CN117860781B - 一种双重调控肿瘤pd-l1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双重调控肿瘤PD‑L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。制备方法包括如下步骤：S1、以乙酰丙酮锰为原料制备硫化锰纳米材料；S2、以步骤S1制备的硫化锰纳米材料、PD‑L1亲合体为原料制备硫化锰‑PD‑L1亲合体。本发明采用上述一种双重调控肿瘤PD‑L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用，合成的产品具有稳定性、可重复性；本发明合成的双重调控肿瘤PD‑L1表达的诊疗一体化纳米探针不仅具有降低肿瘤细胞PD‑L1表达及化学动力学治疗的特性，还能对肿瘤部位进行可视化诊断，有利于临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤免疫逃逸（Tumor immune escape）是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象。程序性死亡配体1（PD-L1）和受体分子PD-1是免疫检查点阻断治疗中的重要靶点。正常情况下，一些肿瘤细胞表面的PD-L1分子是高表达的，这些PD-L1分子能与免疫细胞—T细胞膜表面的PD-1特异性结合，使T细胞识别肿瘤细胞的过程受阻，从而抑制T细胞的活性和功能，促进肿瘤细胞逃避免疫系统的监视，加速增殖。
而抗PD-1或PD-L1抗体能够阻断肿瘤PD-L1和T细胞PD-1的结合，消除这一免疫抑制效应，使得T细胞重新被激活，识别并杀伤癌细胞。亲和体是一类新型的非免疫球蛋白基支架蛋白，可以特异性地与大量不同的靶蛋白结合，具有很高的亲和力。其中，PD-L1亲合体能够特异性识别并结合肿瘤细胞表面高表达的PD-L1分子，使免疫T细胞能正常进攻肿瘤细胞，激发肿瘤细胞免疫。
此外，不仅可以从细胞外部对于PD-L1分子的进行阻断，肿瘤细胞内的一些机制也能达到PD-L1调控的效果。研究表明，一些金属离子，如锰离子，能在肿瘤酸性微环境（TME）和H2O2的条件下，引发肿瘤细胞原位类芬顿反应，产生ROS中强氧化性的羟基自由基（·OH）。·OH能够损伤肿瘤细胞能量工厂—线粒体，致使线粒体产生ATP的水平下降，无法维持肿瘤细胞原本所需供能，一些细胞蛋白表达降低，从而实现从内部降低肿瘤细胞PD-L1分子表达的目的。而且，锰基纳米材料，因其自身锰离子具有较高的顺磁性特征，在发挥治疗作用的同时，还具有核磁成像的能力，能对肿瘤部位进行诊断，为治疗提供指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用，能够调节肿瘤细胞表面PD-L1分子表达，且对肿瘤细胞治疗的同时，实现肿瘤部位可视化诊断。
为实现上述目的，本发明提供了一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
S1、以乙酰丙酮锰为原料制备硫化锰纳米材料；
S2、以步骤S1制备的硫化锰纳米材料和PD-L1亲合体为原料制备硫化锰-PD-L1亲合体。
优选地，步骤S1中，硫化锰纳米材料的制备方法具体为：
S1-1、将乙酰丙酮锰、柠檬酸三钠充分溶于乙二醇，加入聚丙烯酸，搅拌反应120min，制得溶液A；
S1-2、将0.05M硫代乙酰胺的乙二醇溶液与溶液A混合，搅拌反应5min，制得溶液B；向溶液B中滴加一定量的三乙醇胺并在常温下搅拌反应5min，制得溶液C；
S1-3、溶液C进行溶剂热反应，反应结束后离心收集沉淀，将沉淀用无水乙醇洗至上清澄清，沉淀即为硫化锰纳米材料。
优选地，步骤S1-1中，乙酰丙酮锰、柠檬酸三钠与乙二醇的加入量之比为10.6587mg∶2.941 mg∶1 mL，聚丙烯酸与乙二醇的加入量之比为6 mg∶1 mL。
优选地，步骤S1-2中，硫代乙酰胺的乙二醇溶液、溶液A的体积比为3∶4；
三乙醇胺、溶液B的体积比为1∶70。
优选地，步骤S1-3中，溶液C的溶剂热反应在微波合成仪中，200 ℃下加热反应60min进行；反应产物经14000 rpm、10 min离心收集沉淀。
