CN111110866A - 还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及制备与应用 - Google Patents

还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒的制备方法，具体方法如下：由小分子支化聚乙烯亚胺与硫化丙烯反应制得大分子二硫键改性的支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，使SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA，以SSBPEI@siRNA为内核，在其表面通过静电结合修饰上聚乙二醇改性的聚谷氨酸(mPEG‑γ‑PGA)外壳，即得所述纳米粒。本发明的有益效果主要体现在：聚乙二醇的引入提高了载体的生物相容性和血液长循环能力；聚谷氨酸可以与肿瘤细胞上的肿瘤相关的γ‑谷氨酰转肽酶(GGT)特异性结合，使基因药物主动靶向递送至肿瘤部位；SSBPEI可在肿瘤细胞内的高浓度的谷胱甘肽还原下降解成低毒的小分子聚乙烯亚胺，降低大分子SSBPE毒性，同时可在肿瘤部位加速释放siRNA实现基因治疗。

Description

还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及制备与 应用
(一)技术领域
本发明涉及一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及其制备方法，以及其在制备肿瘤靶向基因药物中的应用。
(二)背景技术
基因治疗是指通过基因转移技术，将外源正常基因导入靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的的一种生物治疗方法。近年来，基因疗法已成为治疗各种疾病的重要的手段之一，特别是在肿瘤的治疗上。肿瘤基因治疗可以通过改变肿瘤细胞中基因的表达量，抑制肿瘤细胞的增殖生长等。但由于基因在肿瘤治疗过程中存在靶向性差，易被血清降解等缺点，基因载体成为基因治疗研究中的重要的一部分。
一个理想的基因载体需要具有高转染效率、肿瘤靶向性、低细胞毒性血液长循环能力等特点。目前，最常见的商用基因载体是支化聚乙烯亚胺，因其具有质子海绵效应，支化聚乙烯亚胺可很快从内涵体逃逸，从而在携带基因时，可得到较高的基因转染效率。大分子的聚乙烯亚胺具有高的基因转染效率，但细胞毒性大，低分子量的聚乙烯亚胺具有低毒性，但基因转染效率却很低。将低分子量的聚乙烯亚胺通过二硫键连接形成大分子的二硫键改性的聚乙烯亚胺，既可实现高基因转染效率，同时，由于二硫键改性的聚乙烯亚胺中的二硫键可被细胞内谷胱甘肽还原降解成低分子的聚乙烯亚胺，又能达到材料低毒性的目的。此外，由于肿瘤细胞中含有比正常组织要高出100～1000倍浓度的谷胱甘肽，二硫键改性的聚乙烯亚胺携带基因药物时则更容易被肿瘤细胞中的谷胱甘肽降解，释放出基因药物进行基因治疗，具有肿瘤靶向性。但是，二硫键改性的聚乙烯亚胺作为基因载体还远远不够，为了进一步使得基因载体具有血液长循环能力和主动靶向性，我们制备了聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒，由于聚谷氨酸(γ-PGA)可以与肿瘤细胞上的肿瘤相关的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)特异性结合，因此纳米粒中γ-PGA的引入可将纳米粒更容易聚集在肿瘤部位，实现基因药物的肿瘤主动靶向递送。由于聚乙二醇具有良好的生物相容性和水溶性，聚乙二醇的引入使得纳米粒具有良好的血液长循环能力，实现基因药物的肿瘤被动靶向递送。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种具有低细胞毒性、较好的生物相容性，还原响应性的，能够有效结合基因并将其靶向递送至肿瘤细胞中的基因载体—聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒，所述复合纳米粒由如下方法制备得到：先将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)与硫化丙烯反应制得二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，再将SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA内核，然后在SSBPEI@siRNA内核表面通过静电作用结合上聚乙二醇修饰的聚谷氨酸(mPEG-γ-PGA)外壳，即得所述纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
本发明还涉及制备所述复合纳米粒的方法，所述方法包括：先将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)与硫化丙烯反应制得二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，再将SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA内核，然后在SSBPEI@siRNA内核表面通过静电作用结合上聚乙二醇修饰的聚谷氨酸(mPEG-γ-PGA)外壳，即得所述纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
