ES2795982T3 - Péptidos capaces de reactivar mutantes de p53 - Google Patents

Abstract

Un péptido recombinante o sintético que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 314, en donde dicho péptido reactiva al menos parcialmente una proteína mutante p53 in vitro; y en donde dicho péptido tiene una longitud de 6-15 aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos capaces de reactivar mutantes de p53

La descripción se refiere a péptidos capaces de reactivar proteínas p53 mutantes, y su uso en terapia.

Antecedentes de la descripción

El cáncer es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados, y a medida que la edad promedio de la población continúa aumentando, también lo hace el número de casos diagnosticados y las implicaciones económicas. El cáncer no es una sola enfermedad, sino un grupo de más de 200 enfermedades caracterizadas por un crecimiento descontrolado y la diseminación de células anormales. El cáncer es una enfermedad altamente heterogénea con grandes diferencias moleculares en la expresión y distribución de marcadores de superficie de células tumorales incluso entre pacientes con el mismo tipo y grado de cáncer. Además, las mutaciones celulares tienden a acumularse a medida que el cáncer progresa, lo que aumenta aún más la heterogeneidad del tumor. La mayoría de las células tumorales presentan inestabilidad genómica con una mayor expresión de oncogenes e inactivación de genes supresores de tumores.

Se considera que el gen p53 es el gen supresor de tumores más importante, que actúa como una barrera importante contra la progresión del cáncer. La proteína p53 responde a varios tipos de estrés celular y desencadena la detención del ciclo celular, la apoptosis o la senescencia (Levine, J.A., p53 The cellulargatekeeper forgrowth and división. Cell, 1997. 88: pág. 323-331). Esto se logra mediante la transactivación transcripcional de genes objetivo específicos que llevan motivos de unión al ADN de p53. Se acepta ampliamente que la ruta de p53 está afectada en casi todos los cánceres humanos. La mutación de p53 se considera un paso crítico en el proceso de transformación maligna y más de 50% de los casos de cáncer llevan mutaciones en sus genes p53. La mayoría de estas mutaciones son mutaciones puntuales de sentido erróneo que se dirigen al dominio central de unión al ADN (DBD) de p53, anulando así la unión específica al ADN de p53 a su sitio objetivo. Estas mutaciones evitan la transcripción dependiente de p53 y, en consecuencia, la supresión tumoral mediada por p53. La frecuencia excepcionalmente alta de mutaciones de p53 en tumores humanos de diversos tipos hace que p53 sea único entre los genes implicados en el desarrollo de tumores, convirtiendo a p53 mutado (Mut-p53) en un objetivo atractivo para nuevas terapias contra el cáncer.

Los estudios estructurales han puesto de manifiesto que las mutaciones de sentido erróneo derivadas de tumores en el DBD de p53 producen un efecto común: la desestabilización del plegamiento del DBD a temperatura fisiológica (Joerger, A.C., M.D. Allen y A.R. Fersht, Crystal structure o f a superstable mutant of human p53 core domain. Insights into the mechanism of rescuing oncogenic mutations. J Biol Chem, 2004. 279 (2): pág. 1291 -6) Esta desestabilización puede ser reversible, ya que algunos mutantes pueden volver a la conformación de tipo natural y unirse al ADN a temperaturas reducidas. Por lo tanto, la mayoría de las mutaciones de p53 desestabilizan el plegamiento de la proteína p53, causando desnaturalización parcial a temperatura fisiológica.

Las proteínas p53 mutantes se acumulan en niveles altos en las células tumorales, principalmente debido a su incapacidad para regular por aumento la expresión del destructor propio de p53 Mdm2. Además, muchas señales de estrés activadoras de p53 (como la hipoxia, inestabilidad genómica y expresión de oncogenes) son inducidas constitutivamente en células cancerosas. Por lo tanto, se espera que la reactivación de Mut-p53 ejerza efectos antitumorales importantes. Además, se ha demostrado en un modelo de ratón que el restablecimiento de las funciones de p53 se tolera bien en tejidos normales y no produce efectos tóxicos visibles (Ventura, A., et al., "Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo". Nature, 2007. 445 (7128): pág. 661-5).

p53 ha evolucionado para ser dinámica y conformacionalmente inestable. La falta de una estructura rígida de la proteína p53 puede dar lugar a una serie de confórmeros de p53 que presentan una actividad diferente, dependiendo del tipo de estrés y el contexto celular. En un modelo simplificado, p53 puede asumir bien una conformación activa de tipo natural o una conformación mutante, mal plegada e inactiva. Los dos estados conformacionales de p53 pueden ser distinguidos por dos anticuerpos monoclonales específicos, PAb240 y PAb1620 (Wang, P.L., F. Sait y G. Winter, The ’wild type’ conformation o f p53: epitope mapping using hybridproteins. Oncogene, 2001. 20 (18): pág. 2318-24). PAb240 se une a los restos 212-217 en el DBD de p53. Esta región es inaccesible para el anticuerpo (Ab) en la conformación de tipo natural (WT). Sin embargo, en p53 desnaturalizado o mutante, está expuesto (Vojtesek, B., et al., Conformational changes in p53 analyzed using new antibodies to the core DNA binding domain o f the protein. Oncogene, 1995. 10 (2): pág. 389-93). PAb1620 reconoce un epítopo conformacional, no lineal en el DBD, compuesto por dos regiones distintas de p53 y que incluye los restos R156, L206, R209 y N210 (Cook, A. y J. Milner, Evidence fo r allosteric variants o f wild-type p53, a tumor suppressor protein. Br J Cancer, 1990. 61 (4): p. 548-52). En la conformación WT, la proteína se pliega de una manera que mantiene los bucles muy próximos entre sí (Ravera, M.W., et al., Identification o f an allosteric binding site on the transcription factorp53 using a phage-displayedpeptide library. Oncogene, 1998. 16 (15): pág. 1993-9), formando el epítopo completo reconocido por PAb1620. Cuando la proteína p53 está mal plegada (como resultado de mutación, temperatura, desnaturalización o similares), estos dos bucles se alejan, el epítopo se destruye y, por lo tanto, la conformación mutante es negativa para PAb1620. Se ha mostrado que p53 es una proteína conformacionalmente flexible. Sin embargo, el defecto en el plegamiento en dichos mutantes no es irreversible: algunos mutantes de p53 mantienen capacidad residual de unión al ADN, los mutantes que no se unen al ADN a 37°C pueden unirse a temperaturas sub-fisiológicas (32°C o 25°C), y activar la transcripción de un promotor sensible a p53 a 262C. Además, se demostró que los DBD aislados de las proteínas mutantes R245S, R282W, V143A y otras tienen actividad residual de unión al a Dn (30-60%) a 20°C.

Los estudios estructurales muestran que el grado de mal plegamiento difiere entre mutantes; sin embargo, no hay un plegamiento alternativo definido, sino una desnaturalización parcial. Esto sugiere que un planteamiento de "molécula pequeña" para revertir el efecto de la mutación de p53 en el plegamiento podría ser aplicable a una amplia gama de formas mutantes. Otra predicción importante de los estudios estructurales es que un ligando que se une a la fracción de proteína adecuadamente plegada se espera que cambie el equilibrio hacia el plegamiento natural de acuerdo con la ley de acción de masas.

p53 se identificó por primera vez como una proteína celular que interacciona con el antígeno T grande de SV40 (LT). El área de interfase entre LT y p53 es grande: un total de 23 restos de LT y 19 restos de p53 están enterrados en esta interfase o se encuentra que participan directamente en las interacciones entre estas dos moléculas. Los restos de la interacción p53/ADN son adyacentes y se superponen con la interfase de p53/LT. La unión de LT a estos restos de p53 puede proteger eficazmente toda la superficie de unión al ADN de p53, incluidos los tres restos de p53 mutados más habitualmente en el cáncer: R273, R248 y G245. Esto inhibe la transactivación de promotores dependientes de p53. Dado que la interfase de p53/LT implica varias regiones y bucles de p53 diferentes, la proteína p53 debe plegarse correctamente para alinear los aminoácidos en la ubicación y orientación correctas para formar el contexto de unión a LT. Por lo tanto, la unión de p53 a LT puede servir como marcador del estado conformacional de p53

Se intentaron varios planteamientos de corrección en el campo de la conformación de p53. Friedler et al. proporcionaron una prueba de principio para los péptidos estabilizadores de la conformación (Friedler, A., et al., A peptide that binds and stabilizes p53 core domain: chaperone strategy for rescue o f oncogenic mutants. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2002. 99 (2): pág. 937-42). Se diseñó un péptido de nueve restos, CDB3, basado en la estructura cristalina del complejo entre el DBD de p53 y ASPP (Samuels-Lev, Y., et al., ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function o f p53. Mol. Cell, 2001. 8 (4): pág. 781-94). Se mostró que este péptido se une a Mut-p53 y actúa como una chaperona, desplazando el equilibrio hacia la conformación WT, como lo indica el aumento de la reactividad para PAb1620. Sin embargo, los efectos biológicos de CDB3 (Issaeva, N., et al., Rescue o f mutants of the tumor suppressorp53 in cancer cells by a designed peptide. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2003. 100 (23): pág. 13303-7) son solo parciales ya que la conformación del complejo Mut-p53/CDB3 está en un estado intermedio entre WT y mutante.

Los compuestos de molécula pequeña que se dirigen a Mut-p53 se han identificado utilizando ensayos basados en proteínas o basados en células (Peng, Y., et al., Rescue o f mutantp53 transcription function by ellipticine. Oncogene, 2003. 22 (29): pág. 4478-87). CP-31398 se identificó por cribado de moléculas que protegen el DBD de p53 aislado de la desnaturalización térmica, según lo evaluado por el mantenimiento de la reactividad de PAb1620 tras el calentamiento de proteínas (Foster, B.A., et al., Pharmacological rescue o f mutant p53 conformation and function. Science, 1999. 286 (5449): pág. 2507-10). El mecanismo de acción de CP-31398 sigue sin estar claro. Los estudios de RMN no detectaron ninguna unión de CP-31398 al DBD de p53 (Rippin, T.M., et al., Characterization o f the p53-rescue drug CP-31398 in vitro and in living cells. Oncogene, 2002. 21 (14): pág. 2119-29). CP-31398 afecta a la expresión génica e induce la muerte celular tanto de manera independiente como dependiente de p53. Por lo tanto, parece que CP-3138 tiene objetivos celulares distintos de p53 que pueden explicar su toxicidad celular.

Otras dos pequeñas moléculas que rescatan la función de p53 en las células cancerosas vivas, PRIMA-1 y MIRA-1, se descubrieron mediante el uso de ensayos de cribado basados en células. PRIMA-1 y MIRA-1 tienen perfiles de actividad similares (Bykov, V.J., et al., Reactivation o f mutant p53 and induction o f apoptosis in human tumor cells by maleimide analogs. J Biol Chem, 2005. 280 (34): pág. 30384-91), pero no están relacionadas estructuralmente. Hasta ahora, no se ha demostrado la unión directa a Mut-p53. Parece que el mecanismo puede implicar la ruta de JNK.

En el campo del descubrimiento y diseño de fármacos contra el cáncer, se pueden emplear dos estrategias diferentes y, a veces, complementarias. El diseño racional, que utiliza herramientas biológicas, matemáticas o computacionales para diseñar moléculas para un determinado propósito, se ha utilizado en el caso de CDB3. Sin embargo, dado que las interacciones entre diferentes proteínas y su entorno son complejas, esto es extremadamente difícil y a menudo produce moléculas con un impacto biológico modesto. La segunda estrategia es el cribado de alto rendimiento de bibliotecas de moléculas, para aislar compuestos con las mejores características. Dicho cribado puede emplear bibliotecas de compuestos químicos, de moléculas pequeñas o bibliotecas de péptidos. La mayoría de los medicamentos disponibles hasta la fecha son moléculas pequeñas debido a su capacidad para cruzar las membranas celulares. Las bibliotecas de compuestos químicos generalmente consisten en 104-105 compuestos diferentes; el cribado de una biblioteca de este tipo requiere la evaluación funcional de moléculas individuales, por lo que lo hace poco práctico para un laboratorio pequeño, ya que requiere grandes inversiones en robótica y/o mano de obra. Las bibliotecas de presentación de péptidos son mucho más grandes. La selección de péptidos se basa en la unión de los péptidos (y, por lo tanto, el fago), a un objetivo inmovilizado, elución y amplificación y después identificación por secuenciación.

En el procedimiento de presentación en fagos, el enriquecimiento de fagos que presentan un péptido se logra mediante la selección por afinidad de una biblioteca de fagos en el objetivo inmovilizado. En este proceso de "selección por pasos", los fagos que se unen son capturados mientras que los que no se unen se eliminan por lavado. En el siguiente paso, los fagos unidos se eluyen y amplifican mediante la reinfección de células de E. coli. La población de fagos amplificados se puede, a su vez, someter a la siguiente ronda de cribado. La selección de las bibliotecas de presentación en fagos es un proceso cíclico de enriquecimiento selectivo y amplificación. Después de varias rondas de selección, los fagos se diluyen de una manera que permite el aislamiento de clones de fagos individuales. Después los clones individuales se recogen, se cultivan en E. coli, se extrae el ADN del fago y luego se envía a la secuenciación. Las tecnologías de secuenciación de última generación desarrolladas recientemente están aumentando en gran medida la efectividad de la presentación en fagos, permitiendo el análisis del repertorio completo de péptidos seleccionados, con menos rondas de selección realizadas.

La presentación en fagos ofrece varias ventajas importantes sobre otros métodos de cribado; la principal ventaja de la presentación en fagos es la diversidad de secuencias que pueden estar representadas, lo que permite encontrar moléculas con muy alta afinidad y efecto biológico. Una vez que se encuentra una secuencia de péptidos de consenso, se puede mejorar aún más mediante técnicas de evolución dirigida o diseño racional.

Sin embargo, sigue existiendo una necesidad insatisfecha en la técnica de agentes que puedan reactivar proteínas p53 mutantes de manera eficiente y específica. Dichos agentes específicos y eficientes pueden usarse además como un medio eficaz para tratar diversas afecciones en las que p53 está mutado, en particular, restaurando el plegamiento natural y la actividad de las proteínas p53 mutantes.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un péptido recombinante o sintético que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 314,

en donde dicho péptido reactiva al menos parcialmente una proteína p53 mutante in vitro; y

en donde dicho péptido tiene una longitud de 6-15 aminoácidos.

Preferiblemente, el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 314.

Preferiblemente, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 313 o SEQ ID NO: 310.

Preferiblemente, el péptido se conjuga con al menos un resto de permeación celular.

Preferiblemente, el péptido:

(i) cambia al menos parcialmente la conformación de dicha proteína p53 mutante a una conformación de una proteína p53 de tipo natural (WT) in vitro;

(ii) dicho péptido cambia al menos parcialmente la conformación de dicha proteína p53 mutante de modo que dicha proteína p53 mutante, al unirse a dicho péptido in vitro es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT;

(iii) dicha proteína p53 mutante no es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT. Preferiblemente, el péptido restablece al menos parcialmente la actividad de dicha proteína p53 mutante a la actividad de una proteína p53 WT in vitro,

en donde dicha actividad es reducir la viabilidad in vitro de células que expresan dicha proteína p53 mutante; dicha actividad es promover la apoptosis in vitro de células que expresan dicha proteína p53 mutante; o dicha actividad es unirse a un elemento de unión al ADN de consenso de p53 en células que expresan dicha proteína p53 mutante.

Preferiblemente, dicho elemento de unión al ADN consenso comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 339.

Preferiblemente, dicha unión da como resultado la activación al menos parcial de un gen objetivo p53 endógeno. Preferiblemente, dicha proteína p53 mutante tiene una conformación diferente que una proteína p53 WT.

Preferiblemente, dicha proteína p53 mutante es al menos parcialmente inactiva en comparación con una proteína p53 WT. Preferiblemente, dicha proteína p53 mutante comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R175H, V143A, R249S, R273H, R280K, P309S, P151S, P151H, C176S, C176F, H179L, Q192R, R213Q, Y220C, Y220D, R245, S241F, C242R, R248Q, R248W, D281G, R273C y V274F.

La presente invención también se refiere a un péptido recombinante o sintético que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 321.

Preferiblemente, el péptido se usa para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociada con una proteína p53 mutante.

Otros objetos, características y ventajas de la presente descripción quedarán claros a partir de la siguiente descripción y dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama de bloques de etapas en un método de cribado, que proporciona la selección de parejas de unión (tal como péptidos), de una manera no directa, a través de su efecto sobre la conformación o estructura de una molécula objetivo.

La Figura 1B es un dibujo esquemático de un método de identificación, cribado y selección de péptidos reactivadores de p53 mutante. El método comprende alternar diversas estrategias de selección, con rigurosidades crecientes, para cribar e identificar péptidos reactivadores de p53 mutante, utilizando un método de presentación en fagos. Estrategia A (izquierda): selección según la conformación: selección de péptidos expresados y presentados por un fago, que pueden unirse a una proteína p53 mutante (por ejemplo, Mut-p53 R175H). La proteína Mut-p53 se une a un anticuerpo específico para p53 (por ejemplo, PAb1620) que se inmoviliza en un sustrato, lo que permite la selección de un fago unido. Estrategia B (derecha): selección según la función: selección de péptidos expresados y presentados por un fago, que puede reactivar un Mut-p53 (por ejemplo, Mut-p53 R175H), de modo que la activación está determinada por la capacidad de la proteína Mut-p53 para unir su elemento de unión al ADN consenso. El elemento de unión al ADN (por ejemplo, p53-RE WT) se inmoviliza en un sustrato. Un Mut-p53 no puede unirse al p53-RE WT, a menos que sea reactivado al menos parcialmente por el péptido reactivador unido al mismo. El método puede comprender además la secuenciación (por ejemplo, secuenciación profunda) de los péptidos identificados para determinar sus secuencias, y opcionalmente identificar una secuencia consenso para reactivar péptidos.

La Figura 2 es un pictograma de un análisis de transferencia Western de experimentos de inmunoprecipitación (IP), en los que perlas de agarosa covalentemente entrecruzadas con anticuerpos (PAb1620 o PAb240) o proteínas (ASPP2 o Bcl2) se incubaron con una proteína p53 WT, proteína p53 mutante R175H o p53 mutante V143A (cada una producida a partir de células sf9 transfectadas con baculovirus que expresan la proteína respectiva) durante 3 horas a 4°C. El inmunoprecipitado resultante, así como el líquido sobrenadante (sup) se sometieron a experimentos de transferencia Western, usando un anticuerpo anti-p53 (ap53) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), para determinar el nivel de proteína p53 en cada muestra.

La Figura 3 es un pictograma de análisis de transferencia Western de experimentos de IP, en los que perlas que se entrecruzaron covalentemente con los anticuerpos PAb1620 o PAb240 se incubaron con p53 WT o p53 mutante R175H durante 3 horas a 4°C con varias soluciones (tampón A-I y IP). El inmunoprecipitado resultante, así como el líquido sobrenadante (sup) se sometieron a experimentos de transferencia Western, usando un anticuerpo anti-p53 (ap53) conjugado con HRP, para determinar el nivel de proteína p53 en cada muestra. Solución A - Tris 50 mM; solución B - Tris, NaCl 150 mM; solución C - Tris, NaCl, Tritón al 0.5%; solución D - Tris, glicina al 0,5% ; solución E -Na4O7P240 mM; solución F - Guanidina-HCl 400 mM; solución G - Guanidina-HCl 800 mM; solución H - Urea 1 M; solución I - Urea 3 M; IP: tampón de IP.

La Figura 4 es la secuencia del oligonucleótido utilizado como el elemento de unión para las proteínas p53. El oligonucleótido (SEQ ID NO: 61) comprende un marcador de biotina 5', seguido de un sitio de reconocimiento de HindIII (subrayado), seguido de un sitio de reconocimiento de EcoRI (subrayado), seguido de un elemento de unión consenso de p53 (subrayado, el sitio de unión de p53 está compuesto de dos medios sitios, cada medio sitio se une a un dímero de p53 y juntos este sitio forma un complejo de ADN y tetrámero de p53), seguido de dos copias del elemento de reconocimiento de p53 del promotor p21 (subrayado). Para los experimentos de unión, este oligonucleótido se reasoció con un oligonucleótido complementario para formar un oligonucleótido bicatenario (bc).

