ES2901899T3

ES2901899T3 - Inhibidores de la expresión génica

Info

Publication number: ES2901899T3
Application number: ES18779613T
Authority: ES
Inventors: Hanna Harant
Original assignee: Pivaris Bioscience GmbH
Current assignee: Pivaris Bioscience GmbH
Priority date: 2017-09-24
Filing date: 2018-09-24
Publication date: 2022-03-24
Anticipated expiration: 2038-09-24
Also published as: JP7276895B2; US11034726B2; EP3684783B1; WO2019057973A1; CN111132992B; JP2020536582A; EP3684783A1; CN111132992A; US20200270305A1

Abstract

Péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la fórmula I X1-X2-X3-X4-X5-(A)m-X6-X7-(X8)n-C (I) en donde X1 es C o S, X2 es L o A, X3 es A, V o L, X4 es F o Y, X5 es Y o F, X6 es C o R, X7 es F o L, X8 es W o A y m y n son independientemente 0 o 1, o una variante de los mismos, en donde el péptido consiste en 8 a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la expresión génica

Campo técnico

La presente invención se refiere a péptidos y compuestos que influyen en la transcripción y la traducción de moléculas de ácido nucleico dentro de un organismo, una célula o un tejido.

Técnica anterior

El ADN genómico de una célula eucariota se localiza en el núcleo y se compacta estrechamente en los cromosomas. La transcripción del ADN en ARN tiene lugar en el núcleo, seguida de una exportación del ARN al citosol, en donde se produce la síntesis de proteínas en los ribosomas. Por el contrario, un ADN "extraño", o también denominado ADN extracromosómico, exógeno o heterólogo, se define como un ADN no propio que normalmente no está presente en la célula diana y puede entrar en las células desde el exterior de las mismas. La molécula de ADN "extraño" puede ser, por ejemplo, un ADN plasmídico, un producto de PCR, un ADN sintético, un ADN vírico o de fago, un ADN bacteriano o cualquier otro ADN modificado genéticamente. Un ARN también puede ser un ácido nucleico "extraño", por ejemplo, proporcionado por un virus de ARN.

La transferencia de un ADN no propio, como moléculas de ADN "extraño", por ejemplo procedente de virus o entre bacterias, puede ocurrir en células diana eucariotas o procariotas, en donde la molécula de ADN entra en una célula y puede integrarse en el genoma del hospedador o se utiliza la maquinaria celular del hospedador para su propia replicación, transcripción y la traducción de las proteínas codificadas por el ADN "extraño". Un ADN "extraño" puede ser captado mediante endocitosis o por otros medios, tales como empaquetado dentro de un virus, y atraviesa el citosol desnudo o dentro de un virus antes de entrar en el núcleo de las células diana. Un ADN vírico se puede desempaquetar en el citosol en el sitio de importación nuclear.

En los eucariotas, existen mecanismos de defensa de la célula hospedadora para el reconocimiento de ácidos nucleicos "extraños" que incluyen receptores de reconocimiento de patrones, por ejemplo, los receptores de tipo Toll y otras moléculas de detección de ácidos nucleicos. Esos mecanismos representan el sistema inmunológico innato que conduce a una primera respuesta contra una infección vírica o bacteriana y la activación de una cascada de eventos posteriores para eliminar la infección.

La prevención o el tratamiento de las infecciones víricas sigue siendo un obstáculo principal. La prevención de las infecciones víricas mediante vacunación se limita a virus específicos, mientras que un tratamiento curativo de las infecciones víricas ya establecidas a menudo no es posible. Además, los virus son propensos a mutaciones y, por tanto, pueden evitar tratamientos preventivos o curativos ya establecidos. Además, solo para algunas infecciones víricas, se encuentran disponibles fármacos que pueden reducir o incluso eliminar un virus en un individuo infectado. Un virus requiere una célula hospedadora para su propia replicación.

Por ejemplo, los modos de interferencia con infecciones del virus del herpes es el uso de diferentes tipos de inhibidores, como los análogos de nucleósidos aciclovir o ganciclovir, inhibidores de la ADN polimerasa, como foscarnet, o inhibidores de la primasa/helicasa, como pritelivir. Otros antivirales incluyen inhibidores de la entrada como amantadina o enfuvirtida o inhibidores de proteasas para el tratamiento de la gripe o el VIH. Sin embargo, no existen inhibidores que puedan distinguir entre un ADN genómico y uno "extraño". Un control de una expresión génica específica de un virus podría ser, por tanto, un posible modo de intervención para inhibir una expresión génica vírica temprana y la replicación vírica subsiguiente en el organismo hospedador.

Compendio de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar compuestos que sean capaces de inhibir la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico extraño (es decir, heterólogo o exógeno), incluyendo los genes (inhibición de la expresión génica), en organismos.

Este objeto se logra mediante un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la fórmula I (SEQ ID N21)

X ⁱ-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-X⁶-X⁷-(X^e)ⁿ-C (I)

en donde X ⁱes C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁶es C o R, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1, en donde el péptido consiste en S a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La presente invención se refiere también a un compuesto peptídico que comprende dos o más péptidos idénticos o diferentes, en donde el péptido comprende o consiste en la fórmula I (SEQ ID N° 1)

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-X⁶-X⁷-(X^s)ⁿ-C (I)

en donde X ⁱes C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, Xs es C o R, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1, en donde el péptido consiste en S a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Sorprendentemente, se ha encontrado que los péptidos y compuestos peptídicos de la presente invención son capaces de inhibir la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico extraño/heterólogo/exógeno y/o la expresión génica de las moléculas de ADN extraño en las células, sin afectar a la expresión de los genes celulares que se encuentran de forma natural en dichas células. Por tanto, esa inhibición no es citotóxica o sustancialmente no lo es.

La capacidad de los péptidos y compuestos de la presente invención para inhibir o reducir significativamente la traducción y/o la transcripción de moléculas de ácido nucleico heterólogo dentro de un organismo (es decir, una célula viva), permite el tratamiento y/o la prevención de enfermedades que están asociadas con la traducción y/o la transcripción de moléculas de ácido nucleico extraño.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un péptido y/o un compuesto según la presente invención para el uso en el tratamiento de infecciones víricas, bacterianas, parasitarias o fúngicas en un mamífero o un individuo humano.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido o un compuesto según la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un péptido y/o un compuesto según la presente invención para inhibir la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una célula.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de péptidos y/o compuestos según la presente invención, para evitar que las células bacterianas adquieran genes o fragmentos funcionales de los mismos, capaces de proporcionar una resistencia a los antibióticos a dichas células bacterianas in vitro.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido y/o un compuesto según la presente invención como aditivo para una vacuna viva atenuada.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un péptido y/o un compuesto según la presente invención para inhibir o prevenir una propagación vírica en cultivos celulares.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso de un péptido y/o un compuesto de la presente invención para inhibir una infección con fagos de bacterias in vitro.

de la presente invención se refiere al uso de un péptido y/o un compuesto según la presente invención para localizar la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo dentro de una célula eucariota in vitro.

Breve descripción de las Figuras

FIG. 1. Efectos del péptido I24 sobre la producción de niveles de luciferasa (a) y la liberación de SEAP (b) en células transfectadas con vectores plasmídicos que codifican esas proteínas. Efecto del péptido I24 sobre la expresión del mutante M2 de p65 cuando se transfecta con el plásmido que codifica p65 M2 (Fig. 1c). Efecto del péptido sobre la expresión de GFP y número de células positivas para GFP cuando se transfectan con el plásmido que codifica GFP (Fig. 1d, e).

FIG. 2. El péptido I24 inhibe la expresión de la luciferasa cuando se transfecta con un plásmido que dirige la luciferasa bajo el control de un promotor de IL-S truncado (a) sin inhibir la liberación de IL-S (b).

FIG. 3. Niveles de la proteína (a) y el ARNm (b) de luciferasa, analizados después de los puntos de tiempo indicados después de una transfección del plásmido con el péptido I24.

FIG. 4. El péptido I24 inhibe los niveles de ARNm de la luciferasa bajo el control del promotor de CMV de manera más eficaz, en comparación con los niveles de ARNm del gen de resistencia a la neomicina bajo el control del promotor temprano de SV40, cuando se transfecta con un plásmido que contiene ambos genes en el mismo plásmido.

FIG. 5. El péptido I24 inhibe los niveles de luciferasa codificada por el plásmido en diferentes líneas celulares.

FIG. 6. Niveles de la proteína de luciferasa después de una transfección transitoria de un plásmido que codifica luciferasa y diferentes concentraciones de los péptidos I24, TAT, TAT-I24 y dímero de I24 (para una mejor resolución, ambos ejes se muestran a escala logarítmica).

FIG. 7. (a) Inhibición de la expresión del gen de la luciferasa transducido con baculovirus en células HEK293 tratadas con el péptido de fusión TAT-I24 (para una mejor resolución, ambos ejes se muestran a escala logarítmica), y (b) niveles de ARNm de luciferasa y de IL-S en células tratadas con vehículo DMSO, péptido de fusión TAT-I24 o TAT sola y baculovirus que expresa luciferasa y estimulación con TNF-a (b).

FIG. 8. TAT-I24 inhibe la expresión de luciferasa a partir de células HEK293 infectadas con partículas de adenovirus que codifican luciferasa y GFP (a). TAT-I24 inhibe los niveles de ARNm de luciferasa, GFP y el gen de la hexona codificado por el adenovirus (b). TAT-I24 inhibe la formación y la liberación de partículas de adenovirus al material sobrenadante a través de las células infectadas (c). TAT-I24 inhibe el desprendimiento celular 96 horas después de la infección con adenovirus (d).

FIG. 9. TAT-I24 inhibe la expresión génica vírica (a) y la replicación (b, c) del virus vaccinia en células HEK293.

FIG. 10. TAT-I24 inhibe la expresión del gen de la luciferasa a través de un lentivirus.

FIG. 11. La formación de colonias se inhibe en células de E. co litransformadas simultáneamente con plásmido e I24.

FIG. 12. Análisis del número de copias de plásmidos en células de E. co li4 y 6 horas después de la transformación del ADN del plásmido en presencia de niveles de ARNm del péptido I24 (a) y de p-lactamasa (bla).

