CN111132992B - 基因表达抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含根据式(I)的氨基酸序列或由其组成的肽或其变体X1‑X2‑X3‑X4‑X5‑(A)m‑X6‑X7‑(X8)n‑C (I)，其中X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X6是C或R，X7是F或L，X8是W或A，以及m和n各自为0或1。
Description
技术领域
本发明涉及影响生物体、细胞或组织内核酸分子的转录和翻译的肽和化合物。
背景技术
真核细胞的基因组DNA位于细胞核中，并紧密包装成染色体。DNA转录为RNA发生在细胞核中，然后RNA被输出到细胞溶质中，其中蛋白质合成发生在核糖体处。相比之下，“外来”DNA或也称为染色体外DNA、外源DNA或异源DNA，被定义为非自身DNA，通常不存在于靶细胞中并且可以从细胞外部进入细胞。“外来”DNA分子可以是例如质粒-DNA、PCR产物、合成DNA、病毒或噬菌体DNA、细菌DNA或任何其它工程化DNA。RNA也可以是“外来”核酸，例如由RNA病毒提供。
非自身DNA(如“外来”DNA分子，例如来自病毒或细菌之间)的转移可发生在真核或原核靶细胞中，其中DNA分子进入细胞并可以被整合到宿主基因组，或将宿主细胞机构用于它的自身复制、转录和“外来”DNA编码的蛋白质翻译。“外来”DNA在进入靶细胞的细胞核之前，可以通过内吞作用或通过其它方式(例如包装在病毒中)被吸收，并以裸露或在病毒内的方式穿过细胞质。病毒DNA在细胞溶质中在细胞核进入位点处可以是非包装的。
在真核生物中，存在用于识别“外来”核酸的宿主细胞防御机制，包括模式识别受体，例如Toll样受体和其它核酸传感分子。这些机制代表导致针对病毒或细菌感染的第一反应以及后续事件级联的激活以消除感染的先天性免疫系统。
病毒感染的预防或治疗仍然是主要障碍。通过疫苗预防病毒感染仅限于特定病毒，而对已确立的病毒感染的治愈性治疗通常是不可能的。另外，病毒易于突变，因此可以逃脱已经确立的预防性或治愈性治疗。而且，仅对于某些病毒感染，可以将受感染个体内的病毒减少甚至消除的药物是可获得的。病毒需要宿主细胞供其自身复制。
例如，干扰疱疹病毒感染的方式是使用不同类型的抑制剂，例如核苷类似物阿昔洛韦或更昔洛韦、DNA聚合酶抑制剂例如膦甲酸钠、或引发酶/解旋酶抑制剂例如普里特利韦。其它抗病毒药包括进入抑制剂例如金刚烷胺或恩夫韦肽，或蛋白酶抑制剂，用于治疗流感或HIV。但是，没有可以区分基因组DNA和“外来”DNA的抑制剂。因此，病毒特异性基因表达的治疗可能是抑制宿主生物体内早期病毒基因表达和随后病毒复制的一种可能的干预方式。
发明内容
本发明的目的是提供能够抑制生物体中外来(即异源或外源)核酸分子，的转录和/或翻译，包括基因(抑制基因表达)的化合物。
该目的通过包含根据式I的氨基酸序列(SEQ ID No.1)的肽或由其组成的肽来实现。
X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-X6-X7-(X8)n-C (I)
其中，X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X6是C或R，X7是F或L，X8是W或A，以及m和n各自为0或1。
本发明还涉及一种肽化合物，包含至少一种肽，所述肽包含式I(SEQ ID No.1)或由其组成
X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-X6-X7-(X8)n-C (I)
其中X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X6是C或R，X7是F或L，X8是W或A，以及m和n各自为0或1。
出乎意料地发现，本发明的肽和肽化合物能够抑制细胞中外来/异源/外源核酸分子的转录和/或翻译和/或来自外来DNA分子的基因表达，同时不影响所述细胞中天然存在的细胞基因的表达。因此，这种抑制不具有或基本上不具有细胞毒性。
本发明的肽和化合物显著抑制或降低异源核酸分子在生物体(即活细胞)内翻译和/或转录的能力使得可以治疗和/或预防与外来核酸分子的翻译和/或转录相关的疾病。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物用于在治疗哺乳动物或人类个体中的病毒、细菌、寄生虫或真菌感染中使用。
本发明的另一方面涉及编码根据本发明的肽或化合物的核酸分子。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物用于抑制细胞中异源核酸分子的转录和/或翻译。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物用于阻止细菌细胞获得能够为所述细菌细胞提供抗生素抗性的基因或其功能片段的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物作为减毒活疫苗的添加剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物抑制或阻止病毒在细胞培养物中扩散的用途。
本发明的又一方面涉及本发明的肽和/或化合物抑制细菌的噬菌体感染的用途。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的肽和/或化合物定位真核细胞内的异源核酸分子的转录和/或翻译的用途。
附图说明
图1.肽I24对用编码这些蛋白质的质粒载体转染的细胞中荧光素酶水平的产生(a)和SEAP释放(b)的影响。当用编码p65 M2的质粒转染时，肽I24对表达p65突变体M2的影响(图1c)。当用编码GFP的质粒转染时，肽对GFP表达和GFP阳性细胞数量的影响(图1d，e)。
图2.当用在截短的IL-8启动子控制下驱动萤光素酶的质粒转染时，肽I24抑制萤光素酶的表达(a)，而不抑制IL-8的释放(b)。
图3.在用质粒以及肽I24转染后在指定时间点后分析的荧光素酶蛋白(a)和mRNA(b)的水平。
图4.当用同一质粒上包含这两种基因的质粒转染时，与早期SV40启动子控制下的新霉素抗性基因的mRNA水平相比，肽I24更有效地抑制CMV启动子控制下的萤光素酶的mRNA水平。
图5.肽I24在不同细胞系中抑制质粒编码的荧光素酶水平。
图6.瞬时转染编码萤光素酶的质粒和不同浓度的肽I24、TAT、TAT-I24和I24-二聚体后的萤光素酶蛋白水平(为更好分辨，两个轴均以对数刻度显示)。
图7.(a)在用融合肽TAT-I24处理的HEK293细胞中转导杆状病毒的萤光素酶基因表达的抑制(为了更好分辨，两个轴均以对数刻度显示)，(b)在分别用溶媒DMSO、融合肽TAT-I24或TAT与表达荧光素酶的杆状病毒处理细胞并用TNF-α刺激细胞中的萤光素酶和IL-8的mRNA水平(b)。
图8.TAT-I24抑制来自用编码荧光素酶和GFP的腺病毒颗粒感染的HEK293细胞的荧光素酶表达(a)。TAT-I24抑制荧光素酶、GFP和腺病毒编码的六邻体基因的mRNA水平(b)。TAT-I24抑制腺病毒颗粒的形成以及释放到感染细胞的上清液(c)。TAT-I24抑制腺病毒感染后96小时的细胞脱离(d)。
图9.TAT-I24抑制HEK293细胞中牛痘病毒的病毒基因表达(a)和复制(b，c)。
图10.TAT-I24抑制慢病毒的萤光素酶基因表达。
图11.在用质粒和I24同时转化的埃希氏大肠杆菌细胞中，菌落形成受到抑制。
图12.在存在肽I24下在质粒-DNA转化后4小时和6小时埃希氏大肠杆菌细胞中的质粒拷贝数(a)和β-内酰胺酶(bla)mRNA水平的分析。
具体实施方式
本发明涉及包含根据式I(SEQ ID No.1)的氨基酸序列或由其组成的肽或其变体
X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-X6-X7-(X8)n-C (I)
其中，X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X6是C或R，X7是F或L，X8是W或A，以及m和n各自为0或1。
如上所述，本发明的肽能够抑制细胞中外来/异源/外源核酸分子的转录和/或翻译和/或从外来DNA分子的基因表达，同时不影响所述细胞中天然存在的细胞基因的表达。
根据本发明的优选实施方案，本发明提供了一种肽，可以抑制从“外来”DNA的基因表达，而不影响编码蛋白的细胞基因组的基因表达。虽然当用在白细胞介素-8启动子控制下编码荧光素酶的质粒一同转染，并进一步用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行刺激时肽I24可抑制白细胞介素-8启动子控制下的荧光素酶表达，而TNF-α诱导的白细胞介素-8的内源水平仍不受影响。
如本文所用，“外来核酸分子”(即异源或外源核酸分子)是指不是天然存在于生物体或细胞中并且通常通过本领域已知的方法(包括细胞融合、病毒感染和本领域已知的其它常用方法(例如电穿孔))引入至该生物体或细胞中的核酸分子。