La Figura 5 es un pictograma del análisis de transferencia Western de experimentos de IP, en los que las perlas que se entrecruzaron covalentemente con un anticuerpo PAb1620 se incubaron con p53 mutante R175H purificado en presencia de fagos, obtenido por selección por presentación en fagos con Mut-p53 R175H de longitud completa (175) o Mut-p53 R249S recombinante (249 DBD), con la etapa previa de aclaramiento realizada por incubación del grupo de fagos con perlas con PAb1620. Los fagos no seleccionados (NS) se usaron como control. La incubación se hizo durante 3 horas a 4°C. p53 unida en el inmunoprecipitado se analizó mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo contra p53 (ap53). Los fagos no seleccionados (NS) se usaron como control. "In" representa el 10% del material de entrada de IP que se cargó directamente en el gel. La inmunoprecipitación con el PAb-421 se utilizó como control positivo y como referencia para p53 inmunoprecipitado, ya que este anticuerpo se une al epítopo de p53 en el extremo C independientemente de la conformación de la proteína p53.

La Figura 6 es un pictograma de análisis de transferencia Western de experimentos de IP, en los que perlas recubiertas con estreptavidina unidas a oligonucleótidos p53-RE-DNA o control-RE-DNA marcados con biotina se incubaron con WT-p53-DBD purificado o p53-R249S-DBD mutante en presencia de fago obtenido mediante selección de presentación en fagos con Mut-p53 R175H (175), clon 27 (un solo clon aislado de la selección 175, SEQ ID NO: 328); grupos n°69 y n°94 seleccionadas con WT y Mut-p53 R175H usando combinaciones de antígeno T grande de SV-40 (T-ag) y PAb1620 en rondas de selección alternas. Los fagos no seleccionados (NS) se usaron como control. La incubación se realizó durante 3 horas a 4°C. p53 unido se visualizó mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo contra p53 (ap53).

La Figura 7 es una ilustración esquemática de varios motivos de péptidos consenso identificados como se describe en el presente documento.

Las Figuras 8A y 8B son gráficos de barras que demuestran experimentos ELISA representativos para determinar el efecto de los péptidos ensayados en los cambios de conformación de Mut-p53 en células H1299 que sobreexpresan de manera estable Mut-p53 (R175H p53), según lo determinado por inmunoensayo. Para medir el efecto conformacional de los péptidos en Mut-p53, se recubrió una placa de microtitulación con PAb240, PAb1620 o pAb421 (como control positivo y referencia para la proteína p53 total, ya que el anticuerpo utilizado reconoce las conformaciones tanto de WT como de mutante), se incubaron durante la noche, se lavaron, bloquearon y se añadieron extractos celulares (con o sin péptidos) durante 2 horas adicionales. Después de eliminar los extractos, las placas se lavaron y se incubaron con el Ab conjugado ap53-HRP para la detección de los niveles de p53. Se realizó un ensayo TMB (sustrato de HRP) y se determinó la densidad óptica a 450 nm. p53 WT sirvió como control positivo para la reactividad con PAb1620, y Mut-p53 sirvió como control negativo. Los resultados se presentan como la relación de absorbancia entre las muestras de PAb1620 o PAb240 y la muestra de control pAb241. Se usaron células MCF7 y H1299-Mut-p53 (ts) A135V (TS) como controles positivos para la conformación de p53 WT (la relación 1620/240 es igual o superior a 5:1).

La Figura 9 es un gráfico de barras, que demuestra experimentos de ELISA representativos para determinar el efecto de péptidos ensayados en la actividad de unión al ADN de Mut-p53 en células H1299 que sobreexpresan de manera estable Mut-p53 (R175H p53). Se usó un kit comercial de unión a p53/ADN (R&D), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con anticuerpo anti-p53 durante la noche. Los extractos celulares que contienen p53 se hicieron reaccionar con un oligonucleótido que contiene un sitio de unión consenso de p53, marcado con biotina, en presencia o ausencia (NT) de péptidos de ensayo. Se espera que p53 WT se una a este sitio de unión de ADN, así como al anticuerpo que recubre los pocillos de ensayo de la placa. El exceso de p53 y oligonucleótidos se eliminan por lavado y se usa estreptavidina-HRP para cuantificar la cantidad de oligonucleótidos en el pocillo, que es proporcional al ADN unido por p53. Se realizó un ensayo de TMB para determinar los niveles de HRP (450 nm). Los resultados se presentan como la absorbancia relativa (a 450 nm) (Eje Y) de cada muestra analizada. MCF7 y las células H1299-Mut-p53 (ts) A135V sirven como controles positivos para p53 WT.

La Figura 10 es un gráfico de barras que representa experimentos ELISA representativos para determinar la unión de péptidos ensayados a p53 WT recombinante y Mut-p53. Se usó un kit comercial de unión de péptido-proteína (TAKARA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con péptidos durante 2 horas. Los péptidos solubles se añadieron a los pocillos correspondientes para servir como control de competición para confirmar la especificidad de la unión del péptido a p53 (+comp). Se añadió oligonucleótido de ADN p53-RE a otros pocillos (+ADN) para examinar si afecta a la unión de péptidos a p53. Después de la eliminación de la proteína recombinante, las placas se lavaron y se incubaron con Ab conjugado ap53-HRP para la cuantificación de p53. Finalmente, se realizó un ensayo de TMB (sustrato de HRP) y se determinó la densidad óptica a 450 nm. Los resultados se presentan como una absorbancia relativa a 450 nm (eje Y) de cada muestra analizada. Los siguientes anticuerpos monoclonales ap53 sirvieron como controles internos: PAb1801; PAb1620 y PAb240.

La Figura 11 es un gráfico de barras que demuestra la unión de Mut-p53 a promotores de genes diana de p53 representativos en células vivas. Células de cáncer de mama BT-549 que expresan de forma endógena p53R249S mutante se trataron durante 5 horas con una mezcla de 3 pCAP - 250, 308 y 325. Las células tratadas con una mezcla de péptidos de control (péptidos inertes) sirvieron como control negativo. Las células se fijaron con formaldehído al 1%, se recogieron y el ADN se cortó por sonicación. El ADN entrecruzado con p53 se inmunoprecipitó usando un anticuerpo policlonal anti-p53 (H47). El ADN se purificó y la unión a los elementos sensibles a p53 de los promotores del gen PUMA, p21, CD95 y MDM2 se cuantificó por qPCR. Los resultados se normalizaron respecto a las muestras de entrada que representan los niveles totales de ADN. Como control negativo, los extractos se inmunoprecipitaron con perlas sin anticuerpo (perlas). Un sitio genómico que no contiene ningún elemento de unión a p53 sirvió como control negativo (negro).

La Figura 12 es un gráfico de barras que ilustra la actividad de luciferasa relativa (cLuc/gLuc) medida en las diversas muestras ensayadas. Se llevó a cabo la transfección transitoria de células H1299 p53-/- con plásmidos que expresaban p53 WT, R175H p53, R249S p53 o vector vacío como control, junto con TK-RGC-luc, donde la expresión de luciferasa está bajo el control de una matriz en tándem de múltiples elementos sensibles a p53. 24 horas después de la transfección, las células se trataron con los péptidos de ensayo. 48 horas después de la transfección, se tomó una muestra del medio de cultivo para mediciones de bioluminiscencia.

Las Figuras 13A y 13B son gráficos de barras que ilustran el efecto de varios péptidos ensayados sobre la viabilidad de células que expresan Mut-p53, según se determina mediante el ensayo de cristal violeta. Fibroblastos WI-38 que expresan p53 WT endógeno se infectaron con retrovirus que expresaban shARN Noxa de ratón (WI38-m-Noxa-i) como control no específico o el mutante R175H p53 para la sobreexpresión estable de p53 mutante (WI38-175). Las células (WI38-m-Noxa-i o WI38-175) se sembraron con 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron a las células los péptidos ensayados. Se utilizaron diferentes concentraciones de etopósido (fármaco citotóxico, 4'-desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-O-(R)-etilideno-beta-D-glucopiranosido], 4'-(dihidrógenofosfato) como control positivo para la muerte celular y como una curva de referencia patrón para evaluar el efecto de los péptidos ensayados. 48 horas después del tratamiento, las células se lavaron con PBS para excluir las células muertas y los desechos, y las células que permanecían unidas a la placa se tiñeron con cristal violeta durante 30 minutos. El cristal violeta se eliminó y las células se lavaron 4 veces con PBS para eliminar el cristal violeta residual. Luego, las células teñidas se disolvieron en ácido acético al 10% y las placas se tomaron para medir la densidad óptica a 595 nM (óptimo para cristal violeta). Los gráficos de barras de las Figuras 13A y 13B muestran las lecturas de densidad óptica a 595 nm, que reflejan el número de células en la placa después del tratamiento, normalizadas respecto a las muestras no tratadas (NT).

La Figura 14 es un gráfico de barras que ilustra el efecto de los péptidos ensayados en la activación de Mut-p53 midiendo la transactivación de genes objetivo de p53 según lo determinado por qRT-PCR. Las células H1299 son nulas para p53 y se usan ampliamente para la investigación de p53. Se utilizaron células H1299 transfectadas de forma estable con Mut-p53 (ts) A135V. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos, los péptidos indicados se añadieron directamente al medio en una concentración de 5 pg/ml, y las células después se llevaron a 32°C o se devolvieron a 37°C. 18 horas después, se recogieron las células, seguido de extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis por PCR en tiempo real. Se examinó el nivel de expresión de 3 genes objetivo de p53 representativos, p21, PUMA y Mdm2. Los gráficos de barras mostrados en la Figura 14 ilustran la inducción relativa de la transcripción de los genes ensayados en las diversas muestras con respecto a su nivel de transcripción en células no tratadas.

Las Figuras 15A y 15B son gráficos de barras que ilustran el efecto de los diversos péptidos indicados sobre la viabilidad de las células de cáncer de mama que expresan diferentes isoformas de Mut-p53, según lo determinado por el ensayo de cristal violeta. Figura 15A: células MDA-MB-231 que expresan Mut-p53 con una mutación en la posición 280 del DBD. Figura 15B: células SKBR3 que expresan Mut-p53 con mutación en la posición 175 dentro del DBD. Los gráficos de barras en las Figuras 15A y 15b muestran para cada péptido ensayado que la densidad óptica se lee a 595 nm, lo que refleja el número de células en la placa después del tratamiento, normalizadas respecto a las muestras no tratadas (NT).

La Figura 16 es un gráfico de barras que ilustra el efecto de los péptidos indicados en la activación de Mut-p53 midiendo la transactivación de genes diana de p53 según lo determinado por qRT-PCR. Se usaron células SKBR3 ShCon y células SKBR3 Shp53 con inactivación de la expresión de p53. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y los péptidos indicados se añadieron directamente al medio en una concentración de 5 pg/ml. 18 horas después, las células se recogieron, seguido de análisis por qRT-PCR. Se evaluó el nivel de expresión de p21, PUMA y Mdm2. La Figura 16 ilustra la inducción relativa de la transcripción de los genes ensayados en las diversas muestras en relación con su nivel de transcripción en células no tratadas. El ARNm de GAPDH se midió en paralelo como control.

Las Figuras 17A, 17B, 17C y 17D ilustran experimentos representativos realizados en células de carcinoma de ovario ES2 que expresan Mut-p53 mutado en la posición 241 dentro del DBD. En esencia, las células se sembraron en placas de 6 cm, y los péptidos indicados se añadieron directamente al medio en una concentración de 12 ug/ml en los tiempos de medición indicados. Se recogieron las células y se realizó un ensayo de apoptosis (Figuras 17A y 17B) usando el kit de tinción de Anexina-V (Roche, REF 11 988 549001). Las células no fijadas se tiñeron tanto con anticuerpo antianexina conjugado con FITC para detectar células apoptóticas como con PI (yoduro de propidio) para teñir células muertas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se analizaron luego por citometría de flujo. Se contó un total de 10000 células para cada muestra y se dividieron en cuatro subpoblaciones de acuerdo con la intensidad de la tinción; las células negativas tanto para PI como para anexina (-PI, -anexina) se denominan vivas; las células negativas para PI y positivas para anexina (-PI, anexina) están pasando por etapas tempranas de apoptosis; las células positivas para PI y anexina (+PI, anexina) son células muertas que experimentaron un proceso apoptótico; y las células positivas para PI y negativas para anexina (+PI, -anexina) se asumen como células muertas que murieron por un proceso no apoptótico tal como la necrosis.

Las Figuras 18A, 18B y 18C ilustran el efecto in vivo de los péptidos indicados en un modelo de xenoinjerto de ratón. Se inyectaron células MDA-MB-231 que expresan p53 mutante endógeno y que expresan establemente luciferasa en la cadera izquierda de ratones CD1 Nude/Nude. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño visible, se midió la bioluminiscencia (indicativa del número de células cancerosas) con el sistema IVIS200. Luego, los ratones se trataron por inyección intratumoral, tres veces por semana, con una mezcla de 3 péptidos de control que no mostraban fenotipo in vitro (pCAP 76, 77 y 12; 2 mg de cada péptido). 35 días después del inicio del tratamiento, el experimento se terminó. La Figura 18A muestra un gráfico de escala logarítmica que demuestra las lecturas de luciferasa en cada tumor en función del tiempo después del inicio del tratamiento (inyección de péptidos). La Figura 18B muestra imágenes generadas en vivo de ratones (7-10), al comienzo del tratamiento. La Figura 18C muestra imágenes generadas en vivo de ratones tratados (7-9) el día 35, cuando se terminó el experimento. El ratón 10 tuvo que ser sacrificado después de 28 días debido al gran tamaño del tumor.

Las Figuras 19A, 19B y 19C ilustran el efecto in vivo de los péptidos indicados en un modelo de xenoinjerto de ratón. Se inyectaron células MDA-MB-231 que expresan p53 mutante endógeno y expresan establemente luciferasa en la cadera izquierda de ratones CD1 Nude/Nude. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño visible, se midió la bioluminiscencia (indicativa del número de células cancerosas) con el sistema IVIS200. Luego, los ratones se trataron por inyección intratumoral, tres veces por semana, con una mezcla de 3 péptidos de ensayo que presentaban capacidad de reactivación de p53 muíante (pCAP 159, 155 y 174; 2 mg de cada péptido). 35 días después del inicio del tratamiento, el experimento se terminó. La Figura 19A muestra un gráfico de escala logarítmica que demuestra las lecturas de luciferasa en cada tumor en función del tiempo después del inicio del tratamiento (inyección de péptidos). La Figura 19B muestra imágenes generadas en vivo de ratones 1-6 al comienzo del tratamiento. La Figura 19C muestra imágenes generadas en vivo de ratones 1 -6 tratados el día 35, cuando se terminó el experimento. Dos de los tumores (ratón 1 y ratón 4) mostraron una respuesta parcial al tratamiento, medida por una disminución de 50% y 65%, respectivamente, en la señal de la luciferasa después de 35 días. Los ratones 2 y 5 mostraron una respuesta completa, alcanzando lecturas de bioluminiscencia que son tan bajas como o cercanas a los niveles de detección de umbral del nivel de fondo del sistema IVIS (5x106 fotones) incluso después de 21 días de tratamiento. Tras la interrupción del tratamiento después de 35 días, los ratones números 2 y 5 se mantuvieron vivos y se vigilaron durante 21 días adicionales; no se detectó la reaparición de tumores, ya sea visualmente o mediante generación de imágenes en vivo.

Las Figuras 20A, 20B, 20C y 20D ilustran el efecto in vivo de los péptidos indicados en un modelo de xenoinjerto de ratón. Se inyectaron células MDA-MB-231 que expresan p53 mutante endógeno y que expresan establemente luciferasa en la cadera izquierda de ratones CD1 Nude/Nude. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño visible, se midió la bioluminiscencia (indicativa del número de células cancerosas) con el sistema IVIS200. Luego, los ratones se trataron por inyección intratumoral, tres veces por semana, con una mezcla de 3 péptidos de control que no mostraron fenotipo in vitro (pCAP 76, 77 y 12; 2 gg de cada péptido) o una mezcla de 3 péptidos de ensayo que presentaban capacidad de reactivación de p53 mutante (pCAP 159, 155 y 174; 2 ug de cada péptido). Las Figuras 20A y 20B muestran un gráfico de escala logarítmica que demuestra las lecturas promedio de luciferasa en tumores en función del tiempo, antes (hasta el día 18) y después del inicio del tratamiento (inyección de péptido). Las Figuras 20C y 20D muestran imágenes generadas en vivo de ratones, al comienzo del tratamiento (día 18, izquierda) y 12 días en tratamiento (día 30, derecha). El 40% de los ratones mostraron una respuesta completa, alcanzando lecturas de bioluminiscencia que son tan bajas como o cercanas a los niveles de detección de umbral del nivel de fondo del sistema IVIS (5x106 fotones).

Las Figuras 21A, 21B, 21C, 21D y 21E ilustran el efecto in vivo de los péptidos indicados en un modelo de xenoinjerto de ratón. Células de cáncer de colon SW-480 que expresan p53 mutante endógeno y que expresan establemente luciferasa se inyectaron en la cadera izquierda de ratones CD1 Nude/Nude. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño visible, se midió la bioluminiscencia (indicativa del número de células cancerosas) con el sistema IVIS200. Luego, los ratones se trataron por inyección intratumoral, tres veces por semana, con una mezcla de 3 péptidos de control que no mostraban fenotipo in vitro (pCAP 76, 77 y 12; 2 gg de cada péptido) o una mezcla de 3 péptidos de ensayo que presentaban capacidad de reactivación de p53 mutante (pCAP 250, 308 y 325; 2 ug de cada péptido). Las Figuras 21A 21B y 21C muestran un gráfico de escala logarítmica que demuestra las lecturas promedio de la luciferasa en tumores en función del tiempo, antes (hasta el día 0) y después del inicio del tratamiento (inyección de péptidos). Las Figuras 21D y 21E muestran el diagrama de caja de volumen tumoral y peso tumoral, respectivamente. Como se ve en las figuras 21D y 21E, los tumores extraídos de ratones tratados con una mezcla de los péptidos o el péptido solo pCAP-325, son significativamente más pequeños en tamaño y peso en comparación con los tumores extraídos de ratones tratados con los péptidos de control (valor p <0.05).

Descripción detallada de la divulgación

La presente descripción proporciona péptidos altamente potentes y agentes peptídicos modificados que pueden reactivar eficazmente mutantes conformacionales de p53, idealmente cambiando la conformación y/o actividad de las proteínas p53 mutantes para parecerse a las de una proteína p53 funcional de tipo natural. Por lo tanto, la presente descripción proporciona péptidos y su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con p53 mutantes, donde la activación de proteínas p53 presentes, pero con defectos de conformación puede ser beneficiosa.

La presente descripción se basa en la identificación sorprendente de péptidos altamente potentes y agentes basados en péptidos que pueden reactivar eficazmente mutantes conformacionales de p53, más eficazmente que los péptidos conocidos previamente identificados para este uso.

La presente descripción proporciona agentes capaces de elevar al menos en parte el efecto antineoplásico y/o proapoptótico de las proteínas p53 mutantes, y su uso en el tratamiento de cualquier enfermedad o afección causada o correlacionada con una proteína p53 conformacionalmente aberrante. Sin estar vinculado a ningún mecanismo o teoría, se especula que el cambio conformacional en las proteínas p53 mutantes al unirse a los agentes proporcionados por la presente descripción los acerca a una conformación 3D de una proteína p53 de tipo natural, y por lo tanto restablece al menos parcialmente al menos parte de las funciones de una proteína p53 de tipo natural a las proteínas p53 mutantes.

Más específicamente, la presente descripción proporciona, en un aspecto, un péptido recombinante o sintético que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 321-286.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto, un péptido recombinante o sintético que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321-286, en donde el péptido reactiva, al menos parcialmente, una proteína p53 mutante.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto más, un péptido recombinante o sintético que comprende un motivo consenso de la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 314, 268, 282, 340, 376, 298, 377, 378, 253, 20, 379, 302, 275, 380, 273, 381,280 o 382, en donde el péptido reactiva, al menos parcialmente, una proteína p53 mutante.

En ciertos aspectos, el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 310 o SEQ ID NO: 307. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321-302. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 321-312. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 321-316. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En ciertos aspectos, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SeQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 310 o SEQ ID NO: 307. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 321-302. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321-312. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido descrito anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321-316. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En ciertos aspectos, el péptido se conjuga con al menos un resto de ácido graso. En ciertos aspectos, el ácido graso se selecciona del grupo que consiste en ácido mirístico, ácido láurico, ácido palmítico y ácido esteárico. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el ácido graso es un ácido graso miristoilo.

