JP2016527891A - p53変異体を再活性化することの可能なペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および語句が下に定義される。本明細書の用語法または語法が、本明細書に提示される教示および手引きを考慮し当業者の知識と組み合わせて、当業者により解釈されるものであるように、これらの用語および語句は、説明を目的とするものであって制限を目的とするものでないことは当然理解される。
sf9細胞からの組換え全長(FL)タンパク質の精製:変異体p53 R249S、変異型p53 R175HおよびWT p53:
対数期の2×107のsf9細胞を、25mlの培養液を含有する9の175cm2フラスコで成長させ、27℃で一晩インキュベートした。組換えp53を含有するバキュロウイルスを各フラスコの中に添加し、72時間インキュベートした。細胞をフラスコから擦り取り、4℃で遠心し(3200gで5分間)、培養液を除去し、細胞ペレットを氷冷等張緩衝液(10mM Na2HPO4、pH7.2、130mM NaCl、1mM DTPA−ジエチレントリアミン五酢酸)で2回洗浄した。細胞を溶解させるために、50mlの緩衝液A(20mM Tris−HCl、pH8.0、12%スクロース、2mM EGTA、2mM PMSF、5mM DTT)と0.2%Triton X−100に穏やかに反転させることによって細胞を再懸濁した。5600Gで8分間遠心した核および上清を除去した。20mlの緩衝液B(20mM Tris−HCl、pH8.0、12%スクロース、2mM EGTA、2mM PMSF、10mM DTT +プロテアーゼ阻害剤)と0.5M NaClを添加することによって核を溶解させ、激しくボルテックスし、氷上で20分間インキュベートした。核ライセートを超遠心管に移し、4℃にて60分間100,000gで遠心した。上清を取り出し、緩衝液Bで希釈してNaCl 0.04Mの終濃度にした後、4℃にて5分間20,000gで遠心した。核ライセートを、50mlの緩衝液Aで予洗した、5ml Hitrap Q FF(fast flow)(Amersham Pharmacia)イオン交換カラムに装入した。次に、タンパク質を溶出するためにより高い塩濃度を含有する緩衝液でカラムを洗浄した。例えば、変異体p53 R249Sの場合には、タンパク質は約150mM NaClでイオン交換カラムから溶出した。このタンパク質を、20mM クエン酸ナトリウムpH6.1、150mM NaCl、10μΜ ZnCl2、および10mM DTTで予め平衡化した、分取Superdex 75 高い読取データ数(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製タンパク質を含有する分画を一緒にプールし、6〜7mg/mlに濃縮し、一定分量を取り、−80℃で貯蔵した。各精製工程後に得た画分をドットブロットで変異型p53の存在について分析し、その後、クーマシーブルー染色によるSDS−PAGEで画分の純度を調べた。
96ウェルプレートを、3つの異なる抗体を用いてコーティングした(各ウェルに1種類の抗体(Ab)):PAb421は、p53の両方の立体構造を認識し、C末端エピトープに結合する;PAb240はp53の変異体立体構造を識別し、タンパク質が部分的に変性した場合に(例えば、DBDが変異している場合)にAbに近づくことのできるコアドメイン内のエピトープ(アミノ酸212〜217)に結合する(Stephen,C.W.and D.P.Lane,Mutant conformation of p53.Precise epitope mapping using a filamentous phage epitope library.J.Mol.Biol.,1992.225(3):p.577−83);そして、p53のWT立体構造を認識するPAb1620は、フォールディングがWT立体構造にある場合に形成されるコアドメイン内のエピトープ(aa156、206〜210)に結合する(Wang,P.L.,F.Sait,and G.Winter,The‘wild type’conformation of p53:epitope mapping using hybrid proteins.Oncogene,2001.20(18):p.2318−24)。
これらの実験のために、市販の「R&D」のp53/DNA結合キット(Cat−DYC1355−5 Lot−1273366FA)を、製造業者の手引きに従って使用した。手短に言えば、96ウェルプレートを抗p53抗体で一晩コーティングする。p53を含有する細胞抽出物を、試験ペプチドの存在下または不在(NT)下、ビオチンで標識した、αp53コンセンサス結合部位(キットに提供されている)を含有するオリゴヌクレオチドと反応させる。WT p53は、このDNA結合部位ならびにプレートの試験ウェルをコーティングする抗体と結合することが予期される。過剰なp53およびオリゴを洗い流し、ストレプトアビジン−HRPを用いて、p53によって結合したDNAに比例する、ウェル中のオリゴの量を定量化した。TMBアッセイを実施してHRP(ES001−1L−K)レベル(450nm)を求めた。
細胞を、0.1ml中2500〜4000細胞/ウェルで96ウェルプレート中で培養し、プレートに接着させるために37℃で一晩インキュベートした。異なるペプチド(0.5μg/ml)の系列希釈を0.1mlのアリコートに添加し、プレートを37℃でさらに48時間インキュベートした。その後、培養液を除去し、細胞を各ウェル50μlのメタノール/水(1:4、v/v)中のクリスタルバイオレット(0.5%)で10分間染色することによって細胞溶解を求め、それに続いてPBSで3回洗浄した。その後、10%酢酸(50μl)を各ウェルに添加し、10分間振盪した。次に、自動プレート読取を595nmで実施した。
細胞をカバーガラス上で一晩培養し、その後X−fectトランスフェクションを用いてペプチドで処理した。回収から2時間後、細胞を室温で30分間、4%パラホルムアルデヒドで固定し、それに続いて3回洗浄した(PBS)。試料をRTで10分間0.1% Triton(PBS中1%BSA)で透過処理し、それに続いてブロッキングした(PBS中0.5%BSAの洗浄3回)(各洗浄5分)。次に、1:500で希釈したマウス抗p53(DO−1)抗体で細胞を1.5時間探索し、それに続いてブロッキングした(PBS中0.5%BSAの洗浄3回)(各洗浄5分)。その後、1:600で希釈したヤギ抗マウスCy3および1:1000で希釈したDAPIで細胞を45分間探索した。試料をElvanolとともにマウントした。
ルシフェラーゼ構築物の構築
配列5’−TCGAGTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTTTC−3’(配列番号362)を有するオリゴヌクレオチド(RGC−W)、および配列5’−TCGAGTTTAATGGACTTTAATGGCCTTTAATTTTC−3’(配列番号363)を有するオリゴヌクレオチド変異体RGCオリゴヌクレオチド(RGC−M)は、両方ともKernら(Kern,S.E.,et al.,Identification ofp53 as a sequence−specific DNA− binding protein.Science,1991.252(5013):p.1708−11)に由来し、WT p53のコンセンサス結合部位として働く。
