CN111393509B - 靶向特异性多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向特异性多肽，所述多肽的氨基酸序列由30～40个优选为33～36个氨基酸组成，所述氨基酸序列的C端的氨基酸序列为GRKKRRQRRR且所述氨基酸序列的N端由生物素标记。还提供了其应用。本发明所述的多肽是一种与高表达EZH2蛋白的肿瘤细胞相互作用的多肽，可显著降低EZH2蛋白的表达水平，从而诱导肿瘤细胞的死亡；本发明多肽可以作为细胞筛选、靶向治疗或辅助性治疗肿瘤的药物的潜力，为提高肿瘤的治疗效果提供可行的办法。

Description

靶向特异性多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向特异性多肽及其应用。
背景技术
近年来，肿瘤是全球范围内导致人类死亡的首要因素，已成为全球面临的严峻的健康问题。进一步探索与肿瘤发生、发展和治疗相关的分子标志物具有重要的意义。其中，促癌基因及抑癌基因表达水平的变化在肿瘤发生发展中至关重要。表观遗传修饰在不改变DNA序列的前提下，通过调节DNA甲基化、DNA去甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑等调控重要基因的表达水平。现有的研究表明，多梳组蛋白(polycomb group peoteins,PcGs)是一组重要的表观遗传调节剂，在细胞增殖、干细胞分化及基因异常表达导致的肿瘤细胞恶性转化等过程中发挥重要的作用。
EZH2(Enhancer of zeste homolog2)为多梳基因(polycomb group genes,PcG)蛋白家族的重要成员之一，在PcG基因家族中发挥着核心作用。PcG蛋白作为转录抑制因子直接调控与细胞增殖、分化、发育及干细胞自我更新相关的基因表达，在肿瘤发生发展中起着关键的调控作用。PcG蛋白构成不同的PRC(Polycomb Repressive Complex)蛋白质复合物，主要包括PRC1和PRC2。EZH2是组成PRC2蛋白复合物的一个催化亚基，具有组蛋白甲基转移酶活性。EZH2基因可通过对核小体组蛋白H3的第27位赖氨酸(H3K27)进行甲基化修饰，降低PRC2组蛋白甲基转移酶活性，沉默下游相关抑癌基因的表达，如P16、P21、P57等，进而促进了肿瘤的发生和发展的进程。现有的研究表明，相对于正常组织，EZH2在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中高表达，EZH2的过表达可以明显促进肿瘤细胞增殖并参与肿瘤的转移，EZH2的高表达与患者的不良预后密切相关。另一方面，EZH2蛋白的表达水平与肿瘤化疗耐药及放疗的敏感性密切相关。据研究发现，抑制或降低EZH2表达水平，能增强肺癌细胞及卵巢癌细胞对顺铂药物的敏感性，进而诱导细胞凋亡降低肿瘤细胞的增殖程度。因此，EZH2在肿瘤发生、发展及转移中发挥重要的作用，它有可能成为新的肿瘤临床诊疗的新靶点。
目前，靶向EZH2的药物开发主要为化学小分子类的酶抑制剂。其中DZNep是迄今被研究最多的一个PRC2抑制剂，它是一种非特异性EZH2抑制剂，它通过抑制S-腺苷高半胱氨酸导致EZH2甲基化被抑制从而表现出显著的抗肿瘤作用。但是此药物并不只针对EZH2一个蛋白，据报道，在体外肿瘤动物模型中DZNep既有抗肿瘤的功效又有明显的生物毒性；EPZ005687及GSK126可特异性地抑制EZH2，具有较高的选择性，GSK126是目前EZH2抑制剂中作用最明显的一个抑制剂，可显著性抑制体内外的肿瘤细胞的增殖；ZLD1039及EPZ6438是两种具有高度选择性，有效且可口服剂，可减少H3K27甲基化以上调乳腺癌中抑癌基因并抑制肿瘤生长及转移。另一类针对EZH2的药物开发策略是通过抑制EZH2与PRC2配合物之间的相互作用，进而抑制其酶的活性同时减少药物毒性。其中小分子抑制剂阿斯咪唑、CPI-125及SAH-EZH2肽通过破坏EZH2与PRC2配合物间的相互作用从而抑制H3K27me3的活性并降低EZH2蛋白表达水平，进而导致肿瘤细胞生长的阻滞。此外，另一类抑制EZH2蛋白功能的策略是依赖泛素化降解过程促进EZH2的降解，进而抑制肿瘤细胞的增殖；其中GNA022是一种藤黄酸衍生物，它可以特异性共价结合EZH2-SET结构域中的Cys668，随后触发了与Hsp70相互作用的CHIP蛋白介导的EZH2泛素化降解，最终增强EZH2降解并抑制肿瘤的增殖。因此，EZH2是肿瘤治疗中十分重要的靶点之一，虽然研究显示针对组蛋白甲基化的治疗可能成为临床治疗的潜在靶点，但目前还没有临床可用的靶向药。靶向EZH2的药物仍然处在临床前或临床试验研究阶段，仍需研究开发特异性强，毒副作用小的作用EZH2蛋白高表达的肿瘤细胞。
由于多肽易于合成，在人体内易于代谢并且不会带来明显的毒副作用和严重的免疫反应，因此，研发一种与高表达EZH2蛋白的肿瘤细胞相互作用的多肽，为肿瘤等疾病的研究和治疗提供可能的新技术和新方法，是目前亟待解决的问题。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种靶向特异性多肽及其应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“EZH2”是指：Enhancer of zeste homolog2，多梳基因(polycomb groupgenes,PcG)蛋白之一。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种靶向特异性多肽，所述多肽的氨基酸序列由30～40个优选为33～36个氨基酸组成，所述氨基酸序列的C端的氨基酸序列为GRKKRRQRRR且所述氨基酸序列的N端由生物素标记。
根据本发明第一方面的多肽，其中，所述多肽的氨基酸序列为SQE ID NO.1～12中任一项所示的序列。
根据本发明第一方面的多肽，其中，所述多肽可以特异性地与高表达EZH2的肿瘤细胞结合。
本发明的第二方面提供了一种DNA片段，所述DNA片段包括编码如第一方面所述的多肽的核苷酸序列。
本发明的第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包括至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
本发明的第四方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括如第三方面所述的重组载体。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
1)药学上可接受的载体，和
2)如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞。
根据本发明第五方面的药物组合物，其中，所述药物组合物为用于细胞筛选、靶向治疗和/或辅助性治疗肿瘤的药物。
本发明的第六方面提供了第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞在制备抑制肿瘤细胞活性的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞。
