CN108884137A - 肽及其在治疗与突变型p53相关的疾病、病症或病况中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离肽。所述肽包含在空间和构型上排列为允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)通过DBD的至少一个残基相互作用的氨基酸序列，其中通过所述至少一个残基，pCAP 250(SEQ ID NO:1)结合所述DBD，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，条件是所述肽不是SEQ ID NO:9‑382。

Description

肽及其在治疗与突变型p53相关的疾病、病症或病况中的用途
发明领域和背景
本发明，在其一些实施方案中，涉及肽及其在治疗与突变型p53相关的疾病、病症或病况中的用途。
癌症是发达国家中的主要死亡原因，且随着人口的平均年龄持续上升，诊断病例数和经济影响也随之上升。癌症不是单一疾病，而是特征在于异常细胞的失控生长和扩散的一组超过200种疾病。癌症是高度异质性的疾病，并且甚至在具有相同类型和等级的癌症的患者之间，也具有肿瘤细胞表面标记物的表达和分布的主要分子差异。此外，随着癌症进展，细胞突变倾向于积累，进一步增加肿瘤异质性。大多数肿瘤细胞表现出基因组不稳定性，以及癌基因的增加表达和肿瘤抑制基因的失活。
p53基因被认为是最重要的肿瘤抑制基因，其充当针对癌症发展的主要屏障。p53蛋白响应于各种类型的细胞应激，且触发细胞周期停滞、凋亡或衰老。这通过携带p53 DNA结合基序的特异性靶标基因的转录反式激活而实现。得到广泛赞同的是，p53途径在几乎所有人类癌症中受损。p53的突变被视为恶性转化过程中的关键步骤，且超过50％的癌症病例在其p53基因中携带突变。这些突变中的大多数是靶向p53的DNA-结合核心结构域(DBD)的错义点突变，从而终止p53与其靶标位点的特异性DNA结合。这些突变阻止p53依赖性转录，且因此阻止p53介导的肿瘤抑制。不同类型的人肿瘤中的p53突变的异常高频率使得p53在参与肿瘤发育的基因之中是独特的，使得突变的p53 (Mut-p53)成为用于新型癌症疗法的有吸引力的靶标。
结构研究已经揭示，p53的DBD中的肿瘤来源的错义突变产生共同效果：DBD折叠在生理温度下的不稳定(Joerger, A.C., M.D. Allen和A.R. Fersht, Crystal structure of a superstable mutant of human p53 core domain. Insights into the mechanism of rescuing oncogenic mutations. J Biol Chem, 2004. 279(2): p. 1291-6)。这种不稳定可以是可逆的，因为一些突变型可以在降低的温度下恢复至野生型构象且结合DNA。因此，p53的大多数突变使p53蛋白折叠不稳定，导致在生理温度下的部分变性。
突变型p53蛋白在肿瘤细胞中以高水平积累，主要由于它们无法上调p53的自身破坏物Mdm2的表达。此外，许多活化p53的应激信号(如缺氧、基因组不稳定和癌基因表达)在癌细胞中得到组成型诱导。因此，预期Mut-p53的再活化发挥主要的抗肿瘤作用。此外，已经在小鼠模型中显示，p53功能的恢复在正常组织中被良好耐受，且不产生可见的毒性作用(Ventura, A., 等人, Restoration of p53 function leads to tumour regression invivo. Nature, 2007. 445(7128): p. 661-5)。
结构研究显示，错误折叠的程度在突变型间不同；然而，没有明确的替代折叠，反而有部分变性。这表明，逆转p53突变对折叠影响的“小分子”方法可适用于宽范围的突变型形式。来自结构研究的另一个重要预测是，根据质量作用定律，预期结合至所述蛋白的正确折叠部分的配体将使得平衡朝向天然折叠移动。
p53构象领域中尝试了一些校正方法。Friedler和同事提供了构象稳定肽的原理论证(Friedler, A., 等人, A peptide that binds and stabilizes p53 core domain: chaperone strategy for rescue of oncogenic mutants. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2002. 99(2): p. 937-42)。基于p53 DBD和ASPP之间的复合物的晶体结构设计了九残基肽CDB3 (Samuels-Lev, Y., 等人, ASPP proteins specifically stimulate theapoptotic function of p53. Mol. Cell, 2001. 8(4): p. 781-94)。该肽显示结合Mut-p53且充当分子伴侣，将平衡朝向野生型构象移动，如对PAb1620增加的反应性所示。然而，CDB3的生物效果(Issaeva, N., 等人, Rescue of mutants of the tumor suppressorp53 in cancer cells by a designed peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003.100(23): p. 13303-7)仅仅是部分的，因为Mut-p53/CDB3复合物的构象处于野生型和突变型之间的中间状态。
已经使用基于蛋白或基于细胞的测定法鉴定出靶向Mut-p53的小分子化合物(Peng, Y., 等人, Rescue of mutant p53 transcription function by ellipticine.Oncogene, 2003. 22(29): p. 4478-87)。通过筛选保护分离的p53 DBD免于热变性的分子，鉴定了CP-31398，如通过蛋白加热后PAb1620反应性的维持所评价的(Foster, B.A.,等人, Pharmacological rescue of mutant p53 conformation and function.Science, 1999. 286(5449): p. 2507-10)。CP-31398的作用机制仍不清楚。NMR研究未能检测到CP-31398与p53 DBD的任何结合(Rippin, T.M., 等人, Characterization of the p53-rescue drug CP-31398 in vitro and in living cells. Oncogene, 2002. 21(14): p. 2119-29)。CP-31398以p53依赖和非依赖的方式影响基因表达且诱导细胞死亡。因此，看来CP-3138具有p53以外的其他细胞靶标，这可能是其细胞毒性的原因。
通过使用基于细胞的筛选测定法，发现了在活癌细胞中挽救p53功能的另外两种小分子PRIMA-1和MIRA-1。PRIMA-1和MIRA-1具有类似的活性概况(Bykov, V.J., 等人,Reactivation of mutant p53 and induction of apoptosis in human tumor cells bymaleimide analogs. J Biol Chem, 2005. 280(34): p. 30384-91)，但结构上无关。PRIMA-1是一种前体药物，其转换为结合突变型p53，但也结合其它分子的活性化合物(CellDeath Dis.2015 Jun 18;6:e1794. doi: 10.1038/cddis.2015.143.)，并且它的一些作用似乎独立于突变型p53状态(BMC Cancer. 2015 Oct 13;15:684. doi: 10.1186/s12885-015-1667-1.)。
本发明的一些实施方案的发明人在先前已经描述了噬菌体展示用于选择mutp53-再活化肽的应用(WO2015/019318)。噬菌体肽展示文库具有比化学文库高得多的复杂度。选择过程是基于肽与固定化靶标的结合，洗脱并扩增，并最终通过测序鉴定，从而能够在短时间内筛选大量的分子。将不同的选择策略组合以选择来自不同肽文库的先导物(leads)，并且深度测序所选的集合。显示先导肽在体外和活细胞中赋予mutp53野生型p53样活性，并且导致在几种异种移植模型中携带mutp53的肿瘤的消退。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离肽，其包含在空间和构型上排列为允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)通过DBD的至少一个残基相互作用的氨基酸序列，其中通过所述至少一个残基，pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合所述DBD，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，条件是所述肽不是SEQ ID NO: 59-382。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用是经由DBD的螺旋-2和L1。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用影响DBD的螺旋-2和/或L1的结构稳定性，如通过NMR测定的。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一个残基选自L1的H115、G117和p53的Y126和V274和G279和R280。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少一个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少两个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少三个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少四个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 53)
其中，
X1和X5是带正电荷的氨基酸；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3是任何氨基酸；
X4和X6选自α甲基氨基酸和β断裂子氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 54)
其中，
X1和X5选自His、Arg和Lys；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3、X4、X6是任何氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述带正电荷的氨基酸选自His、二氨基丁酸(Dab)、Arg和Lys。
根据本发明的一些实施方案，X3是D-氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X3是磷酸化的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X3是不可磷酸化的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X3是非氢键结合的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X3选自极性不带电氨基酸和疏水氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X2是Ser。
根据本发明的一些实施方案，X4是α甲基氨基酸且X6是丙氨酸。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽具有氨基酸序列HSAPHP (SEQ ID NO:49)或HSEPHP (SEQ ID NO: 50)。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽包含连接至所述氨基酸序列C-端的至少一个另外的氨基酸(X7)。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一个另外的氨基酸是带负电荷的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一个另外的氨基酸选自Asp、Glu、Gly、Ala和Ser。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一个另外的氨基酸包含两个另外的氨基酸(X7-X8)且其中X8选自His、Dab、Asp和Glu。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽包含连接至所述氨基酸序列N-端的至少一个另外的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽包含连接至所述氨基酸序列N-端的至少两个另外的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述连接至所述氨基酸序列N-端的至少一个另外的氨基酸是Arg。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽进一步包含细胞穿透部分。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞穿透部分连接至所述肽的N-端。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞穿透部分选自脂肪酸部分、蛋白质部分及其组合。
根据本发明的一些实施方案，所述脂肪酸部分包含肉豆蔻酰脂肪酸且所述蛋白质部分包含至少一个带正电荷的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽长度不长于20个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述肽至少部分地将突变型p53蛋白的构象改变为野生型(WT) p53蛋白的构象。
根据本发明的一些实施方案，所述肽至少部分地改变突变型p53蛋白的构象，使得所述突变型p53蛋白被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
根据本发明的一些实施方案，所述突变型p53蛋白不被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
根据本发明的一些实施方案，所述突变型p53蛋白在结合所述肽后，被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
