CN111686127B - 锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用。本发明首次通过工程化手段调控不同锌铁比例来有效对突变p53蛋白的降解，利用降解突变型p53联合化疗药物治疗及核磁共振成像实现p53耐药肿瘤的诊疗一体，为精准治疗及手术导航提供较好的借鉴，为纳米材料用于治疗突变p53肿瘤提供一种新的策略。本发明中还发现酶抑制剂、E1泛素活化酶、内吞抑制剂、TPEN、抗氧化剂、氧化酶抑制剂等能够该抑制锌铁纳米材料降解突变p53蛋白，且发现该锌铁纳米材料能够用于清除突变型p53蛋白外，还能有效地增加化疗药物顺铂的肿瘤杀伤效果，因此，可以将锌铁纳米材料作为化疗药物增敏剂，或与化疗药物联用用于抗肿瘤方面。

Description

锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域，特别涉及一种锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用。
背景技术
p53蛋白是TP53基因编码的转录因子，调控大量参与细胞周期阻滞、凋亡和代谢的靶基因的转录。TP53在超过50％的人类癌症中发生了突变，在某些癌症亚型如高浆液性卵巢癌中发生了高达96％的突变，p53突变是最常见的突变，也是研究得最多的抑癌基因。p53的大部分突变是错义突变，经常发生在DNA结合区域，导致高度稳定的突变p53蛋白的表达以及积累。这些突变体大致可分为两类：接触突变体和构象突变体。在大多数情况下，突变p53失去了与DNA结合序列相互作用的能力，因此不能激活p53的肿瘤抑制功能。在某些情况下，突变p53也可能以其他的方式发挥作用，从而使其他肿瘤抑制因子如p63和p73的功能丧失。此外，许多突变p53的一个重要特征是获得新的功能，而且具有获得性新功能的突变p53通过调控从染色质结构到代谢等多种关键的细胞过程，可以促进肿瘤的生长、转移和耐药等。
由于肿瘤细胞的在很大程度上依赖于突变p53的持续存在，消除突变p53自然成为治疗p53突变癌症的药物靶点。在针对突变p53癌症治疗的各种策略中，最直接的一种是通过诱导降解来清除突变p53蛋白。在过去的二十年里，许多研究都致力于发现小分子药物来降解突变型p53蛋白，主要通过蛋白酶体或自噬途径引起突变p53蛋白的降解。在一些报道的例子中，他汀类药物、NSC59984、Hsp90抑制剂17-AAG和ganetespib通过主要蛋白酶体途径诱导突变p53降解，而MCB-613、SAHA、gambogic acid和Zn(II)-curc则主要通过自噬途径降解突变型p53蛋白。
研究表明野生型p53需要与金属离子Zn(2+)才能折叠为正确的构象。而突变型p53蛋白由于构象发生了改变，失去了结合锌离子的能力。在构象突变体G245C和G245D p53中外源添加锌，可以部分恢复其野生型的构象，发挥p53正常的诱导癌细胞凋亡的功能。硫代咪唑酮金属离子螯合物NSC31926作为一个开关，鳌合培养环境中的锌离子浓度调控突变型p53蛋白的稳定性。姜黄素锌小分子化合物通过往细胞内递送锌离子，使R175H突变型p53构象发生改变并诱导突变型p53蛋白通过自噬溶酶体途径降解。因此，锌离子用于恢复野生型折叠或者降解突变型p53蛋白的潜力已经得到证明，然而除了上述两种小分子化合物，外源性添加的锌离子，由于细胞膜离子通道的严格调控使其很难进入细胞，并且当锌离子的浓度大于100μM时对细胞产生严重的毒性反应。
锌铁纳米材料作为MRI造影剂具有很好的T2成像功能，但到目前为止，尚未有纳米材料用于治疗突变p53肿瘤的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用。
本发明的另一目的在于提供锌铁纳米材料和化疗药物联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用。
所述的应用的环境为体外环境。
所述的锌铁纳米材料中锌元素与铁元素的质量比为(1:2)～(1:18)；优选为1:2。
所述的锌铁纳米材料为球型锌铁纳米颗粒，其平均粒径10nm。
所述的锌铁纳米材料优选为通过如下方法制备得到：将油酸锌和油酸铁溶解在1-十八稀和油酸的混合溶液中，在120～320℃下、真空或保护性气体氛围下进行反应，待反应结束后冷却，再加入2～4倍体积异丙醇，混匀后离心，弃上清，用异丙醇洗涤沉淀，得到锌铁纳米材料。
所述的油酸锌中的锌元素与油酸铁中的铁元素的质量比为(1:2)～(1:18)；优选为1:2(即油酸锌和油酸铁的摩尔比为0.11～1:2.3；优选为1:2.3)。
所述的油酸的用量为占油酸锌和油酸铁总摩尔量的1/2。
所述的反应的条件优选为：先在120℃、真空或保护性气体氛围下反应30分钟，然后在320℃、真空或保护性气体氛围下反应2小时。
所述的保护性气体优选为氮气。
所述的加入的异丙醇优选为加入3倍体积的异丙醇。
所述的离心的条件优选为：5000rpm离心10分钟。
所述的洗涤的次数为2次以上。
所述的锌铁纳米材料的保存方式优选为：将得到的锌铁纳米材料超声分散在正己烷中，然后保存于4℃冰箱。
所述的锌铁纳米材料的制备方法，还包括将获得的锌铁纳米材料转水相的步骤，具体为：
将得到的锌铁纳米材料超声分散在正己烷中，然后加入柠檬酸钠、丙酮和超纯水，于70℃条件下水浴反应，待两相交换反应结束后，再加入2～4倍体积的丙酮，混匀后离心，洗涤，最后超声分散到水中。
所述的加入的丙酮优选为加入3倍体积的丙酮。
所述的反应的时间为3～5小时；优选为4小时。
所述的离心的条件优选为：5000rpm离心10分钟。
所述的洗涤的次数为3次以上。
所述的油酸铁优选为通过如下方法制备得到：
将三氯化铁和油酸钠加入到乙醇、正己烷和超纯水的混合溶液中，于70℃油浴锅中搅拌反应，待反应结束后冷却，洗涤，收集上层油酸铁溶液，静置或旋蒸使正己烷挥发，得到油酸铁。
所述的三氯化铁和油酸钠的摩尔比为1:3。
所述的乙醇、正己烷和超纯水的体积比为4:6:3。
所述的反应的搅拌的转速优选为1000rpm。
所述的反应的时间为2～4小时；优选为4小时。
所述的洗涤为采用超纯水进行洗涤。
所述的静置的条件为：室温放置过夜。
所述的油酸锌优选为通过如下方法制备得到：
将氯化锌和油酸钠加入到乙醇、正己烷和超纯水的混合溶液中，于70℃油浴锅中搅拌反应，待反应结束后冷却，洗涤，收集上层油酸锌液，静置或旋蒸使正己烷挥发，得到油酸锌。
所述的氯化锌和油酸钠的摩尔比为1:2。
所述的乙醇、正己烷和超纯水的体积比为4:6:3。
所述的反应的搅拌的转速优选为1000rpm。
所述的反应的时间为2～4小时；优选为4小时。
所述的洗涤为采用超纯水进行洗涤。
