第1天，经由侧尾静脉(lateral tail vein)，对小鼠(8周龄)静脉内(i.v.)注射C57BL6源性B 16F0(F0)黑素瘤癌细胞，其表达内源性PRL-3(图1-A，泳道1)。在第3天，将小鼠分为'未治疗'和'治疗'组，然后，在实验的整个持续期间，其分别接受两次给予的PBS或PRL-3mAb/周(图1-B)。在实验结束时(第17天)，'未治疗'小鼠出现严重体重减轻，在各种器官(包括肺、肝、肾上腺、肾和骨)中的多个转移性肿瘤。相比之下，'治疗'小鼠外表上看起来似乎更加积极和健康。'治疗'小鼠组，但不是'未治疗'组，在整个实验的持续期间，不断增加体重，其跟肿瘤转移灶的减少是一致(图1-C和图1-D)。为了证实PRL-3mAb的特异性，并行地进行相同的实验，其中对小鼠静脉内注射C57BL6源性B16F10(F10)细胞，另一种黑素瘤细胞系，其表达非常低水平的PRL-3(图1-A，泳道2)。在实验结束时(在第17天)，所有F10受体已在卵巢、肾上腺、肾、和骨中发展转移灶，而不管它们是否已接受PRL-3mAb。两组小鼠均经历体重的显著的损失并且似乎是疲弱/不活跃的(图l-E和图1-F)，这表明，表达非PRL-3的F10受体对PRL-3抗体治疗具有较差反应。注意，相比于来自F0受体的肺(图1-C)，F10受体在肺中发展更具攻击性的转移性肿瘤(图1-E)。这些数据表明，PRL-3抗体治疗的效率紧密相关于癌细胞的PRL-3表达状态，但不相关于转移活性的程度。因此，源自免疫活性野生型C57BL6小鼠的目前的数据证实了我们先前的来自免疫减弱裸鼠的发现19。
实施例13.结果(部分E1)：在B细胞缺陷小鼠中，PRL-3mAb(IgGl)未能延迟表达内源性PRL-3蛋白的转移性肿瘤
为了研究淋巴细胞是否涉及所观测到的抗体疗法的效应，我们采用免疫缺陷小鼠的两种工程品系：muMT小鼠，该小鼠是C57BL6小鼠，其纯合于μ链基因的膜外显子的失活突变。它们不能形成preBCR，因此不含成熟B淋巴细胞。我们还采用Rag-2小鼠，其携带种系突变，其中大部分的RAG-2编码区被删除，因而产生纯合突变体(Rag2～/_)，其是可存活的但未能产生成熟B或T淋巴细胞21。Kaplan-Meier存活曲线用来比较在muMT-FO、C57BL6-F0、和C57BL6-F10小鼠之间的'治疗'和'未治疗'小鼠。出人意外地，在muMT-FO小鼠中，在抑制肿瘤方面，我们没有观测到任何PRL-3mAb治疗功效，同时PRL-3mAb治疗对于延长muMT-FO小鼠的寿命没有任何影响，其中‘治疗’小鼠的中位生存期(median survival)为19天以及‘未治疗’小鼠的中位生存期则为18.5天(图2-A，/？值＝0.8661)。类似地，在B和T细胞缺陷Rag2-F0小鼠中，在‘治疗’和‘未治疗’组之间，在肿瘤转移灶方面，没有观测到差异(数据未示出)。相比之下，PRL-3mAb治疗延长了C57BL6-F0小鼠的存活率，其中‘治疗’小鼠的中位生存期为21.5天，但‘未治疗’小鼠的中位生存期则为17天(图2-B，p＝0002)。与先前的发现一致，PRL-3mAb治疗并不延长患有表达非PRL-3的肿瘤的C57BL6-F10小鼠的总生存期，其中‘治疗’小鼠的中位生存期为17.5天，而未经治疗的小鼠的中位生存期则为16.5天(图2-C，>＝0.535)。为了总结在不同小鼠背景之间抗体疗法的有效性，在每组中，相对于未经治疗的小鼠，我们对PRL-3mAb减少转移性肿瘤形成的程度的能力进行了评分。当转移性肿瘤形成减少至少70％(±10％)被评分为有效结果时，仅在C57BL6-F0组中但不在muMT-FO组看到明确的有利影响(图2-D)。因此，PRL-3抗体疗法可能需要成熟B细胞功能以获得抗肿瘤活性。
实施例14.结果(部分E1)：在C57BL6小鼠中，EGFP mAb(IgG2a)有效阻断表达EGFP蛋白的转移性肿瘤
PRL-3mAb抑制肿瘤转移的有趣的能力促使我们研究是否上述治疗策略也可以适用于其它细胞内蛋白。因为EGFP是非癌症相关蛋白，所以我们选择使用EGFP作为特异性地表达在癌细胞中的细胞内蛋白标记。因为EGFP并不表达在宿主组织中，所以我们预测，在上述动物模型中，EGFP抗体应具有很少的不受欢迎的副作用。利用合并的F0和F10黑素瘤癌细胞系，其异质地过表达外源性EGFP蛋白(图5-A，图5-B)，注射表达EGFP-F0和EGFP-F10的细胞，然后用EGFP mAb并按照相同的治疗方案加以治疗(图5-C)。如预测的，依据肿瘤消退，EGFP-FO和EGFP-F10细胞均同样好地响应EGFP抗体治疗，而不管PRL-3表达。值得注意的是，在肺中发现离散簇的绿色荧光或黑色转移性肿瘤(图5-D和图5-E，图片a、e)。因此，在此模型中，表达非EGFP的转移灶(黑色)用作绿色转移性肿瘤的内部阴性对照。明显地，EGFP mAb可以特异性地减少EGFP转移灶的数目，但并不减少非EGFP转移灶的数目(图5-D和图5-E，图片e)，这表明，仅表达EGFP的肿瘤响应EGFP mAb治疗。在基于转移肿瘤负荷减少对结果进行评分以后，我们发现，EGFP mAb效应的功效紧密相关于在癌细胞中的EGFP表达状态(图5-G)。因此，抗体疗法的治疗功效取决于在细胞上(或在细胞内)的特定的抗体-抗原相互作用。
实施例15.结果(部分E1)：在MMTV-PymT转基因小鼠中，mT(大鼠IgG2b)mAb可以防止表达mT的乳腺肿瘤进展的形成
鉴于已讨论了抗体疗法可以针对内源性(如PRL-3)和外源性(如EGFP)细胞内蛋白发挥作用，我们询问在自发性肿瘤动物模型中这种方式是否可以抑制肿瘤形成。为此，我们选择自发性乳腺肿瘤发生的流行的MMTV-PymT转基因小鼠模型。MMTV-PymT转基因小鼠表达多瘤病毒中T(mT)致癌蛋白，一种包含421个氨基酸的DNA病毒蛋白，其在乳腺上皮细胞中作为有力的癌基因。mT被线性表示，束缚(21aa)于膜，在它的羧基末端，以及短KRSRHF基序可能暴露在细胞表面处(太短以致不可能是外部表位，一般来说)。因此，这种蛋白的大部分面向细胞溶质区室并因此已被认为是细胞内蛋白15。表达mT的细胞具有增强的转移潜力16。在2-3个月的月龄，所有雌性携带者(基因型+/-)发展可触知的乳腺肿瘤(腺癌)(http:// mouse.ncifcrf.gov/information/order livem ice.asp)。在雄性和雌性乳腺中，在高水平下检测到中T表达，并且对于乳腺上皮细胞转化，mT癌基因的表达是足够的。我们使用了44个杂合子(+/-)年轻的转基因雌性并利用RT-PCR来证实它们的基因型(图3-A)，然后将它们分成‘治疗’(n＝18)和‘未治疗’(n＝26)组。为了确定是否mT抗体可以减少表达mT的乳腺肿瘤发展，在4周龄时，对‘治疗’小鼠i.v.注射mT抗体，接着在实验的整个持续期间每周两次给予抗体，时间为约3个月(图3-B)。在图3-C中，选择‘未治疗’小鼠(#2、#6)和‘治疗’小鼠(#7、#10)作为代表性的实例；FVB/N非转基因雌性(#3)用作乳腺(5对)的正常尺寸的对照。‘未治疗’小鼠的乳腺的组织病理学检查呈现出侧支的不规则形成、扩大的顶芽(terminalbud)、和一些较大的多小叶性肿瘤块(图3-D、a)。相比之下，与来自野生型小鼠的正常乳腺比较，来自治疗小鼠的乳腺组织显示更加正常的生长和发展(图3-D、b-c)。利用Kaplan-Meier方法来估计‘治疗’与‘未治疗’MMTV-PymT转基因小鼠的累积存活率，我们发现，mT Ab疗法可以延长治疗小鼠的寿命，从而导致，相比于未经治疗的小鼠的15周，‘治疗’MMTV-PymT小鼠的中位生存期增加至19.5周(图3-E，/？＝0.0018)。总之，我们发现，100％(26/26)的‘未治疗’小鼠携带显著的乳腺肿瘤，而仅16.6％(3/18)的mT抗体治疗小鼠发展携带肿瘤的乳腺，其余部分则显示表达mT癌基因的转移性乳腺肿瘤的形成的显著减少(图3-F、和图5-F)。这些结果表明，通过单独用mT抗体来治疗MMTV-PymT小鼠，可以实现自发性肿瘤形成的广泛的抑制。
实施例16.结果(部分E1)：接种有PRL-3蛋白或EGFP的C57BL6小鼠抵抗表达PRL-3或EGFP的肿瘤的形成