根据本发明第六方面的应用，其中，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：肺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞；
优选地，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：人源小细胞肺癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、人乳腺癌细胞系、人胰腺癌细胞系。
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向特异性的多肽及其应用，该多肽可以作用EZH2高表达的肿瘤细胞，进而抑制肿瘤细胞的活性。
本发明提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-12所示的氨基酸序列。
本发明针对EZH2高表达的肿瘤细胞，发现了一种肿瘤靶向特异性的多肽，该多肽可以特异性地与高表达EZH2的肿瘤细胞结合，且所述多肽能够抑制肿瘤细胞的活性。
本发明提供了一种DNA片段，其包含编码所述多肽的核苷酸序列。
本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的所述的DNA片段。
本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有所述的表达载体。
本方面提供了所述的多肽，所述的核苷酸序列，所述的重组载体或所述的重组细胞，可以特异性地与高表达EZH2的细胞结合。
优选地，所述肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞，所述的肿瘤细胞为肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等；
优选地，所述肿瘤细胞为人源小细胞肺癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、人乳腺癌细胞系及人胰腺癌细胞系。
本方面提供了所述的多肽，所述的核苷酸序列，所述的重组载体或所述的重组细胞，可以抑制肿瘤细胞的活性并降解EZH2蛋白。
优选地，所述肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞，所述的肿瘤细胞为肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等；
优选地，所述肿瘤细胞为人源小细胞肺癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、人乳腺癌细胞系及人胰腺癌细胞系。
在本发明的一个具体实施方式中，采用CCK8方法测定肿瘤细胞的活力。
在本发明的一个具体实施例中，采用western blot的方法检测EZH2蛋白的降解程度。
本发明提供的多肽可以特异性结合高表达EZH2的肿瘤细胞，并能抑制肿瘤细胞的活性及降解EZH2蛋白，在肿瘤靶向治疗中具有重要的意义。
本发明的靶向特异性多肽可以具有但不限于以下有益效果：
(1)本发明所述的多肽是一种与高表达EZH2蛋白的肿瘤细胞相互作用的多肽，可显著降低EZH2蛋白的表达水平，从而诱导肿瘤细胞的死亡；
(2)本发明多肽可以作为细胞筛选、靶向治疗或辅助性治疗肿瘤的药物的潜力，为提高肿瘤的治疗效果提供可行的办法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明多肽对人源小细胞肺癌细胞系H446的毒性研究。
图2示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：3(EZH2-10-3)对人源小细胞肺癌细胞系H446的毒性研究。
图3示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：3(EZH2-10-3)对人源非小细胞肺癌细胞系A549的毒性研究。
图4示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：3(EZH2-10-3)对人源乳腺癌细胞系MDA-MB-231的毒性研究。
图5示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：3(EZH2-10-3)对人源胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的毒性研究。
图6示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：10(EZH2-10-10)对人源小细胞肺癌细胞系H446的毒性研究。
图7示出了本发明不同浓度多肽SEQ ID NO：10(EZH2-10-10)对人源非小细胞肺癌细胞系A549的毒性研究。
图8示出了本发多肽SEQ ID NO：10(EZH2-10-10)降解人源小细胞肺癌细胞系H446中EZH2蛋白。
图9示出了本发多肽SEQ ID NO：10(EZH2-10-10)降解人源非小细胞肺癌细胞系A549中EZH2蛋白。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
除非特别指明，以下实施例中所用的人小细胞肺癌细胞系H446、非小细胞肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MDA-MB-231及人源胰腺癌细胞系MIA PaCa-2均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
以下实施例中使用的试剂购买来源和仪器型号分别如下：
试剂购买来源：
PBS缓冲液、TBS缓冲液、1640培养基、胎牛血清、双抗均购自Thermo FisherScientific；
EZH2抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗及HRP标记的GAPDH抗体购自CellSignaling Technology；
CCK8试剂检测试剂盒购自Sigma；
仪器型号：
纯水仪(德国Merck Millipore，型号Milli-Q Integral3)；
离心机(北京雷勃尔离心机有限公司，型号LD5-2A)；
多功能酶标仪(美国Molecular Devices，型号SpectraMax i3)。
实施例1多肽的制备
靶向EZH2多肽的氨基酸序列为生物素标记的SEQ ID NO.1-12。
所述的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002430632900000061
Figure BDA0002430632900000071
上述按照设计的序列合成多肽(由安徽省国平药业有限公司合成，纯度为98％)，在实验前制成合适浓度的母液。
多肽的溶解：用PBS溶解多肽粉末至浓度为1mM的母液，保证多肽充分溶解，置于-20℃保存备用。
实施例2不同序列多肽(EZH2-10-1～EZH2-10-12)对H446细胞活性影响
