ES2850726T3 - Péptidos de penetración celular para suministro intracelular de moléculas - Google Patents

Péptidos de penetración celular para suministro intracelular de moléculas Download PDF

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Abstract

Un péptido de penetración celular caracterizado por que comprende una secuencia de aminoácidos X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 36), en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L, W, C o I, X4 es S, A, N o T, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es K o R, X8 es A o ninguno, y X9 es R o S.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos de penetración celular para suministro intracelular de moléculas
La presente invención pertenece al campo del suministro intracelular de moléculas tales como ácidos nucleicos y moléculas hidrófobas pequeñas. En particular, la invención se refiere a una nueva familia de péptidos de penetración celular (CPP, por sus siglas en inglés), que presenta una alta eficacia, baja toxicidad y tropismo natural para los tejidos pulmonares.
Aunque las moléculas pequeñas siguen siendo los principales fármacos utilizados en la práctica clínica, en numerosos casos, su impacto terapéutico ha alcanzado limitaciones tales como capacidad insuficiente para alcanzar dianas, falta de especificidad, requisito de dosis altas que provocan toxicidad y efectos secundarios importantes. En los últimos diez años, con el fin de solventar las limitaciones de las moléculas pequeñas y de las terapias basadas en genes, los presentes inventores han presenciado una aceleración drástica en el descubrimiento de moléculas terapéuticas más grandes, tales como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos que presentan una alta especificidad por su diana pero que no siguen las reglas de Lipinski. La potencia farmacéutica de estas moléculas permanece restringida por su escasa estabilidad in vivo y por su baja captación en las células. Por lo tanto, el "suministro" se ha convertido en una pieza central del rompecabezas terapéutico y se han establecido nuevos hitos para validar las estrategias de suministro: (a) carencia de toxicidad, (b) eficacia a dosis bajas in vivo, (c) facilidad de manejo para aplicaciones terapéuticas (d) liberación endosómica rápida y (e) capacidad para alcanzar la diana. Aunque las estrategias de suministro vírico habían dado muchas esperanzas para terapias génicas y celulares, su aplicación clínica se ha visto afectada por efectos secundarios y de toxicidad [1,2]. Las investigaciones se centraron principalmente en el desarrollo de estrategias no víricas, y se han propuesto diferentes métodos que incluyen lípidos, nanopartículas policatiónicas y formulaciones basadas en péptidos, pero solamente algunas de estas tecnologías han sido eficaces in vivo y han alcanzado la práctica clínica. Los péptidos de penetración celular (CPP) son una de las estrategias no víricas más prometedoras. Aunque la definición de los CPP evoluciona constantemente, generalmente se describen como péptidos cortos de menos de 30 aminoácidos derivados de proteínas o de secuencias quiméricas. Suelen ser anfipáticos y poseen una carga neta positiva [3-5]. Los CPP pueden penetrar membranas biológicas, para desencadenar el movimiento de diversas biomoléculas a través de las membranas celulares hacia el citoplasma y para mejorar su ruta intracelular, facilitando, de este modo, las interacciones con la diana. Los CPP se pueden subdividir en dos clases principales, la primera requiere un enlace químico con la carga y la segunda implica la formación de complejos no covalentes estables. Se ha informado que los CPP de ambas estrategias favorecen el suministro de un gran panel de cargas (ADN plásmido, oligonucleótido, ARNip, APN, proteína, péptido, liposoma, nanopartícula...) en una amplia variedad de tipos celulares y modelos in vivo [3-7].
Hace veinte años, se propuso el concepto de dominio de transducción de proteínas (PTD, por sus siglas en inglés) basándose en la observación de que algunas proteínas, principalmente factores de transcripción, podrían desplazarse dentro de las células y de una célula a otra [para revisión véase la referencia 3,4]. La primera observación se realizó en 1988, por Frankel y Pabo. Demostraron que la proteína transactivadora de la transcripción (Tat, por sus siglas en inglés) del VIH-1 podía entrar en las células y trasladarse al núcleo. En 1991, el grupo de Prochiantz llegó a las mismas conclusiones con el homeodominio de Drosophila Antennapedia y demostró que este dominio se internalizaba por células neuronales. Estos trabajos fueron el origen del descubrimiento en 1994 del primer dominio de transducción de proteínas: un péptido de 16 meros derivado de la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia llamado penetratina. En 1997, el grupo de Lebleu identificó la secuencia mínima de Tat requerida para la captación celular y el grupo de Dowdy informó de los primeros estudios preliminares de eficacia de la aplicación de PTD in vivo, para el suministro de péptidos pequeños y proteínas grandes. Históricamente, la noción de péptido de penetración celular (CPP) se introdujo por el grupo de Langel, en 1998, con el diseño del primer transportador peptídico quimérico, el Transportan, que derivó del fragmento aminoterminal del neuropéptido galanina, enlazado a mastoparán, un péptido de veneno de avispa. Se informó originalmente que Transportan mejora el suministro de APN tanto en células cultivadas como en in vivo. En 1997, el grupo de Heitz y Divita propuso una nueva estrategia que implicaba CPP en la formación de complejos no covalentes estables con su carga [7]. La estrategia se basó primero en el transportador peptídico corto (MPG) que consiste en dos dominios: un dominio hidrófilo (polar) y un dominio hidrófobo (apolar). MPG se diseñó para el suministro de ácidos nucleicos [7]. El péptido anfipático primario Pep-1 se propuso entonces para el suministro no covalente de proteínas y péptidos [8]. Después, los grupos de Wender y de Futaki demostraron que las secuencias de poliarginina (Arg8) son suficientes para conducir moléculas pequeñas y grandes al interior de las células e in vivo. Desde entonces, se han identificado muchos CPP derivados de secuencias naturales o no naturales y la lista aumenta constantemente. Los péptidos se han obtenido de la proteína VP22 del virus del herpes simple, de calcitonina, de péptidos antimicrobianos o toxínicos, de proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular, así como de péptidos ricos en poliprolina [revisiones 4-6]. Entre los CPP conocidos, por ejemplo, hay péptidos CADY en los que el resto aminoterminal es una glicina [19] y ppTG20 en los que el aminoácido en la posición 1 puede ser glicina, arginina o histidina y el aminoácido en la posición 7 es una leucina [20].
La materia objeto de la invención está definida por las reivindicaciones 1 a 15.
Los presentes inventores han diseñado ahora una nueva familia de péptidos de penetración celular para el suministro de moléculas cargadas e hidrófobas, llamada VEPEP-6. Las estrategias de suministro que utilizan péptidos VEPEP-6 como capa exterior de nanopartículas se denominan NANOPEP-6.
VEPEP-6 son péptidos anfipáticos secundarios cortos que forman nanopartículas estables con moléculas tales como ácidos nucleicos (en particular, ARNip), miméticos de ADN y moléculas hidrófobas pequeñas, en lo sucesivo, en la presente memoria, denominadas "s Hm , por sus siglas en inglés". los vectores VEPEP-6 comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos:
X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 36), o
X1LX2LARWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 37), o
X1LX2ARLWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 38), en donde
X1 es beta-A o S,
X2 es F o W,
X3 es L, W, C o I,
X4 es S, A, N o T,
X5 es L o W,
X6 es W o R,
X7 es K o R,
X8 es A o ninguno, y
X9 es R o S.
La invención se refiere a un péptido de penetración celular caracterizado por que comprende una secuencia de aminoácidos X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 36), en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L, W, C o I, X4 es S, A, N o T, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es K o R, X8 es A o ninguno, y X9 es R o S.
Según una realización de la invención, los vectores VEPEP-6 comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos: X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 13),
en donde X1 a X8 son como se describe anteriormente.
La estrategia con VEPEP-6 mejora tanto el suministro ex vivo e in vivo y la eficacia de ácidos nucleicos y moléculas hidrófobas pequeñas, sin activar la respuesta inmunitaria innata ni inducir efectos secundarios tóxicos.
En una realización de la presente invención, el péptido de penetración celular comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6KX7 (SEQ ID NO: 14),
en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L o W, X4 es S, A o N, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es A o ninguno. Según una realización preferida de la presente descripción, ilustrada en la parte experimental a continuación, la secuencia de aminoácidos del péptido de penetración celular se selecciona en el grupo que consiste en:
- X1LFRALWRLLRX2LWRLLWX3 (SEQ ID NO: 7)
- X1LWRALWRLWRX2LWRLLWX3A (SEQ ID NO: 8)
- X1LWRALWRLX4RX2LWRLWRX3A (SEQ ID NO: 9)
- X1LWRALWRLWRX2LWRLWRX3A (SEQ ID NO: 10)
- X1LWRALWRLX5RALWRLLWX3A (SEQ ID NO: 11) y
- X1LWRALWRLX4RNLWRLLWX3A (SEQ ID NO: 12),
en donde X1 es beta-A o S, X4 es S o T, X7 es K o R, X3 es L, C o I en las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 12 y X3 es L o I en la secuencia de SEQ ID NO: 11.
En una realización, la invención se refiere a un péptido de penetración celular como se definió anteriormente, en donde la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en
- X1LFRALWRLLRX4LWRLLWX7 (SEQ ID NO: 7)
- X1LWRALWRLWRX4LWRLLWX7A (SEQ ID NO: 8)
- X1LWRALWRLX3RX4LWRLWRX7A (SEQ ID NO: 9)
- X1LWRALWRLWRX4LWRLWRX7A (SEQ ID NO: 10)
- X1LWRALWRLX4RALWRLLWX7A (SEQ ID NO: 11) y
- X1LWRALWRLX3RNLWRLLWX7A (SEQ ID NO: 12),
en donde X1 es beta-A o S, X4 es S o T, X7 es K o R, X3 es L, C o I en las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 12 y X3 es L o I en la secuencia de SEQ ID NO: 11.
Según una realización de la invención, el péptido de penetración celular comprende además, enlazadas covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de aminoácidos, una o varias entidades químicas seleccionadas en el grupo que consiste en un acetilo, un ácido graso, un colesterol, un polietilenglicol, una señal de localización nuclear, una señal de exportación nuclear, un anticuerpo, un polisacárido y una molécula de direccionamiento.
En una realización de la presente invención, el péptido de penetración celular puede comprender, enlazados covalentemente al extremo carboxiterminal de su secuencia de aminoácidos, uno o varios grupos seleccionados en el grupo que consiste en una cisteamida, una cisteína, un tiol, una amida, un ácido nitrilotriacético (NTA) opcionalmente sustituido, un carboxilo, un C1-C6 alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido, una amina primaria o secundaria, un derivado osídico, un lípido, un fosfolípido, un ácido graso, un colesterol, un polietilenglicol, una señal de localización nuclear, señal de exportación nuclear, un anticuerpo, un polisacárido y una molécula de direccionamiento.
En una realización de la presente invención, el péptido de penetración celular se elige en el grupo que consiste en: - VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRLLRSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 1)
- VEPEP-6b: Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 2)
- VEPEP-6c: Ac-X1LWRALWRLLRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID NO: 3)
- VEPEP-6d: Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID NO: 4)
- VEPEP-6e: Ac-X1LWRALWRLLRALWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 5) y
- VEPEP-6f: Ac-X1LWRALWRLLRNLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 6),
en donde X1 es beta-A o S, y Ac representa un acetilo.
Según una realización particular de la presente descripción, el péptido de penetración celular VEPEP-6 está grapado, lo que significa que comprende un enlace químico (además de la cadena de aminoácidos) entre dos restos.
En una realización de la invención relacionada con péptidos VEPEP-6 grapados (denominados ST-VEPEP-6), el péptido VEPEP-6 comprende un enlace hidrocarbonado entre dos restos que están separados por tres o seis restos. El experto en la técnica puede obtener estos péptidos usando técnicas que están disponibles en la técnica, por ejemplo, como lo describen Verdine y Hilinski, Methods in Enzymology, 2012 [17].
En péptidos de penetración celular con una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 36, 37 o 38, el enlace hidrocarbonado preferiblemente une los restos en las posiciones 8 y 12, o los restos en las posiciones 11 y 15, o los restos en las posiciones 8 y 15. En esta última configuración (enlace entre los restos 8 y 15), el resto en la posición 8 es R.
Ejemplos no limitantes de VEPEP-6 grapado según la descripción son los siguientes:
- ST-VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 27)
- ST-VEPEP-6aa: Ac-X1LFLARWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 28)
- ST-VEPEP-6ab: Ac-X1LFRALWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 29)
- ST-VEPEP-6ad: Ac-X1LFLARWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 30)
- ST-VEPEP-6b: Ac-X1LFRALWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 31)
- ST-VEPEP-6ba: Ac-X1LFLARWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 32)
- ST-VEPEP-6bb: Ac-X1LFRALWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 33)
- ST-VEPEP-6bd: Ac-X1LFLARWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 34)
- ST-VEPEP-6c: Ac-X1LFARsLWRLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 35),
en donde X1 es beta-A o S y en donde los restos seguidos de una "s" inferior son los que están enlazados por dicho enlace hidrocarbonado.
En una realización, la invención se refiere al péptido de penetración celular como se definió anteriormente, seleccionado del grupo que consiste en:
- ST-VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 27)
- ST-VEPEP-6ab: Ac-X1LFRALWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 29)
- ST-VEPEP-6b: Ac-X1LFRALWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 31)
- ST-VEPEP-6bb: Ac-X1LFRALWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 33),
en donde X1 es beta-A o S y en donde los restos seguidos de una "s" inferior son los que están enlazados por dicho enlace hidrocarbonado.