En ciertos aspectos, el péptido cambia al menos parcialmente la conformación de la proteína p53 mutante a una conformación de una proteína p53 de tipo natural (WT).

Son conocidos en la técnica los anticuerpos que reconocen específicamente solo las proteínas p53 de tipo natural. Dichos anticuerpos son muy útiles para determinar si cierta proteína p53, ya sea de tipo natural o mutante, mantiene la conformación de una proteína p53 funcional de tipo natural. Por lo tanto, en ciertos aspectos, el péptido cambia al menos parcialmente la conformación de la proteína p53 mutante de modo que la proteína p53 mutante es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido exclusivamente contra una proteína p53 WT o contra una proteína p53 que mantiene una conformación de proteína p53 WT. En ciertos aspectos, el anticuerpo monoclonal es Ab1620.

Debe entenderse que, dado que p53 se expresa a partir de ambos alelos, el contenido general de p53 intracelular puede ser de tipo natural (wt/wt), mezcla de p53 wt y mutante (wt/mut) o solo p53 mutante (cuando ambos alelos están mutados (mut/mut), o se elimina un alelo (mut/-)). En el cáncer, la situación suele ser wt/mut, mut/mut o mut/-. Dado que p53 actúa como un tetrámero, las proteínas p53 mutantes pueden anular la actividad de las proteínas p53 de tipo natural, que pueden existir en las células del cáncer. Por lo tanto, los péptidos proporcionados por la presente descripción son particularmente útiles en el tratamiento de cánceres en los que aumentar el nivel de proteínas p53 de tipo natural no es fructífero.

En ciertos aspectos, el péptido restablece al menos parcialmente la actividad de la proteína p53 mutante a al menos una de las actividades de una proteína p53 WT.

En ciertos aspectos, la actividad es reducir la viabilidad de las células que expresan la proteína p53 mutante. En ciertos aspectos, la actividad es promover la apoptosis de las células que expresan la proteína p53 mutante. En ciertos aspectos, la actividad es activar genes pro-apoptóticos de células que expresan dicha proteína p53 mutante. En ciertos aspectos, los genes pro-apoptóticos se seleccionan del grupo que consiste en CD95, Bax, DR4, DR5, PUMA, NOXA, Bid, 53AIP1 y PERP. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En ciertos aspectos, la actividad es unirse a un elemento de unión a ADN de consenso p53 en células que expresan la proteína p53 mutante. En ciertos aspectos, el elemento de unión al ADN de consenso comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 339.

En ciertos aspectos, la unión da como resultado una activación al menos parcial de un gen objetivo p53 endógeno. En ciertos aspectos, el gen diana endógeno se selecciona del grupo que consiste en p21, MDM2 y PUMA. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En ciertos aspectos, la proteína p53 mutante tiene una conformación diferente a la proteína p53 WT. En ciertos aspectos, la proteína p53 mutante es al menos parcialmente inactiva en comparación con una proteína p53 WT.

En ciertos aspectos, la proteína p53 mutante no es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT. En ciertos aspectos, la proteína mutante p53, al unirse al péptido, es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT. En ciertos aspectos, el anticuerpo monoclonal es Ab1620.

En ciertos aspectos, la proteína p53 mutante comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R175H, V143A, R249S, R273H, R280K, P309S, P151S, P151H, C176S, C176F, H179L, Q192R, R213Q, Y220C, Y220D, R245, D281G, S241F, C242R, R248Q, R248W, D281G, R273C y V274F. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En ciertas realizaciones, el péptido comprende el motivo consenso expuesto en la SEQ ID NO: 314. En ciertos aspectos, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SEQ iD NO: 313, SEQ ID NO: 310 o SEQ ID NO: 307. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 310 o SEQ ID NO: 307. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 268, 282, 340, 376, 298, 377, 378, 253, 20, 379, 302, 275, 380, 273, 381,280 o 382. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 379, 302, 275, 380, 273, 381, 280 o 382. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En ciertos aspectos, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 302, 275, 380, 273, 381, 280 o 382, Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto, un vector de expresión, capaz de expresar los péptidos descritos anteriormente.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto, una composición farmacéutica, que comprende los péptidos descritos anteriormente.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto más, una composición farmacéutica, que comprende el vector de expresión descrito anteriormente.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente son para usar en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada con una proteína p53 mutante.

En algunos aspectos, la enfermedad es cáncer. En algunos aspectos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En algunos aspectos, las células cancerosas expresan la proteína p53 mutante.

La presente descripción además proporciona, en otro aspecto, un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociada con una proteína p53 mutante, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente a un sujeto que lo necesite, tratando así la enfermedad, trastorno o afección.

La presente descripción proporciona, además, en otro aspecto más, un kit que comprende las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente.

En un aspecto, el kit descrito anteriormente es para usar en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada con una proteína p53 mutante.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente descripción, a continuación, se definen una serie de términos y frases. Debe entenderse que estos términos y frases tienen el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser interpretada por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y la orientación presentadas en el presente documento, en combinación con el conocimiento de un experto en la técnica.

La expresión "péptido recombinante o sintético" como se usa en el presente documento se refiere a un péptido producido por métodos biotecnológicos estándar conocidos en la técnica, tales como expresión en bacterias o síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS).

La expresión "capaz de reactivar al menos parcialmente una proteína p53 mutante" o "reactiva al menos parcialmente una proteína p53 mutante" como se usa indistintamente en el presente documento se refiere al péptido, en donde tras la unión del péptido a una proteína p53 mutante, la proteína p53 mutante gana o aumenta una actividad similar a una actividad correspondiente de una proteína p53 de tipo natural.

La expresión "motivo consenso", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos de al menos tres aminoácidos, que se encontraba en más de un péptido proporcionado por la presente descripción.

La expresión "resto de ácido graso", como se usa en el presente documento, se refiere a una parte de un ácido graso que presenta un conjunto particular de características químicas y farmacológicas similares a la molécula de origen de ácido graso completa correspondiente. La expresión se refiere además a cualquier especie molecular y/o fragmento molecular que comprenda el componente acilo de un ácido graso (carboxílico)

Un resto potenciador de la permeabilidad de acuerdo con la presente descripción se conecta preferiblemente covalentemente a la secuencia peptídica mediante un enlace directo o mediante un conector, para formar un conjugado peptídico. El resto potenciador de la permeabilidad puede estar conectado a cualquier posición en el resto péptido, directamente o a través de un espaciador, preferiblemente al extremo amino del péptido. Según ciertos aspectos, el resto potenciador de la permeabilidad es un ácido graso.

Se puede usar cualquier resto conocido en la técnica para facilitar de forma activa o pasiva o potenciar la permeabilidad del compuesto en las células para la conjugación con el núcleo peptídico de acuerdo con la presente descripción. Los ejemplos no limitantes incluyen: restos hidrofóbicos tales como ácidos grasos, esteroides y compuestos aromáticos o alifáticos voluminosos; restos que pueden tener receptores o portadores de membrana celular, tales como esteroides, vitaminas y azúcares, aminoácidos naturales y no naturales y péptidos transportadores. Según algunos aspectos, el resto hidrofóbico es un resto lipídico o un resto de aminoácido.

El término "permeabilidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un agente o sustancia para penetrar, permear o difundirse a través de una barrera, membrana o una capa de piel. Un resto de "permeabilidad celular" o de "penetración celular" se refiere a cualquier molécula conocida en la técnica que sea capaz de facilitar o mejorar la penetración de moléculas a través de membranas. Los ejemplos no limitantes incluyen: restos hidrofóbicos tales como lípidos, ácidos grasos, esteroides y compuestos aromáticos o alifáticos voluminosos; restos que pueden tener receptores o portadores de membrana celular, tales como esteroides, vitaminas y azúcares, aminoácidos naturales y no naturales, péptidos transportadores, nanopartículas y liposomas.

El resto hidrófobo de acuerdo con la descripción puede comprender preferiblemente un resto lipídico o un resto de aminoácido. Según un aspecto específico, el resto hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en: fosfolípidos, esteroides, esfingosinas, ceramidas, octilglicina, 2-ciclohexilalanina, benzolilfenilalanina, propionoilo (C³); butanoilo (C⁴); pentanoilo (C⁵); caproilo (C6); heptanoilo (C⁷); capriloilo (C8); nonanoilo (C⁹); caprilo (C¹⁰); undecanoilo (C¹¹); lauroilo (C¹²); tridecanoilo (C¹³); miristoilo (C¹⁴); pentadecanoilo (C¹⁵); palmitoilo (C¹⁶); ftanoilo ((CH³M ; heptadecanoilo (C¹⁷); estearoilo (C¹⁸); nonadecanoilo (C¹⁹); araquidoilo (C²⁰); heniecosanoilo (C²¹); behenoilo (C²²); trucisanoilo (C²³); y lignoceroilo (C²⁴); en donde dicho resto hidrófobo está unido a dicho polipéptido quimérico con enlaces amida, sulfhidrilos, aminas, alcoholes, grupos fenólicos o enlaces carbono-carbono.

Otros ejemplos de restos lipídicos que pueden usarse de acuerdo con la presente descripción: Lipofectamina, Transfectace, Transfectam, Citofectina, Dm RIE, DLRIE, GAP-DLRIE, DOTa P, DOPE, DMEAP, DODMP, DOPC, DDAB, DOSPA, EDLPC, EDMPC, DPH, TMADPH, CTAB, lisil-PE, DC-Cho, -alanil colesterol; DCGS, DPPES, DCPE, DMAP, DMPE, DOGS, Do HME, Dp EpC, Pluronic, Tween, BRIJ, plasmalógeno, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, glicerol-3-etilfosfatidilcolina, dimetilamoniopropano, trimetilamoniopropano, dietilamoniopropano, trietilamoniopropano, bromuro de dimetildioctadecilamonio un esfingolípido, esfingomielina, un lisolípido, un glicolípido, una sulfatida, un glicosfingolípido, colesterol, éster de colesterol, sal de colesterol, aceite, N-succinildioleoilfosfatidiletanolamina, 1,2-dioleoil-sn-glicerol, 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol, 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol, 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfatidiletanolamina, palmitoilhomocisteína, tetrayoduro de N,N'-Bis(dodeciaminocarbonilmetilen)-N,N'-bis((-N,N,N-trimetilamonioetil-ami nocarbonilmetilen)etilenodiamina; hexayoduro de N,N"-Bis(hexadecilaminocarbonilmetilen)-N,N',N"-tris((-N,N,N-trimetilamonioetilaminocarbonilmetilendietilenotriamina; tetrayoduro de N,N'-Bis(dodecilaminocarbonilmetilen)-N,N"-bis((-N,N,N-trimetilamonioetilaminocarbonilmetilen)ciclohexileno-1,4-diamina; heptayoduro de 1,7,7-tetra-((-N,N,N,N-tetrametilamonioetilamino-carbonilmetilen)-3-hexadecilaminocarbonil-metileno-1,3,7-triaazaheptano; tetrayoduro de N,N,N',N'-tetra((-N,N,N-trimetilamonio-etilaminocarbonilmetilen)-N'-(1,2-dioleoilglicero-3-fosfoetanolaminocarbonilmetilen)dietilenotriamina; dioleoilfosfatidiletanolamina, un ácido graso, un lisolípido, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, un esfingolípido, un glicolípido, un glucolípido, una sulfatida, un glicoesfingolípido, ácido fosfatídico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido oleico, un lípido que lleva un polímero, un lípido que lleva un sacárido sulfonado, colesterol, hemisuccinato de tocoferol; un lípido con un ácido graso unido por éter, un lípido con un ácido graso unido por éster, un lípido polimerizado, fosfato de diacetilo, estearilamina, cardiolipina, un fosfolípido con un ácido graso de 6-8 carbonos de longitud, un fosfolípido con cadenas de acilo asimétricas, 6-(5-colesten-3b-iloxi)-1-tio-b-D-galactopiranósido, digalactosildiglicérido, 6-(5-colesten-3b-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1 -tio-b-D-galactopiranósido, 6-(5-colesten-3b-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio-a-D-manopiranósido, ácido 12-(((7'-dietilamino-cumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metil-amino)octadecanoil]-2-aminopalmitico;) (4'-trimetil-amonio)butanoato de colesterilo; N-succinildioleoil-fosfatidiletanolamina; 1,2-dioleoil-snglicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinil-glicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol, 1 -hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina y palmitoilhomocisteína.

La expresión "células que expresan la proteína p53 mutante" como se usa en el presente documento se refiere a células que expresan a partir de al menos un alelo una proteína p53 mutante. En ciertos aspectos, la expresión "células que expresan la proteína p53 mutante" es intercambiable con "células cancerosas".

La expresión "genes pro-apoptóticos" se refiere a un gen, o una multitud de genes, implicados en la apoptosis, ya sea directamente (tal como ciertas caspasas) o indirectamente (por ejemplo, como parte de una cascada de transducción de señales).

La expresión "composición farmacéutica" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier composición que comprende al menos un ingrediente farmacéuticamente activo.

El término "asociado con una proteína p53 mutante", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o afección que es causada por una proteína p53 mutante o relacionada con la presencia de una proteína p53 mutante en una célula o un órgano.

Debe entenderse que, dado que p53 se expresa a partir de ambos alelos, el contenido general de p53 intracelular puede ser de tipo natural (wt/wt), mezcla de p53 wt y mutante (wt/mut) o solo p53 mutante (cuando ambos alelos están mutados (mut/mut), o se elimina un alelo (mut/-)). En el cáncer, la situación suele ser wt/mut, mut/mut o mut/-. Dado que p53 actúa como un tetrámero, las proteínas p53 mutantes pueden anular la actividad de las proteínas p53 de tipo natural que existen en las células del cáncer. Por lo tanto, los péptidos proporcionados por la presente descripción son particularmente útiles en el tratamiento de cánceres en los que aumentar el nivel de proteínas p53 de tipo natural no es fructífero.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de una composición que contiene un péptido de acuerdo con la presente descripción que es suficiente para reducir, disminuir y/o inhibir una enfermedad, trastorno o afección en un individuo.

Como se usa en el presente documento, el término p53 se dirige a una proteína p53 que puede tener una conformación de una p53WT, una p53 mutada o una conformación intermedia entre p53 WT y mutada.

Como se usa en el presente documento, las expresiones " p53 tipo natural", "p53wt " y "p53 WT " se pueden usar indistintamente y se dirigen a una proteína p53 de tipo natural, que tiene la conformación de una proteína p53 de tipo natural y, por lo tanto, la actividad de un proteína p53 de tipo natural. En algunos aspectos, la p53 de tipo natural puede ser identificada mediante un anticuerpo monoclonal específico.

Como se usa en el presente documento, los términos "p53 mutante", "Mut-p53", "p53 mutado" y "p53 mutante" pueden usarse indistintamente y se dirigen a una proteína p53 mutada, incapaz de funcionar eficazmente en una célula diana. En algunos aspectos, una Mut-p53 no puede unirse a su sitio objetivo. En algunos aspectos, una Mut-p53 está mutada en la región del dominio de unión al ADN (DBD). En algunos aspectos, una Mut-p53 está mal plegada en una conformación inactiva. En algunos aspectos de ejemplo, una Mut-p53 es una mut p53 R249S (R249S p53) sensible a la temperatura (ts), una p53 mutante de longitud completa de punto caliente Mut-p53 R175H (R175H p53), o cualquier otra proteína Mut-p53. En algunos aspectos, una Mut-p53 es identificada por un anticuerpo monoclonal específico, capaz de reconocer una conformación mal plegada de p53 (inducida por la mutación de la p53). En algunos aspectos, una Mut-p53 es identificada por un anticuerpo monoclonal específico.

La frase "péptido reactiva una proteína p53 mutante" como se usa en el presente documento se refiere a un péptido que tras su interacción con una proteína p53 mutante, la proteína p53 mutante aumenta al menos una de sus actividades, en donde las actividades son las actividades de una proteína p53 de tipo mutante. Por ejemplo, tras su interacción con un péptido proporcionado por la presente descripción, una proteína p53 mutante puede aumentar, directa o indirectamente, la expresión de proteínas pro-apoptóticas tales como caspasas en una célula cancerosa, de forma similar a lo que haría una proteína p53 de tipo natural en una situación similar.

Como se menciona en el presente documento, las expresiones "péptido reactivador", "péptido reactivador de Mut-p53" se pueden usar indistintamente y se dirigen a un agente peptídico capaz de restablecer al menos parcialmente la actividad de Mut-p53. En algunos aspectos, el agente reactivador puede reactivar una Mut-p53 afectando a la conformación de Mut-p53, para asumir una conformación que es más similar o idéntica a una p53 WT, natural. En algunos aspectos, el agente reactivador puede reactivar una Mut-p53 para restablecer la unión de la Mut-p53 a un sitio de unión de p53 WT en un ADN objetivo. En algunos aspectos, el agente reactivador puede restablecer las propiedades bioquímicas de Mut-p53. En algunos aspectos, el agente reactivador puede inducir a la proteína Mut-p53 para que presente inhibición selectiva de p53 de las células cancerosas. En algunos aspectos, el agente reactivador puede reactivar una Mut-p53 para tener propiedades estructurales, propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y/o propiedades funcionales similares o idénticas a una proteína p53 WT. En algunos aspectos, el agente reactivador es un péptido. En algunos aspectos, el agente reactivador es un péptido que tiene 3-25 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, el agente reactivador es un péptido que tiene 5-20 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, el agente reactivador es un péptido que tiene de 6-15 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, el agente reactivador es un péptido que tiene 7 o 12 aminoácidos de longitud.

El término "conformación" con respecto a una proteína se dirige a la disposición estructural (plegamiento) de una proteína en el espacio.

Las expresiones "secuenciación profunda" y "secuenciación de próxima generación" pueden usarse indistintamente y están dirigidas a un método de secuenciación mejorado que permite la secuenciación paralela rápida de múltiples secuencias de ácido nucleico.

El método de "presentación en fagos" incluye el cribado de una biblioteca de fagos, cada uno de los cuales expresa y presenta una molécula exógena específica, tal como un péptido. El enriquecimiento de los fagos que expresan y presentan un péptido específico se logra mediante selección por afinidad de una biblioteca de fagos en el objetivo inmovilizado. En este procedimiento de "selección por pasos", se capturan fagos de unión (es decir, fagos que expresan y presentan un péptido que puede unirse al objetivo inmovilizado), mientras que los fagos que no se unen (es decir, fagos que no expresan y presentan un péptido que pueda unirse al objetivo inmovilizado) se separan por lavado. Un siguiente paso en el método puede incluir la elución y amplificación de los fagos unidos mediante la reinfección de células de E. coli con los fagos identificados. En algunos aspectos, una biblioteca de fagos puede ser una biblioteca original o una biblioteca de presentación en fagos disponible en el mercado.

Los términos "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales.

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido" u "oligo" se refieren a un polímero monocatenario o bicatenario compuesto de nucleótidos de ADN (ácido desoxirribonucleico), nucleótidos de ARN (ácido ribonucleico) o una combinación de ambos tipos, y puede incluir nucleótidos naturales, nucleótidos modificados químicamente y nucleótidos sintéticos.

"Aminoácido" se refiere a uno cualquiera de los 20 aminoácidos naturales, aminoácidos que se han modificado químicamente (véase más abajo) o aminoácidos sintéticos.

"Sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de la misma clase, donde una clase se define por las propiedades fisicoquímicas comunes de la cadena lateral de los aminoácidos y las altas frecuencias de sustitución en proteínas homólogas que se encuentran en la naturaleza, según lo determinado, por ejemplo, por una matriz de intercambio de frecuencia de Dayhoff estándar o matriz BLOSUM. Se han categorizado seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gin, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (He, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro resto de Clase III como Asn, Gin o Glu, es una sustitución conservadora.

"Sustitución no conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase por un aminoácido de otra clase; por ejemplo, la sustitución de una Ala, un resto de Clase II, por un resto de Clase III tal como Asp, Asn, Glu o Gin.

"Modificado químicamente" se refiere a un aminoácido que se modifica mediante procesos naturales o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las numerosas modificaciones conocidas, los ejemplos típicos, pero no exclusivos incluyen: acetilación, acilación, amidación, ribosilación de ADP, glucosilación, glucosaminoglucanación, formación de anclaje GPI, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, metilación, miristilación, pegilación, prenilación, fosforilación, ubiqutinación, o cualquier proceso similar.