“外来”DNA的转移可以通过使用脂质体、非脂质体、电穿孔或本领域已知的其它转染方法转染真核细胞来进行，也可以通过自然转移机制，例如通过病毒或噬菌体感染、或细菌或其它生物体之间的DNA转移进行。还可以通过本领域已知的转化方法或通过自然转移例如水平基因转移将“外来”DNA转移至原核细胞。
“外来”核酸，染色体外、异源或外源核酸，通常不存在于靶细胞中，并且可以是质粒、PCR产物或任何其它合成的DNA或RNA，或包装在病毒或噬菌体中的或来源于生物体例如细菌、原生动物或真菌的核酸并且对靶细胞是“外来”的。可以通过化学或生物学手段，通过内吞、感染或入侵将所述DNA分子或携带DNA的生物体或病毒转移至靶细胞。靶细胞可以是真核、哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物的细胞，植物细胞，属于真细菌或古细菌的细菌，真菌或原生动物。
根据本发明的优选实施方案，“外来”核酸优选地代表DNA分子，最优选地代表双链DNA分子，但也可以是RNA分子或与RNA相关的DNA分子。“外来”DNA可以是超螺旋或线性DNA，并且可以是质粒DNA或PCR产物或寡核苷酸。“外来”核酸可以是感染剂的基因组或来源于细菌、噬菌体、病毒、真菌或诸如原生动物或蠕虫的寄生虫的染色体外DNA的一部分。
用于转染真核细胞的表达质粒-DNA可包含特定元件，例如通过RNA聚合酶II驱动编码基因表达的真核启动子(例如CMV或SV40启动子)。它进一步包含诸如聚腺苷酸化位点、核糖体引发位点和任选的真核复制起点的元件。它还可以包含T7启动子以用于测序或用于T7聚合酶的体外表达。为了质粒在细菌中繁殖，表达质粒还可以包含细菌复制起点，用于选择的抗生素抗性基因和驱动抗生素抗性基因表达的原核启动子。
通过病毒，例如天然存在的DNA病毒或用于基因转移的工程化病毒可以提供“外来”DNA。双链DNA病毒具有表示为双链DNA的病毒基因组。双链DNA病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)家族、疱疹病毒科(Herpesviridae)家族和多瘤病毒科(Polyoamviridae)家族、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)家族、有尾噬菌体目(Caudovirales)家族、线状病毒目(Ligamenvirales)家族、杆状病毒(Baculo-like viruse)家族(如杆状病毒科(Baculoviridae))和属于痘病毒科(Poxviridae)家族的核质大DNA病毒。包含环状、部分双链DNA的另一家族属于以乙型肝炎病毒为代表的肝炎病毒科家族，其中环状DNA被转运至细胞核并被转录，随后是合成的前基因组RNA被逆转录。其它类别的病毒是单链DNA病毒和包含单链或双链RNA的RNA病毒。“外来”DNA也可以是噬菌体DNA。具有双链DNA基因组的噬菌体属于肌病毒科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、复层噬菌体科(Tectiviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、盐末端蛋白病毒属(Salterprovirus)或滴状病毒科(Guttaviridae)的家族。用于生物分子研究或技术中使用的基因转导的病毒载体的例子是牛痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、杆状病毒、慢病毒或腺病毒相关病毒。
因此，本发明的肽和化合物的一种应用可以是阻止病毒DNA早期基因表达，从而导致随后的病毒复制减少或抑制。
与阻止“外来”DNA转移和基因表达相对，本发明的肽和化合物还可用于预期基因表达例如在基因治疗期间通过基因转移的情况。通过排除用抑制剂处理的其它细胞类型中的基因表达，所述抑制剂可用于从特定靶细胞类型转基因的选择性基因表达。
本发明的肽和化合物的靶细胞可以是真核细胞，例如原代细胞或组织内细胞，但也可以是细胞系，永生化的肿瘤来源的细胞系或工程化的细胞系或通过其它方式例如通过病毒永生化的细胞系。靶细胞可以具有哺乳动物，包括人类来源，但是也可以具有脊椎动物或无脊椎动物来源，例如昆虫细胞。靶细胞也可以是原核细胞或古细菌细胞，例如细菌或古细菌。
如实施例中所示，并且根据本发明的优选实施方案，本发明的肽，特别是肽I24，抑制用表达质粒和肽同时转染的细胞的mRNA水平，这通过用荧光素酶表达质粒和肽同时转染的细胞中萤光素酶mRNA水平降低例示的。mRNA水平和蛋白质水平的降低具有可比较的时间和剂量依赖性。抑制转染细胞中mRNA水平可以是通过肽与DNA分子之间的直接接触从而阻止RNA转录中的后续步骤，或者是通过抑制DNA依赖性RNA聚合酶的活性，或者是通过抑制宿主因子与参与转录激活的DNA分子(例如转录因子，与转录因子相关的因子或参与一般转录激活的因子例如TATA盒结合蛋白或相关因子)的结合或相互作用。与DNA的相互作用可能是在DNA分子进入细胞核之前已经在膜或细胞质中发生。尽管不太可能，但该抑制剂可能以影响mRNA稳定性的转录后水平起作用。
如实施例所示，本发明的肽，特别是肽I24，抑制表达质粒转染的真核细胞中的蛋白质水平，不依赖于表达质粒的某些元件。该抑制不依赖于细菌或真核抗生素抗性基因的类型。该肽在真核细胞中对蛋白质产生的抑制部分依赖于表达质粒中存在的真核启动子的类型。该启动子可以是例如巨细胞病毒(CMV)启动子或天然真核启动子例如白细胞介素8(CXCL-8)启动子，或合成启动子例如具有诸如NF-KB结合位点、驱动转录的元件的最小启动子。与受CMV启动子控制的荧光素酶相比，受SV40早期启动子控制的基因受肽I24的抑制作用较小。
根据本发明的优选实施方案，本发明的肽的N-末端可以是胺，C-末端可以是酰胺或酸。
本发明的肽和化合物可以通过经典的肽合成来产生，并且可溶于二甲基亚砜(DMSO)，但是可以溶于其它溶剂，例如水溶液、醇、有机溶剂或乳液。
本发明的肽也可以被认为是“抑制剂”，因为该肽“抑制”或甚至阻止外来核酸分子的转录和/或翻译。
本发明的另一方面涉及一种肽化合物，包含至少一种肽或其变体，所述肽包含式I(SEQ ID No.1)或由其组成
X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-X6-X7-(X8)n-C (I)
其中X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X6是C或R，X7是F或L，X8是W或A，以及m和n各自为0或1。
如本文所用，“肽化合物”是指包含通过肽键(即酰胺键)彼此连接以形成氨基酸残基链的氨基酸残基的化合物。根据本发明的“肽化合物”包含至少一种包含式I或由式I组成的肽。该肽化合物可包含紧挨着本发明的至少一种肽的其它化学部分，例如蛋白质、多糖、脂肪酸例如棕榈酸、脂质、其组合(包括脂蛋白和糖脂)、核酸(例如DNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸)、小分子药物(例如核苷类似物、解旋酶抑制剂)和显像剂(例如荧光团、量子点、放射性示踪剂、金属螯合物)。
如本文所用，“化合物”可以是与包含式(I)或由式(I)组成的至少一种肽缀合或结合的多肽或肽或任何其它化学物质。因此，本发明的“肽化合物”可以是融合多肽、肽或蛋白质或缀合物或其组合。
包含式I或由式I组成的至少一种肽的“变体”可以包含至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，至多达五种，优选至多达四种，更优选至多达三种，更优选至多达两种，特别是一种保守性氨基酸取代。保守性取代的实例包括一种疏水残基取代另一种，例如F、V、L或A彼此取代，或一种极性残基取代另一种，例如在K和R之间；E和D之间或Q和N之间。其它这样的保守性取代，例如具有相似疏水性的整个区域的取代，是众所周知的(Kyte和Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1):105-132)。示例性的氨基酸取代如下表所示：
| 原残基 | 取代的示例 |
| Arg(R) | His，Lys |
| Asn(N) | Gln |
| Asp(D) | Glu |
| Cys(C) | Ser |
| Gln(Q) | Asn |
| Glu(E) | Asp |
| Gly(G) | Pro，Ala |
| His(H) | Lys，Arg |
| Ile(I) | Leu，Val，Met，Ala，Phc |
| Leu(L) | Ile，Val，Met，Ala，Phe |
| Lys(K) | Arg，His |
| Met(M) | Leu，Ile，Phe |
| Phe(F) | Leu，Val，Ile，Tyr，Trp，Met |
| Pro(P) | Ala，Gly |
| Ser(S) | Thr |
| Thr(T) | Scr |
| Trp(W) | Tyr，Phe |
| Tyr(Y) | Trp，Phe |
| Val(V) | Ile，Met，Leu，Phe，Ala |