En una realización, la invención se refiere a un complejo que comprende un péptido de penetración celular como se describió anteriormente y una carga seleccionada entre ácidos nucleicos y moléculas hidrófobas. Ejemplos de cargas de ácido nucleico son ARN o ADN monocatenario pequeño (tamaño entre 2 y 40 bases) y ARN o a Dn bicatenario (tamaño hasta 100 pares de bases), en particular ARNip seleccionado para silenciar un ARNm diana. Como se describe en el ejemplo 7 a continuación, los péptidos de penetración celular según la descripción se pueden usar para suministrar una mezcla de varios ARNip diferentes, con una actividad inhibidora mejorada. Como se ilustra en el ejemplo 8 a continuación, otras cargas de ácido nucleico ventajosas en los complejos según la descripción son microARN (miARN), seleccionados por su capacidad para afectar la expresión de genes y proteínas que regulan la proliferación celular y/o la muerte celular. En otra realización preferida del complejo según la descripción, la carga es una molécula pequeña (tamaño inferior a 1,5 kDa), preferiblemente hidrófoba. Ejemplos no limitantes de moléculas hidrófobas pequeñas que se pueden usar incluyen daunomicina, paclitaxel, doxorrubicina, AZT, porfirina, nucleósidos o nucleótidos marcados con fluorescencia (FAM-guanosina), maghemita hidrófoba (agentes de contraste o nanopartículas magnéticas de Fe2O3) y colorantes fluorescentes.
El tamaño de los complejos descritos anteriormente está preferiblemente entre 50 y 300 nm, más preferiblemente entre 50 y 200 nm (el tamaño del complejo en la presente memoria designa su diámetro medio).
En los complejos según la descripción, la relación molar VEPEP-6/carga depende de la naturaleza y el tamaño de la carga, pero generalmente está comprendida entre 1/1 y 50/1. Para cargas de ARNip, la relación molar carga/VEPEP-6 varía preferiblemente de 10/1 a 30/1, más preferiblemente de 15/1 a 25/1.
Según una realización ventajosa de los complejos como se describió anteriormente, los péptidos VEPEP-6 comprenden un grupo acetilo enlazado covalentemente a su extremo aminoterminal y/o un grupo cisteamida enlazado covalentemente a su extremo carboxiterminal.
Los complejos anteriores se pueden utilizar ventajosamente como "capas centrales" para obtener complejos más grandes, o nanopartículas, mediante una etapa adicional de recubrimiento del complejo VEPEP-6/cargo con otra capa de péptidos de penetración celular, que pueden ser diferentes de los péptidos VEPEP-6 descritos anteriormente. Ejemplos de dichas nanopartículas son nanopartículas CADY/VEPEP-6/ARNip y MPG/VEPEP-6/ARNip descritas en el ejemplo 5.4. Otros ejemplos de péptidos que se pueden usar para formar nanopartículas mediante el recubrimiento de un complejo VEPEP-6/carga son PEP-1, ppTG1 y poliarginina tal como Arg8.
Otro aspecto de la presente descripción se refiere a las nanopartículas realizadas de un "armazón central" que comprende una carga y una primera molécula transportadora, rodeada de péptidos VEPEP-6. Estas se denominan en la presente memoria partículas "NANOPEP-6".
En una realización, la invención se refiere a una nanopartícula que comprende un complejo según la reivindicación 10, recubierto por una capa de péptidos de penetración celular periféricos, en donde dicha capa de péptidos de penetración celular periféricos tiene una secuencia peptídica diferente de la SEQ ID NO: 13.
La tecnología NANOPEP-6 constituye un sistema de suministro "personalizado" que contiene una partícula central común, inmovilizando la molécula terapéutica, con péptidos VEPEP-6 de superficie que preferiblemente están funcionalizados para dirigirse a tumores o tejidos in vivo. Desde un punto de vista estructural, las partículas NANOPEP-6 están constituidas por un "núcleo" que está recubierto por una capa de péptidos VEPEP-6. El "núcleo" corresponde a un complejo que comprende una carga y un vector o transportador, tal como un primer péptido de penetración celular, un liposoma, una estructura policatiónica, una nanopartícula de carbono, etc.
En una realización de la presente invención, la nanopartícula comprende un núcleo que comprende una carga en forma de complejo con una primera entidad seleccionada del grupo que consiste en péptidos de penetración celular, liposomas, estructuras policatiónicas y nanopartículas de carbono, en donde dicho núcleo está recubierto por un péptido de penetración celular como se definió anteriormente.
En partículas NANOPEP-6, la capa de péptidos VEPEP-6 (péptido periférico) estabiliza la partícula y puede funcionalizarse. La funcionalización de la superficie de las partículas NANOPEP-6 con moléculas de colesterol o PEG mejora la estabilidad de las partículas in vivo, favorece su administración ya sea por vía sistémica o tópica y permite una rápida liberación de cargas activas dentro de las células o tejidos tumorales. Se ha demostrado que la funcionalización de la superficie de las partículas NANOPEP-6 con pequeños fragmentos Fab, péptidos, anticuerpos y los lípidos favorece el direccionamiento a tejidos o tumores in vivo (ejemplos 5.2 y 5.3 a continuación).
La tecnología NANOPEP-6 mejora el suministro tanto celular como in vivo de cargas biológicamente activas y se ha validado en un gran conjunto de líneas celulares, incluidas las líneas celulares adherentes y en suspensión, líneas celulares difíciles de transfectar. Las partículas NANOPEP-6 interactúan fuertemente con las membranas celulares y entran en la célula independientemente de la vía endosómica o escapan rápidamente de los endosomas tempranos. La tecnología NANOPEP-6 presenta varias ventajas, incluyendo el suministro rápido con una eficacia muy alta, estabilidad en tampones fisiológicos, carencia de toxicidad y de sensibilidad al suero, capacidad de formar nanopartículas mixtas, se pueden funcionalizar y se han aplicado con éxito al suministro de diferentes tipos de cargas en una gran variedad de líneas celulares, así como en modelos animales, constituyendo de este modo poderosas herramientas para la investigación y aplicaciones terapéuticas básicas. La tecnología NANOPEP-6 se puede aplicar tanto a nivel terapéutico como de diagnóstico/teragnóstico.
En una realización, la invención se refiere a una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende un complejo o una nanopartícula como se definió anteriormente.
En una realización particular de partículas NANOPEP-6 según la presente descripción, la carga forma un complejo con un primer péptido de penetración celular, que puede ser, por ejemplo, seleccionado entre CADY (descrito en el documento US 7.579.318, incorporado en la presente memoria por referencia), MPG (SEQ ID No: 23, N-acetil-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-Cisteamida) o sus variantes descritas en el documento US 7.514.530, PEP1 (SEQ ID NO: 24, N-acetil-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cisteamida), PPTG1 (SEQ ID NO: 25, GLFKALLKLLKSLWKLLLKA), motivo de poli Arginina tal como Arg8, péptidos v Ep EP-6 descritos anteriormente, o cualquier otro CPP conocido. Este complejo carga/CPP se recubre después con una capa de péptidos VEPEP-6. Según esta realización, el experto en la técnica elegirá ventajosamente el primer CPP dependiendo de la naturaleza de la carga, para que el complejo de carga y primer CPP sea estable. Por lo tanto, se puede incluir una amplia diversidad de cargas en las partículas NANOPEP-6 (véase el ejemplo: 5.3 utilizando el complejo PEP-1/péptido asociado a VEPEP-6, ya que los péptidos cortos no son carga del péptido VEPEP-6).
En las nanopartículas como se describió anteriormente, la relación molar VEPEP-6/núcleo depende de la naturaleza y el tamaño del núcleo, pero generalmente está comprendida entre 1/1 y 50/1. Para núcleos CPP/ARNip, la relación molar periférica de VEPEP-6/carga varía preferiblemente entre 10/1 y 30/1, más preferiblemente de 15/1 a 25/1. En lo que sigue, cuando se indica una relación péptido periférico/partícula de armazón central para nanopartículas según la descripción, esta relación representa, de hecho, la relación molar péptido periférico/carga.
En una realización preferida de las nanopartículas según la descripción, el tamaño de la nanopartícula está entre 80 y 400 nm.
Según una realización ventajosa de las partículas NANOPEP-6 según la descripción, los péptidos VEPEP-6 que forman la capa periférica de las nanopartículas comprenden un grupo acetilo enlazado covalentemente a su extremo N, y/o un grupo cisteamida enlazado covalentemente a su extremo C.
Según otra realización preferida, descrito en el ejemplo 4 e ilustrado en el ejemplo 5.2 a continuación, el armazón central de las partículas está recubierto con un péptido VEPEP-6 funcionalizado con NTA (por ejemplo, un péptido VEPEP-6 con ácido nitrilotriacético enlazado covalentemente a su extremo C). Esto permite la posterior fijación a la superficie de la partícula, de cualquier proteína (u otra molécula) que albergue una etiqueta de histidina. Esta estrategia ofrece la principal ventaja de tener partículas comunes de dos capas "NANOPEP-6-HIS" que pueden asociarse a cualquier molécula etiquetada con His.
En el presente texto, Las siguientes notaciones se utilizarán para describir las nanopartículas según la presente descripción:
Como ya se describió, "NANOPEP-6" designa una partícula que comprende un armazón central hecho de al menos una carga y una primera molécula transportadora, rodeado por una capa de VEPEP-6. Para especificar adicionalmente la naturaleza del transportador del armazón central y de la carga, de utilizará la notación "NANOPEP-6/transportador del armazón central/carga". Por ejemplo, las nanopartículas formadas por partículas CADY/ARNip rodeadas por una capa de péptidos VEPEP-6 (ejemplo 5.3 a continuación) se denominarán "NANOPEP-6/CADY/ARNip". Para simplificar las notaciones, las nanopartículas formadas con dos capas de péptidos VEPEP-6 alrededor de una carga se pueden denominar "NANOPEP-6/carga".
Se utilizan los mismos principios para designar las nanopartículas funcionalizadas, con la especificidad de que las partículas de NANOPEP funcionalizadas con NTA se denominan NANOPEPHIS. Por lo tanto, en el ejemplo 5.2.2, "NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4" designa nanopartículas en las que la carga de PC4 forma complejo con PEP1 como primer péptido de penetración celular y después se rodea por una capa de péptidos VEPEP-6 funcionalizados con NTA, y en el ejemplo 5.2.1, "MUC-NANOPEp-6-HIS/ARNip" designa nanopartículas con ARNip como carga, en forma de complejo con una primera capa de péptidos VEPEP-6, y rodeado por una segunda capa de péptidos VEPEP-6 que están funcionalizados y unidos a una molécula que se dirige a MUC1.
En realizaciones particulares de los complejos y nanopartículas según la descripción, al menos parte de los péptidos de penetración celular VEPEP-6 están unidos a una molécula de direccionamiento. En el caso de partículas NANOPEP-6, al menos parte de los péptidos de penetración celular que se encuentran en la periferia de la nanopartícula se unen preferiblemente a una molécula de direccionamiento. Ejemplos de moléculas de direccionamiento incluyen: anticuerpos, fragmentos Fc y FAB y ligandos, especialmente dirigidos a receptores que están sobreexpresados en la superficie de determinados tipos celulares, etc. Entre las numerosas moléculas a las que se dirigen los anticuerpos, los fragmentos Fc y Fab, se puede citar el receptor tirosina quinasa de HEK2, MUC1, el receptor de EGF y CXCR4. Ejemplos no limitantes de otros ligandos que se pueden utilizar son: péptido RGD, péptidos de asentamiento dirigidos (péptido NT1 cerebral, péptido GM Ganglion), ácido fólico, polisacáridos, motivo peptídico dirigido a metaloproteasas de matriz (MMP-9).
Según una realización particular de la presente descripción, los complejos o nanopartículas están formulados de manera que se pueden almacenar durante varios meses sin perder su estabilidad y eficacia funcional. Como se describe en el ejemplo 6 a continuación, los complejos y nanopartículas de la descripción se pueden liofilizar de manera ventajosa en presencia de un azúcar. Ejemplos no limitantes de azúcares que pueden utilizarse para tal fin son sacarosa, glucosa y una mezcla de las mismas, y se pueden utilizar, por ejemplo, en una concentración que varía entre un 5 % y un 20 %, preferiblemente de 5 % a 10 %, entendiéndose que se obtiene una concentración del 5 % añadiendo 5 gramos por litro de solución antes de la liofilización.
Otro aspecto de la presente descripción es una composición terapéutica que comprende un complejo o una nanopartícula como se describió anteriormente. Por ejemplo, una composición que comprende un complejo o nanopartícula que tiene un ARNip anticiclina B1 como carga, y una molécula de direccionamiento específica para células tumorales (por ejemplo: péptido RGD, ácido fólico, anticuerpos del receptor de MUC-1 o HEK2...), es parte de la presente descripción. Cabe señalar que los complejos y nanopartículas según la descripción también pueden usarse de manera ventajosa para formular composiciones no terapéuticas (por ejemplo, para investigación, fines de obtención de imágenes y/o diagnóstico).
Se pueden formular composiciones según la descripción (terapéuticas o no terapéuticas), por ejemplo, para administración intravenosa, tópica, intrarrectal, intratumoral, intranasal o intradérmica, así como para la administración a través de un aerosol bucal. Debido a su suministro específicamente eficaz al pulmón, composiciones particulares según la presente descripción pueden dirigirse a células pulmonares, por ejemplo, para tratar o diagnosticar cánceres de pulmón o para tratar enfermedades pulmonares como el asma. Se puede utilizar cualquier formulación conocida en el campo farmacológico, tal como supositorio, soluciones, pulverizaciones, pomadas, etc. Por supuesto, otro objeto de la presente descripción es un método para suministrar una molécula a un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente un complejo o nanopartícula según la presente descripción, en particular a través de vía intrarrectal, intranasal (u oral, con un aerosol) o intradérmica.
