CN112921032A

CN112921032A - 一种引物对、探针、试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN112921032A
Application number: CN202011590129.4A
Authority: CN
Inventors: 张炳为; 王文婧; 辜嘉; 周树民
Original assignee: Suzhou Zhongke Advanced Technology Research Institute Co Ltd
Current assignee: Suzhou Zhongke Advanced Technology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-06-08

Abstract

本发明提供了一对用于扩增TP53基因的rs1042522位点的引物，一种用于表征含有rs1042522位点的DNA序列的表达量的探针以及包含前述引物和探针的试剂盒及其使用方法。本发明的优势包括：检测时间短，完成一次检测只需1.5个小时；闭管检测，无须产物后处理分析；结果判读简单，准确，只需通过熔解曲线和TM值，即可判读不同基因型；单管检测即可判读不同的基因型。

Description

一种引物对、探针、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种引物对、探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

TP53基因是人类恶性肿瘤相关基因，可编码和表达TP53蛋白。TP53蛋白是一种转录因子，可以有效的控制细胞生长和引发细胞凋亡。TP53蛋白的异常表达可作为恶性肿瘤的信号，是判断肿瘤恶性程度的指标。有研究显示，一个常见的TP53基因的多态性位点为condon 72(rs1042522)，该位点的多态性与多种肿瘤的发生、发展和预后相关。

目前，SNP的检测主要方法有：

1)DNA芯片：由于DNA芯片具有高通量等优势，在SNP检测中被大量应用。但其依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测，由于不同位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差、易出现假阳性假阴性结果。

2)DNA测序法：直接测序法一直以来是基因突变检测的标准，但是测序法存在很多缺点，比如耗时长，后续要对PCR产物进行处理，程序复杂，容易出现污染导致结果不准确。

3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此，设计针对不同基因变型的引物序列进行检测。

4)限制性酶切方法(RFLP)：准确性较好，费用也低。但是只能对一部分含有现成酶切位点的多态性位点进行分型。

发明内容

因此，本公开的目的是针对上述问题，提供一种引物对、探针、试剂盒及其使用方法，利用分子信标探针和探针熔解曲线的方法，通过熔解峰的TM值来判断rs10425522位点的基因型。本公开的使用方法为闭管操作、简便快捷。

根据本公开的第一方面，提供了一对引物，

其上游引物序列为：5’-CCAAGCAATGGATGATTTGA-3’；

其下游引物序列为：5’-GTAGGTTTTCTGGGAAGGGACA-3’；

该引物对用于扩增TP53基因的rs1042522位点。

根据本公开的第二方面，提供了一种探针，其序列为：

5’-FAM-CAAaggctgctccccGcgtggcTTG-BHQ-3’；该探针用于表征含有rs1042522位点的DNA序列的表达量。

根据本公开的第三方面，提供了一种用于检测基因多态性的试剂盒，包括前述的引物对和前述的探针。

在一些可能的实现方式中，试剂盒还包括酶混合液，该酶混合液被配置为包括不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶。

根据本公开的第四方面，提供了一种检测基因多态性的方法，该方法包括：

获取含有rs1042522位点的DNA样本；

将前述试剂盒中的PCR反应液与酶混合液混合后再与DNA样本混合，获得待测样本；

对待测样本进行荧光定量PCR扩增并根据探针的熔解曲线和TM值判断rs1042522位点的基因型。

在一些可能的实现方式中，通过核酸提取试剂盒进行DNA样本的提取，将获得的DNA样本用紫外分光光度计进行浓度和质量检测，DNA样本的浓度范围为5～100ng/ul，DNA样本的OD260/280值范围为1.7～2.0。

在一些可能的实现方式中，将试剂盒中的PCR反应液与酶混合液在室温下融化并震荡混匀，在2000rpm的条件下离心10s得到待混液后，再将该待混液与DNA样本混合。

在一些可能的实现方式中，待混液与DNA样本以9：1的体积比混合。

在一些可能的实现方式中，待测样本在进行荧光定量PCR时的反应体系为：

4mM MgCl2；

50mM Tris(pH 8.3)；

500mg/L BSA；

100uM dNTPs；

0.4U taq酶；

0.05uM上游引物，

1uM下游引物；

0.25uM探针。

从以上技术方案可以看出，与背景技术中所述的检测方法相比较，本发明具有如下的优点：

1.检测时间短，完成一次检测只需1.5个小时；

2.闭管检测，无须产物后处理分析；

3.结果判读简单，准确，只需通过熔解曲线和TM值，即可判读不同基因型；

4.单管检测即可判读不同的基因型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本公开的一个实施例中不同基因型的样本用本公开的试剂盒检测结果与测序结果的对照图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例公开了一对引物，

其上游引物序列为：5’-CCAAGCAATGGATGATTTGA-3’；

其下游引物序列为：5’-GTAGGTTTTCTGGGAAGGGACA-3’；

该引物对用于扩增TP53基因的rs1042522位点。

实施例2

本实施例公开了一种探针，其序列为：

5’-FAM-CAAaggctgctccccGcgtggcTTG-BHQ-3’；

该探针的荧光报告基团为6羧基荧光素，用于表征含有rs1042522位点的DNA序列的表达量。

实施例3

本实施例公开了一种用于检测基因多态性的试剂盒，包括：

引物对，其序列为：

其上游引物序列为：5’-CCAAGCAATGGATGATTTGA-3’；

其下游引物序列为：5’-GTAGGTTTTCTGGGAAGGGACA-3’以及，

探针，其序列为：

5’-FAM-CAAaggctgctccccGcgtggcTTG-BHQ-3’。

优选地，该试剂盒中还包括酶混合液，该酶混合液被配置为包括不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶。