优选地，步骤S2中，制备硫化锰-PD-L1亲合体的方法为：
S2-1、分别配置0.2 mg/mL硫化锰纳米粒子的DMF溶液、0.08 mg/mL EDC的DMF溶液和0.08 mg/mL NHS的DMF溶液；
S2-2、将硫化锰纳米粒子的DMF溶液、EDC的DMF溶液混合，冰浴搅拌10 min，继续加入NHS的DMF溶液，冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000 rpm离心10 min收集沉淀；
S2-3、将沉淀用纯水重悬，加入PD-L1亲合体冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000 rpm离心10 min收集沉淀，得到硫化锰-PD-L1亲合体。
优选地，步骤S2-2中，硫化锰纳米粒子的DMF溶液、EDC的DMF溶液、NHS的DMF溶液的体积比为1∶1∶1。
优选地，步骤S2-3中，沉淀与PD-L1亲合体的比例为8∶1。
因此，本发明采用上述一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用，具有如下技术效果：
（1）本发明制备双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的合成方法简便，可操作性强；合成的产品稳定，具有可重复性。
（2）本发明合成的双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针可以降低肿瘤部位PD-L1的表达，增强对肿瘤细胞的免疫治疗。
（3）本发明合成双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针还具有化学动力学治疗的特性，因此，可实现免疫和化学动力学的联合治疗。
（4）本发明合成双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针，能够对肿瘤部位进行可视化诊断，有利于临床应用。
附图说明
图1为实施例制得的MP纳米材料的透射电镜图片；
图2为蛋白免疫印迹（western blot）检测MP和MPZ纳米材料对PD-L1的抑制效果：（a）WB显影条带；（b）PD-L1表达量化图；
图3为MP和MPZ纳米材料对4T1小鼠免疫激活的效果：（a）流式细胞数测定4T1小鼠肿瘤免疫细胞浸润百分比；（b）流式细胞数测定4T1小鼠脾脏免疫细胞浸润百分比；
图4为DCFH-DA/Hoechst荧光探针检测MP和MPZ纳米材料与4T1细胞共孵育后细胞产生活性氧的荧光图像；
图5为MP和MPZ纳米材料对4T1小鼠的治疗效果：（a）4T1小鼠治疗过程的肿瘤体积动态曲线；（b）4T1小鼠治疗结束解剖肿瘤图片；
图6为尾静脉注射MP和MPZ后小鼠的9.4 T磁共振成像效果：(a)为小鼠磁共振图像；(b)为相对信噪比统计。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例
一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法，包括如下步骤：
S1、MP纳米材料的制备
将213.174 mg乙酰丙酮锰和58.82 mg柠檬酸三钠溶于20 mL乙二醇中，溶解完全后，加入120 mg的聚丙烯酸，在常温条件，800 rpm的磁力搅拌下反应120 min。
将56.3475 mg的硫代乙酰胺溶于15 mL乙二醇中，加入至上述溶液中，在常温条件，800 rpm的磁力搅拌下反应5 min，滴加0.5 mL的三乙醇胺，在常温条件，800 rpm的磁力搅拌下反应5 min。
反应结束后，将液体全部转移到微波合成仪中，在200 ℃下加热反应60 min。最后，以14000 rpm，10 min离心收集沉淀，用无水乙醇洗至上清澄清，得到产物硫化锰纳米材料（MP）。将产物分散在乙醇中-20 ℃保存。
S2、MPZ纳米材料的制备
取40 μg上述制备的硫化锰的乙醇溶液，以14000 rpm离心10 min，弃上清收集沉淀。随后，用0.2 mL DMF重悬上述沉淀，然后超声混合均匀。