手短に言えば、クローンをホルムアルデヒド(終濃度1%)で室温にて10分間架橋した。ホルムアルデヒドを2.5Mグリシン(終濃度0.25M)で5分間中和した。1mlの氷冷PBS、緩衝液I(0.25% Triton X−100、10mM EDTA、0.5mM EGTA、10mM HEPES、pH6.5)、および緩衝液II(200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10mM HEPES、pH6.5)で細胞を順次洗浄し、擦り落とすことによって回収した。次に、細胞を0.3mlの溶解緩衝液(1% SDS、10mM EDTA、50mM Tris−HCl、pH8.1、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)に再懸濁し、超音波処理を最大の設定で10回(「オン」20秒の後に「オフ」40秒)行った後(Biorupter,Diagenode,NY)、氷上で10分間遠心分離して、200〜500bpの断片を生成した。上清を収集し、ChIP希釈緩衝液(1% Triton X−100、2mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris−HCl、pH8.1)で10倍に希釈し、それに続いて40μlの予めブロッキングしたプロテインA−セファロース(Santa Cruz Biotech)と2μgの断片化サケ精子DNA、および免疫前血清(1gのウサギ血清と10μlの100mg/mL BSAで4℃にて2時間免疫クリアリング(immuno−clearing)した。入力試料の調製のために試料を確保した。
H1299 p53−ヌル細胞を一晩培養した後、MaxFectトランスフェクション剤(Mediatech)を製造業者のプロトコールに従って用いてルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの前に、細胞培養液をOPTI−MEMに交換した。
RNAを、Macherey−Nagel NucleoSpin RNA IIキットを細胞ペレットに用いて、製造業者のプロトコールに従って得た。0.4〜1μgのアリコートを、Bio−RT 2000(Bio−Lab)およびランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(QRT−PCR)を、PerfeCTa SYBR Green FastMix ROX(Quanta)を用いて、ABI 7300装置(Applied Biosystems)で実施した。使用したRT−PCRプライマーを表1に示す(プライマー配列は5’から3’へ表示される)。
使用したファージディスプレイライブラリーは、New England Biolabs(NEB)により作成された市販のファージライブラリーであった。1つのライブラリーは線状ヘプタ−ペプチド(PhD−7)のものであり、もう一方のライブラリーは、線状ドデカ−ペプチド(PhD−12)のものである(カタログ番号:PhD−7、E8100S;PhD−12、E8110S)。両方のライブラリーでランダム化されたペプチド配列はマイナーコートタンパク質pIIIのN末端に発現し、その結果、ビリオンあたり5コピーの提示されたペプチドの原子価をもたらした。全てのライブラリーは、提示ペプチドとpIIIとの間に短いリンカー配列を含有する。
シークエンシングの前に、挿入されたライブラリーに隣接するプライマー、フォワード−5’−NNNNNNNNCATGGAAAGATAGTG(配列番号364)およびリバース−5’−NNNNNNNNCCTAAAACGATTTGTG(配列番号365)(各プライマーの最初の8塩基はランダム化され、4つ全ての塩基の混合物として組み込まれた)を用いて、PCR反応を実施した。最初の塩基のランダム化は、Solexaシークエンス装置(sequence equipment)が、最初の数サイクルの間の繰り返し配列をシークエンシングできないために導入された。PCR反応は、DNAを必要量の5ugおよび長さ(約120bp)で生じた。それにはSolexaディープシークエンシングのための隣接するプライマーおよびクローン化されたペプチドライブラリーが含まれる。
p53タンパク質源の選定
ファージディスプレイ選択のタンパク質源を選定する場合には、いくつかの考慮事項を考慮に入れる;溶液中のファージクローンと異なるタンパク質との相互作用は非特異的偽陽性ペプチドを生じ得るので、精製タンパク質の使用が推奨される。SF9細胞(上記参照)から精製されたヒト全長p53タンパク質を、以下の実験で使用した(受託番号CG3336)。そのため、バキュロウイルス(上に詳述される通り)に感染したSF9昆虫細胞株のp53の発現系を使用した。この系で発現したp53の主な利点は、それが翻訳後修飾を既に含んでいることである。
Baculo−p53での最初の実験は、WT p53、ホットスポット全長変異体p53(R175H)、または温度感受性(ts)変異型p53(V143A)のいずれかを発現しているSf9細胞の核抽出物ライセートを用いることによって行った。SF9細胞を、これら3つの発現ベクターのいずれか1つを有するウイルスに感染させた。感染の48時間後、細胞を回収し、核を抽出し、抽出物を、PAb1620、PAb240、ASPP2((P53−BP2)とも命名される)および/またはBcl2を用いる4℃で3時間の免疫沈降に付した。免疫沈降物したp53を、αp53−HRP Ab(カタログ番号HAF1355(R&D))を用いるウエスタンブロット法により検出した。このIP−ウエスタンブロット実験の結果を図2に示す。分かるように、温度感受性(ts)−変異体p53 V143A(4℃)およびWT p53は両方ともPAb1620抗体にうまく結合するが、PAb240には結合しない。他方、変異体p53 R175Hは、PAb1620よりもPAb240と強い結合を示す。このことは、Baculoを発現した変異体p53 R175Hは、変異体と野生型のp53の中間の立体構造をとることを示唆する。Bcl2はp53形態のいずれとも結合を示さないが、ASPP2(P53−BP2)は、全ての形態のp53とほぼ同じ親和性で結合する。そのため、ASPP2およびBcl2は、これらの実験条件下でp53立体構造のマーカーとして使用することができないと結論付けた。