La presente invención también se refiere a un método para suministrar una molécula en una célula in vitro, que comprende una etapa de poner dicha célula en contacto con un complejo que comprende dicha molécula y péptidos de penetración celular VEPEP-6 como se describió anteriormente.
En una realización, la invención se refiere al complejo o nanopartícula como se definió anteriormente, para su uso como medicamento.
La descripción se ilustra además mediante las siguientes figuras y ejemplos.
Leyendas a las figuras
Figura 1: Estructura de VEPEP-6 en presencia de fosfolípido u oligonucleótido bicatenario como se monitoriza mediante dicroísmo circular (a) y cálculo de modelado molecular (utilizando el programa Peplook, ref 9) o medición por RMN (b).
Figura 2: Unión de ácido nucleico a VEPEP-6a como se monitoriza mediante espectroscopia de fluorescencia intrínseca de TRP. Las constantes de disociación se calcularon a partir del ajuste de datos. Ácidos nucleicos utilizados: ADN bicatenario (45/35 meros), ARNip (19/19 o 25/25) y ADN monocatenario (19 o 36 meros)
Figura 3: Unión de moléculas hidrófobas pequeñas a VEPEP-6 como se monitoriza mediante espectroscopia de fluorescencia. La unión de la doxorrubicina, AZT y porfirina a VEPEP-6 se monitorizó siguiendo la desactivación de la fluorescencia de VEPEP-6 intrínseca al triptófano y la de guanosina marcada con fluoresceína (FAM-G) monitorizando la fluorescencia de FAM. Las constantes de disociación se calcularon a partir del ajuste de datos.
Figura 4: Impacto del tamaño de partícula de VEPEP-6 sobre la eficacia del silenciamiento. Una concentración fija de 20 nM de ARNip (Cyc-B1) se asoció con diferentes relaciones molares de VEPEP-6/ARNip que varían de 1/1 a 50/1. El tamaño de las partículas de VEPEP-6/ARNip se midió mediante dispersión de luz (barras grises) y se evaluó la respuesta biológica asociada con la internalización de ARNip en células cultivadas midiendo la reducción de los niveles de proteína ciclina B124 horas después de la transfección (barras negras).
Figura 5: Análisis estructural de complejos de VEPEP-6/ARNip mediante microscopía electrónica de barrido (a) y microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés) (b).
Figura 6: Respuesta a la dosis de VEPEP-6 de silenciamiento de Ciclina B1 en los niveles de proteína y ARNm en células Hela (panel A) y HS68 (panel B). Se prepararon partículas de solución madre de VEPEP-6/ARNip (100 nM) en una relación molar de 1/20 (ARNip/VEPEP-6) y se obtuvieron concentraciones más bajas (de 200 nM a 0,125 nM) mediante dilución en serie de la solución madre en PBS. Las células HeLa (Panel A) y HS-68 (Panel B) (60% de confluencia) se solaparon con complejos preformados durante 30 min, después se añadió directamente a las células DMEM nuevo suplementado con FCS al 10 %, que después se devolvieron a la incubadora durante 24 horas. Los niveles de proteína ciclina B1 se determinaron mediante transferencia Western utilizando Cdk2 como control para la cuantificación (barras blancas). Se midieron los niveles de ARNm de ciclina B1 12 horas después de la transfección usando tecnología Quantigen (barras negras). Se utilizaron como control ARNip de Cyc-B3 no coincidente asociado con VEPEP-6 (200 nM) y partículas VEPEP-6 vacías (20 pM). Panel C: Dosis-respuesta de la detención en G2 asociada con el silenciamiento de Ciclina B1. Se trataron células HeLa (barras negras) y HS68 (barras blancas) con concentraciones crecientes de VEPEP-6/ARNip-Cyc-B1 de 0,25 nM a 20 nM. El estado del ciclo celular se evaluó mediante análisis FACS. Se utilizaron como controles ARNip de Cyc-B3 (100 nM) y ARNip de GAPDH (100 nM) no coincidentes asociados a VEPEP-6, así como al transportador de VEPEP-6 solamente (20 pM). Los resultados son las medias ± de 4 experimentos separados.
Figura 7: Toxicidad de las partículas de VEPEP-6: (A) La toxicidad de las partículas de VEPEP-6 se investigó mediante el ensayo MTT (barras grises) y monitorizando el nivel de ARNm de ciclofilina medido mediante tecnología quantigen TM (Affymetrix) (barras blancas). Las células HeLa se trataron con concentraciones crecientes de partículas de VEPEP-6/ARNip que variaban de 1 a 100 pM y después se evaluó la toxicidad 12 h (ARNm de ciclofilina) o 24 h (MTT) después del tratamiento. (B) La partícula sw VEPEp-6 no induce respuestas inmunitarias o de interferón inespecíficas in vivo. Se inyectaron VEpEP-6/ARNip (conjunto 2), NANOPEP-6/ARNip (grupo 3) (1 mg/kg de ARNip) y transportador de VEPEP-6 (grupo 4) por vía intravenosa en ratones y se midió la inducción de citocinas en el suero 6 (grupo A), 12 (conjunto B), 24 (conjunto C) y 48 (conjunto D) horas después de la inyección utilizando el kit Invitrogen 10 plex (LMC 10001). Este kit permitió la medición simultánea de IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-gamma, TNF-a y GM-CSF de ratón en suero o sobrenadante de cultivo de tejidos. Los datos se compararon con la molécula de control LPS (conjunto 1). Los datos indicados son el promedio de 3 experimentos separados.
Figura 8: (A) Unión de moléculas hidrófobas pequeñas fluorescentes (SFM, por sus siglas en inglés) a VEPEP-6 como se monitoriza mediante espectroscopia de fluorescencia. En el caso presente, se utilizó un nucleótido marcado con fluorescencia (guanina marcada con fluoresceína). Las constantes de disociación se calcularon a partir del ajuste de datos. (B) Efecto de la doxorrubicina mediada por VEPEP-6 sobre la viabilidad de las células cancerosas. Se han evaluado las respuestas a las dosis de doxorrubicina libre (barras blancas) y mediada por VEPEP-6 (barras grises) sobre la viabilidad de las células cancerosas U2OS y MCF7.
Figura 9: Suministro de SFM mediado por VEPEP-6 in cellulo. Se evaluó una respuesta a la dosis de suministro de SFM mediado por VEPEP-6 en la línea celular Hela. Las membranas se marcaron en verde con WGA, el núcleo en azul con Hoescht y las moléculas SFM (guanina marcada con fluoresceína) se indican en rojo. Las mediciones se realizaron después de 20 y 135 min de incubación.
Figura 10: Protocolo de formación de partículas utilizando VEPEP-6 (panel A) y VEPEP-6 funcionalizado o NANOPEPHIS-6 (Panel B).
Figura 11: Suministro de NANOPEP-6 ARNip de Ciclina B1 tras inyección tópica y sistémica. Se inocularon por vía subcutánea ratones lampiños atímicos hembra en el costado con 1 x 106 PC3 (paneles A y B) o HT29 (paneles C y D). Dos o tres semanas después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron con inyecciones intratumorales (paneles A y C), cada 3 días, con una solución, ya sea una solución salina tampón (triángulo cerrado), ARNip de Cyc-B1 libre (triángulo abierto), ARNip de control de Cyc-B3 (caja cerrada) o ARNip de Cyc-B1 a 5 pg (círculo abierto) y 10 pg (círculo cerrado) en forma de complejo con nA n OPEP-6 en una relación molar de 1/20. Mediante inyecciones intravenosas (paneles B y D), cada 3 días, con una solución de ARNip de Cyc-B1 libre (triángulo cerrado), ARNip de control de Cyc-B3 (triángulo abierto) o ARNip de Cyc-B1 a 5 pg (círculo abierto) y 10 pg (círculo cerrado) en forma de complejo con NANOPEP-6 en una relación molar de 1/20. El diámetro tumoral se midió en dos direcciones a intervalos regulares usando un calibre digital y el volumen tumoral se calculó como largo x ancho x alto x 0,52. Las curvas muestran el valor medio del tamaño tumoral en una cohorte de seis animales y no se observó muerte de los animales ni ningún signo de toxicidad.
Figura 12: Suministro de ARNip de Ciclina B1 o PEP1/PC4 mediado por NANOPEPHIS tras inyección sistémica. Se inocularon por vía subcutánea ratones lampiños atímicos hembra en el costado con 1 x 106 células tumorales PC3 o A549. Panel A: Dos semanas después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron con una única inyección intravenosa de NANOPEP-6/ARNip (en blanco), MUC-NANOPEP-6-HIS/ARNip (en gris) o (HEK-NANOPE-6-PHIS/ARNip (en negro). En todos los casos, se utilizaron 5 pg de ARNip marcado con Alexa700. A las 24 h, los ratones se sacrificaron y se extrajeron diferentes órganos para cuantificar la fluorescencia de Alexa en los diferentes tejidos y se normalizaron al nivel de proteína en la muestra. Panel B: Dos semanas después del implante del tumor A549, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron cada 3 días, por inyección intravenosa de NANOPEP-6/ARNip (círculo abierto), MUC-NANOPEP-6-HIS/ARNip (triángulo abierto), HEK-NANOPEP-6-HIS/ARNip (triángulo cerrado) o solución salina tampón (círculo cerrado). En todos los casos, Los ARNip forman complejos con NANOPEP-6 o NANOPEPHIS en una relación molar de 1/20. El diámetro tumoral se midió en dos direcciones a intervalos regulares usando un calibre digital y el volumen tumoral se calculó como largo x ancho x alto x 0,52. Las curvas muestran el valor medio del tamaño tumoral en una cohorte de seis animales y no se observó muerte de los animales ni ningún signo de toxicidad. Panel C: Dos semanas después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron con una única inyección intravenosa de PEP1/ PC4 (en blanco), MUC-NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4 (en gris) o HEK-NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4 (en negro). En todos los casos, se utilizaron 10 pg de PC4 marcado con CY5. A las 24 h, los ratones se sacrificaron y se extrajeron diferentes órganos para cuantificar la fluorescencia de CY5 en los diferentes tejidos y se normalizaron al nivel de proteína en la muestra.
Figura 13: Suministro dirigido in vivo mediado por NANOPEP-6 en el pulmón. El ARNip dirigido a GAPDH, marcado con Alexa700 o no, formó complejo con el péptido CADY en una relación de 1/20, después, la "armazón central" de CADY/ARNip se recubrió con péptido VEPEP-6 en una relación molar de 1/10 (Paneles A, B). Un péptido corto de 15 meros marcado con colorante c Y5 se asoció con el péptido PEP-1 a una relación molar de 1/10, después se recubrió el "armazón central" de PEP1/péptido con péptido VEPEP-6 a una relación molar de 1/10 (Panel C). En todos los casos, se inyectaron por vía intravenosa 5 pg/de cargas en forma de complejo con transportador peptídico. La biodistribución in vivo de las partículas del armazón central (en negro) y de las partículas del armazón central recubiertas con VEPEP-6 (en gris) se monitorizaron usando obtención de imágenes de fluorescencia de animales vivos 48 horas después de la inyección. Panel B: La biodistribución del complejo CADY/ARNip recubierto o no con VEPEP-6 también se validó mediante la monitorización del nivel del ARNm del gen constitutivo GAPDH en los diferentes tejidos. Se realizó una única inyección de ARNip desnudo (en blanco: 100 pg), CADY/ARNip (en negro: 5 pg) y NANOPEP-6/CADY/ARNip (en gris: 5 pg). El nivel de ARNm de GAPDH se cuantificó en todos los tejidos utilizando tecnología Quantigen. Los datos indicados son el promedio de 3 experimentos separados.
Figura 14: Suministro dirigido in vivo de complejos VEPEP-6/ARNip mediado por CPP. El ARNip dirigido a GAPDH, marcado con Alexa700 o no, formó complejo con el péptido VEPEP-6 en una relación de 1/20, después, el "armazón central" de VEPEP6/ARNip se recubrió con péptido m Pg o CADY en una relación molar de 1/10. En ambos casos, se inyectaron por vía intravenosa 5 pg de ARNip en forma de complejo con el transportador de VEPEP-6. Panel A; LA biodistribución in vivo de MPG/VEPEP6/ARNip (en negro) y de partículas CADY/VEPEP-6/ARNip (en gris) se monitorizó usando obtención de imágenes de fluorescencia animales vivos 48 horas después de la inyección. Panel B: La biodistribución del complejo VEPEP6/ARNip recubierto con MPG (en negro) o CADY (en gris) también se validó mediante la monitorización del nivel del ARNm del gen constitutivo GAPDH en los diferentes tejidos. Se realizó una única inyección de ARNip desnudo (en blanco: 100 pg), MPG/VEPEP6/ARNip (en negro: 5 pg) y MPG/ VEPEP6/ARNip (en gris: 5 pg). El nivel de ARNm de GAPDH se cuantificó en todos los tejidos utilizando tecnología Quantigen. Los datos indicados son el promedio de 3 experimentos separados.