根据本发明的一些实施方案，所述单克隆抗体是Ab1620。
根据本发明的一些实施方案，所述肽至少部分地将突变型p53蛋白的活性恢复至野生型p53蛋白的活性。
根据本发明的一些实施方案，所述活性是降低表达突变型p53蛋白的细胞的生存力。
根据本发明的一些实施方案，所述活性是促进表达突变型p53蛋白的细胞的凋亡。
根据本发明的一些实施方案，所述活性是结合表达突变型p53蛋白的细胞中的p53共有DNA结合元件。
根据本发明的一些实施方案，所述共有DNA结合元件包含SEQ ID NO: 55和56所示的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述结合导致内源性p53靶标基因的至少部分活化。
根据本发明的一些实施方案，所述内源性靶标基因选自p21、MDM2和PUMA。
根据本发明的一些实施方案，所述突变型p53蛋白与野生型p53蛋白的构象不同。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽如SEQ ID NO: 429或448所示。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽如SEQ ID NO: 429、448、446、449或462所示。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽选自SEQ ID NO: 8和412-464。
根据本发明的一些实施方案，所述分离肽不是SEQ ID NO: 59-382中所示的任何肽。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的如本文描述的分离肽，从而治疗所述疾病、病症或病况。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括向所述对象施用治疗有效量的基于铂的化学疗法。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的基于铂的化学疗法和包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合DBD的相同方式进行结合，其中所述肽至少部分地将突变型p53再活化，从而治疗所述疾病、病症或病况。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合DBD的相同方式进行结合，其中所述肽至少部分地将突变型p53再活化，且其中所述治疗有效量为每天0.01-0.3 mg/kg，从而治疗所述疾病、病症或病况。
根据本发明的一些实施方案，所述肽是如本文所述的肽。
根据本发明的一些实施方案，所述肽是pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)。
根据本发明的一些实施方案，所述施用包括皮下施用。
根据本发明的一些实施方案，所述施用包括连续输注。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病是癌症。
除非另有说明，本文使用的全部技术和/或科学术语具有如本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含义。下文描述了示例性的方法和/或材料，但与本文所述的那些相似或等同的方法和材料可以被用于实践或测试本发明的实施方案。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性的且不意图是必然限制性的。
附图简述
本文参考附图，以仅示例的方式描述了本发明的一些实施方案。对于现在详细附图的具体参考，要强调的是所显示的具体内容是以示例的方式，且为了本发明的实施方案的说明性讨论的目的。对此，连同附图的说明将使得可以如何执行本发明的实施方案对于本领域技术人员显而易见。
在图中：
图1是单独或连同顺铂的pCAP-250 (SEQ ID NO: 1)在ES2卵巢癌细胞的生存力测定中的剂量应答。在96孔板中以3000个细胞/孔培养细胞。将pCAP-250的系列稀释物单独或与1µg/ml的顺铂一起添加，并且将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS (1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。使用1 µg/ml处理的ES2细胞的生存力为39%。估计pCAP-250的IC50为3.2µM并且与顺铂组合的pCAP-250的IC50估计为1.9µM，表明两种化合物之间的协同效应。
图2是显示pCAP-250 (SEQ ID NO: 1)和不同衍生物(SEQ ID NOs: 2-19)在ES2卵巢癌细胞的生存力测定中，以及对于如MST测定的对p53 DBD的结合的作用的柱状图。将表达内源mp53S241F的ES2 Con细胞，和其中使用CRISPR/Cas9将p53稳定敲除以控制对mutp53的特异性的ES2 KO细胞(ES2 p53KO)，以3000个细胞/孔培养在96孔板中。以8 µg/ml的浓度添加指示的肽，并且将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS(1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟，在595 nm测定OD。特定肽对ES2 Con相比ES KO的作用的差异，指示肽对mutp53表达的特异性。其中氨基酸(例如丝氨酸和组氨酸)被取代为丙氨酸的数种肽衍生物显示出对ES2 Con细胞的减少的作用，指示这些氨基酸对肽功效的重要性。
图3A-K是荧光标记的WTp53DBD (图3A)或全长p53 (图3B)与指示的肽(SEQ IDNO: 1、4、9)的结合的微量热泳(MST)分析的图。所述根据生产商的说明进行；制备各指示肽(图3A-pCAP-250) (图3A、F、H、I、K pCAP402、pCAP 404、pCAP409和pCAP 364)的10个系列稀释物；向每个肽样品添加标记的蛋白并加载至毛细管。使用不同浓度的肽分析样品的荧光wtp53DBD在温度梯度下的运动。MST分析结果以从生产商数据分析软件获得的曲线来呈现。
图4A-D显示多种施用模式的药代动力学。图4A：1 mg/kg iv施用后的pCAP-250的血浆浓度相对于时间概况(平均值±SD, n=3)。图4B：连续皮下施用7天后的pCAP-250的血浆浓度相对于时间概况(平均值±SD, n=3)。图4C：1 mg/kg iv施用后的pCAP-250的血浆浓度相对于时间概况(平均值±SD, n=3)。图4D：1 mg/kg皮下施用后的pCAP-250的血浆浓度相对于时间概况(平均值±SD, n=3)。
图5A-D：pCAP-250肽在小鼠异种移植模型中的体内效果。
将表达荧光素酶的2*105个ES2细胞注射至裸小鼠臀部。测量生物发光。注射后12天，将小鼠随机分配至4个组，并每周三次肿瘤内注射2种对照肽(pCAPs 76和12；每种肽5 μg)的混合物或pCAP-250 (10 μg)。可选地，向小鼠移植Alzet微型泵，其含有在PBS中0.8 mg对照肽或在PBS中0.8 mg pCAP-250。图5A，在实验终止时(第21天)，对照组小鼠和肿瘤内pCAP-250治疗的小鼠的活体成像。图5B，在实验终止时(第14天)，对照组小鼠和Alzet微型泵pCAP-250治疗的小鼠的活体成像。图5C，对照小鼠和有效的pCAP-250组：显示作为时间的函数的肿瘤中荧光素酶读数的箱线图；显示了在治疗开始之前(至第0天)和之后的平均值(水平线)，标准差(盒)，最高和最低读数。IVIS系统的背景阈值检测水平为约5x106个光子。图5D，对照小鼠和有效的pCAP-250组：显示作为时间的函数的肿瘤中荧光素酶读数的箱线图；显示了在治疗开始之前(至第0天)和之后的平均值(水平线)，标准差(盒)，最高和最低读数。IVIS系统的背景阈值检测水平为约5x106个光子。
图6A-C显示HSTPHPD肽序列在P53 DNA结合结构域(DBD)的表面上的可选预测的肽结合位置。DBD以青色卡通图像显示，且预测的肽以洋红色棒显示。图6A：DBD肽复合物的概览。图6B：DBD-肽结合交界面的更近的检查。图6C：DBD (链B)和预测的肽结合位置(链A)之间的非键相互作用的详细的原子列表。
图7显示一式三份的p53再活化肽的剂量应答效果。SW489细胞系包含p53突变型p53R273H。在96孔板中以3000个细胞/孔培养细胞。添加不同肽的系列稀释物并且将板在37℃另外温育72h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS (1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。将结果归一化至未处理细胞100%生存力。
图8显示了一式三份的p53再活化肽的剂量应答效果。ES2细胞系包含p53突变型S241F。在96孔板中以3000个细胞/孔培养细胞。添加不同肽的系列稀释物并且将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS (1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。将结果归一化至未处理细胞100%生存力。
图9显示在293 K处获得的野生型p53核心结构域(DBD)的1H-15N HSQC谱，由Wong等人产生的DBD (SEQ ID NO: 44的94-312)谱和残基分配以黑色显示[Wong, K.B., 等人,Hot-spot mutants of p53 core domain evince characteristic local structuralchanges. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(15): p. 8438-42]。对游离DBD (94-296)和对DBD-pCAP 250复合物产生的NMR谱分别以蓝色和红色显示。中等(C277和R280)和强烈的峰变化(G117)的实例分别以洋红色和棕色突出显示。H115和Y126的峰区域以黄色突出显示。
图10显示对于由于pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)与DBD结合而导致的1H-15N HSQC谱变化，DBD结构的作图。DBD结构以卡通图像显示且DNA为黄色。来自Wong等人(同上)的分析的未分配的残基为绿色，且涉及在添加pCAP 250后峰变化的残基为洋红色。
图11A-B显示了H115、G117和Y126的结构重组。DBD结构以卡通图像显示且DNA为黄色。H115、G117和Y126显示为绿色棒，且L1环为洋红色。图11A和11B分别呈现了由NMR (pdb码2FEJ)解析的前两种最佳能量的DBD构象。
图12显示了在293 K获得的野生型p53 DBD-肽复合物的1H-15N HSQC谱。对DBD-pCAP 250和对DBD-pCAP 615 (SEQ ID NO: 465)蛋白肽复合物产生的NMR谱分别以红色和绿色显示。H115和Y126的峰以圆形突出显示。
图13显示了在293 K获得的野生型p53 DBD和DBD-pCAP 553 (SEQ ID NO: 429)-复合物的1H-15N HSQC谱。对游离DBD和对DBD-pCAP 553蛋白肽复合物产生的NMR谱分别以蓝色和红色显示。特异性地出现在pCAP 553肽版本中的强烈未分配的峰以绿色椭圆形突出显示。在DBD-pCAP 553复合物中变得更加致密且圆的峰的几个实例以棕色椭圆形突出显示。
图14显示DBD-pCAP 250复合物的前两种预测的肽结合模型。DBD结构以卡通图像显示且DNA为黄色。H115、G117和Y126显示为绿色棒，且L1环为洋红色。DBD-pCAP 250复合物的前两种预测的肽结合模型为青色。
发明详述
本发明，在其一些实施方案中，涉及肽及其在治疗与突变型p53相关的疾病、病症或病况中的用途。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不一定将其应用限制于以下说明中所示或通过实施例示例的细节。本发明能够具有其它实施方案或能够以各种方式实践或实施。
本发明的一些实施方案的发明人在先前已经描述了噬菌体展示用于选择mutp53-再活化肽的应用(WO2015/019318，其通过引用以其整体并入本文)。显示包括pCAP 250(SEQ ID NO: 1)的先导肽在体外和活细胞中赋予mutp53野生型p53样活性，并且导致在几种异种移植模型中携带mutp53的肿瘤的消退。
在将本发明变成实践时，本发明人已经发现pCAP 250结合p53的DNA结合结构域(DBD)。使用丙氨酸扫描的结构/功能分析揭示了pCAP 250结合DBD的共有序列。
NMR实验结果提供了pCAP 250及其肽变体明确结合p53蛋白的野生型DBD的进一步证据。这些结果支持了使用微量热泳(MST)分析(图3A-K)的关于pCAP 250与DBD结合的发现。NMR结果进一步指示pCAP 250及其肽变体的结合诱导DBD中的结构变化，其直接影响了DBD-DNA结合界面区(即螺旋-2和L1环结构基序，其对于DBD结合DNA的能力至关重要)的完整性和稳定性。pCAP 250及其肽变体的结合进一步影响了螺旋2和L1环结构基序周围的另外的残基，在DBD表面产生相对大且明确受影响斑块(patch)。
这些发现允许设计新型肽，所述肽与p53的DBD共享相同的相互作用，且能够至少部分地使突变型p53再活化，被赋予抗癌活性的此类肽显示于实施例5中。
因此，根据本发明的一个方面，提供了分离肽，所述肽包含在空间和构型上排列为允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)通过DBD的至少一个残基相互作用的氨基酸序列，其中通过所述相同的至少一个残基，pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合所述DBD，其中所述肽至少部分地将突变型p53再活化。
根据具体的实施方案，所述肽不是WO2015/019318的SEQ ID NO: 1-338，368-382(即本文的SEQ ID NO: 59-382)。
根据具体的实施方案，所述肽不是WO2015/019318 (通过引用以其整体并入本文)中教导的具有使突变型p53再活化的活性的任何肽。
如本文所用的术语“分离的”是指至少部分地与自然环境(例如与身体或从肽文库)分开。
如本文所用的术语“p53”也被称为“TP53”，是指编码EC 2.7.1.37的蛋白产物的基因序列，其通常作为转录因子起作用，调节细胞周期，因此在其野生型形式下作为肿瘤抑制基因起作用。根据具体的实施方案，p53是人p53。
如本文所用，术语“野生型p53”、“wt p53”和“WT p53”可互换地使用并且涉及野生型p53蛋白，具有野生型p53蛋白的构象且因此具有野生型p53蛋白的活性。在一些实施方案中，野生型p53可以通过特异性单克隆抗体鉴定。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是Ab1620。