所述的静置的条件为：室温放置过夜。
所述的突变p53蛋白为p53基因上的部分碱基发生突变后编码的p53蛋白，包括结合型突变p53和构象型突变p53；优选为p53蛋白突变体S241F，E285K，Y220C，R249S，R280K，R248W，R175H，R273H和G245C中的至少一种；更优选为S241F，R249S，Y220C，R280K和R248W中的至少一种。
所述的锌铁纳米材料的有效浓度为20μg/mL。
锌铁纳米材料在制备降解突变p53蛋白药物中的应用。
酶抑制剂、E1泛素活化酶、内吞抑制剂、TPEN(N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺)、抗氧化剂、氧化酶抑制剂中的至少一种在制备抑制锌铁纳米材料降解突变p53蛋白的产品中的应用。
所述的产品包括药物、试剂盒等。
所述的酶抑制剂优选为蛋白酶体抑制剂MG-132。
所述的内吞抑制剂优选为内吞抑制剂Genistein。
所述的抗氧化剂优选为抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)。
所述的氧化酶抑制剂优选为氧化酶抑制剂VAS 2870。
锌铁纳米材料作为突变p53蛋白降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用，锌铁纳米材料能够抑制癌细胞的增殖生长以及迁移能力。
锌铁纳米材料和化疗药物联用在制备抗肿瘤药物中的应用，合成的锌铁纳米材料能够用于清除突变型p53蛋白，且有效地增加化疗药物顺铂的肿瘤杀伤效果。
所述的化疗药物包括顺铂等。
所述的肿瘤包括卵巢癌和乳腺癌等。
一种抗肿瘤药物，包括所述的锌铁纳米材料和化疗药物。
所述的肿瘤包括卵巢癌和乳腺癌等。
所述的化疗药物包括顺铂等。
锌铁纳米材料在制备化疗药物增敏剂或核磁共振成像的造影剂材料中的应用。
所述的化疗药物包括顺铂等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明首次通过工程化手段调控不同锌铁比例来有效降解突变p53蛋白，利用降解突变型p53联合化疗药物治疗及核磁共振成像实现p53耐药肿瘤的诊疗一体，为精准治疗及手术导航提供较好的借鉴，为纳米材料用于治疗突变p53肿瘤提供一种新的策略。
附图说明
图1是实施例1中所得不同Zn:Fe比例的锌铁纳米材料引发的降解突变型p53的western blot验证结果图。
图2是实施例1中所得产物的能谱分析图。
图3是实施例1中所得产物的XRD图。
图4是实施例1中所得产物的透射电镜照片图。
图5是实施例1所得产物的水合粒径图。
图6是实施例1所得产物在水中的表面电荷图。
图7是实施例1所得产物的体外MRI图；其中：A为磁滞回线图；B和C为不同浓度的锌铁纳米材料的T2成像信号值和成像图。
图8是实施例1所得产物的体内MRI成像效果图。
图9是ZnFe-4纳米材料在含有不同突变的p53细胞中引发突变型p53蛋白降解的western blot结果图。
图10是ZnFe-4纳米材料在不同突变p53细胞中引发突变p53蛋白降解剂量和时间依赖的western blot检测结果图；其中，A为ES-2细胞的剂量和时间依赖电泳结果图；B为BT549细胞系的剂量和时间依赖电泳结果图。
图11是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中突变p53降解的免疫荧光图。
图12是ZnFe-4纳米材料在野生型p53细胞中p53蛋白western blot检测结果图；其中，A为剂量效应图；B为时间效应图。
图13是ZnFe-4纳米材料在H1299细胞中外转了突变p53(S241F)细胞中引发突变p53蛋白降解的western blot检测结果图；其中，A为剂量效应图；B为时间效应图。
图14是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞的p53基因的荧光定量PCR结果统计图。
图15是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与CHX处理后p53蛋白western blot结果图。
图16是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与3-MA，MG-132处理后p53蛋白westernblot结果图。
图17是ZnFe-4纳米材料处理ES-2细胞泛素化水平结果图；其中，A为ZnFe-4纳米材料2h、4h、6h后，western blot检测细胞中泛素化水平结果图；B为ZnFe-4纳米材料与MG-132处理后且通过免疫沉淀p53蛋白后，western blot检测p53蛋白上的泛素化水平结果图。
图18是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与PYR-41处理后western blot检测细胞中p53蛋白的降解图。
图19是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与内吞抑制剂Genistein处理后westernblot检测细胞中p53蛋白的降解图。
图20是ZnFe-4纳米材料处理ES-2细胞2h、4h、6h后，锌离子探针FluoZinTM-3检测细胞内锌离子含量的荧光图。
图21是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与金属离子螯合剂TPEN处理后westernblot检测细胞中p53蛋白的降解图。
图22是ZnFe-4纳米材料对细胞内ROS水平影响结果图；其中，A为细胞内总ROS的FACS检测图和荧光图；B为细胞内线粒体ROS的FACS检测结果图。
图23是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中与ROS抑制剂NAC、Mito Tempo、VAS2870处理后western blot检测细胞中p53降解结果图。
图24是ZnFe-4纳米材料处理不同的突变型p53细胞系后，CCK8试剂盒检测每种细胞的细胞活力结果图。
图25是ZnFe-4纳米材料处理不同的突变型p53细胞系后，Annexin-V/PI FACS检测结果图。
图26是ZnFe-4纳米材料对p53敲除的ES-2细胞和ES-2细胞的杀伤情况结果图；其中，A为ES-2细胞中p53基因的敲除western blot结果图；B是ZnFe-4纳米材料对p53敲除的ES-2细胞和ES-2细胞的CCK8结果图。