根据本发明的优选实施方案，可以通过例如通过化学肽合成来改变、缺失、插入氨基酸残基或将氨基酸残基添加至肽来修饰肽的效力。在肽的特定位置上的氨基酸残基的保守性交换是可容忍的，且不影响活性。氨基酸的插入也是可能的。可以通过特定的氨基酸取代来改善或削弱肽的活性。为了细胞转染测定中的活性，可以进行以下氨基酸改变：在肽I24的F8和C9之间插入W或A；F8可以是L，A3可以是V或L，F4可以是Y，Y5可以是F，A6可以被缺失，C1可以是S，C7可以是R。本发明的肽的核心基序优选为C1-X1-X2-X3-X4-(A)-C2-X5-(WA)-C3(SEQ ID No.59)，其中，X1是L或A，并且X2是脂肪族残基A、V或L，并且X3和X4是芳香族氨基酸残基F或Y。位置C2可以被不同的氨基酸残基取代。在本发明的特别优选的实施方案中，该基序代表引起对“外来”DNA基因表达的抑制作用和RNA聚合酶活性的抑制的最小基序。
式(I)中的“A”代表丙氨酸，“C”代表半胱氨酸，“S”代表丝氨酸，“L”代表亮氨酸，“V”代表缬氨酸，“F”代表苯丙氨酸，“Y”代表酪氨酸，“R”精氨酸和“W”代表色氨酸。式(I)中的“-”表示在肽、多肽和蛋白质中出现的两个氨基酸残基之间的肽键。
在本发明的特别优选的实施方案中，式(I)的X6为C。
在本发明的另一个优选实施方案中，X1为C，X2为L且X6未C。
在本发明的另一个优选实施方案中，m为1。
在本发明的优选实施方案中，本发明的肽或其变体包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-C-X7-(X8)n-C(SEQ ID No.60)或由其组成，其中X1是C或S，X2是L或A，X3是A、V或L，X4是F或Y，X5是Y或F，X7是F或L，X8是W或A，并且m和n各自为0或1。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的肽或其变体包含氨基酸序列C-L-X3-X4-X5-(A)m-C-X7-(X8)n-C(SEQ ID No.61)或由其组成，其中X3是A、V或L，X4为F或Y，X5为Y或F，X7为F或L，X8为W或A，并且m和n各自为0或1。
为了增强本发明的化合物抑制或阻止生物体/细胞内外来核酸分子的翻译和/或转录的能力，所述化合物可包含大于一种本发明的根据式(I)的肽。因此，本发明的化合物可以包含1至4种、优选1至3种、更优选1或2种包含式I或由式I组成的肽或由其组成。
本发明的肽化合物可以包含大于一种式(I)的肽，其中每种肽可以由相同氨基酸序列或不同氨基酸序列组成。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述化合物包含两种或更多种式(I)的肽，并且本发明由相同的氨基酸序列组成。所得的多聚体(例如二聚体和三聚体)具有可以显著提高本发明的肽的转录/翻译抑制作用的优点。
根据本发明的优选实施方案，本发明的肽由8至40个，优选8至30个，更优选8至20个，更优选8至15个，更优选8至12个，更优选8至10个氨基酸残基组成。
本发明的肽可以是线性的或环状的。用于产生环状化合物，特别是环状肽的方法是本领域众所周知的。由于在本发明的式(I)肽的C-末端和在某些情况下N-末端存在半胱氨酸残基，因此促进了环状肽的产生。当然，环状肽也可以通过在本发明的肽的N-末端和C-末端之间提供酰胺键来合成。
根据本发明的优选实施方案，本发明的肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：CLAFYACFWC(SEQ ID No.2)、CLAFYACLWC(SEQ ID No.3)、CLAFYACFAC(SEQ ID No.4)、CLVFYACFC(SEQ ID No.5)、CLAFYACFC(SEQ ID No.6)、CLLYFCFC(SEQ ID No.7)、CAAFYACFC(SEQ ID No.8)、SLAFYACFAC(SEQ ID No.9)、CLAFYARFC(SEQ ID No.10)、CLAFYCFAC(SEQID No.11)、CLAFYCFC(SEQ ID No.12)和CLAYFCFC(SEQ ID No.13)。
本发明特别优选的肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：CLAFYACFWC(SEQ ID No.2)、CLAFYACLWC(SEQ ID No.3)、CLAFYACFAC(SEQ ID No.4)、CLVFYACFC(SEQ ID No.5)、CLAFYACFC(SEQ ID No.6)和CLLYFCFC(SEQ ID No.7)，特别是CLAFYACFWC(SEQ ID No.2)或CLAFYACLWC(SEQ ID No.3)。
为了促进本发明的化合物和肽转移至细胞中或细胞室之间，本发明的化合物或至少一种根据本发明的肽被修饰以表现出细胞穿透特性。本发明的肽化合物内的细胞穿透部分的存在允许更有效地控制所述化合物转移至细胞中以及在细胞室之间。因为本发明的化合物和肽可以位于所述翻译和/或转录应被抑制或降低的细胞或生物体内，这可以导致甚至更好地抑制或阻止细胞或生物体中外来核酸分子的翻译和/或转录。
根据本发明的优选实施方案，至少一种肽或肽化合物以C-和/或N-末端直接与至少一种细胞穿透肽融合或经由接头与至少一种细胞穿透肽融合。
如本文所用，术语“细胞穿透肽”是指能够跨质膜转运不同类型的分子并因此促进细胞吸收各种分子的分子(纳米颗粒至小分子化学物质、大分子和DNA大片段)的(短)肽。待转运的分子通过共价键以化学键接(例如缀合、融合)或通过非共价相互作用(例如通过Pep-1)与细胞穿透肽结合。细胞穿透肽通常具有这样的氨基酸组成，其含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)，或具有包含极性/带电荷的氨基酸和非极性疏水性氨基酸的交替模式的序列。这两种类型的结构分别被称为聚阳离子型或两亲型。细胞穿透肽具有不同的大小、氨基酸序列和电荷，但是所有这些肽都具有共同的特征，即能够使质膜转移并促进各种分子递送至细胞的细胞质或细胞器。
本发明的肽或肽化合物可以以C-和/或N-末端直接与至少一种细胞穿透肽融合或经由接头与至少一种细胞穿透肽融合。接头具有在本发明的肽和/或化合物与细胞穿透肽之间提供距离的优点。另一个优点是在本发明的肽和/或化合物与细胞穿透肽之间掺入一个或多个切割位点，从而允许蛋白酶例如去除细胞穿透肽。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述细胞穿透肽选自由TAT肽和聚阳离子标签组成的组。
如上所述，细胞穿透肽可以具有聚阳离子结构。因此，特别优选将聚阳离子肽(即聚阳离子标签)添加到本发明的肽和/或化合物中。其它细胞穿透肽可以来源于天然存在的蛋白质，已知这些蛋白质支持其它分子转移通过细胞膜。例如，从人免疫缺陷病毒(HIV)可获得的TAT肽是众所周知的细胞穿透肽。
根据本发明的优选实施方案，所述细胞穿透肽来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白，并且可以包含SEQ ID No.14(MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTTKALGISYGRKKRRQRRRP PQGSQTHQVSLSKQPTSQPRGDPTGPKE)的第37至72位氨基酸残基、更优选第37至60位氨基酸残基、更优选第48至60位氨基酸残基或由其组成，特别是包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID No.15)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID No.16)、CYGRKKRRQRRR(SEQ ID No.17)、YGRKKRRQRRRGGG(SEQ ID No.18)或CGRKKRRQRRR(SEQ IDNo.19)，其中，最优选使用GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID No.15)。
如上所述，本发明的另一方面涉及肽I24或与可以增强细胞渗透性或细胞穿透性的分子融合的本发明的任何其它肽。这样的标签可以是例如TAT肽或聚阳离子标签，例如聚精氨酸标签。实验已经表明，TAT-标签(TAT-I24：GRKKRRQRRRPPQCLAFYACFC，SEQ ID NO：20)，例如，当肽与质粒-DNA一起转染时，会提高该肽在抑制质粒编码的荧光素酶水平方面的效力(IC50＝0.06μM)，然而TAT肽单独是无活性的。