已成功显示借助于它们的相应抗体如何可以靶向三种不同的细胞内蛋白(PRL-3、EGFP、和mT)，我们接着询问，在抗原激发(接种疫苗)以后通过免疫反应而产生的天然抗体是否可以靶向细胞内蛋白。我们着手用三个剂量(各自20g)的PRL-3抗原(n＝16)或EGFP蛋白(n＝14)，并以2周间隔，来免疫8周龄C57BL6小鼠(图6-A)。在免疫结束时，通过ELISA并相对于PRL-3抗原或EGFP蛋白，测试来自14周龄免疫C57B16小鼠的血清的抗体滴定度(数据未示出)。随后将成功免疫小鼠分为两组，并i.v.注射EGFP-FO(PRL-3阳性)或EGFP-F10(PRL-3阴性)黑素瘤细胞。与未免疫的小鼠(n＝18)(图6-B，a-d)比较，PRL-3-免疫小鼠显示在肾上腺、卵巢和肺中由EGFP-FO癌细胞形成的减少的转移性肿瘤(图6-B，e-g)。这是所预期的，因为EGFP-FO黑素瘤细胞表达EGFP和PRL-3蛋白，其应响应EGFP和PRL-3抗体疗法。明显地，相比于来自未免疫小鼠的转移性肺(图6-B，d)，PRL-3-免疫小鼠不能减少由EGFP-F 10黑素瘤细胞形成的转移性肺肿瘤的攻击性程度(图6-B，h)，其并不表达PRL-3蛋白(图5-A)。再一次，这表明，抗原诱导的、天然产生的PRL-3抗体对抑制表达非PRL-3的EGFP-F 10肿瘤没有影响。巧妙地，我们示出了，GFP-免疫可以减少在肾上腺、卵巢和肺中，由EGFP-FO和EGFPFIO癌细胞形成的转移性肿瘤(图6-B，i-1)，而不管PRL-3表达水平。总而言之，这些结果表明，在接种疫苗以后，在宿主免疫系统中抗PRL-3或抗EGFP抗体的引入可以特异性地分别抑制表达PRL-3或EGFP的肿瘤的形成。
实施例17.结果(部分E1)：接种有mT抗原的MMTV-PymT转基因的年轻雌性可预防乳腺mT肿瘤的形成
为了进一步证实用细胞内蛋白进行癌症接种疫苗的可能性，我们再次采用MMTV-PymT转基因乳腺肿瘤模型。将38个FVB/N杂合子雌性(4周龄)分为GST-免疫(n＝3)、GST-mT-免疫(n＝17)、和未免疫(n＝18)对照组。以2周间隔，分别用三个剂量(各自10μg)的GST或GST-mT抗原对小鼠进行免疫(图4-A)。通过ELISA来检查上述小鼠的mT抗体的滴定度，以证实在它们的血液循环中mT抗体的存在(关于代表性的实例，参见图4-B)。比较于GST-免疫小鼠(#43、#44、#45)，明显地，mT-免疫小鼠(#37、#40、#41)表现出乳腺肿瘤的尺寸和重量的显著减少(图4-C和图4-D)，并发现来自GST-免疫、GST-mT-免疫、和野生型对照小鼠的乳腺组织/小鼠的平均重量分别为5.6g、1.3g、和0.6g(图4-D)。接种疫苗实验的结果总结于图6-C和图6-D。Kaplan-Meier存活曲线显示，相比于未免疫组(14.5周)，mT抗原可以延长免疫小鼠(19.5周)的平均存活率(p＝0.0004)(图4-E)，这表明癌症接种疫苗在显著延长生存时间方面的正面益处。共同地，数据表明，抗原诱导的宿主mT抗体可以再次有效地预防由表达mT的癌细胞形成自发性乳腺肿瘤。
实施例18.讨论(部分E1)
尽管在胞外蛋白靶向方面存在进展，但就抗体疗法而言，细胞内蛋白靶向受到很少关注。我们在本文介绍的发现证明了独特的概念验证，其中针对细胞内蛋白的抗癌抗体疗法可以体内显著地减小肿瘤进展。
在本文中，我们显示了在野生型C57BL6小鼠中针对两种细胞内蛋白(PRL-3和EGFP)并相对于小鼠黑素瘤转移灶的抗体疗法的功效。在MMTV-PymT转基因小鼠自发性肿瘤模型中，针对细胞内mT抗原，也获得了类似的成功。观测到的治疗反应似乎是同型无关的，因为IgG1(PRL-3mAb)、lgG2a(EGFP mAb)、IgG2b(PymT大鼠mAb)、和自身产生的抗体可以有效地抑制肿瘤进展。适当的抗体-抗原相互作用似乎是主导因素；用非相关抗体来靶向肿瘤根本不产生有利反应。有趣的是，我们还发现，成熟B细胞构成抗体疗法反应的重要成分。这些结果反映了最近的报告，其中发现B细胞对针对结肠腺癌的抗DR5抗体疗法是必不可少的23。
我们的研究结果还显示，在肿瘤特异性抗原激发以后，宿主免疫性可以被刺激以产生相对于特异性抗原的内源性抗体，从而导致肿瘤抑制。'癌症接种疫苗'的这种设想长期以来一直是有前途的但具有挑战性的前景'9。重要的是，我们发现，相比于外源递送抗体，抗原诱导的抗体疗法可以实现类似的抗肿瘤治疗功效。我们认为，它可以是更有用的和经济的，因为我们自身天然地具有巨大的潜在灵活性来产生高滴定度的抗原诱导的抗体。虽然将癌蛋白用于接种疫苗似乎是不切实际的想法，但我们相信这种方式是值得未来研究的。为了保存在癌细胞信号网络中的致癌功能，癌蛋白应精确定位于其天然亚细胞背景，其配合于它的邻近配偶体，以获得正确通讯。当癌蛋白分离自它的亚细胞定位的天然的动态复杂性时，它可以失去它的连接并且不能履行其正常的生理作用。
这里介绍的工作概述了用于未来临床癌症治疗的潜在方法。首先，除去原发性肿瘤并检查以确定肿瘤特异性抗原。接着是引入相对于肿瘤抗原的特异性嵌合或人源化抗体以消除弥散细胞，从而抑制微转移灶形成24。此步骤可以很好地预防在癌症患者中的进一步扩散或复发。可替换地，对于紧密遗传倾向的癌症，用相关于家族性癌症的抗原对免疫活性年轻易感家族成员进行的免疫可以'引发'相对于癌蛋白的免疫系统。这些内源刺激的抗体将是持久的，并将中和表达特定癌蛋白的癌细胞。这种方式是基于我们的以下观测结果：引入年轻MMTV-PymT转基因小鼠中的非常少量的mT抗原(10μg)可以激活宿主免疫系统并产生mT抗体以抑制表达mT的肿瘤形成，从而允许无症状存活长达4个月。在小鼠中延长数周寿命可相当于在人类中延长几十年。
最后，这里介绍的临床前数据表明用于癌症治疗的一般应用，其中通过利用靶向细胞外和细胞内肿瘤特异性抗原的外源性和内源性抗体疗法。因为现有的常规临床抗体疗法是昂贵的，所以我们敦促研究人员进一步开发这里研究的强大的抗原诱导抗体疗法反应。对于更大的治疗反应，我们觉得，这种方式可以结合于其它免疫刺激剂，以获得最佳效应。随着癌症研究快速走向个体化癌症疗法，我们的特异性靶向细胞内(或细胞外)癌蛋白的策略在未来的定制癌症疗法中具有巨大的前途。
实施例19.参考文献(部分E1)
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实施例部分E2(实施例20至38).在动物模型中，对于靶向细胞内PRL-3的嵌合抗体的抗癌功效，宿主免疫性是关键的
部分E2包括实施例20至38。实施例20是部分E2的简介，实施例21至29是部分E2的材料和方法，实施例30至36是部分E2的结果，实施例37是部分E2的讨论，实施例38是用于部分E2的参考文献。
实施例20.简介(部分E2)
一个世纪前，德国化学家Paul Ehrlich提出了抗体作为"魔术子弹"的设想。确实，单克隆抗体(mAb)已被证明是相对于一些人类最致命的疾病的天然的生物弹头1,2。一般来说，抗体靶向疗法具有比用小分子抑制剂进行的化疗少得多的毒性。抗体构成增长最快类别的人治疗剂并且是理想试剂，用于经由免疫系统来识别和破坏恶性细胞。然而，这种治疗途径已限于表面或由癌细胞表达的分泌蛋白3,4，部分由于以下假设：抗体太大(150kDa)以致不能穿透细胞膜。因此，就抗体疗法而言，广泛系列的细胞内癌蛋白仍然是未开发的。然而，完整抗体不能渗透进入活细胞的设想已受到大量的实验发现和临床观察的挑战5,6,7。在过去30年中，免疫学家已发现，在患有不同自身免疫病的患者的血清中发现的自身抗体可以以某种方式结合它们的相应的细胞内抗原6,7,8。虽然未能确定，在自身免疫性患者中发现的细胞内蛋白的抗体实际引起疾病、或甚至细胞破坏，然而我们强调我们的这项工作的主要贡献在于：细胞内蛋白的抗体可以发挥治疗作用。
PRL-1(肝再生磷酸酶-1)、PRL-2、和PRL-3是细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的有趣的亚组。当与它们的正常对应物比较时，单独PRL被过表达在各种各样的癌细胞系和癌症组织中9。近期重要的综述很好地描述了在癌症进展中的这些PRL-PTP10。PRL是细胞内C端异戊烯基化磷酸酶。通过EM免疫金标记，揭示了PRL-1和PRL-3定位于质膜和早期内体的内小叶"12。相比之下，缺乏异戊烯基化信号的PRL的突变形式则定位在细胞核中13。PRL-3被首次发现为转移相关磷酸酶，其相关于结肠直肠癌(CRC)转移，并发现，它是仅有的在100％的CRC的肝转移灶过表达的基因14。随后已表明，PRL的过表达在促进癌症转移中具有致病作用并且它们成为用于不同的癌症治疗的潜在的独特靶15。然而，因为这些磷酸酶是细胞内定位的，所以，利用治疗性抗体的常规方式将似乎是一项艰巨的任务。在我们早先的研究中，我们报告了意外的观察：相对于PRL-1和PRL-3的小鼠单克隆抗体(mAb)能够阻滞过表达细胞内EGFP标记的PRL-1和PRL-3的癌细胞的实验性转移16。
