CN104998274B - 一种核‑壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核‑壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法，特点是该载体以核‑壳结构纳米复合物为核，在核‑壳结构纳米复合物表面吸附化疗药物多烯紫杉醇后，通过自组装技术在复合物表面包覆一层聚丙烯酸正丁酯‑丙烯酸羟丁酯嵌段两亲性聚合物即可，其中所述的核‑壳结构纳米复合物以四氧化三铁为核，以氧化锌为吸附壳面，其制备方法包括核‑壳结构纳米复合物的合成的步骤；核‑壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附步骤；两亲性嵌段聚合物的合成步骤；最后多功能载药体的合成步骤，优点是具有良好的磁响应性和生物相容性，且兼具靶向光控释药物和吸附癌细胞分泌物。

Description

一种核-壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多功能载药体，尤其是涉及一种核-壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法。

背景技术

癌症，亦称恶性肿瘤，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞可以无止境、无限制地增生，消耗大量患者本应供给给正常组织的营养物质；癌细胞释放出多种毒素，伤害患者的正常机能；癌细胞还通过循环系统和淋巴系统转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终导致死亡。目前，癌症是发病率及致死率最高的疾病之一。对于癌症的治疗，化疗仍是使用最频繁且必不可少的治疗手段。虽然传统的全身性化疗能阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，并且最终杀灭癌细胞，但是化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也不可避免的对正常的人体细胞造成损伤，出现对化疗药物的不良反应，从而出现身体衰弱、免疫功能下降、骨髓抑制、消化障碍、炎症反应、心脏，肾脏，肝脏，神经系统毒性等副作用，导致患者存活率下降。于是，如何能在保证治疗效果的前提下，尽量减少对患者的毒副作用，成为医疗工作者最为关心的问题。

药物载体控释系统能够改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向部位，减少药物的降解和损失，提高生物利用度，有效地保护正常组织免受化疗药物的损伤，降低毒副作用。现有的各种体系的药物载体，如脂质体、聚合物微球、胶束、树枝状大分子、碳纳米管、介孔硅、量子点等。上述药物载体均能有效地包载化疗药物，并通过适当的修饰，利用物理、化学或生物靶向引导，将化疗药物运输到肿瘤靶向部位。更为智能化的药物载体，可接受外界的刺激来控制化疗药物的释放行为，以提高药物利用度和减少毒副作用。然而，目前的药物载体的功能只是将药物运输到癌症部位，释放化疗药物，以高浓度的药物来杀伤癌细胞，如果给药手段或剂量等掌控不好，极有可能造成癌细胞微环境的改变，增加了癌细胞的抗药性，致使化疗药物不能被充分利用，有利于癌细胞生长的分泌物大量产生，反而促进了癌细胞的增殖和转移，给患者带来更大的痛苦。此外，利用药物载体制备的药物新剂型被批准上市的种类极少，原因药物载体在体内的分布、代谢机制还未被完全解析，药物载体是否会对机体产生长期毒性等问题还未有定论。因此，非常有必要开发一种既能靶向运输并控释药物，又能吸附某些癌细胞分泌的促进其生长和转移的分泌物后排出体外的药物载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好的磁响应性和生物相容性，且兼具靶向光控释药物和吸附癌细胞分泌物的核-壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种核-壳结构纳米复合多功能载药体，该载体以核-壳结构纳米复合物为核，在核-壳结构纳米复合物表面吸附化疗药物多烯紫杉醇后，通过自组装技术在复合物表面包覆一层聚丙烯酸正丁酯-丙烯酸羟丁酯嵌段两亲性聚合物即可，其中所述的核-壳结构纳米复合物以四氧化三铁为核，以氧化锌为吸附壳面。