图27是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞的p21基因的荧光定量PCR图。
图28是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞的p53、p21western blot结果图。
图29是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞细胞周期影响的FACS结果图。
图30是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞细胞迁移影响的拍照图。
图31是ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞克隆形成的拍照图。
图32是ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中联合顺铂处理的杀伤情况图。
图33是ZnFe-4纳米材料在动物体内的ICP检测结果图。
图34是小鼠注射ZnFe-4纳米材料后的血清检测结果图；其中，A为AST(谷草转氨酶)的浓度；B为ALT(丙氨酸氨基转移酶)的浓度；C为BUN(血尿素氮)的浓度；D为SCR(血清肌酐)的浓度。
图35是小鼠注射ZnFe-4纳米材料后小鼠脏器H&E染色结果图。
图36是ZnFe-4纳米材料治疗ES-2荷瘤鼠后的小鼠体重统计结果图。
图37是ZnFe-4纳米材料治疗ES-2荷瘤鼠后的肿瘤体积变化图。
图38是ZnFe-4纳米材料治疗ES-2荷瘤鼠后的肿瘤拍照图。
图39是ZnFe-4纳米材料治疗ES-2荷瘤鼠后的肿瘤重量图。
图40是ZnFe-4纳米材料治疗PDX荷瘤鼠后的小鼠体重统计结果图。
图41是ZnFe-4纳米材料治疗PDX荷瘤鼠后的肿瘤体积变化图。
图42是ZnFe-4纳米材料治疗PDX荷瘤鼠后的肿瘤拍照图。
图43是ZnFe-4纳米材料治疗PDX荷瘤鼠后的肿瘤重量图。
图44是ZnFe-4纳米材料ES-2荷瘤鼠治疗后肿瘤组织的TUNEL染色结果图。
图45是ZnFe-4纳米材料PDX荷瘤鼠治疗后肿瘤组织的TUNEL染色结果图。
图46是ZnFe-4纳米材料PDX荷瘤鼠治疗后肿瘤组织的免疫组化染色结果图。
图47是ZnFe-4纳米材料PDX荷瘤鼠治疗后肿瘤组织的p53蛋白western blot结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1、ZnFe-4纳米晶体的制备和表征
1、ZnFe-4纳米晶体的合成
(1)油酸铁合成：
称量三氯化铁0.811g(5mmol)和油酸钠4.567g(15mmol)溶解于含有15mL超纯水，20mL乙醇和30mL的正己烷的圆底烧瓶中，此时的Fe:Na的摩尔比为1:3。匀速(1000rpm)搅拌此混合液，并加热至70摄氏度后保持此反应温度4小时(油浴)。待反应结束后，置于室温中待慢慢冷却后，用移液管将超纯水轻轻转入混合反应液中，轻轻洗涤，静置后待溶液分层后，收集上层含有油酸铁的正己烷溶液。最后用旋蒸仪把正己烷尽量挥发，得到蜡状样红棕色油酸铁产物。
(2)油酸锌的合成：
称取氯化锌0.681g(5mmol)和3.044g油酸钠(10mmol)溶解于含有15mL超纯水，20mL乙醇以及30mL己烷的混合反应液中，此时Zn:Na＝1:2(摩尔比)。同样地，以上述合成油酸铁的方法合成油酸锌(匀速搅拌此混合液，并加热至70摄氏度后保持此反应温度4小时)。待反应结束后，置于室温中待慢慢冷却后，用移液管将超纯水轻轻转入混合反应液中，轻轻洗涤，静置后待溶液分层后(切勿剧烈震荡，避免使油酸锌发生强烈地乳化，影响后续纳米颗粒的形成)收集含有油酸锌的白色正己烷混悬液。最后室温放置过夜，待正己烷尽量挥发完毕后，得到纯白色油酸锌产物。
(3)ZnFe-4纳米颗粒的合成：
采用一锅煮法合成ZnFe-4纳米颗粒：称取以上反应得到的油酸锌0.628g(1mmol)和油酸铁2.07g(2.3mmol)，溶解在含有15mL 1-十八稀和0.932g(1.65mmol)油酸(油酸是油酸锌和油酸铁总摩尔量的一半，即是(1+2.3)/2＝1.65mmol)的耐高温圆底烧瓶中。此混合液匀速(1000rpm)搅拌加热至120摄氏度并在真空中保持30分钟，除去反应液中空气和其他杂质。紧接着，迅速充入N2并升温至320摄氏度且保持搅拌和反应2h。待反应结束后置于室温慢慢冷却后，加入3倍体积的异丙醇于反应液中，上下混匀后，5000rpm，10分钟，离心分离反应产物。弃上清，用异丙醇洗涤沉淀2次，最后获得的沉淀超声分散在正己烷中(切勿烘干纳米颗粒，50mg ZnFe-4纳米颗粒最好分散在4mL正己烷中)，4℃冰箱保存备用。
(4)有机相ZnFe-4纳米材料的转水相：
由于以上合成的ZnFe-4纳米材料分散在正己烷中，正己烷为有机溶剂，不能用于后续的细胞实验以及动物实验，因此需要把有机相的ZnFe-4纳米颗粒转为水相，将ZnFe-4纳米颗粒分散到水溶液中，操作如下：称量50mg新合成的ZnFe-4纳米颗粒和100mg柠檬酸钠，一起溶解于含有4mL超纯水，4mL正己烷以及6mL丙酮的圆底烧瓶中，此混合液匀速搅拌加热至70摄氏度并维持此温度4小时，待两相交换反应结束后，所得反应液加入3倍体积的丙酮，上下混匀洗涤，5000rpm，离心10分钟。洗涤操作重复3次，最后将得到纯净的ZnFe-4纳米颗粒产物超声分散在适量的超纯水中，4℃冰箱保存备用(后续实验所用均为分散到水中的ZnFe-4纳米颗粒)。
2、不同比例的铁锌纳米材料的合成
参考上述步骤(2)和(3)的步骤，合成不同比例的铁锌纳米材料；其中，Zn:Fe比例(质量比)如下：ZnFe-1,1:18(油酸锌0.069g，油酸铁2.07g)；ZnFe-2,1:12(油酸锌0.101g，油酸铁2.07g)；ZnFe-3,1:6(油酸锌0.209g，油酸铁2.07g)；ZnFe-4,1:2(油酸锌0.628g，油酸铁2.07g)。
3、不同比例的铁锌纳米材料的降解效果
将突变p53细胞系ES-2细胞(购于ATCC)接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜培养基，加入浓度为20μg/mL的上述制备的不同比例的铁锌纳米材料，阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液(CON)。细胞培养8h后，然后进行western blot检测，检测各种材料对突变型p53蛋白降解效果。