在本研究中，利用新产生的嵌合PRL-3抗体，我们进一步评估了上述靶向策略的可靠性。在这里，在五个重要方面，我们扩展我们早期的发现，用于相对于细胞内癌蛋白的潜在的未来的临床治疗。首先，我们产生和利用临床相关的嵌合抗体来代替小鼠抗体。其次，我们治疗小鼠，该小鼠具有天然存在的人癌细胞，其在中国仓鼠细胞(CHO)中表达内源性PRL-3而不是外源性PRL-3。第三，我们说明了，天然杀伤(K)细胞的耗尽会增强肿瘤植入。第四，利用成对裸鼠和scid小鼠模型，我们发现了在确定我们的抗体疗法的结果中B细胞的关键作用。最后，通过IVIS实时成像系统并利用荧光标记的抗体来跟踪抗体-肿瘤结合活性；我们提出了在治疗和未经治疗的小鼠中用于抗体疗法的两个工作模型。关于借助于抗体疗法来靶向细胞内癌蛋白的可能的方式，提出了迄今为止基于证据的设想。结果表明，可能有必要评估一系列的细胞内癌蛋白(如磷酸酶、激酶、转录因子)作为用于抗癌疗法的可能的靶。
实施例21.材料和方法(部分E2)：特异性PRL-3人/小鼠嵌合mAb(克隆#318)的产生
关于PRL-3嵌合mAb产生，利用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,cat#74104)，总RNA提取自6x106个杂交瘤细胞(克隆#318)19。然后利用Superscript II RNase H(Invitrogen,Cat18064-014)，将RNA逆转录成cDNA。产生的总cDNA用作模板来产生'通用可变区(universalvariable region)'，其中利用Ig-Prime试剂盒(Novagen,cat#69831-3)用于PCR(95℃-4℃-72℃，30个循环)。借助于TA克隆试剂盒(Invitrogen,part#45-0640)，将PCR片段克隆到PCRII-TOPO-载体。借助于Mfe l和Xhol来切割PCR片段，然后插入人IgG l恒定区表达载体-pCMV-人IgGl17的相应位点，以将小鼠的重链可变区(克隆#318)18连接于人IgG 1恒定区。借助于包含用于的ApaLl和Pst 1的限制位点的未端，对轻链(克隆#318)的小鼠可变区进行类似的PCR程序。借助于ApaLI和Pst I来切割PCR片段，然后插入人IgG l恒定区表达载体(其包含克隆#318的重链的可变区)的相应位点。将完全构建体瞬时转染到在超低IgG FBS(Gibco,16250-078)中培养的293T细胞。随后，嵌合mAb收获自培养上清，然后借助于离心过滤器装置(Millipore,cat#UFC900596)浓缩达40倍。通过间接免疫荧光(IF)和蛋白质印迹分析，测试嵌合mAb的特异性。
实施例22.材料和方法(部分E2)：细胞系和细胞培养
HCT1 16(CCL-247)人结肠直肠癌细胞系、H460(NCI-H460)人非小肺癌细胞系、A431(CRL-1555)人表皮样癌细胞系、B16F0(CRL-6322)、和B16F10(CRL-6475)小鼠黑素瘤细胞系购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC,马纳萨斯,VA)。A27.80(Cat#931 12519)人卵巢癌细胞系购买自ECACC,UK。在由供应商推荐的适当培养基中生长细胞。
实施例23.材料和方法(部分E2)：蛋白质印迹分析
先前已描述了小鼠PRL-3单克隆抗体的产生以及蛋白质印迹程序18。GAPDH抗体来自Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。
实施例24.材料和方法(部分E2)：在小鼠中实验转移性测定20
在第1天，经由尾静脉，将l x106个癌细胞注入8周龄裸鼠(Jackson Labs,USA)的循环。嵌合PRL-3mAb或小鼠PRL-3或PRL-1mAb用来治疗小鼠；在癌细胞注射后的第3天进行第一抗体治疗，接着每周给予两次。对于对照未治疗组，经由尾静脉，给予PBS。所有动物研究得到IMCB的机构审查委员会的批准，并严格遵守新加坡科学、技术和研究机构(A*STAR)的动物设施中心的规则和政策。
实施例25.材料和方法(部分E2)：NK细胞的耗尽
抗去唾液酸GM 1抗血清(兔)购买自Wako Pure Chemical Industries,Ltd(Osaka540-8605，日本)。在实验转移测定以前24小时，经由尾静脉，将GM1抗血清(50μl)注入8周龄裸鼠(Jackson Labs,USA)的循环。
实施例26.材料和方法(部分E2)：统计分析
Kaplan-Meier方法用来估计累积存活率、和存活率的差异，小于0.01的p值被认为是显著的。
实施例27.材料和方法(部分E2)：抗体标记和IVIS实时成像
用CFTM750染料抗体标记试剂盒(http://www.biotium.coin/product/product info/Newproduct/M ix-n-Stain Kits.asp)来标记纯化的PRL-3抗体。在实时成像以前1小时，经由尾静脉，注射标记的抗体。Bioware Ultra细胞系HCT 116-luc2(www.caliperLS.com)是表达荧光素酶的细胞系，在人遍在蛋白C启动子下，其被萤火虫荧光素酶基因(luc2)稳定转染。通过利用HCT116人腺癌(ATCC,CCL-247TM)和在人遍在蛋白C启动子(pGL4luc2)的控制下转导慢病毒(包含荧光素酶2基因)来建立HCT116-Luc2细胞系。将1x106个HCT 116-luc2癌细胞注入8周龄裸鼠(Jackson Labs,USA)的尾静脉。在第3天，经由尾静脉，将抗体注入治疗小鼠，接着每周两次抗体注射。在治疗7周以后，通过腹膜内途径，对小鼠注射萤光素溶液(15mg/ml或30mg/kg，在PBS中，剂量为150mg/kg)，其被允许分配在觉醒动物中约5-15分钟。将小鼠放入透明的有机玻璃麻醉盒(2.5-3.5％异氟醚)，其允许利用
Figure BDA0001598178050000691
Spectrum成像系统3D系列来不受阻碍地视觉监测动物以跟踪和监测体内肿瘤发展。确定了在治疗与未经治疗的小鼠之间的结果。
实施例28.材料和方法(部分E2)：FACS分析
在具有高浓度葡萄糖(4.5g/L)并补充有10％FBS和5％抗生素的DMEM中生长人表皮样癌细胞系A431。在补充有10％FBS和5％抗生素的RPMI中生长B 16F0和B 16F10细胞。借助于非酶促预热细胞解离溶液(Sigma,Cat#c-5914)，自平皿分离细胞(5x106)并转移到5ml聚苯乙烯管，然后用完全培养基洗涤一次。然后，在室温(RT)下，在100μl完全培养基中，用1μl EGFR(Genetech,USA)或5μl PRL-3初级(一级)小鼠抗体18温育细胞1小时。每15分钟搅拌细胞以防止凝集。然后用完全培养基洗涤细胞两次，并在RT下用羊抗小鼠AlexaFluor 546抗体(Invitrogen,USA)温育l小时，洗涤，并在利用BD FACS仪进行分析以前重新悬浮于1ml完全培养基。利用WinMDl ver2.8软件来处理原始数据。
实施例29.材料和方法(部分E2)：利用免疫组化法(IHC)进行的组织病理学分析
人肺组织阵列009-01-004、和CCOO-01-006、CC04-01-CC04购买自Cybrdi,Inc.(Rockville,Maryland 20850USA:http://cybrdi.com/index.php)。人AML骨髓样品获自新加坡国立大学医学院(NUH-N US)组织库(Tissue Repository)，并得到NUH-NUS的机构审查委员会(IRB)的批准，用于研究用途。所有人组织样品，包括商用样品，的使用得到分子与细胞生物学研究所的机构审查委员会(IRB)的批准。我们使用Dako En VisionTM Systems K1395(Dako,Carpinteria,CA)来进行IHC分析18,19。
实施例30.结果(部分E2)：PRL-3小鼠/人嵌合抗体(克隆#318)的产生