Como se menciona en el presente documento, la expresión "tratar una enfermedad" o "tratar una afección" se dirige a administrar una composición, que incluye al menos un agente, eficaz para mejorar los síntomas asociados con una enfermedad, para disminuir la gravedad o curar la enfermedad, o para prevenir que aparezca la enfermedad en un sujeto. La administración puede incluir cualquier ruta de administración. En algunos aspectos, la enfermedad es una enfermedad causada o relacionada con la presencia de una p53 mutada en una célula, tejido, órgano, cuerpo y similares. En algunos aspectos, la enfermedad es cáncer. En algunos aspectos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción. En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano. En algunos aspectos, el sujeto es un animal mamífero. En algunos aspectos, el sujeto es un animal no mamífero.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la producción de una molécula de producto final deseada en una célula objetivo. La molécula de producto final puede incluir, por ejemplo, una molécula de ARN; un péptido o una proteína; y similares; o combinaciones de los mismos.

El término "construcción", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o ensamblada artificialmente que puede ser una o más secuencias de ácido nucleico, en donde las secuencias de ácido nucleico pueden comprender secuencias codificantes (es decir, secuencia que codifica un producto final), secuencias reguladoras, secuencias no codificantes, o cualquier combinación de las mismas. El término construcción abarca, por ejemplo, vector, pero no debe verse como limitado al mismo.

"Vector de expresión" se refiere a vectores que tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ácido nucleico heterólogo (tales como, por ejemplo, ADN), en una célula extraña. En otras palabras, un vector de expresión comprende secuencias/fragmentos de ácido nucleico (tales como ADN, ARNm, ARNt, ARNr), capaces de transcribirse. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas son conocidos y/o están disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Las expresiones "secuencia arriba" y "secuencia abajo", como se usan en el presente documento, se refieren a una posición relativa en una secuencia de nucleótidos, tal como, por ejemplo, una secuencia de ADN o una secuencia de ARN. Como es bien sabido, una secuencia de nucleótidos tiene un extremo 5' y un extremo 3', llamados así por los carbonos en el anillo de azúcar (desoxirribosa o ribosa) de la cadena principal de nucleótidos. Por lo tanto, en relación con la posición en la secuencia de nucleótidos, la expresión secuencia abajo se refiere a la región hacia el extremo 3' de la secuencia. La expresión secuencia arriba se refiere a la región hacia el extremo 5' de la cadena.

Como se usa en el presente documento, los términos "introducción", "transfección" o "transfectar" e "infección" o "infectar" se pueden usar indistintamente y se refieren a la transferencia de moléculas, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos, moléculas de polinucleótidos, vectores y similares en una(s) célula(s) objetivo, y más específicamente en el interior de un espacio cerrado por membrana de una(s) célula(s) objetivo. Las moléculas pueden "introducirse" en la(s) célula(s) objetivo(s) por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como lo enseñan Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001). Los medios para "introducir" moléculas en una célula incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a: choque térmico, transfección con fosfato de calcio, transfección con PEI, electroporación, lipofección, agente(s) de transfección, transferencia mediada por virus y similares, o combinaciones de los mismos. La transfección de la célula puede realizarse en cualquier tipo de célula, de cualquier origen.

Como se menciona en el presente documento, la expresión "gen exógeno" se dirige a un gen (o cualquier parte del mismo) que se introduce desde el exterior a una célula. En algunos aspectos, el gen exógeno se inserta en forma de un polinucleótido (por ejemplo, ADN, ARN y similares). En algunos aspectos, el gen exógeno es capaz de expresarse en la célula. En algunos aspectos, el gen exógeno se sobreexpresa dentro de la célula.

Tal como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" en referencia a un valor numérico indicado en el presente documento debe entenderse como el valor indicado /- 10%.

En algunos aspectos, el péptido reactivador puede reactivar una Mut-p53 para que tenga propiedades estructurales, propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y/o propiedades funcionales similares o idénticas a una proteína p53WT.

De acuerdo con algunos aspectos, se proporcionan péptidos reactivadores de Mut-p53, en donde los péptidos tienen una longitud de aproximadamente 3-25 aminoácidos. En algunos aspectos, los péptidos reactivadores de Mut-p53 tienen una longitud de aproximadamente 4-15 aminoácidos. En algunos aspectos, los péptidos reactivadores de Mutp53 tienen una longitud de aproximadamente 7-12 aminoácidos. En algunos aspectos, los péptidos reactivadores de Mut-p53 tienen una longitud de 7 aminoácidos. En algunos aspectos, los péptidos reactivadores de Mut-p53 tienen una longitud de 12 aminoácidos. Cada posibilidad representa un aspecto separado de la descripción.

En algunos aspectos, se proporciona un péptido reactivador de Mut-p53 que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica por cualquiera de las secuencias de péptidos en las Tablas 6, 7 u 8, en el presente documento a continuación.

Según algunos aspectos, un péptido reactivador de Mut-p53 puede afectar a Mut-p53 de manera que puede transactivar un gen indicador (tal como de Luciferasa) que tiene el elemento de unión a p53 WT en su promotor. En algunos aspectos, la transactivación del gen indicador puede realizarse in vitro (por ejemplo, en un tubo de ensayo o pocillo), o in vivo en una célula, que alberga la construcción del gen indicador.

Según algunos aspectos, un péptido reactivador de Mut-p53 puede unirse al dominio de unión al ADN (DBD) de un p53 mutado. En algunos aspectos, el p53 mutado alberga una mutación en su dominio de unión al ADN (DBD).

En algunos aspectos, el cáncer es carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, tumor cerebral, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumores pineales, glioma hipotalámico, cáncer de mama, tumor carcinoide, carcinoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de conducto biliar extrahepático, tumores de la familia de sarcomas de Ewing (pnet), tumor extracraneal de células germinales, cáncer ocular, melanoma intraocular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, extragonadal, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hipofaringe, carcinoma de células de los islotes, cáncer de laringe, leucemia, linfoblástica aguda, leucemia, cáncer de cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, de células pequeñas, linfoma, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma del sistema nervioso central (primario), linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mesotelioma maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, carcinoma escamoso metastásico, mieloma múltiple, neoplasias de células plasmáticas, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario, de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas exocrino, carcinoma de células de los islotes, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de feocromocitoma, cáncer pituitario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sézary, cáncer de piel, linfoma cutáneo de células T, cáncer de piel, sarcoma de kaposi, cáncer de piel, melanoma, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de tejidos blandos, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides maligno, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma, cáncer inusual de la infancia, cáncer vaginal, cáncer de vulva o tumor de Wilms.

En algunos aspectos, el cáncer es un tumor no sólido, como el cáncer de la sangre. En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia o linfoma. En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia linfoblástica aguda (ALL). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia mielógena aguda (AML). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia linfocítica crónica (CLL). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es el linfoma linfocítico pequeño (SLL). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia mieloide crónica (CML). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia monocítica aguda (AMOL). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre son los linfomas de Hodgkin (cualquiera de los cuatro subtipos). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre son los linfomas no Hodgkin (cualquiera de los subtipos). En otro aspecto, un tumor no sólido o cáncer de la sangre es la leucemia mieloide.

Para usar en los métodos de la descripción, los péptidos reactivadores pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos, estabilizantes o excipientes (vehículos) farmacéuticamente aceptables para formar una composición farmacéutica como se conoce en la técnica, en particular con respecto a agentes activos proteicos. El(los) vehículo(s) son "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Los vehículos adecuados incluyen típicamente solución salina fisiológica o polioles de etanol tales como glicerol o propilenglicol.

Los péptidos reactivadores pueden formularse como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como los ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales como ácidos orgánicos como el acético, oxálico, tartárico y maleico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse a partir de bases inorgánicas tales como sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina y procaína.

Las composiciones pueden formularse adecuadamente para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal y comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles de los péptidos reactivadores, que son preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor. Dichas formulaciones se preparan típicamente disolviendo el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tales como cloruro de sodio, glicina y similares, y que tienen un pH tamponado compatible con condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa, y volviendo estéril dicha solución. Estas pueden prepararse en envases unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados.

Las composiciones pueden incorporar un estabilizante, tal como, por ejemplo, polietilenglicol, proteínas, sacáridos (por ejemplo, trehalosa), aminoácidos, ácidos inorgánicos y sus mezclas. Los estabilizantes se usan en soluciones acuosas a la concentración y pH apropiados. El pH de la solución acuosa se ajusta para estar dentro del intervalo de 5.0-9.0, preferiblemente dentro del intervalo de 6-8. Al formular los péptidos reactivadores, se puede usar un agente antiadsorción. Otros excipientes adecuados pueden incluir típicamente un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Las composiciones pueden formularse como preparaciones de liberación controlada que pueden lograrse mediante el uso de polímero para formar complejos o absorber las proteínas. Los polímeros apropiados para formulaciones de liberación controlada incluyen, por ejemplo, poliéster, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etileno-acetato de vinilo y metilcelulosa. Otro posible método para la liberación controlada es incorporar los péptidos reactivadores en partículas de un material polimérico, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de etileno y acetato de vinilo. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes en partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas de suministro de fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en macroemulsiones.

En algunos aspectos, los péptidos reactivadores de la descripción pueden formularse en composiciones perorales u orales y, en algunos aspectos, comprenden soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones y similares. En algunos aspectos, los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de dichas composiciones son bien conocidos en la técnica. En algunos aspectos, las composiciones orales líquidas comprenden de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.9% de péptidos reactivadores, o en otro aspecto, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 10%.

En algunos aspectos, las composiciones para usar en los métodos de esta descripción comprenden soluciones o emulsiones, que en algunos aspectos son soluciones o emulsiones acuosas que comprenden una cantidad segura y efectiva de un péptido reactivador y opcionalmente, otros compuestos, destinados a la administración intranasal tópica.

En algunos aspectos, las soluciones inyectables de la descripción se formulan en soluciones acuosas. En un aspecto, las soluciones inyectables de la descripción se formulan en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, solución de Ringer o tampón de sal fisiológico. En algunos aspectos, para la administración transmucosa, se usan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera a atravesar. Dichos agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica.

En un aspecto, las preparaciones descritas en el presente documento están formuladas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. En algunos aspectos, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en envases multidosis opcionalmente con un conservante añadido. En algunos aspectos, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Los péptidos reactivadores de la descripción pueden administrarse por cualquier vía de administración adecuada, seleccionada de administración oral, tópica, transdérmica o parenteral. Según algunos aspectos, la vía de administración es por aplicación tópica seleccionada de dérmica, vaginal, rectal, inhalación, intranasal, ocular, auricular y bucal. Según algunos aspectos, la vía de administración es por inyección parenteral. En varios aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo por una ruta parenteral seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraarterial, intracerebral, intracerebroventricular, intraósea e intratecal. Por ejemplo, los péptidos reactivadores pueden administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por rutas parenterales, tales como ruta intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.), subcutánea o intramuscular. Los péptidos reactivadores de la descripción y/o cualquier agente adicional opcional pueden administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por administración intranasal. Los péptidos reactivadores de la descripción y/o cualquier agente adicional opcional pueden administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por administración oral, usando composiciones o formulaciones específicas capaces de proporcionar biodisponibilidad oral a proteínas. Los péptidos reactivadores de la descripción y/o cualquier agente adicional opcional pueden administrarse localmente.

Los péptidos reactivadores pueden administrarse en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso del sujeto, comúnmente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg/kg, y a menudo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg. En algunos casos, puede ser ventajoso administrar una dosis de carga grande seguida de dosis de mantenimiento periódicas (p. ej., semanales) durante el período de tratamiento. Los péptidos reactivadores también pueden administrarse por sistemas de suministro de liberación lenta, bombas y otros sistemas de suministro conocidos para infusión continua. Las pautas posológicas se pueden variar para proporcionar los niveles circulantes deseados de péptidos reactivadores particulares basado en su farmacocinética. Por lo tanto, las dosis se calculan de manera que se mantenga el nivel circulante deseado de agente terapéutico.

Típicamente, la dosis efectiva está determinada por la actividad de los péptidos reactivadores y la afección del sujeto, así como el peso corporal o el área de superficie del sujeto a tratar. El tamaño de la dosis y la pauta posológica también están determinados por la existencia, naturaleza y alcance de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de los péptidos reactivadores en el sujeto particular.

En algunos aspectos, se proporciona un kit para tratar o prevenir una afección relacionada con p53. En algunos aspectos, el kit comprende un recipiente (tal como un vial) que comprende un péptido reactivador de Mut-p53 en un tampón adecuado e instrucciones de uso para la administración del péptido reactivador.

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente ciertos aspectos de la descripción. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la descripción. Un experto en la materia puede idear fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios descritos en el presente documento sin apartarse del alcance de la descripción.

Ejemplos

Materiales y métodos

Purificación de proteínas recombinantes de longitud completa (FL) de células sf9: p53 mutante R249S, p53 mutante R175H y p53WT:

2x107 células sf9 en la fase logarítmica se cultivaron en nueve matraces de 175 cm2 que contenían 25 ml de medio y se incubaron durante la noche a 27°C. Se añadieron baculovirus que contenían una p53 recombinante en cada matraz y se incubaron durante 72 horas. Las células se rasparon de los matraces y se centrifugaron a 4°C (3200 g durante 5 minutos), se separó el medio y el sedimento celular se lavó dos veces con tampón isotónico helado (Na2HPÜ410 mM, pH 7.2, NaCl 130 mM, DTPA - ácido dietilentriaminopentaacético 1 mM). Para lisar las células, las células se resuspendieron en 50 ml de tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, sacarosa al 12%, EGTA 2 mM, Pm Sf 2 mM, DTT 5 mM) con Tritón X-100 al 0-2% mediante inversión suave. Los núcleos se centrifugaron a 5600G durante 8 minutos y se retiró el líquido sobrenadante. Los núcleos se lisaron añadiendo 20 ml de tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, sacarosa al 12%, EGTA 2 mM, PMSF 2 mM, DTT 10 mM inhibidores de proteasa) con NaCl 0.5 M y se agitaron vigorosamente y se incubaron durante 20 min en hielo. El lisado nuclear se transfirió a tubos de ultracentrífuga y se centrifugó a 100000g durante 60 minutos a 4°C. El líquido sobrenadante se eliminó y se diluyó con Tampón B hasta una concentración final de NaCl 0.04 M , luego se centrifugó a 20000g durante 5 min a 4°C. El lisado nuclear se cargó en una columna de intercambio iónico Hitrap Q FF (flujo rápido) (Amersham Pharmacia) de 5 ml, se lavó previamente con 50 ml de tampón A. Luego, la columna se lavó con tampones que contenían mayores concentraciones de sal para eluir la proteína. Por ejemplo, en el caso de p53 mutante R249S, la proteína eluyó de la columna de intercambio iónico con NaCl ~ 150 mM. La proteína se purificó adicionalmente por cromatografía de filtración en gel usando una columna preparativa Superdex 75 (Amersham Pharmacia Biotech), preequilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 6.1, NaCl 150 mM, ZnCl² 10 pM y DTT 10 mM. Las fracciones que contenían proteína purificada se agruparon y se concentraron a 6-7 mg/ml, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -80°C. Las fracciones obtenidas después de cada etapa de purificación se analizaron por transferencia en mancha (dot-blof) para detectar la presencia de p53 mutante y posteriormente en SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie para verificar la pureza de las fracciones.

ELISA tipo sándwich

Se recubrieron placas de 96 pocillos utilizando 3 anticuerpos diferentes (1 tipo de anticuerpo (Ab) en cada pocillo): PAb421 reconoce ambas conformaciones de p53 y se une a un epítopo C-terminal; PAb240 reconoce la conformación mutante de p53, se une al epítopo dentro del dominio central (aminoácidos 212-217) (Stephen, C.W. y D.P. Lane, Mutant conformation o f p53. Precise epitope mapping using a filamentous phage epitope library. J. Mol. B io i, 1992.

225 (3): pág. 577-83) que es accesible al Ab cuando la proteína está parcialmente desnaturalizada (por ejemplo, cuando el DBD está mutado); y PAb1620, que reconoce la conformación WT de p53, se une al epítopo en el dominio central (aa 156, 206-210), formado cuando el plegamiento está en conformación WT (Wang, P.L., F. Sait y G. Winter, The ’wild type’ conformation of p53: epitope mapping using hybridproteins. Oncogene, 2001.20 (18): pág. 2318-24).

Los pocillos se incubaron durante la noche (ON) con 100 pl de Ab (5 pg/ml) a temperatura ambiente (TA). El líquido se desechó y los pocillos se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), 200 pl por cada lavado. A continuación, se realizó el bloqueo con 200 pl de albúmina de suero bovino al 5% (BSA) diluido en PBS en cada pocillo durante 1.5 horas a temperatura ambiente (TA). Se descartó el tampón de bloqueo, seguido de 3 lavados en PBS como se ha descrito anteriormente. Se incubaron muestras de proteínas p53 mutantes y WT (100 pl, 10 pg/ml), junto con péptidos de control pCAP-710 (LPNPPER, SEQ ID NO: 340) y pCAP-1220 (FRSFAlPLVVPF, SEQ ID NO: 368) (5 pg/ml, Sigma Aldrich, o con los péptidos de ensayo 1-153 (5 pg/ml), durante 1.5 horas juntos, y luego se añadieron a los pocillos. Las muestras se rotaron y se incubaron durante 1 hora a TA. Las muestras se descartaron, después de 4 lavados como se ha descrito anteriormente utilizando solución salina tamponada con trifosfato (TPBS). A continuación, se añadió anticuerpo de estreptavidina-p53 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (10 pg/ml HAF1355 (R&D)) a los pocillos y se incubaron a TA durante 1 hora. Después de lavar la placa 3 veces en TPBS, se añadió solución de sustrato TMB (50 pl a cada pocillo, Thermo, (N° Cat. ES001-1L-K)) y se incubó a 37°C durante 20 minutos. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 M (50 pl). La absorbancia se midió a 450 nm con un espectrofotómetro. La concentración de proteína se determinó dividiendo las absorbancias de cada muestra entre la absorbancia de las muestras de Ab 421.

Ensayo de unión de ADN

Para estos experimentos, se usó un kit de unión de p53/ADN comercial de "R&D" (Cat-DYC1355-5 Lote-1273366FA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, placas de 96 pocillos se recubrieron con anticuerpo antip53 durante la noche. Los extractos celulares que contienen p53 se hacen reaccionar con un oligonucleótido que contiene un sitio de unión consenso de p53 (proporcionado en el kit), marcado con biotina, en presencia o ausencia (NT) de péptidos de ensayo. Se espera que p53 WT se una a este sitio de unión de ADN, así como al anticuerpo que recubre los pocillos de ensayo de la placa. El exceso de p53 y oligonucleótidos se separaron por lavado y se usó estreptavidina-HRP para cuantificar la cantidad de oligonucleótidos en el pocillo, que es proporcional al ADN unido por p53. Se realizó un ensayo de TMB para determinar los niveles de HRP (ES001 -1L-K) (450 nm).

Ensayo de cristal violeta

Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos con 2500-4000 células/pocillo en 0.1 ml y se incubaron durante la noche a 37°C con el fin de que se adhirieran a la placa. Se añadieron diluciones seriadas de diferentes péptidos (0.5 pg/ml) en partes alícuotas de 0.1 ml y las placas se incubaron durante 48 h adicionales a 37°C. Luego se separó el medio y se determinó la lisis celular tiñendo las células con cristal violeta (0.5%) en metanol/agua (1:4, v/v), 50 pl cada pocillo, durante 10 minutos, seguido de 3 lavados con PBS. Posteriormente, se añadió ácido acético al 10% (50 pl) a cada pocillo y se agitó durante 10 min. Luego, se realizó la lectura automática de placas a 595 nm.

Inmunofluorescencia

Las células se cultivaron en cubreobjetos durante la noche y luego se trataron con péptidos usando transfección con X-fect. Después de 2 horas de recuperación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente seguido de 3 lavados (PBS). Las muestras se permeabilizaron con Tritón al 0.1% (BSA al 1% en PBS) durante 10 min a TA seguido de bloqueo (3 lavados de BSA al 0.5% en PBS), 5 minutos cada lavado. Luego, las células se detectaron con un anticuerpo de ratón anti-p53 (DO-1) diluido 1:500 durante 1.5 horas, seguido de bloqueo (3 lavados de BSA al 0.5% en PBS), 5 minutos cada lavado. Luego, las células se detectaron con anticuerpo de cabra anti-Cy3 de ratón diluido 1:600 y DAPI diluido 1:1000 durante 45 minutos. Las muestras se montaron con Elvanol.