以H446作为研究EZH2高表达的人源小细胞肺癌细胞系的模型细胞。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，向培养板孔中分别加入12条多肽(EZH2-10-1～EZH2-10-12)溶液，用无血清1640培养基稀释多肽，其浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、50μM及100μM，空白对照组只加入100μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育72h后，移除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL完全培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，在H446细胞中加入不同序列的多肽孵育后，细胞的存活率出现明显的差异，本发明不同序列多肽EZH2-10-1～EZH2-10-12均具有抗肿瘤活性。图1示出了其中多肽EZH2-10-3、EZH2-10-8、EZH2-10-10及EZH2-10-9的抗H446肿瘤细胞活性结果。
实施例3不同浓度EZH2-10-3多肽对H446细胞活性影响
考察不同浓度多肽EZH2-10-3对人源小细胞肺癌细胞系H446的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清1640培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液100μL，其浓度分别为0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、40μM及60μM，空白对照组只加入100μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育，24h及48h后移除上清，重新加入新鲜的多肽溶液。待多肽与细胞共同孵育72小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图2所示，与未经多肽处理的h446细胞相比，在H446细胞中加入0.01～60μM的EZH2-10-3多肽后，随着多肽的浓度增加，H446细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-3多肽能显著抑制小细胞肺癌细胞系H446的生长，其半数致死率(IC50)浓度值为10.9μM。
实施例4不同浓度EZH2-10-3多肽对A549细胞活性影响
考察不同浓度EZH2-10-3对人源非小细胞肺癌细胞系A549的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成7×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清1640培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液100μL，其浓度分别为0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、40μM及60μM，空白对照组只加入100μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育，24h及48h后移除上清，重新加入新鲜的多肽溶液。待多肽与细胞共同孵育72小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图3所示，与未经多肽处理的h446细胞相比，在A549细胞中加入0.01～60μM的EZH2-10-3多肽后，随着多肽的浓度增加，A549细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-3多肽能显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549的生长，其半数致死率(IC50)浓度值为4.05μM。
实施例5不同浓度EZH2-10-3多肽对MDA-MB-231细胞活性影响
考察不同浓度EZH2-10-3对人源乳腺癌细胞系MDA-MB-231的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清1640培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液100μL，其浓度分别为0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、40μM及60μM，空白对照组只加入100μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育，24h后移除上清，重新加入新鲜的多肽溶液。待多肽与细胞共同孵育48小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图4所示，与未经多肽处理的MDA-MB-231细胞相比，在MDA-MB-231细胞中加入0.01～60μM的EZH2-10-3多肽后，随着多肽的浓度增加，MDA-MB-231细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-3多肽能显著抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231的生长，其半数致死率(IC50)浓度值为19.2μM。
实施例6不同浓度EZH2-10-3多肽对MIA PaCa-2细胞活性影响
考察不同浓度EZH2-10-3对人源胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清DMEM培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液100μL，其浓度分别为0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、40μM及60μM，空白对照组只加入100μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育，24h及48h后移除上清，重新加入新鲜的多肽溶液。待多肽与细胞共同孵育48小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图5所示，与未经多肽处理的MIA PaCa-2细胞相比，在MIA PaCa-2细胞中加入0.01～60μM的EZH2-10-3多肽后，随着多肽的浓度增加，MIA PaCa-2细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-3多肽能显著抑制胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的生长，其半数致死率(IC50)浓度值为45.5μM。
实施例7不同浓度EZH2-10-10多肽对H446细胞活性影响