我们先前报道了，在裸鼠中PRL-3或PRL-1小鼠mAb可以特异性地靶向它们的各自的细胞内PRL-3或PRL-1磷酸酶以抑制癌症转移16。在将我们的实验室发现转换为临床设置的尝试中，我们已设计了相对于PRL-3的小鼠/人嵌合mAb，以最小化小鼠mAb在人中的潜在抗原性。利用重组DNA技术，并通过免疫球蛋白基因的转基因融合，我们分别融合人IgGl分子17的重或轻链的恒定域和PRL-3mAb(克隆#318)18的小鼠可变区(图7-A)。将表达构建体转染到人胚胎肾293T细胞以产生重组PRL-3嵌合mAb，其然后收获自培养基并进一步浓缩。PRL-3嵌合mAb的抗原结合特异性得到很好保存，如通过对过表达外源性EGFP-PRL-3的DLD-1细胞进行间接免疫荧光法(图7-B)和进行蛋白质印迹分析(图7-C)所确认的。PRL-3嵌合mAb特异性地识别EGFP-PRL-3(-48kDa)和myc-PRL-3(-21kDa)(图7-C，泳道1-2)，但既不与myc-PRL-1也不与myc-PRL-2蛋白起反应(图7-C，泳道3-4)。在小鼠黑素瘤B 16F0细胞中，对嵌合抗体，进行50％细胞抑制细胞毒性浓度(IC50)，以及当在正常培养条件下在10％FBS培养基中培养细胞时，甚至在高浓度(40g/ml)下，我们没有观测到在生存力方面的细胞毒性(数据未示出)。因为在各种各样的人类癌症中PRL-1、-2、和-3被过表达19，所以我们预计，PRL-抗体可能具有广阔的应用前景来阻滞不同类型的PRL阳性癌症扩散，尤其是在一些致命性恶性疾病中如肺癌和急性髓性白血病JAML)，其经常在短时间范围内复发。在肺癌中，我们发现，PRL-3被过表达于31％鳞状细胞癌和26％腺癌(图1-A至图1-C)，两种主要亚型的极易复发的非小细胞肺癌包括80％的人肺癌
(http://en.wikipedia.org/wiki/Lung_cancer#Non-small_cell_lung_ carcinoma_.28NSCLC.29)。我们还发现，PRL-3被过表达于35％(24/69病例)的AML(图12-D)。在PRL-3-阳性癌症的手术以后，PRL-3嵌合抗体疗法的几次注射将清除剩余的微转移灶和循环癌细胞以防止复发。
实施例31.结果(部分E2)：PRL-3嵌合抗体有效地抑制由表达内源性PRL-3的B16F0癌细胞形成的转移性肿瘤，但并不有效地抑制由并不表达内源性PRL-3的B16F10癌细胞形成的转移性肿瘤
为了找到用于PRL-3相关癌症的临床相关的动物模型，通过蛋白质印迹分析，我们筛查了几十个癌细胞系的内源性PRL-3蛋白的表达水平。用于我们的动物模型的理想的细胞系对应呈现对比水平的内源性PRL-3并且应能够在短时间范围内在小鼠中诱导转移性肿瘤。我们发现两个小鼠黑素瘤细胞系B16F0和B16F10(F0和F10)，其可以符合用于所期望的实验的标准。虽然F10细胞比F0细胞天然地更具转移性，但我们发现，亲代F0细胞比F10细胞表达更高水平的内源性PRL-3蛋白(图8-A)，这提示，F10细胞转移性活性可能不再是PRL-3依赖性的。当我们采用实验转移性测定20时，其中通过侧尾静脉注射，将培养癌细胞引入裸鼠的循环，在小鼠中，在17天内，F0和F10细胞系均能迅速形成多个转移性肿瘤。这样的攻击性体内转移模型使得我们可以在抗体疗法以后不久就看到在治疗和未治疗组之间的功效方面的差异。在癌细胞注射以后的第3天(在治疗中我们可以延迟的最后时间)，类似地经由尾静脉，将嵌合PRL-3抗体给予'治疗小鼠'，接着两次随后给予抗体/周(图8-B)。在实验结束时，我们发现，PRL-3嵌合抗体可以根除由表达PRL-3的F0癌细胞形成的肿瘤；在实验结束时，在'治疗小鼠'中，在多种组织中，转移性肿瘤被显著减少(图8-C)。稍后将讨论针对F0受体的Kaplan-Meier存活分析(图10A，c)。在一个平行实验中，在阻滞由并不表达PRL-3蛋白的F10癌细胞形成的转移性肿瘤方面，PRL-3抗体没有影响。在治疗和未治疗F10细胞受体的肺中，发现数百个转移性肿瘤，并在'未经治疗的小鼠'(图8-D，上图)和'治疗小鼠'(图8-D，下图)之间没有看到明显的差异。此外，Kaplan-Meier存活分析显示，PRL-3抗体不能延长‘治疗’Fl0受体的存活时间(图8-E)。
实施例32.结果(部分E2)：PRL-3嵌合抗体有效地抑制由表达内源性PRL-3的人癌细胞形成的转移性肿瘤，但并不有效地抑制由并不表达内源性PRL-3的癌细胞形成的转移性肿瘤
除小鼠F0黑素瘤细胞之外，我们进一步发现，HCT1 16-luc2、HCT-1 16人结肠直肠癌细胞系、和A2780人卵巢癌细胞系表达内源性PRL-3蛋白(图9-A泳道：1-3)。先前，A2780还已被报道为PRL-3阳性细胞系21。作为对照，我们发现人非小肺癌细胞系(NCI-H460)，其并不表达内源性水平的PRL-3(图9-A泳道4)。不论PRL-3是阳性或阴性的，在裸鼠中，在1-2个月内，上述4种人癌细胞系分别能迅速形成转移性肿瘤。HCT-1 16-luc2是表达荧光素酶的细胞系，其被在HCT-1 16细胞中的萤火虫荧光素酶基因(luc2)稳定转染。在人遍在蛋白C启动子的控制下，通过转导包含荧光素酶2基因的慢病毒来建立上述细胞系。通过Xenogen's
Figure BDA0001598178050000721
光谱系列成像，此细胞系可以用来体内监测肿瘤形成。使用此系统，我们显示了，PRL-3抗体可以抑制HCT1 16-luc2癌细胞的转移，这是因为在'实时成像中在抗体疗法的第7周，观测到转移性肺肿瘤的明显减少(图9-B)。此外，在接种HCT-1 16细胞以后2个月(图9-C，a)以及在接种A2780细胞以后1个月(图9-C，b)，在PRL-3抗体治疗和未经治疗的小鼠之间发现显著差异。PRL-3mAb治疗动物似乎是充满活力和健康的(长达4个月)，而未经治疗的小鼠则均体重减轻并且是奄奄一息的。平行地，NCI-H460(PRL-3阴性细胞)受体并不响应PRL-3抗体治疗(图9-C，c)。总而言之，这些结果进一步支持以下结论：PRL-3抗体治疗的效率紧密相关于癌细胞的PRL-3表达状态。我们说明了，小鼠和嵌合PRL-3抗体疗法的效率是相当(图9-D)。
实施例33.结果(部分E2)：在抗癌疗法中NK细胞是重要的
于是我们研究了天然杀伤(NK)细胞是否在PRL-3抗体疗法中发挥作用，这是因为NK细胞是一种类型的细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要成分。为了耗尽裸鼠的NK细胞，我们对裸鼠预注射抗去唾液酸GM-1抗体22。在这些注射GM 1的裸鼠中，进行我们的抗体疗法的上述程序。我们发现，在GM-1注射小鼠中治疗的功效基本上丧失(图13)。更糟糕的是，在肺、肝、肾上腺、睾丸、和骨中，这样的GM 1注射裸鼠显示比未注射裸鼠更加严重的肿瘤(黑色)承载负担，这表明，在我们的抗体疗法中，先天免疫系统是重要的。NK细胞已显示在人造血干细胞移植排斥中具有一定作用22，NK细胞的除去可以导致NK细胞活性的移植排斥的取消，从而导致肿瘤植入更成功，因此，就肿瘤生长而言，GM1注射'PRL-3治疗'小鼠不如GMl未注射'PRL-3未治疗'小鼠。
实施例34.结果(部分E2)：在介导PRL-3抗体的疗效中，B细胞可能是重要的
迄今为止，我们在T细胞缺陷裸鼠中进行PRL-3抗体疗法。为了解决B淋巴细胞在我们的抗体疗法模型中是否是关键的，我们接着在重症联合免疫缺陷(scid)小鼠中进行抗体疗法，上述小鼠缺乏功能性淋巴细胞，这是因为它们携带缺陷，其损害免疫球蛋白和T细胞抗原受体基因的分开的基因元件的重排，因而破坏B和T淋巴细胞祖细胞的分化和成熟。因而它们显示重症联合免疫缺陷，其影响B和T淋巴细胞，虽然它们具有正常的NK细胞、巨噬细胞、和粒细胞。对于HCT-1 16诱导的转移性肿瘤，PRL-3抗体治疗与未经治疗的小鼠的存活曲线的Kaplan-Meier分析表明，裸鼠寿命但不是scid小鼠的寿命的统计显著的(P<0.001)增加(图10A，a-b)。有趣的是，我们发现，相比于未经治疗的小鼠(11周)，治疗HCT-1 16注射裸鼠的中位存活时间增加45％(16周)。相比之下，在HCT-1 16注射scid小鼠的未治疗或治疗组中，我们没有观测到PRL-3抗体疗法的效应的差异，其显示类似的中位生存期(11周)。此外，利用类似的策略，我们采用F0PRL-3阳性癌细胞系来证实此发现。在FO注射裸鼠中(图10A，c-d)，PRL-3抗体治疗增加中位生存期47％(24天，对于治疗的，与17天，对于未治疗的)。一贯地，在未治疗或治疗FO注射scid小鼠中，抗体没有效应，其中两组显示类似的中位寿命(～17天)。机制是与抗体种类无关的，这是因为利用小鼠或嵌合PRL-3抗体获得了类似的结果(图10B，a-d)。共同地，来自这些基因小鼠模型的结果表明，PRL-3抗体相对于转移性肿瘤形成的功效取决于宿主B细胞但不取决于T细胞。我们表明，不同于抗体生产，B细胞可以具有另外的功能来分泌未知的因子，其可以促进抗体的作用。确实，我们的初步数据表明，B细胞可以分泌这样的因子，其可以促进癌细胞的抗体摄取。当在来自人B细胞的培养上清存在中进行测定时，我们观测到，在PRL-3阳性F0细胞中，抗体的内在化的大幅度增加。平行地，PRL-3空(null)F10细胞不能具有(harbor)任何抗体：存在B细胞条件培养基或存在活B细胞(数据未示出)。