结果如图1所示，在使用同一浓度处理相同的时间，我们发现当Zn:Fe的质量比为1:2时，即命名为ZnFe-4的ZnFe-4纳米材料对突变型p53的效果最好，因此，本实验对ZnFe-4纳米材料进行了表征，其中而能谱分析EDS对ZnFe-4纳米材料进行元素的成分及含量的分析如图2所示。此纳米材料主要包含了锌元素，铁元素以及氧元素等。图3XRD图片表明我们成功合成了ZnFe-4纳米材料。透射电子显微镜照片如图4所示，从图中可以看出所得产物尺寸均匀、分散性好，为球形状纳米晶体，尺寸大小为10纳米左右。同时我们检测了ZnFe-4纳米材料在水溶液中的粒径大小和表面电荷，如图5和图6所示，ZnFe-4纳米材料在水中的粒径约为20nm左右，表面带有负电荷。最后，我们运用核磁共振检测仪器评价了ZnFe-4纳米材料的T2成像能力，根据合成出来的ZnFe-4纳米材料，通过ICP-MS测定纳米材料中Fe的浓度，基于此浓度配制一系列含有不同Fe浓度的ZnFe-4进行核磁共振的扫描。同时，我们在荷瘤(ES-2卵巢癌)裸鼠中尾静脉注射ZnFe-4纳米材料(1.5mg/kg)，核磁共振检测注射0小时及24小时肿瘤部位T2成像能力。结果如图7和图8所示，此纳米材料在体内外均有较好的MRI成像能力。其中，荷瘤(ES-2卵巢癌)裸鼠的构建方法如下：在雌性裸鼠(体重约22g，购自于北京维通利华)的右翼皮下注射100μl ES-2细胞(1×107个)，待肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。
实施例2、测试ZnFe-4纳米材料在不同突变p53细胞中的降解能力
将含有不同突变的p53细胞系(ES-2细胞(S241F：p53基因(Gene ID:7157)第241位Arg突变为Phe)，BT549细胞(R249S：p53基因的第249位密码子突变AGG→AGT/Arg→Ser(R249S))，BxPC3细胞(Y220C：p53基因的第220位Tyr突变为Cys)，MDA-MB-231细胞(R280K：p53基因的第280位Arg突变为Lys)，MIA-PaCa-2细胞(R248W：p53基因的第248位Arg突变为Trp)均购于ATCC)接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜DMEM高糖培养基(购于Hyclone)(或者可用RPMI1640培养基(购于Hyclone))，然后分别加入浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得的ZnFe-4纳米晶体)，阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养8h后，然后进行western blot检测。在这五种表达内源性突变型p53蛋白的细胞系中ES-2，MDA-MB-231，MIA-PaCa-2是属于DNA结合型突变p53细胞系，而BT549和BxPC3是构象型突变p53细胞系。
结果如图9所示，ZnFe-4纳米颗粒在不同突变的p53细胞系中都体现出了良好的降解效果，且这种降解效果在DNA结合型突变和构象型突变细胞系中并没有明显的差异。简言之，ZnFe-4纳米颗粒引起的突变型p53蛋白降解具有广谱性，而且在ES-2细胞系中降解效果最为明显，因此ES-2细胞系为后续研究实验中的主要细胞系。紧接着，我们在ES-2(A)以及BT549(B)细胞系发现，ZnFe-4纳米颗粒降解突变型p53蛋白呈现出剂量和时间依赖性，在20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒处理时，在4h出现了明显的降解，并在8h降解最为明显(图10)。同样地，我们用免疫荧光的方法，在ES-2细胞中，进一步揭示了ZnFe-4纳米颗粒能使突变型p53蛋白明显减少，如图11所示。相反地，如图12所示，ZnFe-4纳米颗粒能稳定野生型p53蛋白(A549细胞(ATCC))，并且这种稳定效果呈现剂量和时间依赖。综上所述，ZnFe-4纳米颗粒能选择性地降解内源性表达的突变型p53蛋白。
另一方面，我们在不含p53的细胞系H1299中(购于ATCC)验证外源性表达的突变型p53蛋白的降解效果。首先我们通过QuickMutationTM基因定点突变试剂盒(购买于碧云天)对含有野生型p53基因的质粒(pCMV3-untagged质粒，购买于Sinobiological)进行点突变实验。其中，我们首先设计点突变引物(F:5’-CCACTACAACTACATGTGTAACAGTTTCTGCATGGGCGGCAT-3’；R:5’-ATGCCGCCCATGCAGA AACTGTTACACATGTAGTTGTAGTGG-3’)；随后根据点突变试剂盒的操作步骤进行PCR实验及对PCR产物进行DpnI消化。最后对经过DpnI消化后的突变产物进行转化及涂板及挑单克隆实验，经过测序确定突变成功后，摇菌，提取质粒，然后把获得的S241F突变型p53质粒转染至H1299中，构建H1299(S241F)过表达细胞系。突变型p53蛋白在H1299中稳定表达，经过ZnFe-4纳米颗粒(20μg/mL)处理后，发现同样地，ZnFe-4纳米颗粒能降解外源性表达的突变型p53蛋白。在同等剂量(20μg/mL)的ZnFe-4纳米颗在H1299(S241F)细胞中，降解外源表达的突变型p53蛋白需要更长的时间，在24h才出现了明显的降解效果，如图13所示。
实施例3、探究ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中调控p53的水平
将ES-2细胞(购于ATCC)在小皿中培养，当细胞的密度达到70％左右，我们使用终浓度为20μg/mL ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)处理ES-2细胞8h，以等体积的PBS缓冲液(CON)为对照，提取细胞的RNA并进行后续的荧光定量PCR实验检测p53基因的表达情况。结果如图14所示，ZnFe-4纳米材料ZnFe-4处理组与CON组相比，p53的mRNA表达水平并没有差异，表明ZnFe-4处理突变型p53细胞，并没有调控p53基因的转录水平。
接着，ES-2细胞的培养方法同上述步骤，当细胞的密度达到70％左右，我们使用蛋白合成抑制剂放线菌酮cycloheximide(50μM；CHX)与ZnFe-4纳米颗粒(终浓度为20μg/mL)共处理ES-2细胞，以cycloheximide(50μM)为对照。结果如图15所示，随着时间的增加，共处理的p53蛋白水平减少越来越明显，说明ZnFe-4纳米材料降解的是翻译后突变型p53蛋白，不涉及基因组水平的调控。
实施例4、探究ZnFe-4纳米材料诱导突变型p53的降解途径