Figura 15: Suministro de ARNip mediado por NANOPEP-6 mediante administración dérmica/intranasal e intrarrectal. Un ARNip marcado con fluorescencia con Alexa700 o un ARNip dirigido a GAPDH se asoció a VEPEP-6 como una "armazón central" rodeado por moléculas VEPEP- 6. Se evaluó la biodistribución del ARNip marcado con fluorescencia in vivo en ratones Balb6, 5 horas después de una administración única intrarrectal (Panel A), intranasal (Panel B) o intradérmica (Panel C) de 10 pg bien de ARNip desnudo o de ARNip en partículas NANOPEP-6. Panel D: La desactivación de GAPDH asociada a ARNip se evaluó después de 48 horas en diferentes tejidos, monitorizando el nivel de ARNm de GAPDH usando tecnología Quantigen (Panomics inc). Administración Intravenosa (gris claro), intrarrectal (en blanco), intranasal (en negro) o intradérmica (en gris claro). Los datos indicados son el promedio de 3 experimentos separados.
Figura 16: Protocolo para la obtención de una formulación fresca o liofilizada de complejos VEPEP-6/ARNip.
Figura 17: Las muestras de VEPEP-6/ARNip se incubaron en una relación molar de 20:1 durante 30 min a 25 °C, después se filtró usando un filtro de 0,2 pm y se analizó mediante cromatografía de HPLC de exclusión por tamaño usando SEC 3000 después de 1, 5, 24 y 96 horas (panel A). Se analizó VEPEP-6/ARNip liofilizado en glucosa al 5 %, después de 24 y 96 h (panel B). El ARNip libre se midió mediante tecnología quantigen (Affymetrix); la cuantificación se basó en la curva de calibración obtenida con dosis crecientes de ARNip libre. El nivel de ARNip dentro de la partícula se determinó antes de la formación de las partículas y luego después de la filtración de la partícula usando acetonitrilo (ACN) para la disociación de las partículas (Panel C).
Figura 18: Suministro de ARNip de Ciclina B1/CDC20/GAPDH con NANOPEP-6 tras la inyección sistémica. Se inocularon por vía subcutánea ratones lampiños atímicos hembra en el costado con 1 x 106PAN-1 (tumor de páncreas). Cinco días después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron mediante inyecciones intravenosas, cada 4 días, con una solución bien de solución salina tampón (PBS, círculo abierto), cóctel de ARNip libre (círculo gris), ARNip de Cyc-B1 (triángulo cerrado) o ARNip de CDC20 (triángulo abierto) a 2 pg y cóctel de ARNip a 2 pg (cuadrado cerrado) en forma de complejo con NANOPEP-6 en una relación molar de 1/20. La curva con los círculos cerrados corresponde a los animales control sin tumores. Las curvas muestran el valor medio de supervivencia en una cohorte de diez animales y no se observó muerte animal ni ningún signo de toxicidad.
Figura 19: Unión de VEPEP-6 y liberación de miARN (supresor de tumores mir34). Panel A: La unión del péptido VEPEP-6 para el miRNA-34 monocatenario se cuantificó mediante medición de fluorescencia en estado estacionario utilizando mi34 marcado con CY5. Se tituló una concentración fija de mi34 marcado con CY5 (20 nM) aumentando las concentraciones de VEPEP-6 hasta 100 nM. La fluorescencia de CY5miRNA-34 se monitorizó a 550 nm tras la excitación a 505 nm. Al unirse al miRNA-34, Vepep-6 indujo una desactivación de la fluorescencia marcada. Los datos se ajustaron mediante una ecuación cuadrática y las curvas muestran el valor medio de tres experimentos diferentes. Panel B: Propiedad de antiproliferación del suministro de miR34 mediada por VEPEP-6 en células de cáncer de mama MCF7. Una solución madre de partículas de VEPEP-6/miARN-34 (2 pM) tenía una relación molar de 20/1 y se obtuvieron concentraciones más bajas mediante dilución en serie de la solución madre en PBS. El miARN-34 monocatenario se asoció a VEPEP-6 como un armazón "central" rodeado por moléculas de VEPEP-6. Las células MCF-7 (confluencia del 40 %) se solaparon con barras blancas de complejos preformados) o miARN34 desnudo (barras grises) y se cuantificó la proliferación celular después de 4 días.
Figura 20: Ilustración de VEPEP-6 grapado. (A) Los dos tipos de péptidos grapados en todos los hidrocarburos. Los aminoácidos de reticulación a-metilo, a-alquenilglicina se incorporan durante la síntesis de péptidos en fase sólida. Un péptido grapado en i, i+4 requiere dos unidades de S5 (notaciones como en [18]) incorporadas en las posiciones relativas i e i+4 (ST-VEPEP-6a y ST-VEPEP-6b). Un péptido grapado en i, i+7 requiere una unidad de R8 en la posición i y una unidad de S5 en la posición i+7 (ST-VEPEP-6C). El péptido unido a la resina se trata con el catalizador de Grubbs I de metátesis de olefinas para producir una reticulación entre los dos aminoácidos no naturales, dando como resultado un péptido grapado que está reforzado en una conformación de hélice a. (B) Síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc de péptidos grapados con hidrocarburos (de Verdine y Hilinski, 2012).
Figura 21: Unión de ácidos nucleicos pequeños a VEPEP-6 grapado como se monitoriza mediante espectroscopia de fluorescencia. La unión de ácido nucleico a ST-VEPEP-6a se monitorizó mediante espectroscopia de fluorescencia intrínseca de TRP. Ácidos nucleicos utilizados: ADN bicatenario (45/35 meros), ARNip (19/19 o 25/25) y ADN monocatenario (19 o 36 meros). Se tituló una concentración fija de ST-VEPEP-6a (50 nM) aumentando las concentraciones de ácido nucleico, después se calcularon las constantes de disociación a partir del ajuste de datos usando una ecuación cuadrática.
Figura 22: Disociación de los complejos ARNip/ST-VEPEP-6 y ARNip/VEPEP-6 en presencia de heparán sulfato. La disociación de los complejos ARNip/ST-VEPEP-6 y ARNip/VEPEP-6 formados a 100 nM en una relación molar de 20/1 se monitorizó mediante espectroscopía de fluorescencia, utilizando ARNip marcado con FITC asociado a ST-VEPEP-6a o VEPEP-6a. Los complejos preformados se incubaron con concentraciones crecientes de heparán sulfato y se midió la disociación a 520 nM tras la excitación a 492 nm. Las constantes de disociación se calcularon a partir del ajuste de datos.
Figura 23: Suministro de ARNip de Ciclina B1 con ST-VEPEP-6 tras inyección sistémica. Se inocularon subcutáneamente ratones lampiños atímicos hembra en el costado con 1 x 106 HT29. Cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm23, los animales se trataron mediante inyecciones intravenosas, cada 4 días, con una solución ya sea solución salina tampón, ARNip de Cyc-B1 libre (cuadrado abierto) o ARNip de Cyc-B1 a 3 pg (símbolo abierto) o 5 pg (símbolo de cierre) en forma de complejo con VEPEP-6 (círculo) o ST-VEPEP-6a o ST-VEPEP-6b (triángulo) a una relación molar de 1/20. El diámetro tumoral se midió en dos direcciones a intervalos regulares usando un calibre digital y el volumen tumoral se calculó como largo x ancho x alto x 0,52. Las curvas muestran el valor medio del tamaño tumoral en una cohorte de tres animales y no se observó muerte de los animales ni ningún signo de toxicidad. (A) Aumento del volumen tumoral tras el tratamiento. (B) Nivel de ARNm de ciclina B1 diana. Después de 48 días, se eliminaron los tumores HT29 y se evaluaron los niveles de ARNm de Ciclina B1 mediante tecnología Quantigen y se normalizaron a los niveles de ciclofilina. Control (negro), 5 pg de ARNip-cyc-B1 (gris) en forma de complejo con VEPEP-6 o ST-VEPEP-6a a una relación molar de 1/20.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales, Métodos, análisis químico y biofísico
Péptidos VEPEP-6
Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis de péptidos en fase sólida utilizando resina AEDI-expensina con (fluorenilmetoxi)-carbonilo (Fmoc) en un sintetizador de péptidos Pioneer (PioneerTM, Applied Biosystems, Foster City, CA) a partir de resina Fmoc-PAL-PEG-PS a una escala de 0,2 mmol. Las reacciones de acoplamiento se realizaron con 0,5 M de HATU en presencia de 1 M de DIEA. La eliminación del grupo protector y la escisión final de la resina se llevaron a cabo con TFA/Fenol/H2O/tioanisol/etanoditiol (82,5/5/5/5/2,5 %) durante 3 h 30 min. Todos los péptidos presentaron un grupo cisteamida en el extremo N y estaban acetilados en el extremo C. La síntesis de péptidos comenzó por el extremo C, usando una resina AEDI-expensina comenzando con un enlace cisteamida, como lo describe Mery et al, 1992 [10]. Todos los péptidos contenían una beta-alanina o una serina en el extremo N para favorecer cualquier funcionalización adicional sin usar el grupo cisteamida carboxiterminal.
Se sintetizaron los siguientes péptidos:
VEPEP-6a: Ac-[pA/S]LFRALWRLLR[S/T]LWRLLW[K/R]-cisteamida (SEQ ID NO: 7)
VEPEP-6b: Ac-[pA/S]LWRALWRLWR[S/T]LWRLLW[K/R]A-cisteamida (SEQ ID NO: 8)
VEPEP-6c: Ac-[pA/S]LWRALWRL[L/C/I]R[S/T]LWRLWR[K/R]A-cisteamida (SEQ ID NO: 9)
VEPEP-6d: Ac-[pA/S]LWRALWRLWR[S/T]LWRLWR[K/R]A-cisteamida (SEQ ID NO: 10)
VEPEP-6e: Ac-[pA/S]LWRALWRL[L/I]RALWRLLW[K/R]A-cisteamida (SEQ ID NO: 11)
VEPEP-6f: Ac-[pA/S]LWRALWRL[L/C/I]RNLWRLLW[K/R]A-cisteamida (SEQ ID NO: 12),
en donde la notación [X/Y] significa que se han probado ambos aminoácidos X e Y en esta posición, con idénticos resultados.
Funcionalización de Vepep-6
Se utilizaron dos enfoques para la funcionalización de péptidos
(1) Se realizaron conjugaciones de péptidos con péptido, anticuerpo, pegilación, NTA, colesterol, o estearilación en el grupo amino primario del resto aminoterminal, a través de una beta alanina o serina. Es ventajoso mantener la cisteamida carboxiterminal libre, ya que se sabe que es necesario estabilizar la partícula a través de enlaces disulfuro (SH-SH). Los péptidos funcionalizados se purificaron adicionalmente mediante HPLC de fase inversa y se analizaron mediante espectroscopía de masas de ionización por electropulverización.
(2) También se realizaron conjugaciones de péptidos a través de enlaces disulfuro usando el grupo SH del resto cisteamida del péptido.
VEPEP-6-Funct-1: X-ALFRAL WRLLRSLWRLLWK-NH-CH2-CH2-SH (SEQ ID NO: 15) (1)
VEPEP-6-Funct-2: Ac-ALFRALWRLLRSLWRLLWK-NH-CH2-CH2-S-S-X (SEQ ID NO: 16) (2)
X: colesterol, pegilación, estearilo, pamitoílo, fragmentos FC o FAB pequeños, ácido nitrilotriacético (2 x NTA) o péptido dirigido (por ejemplo, péptido dirigido al cerebro).
Oligonucleótidos y ARNip
Los ARNip y ARNip marcado con fluorescencia con Alexa700 o fluoresceína (5'-FAM) en 5' se sintetizaron por Eurogentec (Bélgica) según las siguientes secuencias.
Cyc-B1 en sentido 5'GGCGAAGAUCAACAUGGCATT3' (SEQ ID NO: 17),
Cyc-B1 antisentido 5'UGCCAUGUUGAUCUUCGCCTT3' (SEQ ID NO: 18),
Cyc-B3 en sentido 5'GGUGAAGAUCAGCAUGGCATT3' (SEQ ID NO: 19),
Cyc-B3 antisentido 5'UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT3' (SEQ ID NO: 20),
GAPDH en sentido 5'CAUCAUCCCUGCCUCUACUTT-3' (SEQ ID NO: 21) y
GAPDH antisentido 5' AGUAGAGGCAGGGAUGAUG3' (SEQ ID NO: 22).
El ARNip de Cyc-B1, dirigido a ciclina B1, y un ARNip derivado que albergaba dos desapareamientos, Cyc-B3, se utilizó como control. Se usó un ARNip dirigido a GAPDH como control para validar la especificidad de diana y para monitorizar la respuesta de interferón no específica asociada. La solución madre de ARNip se preparó en agua sin RNasa.
Estructura de VEPEP-6
Los péptidos VEPEP-6 son péptidos anfipáticos secundarios, son muy versátiles y muestran un fuerte polimorfismo estructural. Los VEPEP-6 se despliegan en solución como una forma libre y adoptan una conformación alfa helicoidal en presencia de membranas lipídicas o celulares artificiales, así como en presencia de cargas como ARNip/oligonucleótidos monocatenarios y bicatenarios (figura 1).
Caracterización de nanopartículas basadas en péptidos
La distribución por tamaño de partícula medio se determinó con un Coulter N4 Plus (Coulter-Beckman) a 25 °C durante 3 minutos por medición y el potencial zeta se midió con un aparato Zetasizer 4 (Malvern Ltd,)
Citotoxicidad
Se investigó la toxicidad de los complejos VEPEP-6/ARNip en líneas celulares Hela y HS-68. Se incubaron 30.000 células sembradas en placas de 24 pocillos el día anterior a la transfección, con concentraciones crecientes de ARNip en forma de complejo con VEPEP-6 en una relación molar de 20/1 que variaba de 0,1 a 5 pM (VEPEP-6 100 pM), durante 30 minutos antes de la adición de medio para alcanzar una concentración final del 10 % de FCS. La respuesta citotóxica se midió 12 h o 24 h más tarde mediante la monitorización del nivel de ARNm del gen constitutivo de ciclofilina (Quantigen, Panomic Inc.) y mediante el ensayo colorimétrico MTT (Sigma, Alemania), respectivamente. Para el ensayo MTT, se eliminó el medio de cultivo celular y se reemplazó con PBS que contenía 2,5 mg/ml de MTT durante 4 h. Los resultados corresponden al promedio de 3 experimentos por separado.
