CN112578106A - 一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，主要包括纳米孔道阵列化芯片系统、微电流检测系统以及数据处理与构建系统三部分；芯片主要包括氨基酸电性筛选芯片以及基于特异性纳米孔道的氨基酸序列读取芯片等，其设计原理是根据氨基酸的亲疏水性、极性、带电性等性质，设计系列具有氨基酸靶向识别的生物纳米孔道，逐一获得组成待测蛋白质的氨基酸的纳米孔道特征离子流信号；通过阵列化微电流测量系统，实现对每一个纳米孔道内蛋白质序列特征信息获取；进而，利用标准纳米孔道模型肽序列信息库进行氨基酸序列识别、校正、整合与读取，能够实现单个氨基酸的超高分辨，满足蛋白质测序的技术要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一台多通道纳米孔道测序装置，可对蛋白质氨基酸序列进行直接、高效、精准的分析检测，并能灵活的扩展到生物样本中微量蛋白或未知蛋白测序分析的设备。
背景技术
蛋白质维持着细胞的各项生命过程，是生命体最重要的组成部分之一。对生物体内蛋白质氨基酸序列的精准测定是理解蛋白质生物功能的基础。目前蛋白质测序的方法主要是Edman降解测序以及质谱法，Edman法主要用于分析蛋白质N-末端，质谱法则是基于蛋白质酶切后的肽段分子在质谱中有规律性的断裂，寻找特定断裂模式，再根据质谱峰间质量差获取肽段的氨基酸信息和氨基酸上的翻译后修饰信息。质谱法具有较高的重现性和可信度，但其检测原理是通过检测质荷比来测定蛋白质序列的，较难直接测定分子量相似的氨基酸或翻译后修饰基团；此外，该方法需依赖于被收录的已知蛋白质序列数据库，难以直接精准获取蛋白质的序列信息，特别是较难实现未知蛋白质组成和序列的测定。目前，仍缺少针对蛋白质测量的扩增方法，很难实现一些微量蛋白质的测序。
纳米孔道单分子分析技术具有检测灵敏度高、无需标记等优势，近年来，纳米孔测序仪飞速发展，已逐渐应用于商业化DNA测序中，其检测的基本原理是将利用纳米级膜将两侧检测池电解质溶液隔开，将纳米孔道嵌在膜上并在两端施加电位，利用纳米孔道限域界面实现在大溶液体系下单个分子的捕获，单个待测分子会与纳米孔相互作用并穿过孔，产生阻断的特征电流信号，进一步应用模式识别算法得到碱基序列。由于蛋白质分子氨基酸组成复杂且电荷不均一等性质，目前的纳米孔道技术尚无法满足蛋白质测序的需求。
近年来，具有独特天然限域结构的气单胞菌溶素（Aerolysin）纳米孔道其最窄处仅有1 nm，大大提高了生物纳米孔道检测的灵敏度，在多肽分子的检测过程中可有效延长氨基酸在纳米孔道中的停留时间，实现对单个多肽分子中单个带电荷氨基酸的区分，因此，在测序仪上构建新型生物纳米孔道蛋白分子可进一步提高单分子蛋白质测序的空间分辨能力。目前的纳米孔道装置可初步实现几种简单氨基酸的分辨，尚不能满足20种氨基酸及其翻译后修饰的有效识别，且难以获取氨基酸序列信息。
对于研制纳米孔道单分子蛋白质测序装置主要的挑战在于：（1）亟需进一步研制高灵敏、特异性纳米孔道芯片实现不同氨基酸的单分子分辨，搭建多通道检测系统实现未知蛋白质的直接测序；（2）目前的纳米孔道数据采集装置尚不能实现极小电流信号（<pA）的分辨，难以实现多通道同时检测。