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基(购于Hyclone)，分别加入20μg/mL ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)+5mM 3-MA(自噬抑制剂，购于MCE)，20μg/mL ZnFe-4纳米材料+10μM MG-132(蛋白酶体抑制剂，购于MCE)，20μg/mL ZnFe-4纳米材料，5mM 3-MA，10μM MG-132，阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养8小时后，然后进行western blot检测。结果如图16所示，ZnFe-4纳米材料引起的突变型p53蛋白的降解可以被蛋白酶体抑制剂MG-132有效抑制，而自噬抑制剂则没有此抑制效果，说明突变型p53蛋白的这种降解效应主要通过蛋白酶体途径降解。
实施例5、测试ZnFe-4纳米材料对ES-2细胞内泛素化水平的影响
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入浓度为20μg/mL ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)，分别处理2h、4h、6h，空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行western blot检测。结果如图17A所示，ZnFe-4纳米材料处理ES-2细胞后总泛素水平及K48泛素化水平增加，且K48泛素化增加呈时间依赖性。同时我们通过免疫沉淀的方法把细胞中的p53蛋白沉淀下来后，然后进行western blot检测。结果如图17B所示，ZnFe-4纳米材料可以引发p53蛋白泛素化水平增加，说明突变型p53蛋白降解的效应主要通过使p53泛素化后，通过蛋白酶体途径降解。
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入浓度为20μg/mL ZnFe-4纳米材料，20μg/mLZnFe-4纳米材料+50μM PYR-41(E1泛素活化酶，购买于MCE)，50μM PYR-41，阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养8小时后，然后进行western blot检测。结果如图18所示，PYR-41有效抑制ZnFe-4纳米材料引发的突变p53蛋白的降解，说明泛素化过程是降解所必须的。
实施例6、探究ZnFe-4纳米材料引起突变型p53蛋白降解的机理
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，分别加入20μg/mL ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)+50μM Genistein(内吞抑制剂，购于MCE)，20μg/mL ZnFe-4纳米材料+10μM MG-132(蛋白酶体抑制剂，购于MCE)，50μM Genistein，阴性对照为加入等体积的PBS缓冲液。细胞培养8小时后，然后进行western blot检测。结果如图19所示，ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中引起的突变型p53降解可以被内吞抑制剂Genistein有效抑制，说明细胞的内吞对于ZnFe-4纳米材料引发的降解是必须的。
实施例7、测试ZnFe-4纳米材料进入细胞后锌离子的水平及对降解的影响
将ES-2细胞接种在96孔细胞培养板中，密度约8000/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)分别处理2h、4h、6h，空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理完毕后，1×PBS缓冲液轻轻洗涤三遍，用不含双抗和血清的Opti-MEM培养基配制终浓度为1μΜFluoZinTM-3(invitrogen)于细胞培养箱中，避光培养40分钟，用1640培养基(含有10％FBS)轻轻洗涤细胞两遍，荧光显微镜下拍照检。结果如图20所示，ZnFe-4纳米材料进入细胞后，随着处理时间的增加，细胞内锌离子的含量也逐渐增加。
将ES-2细胞接种在96孔细胞培养板中，密度约8000cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，然后分别加入20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒，TPEN(N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺)(50μM，Selleck)，20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒+50μM TPEN，空白对照为等体积的PBS缓冲液。运用金属离子螯合剂TPEN把锌离子鳌合后，然后进行western blot检测。结果如图21所示，TPEN能有效抑制ZnFe-4纳米材料引发的突变型p53蛋白的降解效应，说明细胞内锌离子的升高对于引发的降解效应是必须的。
实施例8、检测ZnFe-4纳米材料对细胞内ROS水平的影响
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)，空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理8h后，用PBS缓冲液清洗两次细胞。然后分别加入含有10μM DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)的新鲜培养基，及在5μM MitoSox的培养条件下处理20min。处理胰酶消化，PBS缓冲液清洗后进行FACS检测。结果如图22所示：图22A中，ZnFe-4纳米材料处理组相对于PBS组细胞内总ROS水平上升，但是线粒体ROS没有变化；图22B说明ZnFe-4纳米材料引发的细胞内ROS升高主要来源于细胞质。
实施例9、探讨ZnFe-4纳米材料引起细胞内ROS上升对突变型p53蛋白降解的影响