変異体p53 R175HとPAb1620の比較的多い残余結合を減らすため、かつWT p53とその抗体の結合を増強するために、アッセイ状態の微調整を実施した。結果は図3に示され、それは対応するバキュロウイルスに感染したSf9細胞の核から抽出した(上記の通り)、精製変異体p53(R175H)およびWT p53のブロットを示す。精製p53を規定緩衝液(A−Tris−50mM;B−Tris、NaCl 150mM;C−Tris、NaCl、Triton 0.5%;D−Tris、Glicyn 0.5%;E−Na4O7P2 40−mM;F−GndCl 400mM;G−GndCl 800mM;H−尿素 1M;I−尿素 3M;IP−IP緩衝液)に溶解し、その後PAb1620およびPAb240で4℃にて3時間免疫沈降させ、αp53−HRP−Abを用いるウエスタンブロット法に付した。分かるように、溶液(A)は50mM Trisだけを含有する。この溶液中で、変異体p53 R175HとPAb1620の結合は、PAb240との結合と比較してわずか約5%である。150mM NaCl(B)、150mM NaCl+0.5% Triton(C)かまたは0.5% グリシン(D)のいずれかの添加により、変異体R175HとPAb1620の結合は増強された。3M 尿素(I)は、p53変異体R175HとPAb1620の結合を、おそらくタンパク質の変性を引き起こすことによって減らした。尿素の低い方の濃度、1M(H)は、変異体p53 R175H(R175H p53)とPAb1620の結合を増加させた。40mM Na4O7P2(E)は、R175H p53とPAb1620の結合を最低のレベルまで減らした。最後に、IP緩衝液中では、R175H p53はPAb1620陰性のままであった;しかしこの緩衝液で、WT p53は強いPAb240結合を示し、PAb1620との結合を減らし、IP緩衝液はWT型の軽度のミスフォールディングを引き起こすことが示唆される。そのため、Trisだけを含有する緩衝液をさらなる実験に使用する。
R175H p53タンパク質、単一のphd−12ファージライブラリー(NEB、カタログ番号E8110S)およびPAb1620抗体による選択を用いるファージディスプレイ検査(screen)を、最初に実施した。200ngのR175H p53を、1011ファージと1時間反応させて、ファージの提示したペプチドとMut−p53(R175H)を結合させた。次に、PAb1620と架橋したビーズをさらに1時間添加して全ての複合体を免疫沈降させた。このパニング手順を3ラウンド繰り返し、インキュベートMut−p53の量を減少させることによって、各ラウンド後に選択のストリンジェンシーを高めた:1回目のラウンド200ng、2回目のラウンド100ngおよび3回目のラウンド50ng。精製WT p53DBDを2μg/mlの濃度で用いてファージを溶出した(p53 DBD(残基94〜293)をpET−27b(Novagen)にサブクローニングした)。プラスミドを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換させた。タンパク質産生を、マウスp53DBDについて記載された手順に従って実行した(Suad,O.,et al.,Structural basis of restoring sequence−specific DNA binding and trans activation to mutant p53 by suppressor mutations.J Mol.Biol,2009.385(1):p.249−65)。各選択ラウンドの後、溶出したファージの力価測定(tittering)を実施して、選択されたファージの数を推定した(表2)。大腸菌(E−coli)を感染させることにより溶出したファージを増幅して、次のラウンドの選択のための約1013ファージを得た。パニングの2回目のラウンドから、対照パニング実験をPAb1620だけで(Mut−p53でのインキュベーションを含まずに)実施した;この力価はパニングの特異性を示す。
特異的p53再活性化ペプチドをスクリーニングし、同定し、単離するために、異なる補完的な選択戦略の組合せを用いる方法を考案し、実施した。
ビオチン−5’−
CTGCTGAAGCTTCGAATTCCTAGACATGCCCAGACATGTCCTACTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCGAACATGTCCCAACATGTTGCTGCTGCTGCTGCTG−3’(配列番号361)。
上で実施したファージディスプレイ選択法がMut−p53を再活性化するファージを濃縮することができるかどうかを決定するために、3サイクルの選択の後に得たファージプールが、全長R175H Mut−p53(BD Pharmingen、カタログ番号556439)かまたは組換え型R249S p53 DBD(249DBD)タンパク質のいずれかとPAb1620との結合を誘導する能力を試験した。pAb1620との直接結合を示す汚染ファージの望ましくない作用を減らすため、プレクリアリング工程を含め、試験反応に添加される前に、ファージプールを最初にPAb1620だけでインキュベートした。PAb1620と共有結合的に架橋されたビーズを、ファージプールをPAb1620ビーズでインキュベートすることによって実施される事前のプレクリアリング工程を行わずに、または行って、Mut−p53 R175H(175)かまたはMut−p53 R249S(249)によるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下で、精製変異体p53 R175Hとともにインキュベートした。非選択ファージ(ns)を対照として使用した。インキュベーションを4℃で3時間実施した。結合したp53を、p53に対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によって視覚化した。図5に示される結果を見て分かるように、一部の選択されたファージプールは、ファージまたは非選択入力ファージ(ns)と比較して、Mut−p53とPAb1620の結合を実際に誘導した。
選択されたファージプールがMut−p53とp53コンセンサスDNA結合エレメントの結合を促進することができるかどうかをさらに試験するために、p53コンセンサス応答配列に対応するビオチン標識オリゴヌクレオチド(p53−RE)ビオチン−AGACATGCCCAGACATGTCCTTATAGACATGCCCAGACATGTCC(配列番号366)または、p53結合に決定的な主要残基が変異した対照オリゴヌクレオチド(Con−RE ビオチン−AGAaATGCCCAGAaATGTCCTTATAGAaATGCCCAGAaATGTCC(配列番号367)を、これらのオリゴとストレプトアビジンコートビーズとを反応させることによって固定化した。p53−REまたはCon−REビーズを、WT p53DBDかまたは変異体249 DBDとともに、3サイクルの選択の後に得たファージプールと一緒にインキュベートした。ビオチン標識した、p53−RE−DNAかまたはCon−RE−DNAオリゴヌクレオチドのいずれかと結合したストレプトアビジンコートビーズを、Mut−p53 R175H(175)、クローン27(LPNPPER、配列番号328)(R175H選択から単離した単一のクローン);WTおよびMut−p53 R175Hで選択されたプール#69および#94によるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下、精製WT p53−DBDまたは変異体p53R249S−DBDとともに、T−AGおよびPAb1620の組合せを使用して交互選択ラウンドでインキュベートした。非選択ファージ(NS)を対照として使用した。インキュベーションは4℃で3時間であった。結合したp53を、ウエスタンブロット分析によって視覚化した。図6に示される結果を見て分かるように、予測したように、WT p53DBDは、Con−REとよりもp53−REに十分に結合した。249DBDはp53−REと結合せず、配列特異的DNA結合能のその知られている消失に一致した。重要なことに、選択されたファージプールは、Mut−p53とp53−REの結合を誘導することができ、Mut−p53の失われた機能を実際に再活性化および回復することが可能であることを示す。