称取16 μg EDC，溶于0.2 mL DMF中；称取16 μg NHS，溶于0.2 mL DMF中。将硫化锰的DMF溶液和EDC的DMF溶液混合，冰浴搅拌10 min；加入NHS的DMF溶液，冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000 rpm离心10 min，收集沉淀。
将沉淀用0.5 mL纯水重悬，加入5 μg PD-L1亲合体，冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000 rpm离心10 min，收集沉淀，得到硫化锰-PD-L1亲合体（MnS-ZPD-L1，MPZ）。
试验测试
（一）如图1所示，取100 μg硫化锰的乙醇溶液，离心去上清后100 μL纯水重悬，配置为1 mg/mL的溶液，使用10 μL移液器取10 μL溶液滴加至铜网上，共滴30-40 μL，烘干制备成透射电镜检测样品，并用透射电镜观察，制备的MP纳米探针的形状为球状，粒径约为90-150 nm左右。
（二）蛋白免疫印迹（western blot）检测MP和MPZ纳米材料对PD-L1的抑制效果。
将4T1细胞铺在六孔板中，分三组处理细胞：
（1）PBS（Mn的浓度为0 μg/mL）；
（2）MP（Mn的浓度为20 μg/mL）；
（3）MPZ（Mn的浓度为20 μg/mL）。
孵育24 h后，收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，按照BCA试剂说明书进行蛋白定量。电泳后，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。转移膜后，用脱脂奶粉封闭1h，加入稀释的PD-L1一抗溶液（根据抗体说明书的推荐浓度稀释），37 ℃孵育2 h。PBST洗涤后，加入二抗摇床慢摇1 h，PBST洗涤，显影，并拍摄，分析WB实验结果。
图2中（a）部分为WB显影条带；（b）部分为PD-L1表达量化图。结果表明，MPZ由于PD-L1亲合体的靶向特性，增加肿瘤细胞对MPZ纳米材料的摄取，更加降低PD-L1在4T1细胞中的表达。
（三）如图3所示，取6周健康BALB/c小鼠，雌雄各半，建立4T1小鼠模型，待瘤生长至100 mm3后，随机分为三组：PBS、MP、MPZ，每组五只。每三天以2 mg/kg的剂量对其进行治疗，治疗14天后，进行解剖，取4T1小鼠的肿瘤组织和脾脏，消化和研磨以制成单分散的细胞悬浮液，封闭后用荧光抗体染色。
流式细胞术测定肿瘤组织和脾脏中CD8+T细胞（CD45+CD3+CD8+)，M1型巨噬细胞（CD11b+F4/80+MHCII+)和M2型巨噬细胞（CD11b+F4/80+CD206+)的浸润百分比。图3中（a）部分为流式细胞数测定4T1小鼠肿瘤免疫细胞浸润百分比；图3中（b）部分为流式细胞数测定4T1小鼠脾脏免疫细胞浸润百分比。
结果表明，MP治疗组小鼠的肿瘤组织和脾脏中的免疫细胞浸润百分比略有升高，MPZ治疗组浸润百分比最高，说明MPZ相较于MP具有进一步免疫治疗的作用。
（四）如图4所示，将4T1细胞铺在6孔板中，分三组处理细胞：PBS组(Mn的浓度为0 μg/mL)，MP组(Mn的浓度为20 μg/mL)，MPZ组(Mn的浓度为20 μg/mL)。4 h后，吸除培养液，加入1 mL的DCFH-DA/Hoechst检测工作液，避光在37 ℃下孵育30 min。30 min后，在荧光显微镜下观察绿色荧光（DCFH-DA）和蓝色荧光（Hoechst）的分布情况。
结果表明：MPZ组产生ROS的水平较MP组增高，说明MPZ相较于MP能够更好地被细胞所摄取，产生更多的·OH，具有更强的化学动力学能力。
（五）如图5所示，取6周健康BALB/c小鼠，雌雄各半，建立4T1小鼠模型，待瘤生长至100 mm3后，随机分为三组：PBS、MP、MPZ，每组五只。每三天以2 mg/kg的剂量对其进行治疗，治疗14天后，进行解剖，并对解剖得到的肿瘤拍照。
在治疗期间，每两天对肿瘤体积进行测量、记录。图5中（a）部分为4T1小鼠治疗过程的肿瘤体积动态曲线；（b）部分为4T1小鼠治疗结束解剖肿瘤图片。结果表明，MP和MPZ组都对4T1肿瘤的生长有明显的抑制作用，且MPZ的抑瘤效果最为明显。