所述蛋白的结构数据可以得自PDBeRCSB。
关于蛋白的术语“构象”涉及蛋白在空间中的结构排列(折叠)。
如本文所用，术语“突变型p53”、“Mut-p53”、“突变的p53”和“p53突变型”可互换地使用且涉及突变的p53蛋白，其不能有效地在靶标细胞中起作用。在一些实施方案中，突变型p53不能结合其靶标位点。在一些实施方案中，突变型p53在DNA结合结构域(DBD)区域突变。在一些实施方案中，突变型p53错误折叠成失活构象。在一些示例性实施方案中，突变型p53是温度敏感型(ts)突变型p53R249S (R249S p53)、热点全长突变型p53 Mut-p53 R175H(R175H p53)或任何其他突变型p53蛋白。在一些实施方案中，通过特异性单克隆抗体鉴定突变型p53，所述抗体能够识别p53的错误折叠构象(由p53的突变诱导)。在一些实施方案中，突变型p53通过特异性单克隆抗体鉴定。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是Ab420。
在某些实施方案中，突变型p53蛋白包含选自以下的突变：R175H、V143A、R249S、R273H、R280K、P309S、P151S、P151H、C176S、C176F、H179L、Q192R、R213Q、Y220C、Y220D、R245S、R282W、D281G、S241F、C242R、R248Q、R248W、D281G、R273C和V274F。每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。
如本文所述的术语“再活化肽”、“突变型p53再活化肽”或“所述肽”可以互换地使用并且涉及能够至少部分地使突变型p53恢复活性的肽。如本文所用的短语“再活化突变型p53蛋白”是指这样的肽，在其与突变型p53蛋白相互作用后，增加了所述突变型p53蛋白的至少一种活性，其中所述活性是野生型p53蛋白的活性。例如，在与本发明提供的肽相互作用后，突变型p53蛋白可以以野生型p53蛋白在相似情况下的相似方式，直接或间接地增加促凋亡蛋白(诸如半胱天冬酶)在癌细胞中的表达；或在体内抑制肿瘤，如可以使用疾病的异种移植小鼠模型测定的。
不受到理论的制约，这表明所述再活化肽在DBD结合突变型p53并且热力学地稳定野生型p53蛋白折叠并且因此恢复肿瘤抑制功能。
在一些实施方案中，所述再活化肽可以通过影响突变型p53的构象，再活化突变型p53，以呈现与天然的野生型p53更相似或相同的构象。在一些实施方案中，所述再活化肽可以再活化突变型p53以恢复突变型p53与靶标DNA中的野生型p53结合位点的结合。在一些实施方案中，所述再活化肽可以恢复突变型p53的生化性质。在一些实施方案中，所述再活化肽可以诱导突变型p53蛋白以展示癌细胞的p53-选择性抑制。在一些实施方案中，所述再活化肽可以再活化突变型p53，以使其具有与野生型p53相似(即，在突变型p53和野生型p53之间±, 10%、20%、30%的差异)或相同的结构性质、生化性质、生理性质和/或功能性质，诸如本文描述的结合/结构测定(例如MST和NMR)所确定的。
在一些实施方案中，所述再活化肽是具有3-30个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有7-30个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有12-30个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有3-25个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有7-25个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有12-25个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有3-22个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有7-22个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有12-22个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有7-9个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有6-9个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有7-10个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是具有6-10个氨基酸的长度的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为9-10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为8-10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为6-9个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为6-8个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为6-7个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为7-8个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为7-9个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为5-20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为6-15个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述再活化肽是长度为7或12个氨基酸的肽。
如在本文中可互换使用的术语“能够至少部分地再活化突变型p53蛋白”或“至少部分地再活化突变型p53蛋白”是指这样的肽，其中当所述肽与突变型p53蛋白结合后，突变型p53蛋白获得或增加了与野生型p53蛋白相应活性相似的活性。
如本文所用的p53的“DNA结合结构域”或“DBD”是指p53的结合靶蛋白中p53应答元件的结构域(例如共有DNA结合元件包含SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列或由其组成)，其通常归于人p53 (全长p53 GenBank: BAC16799.1，SEQ ID NO: 44)的残基94-292、91-292、94-293、94-296、91-296、91-293、94-312或92-312。根据具体的实施方案，所述DBD是突变的p53的。
如提及的，所述肽包含在空间和构型上排列为允许所述肽与p53的DBD通过至少一个DBD的残基相互作用的氨基酸序列，其中pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)通过所述至少一个残基与DBD结合。
因此，根据本发明的一些实施方案的再活化肽通常与p53的DBD结构域结合，使得所述肽的反应基团定位于足够接近DBD中相应的反应基团(通常为氨基酸残基的侧链)，从而允许在DBD中存在有效浓度的所述肽，并且另外地，所述肽的反应基团以适当的方向定位，以允许重叠和因此允许强化学相互作用和低解离。根据本发明的一些实施方案的再活化肽因此通常包括已知参与相互作用的结构元件，并且还可以具有其构象灵活性的限制，从而避免影响或减弱其与p53的DBD结合的构象变化。
根据一些实施方案，所述相互作用是经由所述DBD的螺旋-2和L1。
通常，螺旋-2定位于氨基酸276-289之间，且L1位于氨基酸112-124之间。
根据一些实施方案，所述相互作用影响所述DBD的螺旋-2和/或L1的结构稳定性，如通过NMR测定的。
根据一些实施方案，DBD中介导与所述肽相互作用的至少一个残基选自：p53的L1的H115、G117和p53的Y126和V274和G279和R280 (野生型或突变型，其中氨基酸差异通常是不显著影响氨基酸编号的单一氨基酸)。但是，技术人员将知晓如何找到相应的氨基酸(就突变型p53中的组成和位置而言)。
根据一些实施方案，所述肽与DBD的相互作用是非共价的，例如水介导的氢键结合相互作用。
根据一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少一个氨基酸。
根据一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少两个氨基酸。
根据一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少三个氨基酸。
根据一些实施方案，所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少四个氨基酸。
根据具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Trp146和/或Gln144。这种相互作用可能经由pCAP 250的Ser或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Tyr126、Asn128和/或Asp268。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Lys101，经由pCAP250的Asp10或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Thr102，经由pCAP250的Asp10或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Phe113，经由pCAP250的Thr6或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Trp146，经由pCAP250的Ser5或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Ser5，经由pCAP250的Thr6或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸His8，经由pCAP250的Thr6或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Gly112，经由pCAP250的Ser5或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
根据另一个具体的实施方案，所述相互作用是与人p53的氨基酸Gly112，经由pCAP250的Thr6或类似结构的其类似物，如下文进一步描述的。
另外提出的用于在p53 DBD表面上的相互作用的位置在图6A-C列出，其被认为是说明书的一部分，其中每种可能代表了一个独立的实施方案。
另外提出的用于在p53 DBD表面上的相互作用的位置在图9-14列出，其被认为是说明书的一部分，其中每种可能代表了一个独立的实施方案。
阐明在所述肽或在所述DBD中对相互作用非常重要的氨基酸的方法是本领域熟知的并且包括，但不限于晶体学，以及使用基于计算机的算法，例如AnchorDock (Ben ShimonStructure.2015 May 5;23(5):929-40)，虚拟晶体学计算器V.2.等。
根据具体的实施方案，所述肽包含共有基序。
如本文使用的术语“共有基序”是指连续或不连续的至少3个氨基酸、4、5或6个氨基酸的氨基酸序列。根据具体的实施方案，所述共有基序是6个连续氨基酸的长度。
根据具体的实施方案，所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 53)
其中，
X1和X5是带正电荷氨基酸；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3是任何氨基酸；
X4和X6选自α甲基氨基酸和β断裂子氨基酸。
根据具体的实施方案，所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 54)
其中，
X1和X5选自His、Arg和Lys；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3、X4、X6是任何氨基酸。
如本文所用的“带正电荷氨基酸”是可以在生理pH下带正电(即质子化)的氨基酸。
根据一个实施方案，所述带正电荷氨基酸选自His、二氨基丁酸(Dab)、Arg和Lys。
根据具体的实施方案，X3是D-氨基酸。
根据具体的实施方案，X3是磷酸化的(例如磷酸丝氨酸)或其仿磷酸化物(例如Glu或Asp)。
根据具体的实施方案，X3是不可磷酸化的氨基酸(例如Val)。
根据具体的实施方案，X3是非氢键结合的氨基酸(例如Ala)。
根据具体的实施方案，X3选自极性不带电荷氨基酸(例如Ser)和疏水氨基酸(例如Ile)。
根据具体的实施方案，X2是Ser。
根据具体的实施方案，X4和X6选自Ser、Thr、Pro、Ala和Gly。
根据具体的实施方案，X4是α甲基氨基酸或β断裂子，例如Pro、Aib或Ala。
根据具体的实施方案，X4是α甲基氨基酸。
根据具体的实施方案，X6是Ala。
根据具体的实施方案，所述肽具有氨基酸序列HSAPHP (SEQ ID NO: 46)。
根据具体的实施方案，所述肽包含连接至所述氨基酸序列C-端的至少一个另外的氨基酸(X7)。
根据具体的实施方案，所述至少一个另外的氨基酸是带负电荷的氨基酸(即在生理pH下通常带负电(即去质子化)的氨基酸)或小氨基酸(例如Gly、Ala、Val)。
根据具体的实施方案，所述至少一个另外的氨基酸选自Asp、Glu、Gly、Ala和Ser。
根据具体的实施方案，所述至少一个带负电荷的氨基酸是Asp。
根据具体的实施方案，所述至少一个另外的氨基酸包含两个另外的氨基酸(X7-X8)且其中所述X8选自His、Dab、Asp和Glu。
根据具体的实施方案，所述至少一个带负电荷的氨基酸是Asp或两个连续Asp残基。
根据具体的实施方案，所述肽包含连接至所述氨基酸序列N-端的至少一个另外的氨基酸。
根据具体的实施方案，所述肽包含连接至所述氨基酸序列N-端的至少两个另外的氨基酸。
根据具体的实施方案，连接至所述氨基酸序列N-端的至少一个另外的氨基酸是Arg或两个连续的Arg残基。
所述肽与DBD的结合可以使用本领域已知的任何方法确定，诸如竞争测定，其中使用可溶性DBD作为竞争剂。