将ES-2细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3～5×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，分别加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)，20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒+5mM NAC(抗氧化剂，N-乙酰半胱氨酸，Sigma)，5mM NAC，20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒+1mM Mito Tempo(MT，线粒体抗氧化剂，MCE)，1mM Mito Tempo，20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒+15μM氧化酶抑制剂VAS 2870(VAS，购自于sigma)，15μM氧化酶抑制剂VAS 2870处理8h，空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理完毕后，进行western blot检测。结果如图23所示，NAC及VAS 2870能有效抑制ZnFe-4纳米材料引发的突变型p53蛋白的降解，而线粒体活性氧抑制剂则没有抑制效果，说明ZnFe-4纳米材料引发的来源于细胞质的活性氧对突变型p53蛋白的降解有重要的作用。
实施例10、检测ZnFe-4纳米材料在不同细胞系中的杀伤
(1)ES-2，BT549和BxPC3细胞属于突变型p53细胞系，A549和Hela细胞属于野生型p53细胞系，而APRE-19细胞属于人视网膜上皮细胞(同时也含有野生型p53)，这些细胞均购置于ATCC。将上述细胞分别接种在96孔细胞培养板中，密度约1～2×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)处理12h，空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行CCK8细胞活力检测。结果如图24所示，ZnFe-4纳米材料对野生型p53及正常细胞都不会对其细胞活力造成影响，而对突变型p53细胞具有较强的杀伤，说明ZnFe-4纳米材料引发的突变型p53蛋白的降解，从而特异性地造成其细胞活力严重下降。同时上述细胞在处理完毕后，然后进行Annexin-V/PI FACS检测。结果如图25所示，同样地，ZnFe-4纳米材料对野生型p53及正常细胞几乎没有任何毒性影响，细胞凋亡水平低于2％，但可以引起突变型p53产生约50％及以上的细胞凋亡水平，此结果也同样说明了ZnFe-4纳米材料特异性引发突变型p53细胞的凋亡。
(2)①在CRISPR/Cas9网站(http://crispr.mit.edu/)设计敲除p53 sgRNA引物，并合成引物，根据操作说明把形成双链的sgRNA引物克隆至PX 458质粒(购于Addgene)，构建cas9gp53质粒，然后将构建好的重组质粒转化进JM109感受态细胞中(原JM109菌株购买于上海生工，JM109感受细胞是本实验室根据TaKaRa公司的Competent Cell PreparationKit制备所得)，最后涂板后培养后挑取阳性单克隆，摇菌，提取质粒。其中，引物序列如下：
sgp53-F1:5’-caccgccattgttcaatatcgtccg-3’；
sgp53-R1:5’-aaaccggacgatattgaacaatggc-3’；
sgp53-F2:5’-caccgaccagcagctcctacaccgg-3’；
sgp53-R2:5’-aaacccggtgtaggagctgctggtc-3’。
②将ES-2细胞铺板于24孔板，培养过夜，次日利用LipofectamineTM3000根据操作步骤把构建的质粒转染至ES-2细胞。转染24小时结束后，收集细胞，进行western blot检测p53的敲除情况。结果如图26A所示(Cas9 gNC：不含有敲除p53序列的空载PX 458质粒)，该cas9gp53质粒能有效敲除p53基因。
③将ES-2细胞接种在96孔细胞培养板中，密度约1～2×104cell/孔，过夜培养，待用。用上述验证过敲除效率的cas9gp53质粒转染至细胞中，同时转入空白对照质粒，转染结束后。分别加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒处理12h，空白对照为等体积的PBS缓冲液，然后进行CCK8细胞活力检测。结果如图26B所示，彻底敲除p53基因后对ES-2细胞有70％杀伤，而敲除后再加入ZnFe-4纳米材料处理后，这种杀伤并没有增加。但是对于对照质粒组，加入ZnFe-4纳米材料处理后，有很好的杀伤效果，这说明了ZnFe-4纳米材料导致的细胞死亡是依赖于p53的。
实施例11、检测ZnFe-4纳米材料处理ES-2细胞后p21的表达水平
将ES-2细胞接种在小皿中，密度约1.5～2×106cell/皿，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)处理8h。空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理完毕后，用PBS轻轻洗涤两遍后，加入RNAiso Plus裂解液(RNA提取试剂盒，购于宝生物)冰上裂解细胞，并根据实验操作说明书提取细胞的总RNA后进行逆转实验操作及荧光定量PCR检测p21基因的表达水平。结果如图27所示，ZnFe-4纳米材料处理后p21基因的表达水平上升。同时我们进行western blot检测p21蛋白的表达情况，如图28所示，在ES-2细胞中，ZnFe-4纳米材料处理后，随着突变型p53蛋白的降解，p21的表达升高，与基因表达水平相符。
将ES-2细胞接种在12孔板中，密度约1.5～2×105/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒处理8h。空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理完毕后，用PBS轻轻洗涤两遍后，收集细胞及按照说明书固定细胞后使用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒进行染色操作，最后在流式细仪中检测细胞周期。结果如图29所示，ZnFe-4纳米材料处理后引发细胞周期的阻滞，说明ZnFe-4纳米材料导致突变型p53蛋白降解后，p21的表达水平升高，导致癌细胞的细胞周期阻滞，调控了癌细胞的增殖生长。
实施例12、检测ZnFe-4纳米材料处理ES-2细胞后的GOF(Gain of Function)