Obtención de imágenes in vivo de la biodistribución de ARNip
La obtención de imágenes de fluorescencia in vivo se realizó como se describió anteriormente [26, 27]. Los ratones se inyectaron por vía intravenosa con 10 pg (200 pl) de ARNip marcado con fluorescencia con Alexa700, ya sea desnudo o en forma de complejo con diferentes formulaciones basadas en VEPEP-6: ejemplo 5.2.1 NANOPEP-6-HIS/ARNip; ejemplo 5.3 NANOPEP-6/CADY/ARNip y NANOPEP-6/PEP1/péptido; ejemplo 5.4 CADY/VEPEP6/ARNip y MPG/VEPEP6/ARNip, ejemplo 5.5 NANOPEP-6/ARNip (n = 3 animales por grupo). Los ratones anestesiados, usando isoflurano al 2 %, se iluminaron con diodos emisores de luz de 663 nm equipados con filtros de interferencia y se adquirieron películas durante los primeros 15 minutos y se tomaron imágenes de fluorescencia cada hora durante 5 horas y, a continuación, después de 24 horas, con una cámara CCD refrigerada adelgazada por detrás como se describió anteriormente [11]. A las 24 horas, los ratones se sacrificaron y se extrajeron diferentes órganos para la cuantificación de la fluorescencia de Alexa.
Ejemplo 2: Aplicaciones de péptidos VEPEP-6 para el suministro de moléculas
Ejemplo 2.1: Los péptidos VEPEP-6 forman nanoestructuras estables con ácidos nucleicos
Los péptidos VEPEP-6 forman complejos estables con ARNip, oligonucleótidos monocatenarios y bicatenarios. La unión de las cargas a VEPEP-6 se monitorizó mediante espectroscopia de fluorescencia usando tanto el grupo Trp intrínseco de VEPEP-6 (3 a 5 restos de Trp) como las cargas marcadas con fluorescencia extrínsecas (usando Cy3, Cy5 o FITC). Los experimentos de fluorescencia se realizaron en un espectrofluorímetro PTI a 25 °C en un tampón de NaCl 154 mM. La fluorescencia intrínseca de Trp de VEPEP-6 se excitó a 290 nm y el espectro de emisión se registró entre 310 y 400 nm, con un paso de banda espectral de 2 y 8 nm para excitación y emisión, respectivamente. Se excitó la fluorescencia de FITC del ARNip o ADN marcado a 492 nm y se registró la emisión entre 500 y 580 nm. Para la interacción VEPEP-6/ARNip, se tituló ARNip marcado con FITC 0,5 pM aumentando las concentraciones de péptido. Todas las mediciones se corrigieron para la dilución y el ajuste de la curva se realizó utilizando el programa informático Grafit (Erithacus). El ajuste de la curva revela que VEPEp-6 une fuertemente las diferentes cargas con una constante de disociación en el intervalo nanomolar (tabla 1 y figura 2).
Ejemplo 2.2: Los péptidos VEPEP-6 forman nanoestructuras estables con moléculas hidrófobas pequeñas Los péptidos VEPEP-6 también forman partículas estables con moléculas aromáticas y/o hidrófobas pequeñas, incluyendo la daunomicina, paclitaxel, doxorrubicina, AZT, porfirina, FAM-G o colorantes fluorescentes (figura 3). La constante de disociación para moléculas hidrófobas pequeñas varía entre 0,03 y 4 pM, dependiendo de la naturaleza de los colorantes y de los péptidos.
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Tabla 1: VEPEP-6/Caracterización de complejos de carga. ADNmc: ADN monocatenario; ADNbc: ADN bicatenario.
Figure imgf000012_0001
Tabla 2: VEPEP-6/Caracterización de complejos de carga. SHM: moléculas hidrófobas pequeñas (porfirina, FAM-G, AZT, doxorrubicina)
Se obtuvieron resultados similares para doxorrubicina, paclitaxel y daunomicina.
Ejemplo 2.3: Los péptidos VEPEP-6 forman nanopartículas estables con sus diferentes cargas
El tamaño de las partículas se monitorizó mediante dispersión dinámica de la luz. La relación molar óptima de péptido VEPEP-6/carga varía entre 1/10 y 1/30 (figura 4). El tamaño de las partículas es de aproximadamente 100 a 200 nanómetros de diámetro.
La formación del complejo también se analizó mediante dispersión dinámica de la luz, microscopía de barrido electrónico (figura 5a) y microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés) (figura 5b). El tamaño de las partículas fue de 100 a 300 nm cuando se midió con estas tecnologías.
Ejemplo 3: APLICACIONES de VEPEP-6 en CÉLULAS CULTIVADAS
Ejemplo 3.1: Suministro de ARNip mediado por VEPEP-6 en diferentes líneas celulares
Los péptidos VEPEP-6 se han aplicado para el suministro de diferentes ARNip en diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares adherentes, en suspensión y estimulantes como líneas celulares primarias (Jurkat, CEM-ss, HUVEC, THP1...) y líneas de células madre (mES, CCM.). Las líneas celulares (de la American Type Culture Collection (ATCC)) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con glutamina 2 mM, antibióticos al 1% (estreptomicina 10.000 pg/ml, penicilina, 10.000 Ul/ml) y suero bovino fetal (FCS) al 10 % (p/v), a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5 %. Se prepararon soluciones madre de partículas de VEPEP-6/ARNip formando complejos de ARNip 100 nM con péptidos VePeP-6 en una relación molar de 1/20 durante 30 min a 37 °C. Se obtuvieron concentraciones más bajas de transportador de VEPEP-6/ARNip (de 20 nM a 0,125 nM) mediante dilución en serie de los complejos patrón en PBS, con el fin de conservar la misma relación transportador de VEPEP-6/ARNip. Se cultivaron 150000 células sembradas en una placa de 35 mm el día anterior a la transfección, hasta un 60 % de confluencia y se cubrieron con 200 pl de complejos preformados, incubados durante 3-5 min, después se añadieron 400 pl de DMEM. Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, se añadió 1 ml de DMEM nuevo que contenía suero bovino fetal (FCS) al 16 % para alcanzar una concentración final de FCS del 10 %, sin eliminar el solapamiento de los complejos VEPEP-6/ARNip. Las células se devolvieron a la incubadora durante 24 horas. Los experimentos de dosis-respuesta realizados en diferentes células cultivadas revelaron que el suministro de ARNip (GAPDH) mediado por VEPEP-6 inducía una fuerte regulación negativa tanto de la proteína GAPDH como de los niveles de ARNm (tabla 3). En la mayoría de las líneas celulares, se obtuvo desactivación (KO, por sus siglas en inglés) superior al 70 % a nivel de proteína. La tabla 4 proporciona otra serie de líneas celulares en las que se ha demostrado que VEPEP-6 induce más del 60 % de desactivación de GAPDH.
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Tabla 3
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Tabla 4
Ejemplo 3.2: El suministro mediado por VEPEP6 de ARNip dirigido a ciclina B1 induce la detención en G2
Los experimentos de dosis-respuesta realizados en células cultivadas revelaron que el suministro de ARNip (Cyc-B1) mediado por VEPEP-6 inducía una respuesta biológica fuerte asociada con la regulación negativa de la proteína ciclina B1 y los niveles de ARNm (figura 6). Se determinaron los niveles de ARNm y proteína ciclina B1 12 y 24 horas después de la transducción, usando Quantigen (Panomics Inc.) y transferencia Western, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-Ciclina B1 (SC-245) y los anticuerpos policlonales de conejo anti-Cdk2 (SC-163) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. Los datos presentados son un promedio de 3 o 4 experimentos distintos.
Una concentración de ARNip de 5 nM fue suficiente para reducir los niveles de ciclina B1 en más del 85 % en células Hela y se estimó una CI50 de 1,7 ± 0,7 nM y 1,9 ± 0,3 nM para la regulación negativa de los niveles de proteína, y de 0,7 ± 0,1 nM y 0,5 ± 0,1 nM para los niveles de ARNm, para fibroblastos HS68 no transformados (figura 6) y células HeLa, respectivamente.
La reducción de los niveles de proteína ciclina B1 se asoció directamente con la acumulación de células con un contenido de 4N, consistente con la regulación negativa de la actividad de Cdkl-Ciclina B1, y se obtuvo de manera óptima con ARNip 2 nM y valores de CI50 estimados en 1,2 ± 0,2 nM y 1,7 ± 0,4 nM para células HeLa y HS68, respectivamente (figura 6C). Por el contrario, no se observó ningún efecto sobre los niveles de ciclina B1 y la progresión del ciclo celular con 200 nM de un ARNip no relacionado (ip-GAPDH), o de un desapareamiento de ARNip que alberga dos mutaciones (Cyc-B3) en forma de complejo con VEPEP-6 en una relación de 1/20, o con el transportador de VEPEP-6 solo (100 pM).
Ejemplo 3.3: El suministro de ARNip mediado por VEPEP6 no es tóxico.
Como se muestra en la figura 7A, se investigó la toxicidad de las partículas de VEPEP-6 en células HeLa mediante ensayo MTT y monitorizando el nivel de ARNm de ciclofilina medido mediante tecnología quantigen™ (Affymetrix). No se detectó toxicidad a niveles de hasta 10 nM, y solo se observó una toxicidad leve a la concentración máxima de 100 nM. VEPEP-6 y NANOPEP-6 (VEPEP6/VEPEP6/ARNip) no indujeron una respuesta inmunitaria in vivo. Debido a que la toxicidad ha sido una de las principales causas de fracaso de los sistemas de suministro de ARNip, se ha investigado el impacto de las partículas de VEPEP-6 y NANOPEP-6 en la inducción de citocinas inespecíficas 6 horas y 24 horas después de la inyección IV. La inducción de citocinas se monitorizó utilizando el KIT de citocinas multiplex 10 de invitrogen. Tal y como se muestra en la figura 7B, no se observó inducción de citocinas después de 6 h y 24 h, en contraste con la formulación de control basadas en lípidos o Lipopolisacárido (LPS).
Ejemplo 3.4: Suministro mediado por VEPEP-6 de moléculas hidrófobas pequeñas en diferentes líneas celulares
Los péptidos VEPEP-6 se han aplicado para el suministro de diferentes moléculas hidrófobas fluorescentes pequeñas y doxorrubicina en diferentes líneas celulares, incluidas líneas celulares primarias y líneas celulares estimulantes. Los péptidos VEPEP-6 también forman partículas estables con pequeñas moléculas aromáticas que incluyen doxorrubicina o colorantes fluorescentes (figura 8 y figura 9). La constante de disociación para moléculas hidrófobas pequeñas varía entre 0,1 y 4 pM, dependiendo de la naturaleza de los colorantes y de los péptidos.
Ejemplo 4: Formulaciones y aplicaciones de NANOPEP-6 para suministro in vivo
Las partículas NANOPEP-6 contienen un "núcleo peptídico" o "armazón central" correspondiente a la asociación del péptido VEPEP-6 o cualquier otro péptido que forme complejos no covalentes con su carga correspondiente, que está rodeado por péptidos VEPEP-6 "periféricos" adicionales que estabilizan la partícula y favorecen la asociación de la membrana celular.
La eficacia de NANOPEP-6 se controla principalmente por el tamaño y la carga de las partículas, que debe variar entre 100-200 nm y 10-+20 voltios, respectivamente. Se pueden utilizar varias combinaciones para el "núcleo" y el VEPEP-6 periférico se puede funcionalizar o no. La elección de los péptidos en el "núcleo" depende de la naturaleza de las cargas y puede ser, por ejemplo, VEPEP-6, CADY [12], MPG [11] o PEP-1 [8].
Las partículas de NANOPEP-6 se forman en un proceso de dos etapas (figura 10A): primero el "núcleo" en la relación molar transportador/carga de 5/1 o 10/1, después la "periferia" en una relación molar de VEVEP-6 periférico/carga de 20/1 hasta 80/1. La organización multicapa de la partícula permite su funcionalización orientada, que se elegirá dependiendo de la naturaleza de la diana/tejido celular y el modo de administración.
Se ha establecido un protocolo de tres etapas (figura 10B) cuando tiene lugar la funcionalización de partículas a través del ácido nitrilotriacético (NTA) enlazado al VEPEP-6. El grupo NTA es bien conocido por ser capaz de quelar el metal y de interactuar de manera fuerte con la proteína etiquetada con histidina. El recubrimiento de las partículas con VEPEP-6 funcionalizado con NTA permite la fijación de cualquier proteína que albergue una etiqueta de histidina a la partícula. Esa estrategia ofrece la principal ventaja de tener partículas de 2 capas comunes "NANOPEP-6-HIS" que pueden asociarse a cualquier proteína marcada con His. La estrategia NANOPEP-6-HIS se ha aplicado para recubrir las partículas con un anticuerpo específico dirigido al antígeno de la superficie celular (EGF, HER-2 o MUC1) para el suministro dirigido de ARNip y péptido (véase el ejemplo 5.2.1 para el suministro de ARNip y el ejemplo 5.2.2 para el suministro de péptidos utilizando anticuerpos de MUC1 y HER2). La estrategia NANOPEPHIS-6 se puede aplicar universalmente a cualquier péptido y proteína que albergue un grupo de histidina en su secuencia.