如本文所用的术语“重组或合成肽”是指通过本领域已知的标准生物技术方法产生的肽，诸如在细菌中表达或固相肽合成(SPPS)。
根据具体的实施方案，所述肽进一步包含细胞穿透部分，其可以连接至所述肽的N-端、所述肽的C-端或所述肽的两个末端。应当理解，这个部分还可以不经由其末端结合至肽主体，只要其不干扰所述肽与DBD的结合。应当理解，这个部分是异源部分，其不以相同方式(即，在位置或化学方面)结合天然的肽。
如本文使用的术语“穿透性”是指试剂或物质穿透、弥散或分散通过屏障、膜或皮肤层的能力。“细胞穿透性”或“细胞穿透”部分是指能够促进或增强分子通过膜穿透的本领域已知的任何分子。
如本文所用的短语“穿透性增强部分”是指增强任何连接的肽跨越细胞膜的转位的试剂。
可以使用本领域中已知的主动或被动促进或增加组合物至细胞内的穿透性的任何部分，用于与根据本发明的肽核心缀合。非限制性的实例包括：疏水部分诸如脂肪酸、类固醇和大体积芳族或脂肪族化合物；可以具有细胞膜受体或载体的部分，诸如类固醇、维生素和糖、天然(例如带正电荷的氨基酸，例如Lys或Arg)和非天然氨基酸和蛋白部分，例如转运肽，也被称为“细胞穿透肽”或CPP、多聚精氨酸或多聚赖氨酸、其组合，或抗体。根据一些实施方案，所述蛋白质部分是CPP。根据一些实施方案，所述蛋白质部分是多精氨酸。根据一些实施方案，所述疏水部分是脂质部分或氨基酸部分。根据本发明的一些实施方案，所述细胞穿透部分是蛋白部分和基于脂质部分的组合(例如，一个来自肽的N端且另一个来自肽的C端)。
细胞穿透肽(CPP)是短肽(≤40个氨基酸)，具有获得进入几乎任何细胞内部的能力。它们高度阳离子性并且通常富含精氨酸和赖氨酸氨基酸。事实上，本发明人已经使用带正电荷的氨基酸(在任一肽末端)或多聚阳离子氨基酸(至少2个，例如2-12个)多聚-Arg来赋予所述肽细胞穿透性。它们具有将各种共价和非共价缀合的负荷，诸如蛋白质、寡核苷酸和甚至200nm的脂质体携带进入细胞的优越性质。因此，根据另外的示例性实施方案，CPP可以用于将肽转运至细胞内部。
TAT (来自HIV-1的转录激活因子)、pAntp (也称为穿透素(penetratin)，果蝇触角足基因同源结构域转录因子)和VP22 (来自单纯性疱疹病毒)是CPP的实例，其可以以无毒且有效的方式进入细胞并且可适合用于本发明的一些实施方案。产生CPP-负荷缀合物和使用此类缀合物感染细胞的方案可以见于，例如L Theodore等人[The Journal ofNeuroscience, (1995) 15(11): 7158-7167], Fawell S, 等人[Proc Natl Acad SciUSA, (1994) 91:664–668]，和Jing Bian等人[Circulation Research (2007) 100:1626-1633]。
然而，本公开并不限于此，且可以使用任何合适的穿透剂，如本领域技术人员已知的。
当本发明的肽连接至细胞穿透肽时，可以理解为全长肽不大于50个氨基酸、不大于40个氨基酸、不大于35氨基酸、不大于30氨基酸、不大于25氨基酸、不大于22氨基酸、不大于20氨基酸、不大于15氨基酸、不大于12氨基酸、不大于10氨基酸、不大于9个氨基酸、不大于8氨基酸，或不大于7氨基酸。
非蛋白质的细胞穿透部分的非限制实例包括：疏水部分诸如脂质、脂肪酸、类固醇和大体积芳族或脂肪族化合物；可以具有细胞膜受体或载体的部分，诸如类固醇、维生素和糖，纳米颗粒和脂质体。
如本文所用的术语“脂肪酸部分”是指脂肪酸的部分，其展示与相应的完整脂肪酸来源分子相似的具体的化学和药理学特征的组。该术语进一步是指包含脂肪(羧)酸的酰基组分的任何分子种类和/或分子片段。
根据本发明的穿透性增强部分优选经由直接键合或经由接头共价连接至所述肽序列，以形成肽缀合物。所述穿透性增强部分可以直接或通过间隔物连接至所述肽部分的任何位置，优选连接至肽的氨基末端。根据某些实施方案，所述穿透性增强部分是脂肪酸。
根据本发明的疏水部分可以优选包含脂质部分或氨基酸部分。根据具体的实施方案，所述疏水部分选自：磷脂类、类固醇类、鞘氨醇、神经酰胺类、辛基-甘氨酸、2-环己基丙氨酸、苯甲酰基苯丙氨酸、丙酰基(C3)；丁酰基(C4)；戊酰基(C5)；己酰基(C6)；庚酰基(C7)；辛酰基(C8)；壬酰基(C9)；癸酰基(C10)；十一烷酰基(C11)；月桂酰基(C12)；十三烷酰基(C13)；肉豆蔻酰基(C14)；十五烷酰基(C15)；棕榈酰基(C16)；phtanoyl ((CH3)4)；十七烷酰基(C17)；硬脂酰基(C18)；十九烷酰基(C19)；花生酰基(arachidoyl) (C20)；二十一烷酰基(heniecosanoyl) (C21)；山萮酰基(C22)；二十三烷酰基(trucisanoyl) (C23)；和二十四烷酰基(lignoceroyl) (C24)；其中所述疏水部分以酰胺键、巯基、胺、醇、酚基或碳-碳键连接至所述嵌合多肽。
根据本发明可以使用的脂类部分的其它实例为：Lipofectamine、Transfectace、Transfectam、Cytofectin、DMRIE、DLRIE、GAP-DLRIE、DOTAP、DOPE、DMEAP、DODMP、DOPC、DDAB、DOSPA、EDLPC、EDMPC、DPH、TMADPH、CTAB、赖氨酰-PE、DC-Cho、-丙氨酰胆固醇；DCGS、DPPES、DCPE、DMAP、DMPE、DOGS、DOHME、DPEPC、普兰尼克(Pluronic)、Tween、BRIJ、缩醛磷脂、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱、甘油-3-乙基磷脂酰胆碱、二甲基铵丙烷、三甲基铵丙烷、二乙基铵丙烷、三乙基铵丙烷、二甲基双十八烷基溴化铵、鞘脂类，鞘磷脂、溶血脂(lysolipid)、糖脂(glycolipid)、硫苷脂(sulfatide)、鞘糖脂、胆固醇、胆固醇酯、胆固醇盐、油、N-琥珀酰基二油酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油、1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰基甘油、1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油基磷脂酰乙醇胺、棕榈酰基高半胱氨酸、N,N'-双(十二烷基氨基羰基亚甲基)-N,N'-双((-N,N,N-三甲基铵乙基-氨基羰基亚甲基)乙二胺四碘化物；N,N''-双(十六烷基氨基羰基亚甲基)-N,N',N''-三((-N,N,N-三甲基铵-乙基氨基羰基亚甲基二亚乙基三胺六碘化物；N,N'-双(十二烷基氨基羰基亚甲基)-N,N''-双((-N,N,N-三甲基铵乙基氨基羰基亚甲基)亚环己基-1,4-二胺四碘化物；1,7,7-四-((-N,N,N,N-四甲基铵乙基氨基-羰基亚甲基)-3-十六烷基氨基羰基-亚甲基-1,3,7-三氮杂庚烷七碘化物；N,N,N',N'-四((-N,N,N-三甲基铵-乙基氨基羰基亚甲基)-N'-(1,2-二油酰基甘油基-3-磷酰乙醇氨基羰基亚甲基)二亚乙基三胺四碘化物；二油酰基磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、溶血脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘脂、糖脂、糖脂(glucolipid)、硫苷脂、鞘糖脂、磷脂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、携带聚合物的脂质、携带磺化糖的脂质、胆固醇，生育酚半琥珀酸酯、具有醚连接的脂肪酸的脂质、具有酯连接的脂肪酸的脂质、聚合脂质，磷酸二乙酰酯、硬脂胺、心磷脂、具有6-8个碳长度的脂肪酸的磷脂、具有不对称酰基链的磷脂、6-(5-胆甾烯(cholesten)-3b-基氧基)-1-硫代-b-D-吡喃半乳糖苷、二半乳糖基二甘油酯、6-(5-胆甾烯-3b-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-b-D-吡喃半乳糖苷、6-(5-胆甾烯-3b-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-a-D-吡喃甘露糖苷、12-(((7'-二乙基氨基-香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)-十八烷酸；N-[12-(((7'-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基-氨基)十八烷酰基]-2-氨基棕榈酸；胆甾醇)4'-三甲基-铵基)丁酸酯；N-琥珀酰基二油酰基-磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰基-sn-甘油；1,2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰基-甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油、1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油基-磷酸乙醇胺和棕榈酰基高半胱氨酸。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文使用的术语“肽”涵盖天然肽(降解产物、合成的合成肽或重组肽)和拟肽(通常为合成的合成肽)，以及类肽和半肽，它们是肽类似物，可以具有例如使肽在体内时更稳定或更能够穿透至细胞内的修饰。这样的修饰包括，但不限于N端修饰，C端修饰，肽键修饰，主链修饰和残基修饰。制备拟肽化合物是方法是本领域熟知的，并且例如在Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin PergamonPress (1992)中指出，其通过引入并入本文，如同完全在本文中阐述。下文提供了这方面的进一步的细节。
所述肽内的肽键(-CO-NH-)可以被取代，例如，通过N-甲基化酰胺键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(=O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、亚磺酰基亚甲基键(-S(=O)-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-CH2-NH-)、硫键(-CH2-S-)、亚乙基键(-CH2-CH2-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯族双键(-CH=CH-)、氟化烯族双键(-CF=CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是“正常”侧链，天然地存在于碳原子上。
这些修饰可以发生在肽链的任何键上并且甚至可以同时在几个(2-3)键上发生。
“保守取代”是指一种类型中的氨基酸被相同类型中的氨基酸取代，其中类型通过共同的物理-化学氨基酸侧链性质和自然界中发现的同源蛋白中的高取代频率来定义，如例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵来确定。已经归类出氨基酸侧链的六个一般类型且包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gin、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(He、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，用Asp取代另一III类残基诸如Asn、Gin或Glu是保守取代。
其它分类包括带正电氨基酸(Arg、His、Lys)、带负电氨基酸(Asp、Glu)、极性不带电(Ser、Thr、Asn、Gln)、疏水侧链(Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp)。
“非保守取代”是指一种类型中的氨基酸被来自另一种类型的氨基酸取代；例如，Ala (II类残基)被III类残基(诸如Asp、Asn、Glu或Gin)取代。
天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被非天然芳族氨基酸诸如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、萘基丙氨酸、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或O-甲基-Tyr取代。其它合成选项列于下文表2中。
本发明的一些实施方案的肽还可以包括一种或多种经修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
术语“(一种或多种)氨基酸”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸在体内通常翻译后修饰，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它非天然氨基酸包括，但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸两者。
下文的表1和表2列出了天然存在的氨基酸(表1)和非常规氨基酸或经修饰的氨基酸(例如合成的，表2)，其可以用于本发明的一些实施方案中。
表1
氨基酸 三字母缩写 单字母符号
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酰胺 Gln Q
谷氨酸 Glu E
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
如上的任何氨基酸 Xaa X
表2
本发明的一些实施方案的肽优选以线性形式使用，尽管将理解，在环化没有严重干扰肽特征的情况下，也可以使用肽的环状形式。
为了改善生物利用度，所述肽可以包含至少一个D氨基酸(例如2-7个、2-6个、2-5个、2-4个、2-3个)。根据具体的实施方案，所述肽中的全部氨基酸都是D氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽是化学修饰的。
“化学修饰的”是指通过天然过程或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸。在许多已知的修饰中，典型但不排他的实例包括：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、糖胺多糖化、GPI锚形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、肉豆蔻酰化(myristlyation)、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、泛素化或任何类似过程(参见例如，SEQ ID NO: 2、17-19)。