本发明中使用的细胞穿透肽还可以来源于包含序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO：21)的果蝇触角蛋白同源结构域(Drosophila Antennapedia protein homeodomain)，或包括RRRRRRR(SEQ ID NO：22)即(Arg)7、RRRRRRRC(SEQ ID NO：23)即(Arg)7-C、或RRRRRRRR(SEQ ID NO：24)即(Arg)8、或RRRRRRRRR(SEQ ID NO：25)即(Arg)9的聚精氨酸段，或可以来源于包含序列TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO：26)的抗菌肽，或者可以来源于具有序列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：27)的转运素，或者可以选自包含序列WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO：28)的KALA肽，或包含序列KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO：29)的MAP，或者选自包含序列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO：30)的Pep-1，包含序列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：31)的hCT(9-32)；包含序列LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO：32)的pVEC；包括序列RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：33)的pISL；包含序列RQGAARVTSWLGRQLRIAGKRLEGRSK(SEQ ID NO：34)的Erns；包含序列KLIKGRTPIKFGK(SEQ ID NO：35)的局限曲霉素(Restrictocin)L3；或包含序列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(SEQ ID NO：36)或GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-半胱酰胺的MPG；或来源于包含序列PKKKRKVEDPYC(SEQ ID No.37)或CGGGPKKKRKVED(SEQ ID NO：38)的SV-40大T抗原核定位信号(NLS)，或包含序列YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(SEQID NO：39)的狂犬病毒糖蛋白(RVG)。
通过与细胞渗透性标签融合的肽，感染性病毒例如杆状病毒的基因表达可以降低，如利用I24的N末端融合到TAT标签(TAT-I24：GRKKRRQRRRPPQCLAFYACFC；SEQ ID NO：20)通过编码CMV启动子控制下的荧光素酶基因的杆状病毒的荧光素酶表达降低，而未添加标签的肽I24在抑制萤光素酶表达方面仅具有弱活性所例示的。通过TAT-I24抑制杆状病毒介导的萤光素酶表达的IC50为0.15μM。在一方面，本发明涉及肽和标签的融合优于单独的肽或标签。在另一方面，本发明涉及肽和标签的融合还可以降低杆状病毒编码基因的mRNA水平，而不抑制细胞基因的表达，如白细胞介素8mRNA的表达不受影响所例示的。
本发明的另一个方面涉及TAT标签的肽I24，与本发明的所有肽和化合物一样，它能够抑制腺病毒、双链DNA病毒的基因表达，尽管抑制作用是在较高浓度(IC50＝6μM)下发生的。除了抑制报告基因表达外，病毒六邻体基因的表达也以类似方式被抑制。
根据本发明的优选实施方案，TAT标签的肽I24能够抑制靶细胞中的病毒复制，如与腺病毒感染后的溶媒处理的细胞相比，释放到上清液中的腺病毒颗粒减少并且细胞脱离减少所例示，表明抑制了靶细胞中病毒的产生。
在另一方面，本发明涉及TAT标签的肽I24，与本发明的所有肽和化合物一样，可以抑制牛痘病毒(DNA病毒)的基因表达和复制，牛痘病毒属于痘病毒科家族的核质大DNA病毒。当用牛痘病毒感染并用TAT-I24处理HEK293细胞时，在20μM TAT-I24下，病毒基因表达被抑制>95％，病毒复制被抑制>90％。
在另一方面，本发明涉及TAT标签的肽I24，与本发明的所有肽和化合物一样，可以抑制疱疹病毒、双链DNA病毒的基因表达和复制，如通过抑制单纯疱疹病毒复制所例示的。除此之外，疱疹病毒家族的其它成员是巨细胞病毒或水痘带状疱疹病毒，例如爱泼斯坦巴尔病毒。
在另一方面，本发明涉及TAT标签的肽I24，与本发明的所有肽和化合物一样，也可以引起RNA病毒的基因表达的抑制。可以看到部分抑制单链RNA病毒的基因表达，如慢病毒-Luc，一种含有CMV启动子控制下的荧光素酶的逆转录病毒例示的。当用肽TAT-I24处理并用编码CMV启动子控制下的萤光素酶的慢病毒感染HEK293细胞时，观察到在最高浓度(20μM)下萤光素酶水平降低75％。
本发明的抑制剂/肽，以肽I24为例，由九个氨基酸残基组成，具有以下序列(从氨基(N)-末端至羧基(C)-末端)Cys-Leu-Ala-Phe-Tyr-Ala-Cys-Phe-Cys(SEQ ID NO：6)。当以任何方式被转移到靶细胞时，所述肽可以接触DNA分子，大概是在细胞膜处或细胞溶质内。肽在进入细胞之前可能已经接触了DNA分子，或者例如通过细胞穿透型肽接触细胞内的DNA分子。
肽I24的序列来源于通过针对翻译核糖体的噬菌体筛选以鉴定信号肽的肽结合物而最初鉴定的肽，并且公开于专利申请WO 2011/086116(LAFYACF(WO 2011/086116中的SEQID NO：39))。然而，本文所述的作用方式与筛选原始信号肽的靶无关。在各种细胞系统中测试该肽显示出不依赖于原始信号肽靶的效果。出人意料的是，该肽抑制了导入靶细胞的“外来”DNA的基因表达，而不影响细胞的基因组编码的基因表达。信号肽与本领域已知的“外来”DNA的基因表达调控之间没有关系，支持了这些发现的新颖性。
根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的肽化合物和/或至少一种肽与标记融合或缀合。
本发明的肽和/或化合物可以与充当融合或缀合产物的标记的另一分子缀合或融合。标记的存在允许直接或间接检测和定位例如在细胞或生物体中的本发明的肽和/或化合物。
本发明中使用的标记可以具有不同的结构，包括多肽、蛋白质和其它化学结构。标记优选地选自由染料，优选荧光染料，更优选荧光蛋白、链霉亲和素、生物素或染料结合肽组成的组。
本发明的肽还可以优选地通过它的N末端与其它组分(如其它肽，或化学物质如染料或生物素)融合，这可以有利于定位和活性研究。优选包含肽I24的本发明化合物也可以是多聚体，优选二聚体。与单体相比，实例中显示二聚体提高了效力(IC50＝0.09μM)。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽或化合物在治疗与哺乳动物或人类个体的细胞中的异源核酸分子的转录和/或翻译相关的病症或疾病中使用。
本发明的肽和化合物可用于治疗由哺乳动物和人类受试者的细胞中的异源核酸分子的翻译和/或转录引起的疾病或病症。此类疾病和病症尤其包括病毒感染，例如由单纯疱疹病毒的感染(引起唇疱疹和生殖器疱疹)、巨细胞病毒的感染，引起成年人水痘和带状疱疹的水痘带状疱疹病毒的感染、引起疣或某些类型癌症的乳头瘤病毒的感染或腺病毒的感染。
“与细胞中异源核酸分子的转录和/或翻译相关的病症或疾病”包括通常在被认为健康的细胞中不存在的核酸分子的翻译或转录所引起的病症和疾病。
本发明的另一方面涉及本发明的肽或肽化合物用于在治疗哺乳动物或人类个体中的病毒、细菌、寄生虫或真菌感染中使用。本发明的肽或肽化合物可用于治疗DNA病毒，例如双链DNA病毒，优选痘病毒科家族的病毒，更优选腺病毒科家族的病毒，最优选疱疹病毒科家族的病毒，特别是单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒引起的感染。
已经显示本发明的肽和肽化合物显著抑制或降低细胞或(多细胞)生物体中存在的异源(“外来”)核酸分子的转录和/或翻译速率。具有这些特性的本发明的肽以及因此化合物导致治疗哺乳动物或人类个体中的病毒、细菌、寄生虫或真菌感染。特别地，由病毒引起的感染可以使用本发明的肽和化合物来治疗，因为病毒通常需要其它生物体或细胞以自我复制。
本发明的肽和化合物可以经口腔、静脉内、皮下、局部、阴道内、眼内、吸入或鼻腔给予至哺乳动物或人类受试者。
如本文所述的本发明的肽和化合物可以单独(例如以纯化的肽或化合物的形式)或作为如本文所述的组合物或药物的组分经口腔、静脉内、皮下、局部、阴道内、眼内、吸入或鼻腔给予至受试者。可以将组合物与生理上可接受的载体或辅料一起配制以制备药物组合物。该制剂应适合于给药方式，例如静脉内或皮下给药。配制组合物的方法是本领域已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceuticals Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,(Alfonso R.Gennaro编辑)(1989))。
合适的药学上可接受的载体包括水，盐溶液(例如，NaCl)，盐水，缓冲盐水，醇，甘油，乙醇，阿拉伯胶，植物油，苄醇，聚乙二醇，明胶，碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉，糖例如甘露糖醇、蔗糖或其它，右旋糖，硬脂酸镁，滑石，硅酸，脂质体，粘性石蜡，芳香油，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等，及其组合。所述制剂可以与不与本发明的肽和化合物产生有害反应或干扰其活性的辅助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润助剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香族物质等)混合。在优选的实施方案中，使用适合于静脉内给药的水溶性载体。