Ejemplo 5: Aplicaciones de la estrategia NANOPEP-6
La estrategia NANOPEP-6 se ha aplicado para suministro in vivo y direccionamiento de diferentes cargas y diferentes nanopartículas basadas en péptidos. A continuación se indican cuatro ejemplos diferentes de aplicaciones de NANOPEP-6 y NANOPEPHIS-6.
Ejemplo 5.1: Suministro dirigido in vivo mediado por NANOPEP-6 de ARNip después de una inyección intravenosa sistémica o una inyección tópica
Se ha evaluado el potencial terapéutico de la tecnología NANOPEP-6 in vivo con ARNip dirigido a GAPDH y ciclina B1, una ciclina mitótica no redundante. La potencia de esta tecnología se ha validado in vivo con ARNip dirigido a ciclina B1, una ciclina mitótica no redundante y una diana terapéutica establecida en varios cánceres, que se forma junto con la cinasa Cdk1, el "factor promotor de la mitosis" necesario para la entrada y progresión a través de la mitosis. Se inocularon subcutáneamente ratones lampiños atímicos hembra (6-8 semanas de edad) en el costado con 1 x 106 células PC3 (cáncer de próstata), A549 (cáncer de pulmón) o SCK-3-HEK2 (cáncer de ovario) en 100 pl de PBS. Dos 0 tres semanas después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron mediante inyección intratumoral o intravenosa, cada 3 días, con una solución de 0,1 ml de bien ARNip Cyc-B1 libre (50 o 100 pg), ARNip Cyc-B3 de control o ARNip Cyc-B1 (1, 5, 10 pg) en forma de complejo dentro de partículas NANOPEP-6. El armazón del "núcleo" de las partículas se formó usando péptido VEPEP-6 en una relación molar de 10/1 o 20/1 con un ARNip dirigido a ciclina B1. Las soluciones madre de ARNip están en Tris 50 mM, tampón EDTA 0,5 mM o en agua sin RNasa. Los péptidos VEPEP-6 se solubilizaron en agua y la solución madre de péptido se sometió a sonicación durante 10 minutos en un baño de agua antes de la formación del complejo. A continuación, se formaron complejos VEPEP-6/ARNip añadiendo ARNip en la solución de péptidos e incubando a 37 °C durante 20­ 30 minutos para permitir que se formaran los complejos de péptido transportador/ARNip. Las partículas de NANOPEP-6 contienen una "armazón central" de VEPEP-6/ARNip rodeado de VEPEP-6 o Chol-VEPEP-6 adicional en una relación molar de 1/20. Las formulaciones que contenían Chol-VEPEP-6 al 15 % se prepararon de manera escalonada formando primero un precomplejo de VEPEP-6/ARNip en una relación molar de 20/1, seguido de la adición de Chol-VEPEP-6 para aumentar la relación de transportador/ARNip a 40/1.
El diámetro tumoral se midió en dos direcciones a intervalos regulares usando un calibre digital y el volumen tumoral se calculó como largo x ancho x alto x 0,52. Las curvas muestran el valor medio del tamaño tumoral en una cohorte de seis animales y no se observó muerte de los animales ni ningún signo de toxicidad. Los experimentos se realizaron según las regulaciones nacionales y se aprobaron por el comité ético de experimentación animal local. La significación estadística de los resultados se calculó mediante la prueba t de Student y se consideró estadísticamente significativa una p < 0,05. Las soluciones madre de partículas se realizan en agua y son estables durante al menos tres semanas a 4 °C. Las partículas se pueden liofilizar para un almacenamiento prolongado; en ese caso, se añade del 5 al 20 % de glucosa a la solución de partículas antes de la liofilización para estabilizar las partículas durante el proceso. Antes de la administración, las partículas se diluyen en condiciones fisiológicas, en presencia de: NaCl al 0,9 % y glucosa del 5 al 20 %.
Los inventores demostraron que la combinación de ARNip de ciclina B1 con NANOPEP-6 previene el crecimiento de tumores de pulmón, de ovario y de próstata en modelos de xenoinjerto en ratones, tras la inyección cada tres días de complejos NANOPEP-6/ARNip (figura 11).
Suministro de ARNip de Ciclina B1 con NANOPEP-6 tras inyección tópica
El potencial de NANOPEP-6 (VEPEP6/VEPEP6) para suministro ARNip de ciclina B1 in vivo se evaluó por primera vez en ratones con xenoinjerto de células de carcinoma de próstata humano PC3 (fig. 11A). Se evaluó el efecto de la administración intratumoral local de partículas NANOPEP-6 /ARNip (relación molar 20/1) sobre el crecimiento de tumores subcutáneos establecidos. El día 50, los tamaños de los tumores en la cohorte de control, inyectados con PBS aumentó en aproximadamente 3,5 veces. Se observó una reducción del crecimiento tumoral en un 75 % usando 1 pg (0,05 mg/kg) de ARNip de ciclina B1 en NANOPEP-6/ARNip y el crecimiento tumoral se evitó por completo con 5 pg (0,25 mg/kg) de ARNip de ciclina B1 en NANOPEP-6/ARNip (figura 11A). El día 48, se validó que la inhibición del crecimiento tumoral mediada por ARNip de Cyc-B1 estaba directamente asociada con una disminución en el nivel de ARNm de ciclina B1. Como control, los inventores demostraron que la administración de 100 pg (intratumoral o intravenosa) de ARNip desnudo o transportador de NANOPEP-6 solo no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral. Por otra parte, la inhibición del crecimiento tumoral fue específica de secuencia de ARNip, ya que un ARNip de ciclina B1 que albergaba dos mutaciones (Cyc-B3) en forma de complejo con NANOPEP-6 e inyectadas en ratones a 0,5 mg/kg no pudo inhibir el crecimiento tumoral.
Suministro de ARNip de Ciclina B1 con NANOPEP-6 tras inyección sistémica
Las partículas de NANOPEP-6 se utilizaron para la administración intravenosa sistémica en dos modelos de tumor xenoinjertado en ratones: células de carcinoma de próstata humano (PC3) y de cáncer de ovario (HT29) inyectadas por vía subcutánea en los flancos de ratones lampiños NCR. Las partículas de NANOPEP-6 /ARNip se obtuvieron paso a paso mediante la formación de complejos de moléculas de ARNip con VEPEP-6 en una relación molar de 10/1, seguido de recubrimiento de partículas con una segunda capa de VEPEP-6 en una relación de 10/1. Se inyectaron por vía intravenosa cinco microgramos (0,25 mg/kg) y 10 pg (0,5 mg/kg) de ARNip de Cyc B1 en partículas NANOPEP-6 cada tres días en ratones que portaban tumores de PC3 o HT29 xenoinjertados. Se observó una reducción significativa en el tamaño del tumor PC3 el día 50, con 60 % y 92 % de inhibición con 5 pg y 10 pg de ARNip, respectivamente (figura 11B). La reducción del tamaño tumoral se correlacionó directamente con la reducción de los niveles de proteína ciclina B1, según lo evaluado por transferencia Western, en un 60 % y un 80 % en animales tratados con 5 |jg y 10 |jg de ARNip en forma de complejo con NANOPEP-6, respectivamente.
Se observó una reducción significativa en el tamaño del tumor HT29 el día 50, con 35 % y 70 % de inhibición con 5 jg y 10 jg de ARNip, respectivamente (figura 11C). Estos resultados junto con la falta de actividad antitumoral del NANOPEP-6/desapareamiento de ARNip (10 jg ) o del transportador de NANOPEP-6 solo, subraya la solidez y especificidad de la respuesta biológica asociada con el suministro sistémico de ARNip de ciclina B1. La estabilidad de las formulaciones de transportadores de fármacos. in vivo y en la circulación sanguínea es un tema importante para la administración sistémica de agentes terapéuticos. Para mejorar la biodisponibilidad y estabilidad de las partículas NANOPEP-6/ARNip (VEPEP-6 que recubre un armazón central de VEPEP6/ARNip), haciéndolas, de este modo, más adecuados para la administración sistémica, la capa superficial de partículas de NANOPEP-6 se funcionalizó con un resto de colesterol en el extremo N de VEPEP-6 (Chol-VEPEP6), mediante la activación del grupo amino de la beta alanina aminoterminal. Las partículas de NANOPEP-6/ARNip funcionalizadas con colesterol se obtuvieron paso a paso mediante la formación de complejos de moléculas de VEPEP-6 con ARNip en una relación molar de 20/1, seguida de recubrimiento de partículas con una segunda capa de Chol-VEPEP6 en una relación de 1/10. Para analizar si el aumento en la distribución de ARNip asociado a partículas funcionalizadas de NANOPEP-6 afecta directamente su potencia para inhibir el crecimiento tumoral, las partículas se utilizaron para la administración intravenosa sistémica en un modelo de tumor HT29 xenoinjertado en ratones. Se inyectaron por vía intravenosa dos jg (0,25 mg/kg) de ARNip Cyc-B1 en forma de complejo con chol-NANOPEP-6 en una relación de 1/30 cada tres días en ratones que portaban un tumor HT29 xenoinjertado y se observó una reducción significativa del tamaño del tumor HT29 del 85 % el día 50 (figura 11B), que es 5 veces más potente que la nanopartícula NANOPEP-6 no funcionalizada, lo que sugiere que el colesterol aumenta la biodistribución del ARNip en el tumor al mantener el ARNip en el plasma.
Ejemplo 5.2: Suministro dirigido in vivo mediado por NANOPEPHIS en el tumor después de una inyección intravenosa sistémica.
5.2.1 Suministro dirigido in vivo mediado por NANOPEPHIS de ARNip en el tumor después de una inyección intravenosa sistémica
Las partículas del armazón del núcleo de VEPEP-6/ARNip se recubrieron con péptido VEPEP-6 funcionalizado con NTA y después se incubaron con anticuerpos de MUC1 o HEK-2 etiquetados con his, conocidos por dirigirse a células tumorales. El exceso de anticuerpos se eliminó mediante filtración antes de la inyección IV in vivo. Las partículas NANOPEP-6 -HIS/ARNip se administraron mediante inyección IV sistémica en modelos de carcinoma de próstata (PC3) y pulmón (A549) humanos xenoinjertados en ratones. Se inyectaron células PC3 y A549 por vía subcutánea en los flancos de ratones lampiños NCR. Se inyectó por vía intravenosa 1 jg (0,05 mg/kg) y 5 jg (0,25 mg/kg) de ARNip Cyc-B1 en forma de complejo con MUC-NANOPEP-6-HIS/ARNip o HEK-NANOPEP-6-HIS/ARNip en una relación molar de 40/1 cada tres días en ratones portadores de tumor PC3 o A549 xenoinjertados. El nivel de liberación de ARNip en el tumor se determinó mediante obtención de imágenes de fluorescencia in vivo usando ARNip marcado con fluorescencia con Alexa-700. Los experimentos de obtención de imágenes de fluorescencia en vivo demostraron que la presencia de anticuerpos de MUC o HER-2 aumentaba significativamente el nivel de ARNip en el tumor (de 5 a 10 veces dependiendo del anticuerpo y los tumores (véanse la Fig. 12 y tabla 5).
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Tabla 5: Suministro de ARNip marcado con fluorescencia mediado por NANOPEP-6 en tumores de PC3 y A549 xenoinjertados en ratones.
Se observó una reducción significativa en el tamaño de los tumores de PC3 o A549 el día 30, con 55 % y 95 % de inhibición con 1 jg y 5 jg de ARNip, respectivamente (figura 12b). La reducción del tamaño tumoral es al menos 5 veces más eficaz con MUC-NANOPEPHIS/ARNip o HEK-NANOPEPHIS/ARNip, que con el NANOPEP-6/ARNip.
Ejemplo 5.2.2: Suministro de péptido dirigido in vivo mediado por NANOPEPHIS en el tumor después de una inyección intravenosa sistémica.
Las partículas del armazón central de PEP1/péptido C4 (PC4: un péptido de 12 meros que bloquea la proliferación de células cancerosas: ref 13) se recubrieron con péptido VEPEP-6 funcionalizado con NTA y después se incubaron con anticuerpos de MUC1 o HEK-2 etiquetados con his. El exceso de anticuerpos se eliminó mediante filtración antes de la inyección IV in vivo. Las partículas NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4 se administraron mediante inyección IV sistémica en modelos de carcinoma de próstata (PC3) y pulmón (A549) humanos xenoinjertados en ratones. Se inyectaron células PC3 y A549 por vía subcutánea en los flancos de ratones lampiños NCR. Los péptidos VEPEP-6 funcionalizados con NTA formaron complejos con 10 jg de partículas de PEP1/PC4 en una relación molar de 20/1 VEPEP-6/PC4 y después con anticuerpos etiquetados con HIS para formar partículas MUC-NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4 o HEK-NANOPEP-6-HIS/PEP1/PC4, que se inyectaron por vía intravenosa en ratones portadores de tumor de PC3 o A549 xenoinjertados. El nivel de liberación de PC4 en el tumor se determinó mediante obtención de imágenes de fluorescencia in vivo usando un PC4 marcado con CY5. Los experimentos de obtención de imágenes de fluorescencia en vivo demostraron que la presencia de anticuerpos de MUC o HER-2 aumentaba significativamente el nivel de PC4 en los tumores (de 15 a 40 veces dependiendo del anticuerpo y los tumores (véanse la Fig. 12c y tabla 6).