细胞划痕实验：预先在细胞培养板的底部画好直线，并做好相应的刻度和标记，将适量ES-2单细胞悬液铺板于24孔板，每孔3～5×104cell/孔，培养过夜，次日，当细胞密度为90％以上的单层细胞时，根据板底的刻度线用10μL枪头划过细胞层，用1640培养基轻轻洗涤细胞表面，把划痕中的细胞清洗干净后，显微镜下拍照记录0小时细胞划痕的距离。接着，配制终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米材料处理细胞12小时，空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理结束后，吸掉培养基，1×PBS缓冲液轻轻洗涤细胞表面，洗掉附在细胞表面的ZnFe-4纳米材料，最后加入1640培养基，显微镜下拍照经过12小时处理后细胞划痕的距离，分析处理组与未处理组癌细胞的迁移能力。结果如图30所示，ZnFe-4纳米材料处理后能有效抑制癌细胞的迁移能力。
细胞克隆形成实验：将适量ES-2单细胞悬液(1000个细胞)铺板于6孔板中，次日，配制终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米材料处理细胞12小时，空白对照为等体积的PBS缓冲液。处理结束后，吸掉原培养基，1×PBS缓冲液轻轻洗涤细胞表面两次，洗掉附在细胞表面的ZnFe-4纳米材料，最后加入完全培养基，培养10～14天，期间注意培养基的消耗，及时更换培养基。培养结束后，1×PBS缓冲液轻轻洗涤细胞表面，加入4％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，1×PBS缓冲液洗涤两次。配制0.1％结晶紫溶液并每孔加入1mL，室温染色30分钟后，吸掉染色液，1×PBS缓冲液轻轻洗涤多次，洗干净背景后，室温晾干后拍照记录细胞克隆。结果如图31所示，ZnFe-4纳米材料处理后能有效癌细胞的增殖生长。
以上结果都说明了ZnFe-4纳米材料突变型p53细胞后，引发了突变型p53蛋白的降解，从而解除了突变p53的GOF(Gain-of-Function)，有效抑制了癌细胞的生长。
实施例13、测试ZnFe-4纳米材料在ES-2细胞中联合顺铂处理的的杀伤情况
将ES-2细胞接种在96孔细胞培养板中，密度约1～2×104cell/孔，过夜培养，待用。在加样前，先将细胞换入新鲜1640培养基，然后分别加入终浓度为20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒(实施例1中制得)，20μg/mL的ZnFe-4纳米颗粒+2.5μg/mL的Cisplatin(顺铂，购买于MCE)，2.5μg/mL的Cisplatin处理12h，空白对照为等体积的PBS缓冲液。然后进行CCK8细胞活力检测。结果如图32所示，化疗药物对突变型p53细胞的杀伤不到20％，而在ZnFe-4纳米材料处理及联合化疗药物处理后，对癌细胞的杀伤达到了接近80％，说明在细胞水平ZnFe-4纳米材料能有效增敏化疗药物的杀伤效果。
实施例14、探究ZnFe-4纳米材料在动物体内的药代动力学
Balb/c小鼠(体重约20g，雌性，购买于北京维通利华动物实验技术有限公司)3只，尾静脉注射1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)，不同时间(0.083、0.5、1、2、4、8、16、24h)点眼眶静脉丛取血，通过ICP检测血液中ZnFe-4的含量。结果如图33和表1所示，这些药代动力学参数表明ZnFe-4纳米材料在小鼠体内的具有较快的代谢。
表1 ICP检测血液中ZnFe-4纳米材料的Fe和Zn的含量(平均值±标准偏差，n＝5)
Figure GDA0002979471880000111
表中：T1/2表示药物半衰期、ACU表示曲线面积、CMAX表示最大药物浓度、MRT表示平均滞留时间；所有药代动力学数据均通过DAS 3,0软件中的非房室模型计算得出。
实施例15、检测ZnFe-4纳米材料对小鼠脏器的影响
Balb/c小鼠(体重约20g)(雌性，购买于北京维通利华动物实验技术有限公司))分为两组，每组三只，处理组尾静脉注射1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)，阴性对照注射等体积的PBS缓冲液。24h后眼眶静脉丛取血，分离血清，检测血清中AST(谷草转氨酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、BUN(血尿素氮)、SCR(血清肌酐)的浓度。结果如图34所示，与PBS组比较，ZnFe-4纳米材料处理组的肝肾功能指标与PBS组之间没有明显的差异，说明ZnFe-4纳米材料不会对小鼠体内脏器造成明显影响。
Balb/c小鼠(体重约20g)分为两组，每组三只，处理组尾静脉注射1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料，阴性对照注射等体积的PBS缓冲液。24h后牺牲小鼠，取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要器官，进行切片HE染色观察。结果如图35所示，ZnFe-4纳米材料处理组后各组织的纹理与PBS无明显差别，说明ZnFe-4纳米材料不会对小鼠体内脏器造成明显的损伤。
实施例16、检测ZnFe-4纳米材料在动物体内肿瘤水平上的杀伤
(1)在雌性裸鼠(体重约22g，购自于北京维通利华)右翼皮下分别注射100μl ES-2细胞(1×107)构建肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时进行后续实验。将获得的ES-2荷瘤鼠分为四组，每组5只，每组分别尾静脉注射PBS缓冲液、1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料(实施例1中制得)、1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料+2.5mg/kg Cisplatin(顺铂，购于MCE)，2.5mg/kgCisplatin。一周两次，治疗过程中记录小鼠体重图36及肿瘤体积变化图37。治疗16天(前两周每周两次，第三周注射一次)结束后，牺牲小鼠剥取肿瘤拍照(图38)并进行称重(图39)。可以看出，ZnFe-4纳米材料本身对ES-2肿瘤有较好的治疗效果，而联合化疗药物处理后，治疗效果最好。