具体步骤如下(制备过程及靶向给药原理示意图参见图1)：
1)将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)溶解在去离子水中配制成0.028mol/L的BPEI溶液；调节BPEI溶液的pH值至中性，冻干2～3天；将冻干产物用无水甲醇溶解后，加入硫化丙烯，并在60～70℃的氮气保护下搅拌反应18～24小时；将反应液减压浓缩后所得的产物溶解于无水甲醇中，通过冷乙醚沉淀2～3次后，减压浓缩干燥得到BPEI-SH；其中，BPEI的分子量范围为600～1800Da，BPEI与硫化丙烯的摩尔比为1:5。BPEI与硫化丙烯反应后所得产物所用的甲醇溶剂与冷乙醚沉淀剂的体积比为1:2～3；
2)将步骤1)中所得BPEI-SH溶解在二甲基亚砜溶液中，室温下搅拌反应36～48小时，透析2～3天除去杂质，冻干处理2～3天，得到的淡黄色固体二硫键修饰的聚乙烯亚胺(SSBPEI)；
3)将步骤2)得到的SSBPEI溶于去离子水中(2.56mg/mL)，与siRNA(1μg/mL)水溶液通过静电相互作用结合形成SSBPEI@siRNA混悬液。其中，SSBPEI与siRNA的N/P比为1～20:1；
4)将聚谷氨酸(γ-PGA)溶解在pH＝8.5的硼酸盐缓冲液中，加入氨基修饰的聚乙二醇(mPEG-NH2)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应3～4h，透析2～3天，冻干处理2～3天，得到mPEG-γ-PGA。其中，γ-PGA，mPEG-NH2，EDC.HCl，NHS的质量用量之为10:1.55:14.56:8.92；
5)将mPEG-γ-PGA溶解于去离子水中(2.56mg/mL)，与步骤(4)制得的SSBPEI@siRNA混悬液孵育20～30分钟，即得到所述还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。其中，mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比为0.5～4：1。
本发明还涉及所述还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒在制备肿瘤靶向基因药物中的应用。复合纳米粒中聚乙二醇和聚谷氨酸的引入可提高载体的主/被动靶向性、生物相容性和血液长循环能力，可实现基因药物的肿瘤靶向递送，为抗肿瘤药物筛选提供了新的途径。
本发明的有益效果主要体现在：本发明所制备的还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒具有还原响应性，可在肿瘤细胞内的高浓度的谷胱甘肽的还原下将二硫键改性的聚乙烯亚胺降解成低毒的低分子量的聚乙烯亚胺，因此，既可避免使用毒性大的分子聚乙烯亚胺，又能在肿瘤细胞内加速释放药物，实现基因治疗；纳米粒中聚谷氨酸的引入可增加载体的主动靶向性，在携带基因进入细胞时可促进细胞对基因的摄取，实现基因药物的肿瘤主动靶向递送；纳米粒中聚乙二醇的引入可提高载体的生物相容性和血液长循环能力，实现基因药物的肿瘤被动靶向递送。
(四)附图说明
图1为SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒制备过程及靶向给药原理示意图；(a)SSBPEI的制备；(b)mPEG-g-γ-PGA的制备；(c)SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA的制备及靶向给药原理；
图2为SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒(mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比＝1：1)的原子力显微镜图。
图3为通过动态光散射法测得的SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒(mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比＝1：1)在有/无还原剂DTT存在下、随着时间变化的粒径曲线图。
图4为BPEI@siRNA，SSBPEI@siRNASSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA的凝胶阻滞分析图。
图5为A549细胞经SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理48小时后的细胞活性(a)；和SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒的溶血率(b)。
图6为A549细胞经siRNA,SSBPEI@siRNA，SSBPEI@siRNA/γ-PGA，SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理6小时后的细胞摄取图。