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Tabla 6: Suministro mediado por NANOPEP-6 de péptido marcado con fluorescencia en tumores de PC3 y A549 xenoinjertados en ratones.
Ejemplo 5.3: Suministro in vivo mediado por NANOPEP-6 de nanopartículas basadas en péptidos para ARNip y péptidos terapéuticos y direccionamiento pulmonar.
Los péptidos VEPEP-6 se utilizaron para promover el direccionamiento pulmonar de nanopartículas basadas en péptidos. El péptido VEPEP-6 se añadió como un péptido de recubrimiento en "partículas del armazón central" de VEPEP-6/ARNip, CADY/ARNip y PEP-1/péptido (figuras 13b y 13c). Las cargas utilizadas fueron bien un ARNip marcado con fluorescencia o un péptido, o un ARNip dirigido al gen constitutivo GAPDH. Las partículas se formaron como se indica en la fig. 10. En todos los casos, se inyectaron por vía intravenosa 5 pg de cargas en forma de complejos con transportador peptídico. A continuación, se monitorizó la biodistribución in vivo de las cargas utilizando obtención de imágenes de fluorescencia animales vivos y monitorizando el nivel de ARNm del gen de mantenimiento 48 horas después de la inyección. La presencia de recubrimiento de VEPEP-6 indujo un aumento importante del suministro de cargas en el pulmón (fig. 13a y 13b). La monitorización de cargas marcadas con fluorescencia mostró un aumento de 5 a 10 veces en el pulmón, en comparación con el experimento de control en ausencia de recubrimiento de VEPEP-6 de la partícula. La presencia de recubrimiento de VEPEP-6 también aumentó en un factor de 3 la desactivación de GAPDH en el pulmón (fig. 13c). En conjunto, estos resultados demostraron que el péptido VEPEP-6 mejora significativamente el direccionamiento pulmonar de nanopartículas basadas en péptidos.
Ejemplo 5.4: Suministro dirigido in vivo mediado por CPP de complejos VEPEP-6/ARNip
Se utilizaron péptidos de penetración celular MPG y CADY para promover diferentes direccionamientos in vivo de nanopartículas de VEPEP-6/ARNip. Se formaron las "partículas de armazón central" VEPEP-6/ARNip en una relación molar de 20/1 y después se añadieron péptidos MPG o CADY como péptido de recubrimiento en una relación molar de 20/1, como se indica en la figura 10. En ambos casos, se inyectaron por vía intravenosa 5 pg de ARNip dirigido al gen constitutivo GAPDH en forma de complejo con el transportador peptídico. A continuación, se monitorizó la biodistribución in vivo de los ARNip utilizando la obtención de imágenes de fluorescencia de animales vivos y monitorizando el nivel de ARNm del gen constitutivo 48 horas después de la inyección. Se evaluó la biodistribución del ARNip marcado con fluorescencia in vivo en ratones Balb6, 5 horas después de una sola administración de 5 pg de ARNip en partículas MPG/VEPEP-6 o CADY/VEPEP-6. La presencia de recubrimiento de MPG o CADY indujo un aumento importante del suministro de ARNip en la mayoría de los tejidos. MPG se dirige específicamente al cerebro, páncreas, ganglios linfáticos y CADY al pulmón, músculo, corazón e intestino (fig. 14a). La presencia de recubrimiento de CADY o MPG también promueve una marcada desactivación de GAPDH en los tejidos seleccionados (fig. 14b). En conjunto, estos resultados demostraron que el armazón central de VEPEP-6/ARNip puede recubrirse por varios CPP diferentes para mejorar el direccionamiento a tejidos in vivo de nanopartículas basadas en péptidos.
Ejemplo 5.5: Aplicación tópica mediada por NANOPEP-6 de nanopartículas basadas en péptidos: administración dérmica/intranasal e intrarrectal.
Las partículas basadas en NANOPEP-6 (VEPEP-6/VEPEP-6) se han evaluado utilizando diferentes vías de administración, incluida la administración intravenosa, intrarrectal, intranasal y transdérmica sistémicas. Un ARNip marcado con fluorescencia con Alexa700 o un ARNip dirigido a GAPDH se asoció a VEPEP-6 como un "armazón central", rodeado por moléculas VEPEP-6. Se evaluó la biodistribución del ARNip marcado con fluorescencia in vivo en ratones Balb6, 5 horas después de una única administración de 10 pg de ARNip en partículas de NANOPEP-6. La desactivación de GAPDH asociada a ARNip se evaluó después de 48 horas en diferentes tejidos, monitorizando el nivel de ARNm de GAPDH usando tecnología Quantigen (Panomics inc). Las administraciones intravenosa e intrarrectal del complejo NANOPEP-6/ARNip permitieron el suministro del ARNip en la mayoría de los tejidos analizados, excepto cerebro y ganglios (Fig. 15a). Estos resultados de fluorescencia se correlacionan directamente con una desactivación del ARNm de GAPDH, demostrando que NANOPEP-6 suministra una forma activa del ARNip en todos los tejidos y puede aplicarse de manera eficaz mediante administración tópica (Fig. 15b). La administración intranasal e intratraqueal permitió el suministro de ARNip activo principalmente en el pulmón, hígado y riñón y en el cerebro, con una desactivación significativa del gen GAPDH en estos tejidos. Por el contrario, el suministro transdérmico se limita al suministro del ARNip en y a través de la piel y los músculos, pero no en los otros tejidos (Fig.
Ejemplo 6: Formulaciones optimizadas de complejos VEPEP-6/ARNip
La figura 16 muestra un protocolo para la obtención de una formulación fresca o liofilizada de complejos VEPEP-6/ARNip, que muestran una excelente estabilidad de almacenamiento a largo plazo. El lote más grande producido utiliza 10 mg de ARNip. Antes de la liofilización, se ha añadido un 5 % de glucosa y/o sacarosa a la solución que comprende los complejos VEPEP-6/ARNip (se puede añadir hasta un 20 % de glucosa/fructosa, en donde el porcentaje de azúcar se calcula de la siguiente manera: x % de azúcar = x g de azúcar añadido en 1 l de solución que comprende los complejos o nanopartículas, antes de la liofilización).
El proceso ilustrado en la figura 16 no comprende ninguna etapa de purificación/separación, pero dicha etapa podría añadirse posiblemente si fuera necesario en una escala de producción mayor.
La estabilidad de los complejos VEPEP-6/ARNip se evaluó mediante análisis de cromatografía HPLC de exclusión por tamaño.
Las muestras de VEPEP-6/ARNip se incubaron en una relación molar de 20:1 durante 30 min a 25 °C, después se filtró usando un filtro de 0,2 pm y se analizó mediante cromatografía HPLC de exclusión por tamaño usando s Ec 3000 después de 1, 5, 24 y 96 horas (figura 17, panel A). VEPEP-6/ARNip liofilizados en 5 % de glucosa, se analizaron después de 24 y 96 h (figura 17, panel B). Se estimó el porcentaje de péptido libre. Esto demostró que en las condiciones optimizadas no se detecta ningún péptido libre después de 1 hora y solamente el 7 % después de 24 horas. En cualquier caso, no se ha detectado ARNip libre, medido por tecnología quantigen (figura 17, Panel C) El nivel de ARNip dentro de la partícula se midió después de la disociación de la partícula con acetonitrilo (ACN) al 20 %. Los ensayos QuantiGene (Affymetrix) son ensayos que permiten la cuantificación con sensibilidad de ARN de copia única a resolución de una sola célula en células o tejidos en formatos de ensayo singleplex y multiplex. Los resultados mostraron que los complejos VEPEP-6/ARNip son altamente estables en tampón que contiene azúcar.
Otros experimentos de estabilidad demostraron que los complejos VEPEP-6/ARNip liofilizados son muy estables tras el almacenamiento a 4 °C, ya que después de 5 meses, el producto conservó más del 85 % de su actividad original (medida como silenciamiento de GAPDH en células Hela).
Los mismos experimentos se han realizado con nanopartículas de VEPEP-6/VEPEP-6/ARNip, y mostraron la misma estabilidad que la observada para los complejos.
Ejemplo 7: NANOPEP-6 promueve el suministro de ARNip múltiple
Se ha evaluado el potencial terapéutico de la tecnología NANOPEP-6 in vivo con ARNip dirigido a CDC20 y ciclina B1, una ciclina mitótica no redundante. Se inocularon por vía subcutánea ratones lampiños atímicos hembra (6-8 semanas de edad) en el costado con 1 x 106 células PAN-1 (cáncer de páncreas) en 100 pl de PBS. Cinco días después de la implantación tumoral, los animales se trataron mediante inyección intravenosa, cada 4 días, con una solución de 0,1 ml de tampón fosfato, ARNip Cyc-B1/CDC20 libre (50 pg), ARNip de Cyc-B1 o de CDC20 (2 pg) y ambos ARNip formaron complejos dentro de partículas de NANOPEP-6. El armazón del "núcleo" de las partículas se formó usando péptido VEPEP-6 en una relación molar de 20/1 con un ARNip dirigido a ciclina B1 o CDC20. Las soluciones madre de ARNip están en Tris 50 mM, tampón EDTA 0,5 mM o en agua sin RNasa. Los péptidos VEPEP-6 se solubilizaron en agua y la solución madre de péptido se sometió a sonicación durante 10 minutos en un baño de agua antes de la formación del complejo. A continuación, se formaron complejos VEPEP-6/ARNip añadiendo ARNip en la solución de péptidos e incubando a 37 °C durante 20-30 minutos para permitir que se formaran los complejos de péptido transportador/ARNip. Las partículas de NANOPEP-6 contienen una "armazón central" de VEPEP-6/ARNip rodeado de VEPEP-6 adicional en una relación molar de 1/20. Los experimentos se realizaron según las regulaciones nacionales y se aprobaron por el comité ético de experimentación animal local. La significación estadística de los resultados se calculó mediante la prueba t de Student y se consideró estadísticamente significativa una p < 0,05. Las soluciones madre de partículas se realizan en agua y son estables durante al menos tres semanas a 4 °C. Las partículas se pueden liofilizar para un almacenamiento prolongado; en ese caso, se añade del 5 al 20 % de glucosa a la solución de partículas antes de la liofilización para estabilizar las partículas durante el proceso. Antes de la administración, las partículas se diluyen en condiciones fisiológicas, en presencia de: NaCl al 0,9 % y glucosa del 5 al 20 %.
Los resultados, ilustrados en la figura 18, muestran que VEPEP-6 mejora la eficacia del ARNip mediante la administración IV sistémica, y que la tecnología NANOPEP-6 permite el suministro de varios ARNip mezclados entre sí sin inducir ninguna toxicidad o efecto secundario.
Ejemplo 8: NANOPEP-6 promueve el suministro de miARN
Los microARN (miARN) se han implicado en la iniciación y progresión del cáncer a través de su capacidad para afectar la expresión de genes y proteínas que regulan la proliferación celular y/o la muerte celular. Se encontró que la transcripción de los tres miembros de la familia de miARN miR-34 estaba regulada directamente por p53 [14]. La restauración de miR-34 puede ser muy prometedora como una nueva terapia molecular para varios cánceres, tales como cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioblastoma y cáncer de piel, etc. Por ejemplo, en cáncer de páncreas humano con pérdida de p53-miR34, la restauración de miR-34 puede actuar a través de la inhibición de las células madre del cáncer de páncreas [15].
La capacidad de la tecnología NANOPEP-6 se evaluó utilizando el microARN mir-34a de secuencia uggcagugugguuagcugguug (SEQ ID NO: 26). La constante de disociación del péptido para el miARN-34 monocatenario se determinó mediante medición de fluorescencia en estado estacionario. Se titularon concentraciones fijas de mi34 marcado con CY5, aumentando la concentración de péptido y se monitorizaron los cambios de fluorescencia a 550 nm tras la excitación a 505 nm (figura 19, panel A). VEPEP-6 interactúa de manera fuerte con miARN monocatenario (Kd: 25 nM).
Las propiedades antiproliferativas de miR34 se han evaluado en células de cáncer de mama MCF7. Las líneas celulares (de la American Type Culture Collection (ATCC)) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con glutamina 2 mM, antibióticos al 1% (estreptomicina 10.000 pg/ml, penicilina, 10.000 Ul/ml) y suero bovino fetal (FCS) al 10 % (p/v), a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5 %. Se prepararon soluciones madre de partículas de VEPEP-6a/miRNA34 formando complejos de miRNA34 1 pM con péptidos VEPEP-6a en una relación molar de 1/20 durante 30 min a 37 °C. Se obtuvieron concentraciones más bajas de transportador de VEPEP-6a/miARN (de 500 nM a 1 nM) mediante diluciones en serie de los complejos patrón en PBS, con el fin de conservar la misma relación transportador de VEPEP-6a/miARN. Se cultivaron 150 000 células sembradas en una placa de 35 mm el día anterior a la transfección, hasta un 40 % de confluencia y se cubrieron con 200 pl de complejos preformados, incubados durante 3-5 min, después se añadió 1 ml de DMEM nuevo que contenía suero bovino fetal (FCS) al 16 % y las células se devolvieron a la incubadora durante 24 horas. Se midió el crecimiento celular después de 4 días. Se han evaluado las respuestas a las dosis de miR-34 libre (barras grises) y mediado por VEPEP-6 (barras blancas). VEPEP-6 mejora de manera fuerte las propiedades antiproliferativas de miR34 con un valor de CI50 de 85 nM (figura 19, panel B).