上述核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，包括以下步骤：

（1）核-壳结构纳米复合物的合成

在氮气保护下，将5.4349 g的FeCl₃·6H₂O和2.0184 g的FeCl₂·4H₂O溶于25 mL的去离子水中，在搅拌的同时，加入0.57 mL的浓度为12 mol/L的HCl溶液得到混合液，将混合液逐滴加入到剧烈搅拌的150 mL的浓度为1.5 mol/L的NaOH溶液中；待黑色沉淀生产后，继续搅拌30 min后，磁吸附分离得到黑色沉淀即为四氧化三铁纳米粒，用去离子水洗三次后真空干燥待用；取0.014 g四氧化三铁纳米粒置于20 mL的二甘醇中，超声分散30 min，接着加入0.05 g的Zn(Ac)₂·2H₂O，剧烈搅拌30 min后，置160℃油浴中保温反应1.5 h后，离心收集沉淀，即为核-壳结构纳米复合物，用无水乙醇和去离子水各洗三次后真空干燥待用；

（2）核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附

将浓度为1 -10 mg/mL的多烯紫杉醇丙酮溶液逐滴加入到浓度为0.002 mg/mL的核-壳结构纳米复合物水溶液中，超声处理0.5 h后，于12000 rpm的速度离心15 min，取沉淀用氮气吹干，得到吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物；

（3）两亲性嵌段聚合物的合成

将丙烯酸羟丁酯置于希莱克瓶中，依次加入丙烯酸正丁酯，苯甲醚，五甲基二乙烯三胺和氯化亚铜，混合均匀；将希莱克瓶密封，冷冻30 min后用真空泵抽真空，再室温解冻；重复进行冷冻30 min后用真空泵抽真空，再室温解冻操作三次，待瓶内空气排尽后，将希莱克瓶置于60 ℃油浴1 min，加入引发剂2-溴异丁酸乙酯，真空恒温反应2 h，打开希莱克瓶，混入空气，终止反应得到粗产物；将粗产物溶于氯仿中，过中性氧化铝层析柱分离氯化亚铜催化剂，收集滤过产物，进行旋转蒸发，将浓缩后的产物溶于甲醇中，装入截留分子量为3000的透析袋中密封，将透析袋浸泡到甲醇中，750 rpm的速度下搅拌1 h后用新鲜甲醇置换全部透析液，继续搅拌3 h后再用新鲜甲醇置换全部透析液，接着继续搅拌透析20 h，取出透析袋，将袋中纯产物真空干燥，得两亲性嵌段聚合物；该两亲性嵌段共聚物在分散有表面疏水的核-壳结构纳米复合物的水溶液中，在亲疏水作用力的驱动下，烷基端的疏水支链会附着在核-壳结构纳米复合物的表面，而亲水的支链暴露在水相中，包覆吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物表面形成一层聚合物薄膜；

（4）多功能载药体的合成

在浓度为2.9mg/mL的吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物水溶液中逐滴加入浓度为60 mg/mL的两亲性聚合物丙酮溶液，继续搅拌过夜，于12000 rpm的速度下离心，收集沉淀，真空干燥后得到纳米复合多功能载药体。

步骤（2）中所述的多烯紫杉醇丙酮溶液与所述的核-壳结构纳米复合物水溶液的体积比为1：100。

步骤（2）中所述的核-壳结构纳米复合物与所述的多烯紫杉醇的质量比为1:20。吸附率达到最大，最佳吸附率为89.75±0.15%。

步骤（3）中丙烯酸羟丁酯、丙烯酸正丁酯、苯甲醚、五甲基二乙烯三胺、氯化亚铜、2-溴异丁酸乙酯和甲醇的混合比例为0.945 mL： 2.949 mL：1.298 mL：15 μL：6.9 mg：10 μL：5mL。