Ensayo de luciferasa

Construcción de construcciones de luciferasa

El oligonucleótido (RGC-W) que tiene la secuencia 5'-TCGAGTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTTTC-3' (SEQ ID NO: 362), y el oligonucleótido mutante oligonucleótido RGC (RGC-M) que tiene la secuencia 5'-TCGAGTTTAATGGACTTTAATGGCCTTTAATTTTC-3' (SEQ ID NO: 363), se obtienen ambos de Kern et al. (Kern, S.E., et al., Identification o f p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science, 1991. 252 (5013): pág. 1708­ 11), y sirven como sitios de unión consenso para p53 WT.

Estos motivos se clonaron en los sitios KPN y Eco53IK en el vector pCLuc Mini-TK 2 (NEB, N° Cat. N0324S). La construcción de Luciferasa se utilizó para evaluar la activación transcripcional de p53 en las células de ensayo.

Análisis de ChIP

Brevemente, los clones se entrecruzaron con formaldehído (concentración final al 1%) a temperatura ambiente durante 10 min. El formaldehído se neutralizó con glicina 2.5 M (concentración final 0.25 M) durante 5 min. Las células se lavaron secuencialmente con 1 ml de PBS enfriado con hielo, tampón I (Tritón X-100 al 0.25%, EDTA 10 mM, EGTA 0.5 mM, HEPES 10 mM, pH 6.5) y tampón II (NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0.5 mM, HEpES 10 mM, pH 6.5) y se recogieron por raspado. Luego, las células se resuspendieron en 0.3 ml de tampón de lisis (SDS al 1%, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8.1, 1X cóctel inhibidor de proteasa (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN) y se sonicaron 10 veces (20 s "encendido" seguido de 40 s "apagado") en el ajuste máximo (Biorupter, Diagenode, NY) seguido de centrifugación durante 10 minutos en hielo para producir fragmentos de 200-500 pb. Los líquidos sobrenadantes se recogieron y diluyeron 10 veces en el tampón de dilución de ChIP (Tritón X -100 al 1%, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8.1) seguido de inmuno-eliminación con 40 |ul de proteína A-sepharose prebloqueada (Santa Cruz Biotech) con 2 |ug de ADN de esperma de salmón fraccionado y pre-inmunosuero (1 |jg de suero de conejo con 10 j l de BSA 100 mg/ml durante 2 horas a 4°C. Se retuvo una muestra para la preparación de la muestra de entrada.

La inmunoprecipitación se llevó a cabo durante la noche a 4°C con anticuerpos específicos obtenidos. Después de la inmunoprecipitación, se añadieron 40 |ul de proteína A-Sepharose (prebloqueada con ADN de esperma de salmón) y se incubaron adicionalmente durante otra hora. Los precipitados se lavaron secuencialmente durante 10 min cada uno en TSE I (SDS al 0.1%, Tritón X-100 al 1%, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8.1, NaCl 150 mM), TSE II (SDS al 0.1%, Tritón X-100 al 1%, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8.1, NaCl 500 mM) y tampón III (LiCl 0.25 M, NP-40 al 1%, desoxicolato al 1%, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8.1). Los precipitados después se lavaron tres veces con tampón TE y se extrajeron dos veces con SDS al 1%, NaHCO30.1 M. Los eluatos se agruparon y calentaron a 65°C durante un mínimo de 6 horas a toda la noche para revertir la reticulación de formaldehído. Los fragmentos de ADN se purificaron con un kit QIAquick Spin (Qiagen, CA). Las reacciones de inmunoprecipitación se llevaron a cabo por triplicado utilizando perlas solo como control no específico. El análisis cuantitativo de las marcas de histonas activas y represivas en los productos de ChIP de los clones se evaluó por PCR cuantitativa en tiempo real. Con el fin de normalizar la eficacia de la inmunoprecipitación (IP), la normalización de la cromatina IP se realizó utilizando cebadores específicos para la región promotora de necdina y la región 5' (que corresponde a una región de cromatina represiva).

Cultivo celular y ensayos de indicador luciferasa

Se cultivaron células nulas para p53 H1299 durante la noche y luego se transfectaron con las construcciones de luciferasa usando el agente de transfección MaxFect (Mediatech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Antes de la transfección, el medio celular se intercambió a OPTI-MEM.

Las células se trataron con diferentes péptidos 24 horas después de la transfección. Después de 24 horas adicionales, el medio de crecimiento se recogió en placas negras 96: 40 |ul para el análisis de CLuc y 20 |ul para el análisis de GLuc. El ensayo se realizó con microplaca Modulus de Turner BioSystems. El valor se calculó por CLuc/gLuc/NT (células no tratadas).

RT-PCR

El ARN se obtuvo usando el kit Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II en el sedimento de células de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se transcribieron inversamente partes alícuotas de 0.4-1 |ug usando Bio-RT 2000 (Bio-Lab) y cebadores hexámeros aleatorios. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) se realizó en un instrumento ABI 7300 (Applied Biosystems) utilizando PerfeCTa SYBR Green FastMix ROX (Quanta). Los cebadores de RT-PCR utilizados se presentan en la Tabla 1 (las secuencias de cebadores se presentan de 5' a 3').

Biblioteca de presentación en fagos

La biblioteca de presentación en fagos utilizada eran bibliotecas de fagos disponibles comercialmente, generadas por New England Biolabs (NEB). Una biblioteca es de heptapéptidos lineales (PhD-7), la otra biblioteca es de dodecapéptidos lineales (PhD-12) (N° Cat.: PhD-7, E8100S; PhD-12, E8110S). Las secuencias peptídicas aleatorizadas en ambas bibliotecas se expresan en el extremo N de la proteína de recubrimiento menor pIII, dando como resultado una valencia de 5 copias del péptido presentado por virión. Todas las bibliotecas contienen una secuencia conectora corta entre el péptido presentado y pIII.

Secuenciación profunda

Antes de la secuenciación, se llevó a cabo una reacción de PCR con cebadores que flanquean las bibliotecas insertadas Directo-5'-NNNNNNNNCATGGAAAGATAGTG (SEQ ID NO: 364) e Inverso-5'-NNNNNNNCCTAAAACGATTTGTG (SEQ ID NO: 365), las primeras 8 bases de cada cebador están aleatorizadas y se incorporaron como una mezcla de las cuatro bases. La aleatorización de las primeras bases se introdujo ya que el equipo de secuencia de Solexa es incapaz de secuenciar secuencias repetitivas durante los primeros ciclos. La reacción de PCR produjo ADN en la cantidad requerida de 5 pg y longitud (aproximadamente 120 pb) que incluye los cebadores flanqueadores y la biblioteca de péptidos clonados para la secuenciación profunda de Solexa.

Ejemplo 1: Calibración de condiciones experimentales.

Elegir una fuente de proteína p53

Cuando se elige la fuente de proteínas para la selección de presentación en fagos, se tienen en cuenta varias consideraciones; se recomienda el uso de proteínas purificadas ya que la interacción de clones de fagos con diferentes proteínas en solución puede dar lugar a péptidos falsos positivos inespecíficos. La proteína p53 de longitud completa humana purificada de células SF9 (véase más arriba), se usó en los siguientes experimentos (número de acceso CG3336). Por lo tanto, se usó un sistema de expresión de p53 en la línea celular de insecto SF9 infectada por baculovirus (como se detalla anteriormente). Una ventaja importante de p53 expresada en este sistema es que ya contiene modificaciones postraduccionales.

Conformación de las proteínas p53 WT y Mut-p53 expresadas por Baculovirus

Los experimentos iniciales con el Baculo-p53 se realizaron utilizando los lisados de extractos nucleares de células Sf9 que expresaban p53WT, un p53 mutante de longitud completa de punto caliente (R175H) o p53 mutante sensible a la temperatura (ts) (V143A). Las células SF9 se infectaron con virus que llevaban uno de los tres vectores de expresión.

48 horas después de infección, se recogieron las células, se extrajeron los núcleos y los extractos se sometieron a inmunoprecipitación con: PAb1620, PAb240, ASPP2 (también denominado (P53-BP2)) y/o Bcl2 durante 3 horas a 4°C. El p53 inmunoprecipitado se detectó por transferencia Western usando el ap53-HRp Ab (N° Cat HAF1355 (R&D)). Los resultados de este experimento IP-Western se muestran en la Figura 2. Como se puede ver, tanto p53 mutante sensible a la temperatura (ts) V143A (4°C) como p53 WT se unen bien al anticuerpo pAb1620, pero no al PAb240. Por otro lado, el p53 mutante R175H presenta una unión más fuerte a PAb240 que a PAb1620. Esto sugiere que el p53 mutante expresado en Baculo R175H asume una conformación que es un intermediario entre el p53 mutante y el tipo natural. Bcl2 no presenta unión a ninguna de las formas de p53, mientras que ASPP2 (P53-BP2) se une a todas las formas de p53 con aproximadamente la misma afinidad. Por lo tanto, se concluye que ASPP2 y Bcl2 no pueden usarse como marcadores de conformación de p53 en estas condiciones experimentales.

Calibración de las condiciones de solución.

Con el fin de reducir la unión residual relativamente alta de p53 mutante R175H al PAb1620 y mejorar la unión de p53 WT a ese anticuerpo, se realizó un ajuste fino de las condiciones del ensayo. Los resultados se muestran en la Figura 3, que muestra una transferencia de p53 mutante (R175H) purificado y p53 WT, extraído de núcleos de células Sf9 infectadas con el baculovirus correspondiente (como se describió anteriormente). El p53 purificado se disolvió en los tampones especificados (A-Tris-50 mM; B-Tris, NaCl 150 mM; C-Tris, NaCl, Tritón al 0.5%; D-Tris, Glicina al 0.5%; E-Na4O7P2 40 mM; F-GndCl 400 mM; G-GndCl 800 mM; H-Urea 1 M; I-Urea 3 M; Tampón IP-IP) y luego se inmunoprecipitó con PAb1620 y PAb240 durante 3 horas a 4°C y se sometió a transferencia Western usando el ap53-HRP-Ab. Como se puede ver, la solución (A) contiene solo Tris 50 mM. En esta solución, la unión de p53 mutante R175H a PAb1620 es solo de aproximadamente 5% en comparación con la unión a PAb240. La adición de NaCl 150 mM (B), NaCl 150 mM Tritón al 0.5% (C) o glicina al 0.5% (D) mejoró la unión del mutante R175H a PAb1620. La urea 3 M (I) redujo la unión de p53 mutante R175H a PAb1620, probablemente al causar la desnaturalización de la proteína. Una concentración más baja de urea, 1 M (H), aumentó la unión del p53 mutante R175H (R175H p53) a PAb1620. Na4O7P240 mM (E) redujo la unión de p53 R175H a PAb1620 al nivel más bajo. Finalmente, en el tampón de IP, el p53 R175H permaneció negativo para PAb1620; sin embargo, en este tampón, p53 WT mostró una fuerte unión a PAb 240 y una unión reducida a PAb1620, lo que sugiere que el tampón IP causa un leve plegamiento de la forma WT. Por lo tanto, el tampón que contiene Tris solo se usa para otros experimentos.

Ejemplo 2: Cribado inicial de la biblioteca de presentación en fagos y selección de péptidos reactivadores de Mut-p53

Se llevó a cabo inicialmente un cribado de presentación en fagos, usando la proteína p53 R175H, una única biblioteca de fagos phd-12 (NEB, N° Cat. E8110S) y selección con anticuerpo PAb1620. Se hicieron reaccionar 200 ng de p53 R175H con 1011 fagos durante 1 hora para permitir la unión de los péptidos presentados del fago al Mut-p53 (R175H). A continuación, se añadieron perlas reticuladas con PAb1620 durante 1 hora adicional para inmunoprecipitar todo el complejo. Este procedimiento de selección por pasos se repitió durante tres rondas, aumentando la rigurosidad de la selección después de cada ronda reduciendo la cantidad de Mut-p53 incubada: 1at ronda 200 ng, 2a ronda 100 ng y 3" ronda 50 ng. Los fagos se eluyeron usando DBD de p53 WT purificado, en una concentración de 2 pg/ml (se subclonó DBD de p53 (restos 94-293) en pET-27b (Novagen)). El plásmido se transformó en la cepa de E. coli BL21 (DE3). La producción de proteínas se realizó siguiendo un procedimiento descrito para el DBD de p53 de ratón (Suad, O., et al., Structural basis o f restoring sequence-specific DNA binding and transactivation to mutant p53 by suppressor mutations. J Mol. Biol., 2009. 385 (1): pág. 249-65). Después de cada ronda de selección, se llevó a cabo la titulación del fago eluido, para obtener una estimación del número de fagos seleccionados (Tabla 2). Los fagos eluidos se amplificaron infectando E. coli, para producir aproximadamente 1013 fagos para selección en la siguiente ronda. A partir de la segunda ronda de selección por pasos, se llevó a cabo un experimento de selección por pasos de control solo con PAb1620 (sin incubación con Mut-p53); este título es indicativo de la especificidad de la selección por pasos.

Como se ve en la Tabla 2, se obtuvieron 100 partículas de fagos infecciosos/pl en la primera ronda de selección y valores de enriquecimiento típicos entre las rondas de selección, dando lugar a un mayor enriquecimiento en las primeras dos rondas y luego alcanzando una meseta en la tercera y cuarta selecciones. Sin embargo, el número de fagos eluidos tanto en las reacciones de selección por pasos específicas de selección como en las reacciones de selección por pasos de control de PAb1620 no específicas fue similar. Dicho enriquecimiento sugiere que el fago puede unirse directamente al PAb1620 y no a través de la interacción con el p53 R175H objetivo.

Con el fin de reducir el valor de fondo (unión no específica), se introdujeron etapas adicionales de pre-eliminación y tiempo creciente de pre-eliminación; sin embargo, la proporción de unión de fondo se mantuvo alta. Por lo tanto, se implementaron etapas de selección alternas durante el proceso de presentación en fagos, con el fin de reducir la unión de fondo. Con este objetivo, se realizaron diferentes estrategias de selección en cada ronda de selección, mientras se intentaba minimizar los elementos no específicos comunes en el sistema experimental (y, por lo tanto, se reducía la unión a esos elementos no específicos).

Dado que se supone que un requisito previo del cambio conformacional de p53 es la unión de un péptido a p53, se introdujo una etapa de selección adicional para la unión de p53 WT entre las selecciones de PAb1620. Se planteó la hipótesis de que, dado que PAb1620 no estaría presente en la segunda ronda de selección por pasos, se eliminaría el fago que se une directamente a él. Además, dado que un requisito previo de cualquier péptido funcional es la unión a p53, se espera que los péptidos que se unen preferentemente a la forma WT estabilicen esta conformación. La primera y la tercera ronda de la selección por pasos eran similares al experimento anterior. Sin embargo, en la segunda ronda de selección, se realizó una selección para la unión del fago para WT-p53 (marcado con His), y el complejo p53/fago se inmunoprecipitó usando perlas de níquel (que se unen al marcador His). El título del fago eluido se evaluó después de cada ronda de selección. Como se muestra en la Tabla 3, se logró un enriquecimiento de 10 veces en la elución del fago cuando se comparaba el segundo ciclo con el primero. Aunque esto puede considerarse un poco bajo para los estándares de presentación en fagos, la razón de este enriquecimiento relativamente bajo es probablemente el uso de diferentes estrategias de selección en cada ronda de selección por pasos, lo que aumenta la especificidad, pero, por otro lado, reduce el rendimiento general del fago seleccionado. El enriquecimiento de la segunda ronda de selección a la tercera era del orden de 100 veces, lo que indica un aumento marcado en el enriquecimiento de fagos, en comparación con el factor anterior de 10. Este aumento marcado se debe a la selección repetida de PAb1620. Es importante destacar que el número de fagos después de la tercera ronda era del orden de 105, mientras que con el PAb1620 de control era 4x103. Por lo tanto, el control no específico (es decir, el fondo) constituye solo aproximadamente 5% del fago total seleccionado.

Ejemplo 3: Método para el cribado e identificación de péptidos reactivadores de Mut-p53.

Con el fin de cribar, identificar y aislar péptidos reactivadores de p53 específicos, se diseñó y se llevó a cabo un método que utiliza una combinación de estrategias de selección diferentes y complementarias.

En este ejemplo, se combinaron tres estrategias de selección. La primera estrategia de selección se basa en la reactividad con PAb1620, como se describió anteriormente. La segunda estrategia de selección se basa en la unión de p53 WT a su motivo de secuencia de ADN consenso: elemento de respuesta de p53 (p53-RE). La unión de p53 a su ADN consenso in vitro ha sido ampliamente demostrada [Joerger, A.C., M.D. Allen y A.R. Fersht, Crystalstructure of a superstable mutant o f human p53 core domain. Insights into the mechanism of rescuing oncogenic mutations. J Biol Chem, 2004. 279 (2): pág. 1291-6). En consecuencia, se diseñaron dos oligonucleótidos complementarios para producir ADNbc (después de reasociación). Estos oligonucleótidos contienen dos copias en tándem de una secuencia consenso de p53-RE: una secuencia consenso es el sitio de unión consenso perfecto, deducido de los experimentos de unión (AGACATGCCCAGACATGTCC (SEQ ID NO: 339)) y la otra secuencia es un sitio de unión de ADN de p53, derivado del promotor p21 (GAACATGTCCCAACATGTTG (SeQ ID NO: 340)), que se encuentra secuencia abajo de la primera secuencia consenso (Figura 4). Además, se introdujeron dos sitios de enzimas de restricción (HindIII (AAGCTT (SEQ ID NO: 341)) y EcoRI (GAATTC (SEQ ID NO: 342)), que permiten una etapa de elución más específica después de la selección. Una cadena de oligonucleótido también se marcó con biotina, para permitir la inmunoprecipitación del complejo ADN/p53/fago con perlas recubiertas de estreptavidina. La Figura 4 muestra una secuencia esquemática del oligonucleótido p53-RE y los elementos de secuencia del mismo. La secuencia del oligonucleótido de la cadena superior es:

Biotina-5 '-

CT GCT GA AGCTTCGA ATT CCJA GA CA TGCCCA GA CA TGTCCX ACT GCT GCT GCT GC

TGCTGCTGC GAA CA TGTCCCAA CA rG7TGCTGCTGCTGCTGCTG-3 ’ (SEQ ID

NO:361).

En un procedimiento de selección llevado a cabo usando la estrategia de unión al ADN (como se detalla a continuación), se hicieron reaccionar 0.5-3 pmoles del oligonucleótido biotina-p53-RE con 200 ng de p53 WT purificado durante 1 hora para permitir la unión. Después se introdujeron 1010 fagos de las bibliotecas de fagos PhD-7 o PhD-12 durante una hora adicional. A continuación, se añadieron perlas de agarosa recubiertas con estreptavidina durante 30 minutos. Luego se realizaron 5-12 etapas de lavado, seguidas de la elución llevada a cabo añadiendo las enzimas de restricción o un exceso de ADN no biotinilado durante 30 minutos. Estas precauciones reducirían la selección de la unión del fago al ADN, biotina y estreptavidina.

La tercera estrategia de selección se basa en el antígeno T grande de SV40 (LT). La unión entre p53 y LT SV40 se considera que es muy fuerte. Por lo tanto, p53 tiene que plegarse correctamente para formar la plataforma del epítopo de unión a LT SV40. Con este objetivo, células Sf9 se infectaron con baculovirus que codifica LT SV40. Las células se lisaron y el LT SV40 se aisló usando perlas de proteína A reticuladas con PAb 419 (anticuerpo específico para LT SV40, (Abcam-ab1684)). Las perlas se lavaron varias veces y luego se usaron para las selecciones de presentación en fagos. El procedimiento de selección por pasos para la unión de LT SV40 era similar a la estrategia basada en la conformación, excepto que en lugar de usar perlas con PAb1620, se usaron perlas con PAb 419-LT SV40 para la selección.

Una combinación de las tres estrategias de selección en rondas alternas produce los mejores resultados, ya que cada ciclo aumenta gradualmente el porcentaje de fagos que albergan los péptidos específicos deseados, al tiempo que reduce el fondo no específico. Una ilustración esquemática del método de identificación y selección se ilustra en las Figuras 1A y 1B.