Ejemplo 9: VEPEP-6 grapado
Ejemplo 9.1. El grapado del transportador de VEPEP-6 aumenta la estabilidad de los complejos VEPEP-6/cargas
9.1.1. Química
En un contexto completamente diferente al de los CPP, se han desarrollado péptidos grapados en hélice alfa de hidrocarburos y se ha informado que son más estables y capaces de entrar en la célula [16]. La a-hélice presenta 3.6 restos por vuelta completa, que coloca las cadenas laterales i, i+4, i+7 e i+11 en la misma cara de la estructura plegada. La estrategia clásica para estabilizar la conformación a-helicoidal en los péptidos emplea enlaces covalentes entre los grupos de las cadenas laterales i y i+4 o i e i+7 (figura 20A). Los péptidos VEPEP-6 se grapan en i, i+4 e i, i+7 utilizando el método de puente de hidrocarburos descrito recientemente por Verdine y Hilinski [17] y por Youg-Woo kim et al.
[18]. El i, i+4 es la estructura óptima de péptidos grapados estabilizados. Las grapas se sintetizan mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés), usando aminoácidos con grupos protectores de cadena lateral lábiles a ácidos y un grupo protector fluorenilmetoxicarbonilo lábil a bases en la amina de la cadena principal (figura 20B).
El ST-VEPEP-6aa, ST-VEPEP-6ad, ST-VEPEP-6ba, ST-VEPEP-6bd y ST-VEPEP-6c se citan a continuación solamente como ilustración.
Secuencias:
- ST-VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 27)
- ST-VEPEP-6aa Ac-X1LFLARWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 28)
- ST-VEPEP-6ab Ac-X1LFRALWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 29)
- ST-VEPEP-6ad Ac-X1LFLARWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 30)
- ST-VEPEP-6b: Ac-X1LFRALWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 31)
- ST-VEPEP-6ba Ac-X1LFLARWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 32)
- ST-VEPEP-6bb Ac-X1LFRALWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 33)
- ST-VEPEP-6bd Ac-X1LFLARWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 34)
- ST-VEPEP-6c: Ac-X1LFARsLWRLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 35)
9.1.2. E l grapado aumenta la interacción con las cargas
Se evaluó el impacto de la estabilización de la estructura helicoidal de los péptidos VEPEP-6 sobre su capacidad para interactuar con cargas de ácido nucleico. Debido a que la unión de cargas a péptidos de penetración celular implica una determinada flexibilidad del CPP, la mayor rigidez del CPP grapado podría provocar una disminución de la afinidad por la carga.
La unión de ácido nucleico a ST-VEPEP-6aa se monitorizó mediante espectroscopia de fluorescencia tanto intrínseca de TRP como de ácidos nucleicos marcados con fluorescencia. Las constantes de disociación se calcularon a partir del ajuste de datos. Los ácidos nucleicos utilizados fueron ARNip bicatenario (19/19 o 25/25) y ADN monocatenario (36 meros).
La figura 21 muestra que ST-VEPEP-6aa interacciona de manera fuerte con ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios con una constante de disociación de 4 y 7 nM, 2 veces menor que la obtenida para el péptido no modificado. Se observó la misma eficacia con las otras secuencias de ST-VEPEP.
A continuación, se analizó la disociación de los complejos preformados de ARNip/ST-VEPEP-6 en presencia de heparán sulfato. El heparán sulfato constituye uno de los componentes principales del proteoglicano. La cinética de la disociación de complejos se indica en la figura 22, utilizando ARNip marcado con FITC asociado a ST-VEPEP-6 o VEPEP-6. La disociación se desencadenó añadiendo concentraciones crecientes de heparán sulfato. Los datos demostraron que ST-VEPEP-/ARNip y VEPEP-6/ARNip se disocian con una concentración de 560 pM y 120 pM respectivamente, sugiriendo que los complejos formados con péptidos grapados son 5 veces más estables.
Ejemplo 9.2. El grapado aumentó la potencialidad in cellule e in vivo con cargas
9.2.1. Suministro mediado por ST-VEPEP-6 de ARNip en diferentes líneas celulares
Los péptidos ST-VEPEP-6 se han utilizado para el suministro de ARNip en tres líneas celulares diferentes, incluyendo líneas celulares adherentes (Hela, HEK), en suspensión y estimulantes tales como líneas celulares primarias (Jurkat) y células madre (mES). Se prepararon soluciones madre de partículas de ST-VEPEP-6/ARNip formando complejos de ARNip 100 nM con péptidos ST-VEPEP-6 en una relación molar de 1/20 durante 30 min a 37 °C. Se obtuvieron concentraciones más bajas de transportador de ST-VEPEP-6/ARNip (de 20 nM a 0,125 nM) mediante dilución en serie de los complejos patrón en PBS, con el fin de conservar la misma relación transportador de ST-VEPEP-6/ARNip. Los experimentos de dosis-respuesta realizados en diferentes células cultivadas revelaron que el suministro de ARNip (GAPDH) mediado por ST-VEPEP-6 inducía una fuerte regulación negativa (CE50) del nivel de ARNm de GAPd H medido por tecnología quantigen (tabla 7). ST-VEPEP-6 son entre 2 y 6 veces más eficaces que los péptidos no modificados y muestran una toxicidad 2 veces menor (CE50) medida por ensayos MTT.
Figure imgf000020_0001
Tabla 7
9.2.2. Suministro mediado por ST-VEPEP-6 de ARNip in vivo
Se evaluó el suministro de Ciclina B1/ARNip por ST-VEPEP-6 sobre la inyección sistémica.
Se inocularon por vía subcutánea ratones lampiños atímicos hembra en el costado con 1 x 106 HT-29 (tumor pulmón).
20 días después de la implantación tumoral, cuando el tamaño tumoral alcanzó unos 100 mm3, los animales se trataron mediante inyecciones intravenosas, cada 4 días, con una solución salina tampón (PBS), ARNip libre, ARNip de Cyc-B1 a 3 pg y 5 pg en forma de complejo con ST-VEPEP-6 o VEPEP-6 en una relación molar de 1/20 (figura 23). Las curvas muestran el valor medio del tamaño tumoral en una cohorte de tres animales y no se observó muerte de los animales ni ningún signo de toxicidad. Los datos demostraron que el grapado del péptido mejora la respuesta in vivo en un factor de 2 y permite el uso de concentraciones más bajas de ARNip.
REFERENCIAS
[1] DJ. Glover, HJ. Lipps, DA. Jans, Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet.
6 (2005) 299-310
[2] KA. Whitehead, R. Langer, DG. Anderson, Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2009) 129-138.
[3] Ü Langel, Handbook of Cell-Penetrating Peptides: (Eds.: U. Langel) CRC Taylor y Francis, Boca Raton (2007).
[4] F. Heitz, MC. Morris, G. Divita, Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics; British Journal of Pharmacology 157(2009) 195-206.
[5] S. Deshayes, MC Morris, F. Heitz, G. Divita. Delivery of proteins and nucleic acids using a non-covalent peptidebased strategy. Adv Drug Deliv Rev. 60 (2008) 537-547.
[6] S. Deshayes, MC. Morris, G. Divita, F. Heitz Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics, Cell Mol Life Sci. 62 (2005) 1839-1849.
[7] MC. Morris, P. Vidal, L. Chaloin, F. Heitz, G Divita A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 2730-2736.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido de penetración celular caracterizado por que comprende una secuencia de aminoácidos X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 36), en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L, W, C o I, X4 es S, A, N o T, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es K o R, X8 es A o ninguno, y X9 es R o S.
2. El péptido de penetración celular de la reivindicación 1, caracterizado por que comprende una secuencia de aminoácidos X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 13), en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L, W, C o I, X4 es S, A, N o T, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es K o R, y X8 es A o ninguno.
3. El péptido de penetración celular de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado por que comprende una secuencia de aminoácidos de X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6KX7 (SEQ ID NO: 14), en donde X1 es beta-A o S, X2 es F o W, X3 es L o W, X4 es S, A o N, X5 es L o W, X6 es W o R, X7 es A o ninguno.
4. El péptido de penetración celular de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en
- X1LFRALWRLLRX4LWRLLWX7 (SEQ ID NO: 7)
- X1LWRALWRLWRX4LWRLLWX7A (SEQ ID NO: 8)
- X1LWRALWRLX3RX4LWRLWRX7A (SEQ ID NO: 9)
- X1LWRALWRLWRX4LWRLWRX7A (SEQ ID NO: 10)
- X1LWRALWRLX4RALWRLLWX7A (SEQ ID NO: 11) y
- X1LWRALWRLX3RNLWRLLWX7A (SEQ ID NO: 12),
en donde X1 es beta-A o S, X4 es S o T, X7 es K o R, X3 es L, C o I en las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 12 y X3 es L o I en la secuencia de SEQ ID NO: 11.
5. El péptido de penetración celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además, enlazadas covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de aminoácidos, una o varias entidades químicas seleccionadas en el grupo que consiste en un acetilo, un ácido graso, un colesterol, un polietilenglicol, una señal de localización nuclear, señal de exportación nuclear, un anticuerpo, un polisacárido y una molécula de direccionamiento.
6. El péptido de penetración celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además, enlazado covalentemente al extremo carboxiterminal de dicha secuencia de aminoácidos, uno o varios grupos seleccionados en el grupo que consiste en una cisteamida, una cisteína, un tiol, una amida, un ácido nitrilotriacético opcionalmente sustituido, un carboxilo, un C1-C6 alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido, una amina primaria o secundaria, un derivado osídico, un lípido, un fosfolípido, un ácido graso, un colesterol, un polietilenglicol, una señal de localización nuclear, señal de exportación nuclear, un anticuerpo, un polisacárido y una molécula de direccionamiento.
7. El péptido de penetración celular de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que se elige en el grupo que consiste en:
- VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRLLRSLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 1)
- VEPEP-6b: Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 2)
- VEPEP-6c: Ac-X1LWRALWRLLRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID NO: 3)
- VEPEP-6d: Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLWRKA-cisteamida (SEQ ID NO: 4)
- VEPEP-6e: Ac-X1LWRALWRLLRALWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 5) y
- VEPEP-6f: Ac-X1LWRALWRLLRNLWRLLWKA-cisteamida (SEQ ID NO: 6),
en donde X1 es beta-A o s y Ac representa acetilo.
8. El péptido de penetración celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un enlace hidrocarbonado entre dos restos separados por tres o seis restos.
9. El péptido de penetración celular de la reivindicación 8, que se selecciona del grupo que consiste en:
- ST-VEPEP-6a: Ac-X1LFRALWRsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 27)
- ST-VEPEP-6ab: Ac-X1LFRALWSsLLRSsLWRLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 29)
- ST-VEPEP-6b: Ac-X1LFRALWRLLRsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 31)
- ST-VEPEP-6bb: Ac-X1LFRALWRLLSsSLWSsLLWK-cisteamida (SEQ ID NO: 33)
en donde X1 es beta-A o S y en donde los restos seguidos de una "s" inferior son los que están enlazados por dicho enlace hidrocarbonado.
10. Un complejo que comprende un péptido de penetración celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una carga seleccionada del grupo que consiste en ácidos nucleicos y moléculas hidrófobas.
11. Una nanopartícula que comprende un complejo según la reivindicación 10, recubierto por una capa de péptidos de penetración celular periféricos, en donde dicha capa de péptidos de penetración celular periféricos tiene una secuencia peptídica diferente de la SEQ ID NO: 13.
12. Una nanopartícula que comprende un núcleo que comprende una carga en forma de complejo con una primera entidad seleccionada del grupo que consiste en péptidos de penetración celular, liposomas, estructuras policatiónicas y nanopartículas de carbono, en donde dicho núcleo está recubierto por un péptido de penetración celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende un complejo o una nanopartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. Un método para suministrar una molécula en una célula in vitro, que comprende una etapa de poner dicha célula en contacto con un complejo que comprende dicha molécula y péptidos de penetración celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
15. El complejo o nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para su uso como medicamento.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2014053879A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
CN104725478B (zh) * 2013-12-18 2018-12-25 纳肽得有限公司 多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用
US10745440B2 (en) 2014-12-24 2020-08-18 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of molecules
CA3025523A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
CN111511405A (zh) * 2017-10-16 2020-08-07 阿迪根有限公司 用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒
KR102274999B1 (ko) * 2020-04-23 2021-07-08 주식회사 아임뉴런바이오사이언스 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
US20230304010A1 (en) 2020-07-24 2023-09-28 Aadigen, Llc Compositions and methods for treating viral infections
IL302470A (en) 2020-10-30 2023-06-01 Tod SPEER Oligonucleotide-based treatments and their uses
WO2023133517A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Oak Crest Institute Of Science Subdermal implant for sustained drug delivery

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US7514530B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Peptide carrier for delivering siRNA into mammalian cells
US7579318B2 (en) 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US8242081B2 (en) * 2005-12-06 2012-08-14 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US7906484B2 (en) * 2006-09-21 2011-03-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complex for transferring an anionic substance into a cell
AU2007328206B2 (en) 2006-12-04 2013-08-01 Promedior, Inc. Conjoint therapy for treating fibrotic diseases
JP2011522796A (ja) * 2008-05-06 2011-08-04 ニューヨーク ブラッド センター， インコーポレイテッド 抗ウイルス細胞透過性ペプチド
CA3102008A1 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
WO2012137036A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
CA2873745A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Aadigen, Llc Multi-target modulation for treating fibrosis and inflammatory conditions
CN102745889B (zh) 2012-07-03 2015-02-25 深圳市华星光电技术有限公司 对玻璃基板进行烤焙处理的装置及方法
WO2014053880A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053882A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053881A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
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Vasconcelos et al. Therapeutic potential of cell-penetrating peptides
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