步骤（4）中所述的吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物水溶液与所述的两亲性聚合物丙酮溶液的体积比为10：1。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种核-壳结构纳米复合多功能载药体及其制备方法，该载体以核-壳结构纳米复合物为核，以表明疏水的氧化锌为吸附面，在核-壳结构纳米复合物表面吸附化疗药物—多烯紫杉醇后，通过自组装技术在复合物表面包覆一层聚丙烯酸正丁酯-丙烯酸羟丁酯嵌段两亲性聚合物，制备出一种多功能的药物载体，该多功能药物载体在外界磁场引导下靶向运输到特定部位，并在紫外光照下，氧化锌表面亲/疏水性发生变化，两亲性聚合物在亲/疏水作用力下发生翻转，控制性释放多烯紫杉醇的同时吸附癌细胞分泌物，然后通过磁场引导排出体外。该多功能载药体具有超顺磁性、良好的磁响应性和生物相容性，并且可通过紫外光来控制药物的释放。更重要的是，在释放药物的同时，多功能载药体还能吸附鼻咽癌细胞分泌的表皮细胞生长因子，其对癌细胞的抑制作用要强于单纯药物的化疗作用。

综上所述，本发明一种新型的利用原子转移自由基聚合法合成两亲性嵌段共聚物包覆吸附了多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物，合成的多功能载药体具有良好的磁响应性和生物相容性，且兼具靶向光控释药物和吸附癌细胞分泌物，该多功能载药体可简单地通过外界磁场来实现靶向化疗及靶向清除，将会给传统的临床化疗方式带来巨大的变革，以提高化疗的疗效。

附图说明

图1为核-壳结构纳米复合物的TEM照片，标尺50 nm；插图：更大放大倍数的TEM照片，标尺5 nm；

图2 为核-壳结构纳米复合物能量色散X射线光谱图；

图3为未经处理，（a）经1 h紫外光照（b）和经1 h紫外光照后再1 h暗室处理（c）的核-壳结构纳米复合物的红外光谱图；

图4为两亲性嵌段共聚物的合成过程图；

图5为两亲性嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；

图6为多功能载药体的透射电子显微镜TEM照片低放大倍数图；

图7为多功能载药体的透射电子显微镜TEM照片高放大倍数图；

图8为多功能载药体的粒径分布图；

图9为核-壳结构纳米复合物（a），吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物（b）和多功能药物载体（c）的红外图谱；

图10为多功能载药体的热重分析曲线图；

图11为多功能载药体的磁响应性曲线图；

图12为不同质量比下核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇吸附的关系图；

图13为不同质量比下核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇载药率的关系图；

图14为多功能载药体的释药行为分析示意图；

图15为多功能载药体对细胞培养液中表皮细胞生长因子的吸附 (*，该组中表皮细胞生长因子浓度显著低于其他各组，p<0.05)；

图16为多功能载药体的细胞毒性对比分析示意图；

图17为多功能载药体对CNE细胞抑制的对比分析示意图（*，p<0.05）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

一种核-壳结构纳米复合多功能载药体，该载体以核-壳结构纳米复合物为核，在核-壳结构纳米复合物表面吸附化疗药物多烯紫杉醇后，通过自组装技术在复合物表面包覆一层聚丙烯酸正丁酯-丙烯酸羟丁酯嵌段两亲性聚合物即可，其中所述的核-壳结构纳米复合物以四氧化三铁为核，以氧化锌为吸附壳面，其具体制备方法如下：

（1）核-壳结构纳米复合物的合成

在氮气保护下，将5.4349 g的FeCl₃·6H₂O和2.0184 g的FeCl₂·4H₂O溶于25 mL的去离子水中，在搅拌的同时，加入0.57 mL的浓度为12 mol/L的HCl溶液得到混合液，将混合液逐滴加入到剧烈搅拌的150 mL的浓度为1.5 mol/L的NaOH溶液中；待黑色沉淀生产后，继续搅拌30 min后，磁吸附分离得到黑色沉淀即为四氧化三铁纳米粒，用去离子水洗三次后真空干燥待用；取0.014 g四氧化三铁纳米粒置于20 mL的二甘醇中，超声分散30 min，接着加入0.05 g的Zn(Ac)₂·2H₂O，剧烈搅拌30 min后，置160℃油浴中保温反应1.5 h后，离心收集沉淀，即为核-壳结构纳米复合物，用无水乙醇和去离子水各洗三次后真空干燥待用；