根据具体的实施方案，所述肽可以包含C端酰胺化。
还可选地或另外地，所述肽可以缀合至非蛋白、非毒性部分，诸如但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(苯乙烯共马来酸酐)(SMA)，和二乙烯醚和马来酸酐共聚物(DIVEMA)。
应理解，本发明的肽还可以利用展示出期望活性(例如p53突变型的再活化)的肽同源物，在本文中也称作功能等同物，借以根据本领域已知的方法(诸如本文所述的)确定肽同源物的活性。此类同源物可以是例如，与SEQ ID NO: 53或54或1至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少5%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同(只要其不是WO2015/019318中公开的肽(例如SEQ ID NO: 286-321))。
根据具体的实施方案，所述肽包含氨基酸序列或如SEQ ID NO: 8、412-464中所示。
根据具体的实施方案，所述肽选自以下序列：SEQ ID NO: 429、448、449、446和462。
在某些实施方案中，所述肽至少部分地将突变型p53蛋白的构象改变为野生型(WT) p53蛋白的构象。
本领域已知，仅特异性识别野生型p53蛋白的抗体。此类抗体在确定某些p53蛋白(野生型或突变型)是否维持了野生型的功能p53蛋白的构象中高度有用。因此，在某些实施方案中，所述肽至少部分地改变突变型p53蛋白的构象，使得所述突变型p53蛋白被专门针对野生型p53蛋白或针对保持野生型p53蛋白构象的p53蛋白的单克隆抗体识别。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是Ab1620。
应当理解，因为p53从两个等位基因表达，细胞内p53总含量可以为野生型(wt/wt)、野生型和突变型p53的混合物(wt/mut)，或仅突变型p53 (当两个等位基因均突变(mut/mut)，或一个等位基因缺失(mut/-)时)。在癌症中，情况通常是wt/mut、mut/mut或mut/-。因为p53作为四聚体起作用，突变型p53蛋白可以使可存在于癌细胞中的野生型p53蛋白的活性被废除。因此，本发明提供的肽特别可用于治疗其中野生型p53蛋白的水平增加没有产生结果的癌症。
在某些实施方案中，所述肽至少部分地将突变型p53蛋白的活性恢复为野生型p53蛋白的活性的至少一种。
如本文所用的术语“减少”是指在相同测定条件下，与对照(例如使用对照媒介物处理或完全没有处理的相同细胞/动物系统)相比，使特定表型在统计上显著地下降至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、95%或甚至100%。
如本文所用的术语“增加”或“改善”是指在相同测定条件下，与对照(例如使用对照媒介物处理或完全没有处理的相同细胞/动物系统)相比，使特定表型在统计上显著地增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、95%或甚至100%。
如本文所用的术语“表达突变型p53蛋白的细胞”是指从至少一个等位基因表达突变型p53蛋白的细胞。在某些实施方案中，术语“表达突变型p53蛋白的细胞”与“癌细胞”是可互换的。
术语“促凋亡基因”是指直接(例如某些半胱天冬酶)或间接(例如，作为信号转导级联的以部分)参与凋亡的一个基因，或大量基因。
在某些实施方案中，所述活性是降低表达突变型p53蛋白的细胞的生存力。在某些实施方案中，所述活性是促进表达突变型p53蛋白的细胞的凋亡。在某些实施方案中，所述活性是活化表达所述突变型p53蛋白的细胞的促凋亡基因。在某些实施方案中，所述促凋亡基因选自CD95、Bax、DR4、DR5、PUMA、NOXA、Bid、53AIP1和PERP。每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。
在某些实施方案中，所述活性是结合表达突变型p53蛋白的细胞中的p53共有DNA结合元件。在某些实施方案中，所述共有DNA结合元件包含SEQ ID NO: 55和56中所示的核酸序列或由其组成。
监测通过本发明的任何肽诱导的细胞变化的方法是本领域已知的并且包括例如，MTT测试，其是基于活细胞将黄色的盐MTT (3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴)(Sigma, Aldrich St Louis, MO, USA)还原为蓝紫色不可溶甲臜沉淀物的选择能力；BrDu测定[Cell Proliferation ELISA BrdU比色试剂盒(Roche, Mannheim, Germany]；TUNEL测定[Roche, Mannheim, Germany]；Annexin V测定[ApoAlert® Annexin V ApoptosisKit (Clontech Laboratories, Inc., CA, USA)]；衰老相关的β-半乳糖苷酶测定(DimriGP, Lee X,等人1995. A biomarker that identifies senescent human cells inculture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 92:9363-9367)；以及多种RNA和蛋白检测方法(其检测表达和/或活性水平)，其进一步在下文中描述。
在某些实施方案中，所述结合导致内源性p53靶标基因的至少部分活化。在某些实施方案中，所述内源性靶标基因选自p21、MDM2和PUMA。每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。
在某些实施方案中，所述突变型p53蛋白与野生型p53蛋白的构象不同。在某些实施方案中，所述突变型p53蛋白与野生型p53蛋白相比至少部分失活。
在某些实施方案中，所述突变型p53蛋白不被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。在某些实施方案中，所述突变型p53蛋白在结合所述肽后，被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是Ab1620。
在一些实施方案中，所述再活化肽可以将突变型p53再活化至具有与野生型p53蛋白相似或相同的结构性质、生化性质、生理性质和/或功能性质。
根据一些实施方案，提供了突变型p53再活化肽，其中所述肽长度为约3-25个氨基酸。在一些实施方案中，所述突变型p53再活化肽长度为约4-15个氨基酸。在一些实施方案中，所述突变型p53再活化肽长度为约7-12个氨基酸。在一些实施方案中，所述突变型p53再活化肽长度为7个氨基酸。在一些实施方案中，所述突变型p53再活化肽长度为12个氨基酸。每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。
在本申请全文中描述了其它肽长度。每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。
根据一些实施方案，突变型p53再活化肽可以影响突变型p53，使其可以反式活化在其启动子上具有野生型p53结合元件的报道基因(诸如荧光素酶)。在一些实施方案中，报道基因的反式活化可以在体外(例如在试管或孔中)或在体内，在具有报道基因构建体的细胞内进行。
根据一些实施方案，突变型p53再活化肽可以结合至突变型p53的DNA结合结构域(DBD)。在一些实施方案中，突变型p53在其DNA结合结构域(DBD)中带有突变。
如本文使用的术语“药物组合物”是指包含至少一种药物活性成分的任何组合物。
如本文使用的术语“与突变型p53蛋白相关”是指由突变型p53蛋白引起的，或其进展涉及突变型p53蛋白在细胞或器官中的存在的任何疾病、病症或病况。
应当理解，因为p53从两个等位基因表达，细胞内p53总含量可以为野生型(wt/wt)、野生型和突变型p53的混合物(wt/mut)，或仅突变型p53 (当两个等位基因均突变(mut/mut)，或一个等位基因缺失(mut/-)时)。在癌症中，情况通常是wt/mut、mut/mut或mut/-。因为p53作为四聚体起作用，突变型p53蛋白使确实存在于癌细胞中的野生型p53蛋白的活性被废除。因此，本发明提供的肽特别可用于治疗癌症。值得注意的是，细胞可以具有多于2个p53等位基因，其中至少一个是突变型p53。
如本文使用的术语“治疗有效量”是指含有根据本发明的肽的组合物的量，所述量足以降低、减少和/或抑制个体内的疾病、病症或病况。
根据本发明的一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的如本文所述的分离肽(例如SEQ ID NO:8、412-464)，从而治疗所述疾病、病症或病况。
根据本发明的一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型上允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ IDNO: 1)结合DBD的相同方式进行结合，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，且其中所述治疗有效量是每天0.01-0.3 mg/kg或每天0.01-0.2 mg/kg (例如每天0.01-0.35mg/kg、每天0.01-0.35 mg/kg、每天0.01-0.15 mg/kg、每天0.01-0.1 mg/kg、每天0.01-0.095 mg/kg、每天0.01-0.09 mg/kg、每天0.01-0.085 mg/kg、每天0.01-0.08 mg/kg、每天0.01-0.075 mg/kg、每天0.01-0.07 mg/kg、每天0.01-0.065 mg/kg、每天0.01-0.06 mg/kg、每天0.01-0.055 mg/kg、每天0.01-0.05 mg/kg、每天0.01-0.45 mg/kg、每天0.01-0.04mg/kg、每天0.01-0.035 mg/kg、每天0.01-0.03 mg/kg)，从而治疗所述疾病、病症或病况。
如本文提及的，术语“治疗疾病”或“治疗病况”涉及施用包括至少一种药剂的组合物，其有效缓解与疾病相关的症状，减轻所述疾病的严重性或治愈所述疾病，或防止对象中发生所述疾病。施用可以包括任何施用途径。在一些实施方案中，所述疾病是由突变型p53在细胞、组织、器官、体内等中的存在引起或涉及突变型p53在细胞、组织、器官、体内等中的存在的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性乳腺癌、转移性结肠癌、转移性卵巢癌或转移性肺癌。
每种可能代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，诸如人。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象是非哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象被诊断患有所述疾病、病况或病症。
在一些实施方案中，癌症是肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层、松果体瘤、下丘脑胶质瘤、乳腺癌、类癌瘤、癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、尤因家族肿瘤(pnet)、颅外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞瘤、性腺外,妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性淋巴细胞,白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、小细胞,淋巴瘤、AIDS相关,淋巴瘤、中枢神经系统(原发),淋巴瘤、皮肤T细胞,淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、恶性间皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、转移性鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性病症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、外分泌,胰腺癌、胰岛细胞癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤癌、垂体癌、浆细胞肿瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤癌、卡波西肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、恶性,甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童期的罕见癌症、阴道癌、外阴癌或维尔姆斯氏瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性肺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性卵巢癌。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，癌症是非实体瘤诸如血癌。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是白血病或淋巴瘤。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是急性骨髓性白血病(AML)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是慢性骨髓性白血病(CML)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是急性单核细胞白血病(AMOL)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是霍奇金氏淋巴瘤(四种亚型中任一种)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是非霍奇金氏淋巴瘤(亚型中任一种)。在另一个实施方案中，非实体瘤或血癌是骨髓性白血病。
对于在本发明的方法中的应用，可以使用一种或多种药学上可接受的载体、稳定剂或赋形剂(媒介物)，以常规方式配制所述再活化肽，以形成药物组合物，如本领域中已知的，特别是关于蛋白活性剂。载体在与组合物的其他成分相容且对其受体无害的意义上是“可接受的”。合适的载体通常包括生理盐水或乙醇多元醇诸如甘油或丙二醇。