针对以上挑战，本发明通过设计一系列可用于蛋白质测序的芯片，主要包括蛋白质去折叠芯片、氨基酸电性筛选芯片以及基于特异性纳米孔道的氨基酸序列读取芯片等，在芯片上构建不同的具有氨基酸靶向识别功能的生物纳米孔道，结合微弱电流测量系统，多通道并行最终实现氨基酸序列的电化学直接测量。进一步通过集成化阵列放大器减小输入电路总电容，抑制测量系统噪音，提高并行纳米孔道测量信号的信噪比，实现对每一个纳米孔道的高时间分辨和高电流分辨测量；发展纳米孔道蛋白测序大数据分析系统，利用标准纳米孔道模型肽序列信息库进行氨基酸序列识别、校正、整合与读取。本发明研制一台快速、低成本的蛋白质测序仪实现蛋白质分子在单分子水平上的精准分析，为生物医药的发展及生命科学领域提供一种新的快速分析仪器。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：基于生物纳米孔道的多通道蛋白质分析芯片，本发明提供了一种基于纳米孔道单分子蛋白质测序仪，实现了蛋白质分子在单分子水平上的直接、精准测定。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，主要包括纳米孔道阵列化芯片系统、微电流检测系统以及数据处理与构建系统三部分。具体地，纳米孔道阵列化芯片系统是将多种新型的生物纳米孔道嵌入阵列化芯片中，精准分辨20种不同氨基酸，从而实现蛋白质分子的单分子测序；微电流检测系统是一种阵列化并行式电化学测量系统，可达到皮安级电流分辨及微秒级时间分辨；数据处理与构建系统是将单个蛋白质分子的电流信号与不同氨基酸之间的对应关系，从而实现蛋白质分子的单分子测序。
进一步，上述纳米孔道阵列化芯片系统包括至少四种芯片，包括1块“电性初筛芯片”201、4块“氨基酸正交识别检测芯片”202、1块“光学微扰动芯片”203和1块“交流微扰动”芯片204；
a) 所述芯片上分别构建阵列化检测微池，四种芯片上检测微池是阵列化的，可以为4×4、4×6、2×2、2×2；所述的检测微池上组装不同的精准设计的高灵敏生物纳米孔道以实现20种不同氨基酸测序，主要根据氨基酸的亲疏水性、极性、带电性等性质设计选择具有氨基酸靶向识别的生物纳米孔道，在纳米孔道内构建针对不同种类氨基酸或翻译后修饰基团的灵敏结构域，通过待测目标氨基酸与纳米孔道特异性靶向位点相互作用，延长目标氨基酸与孔道的作用时间，获得待测目标氨基酸的纳米孔道特征离子流信号；
b) 所述的检测微池分别由支撑层、微电流感应层以及芯片层构成；
c) 所述的检测微池体底部都加工有单独的平面微电极，并通过印刷导线直接连接至放大器检测端；
d) 待测样品通过微流体控制系统依次进入上述四种芯片进行测量分析；
e) 待测样品流经电性初筛芯片后，可根据电信号的差异判定蛋白质样品的带电性，选择性的进入1块“氨基酸正交识别检测芯片”实现单个氨基酸分辨。
进一步，上述微电流检测系统至少包括阵列化微弱电流测量放大系统、阵列化微弱电流测量控制系统、信号采集与数据输出系统三部分；
a) 所述的微弱电流测量放大系统主要包括前置放大电路的设计、信号调理电路设计以及低通滤波器三部分；
b) 所述的前置放大电路的设计可以采用具有CMOS缓冲输入的高性能运算放大器(OPA)，也可采用系统级芯片（SOC）设计，基于电阻反馈原理将pA级电流信号转换为mV级电压信号，设计构建多个前置放大电路的阵列微电流放大电路；
c) 所述的信号调理电路的设计可以从噪音源抑制和带宽补偿两方面进行信号调理控制，设计的高度集成化阵列检测芯片通过较少磷脂膜面积及电极面积、去除电极接线、优化阵列电极制备方法实现输入电路的总电容（包括膜电容，电极与溶液的液接电容，阵列电极接线电容等）的降低；
d) 所述的低通滤波器能滤除高于截止频率的高频信号，可以采用有源8阶贝塞尔低通滤波器对放大电路采集的模拟信号进行降噪处理；
e) 所述的阵列化微弱电流测量控制系统可以通过设计阵列选择器以及微控制器来实现实时选择每一组“膜-孔”系统中的最优孔道并同时采集每一块芯片上的每一种孔道的电流读出；
f) 所述的信号采集与数据输出系统主要是利用模数转换器(Analog DigitalConvertor, ADC)将经过滤波器后的模拟信号换成数字信号。