Descripción de las realizaciones

La presente invención se refiere a un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la fórmula I (SEQ ID N21)

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-X⁶-X⁷-(X⁸)ⁿ-C (I)

en donde X¹es C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁶es C o R, X⁷es F o L, X⁸es W o A y m y n son independientemente 0 o 1 o una variante de los mismos, en donde el péptido consiste en 8 a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de la presente invención son capaces de inhibir la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico extraño/heterólogo/exógeno y/o la expresión génica de moléculas de ADN extraño en las células, sin afectar a la expresión de los genes celulares que se encuentran de forma natural en dichas células.

Según una realización preferida de la presente invención, la invención proporciona un péptido que puede inhibir la expresión génica del ADN "extraño" sin afectar a la expresión génica de proteínas codificadas por el genoma celular. Aunque el péptido I24 puede inhibir la expresión de la luciferasa bajo el control del promotor de interleucina-8, cuando se transfectaba junto con un plásmido que codifica la luciferasa bajo el control del promotor de interleucina-8 y una estimulación adicional con el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), los niveles endógenos de interleucina-8 inducida por TNF-a no se vieron afectados.

"Molécula de ácido nucleico extraño" (es decir, molécula de ácido nucleico heterólogo o exógeno), tal y como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en un organismo o una célula y que generalmente se introduce en ese organismo o célula por métodos conocidos en la técnica, incluyendo la fusión celular, infecciones víricas y otros métodos comunes conocidos en la técnica (por ejemplo, electroporación).

La transferencia de ADN "extraño" puede ocurrir por medio de una transfección de células eucariotas usando procedimientos de transfección liposómica, no liposómica, electroporación u otros procedimientos de transfección conocidos en la técnica, pero también mediante mecanismos de transferencia naturales tales como mediante infección vírica o fágica o transferencia de ADN entre bacterias u otros organismos. El ADN "extraño" también se puede transferir a células procariotas mediante procedimientos de transformación conocidos en la técnica o mediante una transferencia natural tal como la transferencia horizontal de genes.

El ácido nucleico "extraño", extracromosómico, heterólogo o exógeno, normalmente no está presente en la célula diana y puede ser un plásmido, un producto de PCR o cualquier otro ADN o ARN sintético, o un ácido nucleico empaquetado dentro de un virus o un fago, u obtenido a partir de organismos tales como bacterias, protozoos u hongos y es "extraño" para la célula diana. Dichas moléculas de ADN u organismos o virus que albergan un ADN pueden transferirse a la célula diana por medios químicos o biológicos, mediante endocitosis, infección o invasión. Una célula diana puede ser una célula eucariota, de mamífero, de vertebrado o invertebrado, una célula vegetal, una bacteria perteneciente a las eubacterias o arqueobacterias, hongos o protozoos.

Según una realización preferida de la presente invención, el ácido nucleico "extraño" representa preferentemente una molécula de ADN, lo más preferentemente una molécula de ADN de doble hebra, pero también puede ser una molécula de ARN o una molécula de ADN asociada con un ARN. El ADN "extraño" puede ser un ADN superenrollado o lineal y puede ser un ADN plasmídico o un producto de PCR o un oligonucleótido. El ácido nucleico "extraño" puede ser parte del genoma del agente infeccioso o ADN extracromosómico obtenido a partir de bacterias, fagos, virus, hongos o parásitos, tales como protozoos o helmintos.

El ADN del plásmido de expresión para la transfección de células eucariotas puede contener elementos específicos, tales como un promotor eucariota que dirige la expresión del gen codificado (como un promotor de CMV o SV40) mediante la ARN polimerasa II. Contiene además elementos tales como un sitio de poliadenilación, un sitio de cebado de ribosoma y, opcionalmente, un origen de replicación de eucariotas. También puede contener un promotor de T7 para secuenciar o para una expresión in vitro con la polimerasa T7. Para la propagación del plásmido en las bacterias, el plásmido de expresión también puede contener un origen de replicación bacteriano, un gen de resistencia a antibióticos para la selección y un promotor de procariotas que dirige la expresión del gen de resistencia a antibióticos.

Un virus puede proporcionar un ADN "extraño", tal como un virus de ADN natural o un virus modificado genéticamente para la transferencia de genes. Un virus de ADN bicatenario tiene un genoma vírico representado como un ADN bicatenario. Los virus de ADN bicatenario pertenecen a las familias de los Adenoviridae, Herpesviridae y Polyoamviridae, Papillomaviridae, Caudovirales, Ligamenvirales, virus similares a Baculo, tales como Baculoviridae, y virus nucleocitoplasmáticos de ADN de gran tamaño que pertenecen a la familia de los Poxviridae. Otra familia con un ADN circular, parcialmente bicatenario, pertenece a la familia de los Hepadnaviridae, representada por el virus de la hepatitis B, en donde el ADN circular se transporta al núcleo y se transcribe, seguido de una transcripción inversa del ARN pregenómico sintetizado. Otras clases de virus son los virus de ADN monocatenario y los virus de ARN, que contienen ARN monocatenario o bicatenario. Un ADN "extraño" también puede ser un ADN de fago. Los fagos con un genoma de ADN bicatenario pertenecen a las familias de los Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Tectiviridae, Corticoviridae, Plasmaviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Fuselloviridae, Salterprovirus o Guttaviridae. Ejemplos de vectores víricos para la transducción de genes usados en la investigación o tecnología biomolecular, son los virus vaccinia, adenovirus, virus del herpes simple, baculovirus, lentivirus o virus adenoasociados.

Por tanto, una aplicación del péptido y el compuesto de la presente invención puede ser la prevención de una expresión génica temprana a partir de un ADN vírico que conduce a una reducción o inhibición posterior de la replicación vírica.

En contraste con la prevención de la transferencia de ADN "extraño" y su expresión génica, el péptido y el compuesto de la presente invención también pueden ser útiles en situaciones en las que se pretende una expresión génica, como mediante una transferencia génica durante una terapia génica. Dicho inhibidor puede ser útil para una expresión génica selectiva desde el transgén en un tipo de célula diana específica, excluyendo una expresión génica en otros tipos de células tratadas con el inhibidor.

Una célula diana del péptido y el compuesto de la presente invención puede ser una célula eucariota, tal como una célula primaria o células dentro de un tejido, pero también puede ser una línea celular, ya sea una línea celular obtenida a partir de un tumor o una línea celular modificada genéticamente o inmortalizada por otros medios, tales como a través de un virus. La célula diana puede ser originaria de un mamífero, incluyendo el ser humano, pero también puede tener un origen de vertebrado o invertebrado, tal como una célula de insecto. La célula diana también puede ser una célula procariota o arquea, tales como bacterias o arqueas.

Como se muestra en los ejemplos y según una realización preferida de la presente invención, los péptidos de la presente invención, en particular el péptido I24, inhiben los niveles de ARNm de células transfectadas con plásmido de expresión y péptido simultáneamente, ejemplificado mediante la reducción de los niveles de ARNm de luciferasa en las células transfectados con un plásmido de expresión de luciferasa y un péptido simultáneamente. La reducción de los niveles de ARNm y de niveles de proteínas tiene una dependencia comparable del tiempo y de la dosis. La inhibición de los niveles de ARNm en las células transfectadas puede ser a través de un contacto directo entre el péptido y la molécula de ADN, evitando así las etapas subsiguientes de transcripción del ARN o mediante una inhibición de la actividad de la ARN polimerasa dependiente de ADN o mediante una inhibición de la unión o interacción de factores del hospedador con la molécula de ADN, implicados en una transactivación, como un factor de transcripción, un factor asociado con un factor de transcripción o un factor implicado en una activación de la transcripción general, por ejemplo, una proteína de unión a la caja TATA o un factor relacionado. Una interacción con el ADN ya puede ocurrir en la membrana o el citoplasma antes de que la molécula de ADN entre en el núcleo. Aunque es poco probable, el inhibidor puede actuar a nivel postranscripcional afectando a la estabilidad del ARNm.

Como se muestra en los ejemplos, los péptidos de la presente invención, en particular el péptido I24, inhiben los niveles de proteína en células eucariotas transfectadas con un plásmido de expresión, independientemente de ciertos elementos del plásmido de expresión. La inhibición es independiente del tipo de gen de resistencia a antibióticos, bacteriano o eucariota. La inhibición de la producción de proteínas a través del péptido en células eucariotas depende parcialmente del tipo de promotor eucariota presente en el plásmido de expresión. El promotor puede ser, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV) o un promotor eucariota natural, como el promotor de interleucina-8 (CXCL-8) o un promotor sintético, como un promotor mínimo con elementos tales como los sitios de unión de NF-KB, que dirigen la transcripción. Un gen bajo el control del promotor temprano de SV40 es inhibido de forma menos potente por el péptido I24 que en comparación con la luciferasa bajo el control del promotor de CMV.

Según una realización preferida de la presente invención, el extremo N-terminal del péptido de la presente invención puede ser una amina, el extremo C-terminal puede ser una amida o un ácido.

El péptido y el compuesto de la presente invención se pueden generar mediante síntesis de péptidos clásica y son solubles en dimetilsulfóxido (DMSO) pero pueden ser solubles en otros disolventes, tales como soluciones acuosas, alcoholes, disolventes orgánicos o emulsiones.

Los péptidos de la presente invención también se pueden considerar que son "inhibidores" porque los péptidos "inhiben" o incluso evitan la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico extraño.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto peptídico que comprende dos o más péptidos idénticos o diferentes que comprenden o consisten en la fórmula I (SEQ ID N° 1)

X ⁱ-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-X⁶-X⁷-(X^e)ⁿ-C (I)

en donde X ⁱes C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁶es C o R, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1 o una variante de los mismos, en donde el péptido consiste en S a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

"Compuesto peptídico", tal y como se usa en este documento, se refiere a un compuesto que comprende residuos de aminoácidos que están unidos entre sí por un enlace peptídico (es decir, un enlace amida) formando una cadena de residuos de aminoácidos. Un "compuesto peptídico" según la presente invención comprende al menos un péptido que comprende o consiste en la fórmula I. El compuesto peptídico puede comprender junto con al menos un péptido de la presente invención, otros restos químicos como proteínas, polisacáridos, ácidos grasos tales como ácido palmítico, lípidos, combinaciones de los mismos que incluyen lipoproteínas y glicolípidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNip, ARNhc, oligonucleótidos antisentido), fármacos de molécula pequeña (por ejemplo, análogos de nucleósidos, inhibidores de helicasa) y agentes de formación de imágenes (por ejemplo, fluoróforo, puntos cuánticos, trazadores radiactivos, quelatos metálicos).