ファージディスプレイの有効性を大いに増加させ、全ての選択されたペプチドレパートリーの抽出および分析を可能にする、次世代配列決定を、より少ない選択サイクルで実施した。8つのファージプールを、選択ラウンド間の濃縮の増加および機能活性という判定基準を用いるディープシークエンシング用に選択した。シークエンシングの前に、挿入されたライブラリーに隣接しているプライマー、フォワード−5’−NNNNNNNNCATGGAAAGATAGTG(配列番号364)およびリバース−5’−NNNNNNNNCCTAAAACGATTTGTG(配列番号365)(各プライマーの最初の8塩基はランダム化され、4つ全ての塩基の混合物として組み込まれた)で、PCR反応を実施した。最初の塩基のランダム化を導入して、シークエンシングの効率および正確さを向上させた。PCR反応は、DNAを必要量の5ugおよび長さ(約120bp)で生じた。それにはSolexaディープシークエンシングのための隣接プライマーおよびクローン化されたペプチドライブラリーが含まれる。
次に、コンセンサスモチーフを同定するために、より包括的なバイオインフォマティクス分析を実施した。かかるモチーフは、いくつかの方法で解明することができた。第1に、12aaおよび7aaライブラリーで同定されたペプチド配列間の比較。両方のライブラリーでの共通のモチーフの出現は、それが2つの完全に非依存性の実験で明白に選択されたものであるので、そのようなモチーフの強度を裏付けることになる。第2に、特定の位置のある特定のアミノ酸の存在量およびモチーフの同じ位置でのその他のアミノ酸に対するその類似度は、この特定の位置のかかるアミノ酸の重要度の指標として役立ち得る。第3に、モチーフの位置は、その機能に非常に重要であることがある:短いモチーフは、その他のアミノ酸配列において変動性を伴って長い方のペプチド配列に沿って移動することができ、ペプチドの遊離N末端からの距離は、その活性に対する重要性を知らせることができる。アルゴリズムを開発して、ペプチド長の増殖窓の中のアミノ酸配列を以下の通りチェックした:
1.各ペプチドのスコア化、同じペプチドに翻訳される異なるヌクレオチド配列の数を、かかる各種類のヌクレオチド配列の出現率で積分;
2.異なるペプチドのクラスター化、異なるペプチド間の配列類似性をスコア化;
および
3.関連するペプチド配列の群の同定、およびそれからコンセンサスを抽出。
上記のように同定されたペプチドモチーフの得られたリストから、128個のペプチドを、96ウェルフォーマットを利用する粗純度でPEPTIDE 2.0により化学的に合成した。このセミハイスループット合成により、比較的低コストの各ペプチドが可能になった。下の表6は、合成したペプチドを一覧表にしたものである。このリストには、文献からp53と相互作用することが公知であるタンパク質から誘導した一部のペプチドも含まれる。このリストには、ポリアルギニンC末端付加を含まないものと含むもの両方の、2種類に合成された10個のペプチドも含まれる。このポリ−Arg付加は、ペプチドが細胞膜を通過することを可能にすることが報告された。このことは、ポリArg C末端付加が細胞内へのペプチド送達を可能にする能力と、それがインビボでこれらの特定のペプチドの活性に干渉するかどうかの両方を評価することを可能にする。ポリArgには、0〜10Arg残基が含まれてよく、それはR0−10と指定される。
リードペプチド候補をMut−p53への立体構造的影響および機能的影響についてスクリーニングするためのいくつかの交互の補完的な方法を使用した。細胞膜を横切る各試験ペプチドの浸透に関する情報は不明であるので、評価のためのインビトロに基づくアッセイを最初に実施した:p53立体構造およびp53の配列特異的DNA結合の評価のためのELISA。その後、ペプチドの活性を生存率アッセイによる生細胞で、p53転写活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子で、およびインビボp53標的遺伝子の調査で調べた。これらのアッセイの組合せ(全て96ウェルフォーマットで実施)が、異なるp53活性へのペプチドの影響、およびペプチドがそのような能力をMut−p53タンパク質に付与する能力の同定および検証を可能にした。
最初のスクリーニング戦略は、ELISAに基づいた。サンドイッチELISAの1つの種類を使用して、リード試験ペプチドのp53立体構造への影響を調べた。Mut−p53へのペプチドの立体構造的影響を測定するため、マイクロタイタープレートをPAb240、PAb1620またはPAb421(陽性対照として)でコーティングし、その後、p53とこれらの抗体との反応を調べた。WT p53は、PAb1620との反応性のための陽性対照として働き、Mut−p53は、陰性対照として働く。被試験ペプチドの影響を調べるために、それをMut−p53を含有する溶液に添加し、いずれかのAbとの反応性の変化を試験した。ペプチドの添加後にMut−p53のPAb1620に対する反応性の増加およびPAb240に対する反応性の低下が観察されたならば、それは被試験ペプチドがMut−p53のWT立体構造を再活性化したことを示した。異なる細胞抽出物を用いるいくつかのELISA実験を実施した。結果を、Mut−p53を安定に過剰発現しているH1299細胞の抽出物(R175H p53)で実施した代表的な実験を示す図8に示す。抽出物は、生理的pHおよび塩濃度の標準的な免疫沈降緩衝液中750ng/μlの濃度で調製され、ブロッキングのために3% BSAを添加し、その後50ng/mlの濃度の異なるペプチドと2時間反応させた。プレートを、様々な抗体(Abs)で一晩コーティングし、洗浄し、ブロッキングし、細胞抽出物(ペプチドを含むまたは含まない)をさらに2時間添加した。抽出物を除去した後、プレートを洗浄し、p53レベルの検出のためにαp53−HRPコンジュゲートAbとともにインキュベートした。最後に、TMB(HRPの基質)アッセイを実施し、450nmでの光学濃度を求めた(上記の通り)。MCF7およびH1299−Mut−p53(ts)A135V(Zhang,W.,et al.,A temperature−sensitive mutant of human p53.Embo J,1994.13(11):p.2535−44)細胞を、WT p53立体構造の陽性対照として使用した(1620/240比は、5:1以上)。H1299−R175H p53抽出物は、より多くの変異体p53立体構造を示しているが、PAb421よりもPAb1620またはPAb240のPAb1620に対する反応性(1620/240比は1:2)をなお維持した。しかし、分析の結果を考察する場合、立体構造変化の程度をより良く捕らえる、PAb1620/PAb240計算比が言及される。これが抗体とのバックグラウンド結合であるかまたは実際のWTフォールディング立体構造であるかどうかを調べるため、異なる時間長の間、抽出物を加熱し、PAb1620およびPAb240とのそれらの反応性をモニターすることによって変性のレベルの増加を誘発した。図8Aおよび8Bに見られるように、熱処理の増加は、PAb240との反応性の増加およびPAb1620との反応性の低下を誘発し、これらの抽出物中のR175H p53がこれらの実験条件下で一部WT立体構造のままであったことが示された。特に、一部の被試験ペプチドでのインキュベーションの後、R175H Mut−p53のPAb1620に対する反応性の増加およびPAb240に対する反応性の低下が検出された。これは、例えば、ペプチド24、36、47、60、68(表6)の例にあたり、これらのペプチドが変異体p53タンパク質において立体構造変化を誘発することを示した。