进一步，上述数据处理与构建系统主要是对阵列化并行正交纳米孔道芯片与微弱电流测量系统得到的数字信号进行分析处理，基于隐马尔科夫机器学习模型获得蛋白质的氨基酸序列信息。在解析单个蛋白质序列时，首先通过机器学习对离子流电信号时域和频域信息进行提取，将单个待测蛋白的离子流电信号进行一级分析，即将离子流电信号以及频率微扰分析得到的频率信息和模型蛋白测序数据库的信息进行比对，解码单个蛋白质初步序列，随后对蛋白质测序信息进行进二级分析，随机突变校正序列信息，获得单个蛋白质精准序列。
本发明具有以下有益技术效果：
通过设计纳米孔道阵列化芯片与微电流检测系统，构建数据分析处理方法，本发明研制了一套纳米孔道单分子蛋白质测序仪，能够实现单个氨基酸识别的分辨率，满足蛋白质分子的测序要求。通过特异性生物纳米孔道的筛选以及阵列化芯片的制备实现20种氨基酸的单分子分辨；进一步减小输入电路总电容，抑制多通电信号测量干扰，研制了多通道低噪音的微弱电流测量系统，实现每一块芯片上纳米孔道电流的平行记录，且具有高的时间分辨率和电流分辨率；提出蛋白序列“两级分步解析”的数据分析处理方法，智能解码氨基酸序列信息，实现单个蛋白质序列的精准解析。本发明无需对待测蛋白质分子进行进一步提纯富集，可以直接快速读取待测分子穿过纳米孔道时的离子流信号实现氨基酸序列的直接读取。
附图标记
图1为纳米孔道单分子蛋白质测序仪的总体技术路线；
图2为纳米孔道阵列化芯片系统工作路线示意图；
图3为本发明所述测序仪的阵列化芯片系统示意图；
图4为阵列化微池的SEM（扫描式电子显微镜）表征图；
图5 单个前置放大电路设计；
图6 单个信号调理电路设计；
图7 阵列化微电流控制系统设计。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明的纳米孔道单分子蛋白质测序仪的优选实例进行详细的描述；如图1所示，本发明所述纳米孔道单分子蛋白质测序仪的总体技术路线包括纳米孔道阵列化芯片系统101、微电流检测系统102以及数据处理与构建系统103三部分。
其中，纳米孔道阵列化芯片系统101包括1块“电性初筛芯片”201、4块 “氨基酸正交识别检测芯片”202 、1块“光学微扰动芯片”203和1块“交流微扰动”芯片204。纳米孔道阵列化芯片系统工作原理，如图2所示：每一次单分子蛋白质测序需要经过含有至少4种多肽电性初筛纳米孔道的“电性初筛芯片”，随后根据多肽的电性特点选择性地通过其中1块“氨基酸正交识别检测芯片”进行氨基酸正交并行识别，进一步通过“氨基酸正交识别检测芯片”、“光学扰动、交流微扰动芯片”实现对每一种氨基酸的精准识别。
其中“氨基酸正交识别检测芯片”至少含有4块分别针对负电荷多肽、正电荷多肽、电中性且正负电荷相互屏蔽多肽、电中性且正负电荷分离多肽的芯片，且每一块检测芯片中需含有至少6种应用于“氨基酸正交识别”的专一型突变Aerolysin纳米孔道，通过多通道正交并行读取多肽序列信息。
在上述四种芯片上分别构建4×4、6×4、2×2以及2×2阵列化检测微池，如图3所示，一个含有单个生物孔的检测微池直径约50~150 μm，扫描电子显微镜照片如图4所示，在池体底部都加工有单独的平面微电极，并通过印刷导线直接连接至放大器检测端，为避免由导线布局所产生的相互电磁信号干扰。
每一个单独检测微池分别由支撑层，微电流感应层以及芯片层构成。
在每一个检测微池内形成磷脂双分子层，构建单个生物纳米孔道，从而实现多通道电流平行记录。该系统能够保持每个磷脂双分子层具有独立的电流信号记录单元，并具备多个芯片级联的可拓展性。