"Compuesto", tal y como se usa en este documento, puede ser un polipéptido o un péptido o cualquier otra sustancia química que se conjuga o se une con al menos un péptido que comprende o consiste en la fórmula (I). Por tanto, un "compuesto peptídico" de la presente invención puede ser un polipéptido, un péptido o una proteína de fusión o un conjugado o una combinación de los mismos.

Una "variante" del al menos un péptido que comprende o consiste en la fórmula I, puede comprender al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, hasta un máximo de cinco, preferiblemente hasta un máximo de cuatro, más preferiblemente hasta un máximo de tres, más preferiblemente hasta un máximo de dos, en particular una, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de un residuo hidrófobo por otro, como F, V, L o A entre sí, o sustituciones de un residuo polar por otro, como entre K y R; E y D; o Q y N. Otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen propiedades de hidrofobicidad similares, son bien conocidas (Kyte y Doolittle, 19S2, J. Mol. Biol. 157 (1): 105-132). En la siguiente tabla se presentan ejemplos de sustituciones de aminoácidos:

Según una realización preferida de la presente invención, la potencia del péptido puede modificarse cambiando, eliminando, insertando o añadiendo residuos de aminoácidos al péptido mediante, por ejemplo, síntesis química de péptidos. Se tolera un intercambio conservador de residuos de aminoácidos en posiciones específicas del péptido sin que afecten a la actividad. También son posibles inserciones de aminoácidos. Puede realizarse una mejora o un deterioro de la actividad del péptido mediante sustituciones específicas de aminoácidos. Para una actividad en el ensayo de transfección celular, se pueden realizar los siguientes cambios de aminoácidos: inserción de W o A entre F8 y C9 del péptido I24; F8 puede ser L, A3 puede ser V o L, F4 puede ser Y, Y5 puede ser F, A6 puede eliminarse, C1 puede ser S, C7 puede ser R. El motivo central del péptido de la presente invención es preferiblemente C I-X ¹-X²-X³-X⁴-(A)-C2-X⁵-(WA)-C3 (SEQ ID N° 59) en donde X ⁱes L o A, siendo X²los residuos alifáticos A, V o L, y siendo X³y X⁴los residuos de aminoácidos aromáticos F o Y. La posición C2 puede reemplazarse por un residuo de aminoácido diferente. En una realización particularmente preferida de la presente invención, ese motivo representa el motivo mínimo para provocar un efecto inhibidor sobre la expresión génica del ADN "extraño" y una inhibición de la actividad de la ARN polimerasa.

"A" en la fórmula (I) significa alanina, "C" es cisteína, "S" es serina, "L" es leucina, "V" es valina, "F" es fenilalanina, "Y" es tirosina, "R" es arginina y "W" es triptófano. "-" en la fórmula (I) indica un enlace peptídico entre dos residuos de aminoácidos tal y como está presente en péptidos, polipéptidos y proteínas.

En una realización particularmente preferida de la presente invención X⁶de la fórmula (I) es C.

En otra realización preferida de la presente invención X¹es C, X²es L y X⁶es C.

En otra realización preferida de la presente invención m es 1.

En una realización preferida de la presente invención, el péptido de la presente invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos X ⁱ-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-C-X⁷-(X^s)ⁿ-C (SEQ ID N° 60), en donde X ⁱes C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1 o una variante de los mismos.

En otra realización preferida de la presente invención, el péptido de la presente invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos C-L-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-C-X⁷-(X^s)ⁿ-C (SEQ ID N° 61), en donde X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1 o una variante de los mismos.

Con el fin de mejorar la capacidad del compuesto de la presente invención para inhibir o prevenir la traducción y/o la transcripción de moléculas de ácido nucleico extraño dentro de un organismo/célula, dicho compuesto puede comprender más de un péptido de acuerdo con la fórmula (I) y la presente invención. Por tanto, el compuesto de la presente invención puede comprender o consistir en 1 a 4, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 o 2, péptidos que comprenden o consisten en la fórmula I.

El compuesto peptídico de la presente invención puede comprender más de un péptido de fórmula (I), por lo que cada péptido puede consistir en la misma secuencia de aminoácidos o en diferentes secuencias de aminoácidos. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el compuesto comprende dos o más péptidos de fórmula (I) y la presente invención consiste en la misma secuencia de aminoácidos. Los multímeros resultantes (por ejemplo, dímeros y trímeros) tienen la ventaja de que el efecto inhibidor de la transcripción/traducción de los péptidos de la presente invención se puede incrementar significativamente.

Según una realización preferida de la presente invención, el péptido de la presente invención consiste en 8 a 30, preferiblemente de 8 a 20, más preferiblemente de 8 a 15, más preferiblemente de 8 a 12, más preferiblemente de 8 a 10, residuos de aminoácidos.

El péptido de la presente invención puede ser lineal o cíclico. Los métodos para producir compuestos cíclicos, en particular péptidos cíclicos, son bien conocidos en la técnica. Debido a la presencia de residuos de cisteína en el extremo C-terminal y en algunos casos en el extremo N-terminal del péptido de fórmula (I) y la presente invención, se facilita la producción de péptidos cíclicos. Por supuesto, los péptidos cíclicos también se pueden sintetizar proporcionando un enlace amida entre los extremos N y C-terminales del péptido de la presente invención.

Según una realización preferida de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del péptido de la presente invención se selecciona a partir del grupo que consiste en CLAFYACFWC (SEQ ID N° 2), CLAFYACLWC (s Eq ID N° 3), CLAFYACFAC (SEQ ID N24), CLVFYACFC (SEQ ID N25), CLAFYACFC (SEQ ID N26), CLLYFCFC (SEQ ID N2 7), CAAFYACFC (SEQ ID N28), SLAFYACFAC (SEQ ID N29), CLAFYARFC (SEQ ID N210), CLAFYCFAC (SEQ ID N211), CLAFYCFC (SEQ ID N212) y CLAYFCFC (SEQ ID N213).

Los péptidos particularmente preferidos de la presente invención comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en CLAFYACFWC (SEQ ID N° 2), CLAFYACLWC (SEQ ID N23), CLAFYACFAC (SEQ ID N24), CLVFYACFC ( SEQ ID N25), CLAFYACFC (SEQ ID N26) y CLLYFCFC (SEQ ID N27), en particular CLAFYACFWC (SEQ ID N22) o CLAFYACLWC (SEQ ID N23).

Para facilitar la translocación del compuesto y los péptidos de la presente invención al interior de la célula o entre compartimentos celulares, el compuesto de la presente invención o el al menos un péptido según la presente invención, se modifica para que muestre propiedades de penetración celular. La presencia de restos que penetran en una célula dentro del compuesto peptídico de la presente invención, permite controlar más eficazmente la translocación de dicho compuesto al interior de las células y entre los compartimentos celulares. Esto puede dar lugar a una inhibición o prevención aún mejor de la traducción y/o la transcripción de las moléculas de ácido nucleico extraño dentro de una célula u organismo ya que el compuesto y el péptido de la presente invención se pueden ubicar dentro de una célula u organismo en donde dicha traducción y/o transcripción se va a inhibir o reducir.

Según una realización preferida de la presente invención, el al menos un péptido o compuesto peptídico se fusiona a través del extremo C y/o N-terminal directamente o mediante un enlazador, con al menos un péptido que penetra en la célula.

La expresión "péptidos que penetran en las células", tal y como se usa en este documento, se refiere a péptidos (cortos) que son capaces de transportar diferentes tipos de moléculas a través de la membrana plasmática y, por lo tanto, facilitan la captación celular de diversas moléculas moleculares (desde partículas nanométricas hasta pequeñas moléculas químicas, macromoléculas y grandes fragmentos de ADN). La molécula que se va a transportar está asociada con el péptido que penetra en la célula, ya sea a través de un enlace químico mediante enlaces covalentes (p. ej., conjugación, fusión) o mediante interacciones no covalentes tales como Pep-1. Los péptidos que penetran en las células suelen tener una composición de aminoácidos que o bien contiene una gran abundancia relativa de aminoácidos cargados positivamente, tales como lisina o arginina, o tienen una secuencia que contiene un patrón alternante de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos hidrófobos no polares. Estos dos tipos de estructuras se denominan policatiónicas o anfipáticas, respectivamente. Los péptidos que penetran en las células tienen diferentes tamaños, secuencias de aminoácidos y cargas, pero todos esos péptidos tienen una característica común que es la capacidad de translocar la membrana plasmática y facilitar la entrega de diversas moléculas en el citoplasma o en un orgánulo de una célula.

El péptido o el compuesto peptídico de la presente invención puede fusionarse a través del extremo C-terminal y/o N-terminal directamente o mediante un enlazador, con al menos un péptido que penetra en la célula. Un enlazador tiene la ventaja de proporcionar una distancia entre el péptido y/o el compuesto de la presente invención y el péptido que penetra en la célula. Una ventaja adicional es incorporar uno o más sitios de escisión entre el péptido y/o el compuesto de la presente invención y el péptido que penetra en la célula, permitiendo que una proteasa, por ejemplo, elimine el péptido que penetra en la célula.

Según otra realización preferida de la presente invención, el péptido que penetra en la célula se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido TAT y un marcador policatiónico.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos que penetran en las células pueden tener estructuras policatiónicas. Por lo tanto, se prefiere particularmente añadir péptidos policatiónicos (es decir, marcadores policatiónicos) al péptido y/o al compuesto de la presente invención. Otros péptidos que penetran en las células pueden obtenerse a partir de proteínas naturales que se sabe que favorecen la translocación de otras moléculas a través de las membranas celulares. El péptido TAT, por ejemplo, que se puede obtener a partir del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), es un péptido bien conocido que penetra en la célula.

Según una realización preferida de la presente invención, el péptido que penetra en la célula se obtiene a partir de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y puede comprender o consistir en los residuos de aminoácidos 37 a 72, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 37 a 60, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 48 a 60, de SEQ ID N214 (MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTTKALGISY-GRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQPRGDPTGPKE), en particular, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID N2 15), YGRKKRRQRRR (SEQ ID N2 16), CYGRKKRRQRRR (SEQ ID N217), YGRKKRRQRRRGGG (SEQ ID N218) o CGRKKRRQRRR (SEQ ID N219), en donde GRKKRRQRRRPPQ (SEQ iD N° 15) se usa lo más preferiblemente.