包含本文所述的肽和化合物的本发明的制剂也可以包含湿润助剂或乳化助剂或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶剂、混悬剂、乳剂、缓释制剂或粉末剂。该组合物也可以与传统的粘合剂和载体例如甘油三酸酯一起配制成栓剂。
在本发明的优选实施方案中，用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。在必要时，该组合物还可包含增溶助剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分以单位剂量形式单独地或混合在一起提供，例如，作为在密闭容器(例如指示活性剂含量的安瓿瓶或小药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注给予时，可以用含有无菌药物级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶进行分配。在通过注射给予该组合物时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿瓶，以便可以在给药之前将成分混合。
本发明的肽和化合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，以及与游离羧基形成的盐，例如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
本发明的肽和肽化合物可以通过任何合适的途径给予，优选经局部、鼻腔、皮下、静脉内、通过吸入、肠胃外、皮内、经皮、直肠、阴道内、眼内或透粘膜给予。如果需要，可以同时使用不只一种途径。
根据本发明待给予的特定剂量或量可以例如取决于期望结果的性质和/或程度，给药途径和/或时间的细节，和/或一种或多种特征(例如体重、年龄、个人病史、遗传特征、生活方式参数等，或其组合)而变化。这样的剂量或量可由本领域技术人员来确定。在一些实施方案中，根据标准临床技术确定合适的剂量或量。例如，在一些实施方案中，合适的剂量或量是足以使疾病严重性指数得分降低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多的剂量或量。例如，在一些实施方案中，合适的剂量或量是足以使疾病严重性指数得分降低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的剂量或量。替代地或另外地，在一些实施方案中，合适的剂量或量通过使用一种或多种体外或体内测定法来确定以帮助鉴定待给予的期望或最佳剂量范围或量。
本发明的肽和化合物优选地以治疗有效量给予。如本文所用，术语“治疗有效量”主要基于本发明的药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。通常，治疗有效量是足以实现对哺乳动物或人类个体的有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或减轻基础疾病或病症)。待给予的合适剂量或量可从体外或动物模型试验系统得出的剂量-反应曲线推算出。
本发明的肽和化合物(包括其盐)的治疗有效剂量范围可以是约10-1000mg(例如约20mg-1,000mg,30mg-1,000mg、40mg-1,000mg、50mg-1,000mg、60mg-1,000mg、70mg-1,000mg、80mg-1,000mg、90mg-1,000mg、约10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、200-1000mg、200-900mg、200-800mg、200-700mg、200-600mg、200-500mg、200-400mg、300-1000mg、300-900mg、300-800mg、300-700mg、300-600mg、300-500mg、400mg-1,000mg、500mg-1,000mg、100mg-900mg、200mg-800mg、300mg-700mg、400mg-700mg、和500mg-600mg)。根据本发明的优选实施方案，本发明的肽和化合物以大于或等于约10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg和/或少于约1000mg、950mg、900mg、850mg、800mg、750mg、700mg、650mg、600mg、550mg、500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg、150mg或100mg的量给予。
本发明的肽和化合物可以单剂量或多剂量给予。治疗有效量的本发明的肽和/或化合物可以在一天或几天内，最优选在一天内给予。
治疗有效剂量可以是例如约0.001mg/kg重量至500mg/kg重量、例如约0.001mg/kg重量至400mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至300mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至200mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至100mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至90mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至80mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至70mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至60mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至50mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至40mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至30mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至25mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至20mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至15mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至10mg/kg重量。本文描述的治疗有效量可以每天一剂量提供。
治疗有效剂量可以是例如约0.001mg/kg重量至约1mg/kg重量、例如约0.001mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.001mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约1mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.01mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、约0.02mg/kg重量至约1mg/kg重量、约0.02mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.02mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.02mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.02mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.02mg/kg重量到约0.5mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约1mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.03mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约1mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.04mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约1mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、约0.05mg/kg重量至约0.5mg/kg重量。