在阵列化芯片上构建纳米孔道的方法具体为：利用微流控成膜方式，即先预灌入缓冲溶液，然后在每一条通路通过进样泵灌入少量磷脂溶液（uL），再立即灌入缓冲溶液，在微流控管道内形成“水-油-水”界面，通过蠕动泵，缓慢（uL/s）流过各个检测微池的支撑层，利用磷脂分子双极性的特点，以自激发的形式构成厚度为5nm的磷脂膜（Bilayer），为纳米孔道提供人工细胞膜的环境。在此构建的铺有磷脂双分子层的阵列池基础上，注入生物纳米孔道蛋白溶液，在芯片上实现符合泊松分布的孔道蛋白嵌膜行为，为单个蛋白分子检测提供稳定的单个“膜-孔”检测单元。
进一步，设计制备“膜-孔”系统检测器，即每四个检测池对应一个高精度电流放大器，从而通过检测每一个“膜-孔”系统的开孔电流，判断单个生物纳米孔道的自组装性能，选择最优的生物纳米孔道系统。
微电流检测系统102包括阵列化微弱电流测量放大系统、阵列化微弱电流测量控制系统、信号采集与数据输出系统三部分，阵列化微弱电流测量放大系统采用互阻放大的原理，实现对pA级电流高精度的测量，并利用频率补偿技术提升信号测量的时间分辨率，以实现电流信号的精准读取。而阵列化微弱电流测量控制系统主要由阵列开关芯片以及阵列滤波器网络所构成，对来自阵列化微弱电流测量放大系统的信号进行选择、降噪等处理。最后，信号采集与数据输出系统将所选择的信号量化形成数字信号，并利用USB、FIFO等高速数据传输协议，通过FPGA等微控制芯片与PC端进行高速数据传输。如说明书附图5-7所示；
数据处理与构建系统103主要是对微电流检测系统102采集到的离子流信号处理获得氨基酸序列信息。单个氨基酸在纳米孔道分析系统中产生的离子电流差异通常在皮安(pA)级别，且在信号采集过程中引入测量噪音、环境噪音和阵列电信号串扰等，本测试仪的数据处理中对电流信号进行降噪预处理进一步降低氨基酸特征离子流电信号中与序列信号幅度相当、频带重合的噪音，提高特征离子流电信号的信噪比。随后，通过模型蛋白将“正交识别纳米孔道”与“微扰放大纳米孔道”中所获得离子流电信号的时域和频域信息通过机器学习进行特征提取，建立模型蛋白单分子测序特征数据库。在解析单个蛋白质序列时，将单个待测蛋白的系列并行‘签名’离子流电信号进行一级分析，即将离子流电信号和模型蛋白测序数据库的信息用隐马尔可夫模型进行氨基酸的识别，解码读取单个蛋白质序列初步序列读取，随后通过频率微扰分析对多肽测序信息进行进一步随机突变校正，获得单个蛋白质精准序列。
采用本发明所述纳米孔道单分子蛋白质测序仪器系统进行蛋白质测序时，以随机氨基酸序列的多肽分子的单分子测序为例。首先，在芯片上构建不同的纳米孔道，通过微流体操控技术将待测多肽分子注入检测池中，检测池两端施加电压（-300mV~+300 mV）驱动多肽分子穿过纳米孔道。通过微电流检测系统记录并采集多肽分子穿过纳米孔道的离子流信号，通过一系列的检测芯片及校正，20种氨基酸所造成的的离子流阻断信号有所不同，通过记录各个氨基酸所对应的离子流阻断信号，并结合数据处理构建系统实现20种氨基酸的区分，从而实现待测多肽分子的单分子测序。
在本发明中，阵列化芯片系统指几种不同芯片的组合，不局限于上述“电性初筛芯片”、 “氨基酸正交识别检测芯片” 、“光学微扰动芯片”和“交流微扰动芯片”四种。
在本发明中，待测样品通过微流体控制系统流经“电性初筛芯片”后，可根据电信号的差异判定蛋白质样品的带电性，选择性的进入1块“氨基酸正交识别检测芯片”进行氨基酸特异性识别，继而逐次经过“光学微扰动芯片”和 “交流微扰动”芯片。
在本发明中，“电性初筛芯片”、 “氨基酸正交识别检测芯片” 、“光学微扰动芯片”和“交流微扰动芯片”可以为4×4、4×6、2×2、2×2（或者类似的其他阵列化芯片）阵列，但不仅限于上述阵列方式，可进一步扩展。