Como se ha mencionado anteriormente, otro aspecto de la presente invención se refiere al péptido I24 o a cualquier otro péptido de la presente invención fusionado con una molécula que puede mejorar la permeabilidad celular o la penetración celular. Un marcador de ese tipo puede ser, por ejemplo, un péptido t At o un marcador policatiónico, tal como un marcador de poliarginina. Los experimentos han mostrado que el TAT-marcador (TAT-I24: GRKKRRQRRRPPQCLAFYACFC; SEQ ID NO: 20), por ejemplo, aumenta la potencia del péptido para la inhibición de los niveles de la luciferasa codificada por el plásmido, cuando se transfecta junto con el ADN del plásmido (CI50 = 0,06 pM) mientras que el péptido TAT solo es inactivo.

Los péptidos que penetran en las células que se utilizarán en la presente invención también se pueden obtener a partir del homeodominio proteico Antennapedia de Drosophila que comprende la secuencia RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 21), o tramos de poliarginina que incluyen RRRRRRR (SEQ ID NO: 22), es decir (Arg)7, RRRRRRRC (SEQ ID NO: 23), es decir (Arg)7-C, o RRRRRRRR (SEQ ID NO: 24), es decir (Arg)8, o RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 25), es decir (Arg)9, o se pueden obtener a partir de buforina que comprende la secuencia TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 26), o se pueden obtener a partir de transportan que tiene la secuencia GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 27) o se pueden seleccionar a partir del péptido KALA que comprende la secuencia WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEQ ID NO: 28), o MAP que comprende la secuencia KLALKLALKALKAALKLA (29), o se pueden seleccionar a partir de Pep-1 que comprende la secuencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 30), hCT (9-32), que comprende la secuencia LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 31); pVEC, que comprende la secuencia LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 32); pISL, que comprende la secuencia RVlRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 33); Erns, que comprende la secuencia RQGAARv Ts WLGRQLRIAGKRLEGRSK (SEQ ID NO: 34); restrictocina L3, que comprende la secuencia KLIKGRTPIKFGK (SEQ ID NO: 35); oMPG que comprende la secuencia GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 36) o GALFLGFLGAAGSTMGAWsQPKSKRKV-cisteamida; u obtener a partir de la señal de localización nuclear (SLN) del antígeno T largo de SV-40 que comprende las secuencias PKKKRKVEDPYC (SEQ ID N° 37) o CGGGPKKKRKVED (SEQ ID NO: 38), o la glicoproteína del virus de la rabia (RVG) que comprende la secuencia YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG (SEQ ID NO: 39).

La expresión génica de un virus infeccioso, tal como un baculovirus, puede reducirse mediante el péptido fusionado con un marcador permeable para las células, tal y como se ejemplifica mediante una expresión reducida de la luciferasa de un baculovirus que codifica el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de CMV con I24 fusionado con un marcador TAT N-terminal (TAT-I24: GRKKRRQRRRPPQCLAFYACFC; SEQ ID NO: 20), mientras que el péptido I24 sin marcar solo es débilmente activo para inhibir la expresión de la luciferasa. La CI50 para la inhibición de la expresión de la luciferasa mediada por baculovirus a través de TAT-I24 es 0,15 pM. En un aspecto, la invención se refiere a la fusión de un péptido y un marcador que es superior al péptido o al marcador solo. En otro aspecto, la invención se refiere a la fusión de un péptido y un marcador que también puede reducir los niveles de ARNm del gen codificado por baculovirus, sin inhibir la expresión de los genes celulares, lo que se ejemplifica con una expresión del ARNm de la interleucina-8 que no se ve afectada.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al péptido I24 marcado con TAT que es, como todos los péptidos y compuestos de la presente invención, capaz de inhibir la expresión génica de un adenovirus, un virus de ADN de doble hebra, aunque la inhibición ocurre a concentraciones más altas (CI50 = 6 pM). Además de la inhibición de la expresión del gen indicador, la expresión del gen de la hexona vírica se inhibe de una manera comparable.

Según una realización preferida de la presente invención, el péptido I24 marcado con TAT es capaz de inhibir una replicación vírica en las células diana, lo que se ejemplifica mediante una reducción de las partículas de adenovirus liberadas al material sobrenadante y una reducción del desprendimiento celular en comparación con las células tratadas con vehículo, después de una infección con adenovirus, demostrando una inhibición de la producción de virus en la célula diana.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al péptido I24 marcado con TAT que, como todos los péptidos y compuestos de la presente invención, puede inhibir la expresión génica y la replicación del virus vaccinia, un virus de ADN que pertenece a los virus nucleocitoplasmáticos de ADN grande de la familia de los Poxviridae. Cuando se infectaban células HEK293 con virus vaccinia y se trataban con TAT-I24, la expresión génica vírica se inhibía en >95% y la replicación del virus en >90% con TAT-I2420 pM.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al péptido I24 marcado con TAT que, como todos los péptidos y compuestos de la presente invención, puede inhibir la expresión génica y la replicación de los virus del herpes, virus de ADN bicatenario, ejemplificado por la inhibición de la replicación del virus del herpes simple. Otros miembros de la familia de los virus del herpes son el citomegalovirus o el virus de la varicela zóster, entre otros, tal como el virus de Epstein-Barr.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al péptido I24 marcado con TAT que, como todos los péptidos y compuestos de la presente invención, también puede provocar una inhibición de la expresión génica de un virus de ARN. Una inhibición parcial de la expresión génica se observa con un virus de ARN monocatenario, ejemplificado por Lentivirus-Luc, un retrovirus que contiene luciferasa bajo el control de un promotor de CMV. Cuando las células HEK293 se trataban con el péptido TAT-I24 y se infectaban con lentivirus que codificaba luciferasa bajo el control del promotor de CMV, se observaba una reducción del 75% en los niveles de luciferasa con la concentración más alta (20 pM).

El inhibidor/péptido de la presente invención, ejemplificado por el péptido I24, consiste en nueve residuos de aminoácidos con la siguiente secuencia (desde el extremo amino-terminal (N) al extremo carboxi-terminal (C)) Cys-Leu-Ala-Phe-Tyr-Ala-Cys-Phe-Cys (SEQ ID NO: 6). Dicho péptido puede entrar en contacto con la molécula de ADN cuando se transfiere por cualquier medio a la célula diana, presumiblemente en la membrana celular o dentro del citosol. El péptido ya puede entrar en contacto con la molécula de ADN antes de entrar en la célula o ponerse en contacto con la molécula de ADN dentro de la célula, por ejemplo, mediante una versión del péptido que penetra en la célula.

La secuencia del péptido I24 se obtiene a partir de un péptido, que se identificó originalmente mediante un cribado de fagos frente a un ribosoma traductor, para identificar ligandos peptídicos de los péptidos señal y que se describe en el documento de solicitud de patente w O 2011/086116 (LAFYACF (SEQ ID NO: 39 en el documento WO 2011/086116)). Sin embargo, el modo de acción descrito en ese documento no está relacionado con la diana que se criba del péptido señal original. Un ensayo del péptido en diversos sistemas celulares mostraba un efecto independiente del péptido señal diana original. Sorprendentemente, el péptido inhibía la expresión génica de un ADN "extraño" introducido en una célula diana, sin afectar a la expresión génica celular codificada por el genoma. No existe una relación entre los péptidos señal y la regulación de la expresión génica del ADN "extraño", que sea conocida en la técnica que respalde la novedad de estos hallazgos.

Según una realización particularmente preferida de la presente invención, el compuesto peptídico y/o el al menos un péptido de la presente invención, se fusiona o se conjuga con un marcador.

El péptido y/o el compuesto de la presente invención se pueden conjugar o fusionar con otra molécula que actúa como marcador para el producto de la fusión o conjugación. La presencia de marcadores permite la detección y localización directa o indirecta del péptido y/o el compuesto de la presente invención, por ejemplo, en una célula o en un organismo.

El marcador utilizado en la presente invención puede tener estructuras variables que incluyen polipéptidos, proteínas y otras estructuras químicas. El marcador se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en un colorante, preferiblemente un colorante fluorescente, más preferiblemente una proteína fluorescente, estreptavidina, biotina o un péptido que se une al colorante.

El péptido de la presente invención también se puede fusionar, preferentemente a través de su extremo N-terminal, con otros componentes tales como otros péptidos o productos químicos como colorantes o biotina que pueden ser útiles para estudios de la localización y de la actividad. El compuesto de la presente invención, que comprende preferiblemente el péptido I24, también puede ser un multímero, preferiblemente un dímero. El dímero mostraba en los ejemplos una potencia aumentada en comparación con el monómero (CI50 = 0,09 pM).

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un péptido o un compuesto según la presente invención para uso en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad asociado con la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo en las células de un mamífero o de un individuo humano.

Los péptidos y compuestos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad o trastorno causado por la traducción y/o la transcripción de moléculas de ácido nucleico heterólogo en células de mamíferos y de sujetos humanos. Tales enfermedades y trastornos incluyen, entre otros, infecciones víricas, como una infección con el virus del herpes simple, que causa el herpes labial y el herpes genital, el citomegalovirus, el virus de la varicela zóster que causa la varicela y el herpes zóster en adultos, el virus del papiloma que causa verrugas o ciertos tipos de cáncer, o adenovirus.

Un "trastorno o enfermedad asociado con la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo en las células" incluye trastornos y enfermedades que son causados por la traducción o la transcripción de moléculas de ácido nucleico que normalmente no están presentes en las células que se consideran sanas.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un péptido o un compuesto peptídico de la presente invención para uso en el tratamiento de infecciones víricas, bacterianas, parasitarias o fúngicas en un mamífero o un individuo humano. Los péptidos o compuestos peptídicos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de infecciones con un virus de ADN, tal como un virus de ADN bicatenario, preferiblemente un virus de la familia de los Poxviridae, más preferiblemente un virus de la familia de los Adenoviridae o más preferentemente un virus de la familia de los Herpesviridae, en particular el virus del herpes simple, el citomegalovirus y el virus de la varicela zóster.