治疗有效剂量可以是例如约0.0001mg/kg重量至0.1mg/kg重量，例如约0.0001mg/kg重量至0.09mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.08mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.07mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量0.06mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.05mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至约0.04mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.03mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.02mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.019mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.018mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.017mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.016mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.015mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.014mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.013mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.012mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.011mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.01mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.009mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.008mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.007mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.006mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.005mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.004mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.003mg/kg重量、约0.0001mg/kg重量至0.002mg/kg重量。在一些实施方案中，治疗有效剂量可以是0.0001mg/kg重量、0.0002mg/kg重量、0.0003mg/kg重量、0.0004mg/kg重量、0.0005mg/kg重量、0.0006mg/kg重量、0.0007mg/kg重量、0.0008mg/kg重量、0.0009mg/kg重量、0.001mg/kg重量、0.002mg/kg重量、0.003mg/kg重量、0.004mg/kg重量、0.005mg/kg重量、0.006mg/kg重量、0.007mg/kg重量、0.008mg/kg重量、0.009mg/kg重量、0.01mg/kg重量、0.02mg/kg重量、0.03mg/kg重量、0.04mg/kg重量、0.05mg/kg重量、0.06mg/kg重量、0.07mg/kg重量、0.08mg/kg重量、0.09mg/kg重量或0.1mg/kg重量。用于具体受试者的有效剂量可以随时间变化(例如增加或减少)，取决于所述受试者(即哺乳动物或人类个体)的需求。
本发明的肽和化合物可以以约1-1,000μg/kg/天(例如，约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg/天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)的有效剂量范围给予。在一些实施方案中，本发明的肽和化合物可以以约1-500μg/kg/天的有效剂量范围给予。在一些实施方案中，本发明的肽和化合物以约1-100μg/kg/天的有效剂量范围给予。在一些实施方案中，本发明的肽和化合物以约1-60μg/kg/天的有效剂量范围给予。在一些实施方案中，本发明的肽和化合物以选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000ug/kg/天的有效剂量给予。
本发明的肽和化合物可以通过连续输注，优选连续静脉内输注来给予。本发明的肽和化合物可以以每两月一次、每月一次、每月两次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每天一次、每天两次、或按另一临床期望剂量方案给予。单个受试者的剂量方案不一定是固定间隔的，可以随时间根据受试者的需要而变化。
本发明的另一方面涉及编码根据本发明的肽或化合物的核酸分子。
本发明的核酸分子是DNA或RNA分子。所述核酸分子可以是载体(优选是本领域公知的克隆载体或表达载体)的一部分。
本发明的另一方面涉及根据本发明的肽或化合物用于抑制细胞，优选真核细胞，更优选哺乳动物或人类细胞或生物体(例如哺乳动物或人类受试者)中的异源核酸分子的转录和/或翻译的用途。
根据本发明的优选实施方案，异源核酸分子具有病毒、细菌、寄生虫或真菌来源。
根据本发明的另一个实施方案，异源核酸分子包含编码抗生素抗性基因或其功能片段的核酸段。
本发明的肽和化合物还能够抑制编码抗生素抗性基因的核酸分子的转录和/或翻译，从而阻止或显著降低微生物如细菌的抗生素抗性。这是特别有利的，因为本发明的肽和化合物能够使细菌对抗生素敏感，尽管细菌能够产生引起抗生素抗性的蛋白质。因此，本发明的肽和化合物可用于对抗抗生素抗性细菌。
质粒DNA，例如含有抗生素抗性基因的DNA(例如R-质粒)，可以通过水平基因转移在细菌之间转移。质粒可以在细菌基因组外复制，也可以整合到细菌基因组中。当吸收这样的DNA时，细菌会变得对抗生素具有抗性。另外，毒性基因也可以在细菌之间转移。由于世界范围内对细菌抗生素抗性的发展以及缺乏合适的候选药物，细菌感染的治疗将是未来的主要挑战。细菌之间基因转移的抑制剂可能会对某些地区例如出现抗性形成的医院的医疗处理或卫生措施产生潜在影响。因此，通过抑制剂分子抑制“外来”DNA分子的转移和抑制蛋白质的产生可以对感染性疾病的治疗性干预或对阻止抗生素抗性细菌的扩散和形成有用。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物用于阻止细菌细胞获得能够为所述细菌细胞提供抗生素抗性的基因或其功能片段的用途。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明的肽和化合物，特别是肽I24，抑制用含有抗生素抗性基因的质粒和肽I24同时转化的埃希氏大肠杆菌在含抗生素琼脂平板上的菌落形成。当转化完成后再施用肽时，该肽无活性。肽的抑制不依赖于所使用的抗生素抗性基因，如由用含有氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因的质粒转化的埃希氏大肠杆菌细菌且在含有氨苄青霉素或卡那霉素的琼脂平板上生长菌落形成减少例示的。
进一步发现，本发明的肽和化合物，特别是肽I24，抑制质粒复制和抗生素抗性基因的RNA产生，如由用含有抗生素抗性的质粒与多肽同时转化的埃希氏大肠杆菌中的β-内酰胺酶mRNA的表达降低例示的。
本发明的肽和化合物可以抑制或显著降低病毒核酸分子的转录和/或翻译。因此，这些肽和化合物可以用作包含减毒病毒的疫苗的添加剂，或者与减毒病毒一起给予以提高活疫苗的安全性或间接使活疫苗减毒。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的肽和/或化合物作为减毒活疫苗的添加剂的用途。在本发明的另一方面，本发明的肽和/或化合物可以与活疫苗共同给予。
本发明的肽和化合物可用于抑制细胞中病毒核酸分子的转录和/或翻译，以降低生物体(例如哺乳动物和人类个体)内的病毒滴度。该性质也可用于抑制或阻止病毒在细胞培养物中传播。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的肽或化合物抑制或阻止病毒在细胞培养物中扩散的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的化合物抑制细菌的噬菌体感染的用途。