El cribado de presentación en fagos se llevó a cabo en paralelo con las bibliotecas de péptidos de fagos PhD-7 y PhD-12. Se realizaron ciclos alternos de selección de fagos, usando una plataforma inmovilizada diferente (PAb1620, p53-RE-ADN o LT SV40) en cada etapa. La Tabla 4 muestra las diferentes rutas de selección tomadas para producir bibliotecas de fagos enriquecidas, y especifica los valores de títulos después de cada ronda de selección. Mediante el uso de dichas combinaciones tan diferentes de plataformas de selección (p. ej., PAb1620 seguido de ADN consenso de p53 seguido nuevamente por PAb1620, o LT SV40 seguido de PAb1620 seguido de LT SV40), así como las 2 bibliotecas de fagos diferentes, se obtuvo un panel de sub-bibliotecas que luego se podría comparar después de la secuenciación. Después de 3 ciclos de selección, se obtuvieron más de 60 grupos diferentes (sub-bibliotecas) que contenían una alta proporción de fago reactivador de Mut-p53 (Tabla 4).

Ejemplo 5: Los grupos de fagos seleccionados inducen la unión de Mut-p53 a PAb1620

Para determinar si el método de selección de presentación en fagos como se realizó anteriormente puede enriquecer para fagos que reactivan Mut-p53, se ensayó la capacidad de los grupos de fagos obtenidos después de 3 ciclos de selección para inducir la unión de Mut-p53 R175H de longitud completa (BD Pharmingen, N° Cat. 556439), o las proteínas DBD de p53 R249S recombinantes (249 DBD) para PAb1620. Para reducir el efecto indeseable de los fagos contaminantes que presentan unión directa a PAb1620, se incluyó una etapa de pre-eliminación mediante la cual la grupo de fagos se incubó primero con PAb1620 solamente, antes de añadirlo a la reacción de ensayo. Las perlas reticuladas covalentemente con PAb1620 se incubaron con p53 mutante R175H purificado en presencia de fagos obtenidos por selección de presentación en fagos con Mut-p53 R175H (175) o Mut-p53 R249S (249), ya sea sin o con etapa previa de pre-eliminación realizada por incubación del grupo de fagos con perlas con PAb1620. Los fagos no seleccionados (ns) se usaron como control. La incubación se realizó durante 3 horas a 4°C. El p53 unido se visualizó por análisis de transferencia Western usando anticuerpo contra p53. Como se puede ver en los resultados presentados en la Figura 5, algunos de los grupos de fagos seleccionados indujeron de hecho la unión de Mut-p53 a PAb1620, en comparación con ningún fago o fago de entrada no seleccionado (ns).

Ejemplo 6: Los grupos de fagos seleccionados inducen la unión de Mut-p53 al ADN consenso de p53

Para probar adicionalmente si los grupos de fagos seleccionados pueden facilitar la unión de Mut-p53 al elemento de unión al ADN consenso de p53, oligonucleótidos marcados con biotina correspondientes al elemento de respuesta consenso de p53 (p53-RE) biotina-AGACATGCCCAGACATGTC CTTATAGACATGCCCAGACATGTCC (SEQ ID NO: 366) u oligonucleótidos de control mutados en restos clave cruciales para la unión a p53 (Con-RE biotina-AGAaATGCCCAGA aATGTCCTTATAGAaATGCCCAGAaATGTCC (SEQ ID NO: 367) se inmovilizaron haciendo reaccionar estos oligonucleótidos con perlas recubiertas con estreptavidina. Las perlas con p53-RE o Con-RE se incubaron con DBD de p53 WT o DBD 249 mutante, junto con los grupos de fagos obtenidos después de 3 ciclos de selección. Las perlas recubiertas con estreptavidina unidas a los oligonucleótidos p53-RE-DNA o Con-RE-DNA, marcados con biotina, se incubaron con p53 WT-DBD o p53 mutante R249S-DBD purificados en presencia de fagos obtenidos por selección de presentación en fagos con Mut-p53 R175H (175), clon 27 (LPNPPER, SEQ ID NO: 328) (un solo clon aislado de la selección de R175H), grupos n° 69 y n° 94, seleccionados con WT y Mut-p53 R175H usando combinaciones de T-AG y PAb1620 en rondas de selección alternas. Los fagos no seleccionados (NS) se usaron como control. La incubación fue durante 3 horas a 4°C. El p53 unido se visualizó por análisis de transferencia Western. Como se puede ver en los resultados presentados en la Figura 6, el DBD de p53 WT se unió a p53-RE mejor que a Con-RE, como se esperaba. El 249DBD no se unió al p53-RE, lo que es consistente con su pérdida conocida de capacidad de unión al ADN específica de la secuencia. Es importante destacar que los grupos de fagos seleccionados eran capaces de inducir la unión de Mut-p53 al p53-RE, lo que demuestra que de hecho son capaces de reactivar y restablecer la función perdida de Mut-p53.

Ejemplo 7: Secuenciación profunda de grupos de fagos seleccionados

Se llevó a cabo la secuenciación de próxima generación, que aumenta en gran medida la eficacia de la presentación en fagos, permitiendo la extracción y análisis de todo el repertorio de péptidos seleccionados, con menos ciclos de selección. Se seleccionaron ocho grupos de fagos para la secuenciación profunda utilizando criterios de enriquecimiento incrementado entre las rondas de selección y la actividad funcional. Antes de la secuenciación, se realizó una reacción de PCR con cebadores que flanquean las bibliotecas insertadas: Directo-5'-NNNNNNNNCATGGAAAGATAGTG (SEQ ID NO: 364) e Inverso-5'-NNNNNNNNCCTAAAACGATTTGTG (SEQ ID NO: 365), las primeras 8 bases de cada cebador están aleatorizadas y se incorporaron como una mezcla de las cuatro bases. La aleatorización de las primeras bases se introdujo para mejorar la eficiencia y la precisión de la secuenciación. La reacción de PCR produjo ADN en la cantidad de 5 gg y longitud (aproximadamente 120 pb) requeridas, que incluye los cebadores flanqueadores y la biblioteca de péptidos clonados para la secuenciación profunda de Solexa.

La secuenciación profunda produjo una base de datos de 36 millones de lecturas. El 95% de las secuencias contenían las secuencias de cebador utilizadas en la PCR cuando se extraían las bibliotecas. A continuación, se realizó un análisis bioinformático preliminar de los datos. Este análisis incluía la eliminación de secuencias que no contienen los cebadores originales, eliminación de secuencias que no están en el marco de lectura correcto, segregación de la base de datos en las bibliotecas originales de 12 aminoácidos y 7 aminoácidos de acuerdo con la longitud del inserto, y finalmente recuento de secuencias únicas y clasificación de estas según el número de apariciones en la base de datos. Se encontró que la mayoría de las secuencias aparecían solo una o dos veces en la base de datos, presumiblemente correspondientes a fagos de nivel de fondo. 12 lecturas se definieron como un corte de exclusión, por debajo del cual el enriquecimiento de las secuencias se consideró insignificante. Las secuencias de ADN en la base de datos después se tradujeron en secuencias de aminoácidos.

Como un control de calidad interno, se compararon las secuencias y su abundancia como el porcentaje de la biblioteca total entre las dos cadenas que se secuenciaron desde direcciones opuestas y, por lo tanto, contenían un cebador diferente en sus 5'. La comparación mostró que las secuencias y su abundancia eran similares entre las dos cadenas, lo que indica que la base de datos de secuencias obtenida es válida.

La Tabla 5 muestra una lista de secuencias de péptidos obtenidas de la base de datos de secuenciación profunda de cadenas 5'. Esta base de datos contiene 107 secuencias en total, después de filtrar secuencias irrelevantes. Luego se llevó a cabo un recuento con corte de exclusión y traducción. La columna (n° de lecturas) muestra el número de veces que la secuencia se repite en la base de datos descrita y, por lo tanto, corresponde al enriquecimiento de esa secuencia específica. Dado que el análisis bioinformático se realizó en secuencias de ADN, y los péptidos individuales pueden ser codificados por varias secuencias de ADN diferentes debido a la degeneración del código genético, hay bastantes péptidos que aparecen en la tabla más de una vez. Si cierto péptido es codificado por diferentes secuencias de ADN, significa que se seleccionó independientemente dentro de diferentes clones de fagos.

Alternativamente, una serie de secuencias de ADN que codifican el mismo péptido podría ser el resultado de errores de secuenciación: sin embargo, en este caso se esperaría que el resultado de dicho error estuviera en una base aleatoria y, por lo tanto, no se enriqueciera en un número alto de lecturas. Por lo tanto, se excluyeron las secuencias de ADN que tenían menos de 30 lecturas en el recuento de n° de repeticiones. La columna (n° de Repeticiones) muestra el número de secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de péptidos y, por lo tanto, es una indicación adicional de la especificidad y la fuerza de la selección.

Como se ve en la Tabla 5, las secuencias podrían segregarse en sus dos bibliotecas de origen. La secuencia de péptidos se representa en la columna central y las secuencias se ordenan en orden descendente de acuerdo con el número de lecturas que corresponde al enriquecimiento en cada biblioteca. Se descubrió que la biblioteca de 12aa estaba dominada por una sola secuencia: KPpDRLWHYTQP (SEQ ID NO: 322), que representa casi 20% del número total de secuencias. La biblioteca de 7aa es más diversa y contiene muchas más secuencias, pero con valores de enriquecimiento más bajos.

La Tabla 5 presenta el análisis de la base de datos de secuenciación profunda: las secuencias se dividen en sus dos bibliotecas de origen, la secuencia de péptidos se representa en la columna central y las secuencias se ordenan en orden descendente de acuerdo con el número de lecturas que corresponde al enriquecimiento en cada biblioteca La columna (n° de Repeticiones) muestra el número de secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de péptido.

Ejemplo 8: Análisis bioinformático de motivos de la base de datos de secuenciación profunda

A continuación, se realizó un análisis bioinformático más exhaustivo con el fin de identificar motivos consenso. Dichos motivos podrían dilucidarse de varias maneras. Primero, la comparación entre las secuencias peptídicas identificadas en las bibliotecas de 12aa y 7aa. La aparición de motivos comunes en ambas bibliotecas apoyaría la fuerza de dicho motivo, ya que se seleccionó claramente en dos experimentos completamente independientes. En segundo lugar, la abundancia de cierto aminoácido en una posición particular y su similitud con otros aminoácidos en la misma posición del motivo pueden servir como una indicación de la importancia de dicho aminoácido en esta posición particular. En tercer lugar, la posición de un motivo puede ser de importancia crítica para su función: un motivo corto se puede desplazar a lo largo de una secuencia peptídica más larga con variabilidad en otras secuencias de aminoácidos y la distancia desde el extremo N libre del péptido puede informar sobre la importancia para su actividad. Se desarrolló un algoritmo para verificar la secuencia de aminoácidos en una ventana creciente de longitud del péptido de la siguiente manera:

1. puntuación de cada péptido, integrando el número de diferentes secuencias de nucleótidos que se traducen en el mismo péptido con las apariciones de cada tipo de secuencia de nucleótidos;

2. agrupación de los diferentes péptidos, puntuando la similitud de secuencia entre diferentes péptidos; y

3. identificación de grupos de secuencias peptídicas relacionadas y extracción de un consenso a partir de ellas.

Los péptidos candidatos eran aquellos con las apariciones superiores > 0.2%: 40 de la biblioteca de 7aa y 32 de la biblioteca de 12aa. Estos podrían agruparse en 40 grupos por sus similitudes Blastp y aparición de un aminoácido corto (motivo aa). La mayoría de los grupos incluían un péptido único, pero 9 grupos incluían 2-13 péptidos, y 6 de estos grupos incluían péptidos de 7aa y 12aa.

Los grupos se transformaron en alineamientos múltiples en bloques, siendo el % de apariciones los pesos de secuencia. Los bloques se usaron para consultar los archivos de secuencias agrupadas de péptidos de 7aa y 12aa, y los resultados superiores se transformaron nuevamente en bloques de la misma manera. En algunos bloques, pero no en todos, los resultados de las dos bibliotecas fueron similares entre sí.

El resultado de la secuenciación profunda (es decir, la creación de una base de datos de millones de secuencias de péptidos en comparación con cientos de secuencias por secuenciación convencional) permitió un análisis mucho más detallado y exhaustivo de los motivos consenso. En general, se identificaron aproximadamente 130 motivos de secuencias significativamente enriquecidas; la mayoría de estos motivos peptídicos están representados por varias secuencias de ADN y 16 de estos motivos son compartidos entre las bibliotecas de 7aa y 12aa. La figura 7 muestra varios de dichos motivos. Algunos de los motivos fueron el resultado de combinar secuencias que se superponen y, por lo tanto, son más largas que las bibliotecas de péptidos originales.

Ejemplo 9: Síntesis de péptidos

De la lista obtenida de motivos peptídicos identificados como se describió anteriormente, 128 péptidos se sintetizaron químicamente mediante PEPTIDE 2.0 a pureza en bruto, aprovechando un formato de 96 pocillos. Esta síntesis de semi-alta capacidad permitió un coste relativamente bajo de cada péptido. La Tabla 6 a continuación da los péptidos sintetizados. Esta lista también incluye algunos péptidos derivados de proteínas que se sabe de la bibliografía que interaccionan con p53. La lista también incluye 10 péptidos sintetizados en dos versiones, tanto sin como con una adición C-terminal de poliarginina. Se informó que esta adición de poli-Arg permite el cruce de péptidos a través de las membranas celulares. Esto permite la evaluación tanto de la capacidad de la adición de poli-Arg C-terminal para permitir el suministro de péptidos a las células como de si interfiere con la actividad de estos péptidos particulares in vivo. La poli-Arg puede incluir 0-10 restos de Arg y se designa como R⁰-¹⁰.

Pueden existir diferencias entre los péptidos sintetizados químicamente y los péptidos que se seleccionaron de las bibliotecas de presentación en fagos. En particular, los péptidos seleccionados se presentaron en el contexto del fago como proteínas de fusión con la proteína de recubrimiento de fago pIII. Por lo tanto, esta transición al péptido sintético no es trivial, y se sabe que en algunos casos los péptidos que se muestra que son activos cuando se presentan en fagos pierden su actividad cuando se sintetiza la misma secuencia como péptido libre.

Ejemplo 10: Cribado funcional de péptidos líder de ensayo

Se utilizaron varios métodos alternativos y complementarios para cribar péptidos líder candidatos para efectos conformacionales y funcionales en Mut-p53. Como no se conocía información sobre la penetración de cada péptido de ensayo a través de las membranas celulares, primero se realizaron ensayos basados in vitro para la evaluación: ELISA para la evaluación de la conformación de p53 y la unión de ADN específica de secuencia de p53. Posteriormente, se examinó la actividad de los péptidos en células vivas mediante ensayos de viabilidad, actividad transcripcional de p53 en un gen indicador de luciferasa y examen de genes objetivo de p53 in vivo. La combinación de estos ensayos (todos realizados en un formato de 96 pocillos) permitió la identificación y validación de los efectos del péptido sobre diferentes actividades de p53 y su capacidad para conferir dicha capacidad a las proteínas Mut-p53.

Cribado de péptidos según el efecto sobre la conformación de p53

La primera estrategia de cribado se basó en ELISA. Se usó una versión de ELISA de tipo sándwich para examinar el efecto de los péptidos líder de ensayo en la conformación de p53. Para medir el efecto conformacional de los péptidos en Mut-p53, se recubrió una placa de microtitulación con PAb240, PAb1620 o pAb421 (como control positivo), y luego se examinó la reactividad de p53 contra estos anticuerpos. p53 WT sirvió como un control positivo para la reactividad con PAb1620, y Mut-p53 sirvió como un control negativo. Para examinar el efecto de un péptido ensayado, se añadió a una solución que contenía Mut-p53 y se ensayó el cambio en la reactividad contra cualquiera de los Ab. Si después de la adición de un péptido se observaba una mayor reactividad de Mut-p53 hacia PAb1620 y una menor reactividad contra PAb240, indicaba que el péptido ensayado ha reactivado la conformación de WT de Mut-p53. Se realizaron varios experimentos ELISA usando diferentes extractos celulares. Los resultados se presentan en la Figura 8, que muestra un experimento representativo realizado en un extracto de células H1299 que sobreexpresan establemente Mut-p53, (R175H p53). Los extractos se prepararon en una concentración de 750 ng/gl en tampón de inmunoprecipitación estándar a un pH y concentraciones de sal fisiológicos y se complementaron con BSA al 3% para bloqueo, y luego se hicieron reaccionar con diferentes péptidos en una concentración de 50 ng/ml durante 2 horas. Las placas se recubrieron con los diversos anticuerpos (Ab) durante la noche, se lavaron, bloquearon y se añadieron extractos celulares (con o sin péptidos) durante 2 horas adicionales. Después de separar los extractos, las placas se lavaron y se incubaron con el Ab conjugado con ap53-HRP para la detección de los niveles de p53. Finalmente, se realizó un ensayo de TMB (sustrato de HRP) y se determinó la densidad óptica a 450 nm (como se describió anteriormente). Se usaron células MCF7 y H1299-Mut-p53 (ts) A135V (Zhang, W., et al., A temperature-sensitive mutant o f human p53. Embo J, 1994. 13 (11): p. 2535-44) como controles positivos para la conformación de p53 WT (la relación 1620/240 es igual o superior a 5:1). Los extractos de p53 H1299-R175H, aunque presentaban una conformación de p53 más mutante, aún mantenían la reactividad contra PAb1620 (la relación 1620/240 es 1:2) de PAb1620 o PAb240 frente a PAb421. Sin embargo, cuando se discute el resultado del análisis, se hace referencia a la relación calculada de PAb1620/PAb240, que captura mejor la extensión del cambio conformacional. Para examinar si esto es unión de fondo al anticuerpo o una conformación de plegamiento de WT real, se indujeron niveles crecientes de desnaturalización calentando los extractos durante diferentes periodos de tiempo, vigilando su reactividad contra PAb1620 y PAb240. Como se ve en las Figuras 8A y 8B, el mayor tratamiento térmico indujo un aumento en la reactividad con PAb240 y una disminución en la reactividad con pAb1620, lo que indica que p53 R175H en estos extractos permanecía parcialmente en la conformación WT en estas condiciones experimentales. En especial, después de la incubación con algunos de los péptidos de ensayo, se detectó mayor reactividad de Mut-p53 R175H hacia PAb1620 y menor reactividad hacia PAb240. Este era el caso, por ejemplo, con los péptidos 24, 36, 47, 60, 68 (Tabla 6), lo que indica que estos péptidos provocan un cambio conformacional en la proteína p53 mutante.

Cribado de péptidos para determinar el efecto en la unión de Mut-p53 al ADN de p53-RE.

Para medir el efecto de los péptidos ensayados en la unión al ADN de Mut-p53, se usó un kit ELISA comercial (R&D Systems DYC1355-5, Lote-1273366FA) como un ensayo de alta capacidad para cuantificar la activación de p53. Este kit utiliza un formato de placa de 96 pocillos. El kit se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los pocillos se recubrieron con anticuerpo anti-p53 durante la noche. Los extractos celulares que contenían p53 se hicieron reaccionar con un oligonucleótido marcado con biotina que contenía un sitio de unión consenso de p53 (incluido en el kit). Se espera que p53 WT se una a este oligonucleótido así como que el anticuerpo recubra los pocillos. El exceso de p53 y oligonucleótidos se separaron por lavado en tampón de lavado (Tween 20 al 0.05% en PBS, pH 7.2 - 7.4; R&D Systems, n° catálogo WA126). Luego, se añadió estreptavidina-HRP (R&D Systems, Componente 890803, proporcionado en el kit) durante 15-45 minutos para cuantificar la cantidad de oligonucleótidos en el pocillo, que es proporcional al ADN unido por p53. Si la adición de un péptido a extractos de Mut-p53 aumenta las lecturas de ELISA en comparación con el fondo, este péptido se considera funcionalmente efectivo y se puede seleccionar para un análisis posterior. La Figura 9 muestra un experimento representativo: de manera similar al ELISA de conformación, los extractos celulares se incubaron con biotina-p53-RE en presencia o ausencia (NT) de péptidos de ensayo. Al igual que con el cribado conformacional, MCF7 y las células H1299-Mut-p53 (ts) A135V sirvieron como controles positivos para p53 WT. Se añadieron extractos a los pocillos recubiertos con ap53-Ab, y después de varias etapas de lavado, se añadió estreptavidina-HRP durante 1 hora, y luego las placas se lavaron nuevamente y se realizó el ensayo TMB (sustrato de HRP). Como se puede ver en la Figura 9, los extractos de p53 H1299-R175H presentaban cierta unión de fondo al oligonucleótido p53-RE, que se redujo adicionalmente mediante oligonucleótidos competidores no marcados. Los controles positivos mostraron una señal 3-4 veces mayor en comparación con el fondo. Varios péptidos parecen elevar la unión de los extractos de p53 H1299-R175H al ADN de p53-RE, por ejemplo: 68, 75, 83, 93, 97.