图7为A549细胞经SSBPEI@siRNA-NC/mPEG-γ-PGA，SSBPEI@siRNA-Survivin/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理48小时后，加入DOX刺激24小时的细胞凋亡图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)称取分子量为1200的支化聚乙烯亚胺10g，溶解在300mL的去离子水中得到BPEI 1.2k水溶液。通过滴加0.1mol/L的盐酸溶液将BPEI1.2k水溶液的pH值调至中性，冻干处理3天；
(2)将步骤(1)中所得到的固体用300mL无水甲醇溶解在三颈烧瓶中，通入氮气20分钟除去体系中的空气，用1mL注射器加入3.3mL的硫化丙烯，并在60℃的氮气保护下搅拌反应18小时；
(3)将步骤(2)中得到的产物通过减压干燥除去溶剂，然后溶解于200mL无水甲醇中，通过冷乙醚沉淀2次后，降压干燥除去溶剂得到BPEI-SH；
(4)将所得的BPEI-SH溶解在30mL二甲基亚砜溶液中，室温下搅拌反应36小时，形成二硫键修饰的聚乙烯亚胺；
(5)将得到的产物在超纯水中透析2天除去杂质，冻干处理2天，得到的淡黄色固体二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)；
(6)将SSBPEI溶于去离子水中(2.56mg/mL)，与siRNA(siRNA-survivin Sense：GCAAAGGAAACCAACAAUATT；Antisense：UAUUGUUGGUUUCCUUUGCTT)水溶液(1μg/ml)按照V:V＝5：1通过静电相互作用结合形成N/P比为10：1的SSBPEI@siRNA悬浮液。
(7)将10g聚谷氨酸溶解在3L硼酸盐缓冲液中，加入1.55g氨基修饰聚乙二醇(mPEG-NH2)，1.456g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，0.892g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应4h，在去离子水中透析2天，冻干处理2天，制得mPEG-γ-PGA；
(8)取100mL的mPEG-γ-PGA水溶液(2.56mg/mL)与步骤(6)所制备的SSBPEI@siRNA悬浮液(100mL)共同孵育30分钟制得还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺载体/siRNA纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
(9)粒径分布：取4μL步骤(8)中所制备的SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA纳米粒悬浮液滴加至新剥离的云母片中心，室温干燥后下以1Hz的扫描速度在空气中记录图像。所得SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒的原子力显微镜图参见图2，可见纳米粒以球形分布，分散性良好。
(10)还原响应性测试：取500μL步骤(8)中所制备的SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA纳米粒悬浮液与DTT溶液(15mM)孵育不同的时间，以不加DTT的组分作为对照。通过激光粒度仪测试SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒在有/无还原剂DTT存在下粒径的变化。每个样品重复测量3次，求出平均值与标准偏差。SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒在有/无还原剂DTT存在下、随着时间变化的粒径曲线图参见图3。由图可见，SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒在无还原剂DTT存在下，粒子比较稳定，粒径变化不大，在加入还原剂DTT后，粒子解离，粒径逐渐变大，释放出siRNA。
实施例2：
(1)样品配置：在3.6μL浓度为20μM的siRNA溶液中分别加入1μL不同浓度的BPEI25k，SSBPEI，及SSBPEI与mPEG-γ-PGA聚合物的PBS溶液(PH＝7.4)，在4℃环境下孵育30分钟制备出BPEI25k@siRNA，SSBPEI@siRNA N/P比分别为1：1，5：1，10：1，20：1的纳米粒，以及mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比分别为0.5：1，1：1，2：1的SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。用移液枪在各溶液中加入2μL6×RNA上样缓冲液，吹打均匀备用。
(2)琼脂糖凝胶配置：称取0.3g琼脂糖置于锥形瓶，加入30mL 1×Tris-acetate-EDTA缓冲液中摇匀，盖上一个小烧杯后，将锥形瓶放入微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。将加热好的琼脂糖放在室温下冷却至60℃左右时，加入3uL的溴化乙啶(EB)，摇匀，然后将溶液转移至插好梳子的制胶板上，轻摇使溶液在制胶板上掌开形成均匀的胶层，室温下静置20分钟左右凝固。