在本发明中，纳米孔道为生物纳米孔道材料，包括气单胞菌溶素（Aerolysin），α-hemolysin(αHL)，MspA，phi29等及各种生物纳米孔道及其突变体，例如Aerolysin的突变体K238Q和N226Q。
在本发明中，芯片结构加工方面，支撑层的主要材料可以为光刻负胶(如SU-8, AZ系列等)、由半导体材料(硅, 氮化硅等) ，但不仅限于以上材料。
在本发明中，纳米孔道阵列化芯片系统、微电流检测系统以及数据处理与构建系统可以是高度集成的，也可以是模块化的。
在本发明中，研制的微电流检测系统可以为该纳米孔道单分子蛋白质测序仪的一个模块，也可以搭建在现有纳米孔道测量装置，如Oxford Nanopore Technologies的纳米孔道测序仪和Nanion Technologies的Orbit 16等。
以上所述仅为本发明的优选实施案例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (16)
1.一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述纳米孔道单分子蛋白质测序仪包括纳米孔道阵列化芯片系统、微电流检测系统以及数据处理与构建系统三部分；其中纳米孔道阵列化芯片系统包含电性初筛芯片、 氨基酸正交识别检测芯片、光学微扰动芯片、交流微扰动芯片；微电流检测系统包含阵列化的微弱电流测量放大系统、阵列化的微弱电流测量控制系统、信号采集与数据输出系统三部分；数据处理与构建系统是对阵列化并行正交纳米孔道芯片与微弱电流测量系统得到的数字信号进行分析处理，基于隐马尔科夫机器学习模型获得蛋白质的氨基酸序列信息。
2.根据权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述纳米孔道阵列化芯片系统包括1块电性初筛芯片、4块氨基酸正交识别检测芯片、1块光学微扰动芯片和1块交流微扰动芯片。
3.根据权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述氨基酸正交识别检测芯片为4块分别针对负电荷多肽、正电荷多肽、电中性且正负电荷相互屏蔽多肽、电中性且正负电荷分离多肽的芯片，且每一块检测芯片中需含有至少6种应用于“氨基酸正交识别”的专一型突变Aerolysin纳米孔道，通过多通道正交并行读取多肽序列信息。
4.根据权利要求3所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述纳米孔道阵列化芯片系统中的芯片上构建阵列化检测微池，四种不同芯片，即电性初筛芯片、 氨基酸正交识别检测芯片、光学微扰动芯片、交流微扰动芯片上检测微池是阵列化的，分别为4×4、4×6、2×2、2×2；所述的检测微池上组装不同的生物纳米孔道以实现20种不同氨基酸测序，根据氨基酸的亲疏水性、极性、带电性性质设计选择具有氨基酸靶向识别的生物纳米孔道，在纳米孔道内构建针对不同种类氨基酸或翻译后修饰基团的灵敏结构域，通过待测目标氨基酸与纳米孔道特异性靶向位点相互作用，延长目标氨基酸与孔道的作用时间，以期获得待测目标氨基酸的纳米孔道特征离子流信号。
5.根据权利要求4所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述检测微池分别由支撑层、微电流感应层以及芯片层构成。
6.根据权利要求4所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述的检测微池体底部都加工有单独的平面微电极，并通过导线直接连接至阵列化微弱电流测量系统。
7.根据权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述的微弱电流测量放大系统包括前置放大电路、信号调理电路以及低通滤波器三部分。