Unión de péptidos a p53 WT y p53 mutante.

Para medir la unión de péptidos a Mut-p53 y p53 WT, se usó un kit de ELISA comercial de "TAKARA" (MK100 Lote AK401) como un ensayo de alta capacidad para cuantificar la unión de diferentes péptidos a proteínas o anticuerpos. El kit se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los pocillos se sembraron con los péptidos llevando a cabo una reacción química que une el extremo C del péptido a la placa.

El p53 WT recombinante o Mut-p53 R175H en una concentración de 10 ng/ml se disolvió en PBS y tampón de bloqueo y luego se añadió a las placas recubiertas con péptido durante 2 horas. Se añadieron péptidos solubles a los pocillos correspondientes para servir como un control de competición que indica la especificidad de la unión del péptido a p53 (+comp) y se añadió oligonucleótido de ADN de p53-RE a otros pocilios (+ADN) para examinar si afecta a la unión de los péptidos a p53. Después de la eliminación de la proteína recombinante, las placas se lavaron y se incubaron con el Ab conjugado ap53-HRP para cuantificar los niveles de p53. Finalmente, se realizó un ensayo de TMB (sustrato de HRP) y se determinó la densidad óptica a 450 nm. La Figura 10 muestra un experimento representativo realizado con los péptidos y anticuerpos correspondientes. Como se ve, se unieron a los pocillos anticuerpos monoclonales ap53 para servir como controles internos del ensayo; PAb1801 se une a ambas formas de p53 como se esperaba; PAb1620 es específico para p53 WT y PAb240 es más reactivo con la forma mutante. Los pocillos (bloqueados) no estaban recubiertos con péptidos y pep76 es la secuencia del péptido de control. Como se puede ver, la mayoría de los péptidos mostrados en la figura se unen con mayor afinidad a p53 WT recombinante en comparación con p53 mutante.

El efecto de pCAP en la unión de Mut-p53 a sus elementos de respuesta en células vivas.

A continuación, se examinó si p53 también puede unirse a la cromatina de sus genes objetivo. Usando el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), se examinó si los pCAP pueden restablecer la capacidad de unión al ADN de Mut-p53 para los elementos de respuesta de p53 (p53-RE). BT-549 de carcinoma de mama, que expresan endógenamente p53R249S mutante , se trataron durante 5 horas con una mezcla de 3 pCAP; 250, 308 y 325. Las células tratadas con una mezcla de péptidos de control sirvieron como control negativo. Luego se fijaron las células y el ADN se fraccionó por sonicación. El ADN reticulado a p53 se inmunoprecipitó usando anticuerpo policlonal anti-p53. El ADN se purificó y luego los elementos de respuesta a p53 de diferentes genes objetivo de p53 se cuantificaron usando diferentes cebadores en la reacción qPCR. Los resultados se normalizaron respecto a la entrada de ADN total. Como control negativo, los extractos se inmunoprecipitaron con perlas sin anticuerpo (perlas). Como se ve en la Figura 11, la unión de la cromatina a las perlas de control estaba a un nivel basal de 0.005% del ADN de entrada. La mezcla de pCAP no aumentó la unión de p53 a una secuencia de control de ADN genómico no específico, pero la unión de p53 a elementos de respuesta en los genes PUMA, p21 y CD95 aumentó 2.34, 9.78 y 4.54 veces, respectivamente, por pCAP en comparación con los péptidos de control.

Cribado de péptidos según el efecto en la actividad transcripcional de p53

Se llevó a cabo una estrategia de cribado adicional utilizada para identificar péptidos reactivadores y se basa en un ensayo de gen indicador. Mide la actividad transcripcional de p53 cuantificando la actividad de un gen indicador, colocado bajo el control de un promotor que contiene 17 repeticiones de un sitio de unión consenso de p53 (RGC). El ensayo de luciferasa se realiza en células vivas y, por lo tanto, proporciona una indicación del efecto de los péptidos de ensayo en la función de Mut-p53 en el contexto de células intactas. Se usó un promotor basado en RGC clonado secuencia arriba de un indicador de luciferasa secretado (TK-RGC-luc) (New England Biolabs (N° CAT. N0324S)), ya que no requiere la lisis de las células y permite el uso de un formato de 96 pocillos.

La Figura 12 muestra un experimento representativo de ensayo de luciferasa que se realizó para evaluar la capacidad de los péptidos para restablecer la actividad transcripcional a p53 mutante. Para el cribado basado en luciferasa in vivo, se utilizaron células H1299. La transfección transitoria de estas células p53-/- se llevó a cabo con vectores que expresan p53 WT, p53R175H, p53 R249S o vector vacío como control (Suad, O., et al., Structural basis o f restoring sequence-specific DNA binding and transactivation to mutant p53 by suppressor mutations. J. Mol. Biol., 2009. 385 (1): pág. 249-65). Las células también se cotransfectaron con TK-RGC-luc (N° CAT. NEB, N0324S). 24 horas después de la transfección, las células se trataron con los péptidos de ensayo. 48 horas después de la transfección, se tomó una muestra del medio de cultivo para mediciones de bioluminiscencia. Como se puede ver en la Figura 12, en las muestras no tratadas, la transfección de p53 WT, (control positivo), inducía transcripción de TK-RGC-luc en 20-30 veces en comparación con TK-RGC-luc solo. Cuando se examinan las muestras tratadas con péptidos, se observa que los péptidos no tenían un efecto significativo en la actividad de p53 WT; este es un resultado alentador, ya que se espera que los péptidos que aumenten enormemente la actividad de p53 WT tengan efectos tóxicos en las células normales. Dos de los péptidos ensayados, a saber, pCAP-68 y pCAP-75, inducen la transcripción de TK-RGC-luc en presencia de p53 R175H y p53R249S.

Cribado de péptidos según el efecto en la viabilidad de las células que expresan p53 mutante

Una indicación importante para la actividad reactivadora de los péptidos es su efecto in vivo en células cancerosas que expresan Mut-p53. En particular, se desean péptidos reactivadores que puedan causar la muerte de células cancerosas específicamente dependiente de Mut-p53, con efectos tóxicos mínimos sobre las células normales. Se usó un ensayo de viabilidad basado en cristal violeta, en el que se utiliza cristal violeta para teñir las células que se adhieren a la placa y, por lo tanto, la cantidad de colorante es proporcional al número de células, para determinar el efecto de los diversos péptidos de ensayo en la muerte dependiente de Mut-p53. El ensayo de cristal violeta es sencillo, rápido, fiable, económico y no requiere una preparación complicada de las muestras.

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, en una densidad calibrada que les permite crecer durante 48 horas sin alcanzar la confluencia. Los péptidos se añaden 6 horas después. Se utilizaron diferentes concentraciones de etopósido (fármaco citotóxico) como control positivo para la muerte celular y como una curva de referencia patrón para evaluar el efecto de los péptidos ensayados. 48 horas después del tratamiento, las células se lavaron con PBS para excluir las células muertas y los desechos, y las células que permanecían unidas a la placa se tiñeron con cristal violeta durante 30 minutos. Se eliminó el cristal violeta y las células se lavaron con PBS 4 veces para eliminar los restos de cristal violeta. Luego, las células teñidas se disolvieron en ácido acético al 10% y las placas se tomaron para medir la densidad óptica a 595 nM (específico para cristal violeta).

Las Figuras 13A y 13B ilustran un experimento representativo de cribado realizado en 128 péptidos sintetizados. En este experimento, se usaron fibroblastos WI-38. Estas células expresan p53 WT endógeno y se infectaron además con un virus que expresa ARNsh Noxa de ratón, como un control no específico o el mutante de p53 R175H para la sobreexpresión estable de p53 mutante. Ambas sublíneas (mNoxa o p53 R175H) se sembraron a 3000 células por pocillo y se trataron como se describió anteriormente. Las lecturas de densidad óptica (595 nm) reflejan el número de células en la placa después del tratamiento, normalizado respecto a las muestras no tratadas que se consideran 100% viables. Como se ve, aunque las células WI-38 son relativamente resistentes a la muerte, las concentraciones crecientes de etopósido sirven como un buen control positivo para la muerte celular y la detención del crecimiento con la concentración más alta que reduce el número de células en 50% después de 48 horas.

Varios de los péptidos ensayados causaron de hecho una reducción significativa en el número de células; esta reducción dependía de p53 mutante, ya que era mucho más importante en las células que expresan p53 R175H en comparación con las células de control mNoxa-i. Estos péptidos incluyen, por ejemplo, pCAP-36, pCAP-46, pCAP-47, pCAP-60, pCAP-97. Por otro lado, se encontró que algunos péptidos tienen un efecto tóxico en ambas sublíneas celulares; un ejemplo es pCAP-68. Se realizó un ensayo similar en varias líneas celulares de cáncer humano que expresan Mut-p53 diferentes, los resultados para los diferentes péptidos se resumen en la Tabla 7.

Ejemplo 11: Homología de péptidos líder con secuencias de proteínas de unión a p53 conocidas

Después de realizar el cribado funcional de los motivos peptídicos predichos por la presentación en fagos, se identificaron 20 péptidos que ejercían efectos funcionales en p53 mutante en una variedad de ensayos y líneas celulares. A continuación, se examinó la similitud de estos péptidos con secuencias de proteínas humanas en general y con proteínas que se sabe que interaccionan con p53 en particular, ya que la alta similitud con las proteínas que interaccionan con p53 puede servir como una indicación de la importancia biológica de un motivo particular y puede proporcionar validación de la suposición de que los péptidos seleccionados en condiciones artificiales in vitro de hecho pueden interaccionar con p53. Además, la estructura de la proteína y la secuencia circundante podrían ser útiles para diseñar péptidos mejorados que se basen tanto en la selección como en el diseño racional. Para encontrar similitudes entre las secuencias de péptidos y las proteínas humanas conocidas, se utilizó el algoritmo BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica). Los motivos peptídicos se introdujeron como secuencias de consulta contra una base de datos de secuencias que contenía secuencias de proteínas humanas. BLAST encuentra subsecuencias en la base de datos que son similares a subsecuencias en la consulta. La idea principal de BLAST es que a menudo hay pares de segmentos de alta puntuación (HSP) contenidos en una alineación estadísticamente significativa. BLAST busca alineaciones de secuencias de alta puntuación entre la secuencia de consulta y las secuencias en la base de datos utilizando un enfoque heurístico que se aproxima al algoritmo de Smith-Waterman. Basado en las similitudes entre los motivos peptídicos y las proteínas humanas conocidas y los datos estructurales de estas proteínas, se diseñó una lista de nuevas secuencias peptídicas (mostradas en la Tabla 8 a continuación), en la que los aminoácidos similares a los motivos peptídicos están flanqueados por otros aminoácidos derivados de la secuencia de proteínas que flanquean el motivo o de elementos estructurales en proximidad física al motivo homólogo de acuerdo con datos cristalográficos tridimensionales.

Se identificaron más de 70 proteínas diferentes con un grado variable de similitud con los motivos de péptidos seleccionados. Se había demostrado previamente que muchas de estas proteínas interaccionan físicamente con p53, mientras que se describió que otras estaban implicadas en la ruta de señalización de p53, ya sea secuencia arriba o secuencia abajo de p53. Se encontró que varios motivos tienen un alto grado de homología con las proteínas que interaccionan con p53 conocidas; pCAP-97 (WNHHHSTPHPAH, SEQ ID NO: 10) por ejemplo tiene una homología de 100% con RAD9A (con un valor p de 10-8) la cual se mostró que interacciona y activa a p53; pCAP-60 (SFILFIRRGRLG, SEQ ID NO: 302) y pCAP-63 (HNHHHSQHTPQH, SEQ ID NO: 226) tienen una homología de 90% con la secuencia de la proteína GAS2 (KILFIRLMHNKH, SEQ ID NO: 369) en la que estos motivos están separados por dos aminoácidos (los aminoácidos similares a los motivos de péptidos se resaltan en negrita).

Se emplearon varios métodos alternativos y complementarios para cribar candidatos de péptidos líder para efectos conformacionales y funcionales en Mut-p53. Para una mayor penetración del péptido a través de las membranas celulares, cada péptido contiene 3-6 restos de arginina, ya sea como parte de su secuencia o añadidos en su extremo N o su extremo C. También se conjugaron 40 péptidos con ácido graso de miristoilo (myr) para mejorar la fusión con las membranas celulares que potencialmente conducirían a un mejor suministro a las células. Primero se llevaron a cabo ensayos basados in vitro para la evaluación, tales como ELISA para la evaluación de la conformación de p53 y la unión al ADN específica de secuencia de p53. Posteriormente, se examinó la actividad de los péptidos en células vivas mediante ensayos de viabilidad, actividad transcripcional de p53 en un gen indicador de luciferasa y examen de genes objetivo de p53 in vivo. La combinación de estos ensayos (todos realizados en un formato de 96 pocillos) permitió la identificación y validación de los efectos de los péptidos en diferentes actividades de p53 y su capacidad para conferir dicha capacidad a las proteínas Mut-p53. Como se ve en la Tabla 8, se encontró que 12 péptidos tenían una puntuación de actividad total superior a 30; se mostró que todos de estos 12 péptidos son efectivos en una variedad de ensayos diferentes que incluyen la conformación de p53 y la unión al ADN específica de secuencia, la reducción de la viabilidad de las células que expresan Mut-p53 y la activación de genes objetivo de p53. Algunos de estos péptidos líder, que tienen un motivo central derivado de la presentación en fagos con secuencias añadidas de proteínas conocidas (pCAP 201-326) mostraron un efecto significativamente mayor en comparación con los péptidos derivados de la presentación en fagos solos (pCAP 1-180), mientras que otros eran comparable a los pCAP 1-180.

Después de un examen cuidadoso de las secuencias de péptidos que han mostrado el efecto más significativo en una combinación de los ensayos, se encontró que los péptidos líder se pueden clasificar en varios grupos principales, de acuerdo con sus motivos consenso. Los motivos consenso consisten en al menos 3 aminoácidos consecutivos, que hipotéticamente forman un sitio de unión secuencial o conformacional para mutantes de p53. Se encontró que estos motivos eran HSTPHP, FPGHTIH, IRGRIIR, LPNPPER, SFILFIR, HANLHHT, YPTQGHL, WNHHHSTPHP, TLYLPHWHRH, YRRLLIGMMW, IRILMFLIGCG, SFILFIRRGRLG, LRCLLLLIGRVG, SWQALALYAAGW, IRILMFLIGCGR, glrgrriflifs, HSSHHHPVHSWN, LRCLLLLIGRVGRKKRRQ (SEQ ID NO: 314, 268282, 340, 376, 298, 377, 378, 253, 20, 379, 302, 275, 380, 273, 381,280 y 382, respectivamente).

Efecto de los péptidos de ensayo en los genes objetivo de p53

La proteína p53 WT funciona principalmente como un factor de transcripción. Tras la activación por diferentes formas de estrés, se acumula, se une a sus elementos de respuesta en muchos genes objetivo y transactiva su transcripción. Las proteínas que son los productos de estos genes objetivo ejecutan sus funciones; la transactivación de p21, por ejemplo, conduce a la detención del crecimiento, mientras que la transactivación de PUMA conduciría a la apoptosis. Por lo tanto, una de las indicaciones más importantes para la activación funcional de p53 es la inducción de sus diferentes genes objetivo. Por lo tanto, se ensayó in vivo el efecto de varios péptidos de ensayo en los genes objetivo de p53.

Para el cribado funcional in vivo, se utilizaron varios sistemas experimentales. Un sistema se basa en las células H1299, que son nulas para p53 y se usan ampliamente para la investigación de p53. Se utilizaron células H1299 transfectadas de forma estable con Mut-p53 (ts) A135V. Esta forma de p53 es un mutante sensible a la temperatura, que tiene una conformación mutante a 37°C y una conformación WT a 32°C. La figura 14 muestra un experimento representativo. En esencia, las células se sembraron en placas de 12 pocillos, los péptidos indicados se añadieron directamente al medio a una concentración de 5 gg/ml, y las células se llevaron a 32°C o se devolvieron a 37°C. 18 horas después, las células se recogieron, seguido de extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis por PCR en tiempo real. Se examinó el nivel de expresión de 3 genes objetivo de p53 representativos; p21, PUMA y Mdm2. La expresión de genes en H1299-ts a 37°C se considera como nivel de fondo y todos los resultados se normalizan respecto a este, y también respecto al gen de mantenimiento GAPDH. La expresión de genes en H1299-ts a 32°C representa la conformación de p53 WT y, por lo tanto, sirve como control positivo. Como se puede ver, el cambio de temperatura a 32°C aumentó considerablemente la expresión de los 3 genes objetivo.

Como se ve en la Figura 14, el péptido de control negativo pCAP-76 no causó la inducción de objetivos de p53. Varios péptidos ensayados causaron efectivamente un aumento significativo en la expresión de p21, PUMA y Mdm2. Este era el caso de pCAP-130, pCAP-135, pCAP-142, pCAP-144 y pCAP-148. Estos péptidos inducían la transcripción de genes objetivo en 2-4 veces, en comparación con las 9-11 veces del control positivo, p53 de tipo natural auténtico. El hecho de que el tratamiento con péptidos inducía los tres genes, pero no tenía efecto en la expresión de estos genes en las células de control H1299 (p53-/-) implica que esta inducción depende de p53.

Dado que el suministro de péptidos es un obstáculo importante en su uso como agentes terapéuticos, se adoptaron diferentes planteamientos para superar este obstáculo. Primero, basándose en las secuencias líder ensayadas, se elucidaron y sintetizaron motivos de secuencias peptídicas cortas (hasta 6 aminoácidos), ya que estos péptidos pequeños podrían atravesar las membranas celulares por difusión. Un segundo planteamiento fue sintetizar péptidos ensayados con una cola C-terminal de poliarginina para facilitar su absorción activa por mecanismos basados en endocitosis.

La adición de una cola de poliarginina a los péptidos aumenta notablemente la solubilidad de los péptidos con un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos. En algunos casos, también aumenta significativamente la actividad de los péptidos tanto in vitro como in vivo; pCAP-25, por ejemplo, era insoluble en DMSO en una concentración de 10 mg/ml y no mostró ningún efecto en la actividad de p53 cuando se ensayó el cambio conformacional o la viabilidad. Mientras que pCAP-68 que tiene la misma secuencia de aminoácidos con la adición de la cola 9R causaba un cambio significativo en la conformación de Mut-p53 hacia PAb1620, así como la muerte celular masiva. Los péptidos líder se sometieron adicionalmente a un examen riguroso de los efectos en la viabilidad celular de una manera específica de Mut-p53.

Se realizaron experimentos usando diferentes líneas celulares de cáncer que expresan isoformas mutantes de p53 diferentes de manera endógena. Las Figuras 15A y 15B ilustran dos experimentos representativos realizados en células de cáncer de mama MDA-MB-231 (Figura 15A) y SKBR3 (Figura 15B) que expresan Mut-p53 con mutaciones en las posiciones 280 o 175, respectivamente, dentro del dominio de unión al ADN (DBD). Para examinar la especificidad de los péptidos para Mut-p53, el control utilizado era dichas células con una reducción de la expresión de Mut-p53 (shp53). Como se ve en las Figuras 15A y 15B, muchos de los péptidos ensayados mostraron una reducción en la viabilidad celular de una manera específica de Mut-p53, con lecturas significativas de 30%-80% en relación con la viabilidad de 100% representada por células que expresan Mut-p53 no tratadas. Algunos péptidos muestran cierto grado de un efecto tóxico en la viabilidad celular en general, como se ve en las células shp53. Por ejemplo, pCAP-155 presentaba una reducción de 30% a 40% en la viabilidad en las dos sublíneas celulares infectadas con shp53. Además, también se ve que algunos péptidos muestran una reducción específica en el número de células en tipos de células particulares en comparación con la actividad mínima en otros. pCAP-146, por ejemplo, causaba una disminución significativa en las células shCon MDA-MB-231, pero casi ningún efecto específico en las células shCon SKBR3.