实施例35.结果(部分E2)：在细胞表面上PRL-3抗原是微不足道的
PRL-3抗体作用的可能机制可以是细胞表面抗原的结合，从而触发表达PRL-3的细胞的B细胞依赖性消除。然而，到目前为止，没有报告描述PRL-3的细胞表面定位。为了解决在细胞表面上PRL-3抗体结合它的抗原的可能性，我们使用常规用于细胞表面标记的FACS测定。作为阳性对照，过表达EGFR的人表皮样癌A431细胞系的抗EGFR抗体结合用于此测定。我们发现，在FACS测定中，用抗EGFR抗体来温育A431细胞引起明显的峰移(图11A，a)。然而，对于在有或没有抗PRL-3抗体的条件下温育的F0(PRL-3阳性)或F10(PRL-3阴性)细胞没有观测到峰移(图11A，b-c)。这些结果意味着，细胞表面PRL-3抗原，如果有的话，不大可能是抗体结合和摄取的主要原因。然而，因为免疫系统不断地抗争入侵者，如细菌和病毒，以及体内的癌细胞，所以可以破坏癌细胞并以某种方式将它们的细胞内蛋白暴露于免疫系统。如果是这样的话，则相同的可能性也可能适用于其它细胞内癌蛋白。
实施例36.结果(部分E2)：基于IVIS实时成像的工作模型
在我们的动物模型系统中，我们发现，在癌细胞注射3天以后，抗体疗法是无效的，这提示，最初的3天可以足以使癌细胞植入在新组织中。利用IVIS系统并通过标记的抗体-抗原结合来跟踪转移性肿瘤的部位，我们在这里提出了两个工作模型(图11A的B)，a.治疗的小鼠.1.在早期阶段，癌细胞处于聚簇状态，抗体的适时引入可以以某种方式捕捉在循环中、或在淋巴系统中的抗原特异性癌细胞，以及借助于淋巴细胞(如B、和NK细胞)并经由先天免疫系统，以破坏和除去这些癌细胞。2.逃逸的癌细胞将能够到达新器官以进行植入；因此，将抗体不断递送到循环是重要的以去掉这些早期肿瘤并防止它们进一步发展，从而从宿主免疫系统破坏和清除它们。3.在'治疗小鼠'中的早期肿瘤没有机会来充分发展肿瘤，因而是处于暴露于免疫系统的开放阶段。另外，相比于在较大肿瘤中，我们在小肿瘤(H&E肺切片)中发现更高的血管密度。因此，在'治疗小鼠'中，经由血液循环，荧光标记的抗体可以容易地接近转移性肺肿瘤。因此我们观测到强荧光标记的‘治疗’转移性肺。b.未经治疗的小鼠。已错过上述早期步骤；在宿主中未检查的癌细胞迅速倍增。大量癌细胞被未受控植入并具有足够的时间来发展微至大转移灶，积聚它们的领土，具有肿瘤边界'围栏'作为防御系统，并具有远离免疫系统的紧密阶段。此外，我们发现，在肿瘤的较大区域中更低的血管密度，不足的供血导致坏死(未示出)。因此，在'未经治疗的小鼠'中荧光标记的抗体不易经由血液供应来达到转移性肺肿瘤。因此，我们发现弱荧光标记的‘未治疗’转移性肺。
实施例30.讨论(部分E2)
在许多类型的人类癌症中PRL-3被上调。可以预见的是，在阻滞多种PRL-3相关癌症转移方面，PRL-3嵌合抗体将是有前途的治疗剂。我们希望开始致力于几种致命性恶性疾病(如肺癌和AML)，其经常在短时间范围内复发。因为这些癌症是攻击性的，所以容易观测到疗效，并且可以明确定义在治疗和未治疗患者之间的结果。尤其是，白血病细胞是可容易进入的并且直接接触在循环系统中的抗体。患有这些侵袭性癌症的末端患者更可能被招募到临床试验。有希望地，在这些实例中的成功可以影响借助于抗体疗法来靶向其它细胞内癌蛋白，其是翻译研究的重要领域并将提供对癌症患者的可行的替代治疗。
在本文提供的这些非常规调查结果后面的分子机制仍然是难以捉摸的并且正获得积极研究。目前，对我们而言，抗体如何体内破坏肿瘤仍然是'暗箱'。类似地，着眼于理解众所周知的抗HER2/neu抗体疗法的机制已经超过二十年，虽然抗HER2/neu抗体已在临床应用中用于治疗乳癌多年23。期待利用体外系统来阐明'暗箱'可能是不现实的，这是因为传统的体外细胞培养体系的主要考虑的因素是远远简化的，由于在培养箱中生长的单细胞类型的限制，其中通常使用补充有10％胎牛血清的培养基，而缺乏涉及的免疫系统，其不大可能能够实际模拟在100％天然血液循环和淋巴系统中多种类型的细胞和器官的体内复杂性。不管是什么机制，这项研究的中心部分在于，细胞内蛋白的抗体可以发挥治疗作用，并且更重要的是，效果是可重现的。如果我们可以在人类中看到在癌症治疗中可以具有巨大价值的相同疗效来支持未被发现的概念，那么抗体疗法可以用于靶向细胞内抗原。
然而，我们的理解在'暗箱'内的可能的事件的艰苦尝试使得我们能够依据此研究得到若干结论：
1.PRL-3抗体治疗紧密相关于癌细胞的PRL-3表达状态。我们表明，嵌合抗体确实可以成功地阻滞转移性肿瘤的形成，上述转移性肿瘤源自若干种癌细胞系(B 16F0、HCT-116、和A2780)，其表达内源性细胞内PRL-3磷酸酶。抑制是特异性的，这是因为抗体并不阻滞源自并不表达PRL-3的其它癌细胞系(B16F10、H460)的转移性肿瘤的形成。先前，我们已显示，小鼠PRL-3抗体并不抑制由CT26小鼠结肠细胞，另一种PRL-3阴性癌细胞系，形成的转移性肺肿瘤16。总而言之，数据支持以下想法：小鼠或嵌合PRL-3抗体治疗的效率紧密相关于癌细胞的PRL-3表达状态。如果癌细胞的转移性特性并不是由于PRL-3过表达(如B16F10、H460、CT26细胞)，则PRL-3mAb的给予不会阻滞由这些PRL-3阴性细胞形成的肿瘤。此外，我们先前'6已经表明，PRL-1mAb特异性地阻滞PRL-1(但不是PRL-3)转移性肿瘤；同时PRL-3mAb特异性地阻滞PRL-3(但不是PRL-1)转移性肿瘤，虽然PRL-1和PRL-3共享非常高的蛋白序列的同源性。这些结果意味着，PRL抗体疗法是高度针对它的抗原，而并不涉及与其它非特异性细胞表面蛋白的交叉反应性。
2.在'先天免疫系统'中的NK细胞涉及治疗。为了理解先天免疫系统是否涉及抗体疗法，我们经由尾静脉将GM1抗体静脉内注入裸鼠以耗尽NK细胞，这些NK细胞是一种类型的细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要成分。我们发现，在没有NK细胞的情况下，抗PRL-3抗体并没有表现出疗效。此外，肿瘤植入被显著增强(图13)，这表明，NK细胞通常在针对外源细胞的植入的移植物排斥反应中发挥关键作用。先前，越来越多的证据提示，NK细胞在早期肿瘤的破坏中发挥重要作用24。
3.ADCC也可以涉及治疗。抗体疗法的最好表征的机制是抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。在ADCC中，抗体结合于特异性细胞表面抗原并触发Fc介导的免疫反应，其涉及细胞毒性CD8T细胞、补体激活、和/或NK细胞活性。在PRL-3阳性F0细胞和PRL-3阴性Fl0细胞中，在我们的PRL-3细胞表面抗原的FACS分析中，虽然我们没有观测到任何峰移，但我们不能排除以下可能性：这些癌细胞是在异常炎症压力下，其可能引起癌细胞的破坏以释放和暴露它们的细胞内蛋白，从而受到抗体的攻击，以及以某种方式触发特异性免疫反应，从而导致淋巴细胞除去这些癌细胞。可替换地，在体内，癌细胞是在缺氧应激和血清剥夺(serumdeprivation)的条件下，其阻止在G]和Go期的细胞25。有可能，这些条件可能引起细胞内抗原的释放，从而由抗体来识别。假如这样的话，其它细胞内癌蛋白也可以遇到类似的情况，因此借助于抗体疗法，可以类似地靶向它们。
4.'适应性免疫系统'(IgM和/或B细胞)在mAb疗效中是重要的。我们采用无胸腺裸鼠和免疫缺陷scid小鼠用于肿瘤减少实验并仅在裸鼠但不在scid小鼠中取得疗效。在裸鼠和scid小鼠之间的主要差异在于，裸鼠是T细胞缺陷的，但具有功能性IgM抗体和B细胞，而scid小鼠则没有功能性适应性免疫系统，其包括B细胞、T细胞、以及IgM和其它抗体。裸鼠和scid小鼠均具有完整的先天免疫系统，包括NK细胞和补体活性，但仅在裸鼠(但不在scid小鼠)中看到的阳性反应表明，成熟B细胞(但不是T细胞)，以及或许IgM/血清抗体，是重要的。当将抗体外源性引入小鼠时，假设需要用于抗转移性PRL-3抗体活性的B细胞，一种在抗体反应中用于B细胞的替代作用，可能通过分泌未识别的因子，其调节用于宿主反应的任何给定抗体。共同地，我们强调的是，先天性和获得性免疫系统的复杂的相互作用对于靶向细胞内PRL-3癌蛋白的嵌合抗体的抗癌功效是关键的。