由图1 核-壳结构纳米复合物TEM照片可以看出，合成核-壳结构纳米复合物的平均粒径为12.1 nm，呈类方形，分散较为均匀，因此具有较大的比表面积。由图2核-壳结构纳米复合物的能量色散X射线光谱显示复合物中锌元素占6.7%，铁元素占8.9%，氧元素占5.1%，而其中的铜元素和碳元素是来自样品支撑台；由图3未经处理，经1 h紫外光照和经1h紫外光照后再1 h暗室处理的核-壳结构纳米复合物的红外光谱图可知，核-壳结构纳米复合物中没有醋酸根存在，说明本章所制备的核-壳结构纳米复合物即为以四氧化三铁为核，氧化锌为壳的核-壳结构纳米复合物。在自然状态下，核-壳结构纳米复合物表面的氧化锌呈疏水态，可以吸附用于鼻咽癌化疗的疏水性药物多烯紫杉醇，与其它的载药系统的吸附率和载药率相近；

（2）核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附

将0.1 -1 mg的多烯紫杉醇溶于50 μL的丙酮中，将配好的多烯紫杉醇丙酮溶液逐滴加入到5 mL的均匀分散有0.01 mg的核-壳结构纳米复合物的去离子水中，超声处理0.5h后，于12000 rpm的速度离心15 min，取沉淀用氮气吹干，即得到吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物；

（3）两亲性嵌段聚合物的合成

取0.945 mL 的丙烯酸羟丁酯置于50 mL的希莱克瓶中，依次加入2.949 mL的丙烯酸正丁酯，1.298 mL的苯甲醚，15 μL的五甲基二乙烯三胺和6.9 mg的氯化亚铜，混合均匀；将希莱克瓶密封，冷冻30 min后用真空泵抽真空，再室温解冻；重复进行冷冻30 min后用真空泵抽真空，再室温解冻操作三次，待瓶内空气排尽后，将希莱克瓶置于60 ℃油浴1 min，加入10 μL的引发剂2-溴异丁酸乙酯，真空恒温反应2 h，打开希莱克瓶，混入空气，终止反应得到粗产物；将粗产物溶于氯仿中，过中性氧化铝层析柱分离氯化亚铜催化剂，收集滤过产物，进行旋转蒸发，将浓缩后的产物溶于5 mL甲醇中，装入截留分子量为3000的透析袋中密封，将透析袋浸泡到100 mL的甲醇中，750 rpm的速度下搅拌1 h后用新鲜甲醇置换全部透析液，继续搅拌3 h后再用新鲜甲醇置换全部透析液，接着继续搅拌透析20 h，取出透析袋，将袋中纯产物真空干燥，得两亲性嵌段聚合物；

上述利用原子转移自由基聚合法，合成嵌段两亲性聚合物，合成过程如图4所示，丙烯酸正丁酯和丙烯酸羟丁酯的碳-碳双键断裂，发生加成聚合，合成产物以柔韧的碳-碳链为主链，支链为两种，一种是烷基端的疏水链，另一种是羧基端的亲水链。图5是加成聚合产物的核磁共振氢谱，δ0.910是亲水端羟基的化学位移，δ1.055-1.187是疏水端甲基的化学位移，δ 4.1左右的峰为加成聚合后出现的次甲基化学位移，图谱中未出现碳碳双键的化学位移，证明合成的产物即是制备得到的两亲性嵌段共聚物。而δ 2.525处出现的化学位移为溶剂氘代DMSO。同时，通过峰面积积分计算可知，合成产物中端羟基与端甲基的比为2:1，说明合成产物为HBA-BA-HBA型。该两亲性嵌段共聚物同时具有疏水的烷基端支链和亲水的羟基端支链，所以有特殊的表面性能，在选择性溶剂中会自组装成以不溶嵌段为核，可溶嵌段为壳的高分子胶束；