Mut−p53のDNA結合への被試験ペプチドの影響を測定するため、市販のELISAキット、(R&D Systems DYC1355−5、Lot−1273366FA)を高スループットアッセイとして使用して、p53活性化を定量化した。このキットは96ウェルプレート形式を使用する。キットは製造業者の使用説明書に従って使用した。ウェルを抗p53抗体で一晩コーティングした。p53を含有する細胞抽出物を、p53コンセンサス結合部位(キットに含まれる)を含有するビオチン標識オリゴヌクレオチドと反応させた。WT p53は、ウェルをコーティングする抗体だけでなくこのオリゴと結合することが予期される。過剰なp53およびオリゴを洗浄緩衝液で洗い流した(PBS中0.05% Tween 20、pH7.2〜7.4;R&D Systems、カタログ# WA126)。次に、ストレプトアビジン−HRP(R&D Systems、Part 890803、キットに提供される)を15〜45分間添加して、p53によって結合されたDNAに比例するウェル中のオリゴの量を定量化した。ペプチドをMut−p53抽出物に添加することが、バックグラウンドと比較してELISA読取値を増加させるのであれば、このペプチドは機能上効果的であるとみなされ、さらなる分析のために選択されうる。図9は、代表的な実験を示す:立体構造ELISAと同様に、細胞抽出物を、試験ペプチドの存在下または不在下(NT)で、ビオチン−p53−REとともにインキュベートした。立体構造スクリーニングと同様に、MCF7およびH1299−Mut−p53(ts)A135V細胞はWT p53の陽性対照として働く。抽出物を、αp53−Abでコーティングしたウェルに添加し、数回の洗浄工程の後、ストレプトアビジン−HRPを1時間添加し、その後プレートを再び洗浄して、TMB(HRPに対する基質)アッセイを実施した。図9に見られるように、H1299−R175H p53抽出物は、p53−REオリゴに対していくらかのバックグラウンド結合を提示し、それは非標識競合オリゴによってさらに減少した。陽性対照は、バックグラウンドと比較して3〜4倍高いシグナルを示した。いくつかのペプチド、例えば:68、75、83、93、97は、H1299−R175H p53抽出物とp53−RE DNAの結合を高めると思われる。
ペプチドのMut−p53およびWT p53との結合を測定するため、「TAKARA」より市販されているELISAキット(MK100 Lot AK401)を高スループットアッセイとして使用して、異なるペプチドのタンパク質または抗体との結合を定量化した。キットは製造業者の使用説明書に従って使用した。ペプチドのC末端をプレートに接着させる化学反応を実施することにより、ウェルにペプチドを播種した。
次に、p53がその標的遺伝子のクロマチンとも結合することができるかどうかを調べた。クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを使用して、pCAPがp53応答配列(p53−RE)に対するMut−p53 DNA結合能を回復させることができるかどうかを調べた。変異体p53R249Sを内因的に発現している乳癌細胞BT−549を、3つのpCAP;250、308および325の混合物で5時間処理した。対照ペプチドの混合物で処理した細胞は、陰性対照として働く。次に、細胞を固定し、DNAを超音波処理によって剪断した。p53と架橋したDNAを、ポリクローナル抗p53抗体を用いて免疫沈降させた。DNAを精製した後、異なるp53標的遺伝子のp53応答配列を、qPCR反応において異なるプライマーを用いて定量化した。結果を、全DNA入力に標準化した。陰性対照として、抗体を含まないビーズ(ビーズ)で抽出物を免疫沈降させた。図11に見られるように、クロマチンと対照ビーズとの結合は、入力DNAの0.005%の基底レベルであった。pCAP混合物はp53と非特異的ゲノムDNA対照配列との結合を増加させなかったが、PUMA、p21およびCD95遺伝子中の応答配列とのp53結合は、対照ペプチドと比較してpCAPによって、それぞれ2.34、9.78および4.54倍増加させた。
再活性化ペプチドを同定するために使用されるさらなるスクリーニング戦略がインビボで実施された。これはレポーター遺伝子アッセイに基づく。それは、17反復のp53コンセンサス結合部位(RGC)を含有するプロモーターの制御下に置かれた、レポーター遺伝子の活性を定量化することによって、p53転写活性を測定する。ルシフェラーゼアッセイは生きている細胞で実施され、そのために、無傷の細胞の状況でMut−p53機能への試験ペプチドの影響の指標を提供する。分泌されたルシフェラーゼレポーターの上流でクローン化されたRGCに基づくプロモーター(TK−RGC−luc)(New England Biolabs(カタログ番号N0324S))を使用した。それは細胞の溶解を必要とせず、96ウェルフォーマットの使用を可能にするためである。
再活性化ペプチド活性の重要な指標は、Mut−p53を発現する癌細胞へのインビボでのそれらの影響である。特に、正常細胞への有毒作用が最小の、癌細胞の特異的Mut−p53依存性死を引き起こすことのできる再活性化ペプチドが望ましい。クリスタルバイオレットを用いてプレートに接着する細胞を染色するので、染料の量が細胞数に比例する、クリスタルバイオレットに基づく生存率アッセイを用いて、Mut−p53依存性死への様々な試験ペプチドの影響を求めた。クリスタルバイオレットアッセイは複雑でなく、迅速で、信頼でき、安価であり、試料の複雑な調製を必要としない。
ファージディスプレイによって予測されたペプチドモチーフの機能的スクリーニングを行った後、20のペプチドは、多様なアッセイおよび細胞株において変異型p53に機能的影響を及ぼすことが確認された。次に、これらのペプチドと、一般にヒトタンパク質の配列との、特にp53と相互作用することが知られているタンパク質との類似性を調べた。これは、p53と相互作用するタンパク質との類似性が高いことは、特定のモチーフの生物学的意義の指標として用いることができ、人工インビトロ条件下で選択されたペプチドが実際にp53と相互作用することができるという仮説の確認を得ることができるためである。さらに、タンパク質構造および周辺配列が、選択および合理的設計の両方に基づいている改良されたペプチドを設計する上で役に立つかもしれない。ペプチド配列と既知のヒトタンパク質との類似性を見つけるため、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズムを使用した。ペプチドモチーフを、ヒトタンパク質配列を含有する配列データベースに対してクエリー配列として導入した。BLASTは、クエリー内の部分配列と類似しているデータベース内の部分配列を見つける。BLASTの主な考え方は、多くの場合、1つの統計学的に有意なアラインメントには複数の高スコアセグメント対(HSP)が含まれるというものである。BLASTは、Smith−Watermanアルゴリズムに近似するヒューリスティックアプローチを用いてクエリー配列とデータベース内配列との間の高スコア配列アラインメントを検索する。ペプチドモチーフと既知のヒトタンパク質との類似性およびこれらのタンパク質の構造データに基づいて、新たなペプチド配列のリストを設計した(下の表8に示す)。それらの配列では、ペプチドモチーフに類似したアミノ酸には、そのモチーフに隣接するいずれか一方のタンパク質配列に由来するか、または三次元結晶学的データによる相同モチーフに物理的に近い構造エレメントに由来する、他のアミノ酸が隣接している。