5.借助于抗体疗法，并不能靶向所有细胞内癌蛋白。所期望的抗癌症治疗剂应特异性地靶向癌细胞，同时不伤害正常组织。应当强调的是，在裸鼠中PRL-3嵌合抗体疗法几乎没有可检测到的副作用，这是因为PRL-3在正常组织中的表达并不是无处不在的。我们说明了，仅在几种器官如脾、脑、和胰腺中检测到PRL-3蛋白(图14-A)。相比之下，PRL-2广泛表达在大多数小鼠组织中(图14-B)。如所预料的，对于表达PRL-2的癌症的PRL-2抗体疗法是不成功的(图14-C)。相比于未经治疗的小鼠，PRL-2抗体治疗小鼠早1周死亡或显示更糟结果，其可能是由于在大多数小鼠组织中PRL-2的普遍存在的表达，这表明以下可能性：PRL-2抗体可能攻击正常组织以造成这种不期望的副作用。结果表明，良好的治疗靶应更特异性地针对肿瘤抗原，而不伤害宿主正常组织。
6.相对于细胞内癌蛋白的抗体疗法是临床相关的。为了产生用于治疗的非常侵袭性癌症模型，我们将1百万个癌细胞直接注入裸鼠的循环；在裸鼠中的总血容量是8％的其体重(～19g的8％＝1.5ml)。在人(50kg)中的总血容量是约4.7升。如果将1百万个癌细胞注入裸鼠的-1.5ml血液循环，其相当于在男人的～4.7升血液中3133(4.7升/1.5ml)百万个癌细胞。甚至在癌细胞注射3天以后，通过开始抗体(静脉内注入尾静脉)治疗就获得显著的疗效，这表明上述治疗是令人感兴趣地有效的。如果我们在治疗的患者中可以实现类似于小鼠系统的寿命延长，则就总寿命和延长的寿命而言它将相当于在人类中的数年。从这些临床前研究到现实，我们预计，嵌合抗体的几次注射对于降低复发率是非常关键的，这是因为，在手术清除可见的PRL-3相关实体瘤以后，PRL-3抗体将清除循环的癌细胞26或去掉看不见的早期肿瘤。
为此，在PRL-3抗体疗法以后，在裸鼠中，任何可观测到的副作用的缺乏进一步暗示它的潜在的临床益处。我们的数据提示，重新评估一系列的肿瘤特异性细胞内癌蛋白作为用于抗癌mAb治疗的可能的靶，从而实现这些'魔术子弹'的全部潜力。
实施例38.参考文献(部分E2)
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实施例部分E3(实施例39).借助于VHZ对C57BL6小鼠的免疫以及监测肿瘤发展
实施例39：部分E3：借助于VHZ对C57BL6小鼠的免疫以及监测肿瘤发展
通过腹膜内注射总体积为200ml的弗氏佐剂：20mg的VHZ抗原，在100ml盐水中，并混合100ml完全佐剂(Cat#77140,Pierce)，来免疫8周龄C57BL6小鼠。
接下来的两次免疫是注射总体积为200ml的佐剂：20mg的VHZ抗原，在100ml盐水中，并混合100ml不完全佐剂(Cat#77145,Pierce)。
每2周给予第二次和第三次注射，并在肝素涂层毛细管中收集100-200ml的尾部出血。
血浆制备自血液样品并通过ELISA来测量抗体滴定度。
先前描述了ELISA的详细步骤。
选择在它们的血清中具有高滴定度的VHZ抗体的小鼠并侧尾静脉注射1x106个表达VHZ的癌细胞。
结果示于图15。图15示出，接种有VHZ抗原的小鼠可以预防表达VHZ的肿瘤。在本研究中，未接种疫苗小鼠作为阴性对照。
实施例部分E4(实施例40、41、42)
实施例40：部分E4：借助于Her2/neu肽片段进行的免疫
通常，疫苗相关于传染病，但我们的免疫系统还能够对抗癌细胞。因此，诱导相对于癌蛋白的宿主免疫性将是一种范式转变来最大限度地发挥我们的免疫系统以对抗癌细胞，从而获得治疗效果。多种蛋白质/因子可以引起正常细胞变成癌性的。然而，如果我们能够确定它们的至少一种(没有必要所有)，则我们可以用它的特异性抗体来靶向上述蛋白以杀伤表达上述特定蛋白的癌细胞。虽然，接受‘癌蛋白’用于接种疫苗的想法，人们可能会感到不舒服，但值得一提的是，在本研究中，用作抗原的纯化的癌蛋白它们自己不可能是致癌的，这是因为它们并不位于它们的天然的亚细胞位置。因此，它们不能与它们的天然的邻近配偶体相互作用来诱发途径特异性反应以驱动肿瘤发生。"癌蛋白"的这些纯化形式已经失去了它们的特定的细胞内的时空定位，因而它们仅是蛋白质。然而，更为保守的方式将是使用特定的肽抗原(部分癌蛋白)来实现类似的治疗效果。基于表位的肽(或片段)接种疫苗将是更加特异性的并较少与同源蛋白交叉反应以减少副作用。
在本研究中，我们使用4个Her2片段(参见图16)：
1.Her2细胞外片段(Her2外-)
2.Her2细胞内片段(Her2内-)
3.Her2C端片段(Her2C端)
4.Her2a短肽(Her2肽)
如图17所示，用Her2片段免疫的小鼠可以抑制由B16F0黑素瘤癌细胞形成的表达Her2的肿瘤的形成。在第16周，经由尾静脉，用1百万个B16F0癌细胞来激发未免疫、Her2内免疫、或Her2外免疫小鼠、以及Her2C端免疫小鼠。在癌细胞注射～17天以后，检查所有器官并拍照片以显示转移性肿瘤的形态。如图17(c，上图)所示，ELISA分析确认，Her2片段免疫小鼠在它们的血清中具有高水平的Her2抗体。如图17(c，下图)所示，计数来自每只小鼠的肺肿瘤(黑色肿瘤，在B中，表示B16F0黑素瘤细胞)的总数。
如图18所示，用Her2a短肽免疫的小鼠可以抑制由B16F0黑素瘤癌细胞形成的表达Her2的肿瘤的形成。在第16周，经由尾静脉，用1百万个B16F0癌细胞来激发Her2短肽免疫、Her2外免疫(用Her2-细胞外片段免疫的)、和未免疫小鼠。在癌细胞注射～17天以后，检查所有器官并拍照片以显示转移性肿瘤的形态。确认ELISA分析以显示，Her2短肽免疫、Her2外片段免疫(但不是未免疫)小鼠在它们的血清中具有高水平的Her2抗体(参见C，上部)。在下部的C中示出来自每只小鼠的肺肿瘤的总数。
实施例41：部分E4：用mT癌蛋白的片段对MMTV-PymT转基因小鼠的免疫
为了应用利用靶向肽接种疫苗的一般设想，再一次，我们检查了第二肿瘤模型，MMTV-PymT转基因(TG)小鼠自发性肿瘤模型，其携带mT细胞内DNA病毒蛋白并在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子/增强子的转录调控下，作为癌基因诱导的乳腺肿瘤发生的模型(9)。在3月龄时，所有雌性携带者(基因型+/-)发展可触知的乳腺肿瘤(腺癌)。在乳腺中，在高水平下，检测到mT表达，并且mT癌基因的表达对于乳腺上皮细胞转化是足够的(10)。癌症研究团体已广泛使用这些TG小鼠作为良好的自发性肿瘤模型几十年(10,18)。
接种有mT肽的MMTV-PymT TG年轻雌性(参见图16)减少了乳腺肿瘤的形成。相比于GST-免疫小鼠(不相关的免疫小鼠作为阴性对照)，mT肽免疫小鼠显示肿瘤的显著抑制，如图19所示，在MMTV-PymT转基因小鼠的模型中，mT癌蛋白的小肽有效地预防乳腺肿瘤进展。
实施例42：部分E4：用雌激素受体的片段对MMTV-PymT转基因小鼠的免疫
我们进一步检查了上述MMTV-PymT转基因(TG)小鼠自发性肿瘤模型。在m-T小鼠，以及尤其是在乳腺组织中，雌激素受体以高水平被表达。
MMTV-PymT TG年轻雌性接种有ER-红色和ER-紫色肽(参见图20)，其是雌激素受体的片段。如图21所示，相比于GST-免疫小鼠(不相关的免疫小鼠作为阴性对照)，ER-红色和ER-紫色免疫小鼠均显示肿瘤的显著消退。在MMTV-PymT转基因小鼠的模型中，ER的小肽有效地预防乳腺肿瘤进展。
每周，MMTV-PymT小鼠被注射ERa-mAb，时间为13周。相比于未经治疗的小鼠，治疗小鼠显示乳腺肿瘤重量的统计上显著的减少(参见图22)。
实施例43：部分E4：用HBV-X蛋白片段对小鼠的免疫
我们正在研究，乙型肝炎X蛋白是否可以用来治疗肝癌。HBV X蛋白是位于感染细胞的细胞核中。
检查了表达X蛋白的肝癌细胞系的图片，检查是针对它们体内形成肿瘤的能力。使用具有最高肿瘤形成能力的细胞系。
小鼠被注射抗X蛋白抗体以研究抗X蛋白抗体阻滞来自表达X蛋白的肝癌细胞的肿瘤形成的能力。按照上文概述的协议，将抗X蛋白抗体给予小鼠。
小鼠被注射X蛋白和X蛋白片段(参见图20)以触发宿主免疫系统来产生相对于X蛋白的抗体，从而预防表达X蛋白的肿瘤的形成。使用如上所述的接种疫苗协议。
自发性肝细胞癌(HCC)小鼠模型，其模拟人肝癌发展，也可以用来检查抗X蛋白抗体、X蛋白和X蛋白片段接种疫苗对肝细胞癌的影响。在信号通路中讨论了涉及HCC发展的信号通路，以及肝细胞癌的治疗讨论于Whittaker S,Marais R,Zhu AX.The role ofsignaling pathways in the development and treatment of hepatocellularcarcinoma.Oncogene.2010；29:4989-5005。