Los péptidos y los compuestos peptídicos de la presente invención han mostrado que inhiben o reducen significativamente la tasa de transcripción y/o traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo ("extraño") que están presentes en una célula u organismo (multicelular). Los péptidos y, por tanto, los compuestos de la presente invención que tienen esas propiedades dan como resultado el tratamiento de una infección vírica, bacteriana, parasitaria o fúngica en un mamífero o un individuo humano. En particular, las infecciones causadas por virus pueden tratarse usando los péptidos y compuestos de la presente invención, porque los virus normalmente requieren otros organismos o células para replicarse.

Los péptidos y compuestos de la presente invención se pueden administrar a un mamífero o a un ser humano por vía oral, intravenosa, subcutánea, tópica, intravaginal, intraocular, inhalada o nasal.

Los péptidos y los compuestos tal y como se describen en el presente documento de la invención, se pueden administrar solos por vía oral, intravenosa, subcutánea, tópica, intravaginal, intraocular, inhalada o nasal a un sujeto (por ejemplo, como un péptido o compuesto purificado) o como un componente de una composición o un medicamento, tal y como se describe en el presente documento. Las composiciones se pueden formular con un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. La formulación debe adaptarse al modo de administración, por ejemplo, administración intravenosa o subcutánea. Los métodos para formular composiciones son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceuticals Sciences, 17a edición, Mack Publishing Co., (Alfonso R. Gennaro, compilador) (1989)).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones salinas (por ejemplo, NaCl), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos como lactosa, amilosa o almidón, azúcares tales como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, liposomas, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Las formulaciones se pueden mezclar con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes y/o aromáticas y similares) que no reaccionen de manera perjudicial con los péptidos y los compuestos de la presente invención o que no interfieran con su actividad. En una realización preferida, se usa un vehículo soluble en agua adecuado para administración intravenosa.

La formulación de la presente invención que comprende los péptidos y compuestos descritos en el presente documento, también puede contener agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores del pH. La composición puede ser una solución líquida, una suspensión, una emulsión, una formulación de liberación sostenida o un polvo. La composición también se puede formular como supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales como los triglicéridos.

En una realización preferida de la presente invención, una composición para administración intravenosa normalmente es una solución en un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de una dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición debe administrarse mediante infusión, se puede dispensar con un frasco de infusión que contiene agua de calidad farmacéutica estéril, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres, como las obtenidas a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres como las obtenidas a partir de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

El péptido y el compuesto peptídico de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier ruta apropiada, preferiblemente tópica, nasal, subcutánea, intravenosa, inhalada, parenteral, intradérmica, transdérmica, rectal, intravaginal, intraocular o transmucosa. Se puede utilizar más de una ruta al mismo tiempo, si se desea.

Las dosis o cantidades particulares que se van a administrar según la presente invención pueden variar, por ejemplo, dependiendo de la naturaleza y/o la extensión del resultado deseado, de los detalles de la ruta y/o el momento de la administración, y/o de una o varias características (por ejemplo, peso, edad, historial personal, característica genética, parámetro de estilo de vida, etc., o combinaciones de las mismas). Esas dosis o cantidades pueden ser determinadas por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, se determina una dosis o una cantidad apropiada según técnicas clínicas convencionales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una dosis o una cantidad apropiada es una dosis o una cantidad suficiente para reducir una puntuación del índice de gravedad de una enfermedad en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% o más. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una dosis o una cantidad apropiada es una dosis o una cantidad suficiente para reducir una puntuación del índice de gravedad de una enfermedad en un 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%. Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, se determina una dosis o una cantidad apropiada mediante el uso de uno o más ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar intervalos de dosificación o cantidades, deseables u óptimos, que se van a administrar.

El péptido y el compuesto de la presente invención se administran preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se determina en gran medida basándose en la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para lograr un beneficio significativo para el mamífero o el individuo humano (por ejemplo, para tratar, modular, curar, prevenir y/o mejorar la enfermedad o el trastorno subyacente). Las dosis o cantidades apropiadas que se van a administrar pueden extrapolarse de las curvas de dosis-respuesta obtenidas in vitro o a partir de sistemas de ensayo en modelos animales.

Las cantidades de una dosificación terapéuticamente eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención, incluyendo sales de los mismos, pueden oscilar entre aproximadamente 10-1000 mg (p. ej., aproximadamente 20 mg-1000 mg, 30 mg-1000 mg, 40 mg-1000 mg, 50 mg-1000 mg, 60 mg-1000 mg, 70 mg-1000 mg, 80 mg-1000 mg, 90 mg-1000 mg, aproximadamente 10-900 mg, 10-800 mg, 10-700 mg, 10-600 mg, 10-500 mg, 100-1000 mg, 100-900 mg, 100-800 mg, 100-700 mg, 100-600 mg, 100-500 mg, 100-400 mg, 100-300 mg, 200-1000 mg, 200-900 mg, 200 800 mg, 200-700 mg, 200-600 mg, 200-500 mg, 200-400 mg, 300-1000 mg, 300-900 mg, 300-800 mg, 300-700 mg, 300-600 mg, 300-500 mg, 400 mg-1000 mg, 500 mg-1000 mg, 100 mg-900 mg, 200 mg-800 mg, 300 mg-700 mg, 400 mg-700 mg y 500 mg-600 mg). Según una realización preferida de la presente invención, el péptido y el compuesto de la presente invención se administran en una cantidad igual o superior a aproximadamente 10 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg y/o menos de aproximadamente 1000 mg, 950 mg, 900 mg, 850 mg, 800 mg, 750 mg, 700 mg, 650 mg, 600 mg, 550 mg, 500 mg, 450 mg, 400 mg, 350 mg, 300 mg, 250 mg, 200 mg, 150 mg o 100 mg.

El péptido y el compuesto de la presente invención se pueden administrar en una o varias dosis. La cantidad terapéuticamente eficaz del péptido y/o el compuesto de la presente invención puede administrarse en uno o varios días, lo más preferiblemente en un día.

Una cantidad de la dosificación terapéuticamente eficaz puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 500 mg/kg de peso, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 400 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 300 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 200 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 100 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 90 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 80 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 70 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 60 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 50 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 40 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 30 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 25 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 20 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 15 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a 10 mg/kg de peso. La cantidad terapéuticamente eficaz descrita en el presente documento se puede proporcionar en una dosis al día.

Una cantidad de dosificación terapéuticamente eficaz puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, p. ej., de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,03 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,04 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 1 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 0,9 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 0,8 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 0,7 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso.

Una cantidad de dosificación terapéuticamente eficaz puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,1 mg/kg de peso, p. ej., de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,09 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,08 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,07 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,06 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,05 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a aproximadamente 0,04 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,03 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,02 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,019 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,018 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,017 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,016 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,015 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,014 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,013 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,012 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,011 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,01 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,009 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,008 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,007 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,006 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,005 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,004 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,003 mg/kg de peso, de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso a 0,002 mg/kg de peso. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser 0,0001 mg/kg de peso, 0,0002 mg/kg de peso, 0,0003 mg/kg de peso, 0,0004 mg/kg de peso, 0,0005 mg/kg de peso, 0,0006 mg/kg de peso, 0,0007 mg/kg de peso, 0,0008 mg/kg de peso, 0,0009 mg/kg de peso, 0,001 mg/kg de peso, 0,002 mg/kg de peso, 0,003 mg/kg de peso, 0,004 mg/kg de peso, 0,005 mg/kg de peso, 0,006 mg/kg de peso, 0,007 mg/kg de peso, 0,008 mg/kg de peso, 0,009 mg/kg de peso, 0,01 mg/kg de peso, 0,02 mg/kg de peso, 0,03 mg/kg de peso, 0,04 mg/kg de peso, 0,05 mg/kg de peso, 0,06 mg/kg de peso, 0,07 mg/kg de peso, 0,08 mg/kg de peso, 0,09 mg/kg de peso o 0,1 mg/kg de peso. La dosis eficaz para un sujeto particular se puede variar (por ejemplo, aumentar o disminuir) a lo largo del tiempo, dependiendo de las necesidades de dicho sujeto (es decir, mamífero o individuo humano).

Se puede administrar una dosis eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención que varía de aproximadamente de 1-1000 gg/kg/día (p. ej., que varía de aproximadamente de 1-900 gg/kg/día, de 1-800 gg/kg/día, de 1-700 gg/kg/día, de 1-600 gg/kg/día, de 1-500 gg/kg/día, de 1-400 gg/kg/día, de 1-300 gg/kg/día, de 1-200 gg/kg/día, de 1-100 gg/kg/día, de 1-90 gg/kg/día, de 1-80 gg/kg/día, de 1-70 gg/kg/día, de 1-60 gg/kg/día, de 1-50 gg/kg/día, de 1-40 gg/kg/día, de 1-30 gg/kg/día, de 1-20 gg/kg/día, de 1-10 gg/kg/día). En algunas realizaciones, se administra una dosis eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención que varía de aproximadamente 1-500 gg/kg/día. En algunas realizaciones, se administra una dosis eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención que varía de aproximadamente 1 -100 gg/kg/día. En algunas realizaciones, se administra una dosis eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención que varía de aproximadamente 1-60 gg/kg/día. En algunas realizaciones, se administra una dosis eficaz de los péptidos y los compuestos de la presente invención seleccionada desde aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75., 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 gg/kg/día.

Los péptidos y compuestos de la presente invención pueden administrarse mediante infusión continua, preferiblemente infusión intravenosa continua. Los péptidos y compuestos de la presente invención pueden administrarse bimensualmente, mensualmente, dos veces al mes, trisemanalmente, quincenalmente, semanalmente, dos veces por semana, tres veces por semana, diariamente, dos veces al día o con otra pauta de dosificación clínicamente deseable. El régimen de dosificación para un solo sujeto no tiene que tener un intervalo fijo, pero puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del sujeto.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido o un compuesto según la presente invención.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención es una molécula de ADN o ARN. Dicha molécula de ácido nucleico puede ser parte de un vector, preferiblemente un vector de clonación o expresión, que son bien conocidos en la técnica.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido o compuesto según la presente invención para inhibir in vitro la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una célula, preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero o humana, o un organismo (por ejemplo, un mamífero o un sujeto humano).

Según una realización preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico heterólogo es de origen vírico, bacteriano, parasitario o fúngico.