WT p53タンパク質は主に転写因子として機能する。異なる形のストレスによって活性化されると、それは蓄積され、多くの標的遺伝子中のその応答配列と結合し、それらの転写をトランス活性化する。これらの標的遺伝子の産物であるタンパク質はその機能を実行する;例えば、p21のトランス活性化は、成長停止を導くが、PUMAのトランス活性化はアポトーシスを導くことになる。そのため、p53の機能的活性化の最も重要な指標の1つは、その異なる標的遺伝子の誘導である。そのため、p53標的遺伝子への様々な試験ペプチドの影響をインビボで試験した。
図17Aおよび17Bは、DBD内の241位に突然変異をもつMut−p53を発現しているES2卵巣癌細胞(図17A〜D)で実施した代表的な実験を示している。手短に言えば、細胞を6cmディッシュに播種し、示したペプチドを示した時点で12ug/mlの濃度で培養液に直接に添加した。細胞を回収し、細胞の60%をアネキシン−PIアポトーシスアッセイのために採取し、40%をRNAの抽出、cDNA合成およびリアルタイムPCR分析のために採取した。アポトーシスは、アネキシン−V染色キット(Roche、REF 11 988 549 001)を用いてアッセイした。非固定細胞を製造業者の使用説明書に従って、アポトーシス細胞を検出する抗アネキシンFITCコンジュゲート抗体、およびその化合物に対して透過性の死細胞を染色するPI(ヨウ化プロピジウム)の両方で染色した。次いで、染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各試料に対して合計10,000個の細胞を計数し、染色強度に応じて4つの亜集団に分割した:PIおよびアネキシンの両方に陰性の細胞(−PI、−アネキシン)は生と名付けられ;PIに陰性でアネキシンに陽性の細胞(−PI、+アネキシン)はアポトーシスの初期段階を通過中であり;PIおよびアネキシンに陽性の細胞(+PI、+アネキシン)はアポトーシスプロセスを経た死細胞であり;PIに陽性でかつアネキシンに陰性の細胞(+PI、−アネキシン)は壊死などの非アポトーシス死で死んだ死細胞であるとみなされる。図17A、17Bで分かるように、非処理細胞(0時時点)は、大部分(94%)がPIおよびアネキシンの両方に対して陰性であり、その細胞は生存能力があり健康であることを意味している。pCAP 242および250での処理はアポトーシス細胞の急速な増加、続いて細胞死を引き起こし、処理の5時間後に細胞の12%はアネキシン陽性であり、約7%は死滅している。pCAP 250での処理の16時間および24時間後に、アポトーシス集団は約27%まで増加し、死細胞は16時間後に29%、24時間後に36%まで蓄積する。この傾向はpCAP 242にも同様に当てはまるが、その影響は弱まり、より遅い。図17Cおよび17Dで分かるように、細胞生存率へのペプチドの影響はp53標的遺伝子の著しいトランス活性化を伴い、4つの代表的な標的の発現を示す。分かるように、全ての遺伝子はペプチド処理後に活性化され、p21およびPUMAのmRNA発現はpCAP 250およびpCAP 242での処理後に経時的にそれぞれ10倍および6倍まで増加する。CD95およびBtg−2の発現は、非処理細胞に対して6倍まで上昇する。
インビボ(前臨床)実験を2種類のモデル:ヌードマウスおよびMut−p53「ノックイン」マウスのヒト異種移植モデルで実施した。各モデルにおいて、被試験ペプチドの腫瘍内注射の腫瘍増殖および動物生存への影響を判定する。
p53 R280Kを内因的に発現しているMDA−MB−231細胞に、ルシフェラーゼ発現ベクターと、p53ノックダウンについてのshp53か、または非特異的対照としてのマウスNOXA shRNA(shmNOXA)のいずれかを感染させた。MDA−MB−231細胞は高度腫瘍形成性であり、浸潤性の、急速に増殖する腫瘍を形成し、また、ヒトでは転移性である。全体で10匹のマウスに注射した。各マウスに、shp53を発現しているMDA−MB−231細胞2×106個を右脇腹に、shmNOXAを発現しているMDA−MB−231細胞2×106個を左側に皮下注射した。腫瘍を、目に見える大きさに達するように14日間増殖させた。IVIS200システムを使用し、ライブイメージングにより増殖をモニターした。このシステムでは、ルシフェラーゼ生物発光は癌細胞数に比例する。結果は図18A〜18Cおよび図19A〜19Cに示す。細胞注射の14日後、4匹のマウス(マウス7〜10)を対照群に割り当て(図18A〜18C)、6匹のマウス(マウス1〜6)を処置群に割り当てた(図19A〜19C)。対照の処置は、インビトロでp53に影響(表現型)を示さなかった3つの対照ペプチド(pCAP 76、77および12)の混合物で構成された。処置群マウスには、インビトロでp53に最良の表現型作用を示した3つのペプチド(pCAP 174、155および159)の混合物を注射した。pCAP−159(配列番号312)は、アルギニン残基が付加されたpCAP−60(配列番号302)と類似した配列を有する。そのペプチドは、D−アミノ酸で構成され、「レトロ−インベルソ」戦略により、pCAP−60:SFILFIRRGRLG、(配列番号302)とは逆の順序で合成されている(pCAP−159:rrrrrrrrglrgrriflifs(配列番号312))(小文字はD−アミノ酸を表す)。ペプチドを、週3回腫瘍あたり40μlの量および混合物中各ペプチドの濃度5μg/mlで腫瘍内に直接注射した(腫瘍内注射)。従って、対照ペプチドかまたは処置用ペプチドのいずれかの混合物合計6μgを各時点で各マウスに投与した。マウスは、ペプチド処置開始から合計5週間モニターした。生物発光は7日ごとに測定した。図18Aに示すように、内在性Mut−p53を発現しているshmNOXA腫瘍は、対照ペプチド混合物で処置した場合に、実験の時間経過にわたってルシフェラーゼ強度の6〜15倍(対数目盛)の増加を示した。マウス10は、腫瘍が大きな限界サイズに達したために、処置の28日後に屠殺しなければならなかった。図19Aは、3つのMut−p53活性化ペプチドの混合物で並行して処置したマウスの分析を示す。図19Aで分かるように、35日間の実験にわたって癌細胞数の著しい増加を示した腫瘍はなかった。腫瘍のうちの2つ(マウス−1およびマウス−4)は、それぞれ、生物発光の50%〜65%の減少として明白な、処置に対する部分寛解を示した。マウス2番および5番は完全寛解を示し、ルシフェラーゼ読取値は、処置の21日後でさえIVISシステムのバックグラウンド閾値検出レベル(5×106光子)と同程度かまたはそれに近かった。ペプチドの投与は35日後に中止し、マウス2番および5番は、さらなる処置を一切行わずに放置し、さらに21日間モニターした。それらのマウスでは視覚的にもライブイメージングによっても腫瘍再出現は検出されなかった。