考察不同浓度EZH2-10-10对人源小细胞肺癌细胞系H446的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清1640培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液200μL，其浓度分别为1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、400nM、800nM、1μM及2μM，空白对照组只加入200μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育72小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图6所示，与未经多肽处理的h446细胞相比，在H446细胞中加入不同浓度的EZH2-10-10多肽后，随着多肽的浓度增加，H446细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-10多肽能显著抑制小细胞肺癌细胞H446的生长。
实施例8不同浓度EZH2-10-10多肽对A549细胞活性影响
考察不同浓度EZH2-10-10对人源非小细胞肺癌细胞系A549的细胞毒性影响。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成7×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，用无血清1640培养基稀释多肽，向培养板孔分别加入含不同浓度的EZH2-10-3多肽溶液200μL，其浓度分别为1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、400nM、800nM、1μM及2μM，空白对照组只加入200μL无血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育72小时后，吸除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图7所示，与未经多肽处理的A549细胞相比，在A549细胞中加入不同浓度的EZH2-10-10多肽后，随着多肽的浓度增加，A549细胞的存活率逐渐降低，说明EZH2-10-10多肽能显著抑制小细胞肺癌细胞A549的生长。
实施例9Western Blot方法检测EZH2-10-10多肽对H446细胞中EZH2蛋白的降解作 用
取对数生长期的H446细胞，胰酶消化后计数细胞，按每孔4×105细胞将H446细胞种于6孔板中，将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时。待细胞完全贴壁后，在孔板中加入用无血清1640培养基稀释EZH2-10-10多肽(1μM)2mL，分别在0h、24h、48及72h消化并收集细胞。将细胞用胰酶消化计数，1500rpm/min离心5分钟；用冷的PBS清洗细胞三次，每次1500rpm/min离心5min后，吸除上清，最终获得的细胞沉淀中加入蛋白提取液(按1×106细胞加入蛋白提取液100μL)，在冰上裂解细胞15min后于4℃和14000g下离心10min，吸取上清使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，然后分装保存于-80℃用于western blot的检测。取出同等质量的蛋白样品，加入5X蛋白上样缓冲液，置于95℃金属浴中10min使蛋白变性，将蛋白样品加到10％SDS-PAGE胶板的浓缩胶的样品槽里进行蛋白电泳，先恒压80V 20min，样品进入分离胶后恒压120V，直至溴酚蓝迁移至分离胶的下沿，使用PVDF膜将蛋白进行转膜，转膜条件为20V恒压在冰水浴中转膜1小时；将膜取出后，加入5％脱脂奶粉(含0.1％土温20的TBS溶液)室温下封闭2h，使用5％脱脂奶粉按1:1000稀释一抗EZH2抗体，将膜与一抗在4℃孵育过夜；使用TBST清洗膜3次，每次10min，然后与5％脱脂奶粉稀释的HRP标记的山羊抗图IgG二抗(1:3000)室温下在摇床上孵育2h，使用TBST清洗3次，每次10min。最后将ECL显色液与膜充分接触后，使用化学发光成像分析仪进行成像分析EZH2的表达。GAPDH作为内参蛋白。该实验结果表明，如图8所示，随着多肽孵育时间的延长，EZH2-10-10多肽可以明显降解H446细胞中EZH2蛋白的表达。
实施例10Western Blot方法检测EZH2-10-10多肽对A549细胞中EZH2蛋白的降解 作用
取对数生长期的A549细胞，胰酶消化后计数细胞，按每孔3×105细胞将A549细胞种于6孔板中，将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时。待细胞完全贴壁后，在孔板中加入用无血清1640培养基稀释EZH2-10-10多肽(1μM)2mL，分别在0h、24h、48及72h消化并收集细胞。将细胞用胰酶消化计数，1500rpm/min离心5分钟；用冷的PBS清洗细胞三次，每次1500rpm/min离心5min后，吸除上清，最终获得的细胞沉淀中加入蛋白提取液(按1×106细胞加入蛋白提取液100μL)，在冰上裂解细胞15min后于4℃和14000g下离心10min，吸取上清使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，然后分装保存于-80℃用于western blot的检测。取出同等质量的蛋白样品，加入5X蛋白上样缓冲液，置于95℃金属浴中10min使蛋白变性，将蛋白样品加到10％SDS-PAGE胶板的浓缩胶的样品槽里进行蛋白电泳，先恒压80V 20min，样品进入分离胶后恒压120V，直至溴酚蓝迁移至分离胶的下沿，使用PVDF膜将蛋白进行转膜，转膜条件为20V恒压在冰水浴中转膜1小时；将膜取出后，加入5％脱脂奶粉(含0.1％土温20的TBS溶液)室温下封闭2h，使用5％脱脂奶粉按1:1000稀释一抗EZH2抗体，将膜与一抗在4℃孵育过夜；使用TBST清洗膜3次，每次10min，然后与5％脱脂奶粉稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1:3000)室温下在摇床上孵育2h，使用TBST清洗3次，每次10min。最后将ECL显色液与膜充分接触后，使用化学发光成像分析仪进行成像分析EZH2的表达。GAPDH作为内参蛋白。该实验结果表明，如图9所示，随着多肽孵育时间的延长，EZH2-10-10多肽可以明显降解A549细胞中EZH2蛋白的表达。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 靶向特异性多肽及其应用
<130> YZDI-200025
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Asp Asp Met Asp Pro Asn Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Trp
1 5 10 15