Según una realización adicional de la presente invención, la molécula de ácido nucleico heterólogo contiene tramos de ácido nucleico que codifican genes de resistencia a antibióticos o fragmentos funcionales de los mismos.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención también pueden inhibir la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico que codifican genes de resistencia a antibióticos y así prevenir o reducir significativamente la resistencia a los antibióticos de microorganismos tales como bacterias. Esto es particularmente ventajoso porque los péptidos y los compuestos de la presente invención permiten que las bacterias se vuelvan susceptibles a los antibióticos, aunque son capaces de producir proteínas que son responsables de la resistencia a los antibióticos. Por lo tanto, los péptidos y los compuestos de la presente invención pueden usarse para combatir bacterias resistentes a antibióticos.

Un ADN plasmídico, por ejemplo, un ADN que contiene un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, un plásmido R), se puede transferir entre las bacterias mediante transferencia horizontal de genes. Un plásmido puede replicarse fuera del genoma bacteriano o puede integrarse en el genoma bacteriano. Las bacterias pueden volverse resistentes a los antibióticos cuando aceptan ese ADN. Además, los genes de virulencia también se pueden transferir entre las bacterias. Controlar una infección bacteriana será un desafío importante en el futuro debido al desarrollo mundial de una resistencia a los antibióticos en las bacterias y la falta de fármacos candidatos adecuados. Un inhibidor de la transferencia de genes entre las bacterias podría tener implicaciones potenciales para un tratamiento médico o medidas de higiene en áreas, p. ej., hospitales, en donde se produce la formación de resistencias. Por tanto, una inhibición de la transferencia de una molécula de ADN "extraño" y una inhibición de la producción de proteínas a través de la molécula inhibidora, podrían ser útiles para una intervención terapéutica sobre enfermedades infecciosas o para prevenir la propagación y la formación de bacterias resistentes a los antibióticos.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido o un compuesto según la presente invención para evitar que las células bacterianas adquieran genes o fragmentos funcionales de los mismos, capaces de proporcionar resistencia a los antibióticos a dichas células bacterianas in vitro.

Según una realización preferida de la presente invención, los péptidos y los compuestos de la presente invención, en particular el péptido I24, inhiben la formación de colonias sobre placas de agar que contienen antibióticos, de bacterias Escherichia coli transformadas con un plásmido que contiene el gen de resistencia a antibióticos y el péptido I24 simultáneamente. El péptido es inactivo cuando se aplica después de que se completa la transformación. La inhibición a través del péptido es independiente del gen de resistencia a antibióticos usado, lo que se ejemplifica por una formación reducida de colonias de bacterias Escherichia coli transformadas con plásmidos que contienen el gen de resistencia a ampicilina o kanamicina y un crecimiento sobre las placas de agar que contienen ampicilina o kanamicina.

Se ha encontrado además que los péptidos y los compuestos de la presente invención, en particular el péptido I24, inhibe la replicación de los plásmidos y la producción de ARN del gen de resistencia a antibióticos, lo que se ejemplifica por una reducción de la expresión del ARNm de la p-lactamasa en bacterias Escherichia coli transformadas con un plásmido que contiene el gen de resistencia a antibióticos y el péptido simultáneamente.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención pueden inhibir o reducir significativamente la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácidos nucleicos víricos.

Por tanto, esos péptidos y compuestos pueden usarse como aditivos para vacunas que comprenden virus atenuados o administrarse junto con virus atenuados para aumentar la seguridad de las vacunas vivas o para atenuar indirectamente la vacuna viva.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido o un compuesto según la presente invención como aditivo para una vacuna viva atenuada. En un aspecto alternativo de la presente invención, el péptido y/o el compuesto de la presente invención pueden coadministrarse con una vacuna viva.

El péptido y el compuesto de la presente invención pueden usarse para inhibir la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico vírico en células para reducir el título vírico dentro de organismos (por ejemplo, mamíferos e individuos humanos). Esta propiedad también se puede utilizar para inhibir o prevenir la propagación vírica en cultivos celulares.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido o un compuesto según la presente invención para inhibir o prevenir la propagación vírica en cultivos celulares.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto según la presente invención para inhibir una infección con fagos de bacterias in vitro.

Otra aplicación potencial del compuesto/inhibidor de la presente invención es la prevención de infecciones fágicas en bacterias. Una infección con fagos de cultivos bacterianos puede ser un problema particular en aplicaciones biotecnológicas que incluyen fermentaciones a gran escala. Debido a la capacidad del compuesto de la presente invención para inhibir la traducción y/o la transcripción de moléculas de ácido nucleico extraño dentro de un organismo/célula, la replicación de los fagos dentro de las bacterias puede inhibirse o incluso prevenirse. Esto significa que durante el cultivo de las células bacterianas se añade al medio de cultivo el compuesto de la presente invención o una composición que comprende dicho compuesto.

Por tanto, otra aplicación potencial de dicho inhibidor es la prevención de infecciones con fagos en bacterias in vitro. Una infección con fagos de cultivos bacterianos puede ser un problema particular en aplicaciones biotecnológicas que incluyen fermentaciones a gran escala. Además, una prevención de las infecciones víricas en cultivos de células animales puede ser otra aplicación de relevancia biotecnológica y biofarmacéutica. El inhibidor también puede expresarse intracelularmente en una célula diana y podría ser útil para aplicaciones biotecnológicas tales como la prevención de infecciones víricas o fágicas o podría ser útil para el control de la expresión génica.

El compuesto de la presente invención puede marcarse con otras sustancias para permitir su detección y/o su visualización. Esto puede ser útil en la localización de los compuestos de la presente invención en células, tejidos y organismos, en donde los compuestos inhiben la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo/extraño in vitro. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto según la presente invención para localizar la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo dentro de una célula eucariota in vitro.

Según una realización preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico heterólogo/extraño que se va a localizar es de origen vírico, bacteriano, parasitario o fúngico.

La presente descripción se refiere a los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, que reduce la expresión de una proteína codificada por un plásmido en células eucariotas cuando se pone en contacto con el plásmido de expresión durante la transfección del plásmido de expresión. La transfección del ADN plasmídico se puede realizar, por ejemplo, usando un reactivo liposómico, polímeros de poliamidoamina catiónica, electroporación, fosfato cálcico o DEAE-dextrano.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, son capaces de reducir los niveles de una proteína citosólica en lisados celulares, lo que se ejemplifica por la reducción de los niveles de luciferasa en las células transfectadas con un plásmido de expresión que codifica la luciferasa y un péptido simultáneamente.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, son capaces de reducir los niveles de una proteína secretora en el material sobrenadante celular, lo que se ejemplifica por la reducción de los niveles de fosfatasa alcalina secretada desde las células transfectadas con un plásmido de expresión que codifica la fosfatasa alcalina secretada y un péptido simultáneamente.

La invención proporciona los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, que también puede reducir los niveles de una proteína nuclear en los lisados celulares, lo que se ejemplifica por una inhibición de los niveles de una versión truncada de NF- ^k B p65 (NF- ^k B p65 M2) cuando se transfecta con un plásmido de expresión de NF- ^k B p65 M2 y un péptido del ensayo simultáneamente.

Los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, son capaces de reducir los niveles de la proteína de fluorescencia verde (GFP) en lisados celulares cuando células eucariotas se transfectan simultáneamente con un plásmido de expresión de GFP y un péptido, tal y como se determina con un análisis de transferencia Western. Se ha encontrado que los péptidos y los compuestos de la presente invención reducen el número total de células positivas para GFP en células transfectadas con un plásmido de GFP y un péptido simultáneamente.

La inhibición de la producción de proteínas en células eucariotas transfectadas con un plásmido de expresión mediante los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, es independiente del estado del ADN (por ejemplo, ADN circular, superenrollado o relajado, ADN lineal, ADN plasmídico circular, ADN plasmídico linealizado, un producto de PCR y un oligonucleótido bicatenario). El péptido inhibe la producción de proteínas en las células eucariotas cuando se transfecta con un ADN bicatenario lineal, tal como un plásmido linealizado o un fragmento de ADN bicatenario obtenido mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La invención proporciona los péptidos y los compuestos de la presente invención, preferiblemente el péptido I24, que inhiben la producción de proteínas desde células eucariotas transfectadas con un plásmido de expresión, de una manera dependiente de la dosis, con una CI50 (concentración inhibidora media máxima) que se encuentra entre 0,1 y 2 gM, preferiblemente 0,3 a 0,7 pM. Los péptidos y los compuestos de la presente invención son activos cuando entran en contacto con el ADN durante la transfección de las células eucariotas, pero no cuando se añade el péptido después de que se ha completado el proceso de transfección.

La presente invención describe efectos del péptido que son independientes del tipo de célula. El péptido I24 inhibe la producción de proteínas codificadas por plásmidos cuando se transfecta junto con el plásmido en diversas líneas celulares, lo que se ejemplifica con el uso de células HEK293, CV-1, COS-7, MCF-7 o hT-29.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, pero sin limitarse a los mismos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Secuencia del péptido I24

I24 es un péptido que consiste en nueve residuos de aminoácidos Cys-Leu-Ala-Phe-Tyr-Ala-Cys-Phe-Cys (CLAFYACFC, SEQ ID NO: 6). El péptido puede ser lineal o estar ciclado mediante residuos de cisteína y enlaces disulfuro.