(2)在雌性NOD/SCID小鼠(体重约19g，购自于北京维通利华)第二个乳垫处植入2～3mm3病人来源的乳腺癌组织(含有Y220C p53突变)，当原位乳腺癌肿瘤生长至800mm3时，剥离肿瘤组织，于无菌PBS中清洗并切割成2～3mm3大小的组织块，种植于NOD/SCID小鼠的乳垫下，构建PDX肿瘤模型，待肿瘤生长至150mm3时，把荷瘤小鼠随机分成4组(每组6只)，每组接受不同的治疗，分别为尾静脉注射PBS缓冲液、1.5mg/kg ZnFe-4纳米材料、1.5mg/kgZnFe-4纳米材料+2.5mg/kg Cisplatin，2.5mg/kg Cisplatin。一周两次，治疗过程中记录小鼠体重(图40)及肿瘤体积变化(图41)。治疗14天结束后，牺牲小鼠剥取肿瘤拍照(图42)并进行称重(图43)。可以看出，在PDX肿瘤模型中ZnFe-4纳米材料本身对ES-2肿瘤有较好的治疗效果，而联合化疗药物处理后，治疗效果最佳。
实施例17、检测ZnFe-4纳米材料动物水平治疗后肿瘤组织的凋亡水平
在实施例16中ES-2荷瘤鼠及PDX模型鼠治疗结束后，取每组的部分肿瘤组织进行石蜡切片，利用凋亡试剂盒进行TUNEL染色(购于碧云天)。结果如图44(ES-2肿瘤模型)及图45(PDX肿瘤模型)所示，两组肿瘤模型中肿瘤细胞的凋亡结果与治疗后的肿瘤称重结果相符，ZnFe-4纳米材料处理组及联合处理组均有较高的细胞凋亡水平。
实施例18、检测ZnFe-4纳米材料动物水平治疗后肿瘤组织的p53水平
在实施例16中PDX模型鼠治疗结束后，取每组的部分肿瘤组织进行石蜡切片，免疫组化抗体(Anti-p53，DO-1，购买于Santa Cruze)染色检测肿瘤组织p53的表达水平。结果如图46所示，ZnFe-4纳米材料处理组及联合处理组的肿瘤组织中p53的表达降低，说明ZnFe-4纳米材料在动物体内仍然能降解肿瘤组织中的突变型p53蛋白。
在实施例16中PDX模型鼠治疗结束后，取每组的部分肿瘤组织，并使用RIPA组织裂解液提取肿瘤组织中的蛋白，进行western blot检测肿瘤组织中p53蛋白的表达情况。结果如图47所示，在ZnFe-4纳米材料处理组及联合处理组中，每只老鼠的肿瘤组织里的p53蛋白都出现明显的降低，与免疫组化结果相符。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 点突变引物F
<400> 1
ccactacaac tacatgtgta acagtttctg catgggcggc at 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 点突变引物R
<400> 2
atgccgccca tgcagaaact gttacacatg tagttgtagt gg 42
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp53-F1
<400> 3
caccgccatt gttcaatatc gtccg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp53-R1
<400> 4
aaaccggacg atattgaaca atggc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp53-F2
<400> 5
caccgaccag cagctcctac accgg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp53-R2
<400> 6
aaacccggtg taggagctgc tggtc 25

Claims (6)

1.一种锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用，其特征在于：
所述的应用的环境为体外环境；
所述的锌铁纳米材料通过如下方法制备得到：
将油酸锌和油酸铁溶解在1-十八稀和油酸的混合溶液中，在120～320℃、真空或保护性气体氛围下进行反应，待反应结束后冷却，再加入2～4倍体积异丙醇，混匀后离心，弃上清，用异丙醇洗涤沉淀，得到锌铁纳米材料；
所述的锌铁纳米材料中锌元素与铁元素的质量比为1:2；
所述的突变p53蛋白为p53蛋白突变体S241F，R249S，Y220C，R280K和R248W中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用，其特征在于：
所述的锌铁纳米材料为球型锌铁纳米颗粒，其平均粒径10nm。
3.根据权利要求1所述的锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用，其特征在于：
所述的油酸的用量为占油酸锌和油酸铁总摩尔量的1/2；
所述的反应的条件为：先在120℃、真空或保护性气体氛围下反应30分钟，然后在320℃、真空或保护性气体氛围下反应2小时。
4.根据权利要求1所述的锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用，其特征在于，还包括将获得的锌铁纳米材料转水相的步骤，具体为：
将得到的锌铁纳米材料超声分散在正己烷中，然后加入柠檬酸钠、丙酮和超纯水，于70℃条件下水浴反应，待两相交换反应结束后，再加入2～4倍体积的丙酮，混匀后离心，洗涤，最后超声分散到水中；
所述的反应的时间为3～5小时。
5.根据权利要求1所述的锌铁纳米材料在降解突变p53蛋白中的应用，其特征在于，还包括将获得的锌铁纳米材料转水相的步骤，具体为：
所述的油酸铁通过如下方法制备得到：将三氯化铁和油酸钠加入到乙醇，正己烷和超纯水的混合溶液中，于70℃油浴锅中搅拌反应，待反应结束后冷却，洗涤，收集上层油酸铁溶液，静置或旋蒸使正己烷挥发，得到油酸铁；
所述的三氯化铁和油酸钠的摩尔比为1:3；
所述的乙醇，正己烷和超纯水的体积比为4:6:3；
所述的反应的时间为2～4小时；
所述的洗涤为采用超纯水进行洗涤；
所述的静置的条件为：室温放置过夜；
所述的油酸锌通过如下方法制备得到：将氯化锌和油酸钠加入到乙醇，正己烷和超纯水的混合溶液中，于70℃油浴锅中搅拌反应，待反应结束后冷却，洗涤，收集上层油酸锌溶液，静置或旋蒸使正己烷挥发，得到油酸锌；
所述的氯化锌和油酸钠的摩尔比为1:2；
所述的乙醇，正己烷和超纯水的体积比为4:6:3；
所述的反应的时间为2～4小时；
所述的洗涤为采用超纯水进行洗涤；
所述的静置的条件为：室温放置过夜。
6.权利要求1～5任一项中所述的锌铁纳米材料在制备降解突变p53蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的突变p53蛋白为p53蛋白突变体S241F，R249S，Y220C，R280K和R248W中的至少一种。
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