实施例44：部分E4：讨论
在肿瘤形成期间特异性地被上调但不良或不表达在宿主组织中的基因特别有希望作为肿瘤特异性靶。对于显示基因连锁的癌症，用抗原(基于表位的肽疫苗)，其相关于家族性癌症，对有免疫能力的年轻易感家族成员的免疫，可以引发相对于上述癌蛋白的免疫系统。然后，这些内源性刺激的抗体可以潜在地对抗表达特定癌蛋白的癌细胞。
本研究提示，可以将相对于癌症的基于抗体的疗法和接种疫苗扩展到各种各样的细胞内癌蛋白作为治疗靶。以前被认为是通过治疗性抗体或接种疫苗不可靶向的全部类别的细胞内癌蛋白现在可以扩大用于定制的癌症疗法的范围以及迎来癌症疫苗的新时代。我们预计，使用细胞内自体抗原的一个潜在的优势在于，它们比胞外自体抗原可以具有激起免疫反应的更好的机会，这是因为靶向胞外自体抗原的免疫细胞通常在发展期间被消除。我们发现，相比于外源递送抗体，抗原诱导的抗体疗法可以实现类似的抗肿瘤治疗功效。由于现有的常规临床抗体疗法是昂贵的，所以接种疫苗可以是更有用的和经济的方式来诱导高滴定度的抗原诱导的抗体。“癌症接种疫苗”的这种设想是有希望的和具有挑战性的。
这项研究表明，相对于乙型肝炎病毒(HBV)蛋白(如HBV X蛋白，其定位于感染细胞的细胞核内)(Whittaker et al；Oncogene 29；4989-5005(2010))的抗体可以用作用于肝细胞癌(HCC)的治疗性细胞内靶，因为大多数HCC相关于HBV感染，所以靶向病毒蛋白的抗体将特异性地破坏病毒感染细胞但不伤害正常细胞。类似地，对于由雌激素受体(ER)的过表达引起的乳癌，相对于ER的抗体或使用ER片段的接种疫苗可以用来预防扩散。这特别可用来靶向ER阳性乳癌患者，而不管Her2或其它蛋白的表达。
在未来癌症治疗中，一种潜在方案可以是除去/活检原发性肿瘤，利用免疫组化法来确定至少一种表达抗原的肿瘤，然后给予相对于特异性肿瘤标记物的抗体或治疗性疫苗，其刺激相对于它的抗体。对于具有癌症的强家族史的患者，用相关于家族性癌症的抗原对年轻易感家族成员的免疫也可以引发相对于表达上述抗原的肿瘤细胞的免疫系统。如果研究无数的先前未开发的候选靶蛋白，则定制的个性化癌症疗法的新时代将很快成为现实。
虽然在我们的非传统研究结果背后的分子机制仍然是难以捉摸的并且需要解释，但可以设想抗体作用的若干可能的机制(图22)。首先(模型A)，抗体可以潜在地进入表达PRL-3的细胞以靶向细胞内PRL-3并中和它的功能。我们观测到，约10％的表达PRL-3的癌细胞可以摄取在培养物中的抗体，并且在血清饥饿以后这种摄取增强6倍(Guo et al.,Cancer Therapy 2008)。血清饥饿用来阻止在G1和G0期的细胞(Cooper et al.,FASEBJ.2003；17:333-340)。有可能的是，细胞周期的特定期(也许G1-G0)可有助于细胞摄取抗体的能力。在体内，在缺氧应激和血清剥夺的条件下，癌细胞可以增强癌细胞接纳抗体的能力。据报道，通过表面Fc受体，抗体可以被纳入活人单核细胞(Alarcon-Segovia Nature1978:271；67-69)。我们发现，如果NH4Cl阻断胞吞作用或当细胞是温育的小鼠细胞时(未发表的数据)，则抗体摄取的现象被取消，这提示，最有可能，这些抗体结合于细胞表面蛋白，接着胞吞作用或胞饮作用。在内吞室中以后，抗体可以被释放到胞质溶胶。
其次(模型B)，通过非常规分泌(24)，一些细胞内抗原可以被外化和展示在癌细胞的表面上，使得抗体可以结合和触发免疫反应如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
第三(模型C)，可以通过主要组织相容性(MHC)I类分子来呈递细胞内靶的蛋白水解片段以吸引细胞毒T细胞(CTL)，从而介导癌细胞的细胞介导的溶解。另外，由于坏死或癌细胞裂解，小部分的细胞内抗原被释放，从而导致在肿瘤内的抗原-抗体复合物并刺激局部炎症反应以吸引免疫细胞靶向在肿瘤内的邻近有活力的癌细胞。最可能的机制可以是若干模式的组合，可能包括补体介导的事件，其实际上涉及相对于细胞内癌蛋白实现抗体的最终的治疗结果。目前，抗体如何体内破坏肿瘤的理解仍然是“暗箱”。这类似于抗HER2/neu抗体治疗机制；它已经超过二十年并且我们仍然不充分了解它的机制，即使上述抗体已临床使用多年来治疗乳腺癌(Hüsemann et al.,Cancer Cell 2008；13:58-68)。
利用体外细胞培养体系来阐明或重新组合体内“暗箱”可能是不现实的，这是因为传统的体外细胞培养体系是过度简化的。在培养箱中生长的单细胞类型存在限制，其通常使用补充有10％(因此缺少90％)胎牛血清并且不参与免疫系统的培养基。体外系统还不可能实际模拟多种类型的细胞和器官的体内复杂性，其协调100％天然血液循环和淋巴系统。不管使用的是什么机制，本研究的核心发现是，相对于细胞内蛋白的抗体可以发挥治疗作用。因为抗体对细胞内蛋白的疗效是显著的和可重复的，所以基本机制的不完全理解不应阻碍未来对此新类疗法的研究。
实施例45：借助于围绕致癌突变设计的癌肽进行的免疫
利用接种疫苗协议，用PRL-3合成肽免疫的C57BL/6小鼠示于图24-B。合成肽包含两种不同的肽，完整PRL-3蛋白的两个片段，并用GGSG接头(粗体表示)连接，以及具有序列EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC-KLH。如图24-C所示，免疫导致产生突变肽特异性抗体。
在免疫以后，用表达PRL-3靶蛋白的B16F0细胞来激发小鼠(参见图24-A)。相比于 未免疫的对照小鼠，或用GST免疫的对照小鼠，免疫小鼠能够阻滞肿瘤形成(参见图24-D)。
在另一项实验中，用B16F10细胞来激发C57BL6小鼠。不同于B16F0细胞，B16F10细 胞并不表达PRL-3。用B16F10细胞激发的小鼠不能阻滞肿瘤形成，这表明免疫会诱导特异性 免疫反应。
实施例44：相对于癌蛋白的突变肽接种疫苗
虽然许多人肿瘤细胞系携带突变癌蛋白，但不可能将这些突变癌蛋白引入野生型小鼠，这是因为小鼠不能耐受人癌细胞，并由于产生的强免疫反应而死亡。
相反地，仅有限数目的小鼠癌细胞系携带可用于小鼠疫苗模型的突变癌蛋白。我们仅确定一种小鼠结肠癌细胞系，CT26，其携带Ras(G12D)突变。此细胞系能够在Balb/c小鼠中诱导肿瘤。
在本实验中使用的免疫和激发协议示于图26-A。
用肽，该肽对应于Ras癌蛋白的区，其包含G12D突变(CMTEYKLVVVGADGVGKSALT)，对Balb/c小鼠进行的免疫能够触发宿主生产抗体，其相对于在靶蛋白中表达特定点突变的肿瘤(参见图26-B)。
在肿瘤发生研究中，对免疫小鼠注射CT26小鼠细胞系。在Balbc小鼠中，免疫能够预防CT-26肿瘤形成(图26-C)。
抗体疗法是昂贵的；接种疫苗可以是更有用的和经济的方式来诱导高滴定度的抗原诱导的抗体。“癌症接种疫苗”的这种设想是有希望的和具有挑战性的。
在本文件中提及的每个申请和专利、和在每个上述申请和专利中引用或参考的每个文献，包括在每个申请和专利("申请引用文件")的执行期间，以及用于在每个申请和专利以及在任何申请引用文件中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或产品目录，以引用方式结合于本文。此外，在本文中引用的所有文件，和在在本文中引用的文件中引用或参考的所有文件，以及在本文中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或产品目录，以引用方式结合于本文。
所描述的本发明的方法和系统的各种改进和变化，对于本领域技术人员而言，将是显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。虽然，已连同具体的优选实施方式一起描述了本发明，但应当理解的是，如要求的本发明不应不适当地被限于这样的具体实施方式。确实，所描述的用于实施本发明的方式的各种改进，其对于分子生物学或相关领域的技术人员而言是显而易见的，旨在落在权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种多肽在制备用于通过在需要其的主体中刺激抗细胞内癌蛋白抗体产生而治疗或预防癌症的药物中的应用，所述多肽是细胞内癌蛋白的片段，其中，所述片段选自以下各项组成的组：