Ejemplo 2: I24 inhibe la producción de proteínas codificadas por vectores de expresión en células de mamífero transfectadas de manera transitoria

Se transfectaron células HEK293 (células de riñón embrionario humano) con una estructura artificial de luciferasa (región codificante de la luciferasa clonada en un plásmido de expresión eucariota bajo el control de un promotor de CMV) usando Superfect (Qiagen) en presencia de DMSO como control de vehículo o diferentes dosis de péptido I24. Después de 24 horas, se analizaron los niveles de luciferasa en los lisados celulares usando un sustrato de luciferasa. El péptido provocaba una inhibición dependiente de la dosis, de la producción de luciferasa, en comparación con el control de vehículo (Figura 1 a). Las células HEK293 se transfectaron con fosfatasa alcalina secretada (SEAP) clonada en un vector de expresión eucariota bajo el control de un promotor de CMV, en presencia de DMSO o diferentes dosis de péptido I24. Después de 24 horas, la SEAP liberada al material sobrenadante se analizó mediante un ensayo colorimétrico. I24 reducía la producción de SEAP de una manera dependiente de la dosis en las células HEK293 transfectadas, en comparación con el control de vehículo (Figura 1b). Los péptidos J9 (versión ciclada de I24_M23; CPSALAFYC (SEQ ID NO: 53)) e I21 (CSLTGPIAC (SEQ ID NO: 56)) servían como controles inactivos. Se transfectaron células HEK293 con un plásmido de expresión que codificaba una versión truncada de NF-KB p65 (p65 M2) durante 24 horas. La producción de p65 se analizó mediante transferencia Western a partir de lisados de las células transfectadas (Figura 1c). En las células transfectadas con p65 M2 y péptido I24 (20 pM), no se podía detectar p65 M2 mediante transferencia Western. Se transfectaron células HEK293 con un plásmido de expresión, que codificaba la proteína de fluorescencia verde (GFP) en presencia y ausencia del péptido I24 (2 pM). El análisis de la transferencia Western mostraba que la producción de GFP y el número de células positivas para GFP se reducen gracias al péptido I24 (Figura 1d, e).

Ejemplo 3: El péptido I24 inhibe la expresión génica codificada por un vector plasmídico bajo el control de un promotor de interleucina-8 truncado sin inhibir la expresión de interleucina-8 endógena en las células transfectadas de forma transitoria

Las células HEK293 se transfectaron de forma transitoria con una estructura artificial que contenía la región codificante de luciferasa bajo el control del promotor de interleucina-8 (IL-8) truncado y el péptido I24, y se estimularon con factor de necrosis tumoral (TNF)-a 6 horas después de la transfección y se analizaron 24 horas después de la transfección para estudiar la expresión de luciferasa en los lisados celulares y la liberación de IL-8 en el material sobrenadante mediante ELISA. El péptido reducía la expresión de luciferasa inducida por TNF-a, mientras que la liberación de IL-8 no se vio afectada (Figura 2).

Ejemplo 4: Los niveles de ARN mensajero y de proteína se regulan a la baja cuando el péptido I24 se transfecta dentro de las células con el plásmido de expresión

Se transfectaron células COS-7 de riñón de mono verde africano con un plásmido de expresión que dirigía la luciferasa bajo el control del promotor de CMV y se determinó la luciferasa en los lisados celulares. Para el análisis de la expresión del ARNm de la luciferasa, se aisló el ARN total, se trató con ADNasa I y se sometió a una transcripción inversa utilizando hexámeros aleatorios. Se realizó una PCR en tiempo real con sondas de hidrólisis que detectaban la luciferasa y se normalizaron a los niveles de transcripción del ARNr 18S. Tanto la proteína luciferasa como los niveles de ARNm se regularon negativamente después de diferentes tiempos de incubación (Figura 3).

Ejemplo 5: La inhibición de la expresión génica codificada por el vector plasmídico es parcialmente dependiente del promotor en las células HEK293 transfectadas de manera transitoria

Las células HEK293 se transfectaron de forma transitoria en presencia de concentraciones crecientes de péptido I24 con un plásmido de expresión que contenía luciferasa bajo el control del promotor de CMV y el gen de resistencia a neomicina bajo el control del promotor temprano de SV40. Después de 24 horas, se aisló el ARN total de las células, se digirió con ADNasa I para eliminar el ADN plasmídico y se sometió a transcripción inversa. Se realizó un análisis con PCR cuantitativa en tiempo real del ARNm de la luciferasa y la neomicina, utilizando sondas de hidrólisis y se normalizó frente a los transcritos de GAPDH. Aunque los transcritos de luciferasa se reducían en presencia de una concentración creciente de péptido I24 en un 87%, los niveles de ARNm de neomicina solo se reducían en aproximadamente un 50% (Figura 4).

Ejemplo 6: La inhibición de la expresión génica codificada por un vector plasmídico es independiente de la línea celular utilizada

Las líneas celulares CV-1 y COS-7 de células renales de mono verde africano, así como la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 y las líneas celulares de cáncer de colon humano HT-29, se transfectaron de forma transitoria con un plásmido que contenía luciferasa bajo el control de un promotor de CMV y diferentes concentraciones de péptido I24. Se observó una inhibición del gen indicador de luciferasa en todas las líneas celulares utilizadas (Figura 5).

Ejemplo 7: Una versión con penetración celular de I24 mediante la adición de un marcador-TAT amino-terminal o una dimerización, aumenta la potencia del péptido I24

Se generó una versión de I24 que penetra en las células mediante la adición de un marcador-TAT N-terminal que era un dímero de I24 con dos monómeros separados por tres residuos de glicina. La transfección transitoria con los péptidos y un plásmido de expresión que codificaba la luciferasa mostraba una inhibición más potente de la expresión de luciferasa a través de TAT-I24. El dímero I24 también era más potente, en comparación con el péptido I24, pero menos potente en comparación con TAT-I24. El péptido que representaba el marcador TAT solo (TAT) era inactivo para inhibir la luciferasa (Figura 6).

Ejemplo 8: Inhibición de la expresión génica mediada por baculovirus en células HEK293 con una versión permeable para las células del péptido I24 fusionado con un marcador-TAT amino-terminal

Se generó un baculovirus con la región codificante de luciferasa bajo el control del promotor de CMV integrada en su genoma viral. El baculovirus se aplicó sobre células HEK293 tratadas previamente durante 10 minutos con DMSO o concentraciones crecientes de péptido I24, TAT y el péptido de fusión TAT-I24. La expresión de la luciferasa se reduce en las células tratadas con péptido de fusión permeable para las células, TAT-I24, de una manera dependiente de la dosis (Figura 7a). Las células infectadas con baculovirus incubadas con DMSO, TAT-I24 o TAT se estimularon con TNF-a y el ARN total se aisló de las células. Después del tratamiento del ARN con ADNasa I, se realizó una transcripción inversa. La luciferasa y el ARNm de IL-8 se analizaron mediante PCR en tiempo real. Mientras que el ARNm de la luciferasa estaba regulado a la baja por TAT-I24, los niveles de ARNm de IL-8 no se vieron afectados por el tratamiento (Figura 7b).

Ejemplo 9: El péptido I24 permeable para las células inhibe la expresión del gen a través de adenovirus e inhibe la replicación del virus en las células HEK293

Las células HEK293 se trataron con concentraciones crecientes de los péptidos I24, TAT-I24 o TAT sola y se incubaron con adenovirus que codificaban luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de CMV. Los niveles de proteína luciferasa estaban regulados a la baja por TAT-I24 con una CI50 de 6 |uM (Fig. 8a). Las células HEK293 se trataron con vehículo de control, el péptido I24, TAT-I24 o TAT sola (20 |uM) y partículas de adenovirus que codificaban luciferasa y GFP. Después de 72 horas, se aisló el ARN, y la luciferasa y la GFP, así como los niveles de transcripción de hexonas del adenovirus se analizaron mediante PCR en tiempo real y se normalizaron frente a GAPDH. TAT-I24 provocaba la inhibición de los tres genes codificados por adenovirus (Figura 8b). Se aisló el ADN a partir del material sobrenadante y se cuantificó el ADN de la hexona del adenovirus usando PCR en tiempo real (Fig. 8c). TAT-I24 provoca la inhibición del desprendimiento celular en las células HEK293 infectadas con virus, determinada mediante fijación y tinción con violeta cristal, 96 horas después de la infección (Fig. 8d).

Ejemplo 10: El péptido permeable para las células, TAT-I24, inhibe la expresión génica y la replicación del virus vaccinia en las células HEK293

Las células HEK293T se trataron con DMSO, TAT-I24 o TAT durante 4 horas antes de la infección con el virus vaccinia. Veinticuatro horas después de la infección, se aisló el ARN total y se trató con ADNasa I antes de la síntesis de ADNc. La expresión de los transcritos de la subunidad rpo22 de la ARN polimerasa dependiente de ADN, un gen codificado por el virus vaccinia, se analizó mediante PCR en tiempo real usando SYBR Green y se normalizó frente a los niveles de ARNm de GAPDH. TAT-I24 inhibía de forma dependiente de la dosis los niveles de ARNm de rpo22, mientras que TAT sola no causaba inhibición (a). El ADN vírico se extrajo a partir del material sobrenadante 24 horas después de la infección y se sometió a PCR en tiempo real. El material sobrenadante se sometió a un ensayo en placa utilizando células BSC-40. Con una concentración de 20 |uM, TAT-I24 reducía la cantidad de ADN vírico (b) y el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el material sobrenadante en >90% (c).

Ejemplo 11: El péptido I24 permeable para las células inhibe la expresión génica a través de lentivirus en células HEK293

Se incubaron células HEK293 con péptido I24, péptido I24 marcado con TAT (TAT-I24) o TAT, seguido de la adición de lentivirus que contenía luciferasa bajo el control del promotor de CMV durante 48 horas. La luciferasa se regulaba a la baja en un 75% en presencia de TAT-I2420 |uM (Figura 9).

Ejemplo 12: Inhibición de la expresión del gen indicador a través de variantes del péptido I24

Se sintetizó un total de 29 péptidos. Los péptidos se aplicaron sobre la reacción de transfección junto con el plásmido que codificaba la luciferasa y se transfectaron dentro de células HEK293. Todos los péptidos se sometieron a ensayo con una concentración final de 2 pM y los niveles de luciferasa se analizaron 24 horas después de la transfección. La Tabla 1 muestra la inhibición de la expresión del gen indicador en relación con el control de DMSO.

Tabla 1. Efectos de las variantes de péptidos sobre la expresión del gen indicador en HEK293 en una transfección transitoria de plásmido-ADN.

Ejemplo 13: Inhibición de la formación de colonias en bacterias transformadas simultáneamente con un ADN plasmídico que contiene un gen de resistencia a antibióticos y péptido I24

Células competentes de Escherichia coli se transformaron con un plásmido que contenía un gen de resistencia a ampicilina o un gen de resistencia a kanamicina y DMSO como control de vehículo o I24. Al día siguiente, el número de colonias se redujo en presencia del péptido I24, en comparación con el control de vehículo (Figura 11).