实施例4

本实施例公开了一种使用前述试剂盒的检测基因多态性的方法，该方法包括：

通过核酸提取试剂盒进行DNA样本的提取，获取含有rs1042522位点的DNA样本，将获得的DNA样本用紫外分光光度计进行浓度和质量检测，DNA样本的浓度范围为5～100ng/ul，DNA样本的OD260/280值范围为1.7～2.0。

将试剂盒中的PCR反应液与酶混合液在室温下融化并震荡混匀，在2000rpm的条件下离心10s得到待混液后，再将该待混液与DNA样本以9：1的体积比混合混合，获得待测样本；

此时，待测样本在进行荧光定量PCR时的反应体系为：

4mM MgCl2；

50mM Tris(pH 8.3)；

500mg/L BSA；

100uM dNTPs；

0.4U taq酶；

0.05uM上游引物，

1uM下游引物；

0.25uM探针。

对待测样本进行荧光定量PCR扩增并根据探针的熔解曲线和TM值判断所述rs1042522位点的基因型。

其中，

熔解曲线(Melting curve)是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。

总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(TM)，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

熔解曲线是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点(Tm)，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，其Tm值不同，这与双链DNA序列长度、碱基组成相关。在实时PCR技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的Tm值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。

实施例5

本实施例提供一种TP53基因中的rs1042522位点的基因型的检测方法：

1)样本处理

使用商品化的核酸提取试剂盒进行DNA提取，提取过程严格按照核酸提取试剂盒的说明书进行。

将提取好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，5ng/μl≤DNA浓度要求≤100ng/μl，DNA浓度低于5ng/μl时，重新进行样本处理；DNA浓度高于100ng/μl时，适当稀释后进行试验。保证DNA的OD_260/280值在1.7-2.0之间。

2)试剂配制

从检测试剂盒中取出TP53 PCR反应液和酶混合液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10秒。计算所需反应试剂测试数n[n＝测试数+对照数(2)]，每测试反应体系配制如下：

主反应液(μl)	Taq酶(μl)	总体积(μl)
			17.6μl(TP53 PCR反应液)	0.4μl	18μl

按n测试计算上述各试剂的用量，加入一适当容积的离心管中混匀。按18μl量分装到PCR薄壁管中。

3)加样

单个反应总体积为20μl，因此往上述分装有18μl反应液的PCR薄壁管中按顺序分别加入2μl阳性对照(无需提取)、2μl阴性对照(无需提取)、2μlDNA样本，盖紧8联管管盖，然后将8联管轻轻混匀后微离心，最后转移至PCR检测区。

4)PCR扩增及荧光检测

将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增(检测荧光选择FAM通道)：

5)读取检测结果并判断基因型

检测结果如图1所示，当熔解曲线为显示为单峰型，且TM值为69±1℃时，表示含有rs1042522位点的DNA序列的基因型为GG纯合型。当熔解曲线为显示为单峰型，且TM值为55±1℃时，表示含有rs1042522位点的DNA序列的基因型为CC纯合型。当熔解曲线为显示为双峰型，且TM值分别为55±1℃和69±1℃时，表示含有rs1042522位点的DNA序列的基因型为GC杂合型。

尽管已经通过优选实施例进一步详细说明和描述了本发明，但是本发明不限于所公开的示例，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下从其中得出其他变型。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一对引物，其特征在于，

上游引物序列为：5’-CCAAGCAATGGATGATTTGA-3’；

下游引物序列为：5’-GTAGGTTTTCTGGGAAGGGACA-3’；

该引物对用于扩增TP53基因的rs1042522位点。

2.一种探针，其特征在于，

其序列为：5’-FAM-CAAaggctgctccccGcgtggcTTG-BHQ-3’；

该探针用于表征含有rs1042522位点的DNA序列的表达量。

3.一种用于检测基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括：

如权利要求1所述的引物对；

如权利要求2所述的探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液被配置为包括不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶。

5.一种检测基因多态性的方法，其特征在于，该方法包括：

-获取含有rs1042522位点的DNA样本；

-将如权利要求3～4所述试剂盒中的PCR反应液与酶混合液混合后再与所述DNA样本混合，获得待测样本；

-对所述待测样本进行荧光定量PCR扩增并根据所述探针的熔解曲线和TM值判断所述rs1042522位点的基因型。

6.根据权利要求5所述的检测基因多态性的方法，其特征在于，通过核酸提取试剂盒进行所述DNA样本的提取，将获得的所述DNA样本用紫外分光光度计进行浓度和质量检测，所述DNA样本的浓度范围为5～100ng/ul，所述DNA样本的OD_260/280值范围为1.7～2.0。

7.根据权利要求5所述的检测基因多态性的方法，其特征在于，将所述试剂盒中的PCR反应液与酶混合液在室温下融化并震荡混匀，在2000rpm的条件下离心10s得到待混液后，再将该待混液与所述DNA样本混合。

8.根据权利要求7所述的检测基因多态性的方法，其特征在于，所述待混液与DNA样本以9：1的体积比混合。

9.根据权利要求8所述的检测基因多态性的方法，其特征在于，所述待测样本在进行荧光定量PCR时的反应体系为：

4mM MgCl2；

50mM Tris(pH 8.3)；

500mg/L BSA；

100uM dNTPs；

0.4U taq酶；

0.05uM上游引物，

1uM下游引物；

0.25uM探针。