所述再活化肽可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与游离氨基形成)，并且其是与无机酸诸如盐酸或磷酸，或此类有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因。
所述组合物可以合适地配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内施用，且方便地包含所述再活化肽的无菌水溶液，其优选与受体的血液等渗。此类制剂通常通过以下制备：将固体活性成分溶解于含有生理上相容的物质诸如氯化钠、甘氨酸等且具有与生理条件相容的缓冲pH的水中以产生水溶液，且使得所述溶液无菌。这些可以制备于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿或小瓶)中。
所述组合物可以并入稳定剂，诸如例如聚乙二醇、蛋白、糖类(例如海藻糖)、氨基酸、无机酸及其混合物。稳定剂在水溶液中以适当的浓度和pH使用。将该水溶液的pH调整至5.0-9.0的范围内，优选6-8的范围内。在配制再活化肽中，可以使用抗吸附剂。其他合适的赋形剂可以通常包括抗氧化剂诸如抗坏血酸。
所述组合物可以配制为控释制剂，其可以通过使用聚合物来复合或吸附蛋白而实现。用于控释制剂的适当聚合物包括例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯,吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯和甲基纤维素。用于控释的另一种可能方法是将再活化肽并入聚合物材料(诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物)的颗粒中。或者，代替将这些试剂并入聚合颗粒中，可将这些材料捕获到微胶囊中，例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或捕获到胶体药物递送系统、例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊中或大乳剂(macroemulsions)中。
在一些实施方案中，本发明的再活化肽可以配制于经口或口服组合物中，并且在一些实施方案中，包含液体溶液、乳液、悬浮液等。在一些实施方案中，适合用于制备此类组合物的药学上可接受的载体是本领域中熟知的。在一些实施方案中，液体口服组合物包含约0.001％至约0.9％的再活化肽，或在另一个实施方案中，约0.01％至约10％的再活化肽。
在一些实施方案中，用于在本发明的方法中使用的组合物包含溶液或乳液，其在一些实施方案中是包含安全和有效量的再活化肽和任选其他化合物的水溶液或乳液，其意欲用于局部鼻内施用。
在一些实施方案中，本发明的可注射溶液配制于水溶液中。在一个实施方案中，本发明的可注射溶液配制于生理上相容的缓冲液诸如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中。在一些实施方案中，对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域中通常已知的。
在一个实施方案中，本文所述的制剂配制用于肠胃外施用，例如通过推注注射或连续输注。在一些实施方案中，用于注射的制剂以单位剂量形式呈现，例如安瓿中或多剂量容器中，并且任选地具有添加的防腐剂。在一些实施方案中，组合物是油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，且含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
本发明的再活化肽可以通过任何合适的施用途径进行施用，所述施用途径选自口服、局部、经皮或肠胃外施用。根据一些实施方案，所述施用途径是经由选自真皮、阴道、直肠、吸入、鼻内、经眼、经耳和经颊的局部应用。根据一些实施方案，所述施用途径是经由肠胃外注射。在各个实施方案中，施用步骤通过选自以下的肠胃外途径实施：静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、脑内、脑室内、骨内和鞘内。例如，所述再活化肽可以全身施用，例如，通过肠胃外途径，诸如，腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)、皮下或肌内途径。本发明的再活化肽和/或任何任选的额外药剂可以全身施用，例如，通过鼻内施用。本发明的再活化肽和/或任何任选的额外药剂可以全身施用，例如，通过口服施用，通过使用能够为蛋白提供口服生物利用度的特定组合物或制剂。本发明的再活化肽和/或任何任选的额外药剂可以局部施用。
根据具体的实施方案，施用包括皮下施用。
可选或另外地，根据具体的实施方案，施用包括连续输注。
因此，所述再活化肽(例如SEQ ID NO: 1、8或412-464或429、448、449、446、462)还可以通过慢释递送系统、泵和用于连续输注的其它已知递送系统以例如以下剂量递送：例如每天0.01-0.3 mg/kg、每天0.01-0.15 mg/kg、每天0.01-0.1 mg/kg、每天0.01-0.095mg/kg、每天0.01-0.09 mg/kg、每天0.01-0.085 mg/kg、每天0.01-0.08 mg/kg、每天0.01-0.075 mg/kg、每天0.01-0.07 mg/kg、每天0.01-0.065 mg/kg、每天0.01-0.06 mg/kg、每天0.01-0.055 mg/kg、每天0.01-0.05 mg/kg、每天0.01-0.45 mg/kg、每天0.01-0.04 mg/kg、每天0.01-0.035 mg/kg、每天0.01-0.03 mg/kg)。可以改变给药方案以基于其药代动力学提供特定再活化肽的循环水平。因此，计算剂量，从而维持治疗剂的期望的循环水平。
通常，通过再活化肽的活性和对象的状况以及待治疗的对象的体重或表面积确定有效剂量。还通过伴随在具体对象中施用再活化肽的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小和给药方案。
在一些实施方案中，提供用于治疗或预防p53相关病况的药剂盒。在一些实施方案中，所述药剂盒包含容器(例如小瓶)，其包含在合适的缓冲液中的Mut-p53再活化肽，和用于施用所述再活化肽的使用说明。
提出，当与黄金标准治疗(例如抗癌疗法)组合时，可以提高使用本发明的肽的治疗的功效。因此，可以单独或与用于此类病症的其它既定的或实验性治疗方案组合使用所述肽，用于治疗与p53相关的疾病或病症(如上文所述)。可理解，使用另外的治疗方法或组合物的治疗具有显著降低此类治疗的有效临床剂量的潜力，从而降低所述治疗的通常为破坏性的副作用和高成本。
适合与本发明的一些实施方案的肽或编码其的多核苷酸组合的治疗癌症的治疗方案包括，但不限于化学疗法、放疗、光疗和光动力疗法、手术、营养疗法、消融疗法、放疗和化学疗法的组合、近距离放射治疗、质子束疗法、免疫疗法、细胞疗法和光子束放射外科疗法。根据具体的实施方案，所述化学疗法是基于铂的。
抗癌药物
可以与本发明的化合物共施用的抗癌药物包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿霉素；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德(BisnafideDimesylate)；比折来新；硫酸博来霉素；布列奎钠(Brequinar Sodium)；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸艾佛鸟氨酸；依沙芦星；恩络铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表阿霉素；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺(Etoprine)；盐酸法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟环胞苷；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；依莫佛新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌(Meturedepa)；米汀度胺；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；丝裂帕菌素；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑(Nocodazole)；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑(Oxisuran)；紫杉醇；培加帕酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜霉素；松龙苯芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；吡鲁米特；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；司泊索非钠(Sparfosate Sodium)；稀疏霉素(Sparsomycin)；盐酸锗螺胺；螺旋氮芥；螺铂；链黑霉素；链脲佐菌素；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉醇；替可加兰钠(Tecogalan Sodium)；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑呋林(Tiazofuirin)；替拉扎明；盐酸拓扑替康；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙(Trimetrexate)；三甲曲沙葡糖醛酯；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替哌(Uredepa)；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。另外的抗肿瘤药包括在Antineoplastic Agents，第52章(Paul Calabresi and Bruce A. Chabner)中公开的那些，和在Goodman and Gilman's “The Pharmacological Basis ofTherapeutics”, Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health ProfessionsDivision)中公开的那些。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的基于铂的化学疗法和包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合所述DBD的相同方式进行结合(例如SEQ ID NO: 1、8、412-464、429、448、449、446、462)，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，从而治疗所述疾病、病症或病况。
基于铂的化学疗法的具体实例包括但不限于顺铂(首先被开发的)，卡铂(第二代基于铂的抗肿瘤药)，奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三核铂(Triplatin)、Lipoplatin(顺铂的脂质体版本)。
用于实现如本文所述的组合治疗(例如所述肽连同基于铂的化学疗法)的试剂盒和物品或产品也在本文预期中。
应理解，包含选自59-382的氨基酸序列的肽也可以在上述方法中实施。
如本文使用，术语“约”是指±10%。
术语“包含”、“包括”、“具有”和它们的同源词是指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括且限于”。
术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但只有所述另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征的情况。
除非上下文另有明确说明，如本文使用的单数形式“一个/种”和“所述”包括复数引用物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅为了便利和简洁，而不应当被解释为对本发明的范围的严格限定。因此，范围的描述应当被理解为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单一数值。例如，范围的描述诸如1至6应当被理解为具有具体公开的子范围诸如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及在该范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的幅度如何都适用。
在本文指定的任何数值范围，均意为包括在指定范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”，和“范围从”第一指定数“到”第二指定数，在本文中可互换使用，并且意为包括第一指定数和第二指定数以及在其间的全部分数和整数。
如本文使用的术语“方法”是指用于完成给出的任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域实践者已知的，或容易从已知的方式、手段、技术和程序发展的那些方式、手段、技术和程序。
如本文使用的，术语“治疗”包括终止、基本上抑制、减缓或反转病况的进程，基本上缓解病况的临床或审美症状或基本上预防病况的临床或审美症状的出现。
当参考具体的序列表时，这样的参考应当被理解为还涵盖基本对应于其互补序列的序列，同时包括较少的序列变异，其例如由测序错误、克隆错误或引起碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它变化而导致，前提是此类变异的频率小于50个核苷酸中1个，可选地，小于100个核苷酸中1个，可选地，小于200个核苷酸中1个，可选地，小于500个核苷酸中1个，可选地，小于1000个核苷酸中1个，可选地，小于5,000个核苷酸中1个，可选地，小于10,000个核苷酸中1个。
应理解，出于清楚的目的而在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以提供在单一实施方案的组合中。反之，出于简洁的目的而在单一实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以被分开提供，或提供在任何合适的亚组合中，或合适地，提供在本发明的任何其它描述的实施方案中。各种实施方案的上下文中描述的特定特征不被认为是那些实施方案的关键特征，除非所述实施方案没有那些要素则无法操作。