a)PRL3肽：EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC；
b)Her2短肽：VHHRHRSSSTRSGGGDLT；
c)Her2内肽：THQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM；
d)Her2 C端肽：ENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDRDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV；
e)Her2外肽：ITGPLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALI；
f)HBV-X肽：FKDWEELGEEIRLKVFVLGGC；
g)ER肽：CGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRE；
h)ER肽：LKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLC；或
i)Ras肽：CMTEYKLVVVGADGVGKSALT；
其中，片段a)至e)用于制备用于治疗或预防黑素瘤的药物，片段f)用于制备用于治疗或预防肝癌的药物，片段g)和h)用于制备用于治疗或预防乳癌的药物，以及片段i)用于制备用于治疗或预防结肠癌的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述治疗包括给予多个片段。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述治疗包括给予来自相同癌蛋白的多个片段。
4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述治疗包括给予来自两种或更多种癌蛋白的多个片段。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物是用于预防或减少癌症转移的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述主体患有表达所述细胞内癌蛋白的原发性癌症。
7.细胞内癌蛋白的片段在制备用于在癌症患者中通过刺激抗细胞内癌蛋白抗体产生而预防癌症转移的药物中的应用，
其中，所述片段选自以下各项组成的组：
a)PRL3肽：EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC；
b)Her2短肽：VHHRHRSSSTRSGGGDLT；
c)Her2内肽：THQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM；
d)Her2 C端肽：ENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDRDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV；
e)Her2外肽：ITGPLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALI；
f)HBV-X肽：FKDWEELGEEIRLKVFVLGGC；
g)ER肽：CGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRE；
h)ER肽：LKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLC；或
i)Ras肽：CMTEYKLVVVGADGVGKSALT；
其中，片段a)至e)用于制备用于在黑素瘤患者中治疗或预防转移的药物，片段f)用于制备用于在肝癌患者中治疗或预防转移的药物，片段g)和h)用于制备用于在乳癌患者中治疗或预防转移的药物，以及片段i)用于制备用于在结肠癌患者中治疗或预防转移的药物。
8.细胞内癌蛋白的片段在制备用于在患者中通过刺激抗细胞内癌蛋白抗体产生而治疗或预防癌症的药物中的应用，
其中，所述片段选自以下各项组成的组：
a)PRL3肽：EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC；
b)Her2短肽：VHHRHRSSSTRSGGGDLT；
c)Her2内肽：THQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM；
d)Her2 C端肽：ENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDRDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV；
e)Her2外肽：ITGPLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALI；
f)HBV-X肽：FKDWEELGEEIRLKVFVLGGC；
g)ER肽：CGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRE；
h)ER肽：LKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLC；或
i)Ras肽：CMTEYKLVVVGADGVGKSALT；
其中，片段a)至e)用于制备用于治疗或预防黑素瘤的药物，片段f)用于制备用于治疗或预防肝癌的药物，片段g)和h)用于制备用于治疗或预防乳癌的药物，以及片段i)用于制备用于治疗或预防结肠癌的药物。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，给予所述患者多个癌蛋白片段。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，在所述患者发展所述癌症以前，给予其所述细胞内癌蛋白片段。
11.根据权利要求7或8所述的应用，其中，给予所述患者进一步剂量的所述细胞内癌蛋白片段。
12.根据权利要求8所述的应用，其中，通过评估在家族成员中所述癌症的患病率，将所述患者识别为可能患有与细胞内癌蛋白相关的癌症。
13.根据权利要求1、7或8中任一项所述的应用，其中，所述细胞内癌蛋白包括细胞质或核癌蛋白。
14.根据权利要求1、7或8中任一项所述的应用，其中，所述癌症与所述细胞内癌蛋白的过表达相关或者起因于所述细胞内癌蛋白的过表达。
15.一种药物组合物在制备用于通过在需要其的主体中刺激抗细胞内癌蛋白抗体产生而治疗或预防癌症的药物中的应用，所述药物组合物包含细胞内癌蛋白片段，以及药用赋形剂、稀释剂或载体，其中，所述片段选自以下各项组成的组：
a)PRL3肽：EVTYDKTPLEKDGITVGGSGDPHTHKTRC；
b)Her2短肽：VHHRHRSSSTRSGGGDLT；
c)Her2内肽：THQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM；
d)Her2 C端肽：ENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDRDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV；
e)Her2外肽：ITGPLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALI；
f)HBV-X肽：FKDWEELGEEIRLKVFVLGGC；
g)ER肽：CGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRE；
h)ER肽：LKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLC；或
i)Ras肽：CMTEYKLVVVGADGVGKSALT；
其中，包含片段a)至e)的所述药物组合物用于制备用于治疗或预防黑素瘤的药物，包含片段f)的所述药物组合物用于制备用于治疗或预防肝癌的药物，包含片段g)和h)的所述药物组合物用于制备用于治疗或预防乳癌的药物，以及包含片段i)的所述药物组合物用于制备用于治疗或预防结肠癌的药物。
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