本发明的化合物/抑制剂的另一潜在应用是阻止细菌中的噬菌体感染。细菌培养物的噬菌体感染可以是特别为生物技术应用(包括大规模发酵)中的一个问题。由于本发明化合物抑制生物体/细胞内外来核酸分子的翻译和/或转录的能力，细菌内噬菌体的复制可以被抑制甚至被阻止。这意味着在细菌细胞的培养期间，本发明的化合物或包含所述化合物的组合物被添加至培养基。
因此，所述抑制剂的另一潜在应用是阻止细菌中的噬菌体感染。细菌培养物的噬菌体感染可以是特别为生物技术应用(包括大规模发酵)中的一个问题。另外，阻止动物细胞培养中病毒感染可能是生物技术和生物制药相关的另一种应用。该抑制剂还可以在靶细胞内被细胞内表达，并且可以用于生物技术应用，例如阻止病毒或噬菌体感染，或者可以用于控制基因表达。
为了允许其检测和/或可视化，本发明的化合物可以用其它物质标记。这可以有助于本发明的化合物在细胞、组织和生物体中的定位，在所述细胞、组织和生物体中所述化合物抑制异源/外来核酸分子的转录和/或翻译。因此，本发明的另一个方面涉及根据本发明的化合物定位在真核细胞内的异源核酸分子的转录和/或翻译的用途。
根据本发明的优选实施方案，待定位的异源/外来核酸分子具有病毒、细菌、寄生虫或真菌来源。
在一方面，本发明涉及本发明的肽和化合物，优选肽I24，其当在表达质粒的转染过程中与表达质粒接触时降低了真核细胞中的质粒编码蛋白的表达。质粒-DNA的转染可以例如通过使用脂质体试剂、阳离子聚酰胺-胺聚合物、电穿孔、磷酸钙或DEAE-右旋糖酐来进行。
本发明的肽和化合物，优选为肽I24，其能够降低细胞裂解物中的细胞溶质蛋白水平，如由用编码荧光素酶的表达质粒和肽同时转染的细胞的荧光素酶水平降低例示的。
本发明的肽和化合物，优选为肽I24，其能够降低细胞上清液中的分泌蛋白水平，如由用编码分泌型碱性磷酸酶的表达质粒和肽同时转染的细胞的分泌型碱性磷酸酶水平降低例示的。
在另一方面，本发明提供了本发明的肽和化合物，优选肽I24，其还可以降低细胞裂解物中的核蛋白水平，如由当用NF-κB p65 M2表达质粒和测试肽同时转染时，截短形式的NF-κB p65(NF-κB p65 M2)水平的抑制例示的。
当用GFP表达质粒和肽同时转染真核细胞时，本发明的肽和化合物，优选肽I24，能够降低细胞裂解物中绿色荧光蛋白(GFP)的水平，如通过蛋白质印迹分析所确定的。发现本发明的肽和化合物降低了用GFP质粒和肽同时转染的细胞中的GFP阳性细胞的总数。
本发明的肽和化合物，优选肽I24，对表达质粒转染的真核细胞中蛋白质产生的抑制不依赖于DNA的形态(例如，环状、超螺旋或松弛DNA，线性DNA，环状质粒-DNA，线性质粒-DNA，PCR产物和双链寡核苷酸)。当用线性双链DNA，例如线性质粒或通过聚合酶链反应(PCR)获得的双链DNA片段转染时，该肽抑制真核细胞中的蛋白质产生。
在另一方面，本发明提供了本发明的肽和化合物，优选肽I24，以剂量依赖性方式抑制表达质粒转染的真核细胞的蛋白质产生，其中IC50(半最大抑制浓度)为0.1至2μM，优选0.3至0.7μM。当本发明的肽和化合物在真核细胞转染过程中与DNA接触时具有活性，而在转染过程完成后添加该肽时则无活性。
本发明的另一方面涉及该肽不依赖细胞类型的作用。当在各种细胞系中与质粒一起转染时，肽I24抑制质粒编码的蛋白质产生，如使用HEK293、CV-1、COS-7、MCF-7或HT-29细胞所例示的。
通过以下实施例进一步说明本发明，但是不限于此。
实施例
实施例1：肽I24的序列
I24是由9个氨基酸残基组成的肽Cys-Leu-Ala-Phe-Tyr-Ala-Cys-Phe-Cys(CLAFYACFC，SEQ ID NO：6)。该肽可以是线性的，也可以通过半胱氨酸残基和二硫键环化。
实施例2：I24抑制瞬时转染的哺乳动物细胞中表达载体编码的蛋白质产生
在DMSO作为溶媒对照或不同剂量的肽I24存在下，使用Superfect(Qiagen)将荧光素酶构建体(CMV启动子控制下的荧光素酶编码区克隆到真核表达质粒中)转染HEK293细胞(人胚肾细胞)。24小时后，使用萤光素酶底物分析细胞裂解物中的萤光素酶水平。与溶媒对照相比，该肽引起荧光素酶的剂量依赖抑制作用(图1a)。在DMSO或不同剂量肽I24的存在下，用将分泌型碱性磷酸酶(SEAP)克隆至其中的CMV启动子控制下的真核表达载体转染HEK293细胞。24小时后，通过比色测定法分析释放到上清液中的SEAP。与溶媒对照相比，I24在转染的HEK293细胞中以剂量依赖方式减少SEAP的产生(图1b)。将肽J9(I24_M23的环化版本；CPSALAFYC(SEQ ID NO：53))和I21(CSLTGPIAC(SEQ ID NO：56))用作无活性对照。用编码截短形式的NF-KB p65(p65 M2)的表达质粒转染HEK293细胞24小时。通过蛋白质印迹分析转染细胞的裂解物中的p65的产生(图1c)。在转染有p65 M2和肽I24(20μM)的细胞中，蛋白质印迹检测不到p65 M2。在存在和不存在肽I24(2μM)的情况下，用编码绿色荧光蛋白(GFP)的表达质粒转染HEK293细胞。蛋白质印迹分析表明，肽I24降低了GFP的产生和GFP阳性细胞的数量(图1d，e)。
实施例3：在瞬时转染细胞中肽I24抑制截短的白细胞介素-8启动子控制下的质粒
载体编码基因的表达，而不抑制内源性白细胞介素-8的表达
用含有截短的白细胞介素8(IL-8)启动子控制下的荧光素酶编码区的构建体和肽I24瞬时转染HEK293细胞，并在转染后6小时用肿瘤坏死因子(TNF)-α进行刺激，在转染后24小时通过ELISA分析细胞裂解物中荧光素酶的表达以及上清液中释放的IL-8。该肽降低了TNF-α诱导的荧光素酶的表达，而IL-8的释放不受影响(图2)。
实施例4：当肽I24与表达质粒被转染到细胞中时，蛋白质和信使RNA水平被下调
用在CMV启动子控制下驱动荧光素酶的表达质粒转染COS-7非洲绿猴肾细胞，并测定细胞裂解液中的荧光素酶。为了分析荧光素酶mRNA的表达，总RNA被分离出来，用DNA酶I处理，并使用随机六聚体进行逆转录。用水解探针进行实时PCR以检测荧光素酶，并以18SrRNA转录水平进行归一化。在不同的孵育时间后，荧光素酶蛋白和mRNA水平均被下调(图3)。
实施例5：抑制质粒载体编码的基因表达部分依赖于瞬时转染的HEK293细胞中的
启动子
在浓度递增的肽I24存在下，用含有CMV启动子控制下的荧光素酶的表达质粒和含有早期SV40启动子控制下的新霉素抗性基因的表达质粒瞬时转染HEK293细胞。24小时后，从细胞中分离出总RNA，用DNA酶I进行消化以除去质粒-DNA并进行逆转录。使用水解探针进行荧光素酶和新霉素mRNA的实时定量PCR分析，并针对GAPDH转录本进行归一化。尽管在浓度递增的肽I24存在下，荧光素酶转录物减少87％，但新霉素mRNA水平仅减少约50％(图4)。
实施例6：质粒载体编码的基因表达的抑制不依赖于所用的细胞系
用含CMV启动子控制下的萤光素酶的质粒和不同浓度的肽I24瞬时转染细胞系非洲绿猴肾细胞CV-1和COS-7以及人乳腺癌细胞系MCF-7和人结肠癌细胞系HT-29。在使用的所有细胞系中观察到对报告基因荧光素酶的抑制(图5)。
实施例7：通过在氨基末端添加TAT-TAG或二聚作用，细胞穿透型I24提高了肽I24
的效力
通过在N-末端添加TAT-标签产生了细胞穿透型I24，I24二聚体具有被三个甘氨酸残基分隔的两个单体。肽和编码荧光素酶的表达质粒的瞬时转染显示了TAT-I24更有效地抑制荧光素酶表达。I24二聚体与肽I24相比也更有效力，但是与TAT-I24相比，其效力较弱。仅代表TAT标签的肽(TAT)在萤光素酶抑制中是无活性的(图6)。
实施例8：融合到氨基末端TAT-TAG的肽I24的细胞穿透型抑制HEK293细胞中杆状
病毒介导的基因表达
产生具有整合到其病毒基因组中的CMV启动子控制下的荧光素酶编码区的杆状病毒。将该杆状病毒施用于用DMSO或浓度递增的肽I24、TAT和融合肽TAT-I24预处理10分钟的HEK293细胞。在以细胞穿透性融合肽TAT-I24处理的细胞中，萤光素酶的表达呈剂量依赖性降低(图7a)。用TNF-α刺激与DMSO、TAT-I24或TAT孵育的杆状病毒感染的细胞，并从细胞中分离出总RNA。在用DNA酶I处理RNA后，进行逆转录。通过实时PCR分析萤光素酶和IL-8mRNA。尽管萤光素酶mRNA被TAT-I24下调，但IL-8的mRNA水平仍不受该处理的影响(图7b)。
实施例9：细胞穿透肽I24抑制HEK293细胞中腺病毒的基因表达并抑制病毒复制
分别用浓度递增的肽I24、TAT-I24或TAT处理HEK293细胞，并与编码CMV启动子控制下的荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒孵育HEK293细胞。通过TAT-I24下调荧光素酶蛋白水平，IC50为6μM(图8a)。分别用溶媒对照、肽I24、TAT-I24或TAT(20μM)与编码荧光素酶和GFP的腺病毒颗粒处理HEK293细胞。72小时后，分离RNA，并通过实时PCR分析萤光素酶和GFP以及腺病毒六邻体转录物水平，并以GAPDH归一化。TAT-I24引起所有三个腺病毒编码基因的抑制(图8b)。从上清液中分离出DNA，并使用实时PCR)对腺病毒六邻体DNA进行了定量(图8c)。TAT-I24抑制病毒感染的HEK293细胞的细胞脱离，如在感染后96小时通过固定和结晶紫染色确定的(图8d)。