Los péptidos ensayados se ensayaron adicionalmente para determinar su efecto en la expresión del gen objetivo de p53 en células SKBR3 que expresan p53 R175H endógeno. Los resultados se muestran en la Figura 16, que muestra un gráfico de barras de un experimento representativo realizado en células SKBR3 ShCon y células SKBR3 Shp53, con reducción de la expresión de p53. En esencia, estas células se sembraron en placas de 12 pocillos; los péptidos indicados se añadieron directamente al medio en una concentración de 5 pg/ml. 18 horas después, las células se recogieron, seguido de análisis de qRT-PCR. Se evaluó el nivel de expresión de p21, PUMA y Mdm2. La expresión de esos genes en células no tratadas se considera nivel de fondo y todos los resultados se normalizaron respecto a este, así como respecto a GAPDH. Como se ve, algunos de los péptidos líder presentaban una transactivación significativa de los genes objetivo de p53. Este efecto era mediado a través de Mut-p53 ya que no se observó en las células SKBR3 shp53. pCAP-155, pCAP-144 y pCAP-148 mostraron niveles de transactivación entre los más altos.

Efecto de los péptidos de ensayo en la apoptosis y correlación con la activación de genes objetivo de p53

Las Figuras 17A y 17B ilustran experimentos representativos realizados en células de carcinoma de ovario ES2 (Figura 17A-D) que expresan Mut-p53 con una mutación en las posiciones 241 dentro del DBD. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 cm, y los péptidos indicados se añadieron directamente al medio en una concentración de 12 pg/ml en los puntos de tiempo indicados. Las células se recogieron, y 60% de las células se tomaron para el ensayo de apoptosis de anexina-PI y 40% para la extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis de PCR en tiempo real. La apoptosis se ensayó utilizando el kit de tinción de anexina-V (Roche, REF 11 988549 001). Las células no fijadas se tiñeron tanto con anticuerpo anti-anexina conjugado con FITC para detectar células apoptóticas como con PI (yoduro de propidio) para teñir células muertas permeables al compuesto, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se analizaron luego por citometría de flujo. Se contó un total de 10000 células para cada muestra y se dividieron en cuatro subpoblaciones de acuerdo con la intensidad de la tinción: las células negativas tanto para PI como para anexina (-PI, -Anexina) se denominan vivas; las células negativas para PI y positivas para anexina (-PI, anexina) están pasando por etapas tempranas de apoptosis; las células positivas para PI y anexina (+ PI, anexina) son células muertas que sufrieron un proceso apoptótico; y se supone que las células positivas para PI y negativas para anexina (+PI, -anexina) son células muertas que murieron por una muerte no apoptótica tal como la necrosis. Como se ve en la figura 17A, las células no tratadas 17B (tiempo 0 h) son en su mayoría (94%) negativas tanto para PI como para anexina, lo que significa que las células son viables y están bien. El tratamiento con pCAP 242 y 250 provoca un rápido aumento de las células apoptóticas seguido de muerte celular y después de 5 horas de tratamiento, 12% de las células son positivas para anexina y aproximadamente 7% están muertas. Después de 16 y 24 horas de tratamiento con pCAP 250, la población apoptótica aumenta a aproximadamente 27% y las células muertas se acumulan hasta 29% a las 16 h y 36% después de 24 h. Esta tendencia también es cierta para pCAP 242, aunque sus efectos son atenuados y más lentos. El efecto de los péptidos en la viabilidad celular va acompañado de una transactivación significativa de los genes objetivo de p53 como se ve en las Figuras 17C y 17D, que muestran la expresión de 4 objetivos representativos. Como se ve, todos los genes son activados después del tratamiento con péptidos, y la expresión de ARNm de p21 y PUMA aumenta con el tiempo hasta 10 veces y 6 veces después del tratamiento con pCAP 250 y pCAP 242, respectivamente. La expresión de CD95 y Btg-2 se eleva hasta 6 veces sobre las células no tratadas.

Ejemplo 12: Ensayo in vivo (preclínico) de péptidos reactivadores de Mut-p53

Los experimentos in vivo (preclínicos) se realizaron en dos tipos de modelos: modelos de xenoinjerto humano en ratones atímicos y ratones con ''genosustitución" ("knock-irí') de Mut-p53. En cada modelo, se determinan los efectos de la inyección intratumoral de los péptidos ensayados sobre el crecimiento tumoral y la supervivencia animal.

En el modelo preclínico de xenoinjerto, las células tumorales se transfectan con un vector de expresión de luciferasa, lo que permite el seguimiento del tumor mediante imágenes en vivo.

En el modelo de ratones con "genosustitución" de Mut-p53, se utiliza un ratón con genosustitución de Mut-p53 condicional específica para pulmón (Kim, C.F., et al., Mouse models of human non-small-cell lung cáncer: raising the bar. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2005. 70: pág. 241-50. Olive, K.P., et al., M utantp53gain o f function in two mouse models o f Li-Fraumeni syndrome. Cell, 2004. 119 (6): pág. 847-60). Este modelo ofrece un compuesto de ratones con genosustitución condicional con mutaciones en K-ras combinado con uno de los tres alelos de p53: R273H, R175H, o un alelo nulo de p53. La infección con AdenoCre induce la recombinación de los alelos condicionales y se mostró que produce adenocarcinomas de pulmón inducidos por K-ras tan pronto como 6 semanas después del inicio del tumor. Este modelo recapitula de cerca varios aspectos del adenocarcinoma pulmonar humano avanzado y permite que dos mutantes diferentes (175 y 273) se expresen a partir del promotor p53 endógeno, a niveles fisiológicos, con el perfil espacial y temporal correcto. Este modelo permite demostrar las características de los péptidos reactivadores ensayados, in vivo, con respecto a varios cruciales; efecto de seguridad insignificante en tejido normal de ratón o ratones no infectados; reducción de eficacia en el tamaño y número de tumores en ratones tratados en comparación con el control; y especificidad para la reducción tumoral en ratones que expresan Mut-p53 en comparación con ratones inactivados para p53. Además, los experimentos de aumento de dosis se realizan con péptidos de control positivo, para evaluar las concentraciones activas mínimas y la dosis máxima tolerada.

Ensayos preclínicos en un modelo de xenoinjerto

Las células MDA-MB-231 que expresan de forma endógena p53 R280K se infectaron con un vector de expresión de luciferasa y shp53 para inactivación de p53 o ARNsh NOXA de ratón (shmNOXA) como control no específico. Las células MDA-MB-231 son altamente tumorigénicas, forman tumores agresivos y de rápido crecimiento, además de ser metastásicas en seres humanos. En total se inyectaron 10 ratones. Se inyectó a cada ratón por vía subcutánea 2*106 células MDA-MB-231 que expresan shp53 en el flanco derecho y 2*106 células MDA-MB-231 que expresan shmNOXA en el lado izquierdo. Se permitió que los tumores crecieran durante 14 días con el fin de alcanzar un tamaño visible. El crecimiento se vigiló por generación de imágenes en vivo, utilizando el sistema IVIS200. En este sistema, la bioluminiscencia de luciferasa es proporcional al número de células cancerosas. Los resultados se presentan en las Figuras 18A a 18C y en las Figuras 19A a 19C. 14 días después de inyección de las células, se asignaron 4 ratones (ratones 7-10) al grupo de control (Figuras 18A a 18C) y 6 ratones (ratones 1-6) se asignaron al grupo de tratamiento (Figuras 19A a 19C). El tratamiento de control estaba compuesto por una mezcla de 3 péptidos de control (pCAP 76, 77 y 12), que no mostraban ningún efecto (fenotipo) en p53 in vitro. A los ratones del grupo de tratamiento se les inyectó una mezcla de 3 péptidos (pCAP 174, 155 y 159) que mostraban los mejores efectos fenotípicos in vitro en p53. pCAP-159 (SEQ ID No : 312) tiene una secuencia similar a pCAP-60 (SEQ iD NO: 302) con la adición de restos de arginina, el péptido está compuesto de D-aminoácidos y se sintetiza en el orden inverso (pCAP -159: rrrrrrrrglrgrriflifs (SEQ ID n O: 312)) en comparación con pCAP-60: SFILFIRRGRLG, (SEQ ID NO: 302) (letras minúsculas representan D-aminoácidos), en una estrategia "retro-inversa". Los péptidos se inyectaron directamente en el tumor (inyección intratumoral) tres veces por semana en un volumen de 40 pl por tumor y una concentración de 50 pg/ml para cada péptido en la mezcla. Por lo tanto, se administró a cada ratón un total de 6 pg de mezcla de los péptidos de control o los péptidos de tratamiento cada vez. Los ratones se vigilaron durante un total de 5 semanas desde el inicio del tratamiento con péptidos. La bioluminiscencia se midió cada 7 días. Como se muestra en la Figura 18A, los tumores shmNOXA, que expresan Mut-p53 endógeno, mostraron un aumento de 6-15 veces (escala logarítmica) en la intensidad de luciferasa durante el transcurso del tiempo del experimento cuando se trataron con la mezcla de péptidos de control. El ratón 10 tuvo que ser sacrificado después de 28 días de tratamiento ya que los tumores alcanzaron un gran tamaño limitante. La Figura 19A muestra el análisis de ratones tratados en paralelo con una mezcla de 3 péptidos activadores de Mut-p53. Como se ve en la Figura 19A, ninguno de los tumores mostró un aumento significativo en el número de células cancerosas durante el período de 35 días del experimento. Dos de los tumores (ratón-1 y ratón-4) mostraron una respuesta parcial al tratamiento, evidente como una reducción de 50% a 65%, respectivamente, en la bioluminiscencia. Los ratones número 2 y 5 mostraron una respuesta completa, con lecturas de luciferasa que eran tan bajas o cercanas como los niveles de detección de umbral de nivel de fondo del sistema IVIS (5*106 fotones) incluso después de 21 días de tratamiento. La administración de péptidos se interrumpió después de 35 días, y los ratones número 2 y 5 se dejaron sin ningún tratamiento adicional y se vigilaron durante otros 21 días. No se detectó reaparición tumoral en esos ratones, ya sea visualmente o por generación de imágenes en vivo.

Ensayo preclínico n°2

Las células MDA-MB-231 que expresan de forma endógena p53 R280K se infectaron con un vector de expresión de luciferasa, a 15 ratones se les inyectó por vía subcutánea 1x106 células MDA-MB-231-luc en ambas caderas. Se permitió que los tumores crecieran durante 10 días con el fin de alcanzar un tamaño visible y, a partir de ese momento en adelante, se controló el crecimiento del tumor mediante generación de imágenes en vivo. Los resultados se presentan en las Figuras 20A a 20C. 18 días después de inyección de las células, se asignaron 6 ratones al grupo de control y 9 ratones se asignaron al grupo de tratamiento. Como antes, el tratamiento de control implicaba una mezcla de 3 péptidos de control (pCAP 76, 77 y 12). Se inyectó a los ratones del grupo de tratamiento una mezcla de 3 péptidos (pCAP 174, 155 y 159). Los péptidos se inyectaron directamente en el tumor (inyección intratumoral) tres veces por semana en un volumen de 40 pl por tumor y una concentración de 50 pg/ml para cada péptido en la mezcla. Como se muestra en la Figura 20, tanto el grupo de control como de tratamiento mostraron un comportamiento similar antes del tratamiento; aumento de aproximadamente 2-3 veces (escala logarítmica) en la intensidad de luciferasa (días 10-18). La Figura 20A muestra el análisis de ratones tratados en paralelo con una mezcla de 3 péptidos de control: como se ve, el tratamiento de control solo tiene un efecto muy leve sobre el crecimiento tumoral, reduciendo la tasa de crecimiento en comparación con el período anterior al tratamiento. Sin embargo, como se ve en la Figura 20B, el tratamiento con la mezcla de tres pCAP reactivadores de p53 causó una disminución significativa en la luminiscencia de los tumores MDA-MB-231. Después de una sola inyección de la mezcla de pCAP, la luminiscencia promedio se redujo en 70% y 7 de los 18 tumores mostraron regresión total con lecturas de imágenes en vivo cercanas al umbral de detección del nivel de fondo (datos no mostrados). Como se muestra en la figura 20B, 12 días después del comienzo del tratamiento (4 inyecciones), la luminiscencia tumoral promedio disminuyó en 93%, y 11 de los 18 tumores mostraron una respuesta completa. Solo uno de los 18 tumores no mostró respuesta o mostró respuesta de una semana. Este tumor era relativamente grande antes de comenzar el tratamiento, por lo tanto, es posible que la dosis de pCAP no fuera suficiente para causar una respuesta significativa.

Ensayo preclínico n°3 - Células de carcinoma de colon SW-480

Después de observar el resultado altamente significativo en el experimento MDA-MB-231, se dirigieron estudios adicionales a extender la observación y examinar las células de un origen diferente, que albergaban una mutación puntual de p53 diferente. La línea celular de carcinoma de colon SW-480 alberga dos mutaciones de p53 endógenas: la R273H y la P309S. Las células SW-480 se infectaron establemente con el gen indicador de luciferasa, y se inyectaron 106 células por vía subcutánea a ratones atímicos. El experimento contenía 15 ratones que se dividieron aleatoriamente durante el experimento en 3 grupos: un grupo de control tratado con un cóctel de 3 pCAP previamente demostrados ineficaces, un grupo tratado con un cóctel de 3 pCAP eficaces (250, 308, 325) y finalmente un grupo tratado con un solo péptido, el pCAP-325. La duración del experimento de SW-480 era de 42 días desde el punto de implantación de las células. La línea de tiempo es relativa al primer día de tratamiento que se marca como día 0. La Figura 21 muestra crecimiento tumoral con el tiempo en los tres grupos, medido por imágenes en vivo en IVIS. Como se ve, con el tiempo los tumores de control muestran un aumento promedio de 2.75 veces el tamaño del tumor (como se infiere del cambio en el log de la intensidad de luminiscencia media de 9.24 el día 0 a 9.68 el día 35, presentado en la figura 21A). Los tumores en el grupo de tratamiento mixto muestran una disminución equivalente a una disminución del tamaño tumoral de 96.7% (como se infiere del cambio en el log de la intensidad de luminiscencia media de 9.13 el día 0 a 7.65 el día 35, presentado en la Figura 21B). Del mismo modo, los tumores en el grupo pCAP 325 mostraron un cambio promedio de 0.043 que es equivalente a una disminución del tamaño del tumor de 95.6% (como se infiere del cambio en el log de la intensidad de luminiscencia media de 8.97 el día 0 a 7.61 el día 35, presentado en la figura 21C).

Resumen de experimentos preclínicos.

Hasta el momento ya se han realizado 4 experimentos preclínicos, utilizando el modelo de xenoinjerto de células que expresan Mut-p53 transfectadas con un vector de expresión de luciferasa, lo que permite la vigilancia del tumor mediante generación de imágenes en vivo. Se realizaron dos experimentos con células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 (p53 R280K), un experimento utilizó células de carcinoma de cáncer de colon SW-480 (p53 R273H) y otro experimento utilizó células de cáncer de mama SKBR3 (p53 R175H). En cada experimento, las células de la línea celular correspondiente se inyectaron por vía subcutánea y se permitió la formación de tumores bien establecidos visibles tanto a simple vista como mediante generación de imágenes en vivo (típicamente 2-3 semanas). Luego se administró un régimen de tratamiento, compuesto por inyección intratumoral de péptidos líder efectivos o péptidos de control (que no muestran actividad in vitro) cada tres días durante un período de hasta 42 días.

En todos los experimentos preclínicos realizados, los ratones tratados con péptidos líder han mostrado una disminución muy significativa en todos sus parámetros tumorales (los porcentajes varían entre los diferentes experimentos); señal de luminiscencia media (81%-99% medida por IVIS), peso y volumen del tumor (72%-93% medido después de la extracción del tumor). Los tumores de ratones tratados con péptidos de control, por otro lado, continuaron creciendo, aunque a una tasa reducida en comparación con la tasa de crecimiento antes del tratamiento. Casi todos los tumores tratados con péptidos líder respondieron al tratamiento, y 35%-70% de los tumores tratados mostraron una respuesta completa con tumores que regresaron a niveles de detección por debajo del umbral. Seis de los ratones que mostraron una respuesta completa se mantuvieron vivos durante dos meses después de la finalización del experimento (sin tratamiento) y no se detectó recurrencia de tumores.

Ensayos in vivo de toxicidad de péptidos

En total, se usaron 6 ratones para ensayar la toxicidad de la mezcla de péptidos: dos ratones para cada concentración de péptido. La mezcla de péptidos utilizada en este experimento era la misma que la descrita anteriormente (Figuras 19A a 19C) (pCAP 174, 155 y 159). Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal, tres veces por semana durante tres semanas, una mezcla de péptidos preparada en una concentración de 100 ug/ml. A dos ratones se les inyectó un volumen de 40 pl que se asemeja a la cantidad total recibida por los ratones en el ensayo preclínico. A dos ratones se les inyectaron 120 pl, y a los dos ratones restantes se les inyectaron 400 pl. Dado que el peso promedio de un ratón es de 20 g, estas cantidades representan concentraciones de 0.6, 1.8 y 6 mg/Kg, respectivamente. Se inspeccionó a los ratones diariamente después de la inyección. No se detectó ningún cambio visible en ninguno de los ratones. Además, el tejido que rodea los tumores de los ratones utilizados en el experimento preclínico (Figuras 18A a 18C y Figuras 19A a 19C) se examinó después de que los ratones fueron sacrificados, en busca de signos de necrosis o inflamación. Sin embargo, el tejido que rodea el tumor aparecía normal en todos los casos, lo que indica que no hay un efecto tóxico importante del tratamiento con los péptidos pCAP.

La Tabla 10 resume la actividad de los péptidos ensayados en la presente descripción.

Tabla 1.

Tabla 2. Selección para p53 R175H.

Tabla 3. Selección alterna para Mut-p53 y p53 WT.

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

Tabla 7

*PA - Puntuación de actividad Tabla 8

* PA - Puntuación de actividad.

Tabla 9

Tabla 10

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido recombinante o sintético que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 314, en donde dicho péptido reactiva al menos parcialmente una proteína mutante p53 in vitro; y

en donde dicho péptido tiene una longitud de 6-15 aminoácidos.

2. El péptido de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 314.

3. El péptido de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 313 o SEQ ID NO: 310.

4. El péptido de la reivindicación 1, conjugado con al menos un resto de permeación celular.

5. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicho péptido:

(i) cambia al menos parcialmente la conformación de dicha proteína p53 mutante a una conformación de una proteína p53 de tipo natural (WT) in vitro;

(ii) dicho péptido cambia al menos parcialmente la conformación de dicha proteína p53 mutante de modo que dicha proteína p53 mutante, al unirse a dicho péptido in vitro, es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT;

(iii) dicha proteína p53 mutante no es reconocida por un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína p53 WT.

6. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicho péptido restablece al menos parcialmente la actividad de dicha proteína p53 mutante a la actividad de una proteína p53 WT in vitro,

en donde dicha actividad es reducir la viabilidad in vitro de células que expresan dicha proteína p53 mutante; dicha actividad es promover la apoptosis in vitro de células que expresan dicha proteína p53 mutante; o dicha actividad se unirse a un elemento de unión al ADN consenso de p53 en células que expresan dicha proteína p53 mutante.

7. El péptido de la reivindicación 6, donde dicho elemento de unión al ADN consenso comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 339.

8. El péptido de la reivindicación 6, en donde dicha unión da como resultado la activación al menos parcial de un gen objetivo de p53 endógeno.

9. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicha proteína p53 mutante tiene una conformación diferente que una proteína p53 WT.

10. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicha proteína p53 mutante es al menos parcialmente inactiva en comparación con una proteína p53 WT.

11. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicha proteína p53 mutante comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R175H, V143A, R249S, R273H, R280K, P309S, P151S, P151H, C176S, C176F, H179L, Q192R, R213Q, Y220C, Y220D, R245S, R282W, D281G, S241F, C242R, R248Q, R248W, D281G, R273C y V274F.

12. Un péptido recombinante o sintético que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 321.

13. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, para uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada con una proteína p53 mutante.