(3)凝胶电泳：待胶完全凝固后取掉梳子，将装有琼脂糖凝胶的制胶板内槽放入电泳槽中，倒入1×Tris-acetate-EDTA缓冲液至完全浸没凝胶板。用移液枪取8uL样品溶液，加到胶孔中，盖上电泳槽盖后通电，100V进行电泳。可观察到RNA条带从负极向正极移动，待条带的移动距离为2cm左右时，停止电泳。将凝胶放入到凝胶仪中曝光，得到图像。
所得BPEI@siRNA，SSBPEI@siRNASSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA的理化性质参见表1和表2。
表1：不同N/P比SSBPEI@siRNA理化性质
Figure BDA0002345415830000081
表2：不同mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比的SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA理化性质
Figure BDA0002345415830000082
Figure BDA0002345415830000091
注：pH＝7.4pbs中测定，结果为平均值±标准偏差(n＝3)
所得BPEI@siRNA，SSBPEI@siRNASSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA的凝胶阻滞分析图参见图4，由图可见，当SSBPEI与siRNA的N/P大于5时，SSBPEI能够有效结合siRNA，且mPEG-γ-PGA外壳的引入不会对SSBPEI与siRNA结合稳定性产生影响。
实施例3：
(1)细胞毒性：将待处理的A549细胞从培养箱中取出并置于超净工作台中，用移液枪吸去原培养液，加入PBS溶液洗涤2次，随后加入400μL胰蛋白酶消化液进行消化，将培养瓶放置在37℃培养箱中消化3分钟左右，然后使用显微镜观察培养瓶中细胞的情况。当细胞变圆、细胞间隙变大时，除去胰蛋白酶消化液，加入一定量的含10％FBS的培养基终止消化。用移液管轻轻吹打制成单细胞悬液，使用血球计数板计数后，将其稀释成浓度为5×104cells/mL的单细胞悬液。取出96孔板，每孔中加入100μL上述细胞悬液，置于操作台中静置10min后，放入37℃培养箱中培养过夜。然后将纳米载体按照不同的比例混合静置30分钟。取96孔板放置于操作台中，用移液枪吸去原培养基，每孔加入100μL新鲜的含上述纳米粒的培养基，放37℃培养箱中分别培养48小时。在相同的时间间隔中，向每孔添加20μL MTS试剂，并在37℃下再培养3小时。随后，取出96孔板，用酶标仪于490nm下测定OD光值。
(2)溶血实验：将来自雄性新鲜新西兰兔的血液收集在肝素化的离心管中，加入pH＝7.4的冷PBS缓冲液稀释，以700×g离心10分钟。通过PBS缓冲液多次洗涤并离心将红细胞从血清中分离出来。然后将红细胞重悬于PBS缓冲液中，并将红细胞的浓度稀释至2％。在PBS缓冲液中分别制备BPEI 25K@siRNA，SSBPEI@siRNA，SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA纳米粒。将纳米粒加入到红细胞溶液中，在摇床中以37℃的恒定温度孵育3小时。为了确定血红蛋白的释放量，将样品以700×g离心10分钟，取上清液并转移至96孔板，通过酶标仪在540nm处分析上清液，使用PBS缓冲液和超纯水处理的红细胞溶液作为阴性和阳性对照。
A549细胞经SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理48小时后的细胞活性和溶血率参见图5。由图可见，A549细胞经SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理48小时后细胞存活率＞80％，说明纳米粒具有良好的细胞相容性；SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA溶血率＜5％，说明纳米粒具有良好血液相容性。
实施例4：
利用流式细胞仪来证明纳米载体是通过γ-PGA介导的细胞内化途径来完成有效的摄取。简言之，将人肝癌细胞A549以5×105cells/well接种于6孔板上培养24小时。将纳米载体(Free siRNA，SSBPEI@siRNA，SSBPEI@siRNA/γ-PGA，SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA)添加到六孔板中继续孵育6小时。用胰酶消化处理后收集细胞，将得到的细胞以1200rpm离心5min，用PBS洗涤2次，再次离心收集细胞。最后将细胞重悬于含有2％FBS的300μL的PBS中，用流式细胞仪进行上机分析。
A549细胞经上述复合纳米粒处理6小时后的细胞摄取情况参见图6。由图可见，A549细胞经SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA复合纳米粒处理后检测到有最强的荧光强度，同时，mPEG的加入对这一趋势没有显著影响。在相同条件下，细胞经SSBPEI@siRNA处理后，荧光强度明显下降。
实施例5：