实施例10：细胞穿透肽TAT-I24抑制HEK293细胞中痘苗病毒的基因表达和复制
在用牛痘病毒感染之前，用DMSO、TAT-I24或TAT处理HEK293T细胞4小时。感染后24小时，分离总RNA，并在cDNA合成之前用DNA酶I进行处理。DNA依赖的RNA聚合酶亚基rpo22(一种痘苗病毒编码的基因)的转录本的表达通过使用SYBR Green的实时PCR进行分析，并以GAPDH mRNA水平归一化。TAT-I24剂量依赖性地抑制rpo22 mRNA水平，而仅TAT不会引起抑制(a)。转染后24小时从上清液中提取病毒DNA并进行实时PCR。使用BSC-40细胞对上清液进行噬菌斑测定。在20μM的浓度，TAT-I24使上清液中的病毒DNA量(b)和噬菌斑形成单位(PFU)数量(c)减少>90％。
实施例11：细胞穿透肽I24抑制HEK293细胞中慢病毒的基因表达
HEK293细胞与肽I24、TAT标签的肽I24(TAT-I24)或TAT孵育，随后添加含有CMV启动子控制下的萤光素酶的慢病毒48小时。在20μM TAT-I24存在下，萤光素酶被下调了75％(图9)。
实施例12：肽I24的变体抑制报告基因表达
合成总共29种肽。将肽与编码荧光素酶的质粒一起施加于转染反应，并转染到HEK293细胞中。测试终浓度为2μM的所有肽，转染后24小时分析萤光素酶水平。表1显示了相对于DMSO对照，报道基因表达的抑制。
表1在瞬时转染质粒DNA中肽变体对HEK293中报告基因表达的影响
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实施例13：用含有抗生素抗性基因的质粒DNA和肽I24同时转化的细菌的克隆形成
的抑制
用含有氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的质粒以及作为溶媒对照的DMSO或I24转化感受态埃希氏大肠杆菌细胞。在第二天，与溶媒对照相比，在肽I24存在下菌落数量减少(图11)。
实施例14：用质粒和肽I24转化的埃希氏大肠杆菌细胞中质粒复制和β-内酰胺酶
MRNA表达的抑制
用含有氨苄青霉素抗性基因的质粒和肽I24转化感受态埃希氏大肠杆菌细胞。在指定时间点之后，通过归一化为埃希氏大肠杆菌单拷贝基因的实时PCR确定质粒总数和β-内酰胺酶mRNA水平。在肽I24存在下，质粒拷贝数和β-内酰胺酶mRNA水平均被下调(图12)。
实施例15：比较性数据
Deng等人的出版物(2004)描述了可以抑制人乳头瘤病毒11型E2蛋白的DNA结合、反式激活和DNA复制的肽。通过针对E2蛋白的噬菌体筛选鉴定肽。从组1的筛选，来自生物淘选(biopanning)的一个序列SVFYACFACF与肽I24，特别是FYACF基序具有相似性。Deng等人出版物中的另一种肽具有序列WSEQCFTCWW(表1中显示的序列28)。在几轮生物淘选中仅发现一次这两个序列，并且在出版物中未显示这些肽的任何生物活性数据。基于序列SVFYACFACF，特定氨基酸残基被改变或被包含在I24变体中(表1中显示了I24_M8)，其它变体是在F8和C9之间插入W或A或将F8变为L，这没有损害肽I24的活性。将I24的A3位变为V没有对效力产生消极影响，而用S取代C1对效力产生消极影响。当以2μM(在该浓度时I24抑制报告基因表达约90％)进行测试时，肽SVFYACFAC和WSEQCFTCWW在细胞转染测定中没有显示出抑制作用。然而，Deng等人没有提供关于这两种肽的任何数据，并且关注来自组1的第三种序列(EDGGSFMCLWCGEVHG；SEQ ID No.57)，其显示出对乳头瘤病毒11E2反式激活和复制功能的抑制作用。这些肽和肽I24之间可能存在共同的作用机制，但没有数据支持关于抑制“外来”DNA基因表达的效果，这强烈支持了用I24获得的发现的新颖性。Deng等人(2004年)显示用与细胞内核定位信号一起表达的肽EDGGSFMCLWCGEVHG(SEQ ID No.57)抑制E2依赖性报告基因表达，但这些作用与E2蛋白的相互作用相关联。在这项研究中没有示出在活细胞中的其它影响，也没有示出细胞穿透肽的使用(Deng等人，2004年)。相反，在没有核定位信号的情况下，肽I24或TAT-I24仅对“外来”DNA分子有活性而对细胞蛋白表达无活性，并且在直接应用于未在Deng等人(2004)的出版物或本领域已知的任何其它出版物中显示的细胞时发挥这些作用。
专利申请WO 2011/086116中公开的另一序列(PSALAFY(WO 2011/086116中的SEQID NO：58))也被包括。序列为CPSALAFYC(SEQ ID No.53)的肽M23，具有类似于I24的基序LAFYC，在细胞转染测定中在高达20μM的浓度(在该浓度，I24使报告基因表达抑制90％)无活性。
实施例16：细胞穿透型肽I24抑制单纯疱疹病毒的复制
用单纯疱疹病毒感染细胞，并通过噬斑形成测定法确定病毒的复制(参见以上实施例)。TAT-I24以剂量依赖性方式抑制单纯疱疹病毒的复制。
Claims (17)
1.肽，所述肽由氨基酸序列CLAFYACFC（SEQ ID No. 6）组成。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽是线性的或环状的。
3.一种肽化合物，包含两个或更多个根据权利要求1或2所述的肽。
4.根据权利要求3所述的肽化合物，其中所述肽化合物包含3个或4个根据权利要求1或2所述的肽。
5.根据权利要求3所述的肽化合物，其中所述肽化合物被修饰以表现出细胞穿透特性。
6. 根据权利要求3所述的肽化合物，其中所述肽化合物或至少一个所述肽以N-末端与细胞穿透肽融合，所述细胞穿透肽由氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ（SEQ ID No. 15）组成。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的肽化合物，其中至少一个所述肽与标记融合或缀合。
8.根据权利要求7所述的肽化合物，其中所述标记选自由染料、链霉亲和素、生物素或染料结合肽组成的组。
9.根据权利要求7所述的肽化合物，其中所述标记选自由荧光染料、链霉亲和素、生物素或染料结合肽组成的组。
10.根据权利要求7所述的肽化合物，其中所述标记选自由荧光蛋白、链霉亲和素、生物素或染料结合肽组成的组。
11.根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物在制备用于治疗哺乳动物中的病毒或细菌感染的药物中的用途，其中所述病毒感染为由杆状病毒、腺病毒、痘苗病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒引起的感染；并且所述细菌感染为由大肠杆菌引起的感染。
12.根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物在制备用于治疗DNA病毒感染的药物中的用途，其中所述DNA病毒为杆状病毒、腺病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。
13.一种核酸分子，编码根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物。
14.根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物在制备用于阻止细菌细胞在体外获得能够为所述细菌细胞提供抗生素抗性的基因或其功能片段的制剂中的用途，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
15.根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物在制备减毒活疫苗的添加剂中的用途，其中所述活疫苗为含有DNA病毒的活疫苗；并且所述DNA病毒为杆状病毒、腺病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。
16.根据权利要求1或2所述的肽或根据权利要求3至10中任一项所述的肽化合物抑制或阻止病毒在细胞培养物中扩散的用途，其中所述病毒为杆状病毒、腺病毒、痘苗病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒。
17.根据权利要求7或8所述的肽化合物在体外定位真核细胞内异源核酸分子的转录和/或翻译的用途，其中所述异源核酸分子具有病毒或细菌来源；所述病毒来源为杆状病毒、腺病毒、痘苗病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒来源；并且所述细菌来源为大肠杆菌来源。
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