如上文描述的以及如下文权利要求书部分要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现参考以下实例，其与上文的说明一起以非限制性的方式阐明本发明。
通常，本文使用的术语和在本发明中利用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中得到透彻解释。参见例如，“Molecular Cloning: Alaboratory Manual” Sambrook等人, (1989); “Current Protocols in MolecularBiology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel等人, “CurrentProtocols in Molecular Biology”, John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”等人, John Wiley &Sons, New York (1988); Watson等人, “Recombinant DNA”, Scientific AmericanBooks, New York; Birren等人(eds) “Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 如在以下中所述的方法：美国专利号4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659和5,272,057；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E.,ed. (1994); “Current Protocols in Immunology”等人Volumes I-III Coligan J. E.,ed. (1994); Stites 等人 (eds), “Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (eds), “SelectedMethods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); 可获得的免疫测定被广泛描述于专利和科学文献中，参见例如，美国专利号3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771和5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic AcidHybridization” Hames, B. D.,和Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription andTranslation” Hames, B. D.,和Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture”Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press,(1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) 和”Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide ToMethods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等人,“Strategies for Protein Purification and Characterization - A LaboratoryCourse Manual” CSHL Press (1996); 其全部通过引用并入，如同完全在本文中阐述。本文全文提供了其它的一般参考文件。相信在其中的程序是本领域熟知的并且为了方便读者而提供。在其中所含的全部信息通过引用并入本文。
实验程序
结晶紫生存力测定
在96孔板中以2500-4000个细胞/孔培养细胞。添加不同肽的系列稀释物，并且将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS (1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。
ChIP分析
在室温下，使用甲醛(1%终浓度)交联细胞10分钟。使用0.25M甘氨酸中和甲醛5分钟。使用10ml冰冷的PBS洗涤细胞两次，并通过刮落收集。最终，将细胞重悬于0.3ml的裂解缓冲液(1% SDS、10mM EDTA、50mM Tris-HCl、pH 8.1，蛋白酶抑制剂混合物)，并且在超声浴中超声处理6分钟，随后在冰上离心10分钟以产生200-500bp片段。收集上清液并且在ChIP稀释缓冲液(1% Triton X-100、2 mM EDTA、150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl，pH 8.1)中稀释10次，随后在4℃，使用具有2μg剪切的鲑鱼精DNA和10μg BSA的40μl预阻断蛋白A-琼脂糖进行免疫清除2小时。在4℃下，使用特异性αp53或αRNApolII多克隆抗体，进行免疫沉淀过夜。在免疫沉淀后，添加40 μl蛋白A-琼脂糖并进一步温育另外1小时。依次在TSE I (0.1% SDS、1%Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH 8.1，150 mM NaCl)、TSE II (500 mMNaCl)和缓冲液III (0.25 M LiCl、1% NP-40、1%脱氧胆酸盐、1 mM EDTA、10 mM Tris-HCl，pH 8.1)中洗涤沉淀物。使用TE缓冲液将沉淀物洗涤三次并使用1% SDS，0.1 M NaHCO3萃取两次。合并洗出液并且在65℃加热过夜以逆转甲醛交联。使用QIAquick Spin Kit(Qiagen, CA)纯化DNA片段。一式三份执行免疫沉淀反应。以单独的珠子充当非特异性对照。通过定量RT-PCR评估来自克隆的ChIP产物中的活性和抑制性组蛋白标记的定量分析。为了将免疫沉淀反应(IP)的功效归一化，使用necdin启动子区域和5'区域的特异性引物完成染色质IP的归一化。
CRISPR p53敲除
质粒#42230，含有TP53外显子3单向导RNA (sgRNA)，来自Addgene。根据生产商的方案，使用jetPEI试剂(Polyplus)转染ES2细胞。在48小时后，在96孔板中接种细胞作为单细胞克隆。扩增单细胞克隆并且使用DO-1抗-p53抗体，通过蛋白质印记分析检验它们的p53状态。
sgRNA序列：
F:5'-CACCGCCATTGTTCAATATCGTCCG-3' (SEQ ID NO:47)
R:5'-AACCGGACGATATTGAACAATGG-3' (SEQ ID NO:48)。
肽的临床前测试
将2x105-106个细胞皮下注射至小鼠(6周龄无胸腺裸鼠)的各个股骨。在这些实验中采用的全部细胞系稳定表达荧光素酶报道基因，以能够通过活体成像监控肿瘤生长。4-18天后，当肿瘤达到可视大小，将小鼠随机分配至几个组：对照组，使用任一单个对照肽处理，和使用有效肽(任一单个肽)处理的组。通过一周三次在40μl PBS中10μg肽/肿瘤的瘤内注射，或通过Alzet微型泵0.8mg进行两周来施用肽。使用IVIS2000系统，通过活体成像测量随时间的肿瘤生长。将暴露时间校准至20秒。在8分钟内获得16张图像，并且对每个肿瘤获取峰发光值。实验进行至肿瘤达到1cm3的最大允许大小，在此时将小鼠处死并且将肿瘤取出，测量并称重。
RT-PCR
根据制造商的方案，使用Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II试剂盒，从细胞沉淀物获得RNA。使用Bio-RT 2000 (Bio-Lab)和随机六聚体引物，对0.4-1 µg的等分试样进行反转录。使用SYBR Green FastMix ROX (Quanta)在ABI 7300仪器(Applied Biosystems)上执行QRT-PCR。RT-PCR引物(全部引物序列以5'至3'呈现)：
引物列表
基因 正向引物/(SEQ ID NO:20-31) 反向引物/(SEQ ID NO:32-43)
p53 CCCAAGCAATGGATGATTTGA GGCATTCTGGGAGCTTCATCT
p21 GGCAGACCAGCATGACAGATT GCGGATTAGGGCTTCCTCTT
PUMA GACCTCAACGCACAGTACGAG AGGAGTCCCATGATGAGATTGT
MDM2 AGGCAAATGTGCAATACCAACA GGTTACAGCACCATCAGTAGGTACAG
CD95 ACTGTGACCCTTGCACCAAAT GCCACCCCAAGTTAGATCTGG
Btg2 AGGCACTCACAGAGCACTACAAAC GCCCTTGGACGGCTTTTC
GAPDH ACCCACTCCTCCACCTTTGA CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT
p21 (ChIP) GTGGCTCTGATTGGCTTTCTG CTTGGGCTGCCTGTTTTCAG
PUMA (ChIP) GCGAGACTGTGGCCTTGTGTC ACTTTGTGGACCCTGGAACG
MDM2 (ChIP) GGTTGACTCAGCTTTTCCTCTTG TATTTAAACCATGCATTTTCC
CD95 (ChIP) GGATAATTAGACGTACGTGGGC GGACAATTGACAAAATCAGTATC
GAPDH (ChIP) GTATTCCCCCAGGTTTACAT AGGAGTGAGTGGAAGACAGAA
NMR
用1L NMR缓冲液(含有52.5mM NaCl和2.625mM DTT，pH 7.2的157.5mM磷酸钠缓冲液)透析纯化的15N标记的p53核心结构域1ml 40μM (aa 94-296) 48小时，替换缓冲液并使用1L NMR缓冲液透析样品另外24-48小时(总共72小时)。对0.5 ml样品进行高分辨NMR。在魏茨曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)进行NMR分析。
在293 K，记录15N-p53自身，以及当如与指定的肽复合时的二维1H-15N异核单量子相干(HSQC)谱。在装配有5 mm反式检测三重共振CryoProbe(TCI)的Bruker AVIII-800NMR谱仪上获得谱。使用WATERGATE序列实现溶剂抑制。
实施例1：pCAP-250与顺铂协同降低ES2卵巢癌细胞的生存力
在96孔板中以3000个细胞/孔培养ES2细胞。将pCAP-250的系列稀释物单独或与1µg/ml顺铂一起添加，并将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS(1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。使用1µg/ml处理的ES2细胞的生存力为39%。估计pCAP-250的IC50为3.2µM并且与顺铂组合的pCAP-250的IC50估计为1.9µM，表明两种化合物之间的协同效应。
图1显示了实验的结果。明显地，癌症细胞的生存力在pCAP 250存在下显著降低。通过pCAP 250与基于铂的化学疗法的组合治疗，观察到协同作用。
实施例2：pCAP-250和不同衍生物的活性的表征
将表达内源mp53S241F的ES2 Con细胞，和其中使用CRISPR/Cas9将p53稳定敲除以控制对mutp53的特异性的ES2 KO细胞(ES2 p53KO)，以3000个细胞/孔培养在96孔板中。以8µg/ml的浓度添加指示的肽，并且将板在37℃另外温育48h。随后将培养基移除，并通过使用在甲醇/PBS (1:5, v/v)中的结晶紫(0.05%)将细胞染色10分钟，随后使用PBS洗涤3次，来测定细胞生存力。向每孔添加10%乙酸，进行10分钟。在595 nm测定OD。
图2显示了特定肽对ES2 Con相比ES KO的作用的差异，指示肽对mutp53表达的特异性。其中氨基酸(例如丝氨酸和组氨酸)被取代为丙氨酸的数种肽衍生物显示出对ES2Con细胞的减少的作用，指示这些氨基酸对肽功效的重要性。
在如下文所述的亲和结合测定进一步强化了所述结果。
实施例3：pCAP 250结合p53 DBD
图3A-K显示了荧光标记的WTp53DBD和pCAP-250的结合的微量热泳分析。根据生产商说明执行实验；制备pCAP-250的10个系列稀释物，向每个肽样品添加标记的蛋白并加载至毛细管。使用不同浓度的pCAP-250，分析样品的荧光wtp53DBD在温度梯度下的运动。微量热泳分析结果以从生产商数据分析软件获得的曲线来呈现。
实施例4：药代动力学研究-pCAP 250施用模式和血浆中半衰期
图4A-D的结果显示当静脉内施用时，pCAP 250 (SEQ ID NO:1)具有0.8-1.8小时的血浆半衰期。结果进一步显示当皮下施用时，pCAP 250具有3-8小时的血浆半衰期。
实施例5：pCAP-250肽在小鼠异种移植模型中的体内效果
图5A-D显示当以0.4mg/kg的剂量一周3次瘤内注射施用时，pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)对卵巢癌异种移植模型中的ES2细胞的肿瘤发育具有显著效果。进一步显示当以每天2.3mg/kg的剂量，通过Alzet微型泵皮下施用时，pCAP 250对卵巢癌异种移植模型中的ES2细胞的肿瘤发育具有显著效果。
实施例6：由体外细胞生存力测定确定的pCAP 250肽变体的抗癌症活性
表3
SEQ ID NO: pCAP编号 肽序列
412 483 myr-RRHSTPHPGE
413 485 myr-RRHSTPHPSE
414 488 myr-RRHSTPHPAD
415 489 myr-RRHSTPHPAE
416 504 myr-RRHSSPHPD
417 505 myr-RRHSVPHPD
418 507 myr-RRHSCPHPD
419 513 myr-RRHSePHPD
420 514 myr-RRHStPHPD
421 515 myr-RRHSsPHPD
422 516 myr-RRHSvPHPD
423 518 myr-RR(L-DAB)STPHPD
424 519 myr-RRHSTP(L-DAB)PD
425 530 myr-RRHSTPHPDD-ch3
426 541 myr-RRHSTPHAD
427 551 myr-RRHSKPHPD
428 552 myr-RRHSSP(L-DAB)PD
429 553 myr-RRHSvP(L-DAB)PD
430 554 myr-RRHSTP(L-DAB)AD
431 590 myr-RRHSsP(L-DAB)PD