（4）多功能载药体的合成

将500 μL溶有30 mg步骤（3）得到的两亲性聚合物的丙酮溶液逐滴加入到5 mL溶有14.5 mg步骤（2）得到的多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物的去离子水中，500 rpm的速度搅拌下，继续搅拌过夜（除去丙酮），于12000 rpm的速度下离心，收集沉淀，真空干燥后得到纳米复合多功能载药体。

在水溶液中，利用两亲性嵌段共聚物的两亲性，包裹表面疏水的吸附了多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物，合成多功能载药体。由图1核-壳结构纳米复合物的TEM照片（标尺：50 nm）显示核-壳结构纳米复合物原来粒径分布在11.2 nm左右的，由于吸附了多烯紫杉醇以及两亲性嵌段共聚物的包裹作用，团聚成了较大粒径的纳米颗粒（如图5所示）。从放大倍数更高的照片可以清楚地看出，许多小微粒团聚在一起形成了较大规格的球形纳米颗粒（如图7所示）。通过激光粒度分析仪测定多功能载药体的粒径分布结果可知，多功能载药体的粒径分布在120 nm左右（如图8所示）。

利用红外光谱仪分析核-壳结构纳米复合物、吸附多稀紫衫醇的核-壳结构纳米复合物以及多功能载药体的表面化学性质，结果如图9所示，图中曲线b吸附多稀紫衫醇的核-壳结构纳米复合物中3000 cm^-1附近出现较弱的三个吸收峰，为甲基的吸收峰；1720cm^-1左右有明显的羰基吸收峰；1500 cm^-1到1300 cm^-1之间有明显的峰出现，为苯环骨架伸缩振动，证明多烯紫杉醇已经成功吸附到核-壳纳米复合物表面；图中曲线C多功能载药体中，2960 cm^-1附近的吸收峰明显增强，说明物质中甲基含量明显增大，1168 cm^-1 及1247 cm^-1的吸收峰也明显增大，为羟基的振动峰，说明了物质中羟基的含量也明显增大。结果证明，吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物已被两亲性嵌段共聚物包附。同时，通过多功能载药体的热重分析，结果如图10多功能载药体的热重分析曲线所示，在80～100 ℃、200～420℃、620～750 ℃三个区间有失重，分别是多功能载药体表面吸附的水分、多烯紫杉醇和两亲性嵌段共聚物的失重，证实了核-壳结构纳米物外吸附多烯紫杉醇并被两亲性嵌段共聚物包覆。

图11是多功能载药体的室温磁滞曲线。虽然多功能载药体的饱和磁强度由于多烯紫杉醇的吸附及两亲性聚合物的包裹，相对于核-壳结构纳米复合物来说，从17.84 emu/g下降到了8.16 emu/g，但其无磁滞现象，剩磁及矫顽力全部为零，表明多功能载药体为超顺磁性，并且多功能载药体对外界磁场具有良好的磁响应性，原来均匀分散的多功能载药体，能在5 min内被磁场固定在一定区域。从图11的插图中可以看出，外界磁场可以容易地引导多功能载药体并限制在一定的区域内，移动磁场的方向，多功能载药体便随着磁场方向的改变而改变聚集的方向。因此，随着磁精确定位及成像技术的发展，在进行鼻咽癌治疗时，多功能载药体是具有巨大的临床应用潜力的，其可以被外界磁场引导并限度在鼻咽癌的病灶部位，当行使完释药及吸附癌细胞分泌物的功能后，多功能载药体又能在外界的磁场引导下排除体外，将吸附的利于癌细胞增殖、转移的分泌物排除体外，并且消除载体自身对机体代谢的毒副作用。