p53 R280Kを内因的に発現しているMDA−MB−231細胞を、ルシフェラーゼ発現ベクターに感染させ、15匹のマウスに、両方の腰にMDA−MB−231−luc細胞1×106個を皮下注射した。腫瘍は、目に見える大きさに達するために10日間増殖させ、その時点以降、腫瘍増殖をライブイメージングによってモニターした。結果を図20A〜20Cに示す。細胞注射の18日後、6匹のマウスを対照群に割り当て、9匹のマウスを処置群に割り当てた。前と同様に、対照の処置は、3つの対照ペプチド(pCAP 76、77および12)の混合物を含んだ。処置群マウスに3つのペプチド(pCAP 174、155および159)の混合物を注射した。ペプチドは、週3回腫瘍あたり40μlの量および混合物中各ペプチドの濃度5μg/mlで腫瘍内に直接注射した(腫瘍内注射)。図20に示すように、対照群および処置群はいずれも処置前に類似した反応;ルシフェラーゼ強度の約2〜3倍(対数目盛)の増加(第10日〜第18日)を示した。図20Aは、3つの対照ペプチドの混合物で並行して処置したマウスの分析を示す:分かるように、対照の処置は、腫瘍増殖に対して非常に軽度の影響しかなく、処置前の期間と比較すると増殖速度を低下させている。しかし、図20Bで分かるように、3つのp53再活性化pCAPの混合物での処置は、MDA−MB−231腫瘍の発光の著しい減少を引き起こした。pCAP混合物の1回の注射後、平均発光は70%減少し、18の腫瘍のうち7は、ライブイメージング読取値がバックグラウンド検出閾値に近く、完全退縮を示した(データは示していない)。図20Bに示すように、処置開始から12日(4回注射)後、平均腫瘍発光は93%減少し、18の腫瘍のうち11は完全寛解を示した。18の腫瘍のうち1つだけが不変または弱い寛解を示した。この腫瘍は処置開始前に比較的大きかったため、顕著な応答を引き起こすにはpCAPの用量が不十分であった可能性である。
MDA−MB−231実験で高度に有意な結果を観察した後、観察を拡張し、異なるp53点突然変異を保有する異なる起源の細胞を調べるために、追加の研究を計画した。SW−480結腸癌細胞株は2つの内在性p53突然変異:R273HおよびP309Sを保有する。SW−480細胞をルシフェラーゼレポーター遺伝子に感染させ、細胞106個をヌードマウスに皮下注射した。実験には15匹のマウスを含め、実験中それらをランダムに3群:これまでに影響のないことが判明している3つのpCAPのカクテルで処置される対照群、3つの有効なpCAP(250、308、325)のカクテルで処置される群および最後に、単一のペプチド、pCAP−325で処置される群に分けた。SW−480実験の期間は、細胞移植時点から42日であった。タイムラインは、0日目と表示した初日の処置を基準とする。図21は、IVISでのライブイメージングによって測定した3群全ての経時的腫瘍増殖を示す。分かるように、経時的に対照腫瘍は腫瘍サイズの2.75倍の平均増加を示す(図21Aに示される、0日目の9.24から35日目の9.68への発光強度平均の対数変化から推測される通り)。混合物処置群の腫瘍は96.7%の腫瘍サイズ減少に相当する縮小を示す(図21Bに示される、0日目の9.13から35日目の7.65への発光強度平均の対数変化から推測される通り)。同様に、pCAP 325群の腫瘍は、95.6%の腫瘍サイズ減少に相当する0.043の平均倍率変化を示した(図21Cに示される、0日目の8.97から35日目の7.61への発光強度平均の対数変化から推測される通り)。
ここまでに、ライブイメージングによる腫瘍モニタリングを可能にするルシフェラーゼ発現ベクターでトランスフェクトしたMut−p53発現細胞の異種移植モデルを使用して、4つの前臨床実験を既に行ってきた。2つの実験は、MDA−MB−231トリプルネガティブ乳癌細胞(p53 R280K)で実施し、1つの実験はSW−480結腸癌細胞(p53 R273H)を使用し、もう1つの実験はSKBR3乳癌細胞(p53 R175H)を使用した。各実験では、対応する細胞株由来の細胞を皮下注射し、肉眼でもライブイメージングでも観察できる十分に確立された腫瘍を形成させた(一般的には、2〜3週間)。その後、3日ごとに最大42日間の有効なリードペプチドかまたは対照ペプチド(インビトロで活性を示さない)のいずれかの腫瘍内注射からなる処置計画を行った。
全体で、6匹のマウスを使用して、ペプチド混合物の毒性を試験した:各ペプチド濃度に対してマウス2匹。この実験に使用したペプチド混合物は上記のものと同じであった(図19A〜19C)(pCAP 174、155および159)。マウスに、100ug/mlの濃度で調製したペプチド混合物を週3回3週間腹腔内注射した。2匹のマウスには、前臨床試験でマウスが受けた総量に似た40μlの量を注射した。2匹のマウスには120μlを注射し、残りの2匹のマウスには400μlを注射した。マウスの平均重量が20gであることを考えると、これらの量はそれぞれ、0.6mg/Kg、1.8mg/Kgおよび6mg/Kgの濃度を表す。マウスは、注射後毎日検査した。いずれのマウスにおいても目に見える変化は検出されなかった。さらに、前臨床実験で使用したマウスの腫瘍の周囲組織(図18A〜18Cおよび図19A〜19C)を、マウスを屠殺した後に、壊死または炎症の徴候について調べた。しかし、腫瘍の周囲組織は全ての場合で正常に見え、pCAPペプチドでの処置には大きな有毒作用がないことを示した。
Claims (48)
- 配列番号314、268、282、340、376、298、377、378、253、20、379、302、275、380、273、381、280または382のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドであって、
前記ペプチドが、変異型p53タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させ;かつ
前記ペプチドが、最大30アミノ酸の長さである、ペプチド。 - 配列番号314で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号321、配列番号314、配列番号313、配列番号310または配列番号307で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項2に記載のペプチド。
- 配列番号321、配列番号314、配列番号313、配列番号310または配列番号307で示される前記アミノ酸配列からなる、請求項3に記載のペプチド。
- 少なくとも1つの細胞浸透性部分とコンジュゲートした、請求項1に記載のペプチド。
- 前記細胞浸透性部分が脂肪酸部分である、請求項5に記載のペプチド。
- 前記脂肪酸が、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される、請求項6に記載のペプチド。
- 前記脂肪酸がミリストイル脂肪酸である、請求項7に記載のペプチド。