8.根据权利要求7所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述的前置放大电路采用具有CMOS缓冲输入的高性能运算放大器或采用系统级芯片设计，基于电阻反馈原理将pA级电流信号转换为mV级电压信号。
9.根据权利要求7所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述信号调理电路可以从噪音源抑制和带宽补偿两方面进行信号调理控制，设计成高度集成化阵列检测芯片通过较少磷脂膜面积及电极面积、去除电极接线、优化阵列电极制备方法实现输入电路的总电容，包括膜电容，电极与溶液的液接电容，阵列电极接线电容的降低。
10.根据权利要求7所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述低通滤波器能用于滤除高于截止频率的高频信号，可以采用有源8阶贝塞尔低通滤波器对放大电路采集的模拟信号进行降噪处理。
11.根据权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述的阵列化的微弱电流测量控制系统通过设计阵列选择器以及微控制器来实现实时选择每一组“膜-孔”系统中的最优孔道并同时采集每一块芯片上的每一种孔道的电流读出，阵列选择器可位于前置放大电路和阵列孔道间。
12.根据权利要求10所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述信号采集与数据输出系统采用利用模数转换器将经过滤波器后的模拟信号换成数字信号。
13.根据权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述数据处理与构建系统主要是对阵列化并行正交纳米孔道芯片与微弱电流测量系统得到的数字信号进行分析处理，基于隐马尔科夫机器学习模型获得蛋白质的氨基酸序列信息，该系统在解析单个蛋白质序列时，首先通过机器学习对离子流电信号时域和频域信息进行提取，将单个待测蛋白的离子流电信号进行一级分析，即将离子流电信号以及频率微扰分析得到的频率信息和模型蛋白测序数据库的信息进行比对，解码单个蛋白质初步序列，随后对蛋白质测序信息进行进二级分析，随机突变校正序列信息，获得单个蛋白质精准序列。
14.根据权利要求4所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述检测微池内形成磷脂双分子层，生物纳米孔道构建在在磷脂双分子层中；每个检测微池有独立的形成磷脂双分子层构建单个生物纳米孔道的系统，因此可构建不同类型的生物纳米孔道。
15.根据权利要求4所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪，其特征在于，所述生物纳米孔道材料为气单胞菌溶素、 α-hemolysin、MspA或phi29生物纳米孔道以及突变体。
16.权利要求1所述一种纳米孔道单分子蛋白质测序仪在蛋白质测序方面的应用，其具体方法为：首先利用温度、pH调控手段将待测蛋白质样品去折叠，利用特定的肽核酸或荧光团标记多肽的N端，并以此为测序起点，将去折叠荧光标记的样品加入蛋白质测序仪的进样口，通过微流体控制系统使其依次流经电性初筛芯片、氨基酸正交识别检测芯片、光学微扰动芯片和交流微扰动芯片，通过仪器系统的微弱电流测量系统捕获电化学信号，利用大数据分析系统解析蛋白质的精准氨基酸序列。
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