二、试验分析

1、核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的最佳吸附

分别将0.01 mg，0.05 mg，0.1 mg，0.2 mg，0.5 mg和1 mg的多烯紫杉醇溶于50 μL的丙酮中，然后逐滴加入到5mL浓度为0.002 mg/mL的核-壳结构纳米复合物水溶液中，超声处理0.5 h后，于12000 rpm的速度离心15 min，取沉淀用氮气吹干，即得到吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物沉淀；将干燥好的吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物沉淀置于15 mL离心管中，加入5 mL的甲醇超声处理5 min（以洗脱下吸附于核-壳结构纳米的多烯紫杉醇），于12000 rpm的速度离心15 min后，取上清液，测定上清液中多烯紫杉醇含量，从而计算获得核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附率；

如图12所示，不同质量比下核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附率。从图中可以看出，当核-壳结构纳米复合物与多烯紫杉醇的质量比为1:20时，吸附率达到最大，最佳吸附率为89.75±0.15%。

如图13所示，不同质量比下核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的载药率。从图中可以看出，核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的载药率随着多烯紫杉醇的质量的增大而增高，当质量比增加到1:20时，载药率达到17.95±2.97%。之后，当多烯紫杉醇的质量再增大后，载药率再无明显增加。

2、实施例一制备的多功能载药体的药物释放

取0.5 mg的多功能载药体，分散于10 mL的PBS缓冲液中，将多功能载药体悬浊液均匀铺散在90 mm培养皿中，使用365 nm波长，功率为12 W的紫外灯光照1 h。磁吸附多功能载药体，取上清，利用紫外分光光度计测量上清液中多烯紫衫醇的含量。干燥后，又将多功能载药体分散于PBS缓冲液中，重复上述操作5次，观察紫外光照条件下，多功能载药体的药物释放行为。同时，设置不做紫外光照处理的对照组，考察多功能载药体的稳定性。

结果如图14多功能载药体的药物释放行为所示，在紫外光照的起始的1 h内，多烯紫杉醇的释放量达到了60.35±0.74%，而在继后的5 h小时紫外光照后，累积释放量达到了85.18±0.38%。相对于无紫外光照组的多功能载药体，药物比较稳定的被包裹在载药体内，6 h后的累积释药量仅为10.32±0.68%。结果说明，紫外光照能控制并促进药物的释放。这是由于本发明制备的多功能载药体是利用氧化锌的疏水态吸附疏水性的药物多烯紫杉醇，外面再包覆一层两亲性嵌段聚合物，两亲性聚合物在水溶液中亲/疏水作用力的驱动下，发生结构重排，疏水端支链附着在吸附了多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物表面，亲水端朝向水相中；氧化锌在紫外光照下会发生亲/疏水状态的改变，从疏水性向亲水性转变。经过紫外照射后，包裹在里面的核-壳结构纳米复合物的表面向亲水态转变，在亲/疏水作用力下，多烯紫杉醇被排斥，解吸附下来。同时，两亲性嵌段聚合物的支链也发生翻转，疏水端被排斥，亲水端被吸引，包覆结构暂时解体，由此，被解吸下来的多烯紫杉醇被释放到环境溶液中。在2-6 h内，多烯紫杉醇的释放量没有1 h内的释放量多，原因是由于核-壳结构纳米复合物在吸附多烯紫杉醇和被两亲性聚合物包裹后发生了一定程度的聚集，被集聚到内部的核-壳结构纳米复合物可能接受不到紫外光的辐射，因此被吸附的多烯紫杉醇未被完全释放出来，但释放速率还是快于无紫外光照的对照组。在对照组中，1 h内释放量仅为2.33%，到6 h后释放量刚刚达到10%，说明本发明合成的多功能载药体稳定程度高，药物不易泄露。

由此可知，本发明成功合成了一种智能紫外光控释放的药物载体，只有在紫外光照的条件下才能释放药物，而无紫外光照条件下，药物释放量极少，药物制剂稳定性高，因此在化疗时对正常细胞或组织的毒副作用小。