Ejemplo 14: Inhibición de la replicación del plásmido y la expresión de ARNm de beta-lactamasa en células de E. coli transformadas con plásmido y péptido I24

Células competentes de Escherichia coli se transformaron con un plásmido que contenía un gen de resistencia a la ampicilina y el péptido I24. Después de los puntos de tiempo indicados, se determinaron el número total de plásmidos y los niveles de ARNm de p-lactamasa, mediante PCR en tiempo real normalizada frente a un gen de copia única de E. coli. Tanto el número de copias de plásmido como los niveles de ARNm de p-lactamasa se regulaban a la baja en presencia del péptido I24 (Figura 12).

Ejemplo 15: Datos comparativos

Una publicación de Deng et al. (2004) describía péptidos que pueden inhibir la unión al ADN, la transactivación y la replicación del ADN de la proteína E2 del virus del papiloma humano tipo 11. Los péptidos se identificaron mediante un cribado de fagos frente a la proteína E2. A partir del cribado del grupo 1, una secuencia SVFYACFACF de la bioclasificación tiene similitud con el péptido I24, particularmente el motivo FYACF. Otro péptido de la publicación de Deng et al. tiene la secuencia WSEQCFTCWW (la secuencia 28 que se muestra en la Tabla 1). Ambas secuencias se encontraron solo una vez en varias rondas de bioclasificación y no se muestra ningún dato sobre alguna actividad biológica con esos péptidos en la publicación. Basándose en la secuencia SVFYACFACF, se cambiaron o incluyeron residuos de aminoácidos específicos en las variantes de I24 (I24_M8 que se muestra en la Tabla 1). Otras variaciones eran inserciones de W o A entre F8 y C9 o el cambio de F8 a L, que no afectaba a la actividad del péptido I24. El cambio de la posición A3 de I24 por V no afectaba negativamente a la potencia, mientras que el reemplazo de C1 por S tenía algo de efecto negativo sobre la potencia. Los péptidos SVFYACFAC y WSEQCFTCWW no mostraban ningún efecto inhibidor en los ensayos de transfección celular, cuando se analizaban con 2 pM, una concentración con la que I24 inhibe la expresión del gen indicador en aproximadamente un 90%. Sin embargo, Deng et al. no proporcionaron ningún dato sobre esos dos péptidos y se centraron en una tercera secuencia del grupo 1 (EDGGSFMCLWCGEVHG; SEQ ID N° 57) que muestra efectos inhibidores sobre las funciones de transactivación y replicación del papilomavirus 11 E2. Es posible que exista un mecanismo de acción común entre esos péptidos y el péptido I24, pero no hay datos que sostengan un efecto relacionado con la inhibición de la expresión génica del a Dn "extraño" que apoye con fuerza la novedad de los hallazgos obtenidos con I24. Deng et al. (2004) mostraron una inhibición de la expresión del gen indicador dependiente de E2 con el péptido EDGGSFMCLWCGEVHG (SEQ ID N° 57) expresado con una señal de localización nuclear de forma intracelular, pero ligaron esos efectos a la interacción con la proteína E2. En ese estudio no se mostraron otros efectos sobre las células vivas ni el uso de péptidos que penetran en las células (Deng et al.

2004). Por el contrario, los péptidos I24 o TAT-I24 son activos sin una señal de localización nuclear solo sobre la molécula de ADN "extraño" y no sobre la expresión de proteínas celulares y ejercen esos efectos después de una aplicación directa sobre las células, lo que no se muestra en la publicación de Deng et al. (2004) o en cualquier otra publicación conocida en la técnica.

Otra secuencia descrita en el documento de solicitud de patente WO 2011/086116 (PSALAFY (SEQ ID NO: 58 en el documento WO 2011/086116)) también se incluyó. El péptido M23 con la secuencia CPSALAFYC (SEQ ID N° 53), que tiene el motivo LAFYC similar a I24, era inactivo en el ensayo de transfección celular con una concentración de hasta 20 pM, en donde I24 provoca una inhibición del 90% de la expresión del gen indicador.

Ejemplo 16: El péptido I24 permeable para las células inhibe la replicación del virus del herpes simple

Las células se infectaron con el virus del herpes simple y se determinó la replicación del virus mediante un ensayo de formación de placas (véanse los ejemplos anteriores). La replicación del virus del herpes simple fue inhibida por TAT-I24 de una manera dependiente de la dosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según la fórmula I

X ⁱ-X²-X³-X⁴-X⁵-(A)^m-X⁶-X⁷-(X^e)ⁿ-C (I)

en donde X¹es C o S, X²es L o A, X³es A, V o L, X⁴es F o Y, X⁵es Y o F, X⁶es C o R, X⁷es F o L, X^ses W o A y m y n son independientemente 0 o 1, o una variante de los mismos,

en donde el péptido consiste en S a 40 residuos de aminoácidos y la variante comprende de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos.

2. Péptido según la reivindicación 1, en donde el péptido es lineal o cíclico.

3. Péptido según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos se selecciona a partir del grupo que consiste en CLAFYACFWC (SEQ ID N22), CLAFYACLWC (SEQ ID N23), CLAFYACFAC (SEQ ID N24), CLVFYACFC (SEQ ID N25), CLAFYACFC (SEQ ID N26), CLLYFCFC (SEQ ID N27), CAAFYACFC (SEQ ID N2 S), SLAFYACFAC (SEQ ID N29), CLAFYARFC (SEQ ID N210), CLAFYCFAC (SEQ ID N211), CLAFYCFC (SEQ ID N212) y CLAYFCFC (SEQ ID N213).

4. Un compuesto peptídico que comprende dos o más péptidos idénticos o diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto comprende preferiblemente 3 o 4 péptidos idénticos o diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Compuesto según la reivindicación 4, en donde el compuesto se modifica para mostrar propiedades de penetración celular.

6. Compuesto según la reivindicación 4 o 5, en donde el compuesto o el al menos un péptido se fusiona de forma C-terminal y/o N-terminal con al menos un péptido que penetra en las células, en donde el péptido que penetra en las células se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en un péptido TAT y un marcador policatiónico, en donde el péptido que penetra en las células preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de la proteína TAT del VIH que comprende los residuos de aminoácidos 37 a 72, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 37 a 60, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 48 a 60, de SEQ ID N214, GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID N215), YGRKKRRQRRR (SEQ ID N216), CYGRKKRRQRRR (SEQ ID N217), YGRKKRRQRRRGGG (SEQ ID N218) o CGRKKRRQRRR (SEQ ID N2: 19), un marcador de poliarginina, preferiblemente RRRRRRR (SEQ ID NO: 22), RRRRRRRC (SEQ ID NO: 23), RRRRRRRR (SEQ ID NO: 24) o RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 25), obtenido a partir de buforina TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 26), obtenido a partir de transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 27) u obtenido a partir del péptido KALA que comprende la secuencia WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEQ ID NO: 28) o MAP que comprende la secuencia KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 29), obtenido a partir de Pep-1 que comprende la secuencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SeQ ID NO: 30) o hCT (9-32) que comprende la secuencia LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 31), pVEC, que comprende la secuencia LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 32), pISL, que comprende la secuencia rV iRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 33), Erns que comprende la secuencia Rq Ga ARv Ts WLGRQLRIAGKRLEGRSK (SEQ ID NO: 34), restrictocina L3, que comprende la secuencia KLIKGRTPIKFGK (SEQ ID NO: 35); o MPG que comprende la secuencia GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 36) o GALFLGFLGAAGSTMGAWsQPKSKRKV-cisteamida; u obtenido a partir de la señal de localización nuclear (SLN) del antígeno T largo de SV-40 que comprende las secuencias PKKKRKVEDPYC (SEQ ID N° 37) o CGGGPKKKRKVED (SEQ ID NO: 38), o la glicoproteína del virus de la rabia (RVG) que comprende la secuencia YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGk Ra SNG (s Eq ID NO: 39) o péptidos obtenidos a partir del homeodominio proteico de Antennapedia, preferiblemente RQIKIWFQNRRm Kw k K (SEQ ID NO: 21).

7. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el al menos un péptido se fusiona o se conjuga con un marcador, en donde el marcador se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en un colorante, preferiblemente un colorante fluorescente, más preferiblemente una proteína fluorescente, estreptavidina, biotina o un péptido que se une a un colorante.

8. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad asociados con la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo en las células de un mamífero o un individuo humano, en donde el trastorno o la enfermedad asociados con la transcripción y/o la traducción de moléculas de ácido nucleico heterólogo en las células se selecciona a partir del grupo que consiste en infecciones víricas.

9. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en el tratamiento de una infección vírica, bacteriana, parasitaria o fúngica en un mamífero o un individuo humano, en donde el tratamiento se caracteriza preferiblemente por evitar que las células bacterianas adquieran genes o fragmentos funcionales de los mismos, capaces de proporcionar una resistencia a los antibióticos a dichas células bacterianas.

10. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en el tratamiento de una infección con un virus de ADN, tal como un virus de ADN bicatenario, preferiblemente un virus de la familia de los Poxviridae o más preferiblemente un virus de la familia de los Adenoviridae, o lo más preferiblemente un virus de la familia de los Herpesviridae, en particular un virus del herpes simple, citomegalovirus y virus de la varicela zóster.

11. Una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

12. Uso de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, para inhibir la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una célula in vitro, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo es preferiblemente de origen vírico, bacteriano, parasitario o fúngico.

13. Uso según la reivindicación 12, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo contiene tramos de ácido nucleico que codifican genes de resistencia a los antibióticos o fragmentos funcionales de los mismos.

14. Uso de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, para evitar que las células bacterianas adquieran genes o fragmentos funcionales de los mismos, capaces de proporcionar una resistencia a los antibióticos a dichas células bacterianas in vitro, o como aditivo para una vacuna viva atenuada, tal como una vacuna viva que contiene un virus de ADN, en particular un virus de ADN bicatenario, tal como el virus vaccinia, adenovirus o un miembro de la familia del virus del herpes u otros miembros del grupo de virus de ADN bicatenario, o para inhibir o prevenir una propagación vírica en cultivos celulares, o para inhibir una infección con fagos de bacterias in vitro.

15. Uso de un compuesto según la reivindicación 7, para localizar la transcripción y/o la traducción de una molécula de ácido nucleico heterólogo dentro de una célula eucariota in vitro, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo es preferiblemente de origen vírico, bacteriano, parasitario o fúngico.