如图6所示，图6中(a)部分为小鼠磁共振图像；(b)部分为相对信噪比统计。
按2 mg/kg的剂量对4T1小鼠模型尾静脉注射MP和MPZ纳米材料后，图像信噪比较注射升高，在60 min时，达到最大值，且MPZ组的相对信噪比高于MP组相对信噪比，说明MP纳米材料具有磁共振成像的能力，在连接了PD-L1亲合体后，增加了靶向性能，使得这种核磁成像能力增强。
因此，本发明采用上述一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针及其制备方法与应用，合成的产品具有稳定性、可重复性；本发明合成的双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针不仅具有降低肿瘤细胞PD-L1表达及化学动力学治疗的特性，还能对肿瘤部位进行可视化诊断，有利于临床应用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以乙酰丙酮锰为原料制备硫化锰纳米材料；
S1-1、将乙酰丙酮锰、柠檬酸三钠充分溶于乙二醇，加入聚丙烯酸，搅拌反应120 min，制得溶液A；
S1-2、将0.05M硫代乙酰胺的乙二醇溶液与溶液A混合，搅拌反应5min，制得溶液B；向溶液B中滴加一定量的三乙醇胺并在常温下搅拌反应5min，制得溶液C；
S1-3、溶液C进行溶剂热反应，反应结束后离心收集沉淀，将沉淀用无水乙醇洗至上清澄清，沉淀即为硫化锰纳米材料；
S2、以步骤S1制备的硫化锰纳米材料和PD-L1亲合体为原料制备硫化锰-PD-L1亲合体。
2.根据权利要求1所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤S1-1中，乙酰丙酮锰、柠檬酸三钠与乙二醇的加入量之比为10.6587 mg∶2.941 mg∶1 mL，聚丙烯酸与乙二醇的加入量之比为6 mg∶1 mL。
3.根据权利要求1所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，
步骤S1-2中，硫代乙酰胺的乙二醇溶液、溶液A的体积比为3∶4；
三乙醇胺、溶液B的体积比为1∶70。
4.根据权利要求1所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S1-3中，溶液C的溶剂热反应在微波合成仪中，200 ℃下加热反应60min进行；反应产物经14000 rpm、10 min离心收集沉淀。
5.根据权利要求1所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，制备硫化锰-PD-L1亲合体的方法为：
S2-1、分别配置0.2 mg/mL硫化锰纳米粒子的DMF溶液、0.08 mg/mL EDC的DMF溶液和0.08 mg/mL NHS的DMF溶液；
S2-2、将硫化锰纳米粒子的DMF溶液、EDC的DMF溶液混合，冰浴搅拌10 min，继续加入NHS的DMF溶液，冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000 rpm离心10 min收集沉淀；
S2-3、将沉淀用纯水重悬，加入PD-L1亲合体冰浴搅拌30 min，在4 ℃条件下，以14000rpm离心10 min收集沉淀，得到硫化锰-PD-L1亲合体。
6.根据权利要求5所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S2-2中，硫化锰纳米粒子的DMF溶液、EDC的DMF溶液、NHS的DMF溶液的体积比为1∶1∶1。
7.根据权利要求5所述的一种双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S2-3中，沉淀与PD-L1亲合体的比例为8∶1。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的双重调控肿瘤PD-L1表达的诊疗一体化纳米探针的制备方法所制备的硫化锰-PD-L1亲合体。
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