3、实施例一制备的多功能载药体对表皮细胞生长因子的吸附行为

按照5000个细胞每孔的密度将100 μL的CNE细胞悬浊液加入96孔板中，放入细胞培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，从中吸取6孔细胞培养液，离心后取上清液，利用ELISA试剂盒测定其中表皮细胞生长因子的含量。剩余每孔中加入一定量的多功能载药体，使得加入的多烯紫杉醇的浓度为50 ng/mL。使用365 nm波长，功率为12 W的紫外灯光照1 h。从中吸取6孔细胞培养液，离心后取上清液，利用ELISA试剂盒测定其中表皮细胞生长因子的含量。其余细胞继续培养1 h，吸取6孔细胞培养液，离心后取上清液，利用ELISA试剂盒测定其中表皮细胞生长因子的含量。同时，设置不做任何处理的细胞为对照，分别在对应实验组紫外光照1 h和紫外光照后继续培养1 h的时间点测定培养液中表皮细胞生长因子的含量。

结果如图15经过多功能载药体处理后不同时间点的细胞上清液中表皮细胞生长因子的浓度所示，初始时CNE细胞培养上清液中的浓度为592.67 pg/mL，紫外光照1 h后，两亲性嵌段聚合物的疏水端支链还未完全展开，CNE细胞继续分泌表皮细胞生长因子，上清液中表皮细胞生长因子浓度稍有增加，但当1 h紫外光照完毕后，疏水端支链被核-壳结构复合物排斥，两亲性聚合物骨架发生一定程度的翻转，疏水端支链暴露出来，吸附一定量的细胞培养液中表皮细胞生长因子，接着在1 h的暗室处理中，核-壳结构复合物逐恢复为疏水态，两亲性嵌段聚合物的疏水端支链又逐渐被吸引，聚合物骨架也逐渐翻转回来，表皮细胞生长因子被吸附到核-壳结构复合物表面，包裹于聚合物和内核之间。因此，细胞培养液中的表皮细胞生长因子浓度降低到459.79 pg/mL。对照组的实验结果显示，细胞培养液中的表皮生细胞长因子随着培养时间的增加其浓度不断上升。因此，实验结果证明，多功能载药体具有光控吸附细胞培养液中表皮细胞生长因子的功能。

4、多功能载药体对人鼻咽癌细胞系CNE细胞的抑制

80%的鼻咽癌组织中存在表皮细胞生长因子受体过度表达，且鼻咽癌细胞与正常的细胞相比能分泌大量的表皮细胞生长因子，经表皮细胞生长因子/受体自分泌环路促进鼻咽癌细胞的生长，增殖及转移。临床上鼻咽癌组织中高浓度的表皮细胞生长因子与鼻咽癌预后差、局部复合和转移快等症状相关。因此，选取鼻咽癌细胞为模型，观察多功能药物载体在紫外光刺激下的药物控释行为及其对癌细胞分泌的表皮细胞生长因子的吸附行为。同时，考察了多功能药物载体对鼻咽癌细胞的抑制效果。

细胞培养：CNE细胞和HUVEC细胞均使用含体积分数10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640培养基培养于25 cm²的细胞培养瓶中。置于37 ℃，5%CO₂细胞培养箱中培养，隔天换液一次。待细胞处于对数生长期时进行试验。

按照5000个细胞每孔的密度将100 μL的CNE细胞悬浊液加入96孔板中，放入细胞培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，每孔加入一定量的多功能载药体，使得加入的多烯紫杉醇的当量浓度分别为50 、100 和200 ng/mL。使用365 nm波长，功率为12 W的紫外灯光照1h后暗室中继续培养1 h，利用MTT法测定96孔板中6孔CNE细胞的活性。剩余细胞继续培养22h，利用MTT法测定96孔板中6孔CNE细胞的活性。以不做任何处理的细胞为阴性对照，设定其活性为100%。同时，设置另外两组实验组：一组为只加等量多烯紫杉醇，不做光照处理的实验组，观察单纯药物对细胞的抑制；一组为不加多功能载药体，只有光照处理的对照组，考察紫外光照对细胞活性的影响。