432 594 myr-RRHSKPHPDD-NH2
433 595 myr-RR(L-DAB)STP(L-DAB)PD
434 596 myr-RRHSKP(L-DAB)PD
435 597 myr-RR(L-DAB)SKPHPD
436 598 myr-RR(L-DAB)SKP(L-DAB)PD
437 599 myr-RRHSKPHAD
438 600 myr-RRHSKPHASE
439 601 myr-RRHSKPHPSE
440 602 myr-RR(L-DAB)SsP(L-DAB)PD
441 603 myr-RR(L-DAB)SvP(L-DAB)PD
442 606 myr-RRHSTPHASE
443 607 myr-RRHSkPHPD
444 608 myr-RRHS(L-DAB)PHPD
445 609 myr-RRHS(L-DAB)PHAD
446 610 myr-RRHSEP(L-DAB)PD
447 611 myr-RR(L-DAB)SEPHPD
448 622 myr-RRHSvP(L-DAB)PD-NH2
449 624 myr-RRHST(Aib)HAD
450 630 myr-RRHSTPHPDIEGR
451 632 myr-RRHSTPHPDIEGRGWQRPSSW
452 633 myr-RR(L-DAB)SEP(L-DAB)PD
453 634 myr-RRHSEP(L-DAB)PD-NH2
454 635 myr-RR(L-DAB)SEPHPD
455 636 myr-RRHS(PSER)P(L-DAB)PD
456 637 myr-RRHS(pser)P(L-DAB)PD
457 638 myr-RRHS(PSER)P(L-DAB)PD-NH2
458 639 myr-RRHSKP(L-DAB)PD
459 640 myr-RR(L-DAB)SKPHPD
460 642 myr-RRHSTPHPAH
461 643 myr-RRHSTPHPA(L-DAB)
462 644 myr-RRHSTPHPDH
463 645 myr-RRHSvP(L-DAB)PDH
464 646 myr-RRHSTPHADH
表3：53种pCAP-250肽变体的列表。myr代表肉豆蔻酰基，大写字母和小写字母分别代表L-型和D-型氨基酸。L-DAB代表L-型二氨基丁酸。PSER和pser分别代表L-型和D-型磷酸丝氨酸。AIB代表氨基异丁酸。
在对两个细胞系的抗肿瘤测定中测试肽。如图7-8所示，指示的肽被赋予抗癌活性，如细胞生存力(结晶紫生存力测定)所确定的。
实施例7：pCAP-250-DBD复合物及其肽变体的NMR实验。
执行NMR实验(1H-15N HSQC谱)以评价由pCAP-250肽(PCAP-250)与p53 DBD结合所诱导的结构效果。因为先前产生了对WT DBD (SEQ ID NO: 44的94-312)的残基峰分配[Wong 等人 同上]，使用WT DBD (94-296, SEQ ID NO: 44)进行NMR实验，保持如Wong等人[同上]所述相同的条件。
图9显示了由Wong等人(同上)获得的NMR峰分配，连同对游离DBD和DBD-pCAP 250复合物获得的NMR峰图谱。从图9可以看出，总体上，成功再现了Wong等人(同上)的图谱，尽管在两个DBD构建体的C-端长度上存在差异(296相对312)。在游离DBD和DBD-pCAP 250的图谱之间观察到不同强度的许多峰变化，包括一些未分配峰的消失和出现，因此清晰地提供了pCAP 250与WT DBD结合的指示。这些变化在DBD结构上的作图提供了关于被pCAP 250结合所影响的三维结构区的清晰图像。这个区域主要涉及DBD-DNA交界面基序的螺旋-2和L1环，并且其进一步延伸至蛋白的中心区域中(参见图10中的洋红色)。C277和R280是位于螺旋-2的残基的中等峰移动的实例，而对于位于L1环的G117上观察到最剧烈的峰移动(参见图9中的洋红色和棕色圆圈)。
有趣的是，最初由Wong等人(同上)观察到的H115和Y126的相对低强度的峰没有在游离DBD上观察到，但是在添加pCAP 250肽后确实出现(参见图10中黄色圆圈)。在峰分配中的如此显著的差异可以被视为由pCAP 250诱导的最主要的峰变化。初始峰的低强度和峰从游离DBD谱的消失指示这些残基位于蛋白质的低稳定性结构区域，其可以采用超过一种优势稳定构象，并且因此对蛋白条件中的小变化高度敏感。实际上，在比较通过NME解析的DBD结构的前两种低能量构象(pdb码2FEJ)时，H115和Y126显示了剧烈的结构重组。值得注意的是，H115和Y126的三维组织紧密接近G117，并且可以直接影响G117，并且这三个残基一同与L1环的结构完整性高度相关(参见图11A-B)。在肽添加后的H115和Y126峰的出现通过使用不同pCAP 250肽变体pCAP-615 (RRHSTP{DAB}PD)，SEQ ID NO: 465的额外NMR实验而进一步确认(参见图12)。
在具有突变型p53R273H的基于SW-480细胞的测定中，发现pCAP-553 (myr-RRHSvP(L-DAB)PD, v代表D-型缬氨酸, SEQ ID NO: 429) pCAP 250肽变体比P-250的效果强2倍(参见图7)。NMR分析指示pCAP-553 (P553)倾向于以改善的亲和力结合DBD。这主要反映在与游离DBD比较，对DBD-pCAP 553复合物产生的NMR峰图谱上的7个不同的新的且非常强烈未分配的峰的出现。另外地，对DBD-pCAP 553复合物获得的峰的形状倾向于更加统一和圆，指示P553肽的结合改善了DBD的结构稳定性(参见图13)。
NMR实验结果提供了pCAP 250及其肽变体明确结合p53蛋白的野生型DBD的证据。这些结果支持了使用MST方法(图3A-K)的关于pCAP 250与DBD结合的发现。NMR结果进一步指示pCAP 250及其肽变体的结合诱导DBD中的结构变化，其直接影响了DBD-DNA结合界面区(即螺旋-2和L1环结构基序，其对于DBD结合DNA的能力至关重要)的完整性和稳定性。pCAP250及其肽变体的结合进一步影响了螺旋2和L1环结构基序周围的另外的残基，在DBD表面产生了相对大而明确受影响斑块。
尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，但是很明显许多可选方案、修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围中的全部此类可选方案、修改和变化。
在本说明书中提及的全部出版物、专利和专利申请以其整体通过引用并入说明书，以如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体或单独指出通过引用并入本文的相同程度。另外，在本申请中的任何参考的引用或鉴定不应当被理解为承认该参考可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，不应当将其解释为必然限定性的。

Claims (51)

1.一种分离肽，其包含在空间和构型上排列为允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)通过所述DBD的至少一个残基相互作用的氨基酸序列，其中pCAP 250 (SEQ ID NO:1)通过所述至少一个残基结合所述DBD，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，条件是所述肽不是SEQ ID NO: 59-382。
2.权利要求1的分离肽，其中所述相互作用是经由所述DBD的螺旋-2和L1。
3.权利要求1或2的分离肽，其中所述相互作用影响所述DBD的螺旋-2和/或L1的结构稳定性，如通过NMR测定的。
4.权利要求1的分离肽，其中所述至少一个残基选自L1的H115、G117和所述p53的Y126和V274和G279和R280。
5.权利要求1的分离肽，其中所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少一个氨基酸。
6.权利要求1的分离肽，其中所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少两个氨基酸。
7.权利要求1的分离肽，其中所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少三个氨基酸。
8.权利要求1的分离肽，其中所述相互作用是通过所述氨基酸序列的至少四个氨基酸。
9.权利要求1-8中任一项的分离肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO:53)
其中，
X1和X5是带正电荷的氨基酸；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3是任何氨基酸；
X4和X6选自α甲基氨基酸和β断裂子氨基酸。
10.权利要求1-8中任一项的分离肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO:54)
其中，
X1和X5选自His、Arg和Lys；
X2选自Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala和Gly；
X3、X4、X6是任何氨基酸。
11.权利要求9-10中任一项的分离肽，其中所述带正电荷的氨基酸选自His、二氨基丁酸(Dab)、Arg和Lys。
12.权利要求9-11中任一项的分离肽，其中所述X3是D-氨基酸。
13.权利要求9-12中任一项的分离肽，其中所述X3是磷酸化的氨基酸。
14.权利要求9-12中任一项的分离肽，其中X3是不可磷酸化的氨基酸。
15.权利要求9-14中任一项的分离肽，其中所述X3是非氢键结合的氨基酸。
16.权利要求9-15中任一项的分离肽，其中所述X3选自极性不带电荷的氨基酸和疏水氨基酸。
17.权利要求9-16中任一项的分离肽，其中所述X2是Ser。
18.权利要求9-16中任一项的分离肽，其中所述X4是α甲基氨基酸且X6是丙氨酸。
19.权利要求1-18中任一项的分离肽，其具有HSAPHP (SEQ ID NO: 49)或HSEPHP (SEQID NO: 50)。
20.权利要求9-19中任一项的分离肽，其包含连接至所述氨基酸序列的C端的至少一个另外的氨基酸(X7)。
21.权利要求20的分离肽，其中所述至少一个另外的氨基酸是带负电荷的氨基酸。
22.权利要求20的分离肽，其中所述至少一个另外的氨基酸选自Asp、Glu、Gly、Ala和Ser。
23.权利要求20-22中任一项的分离肽，其中所述至少一个另外的氨基酸包含两个另外的氨基酸(X7-X8)且其中所述X8选自His、Dab、Asp和Glu。
24.权利要求9-23中任一项的分离肽，其包含连接至所述氨基酸序列的N端的至少一个另外的氨基酸。
25.权利要求24的分离肽，其包含连接至所述氨基酸序列的N端的至少两个另外的氨基酸。
26.权利要求24或25的分离肽，其中所述连接至所述氨基酸序列的N-端的至少一个另外的氨基酸是Arg。
27.权利要求1-22中任一项的分离肽，其进一步包含细胞穿透部分。
28.权利要求27的分离肽，其中所述细胞穿透部分连接至所述肽的N-端。
29.权利要求27或28的分离肽，其中所述细胞穿透部分选自脂肪酸部分、蛋白质部分及其组合。
30.权利要求29的分离肽，其中所述脂肪酸部分包含肉豆蔻酰脂肪酸且所述蛋白质部分包含至少一个带正电荷的氨基酸。
31.权利要求1-30中任一项的分离肽，其中所述肽至少部分地将所述突变型p53蛋白的构象改变为野生型(WT) p53蛋白的构象。
32.权利要求1-31中任一项的分离肽，其中所述肽至少部分地改变所述突变型p53蛋白的构象，使得所述突变型p53蛋白被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
33.权利要求1-31中任一项的分离肽，其中所述突变型p53蛋白不被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
34.权利要求1-31中任一项的分离肽，其中所述突变型p53蛋白在结合所述肽后，被针对野生型p53蛋白的单克隆抗体识别。
35.权利要求1-34中任一项的分离肽，其中所述肽至少部分地将所述突变型p53蛋白的活性恢复为野生型p53蛋白的活性。
36.权利要求1-35中任一项的分离肽，其中所述活性是降低表达所述突变型p53蛋白的细胞的生存力。
37.权利要求1-36中任一项的分离肽，其中所述活性是促进表达所述突变型p53蛋白的细胞的凋亡。
38.权利要求1-37中任一项的分离肽，其中所述活性是在表达所述突变型p53蛋白的细胞中结合p53共有DNA结合元件。
39.权利要求1-38中任一项的分离肽，其中所述共有DNA结合元件包含SEQ ID NO: 55和56中所示的核酸序列。
40.权利要求1-39中任一项的分离肽，其中所述结合导致内源p53靶基因的至少部分活化。
41.权利要求1-40中任一项的分离肽，其如SEQ ID NO: 429或448中所示。
42.权利要求1-40中任一项的分离肽，其选自SEQ ID NO: 8和412-464。
43.权利要求1-40中任一项的分离肽，其不是SEQ ID NO: 59-382中所示的任何肽。
44.一种治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1-43中任一项的分离肽，从而治疗所述疾病、病症或病况。
45.一种治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的基于铂的化学疗法和包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合所述DBD的相同方式进行结合，其中所述肽至少部分地将突变型p53再活化，从而治疗所述疾病、病症或病况。
46.一种治疗与突变型p53蛋白相关的疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的包含氨基酸序列的分离肽，所述氨基酸序列具有的空间和构型允许所述肽与p53的DNA结合结构域(DBD)以如pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)结合所述DBD的相同方式进行结合，其中所述肽至少部分地将突变型p53蛋白再活化，且其中所述治疗有效量为每天0.01-0.3 mg/kg，从而治疗所述疾病、病症或病况。
47.权利要求45的方法，其中所述肽是权利要求9-42中任一项的肽。
48.权利要求45的方法，其中所述肽是pCAP 250 (SEQ ID NO: 1)。
49.权利要求44-48中任一项的方法，其中所述施用包括皮下施用。
50.权利要求44-49中任一项的方法，其中所述施用包括连续输注。
51.权利要求44-50中任一项的方法，其中所述疾病是癌症。
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