- 前記細胞浸透性部分がアミノ酸部分である、請求項5に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸部分がポリアルギニン部分である、請求項9に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、前記変異型p53タンパク質の立体構造を野生型(WT)p53タンパク質の立体構造に少なくとも部分的に変化させる、請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、前記変異型p53タンパク質がWT p53タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されるように、前記変異型p53タンパク質の立体構造を少なくとも部分的に変化させる、請求項1に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、WT p53タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されない、請求項1に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、前記ペプチドと結合すると、WT p53タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識される、請求項13に記載のペプチド。
- 前記モノクローナル抗体がAb1620である、請求項12〜14のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、前記変異型p53タンパク質の前記活性をWT p53タンパク質の前記活性まで少なくとも部分的に回復させる、請求項1に記載のペプチド。
- 前記活性が、前記変異型p53タンパク質を発現している細胞の生存率を低下させることである、請求項16に記載のペプチド。
- 前記活性が、前記変異型p53タンパク質を発現している細胞のアポトーシスを促進することである、請求項16に記載のペプチド。
- 前記活性が、前記変異型p53タンパク質を発現している細胞のp53コンセンサスDNA結合エレメントとの結合である、請求項16に記載のペプチド。
- 前記コンセンサスDNA結合エレメントが、配列番号339で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 前記結合の結果、内在性のp53標的遺伝子の少なくとも部分的な活性化がもたらされる、請求項19に記載のペプチド。
- 前記内在性の標的遺伝子が、p21、MDM2およびPUMAからなる群から選択される、請求項21に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、WT p53タンパク質とは異なる立体構造をもつ、請求項1に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、WT p53タンパク質と比較して少なくとも部分的に不活性である、請求項1に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、R175H、V143A、R249S、R273H、R280K、P309S、P151S、P151H、C176S、C176F、H179L、Q192R、R213Q、Y220C、Y220D、R245S、R282W、D281G、S241F、C242R、R248Q、R248W、D281G、R273CおよびV274Fからなる群から選択される突然変異を含む、請求項1に記載のペプチド。
- 前記変異型p53タンパク質が、R175H、V143A、R249S、R273H、R280KおよびP309Sからなる群から選択される突然変異を含む、請求項25に記載のペプチド。
- 配列番号321〜286のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドであって、前記ペプチドが、最大50アミノ酸の長さである、ペプチド。
- 前記ペプチドが、変異型p53タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させる、請求項27に記載のペプチド。
- 配列番号321、配列番号314、配列番号313、配列番号310または配列番号307で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項28に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、30アミノ酸未満の長さである、請求項27に記載のペプチド。
- 配列番号321〜302のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列を含む、請求項27に記載のペプチド。
- 配列番号321〜312のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列を含む、請求項31に記載のペプチド。
- 配列番号321〜316のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列を含む、請求項32に記載のペプチド。
- 配列番号321〜286のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からなる組換えもしくは合成ペプチド。
- 配列番号321、配列番号314、配列番号313、配列番号310または配列番号307で示される前記アミノ酸配列からなる、請求項34に記載のペプチド。
- 配列番号321〜302のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列からなる、請求項34に記載のペプチド。
- 配列番号321〜312のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列からなる、請求項36に記載のペプチド。
- 配列番号321〜316のいずれか1つに示される前記アミノ酸配列からなる、請求項37に記載のペプチド。
- 請求項1〜38のいずれか一項に記載のペプチドを発現する能力のある発現ベクター。
- 請求項1〜38のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項39に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
- 変異型p53タンパク質に関連する疾患、障害または状態の治療に使用される、請求項40または41に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が癌である、請求項42に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、乳癌、結腸癌および肺癌からなる群から選択される、請求項43に記載の医薬組成物。
- 前記癌の細胞が、前記変異型p53タンパク質を発現する、請求項42に記載の医薬組成物。
- 変異型p53タンパク質に関連する疾患、障害または状態を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項40または41に記載の医薬組成物を、治療を必要とする被験体に投与し、それにより前記疾患、障害または状態を治療する工程を含む、方法。
- 請求項40または41に記載の医薬組成物を含むキット。
- 変異型p53タンパク質に関連する疾患、障害または状態の治療に使用される、請求項47に記載のキット。
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