Ser Gly Ala Arg Ala Ser Met Phe Asp Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
20 25 30
Gln Arg Arg Arg
35
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Asp Arg Arg Thr Ser Ser Ser Ser Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln
1 5 10 15
Thr Pro Ile Asp Met Asp Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Arg
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln Thr Pro Ile Asp Asp Asp Pro Asn
1 5 10 15
Arg Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln Thr Pro Asp Asp Met Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 5
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln Thr Pro Ile Asp Met Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Pro Arg Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 6
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Arg Arg Asn Asp Asp Cys Gln Thr Pro Ile Asp Met Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 7
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln Thr Pro Arg Asp Met Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 8
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Arg Ala Asn Ser Asp Cys Gln Thr Pro Ile Asp Asp Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Arg Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Ala Asn Ser Asp Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Asp Met Asp Pro
1 5 10 15
Asn Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
20 25 30
Gln Arg Arg Arg
35
<210> 10
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Asn Ser Asp Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Asp Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
20 25 30
Arg Arg Arg
35
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Gly Ser Gly Ser Asp Met Asp Pro
1 5 10 15
Asn Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
20 25 30
Gln Arg Arg Arg
35
<210> 12
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Met Asp Pro Asn Ile Arg Pro Pro Arg Asn Val Arg Ala Leu Ala
1 5 10 15
Pro Tyr Ile Pro Gly Ser Gly Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
20 25 30
Arg Arg

Claims (10)

1.一种靶向特异性多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列由30～40个氨基酸组成，所述氨基酸序列的C端的氨基酸序列为GRKKRRQRRR且所述氨基酸序列的N端由生物素标记；其中，
所述多肽的氨基酸序列为SQE ID NO.1～12中任一项所示的序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽可以特异性地与高表达EZH2的肿瘤细胞结合。
3.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括编码根据权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括至少一个拷贝的根据权利要求3所述的DNA片段。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括根据权利要求4所述的重组载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
1)药学上可接受的载体，和
2)根据权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的DNA片段、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为用于细胞筛选、靶向治疗和/或辅助性治疗肿瘤的药物；其中，所述肿瘤的细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞。
8.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的DNA片段、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组细胞在制备抑制肿瘤细胞活性的药物中的应用，其中，所述肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：肺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：人源小细胞肺癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、人乳腺癌细胞系、人胰腺癌细胞系。
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