利用双凋亡实验来证明纳米载体包载的Survivin可以促进癌细胞的凋亡。简言之，将人肝癌细胞A549以5×105cells/well接种于6孔板上培养24小时。将纳米载体(SSBPEI@siRNA-NC/mPEG-γ-PGA，SSBPEI@siRNA-Survivin/mPEG-γ-PGA)添加到六孔板中继续孵育48小时。然后，将化疗药物阿霉素和PTX(浓度参考IC50)添加到细胞中孵育24小时进一步刺激凋亡。用胰酶消化处理后收集细胞，将得到的细胞以1200rpm离心5min，用PBS洗涤2次，再次离心收集细胞。使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)通过流式细胞仪检测细胞凋亡。
双凋亡实验结果见图7，使用siR-Survivin纳米粒子处理48小时之后分别加入DOX与PTX刺激，凋亡和坏死细胞的比例可以达到总数的85.3％和41.0％，而使用siR-NC纳米粒子处理，凋亡和坏死细胞的比例只有53.6％和29.9％。结果表明，有效的Survivin基因沉默导致较高的细胞凋亡和肿瘤的化疗敏感性更高。

Claims (8)

1.一种还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒，由如下方法制备得到：先将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)与硫化丙烯反应制得二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，再将SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA内核，然后在SSBPEI@siRNA内核表面通过静电作用结合上聚乙二醇修饰的聚谷氨酸(mPEG-γ-PGA)外壳，即得所述纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
2.制备权利要求1所述还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒的方法，其特征在于所述方法包括：先将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)与硫化丙烯反应制得二硫键改性支化聚乙烯亚胺(SSBPEI)，再将SSBPEI与siRNA通过静电结合制得SSBPEI@siRNA内核，然后在SSBPEI@siRNA内核表面通过静电作用结合上聚乙二醇修饰的聚谷氨酸(mPEG-γ-PGA)外壳，即得所述纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)将低分子量的支化聚乙烯亚胺(BPEI)溶解在去离子水中配制成BPEI溶液；调节BPEI溶液的pH值至中性，冻干2～3天；将冻干产物用无水甲醇溶解后，加入硫化丙烯，并在60～70℃的氮气保护下搅拌反应18～24小时；将反应液减压浓缩后所得的产物溶解于无水甲醇中，通过冷乙醚沉淀2～3次后，减压浓缩干燥得到BPEI-SH；
(2)将步骤(1)中所得BPEI-SH溶解在二甲基亚砜溶液中，室温下搅拌反应36～48小时，透析2～3天除去杂质，冻干处理2～3天，得到的淡黄色固体二硫键修饰的聚乙烯亚胺(SSBPEI)；
(3)将步骤(2)中得到的SSBPEI溶于去离子水中，与siRNA水溶液通过静电相互作用结合形成SSBPEI@siRNA混悬液；将聚谷氨酸(γ-PGA)溶解在pH＝8.5的硼酸盐缓冲液中，加入氨基修饰的聚乙二醇(mPEG-NH2)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应3～4h，透析2～3天，冻干处理2～3天，得到mPEG-γ-PGA；
(4)将mPEG-γ-PGA溶解于去离子水中，与步骤(4)制得的SSBPEI@siRNA混悬液孵育20～30分钟，即得到所述还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒SSBPEI@siRNA/mPEG-γ-PGA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中支化聚乙烯亚胺(BPEI)的分子量范围为600～1800Da，BPEI与硫化丙烯的摩尔比为1:5，BPEI与硫化丙烯反应后所得产物所用的甲醇溶剂与冷乙醚沉淀剂的体积比为1:2～3。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)中SSBPEI与siRNA的N/P比为1～20:1。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)中γ-PGA，mPEG-NH2，EDC.HCl，NHS的质量用量之为10:1.55:14.56:8.92。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(5)中mPEG-γ-PGA与SSBPEI@siRNA的质量比为0.5～4：1。
8.权利要求1所述还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒在制备肿瘤靶向基因药物中的应用。
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