此外，以CNE细胞为癌症模型细胞，HUVEC细胞为正常模型细胞，添加上述三种浓度的多功能载药体共培养2 h及24 h后用MTT测定细胞活性，以判断多功能载药体对癌症细胞及正常细胞的毒性。以不做任何处理的细胞为阴性对照，设定其活性为100%。各孔细胞的活性按以下公式计算。CV%=O_t/O₀× 100%

其中CV表示细胞活性；O_t表示实验组细胞的吸光值；O₀表示对照组细胞的吸光值。

由图14可知，在没有受到紫外光照射时，多烯紫杉醇的释放量极少，而本身又是以羟基暴露在表面的聚合物膜包裹，因此，其生物相容性良好，同正常细胞或癌细胞共培养24h后，细胞活性仍在82%以上，可以认为，多功能载药体对细胞是无毒性的（如图16所示）。但是，在利用紫外光使多功能载药体释放多烯紫杉醇后，鼻咽癌细胞的活性明显被抑制，200ng/mL实验组的细胞活性已下降到70%以下。然而，多功能载药体中的多烯紫杉醇在1 h光照内未被完全释放，所以，其对鼻咽癌细胞的抑制效果不如纯多稀紫衫醇实验组，但未显示出明显差异。当培养24 h后，多功能载药体实验组的细胞活性明显低于纯多烯紫杉醇处理组，200 ng/mL实验组中的细胞活性只有44.43%，已经显著低于纯多烯紫杉醇处理组（如图17所示），说明药物的抑制和表皮细胞生长因子的浓度下降的联合作用的效果要强于单独药物化疗的效果。

综上所述，上述实施例1合成的多功能载药体能在紫外光的控制下释放多烯紫杉醇的同时吸附鼻咽癌细胞分泌的表皮细胞生长因子，并且对癌细胞的抑制效果要强于单纯的多烯紫杉醇。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种核-壳结构纳米复合多功能载药体，其特征在于：该载药体以核-壳结构纳米复合物为核，在核-壳结构纳米复合物表面吸附化疗药物多烯紫杉醇后，通过自组装技术在复合物表面包覆一层聚丙烯酸正丁酯-丙烯酸羟丁酯嵌段两亲性聚合物即可，其中所述的核-壳结构纳米复合物以四氧化三铁为核，以氧化锌为吸附壳面。

2.一种根据权利要求1所述的核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)核-壳结构纳米复合物的合成

在氮气保护下，将5.4349g的FeCl₃·6H₂O和2.0184g的FeCl₂·4H₂O溶于25mL的去离子水中，在搅拌的同时，加入0.57mL的浓度为12mol/L的HCl溶液得到混合液，将混合液逐滴加入到剧烈搅拌的150mL的浓度为1.5mol/L的NaOH溶液中；待黑色沉淀生产后，继续搅拌30min后，磁吸附分离得到黑色沉淀即为四氧化三铁纳米粒，用去离子水洗三次后真空干燥待用；取0.014g四氧化三铁纳米粒置于20mL的二甘醇中，超声分散30min，接着加入0.05g的Zn(Ac)₂·2H₂O，剧烈搅拌30min后，置160℃油浴中保温反应1.5h后，离心收集沉淀，即为核-壳结构纳米复合物，用无水乙醇和去离子水各洗三次后真空干燥待用；

(2)核-壳结构纳米复合物对多烯紫杉醇的吸附

将浓度为1-10mg/mL的多烯紫杉醇丙酮溶液逐滴加入到浓度为0.002mg/mL的核-壳结构纳米复合物水溶液中，超声处理0.5h后，于12000rpm的速度离心15min，取沉淀用氮气吹干，即得到吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物；

(3)两亲性嵌段聚合物的合成

将丙烯酸羟丁酯置于希莱克瓶中，依次加入丙烯酸正丁酯，苯甲醚，五甲基二乙烯三胺和氯化亚铜，混合均匀；将希莱克瓶密封，冷冻30min后用真空泵抽真空，再室温解冻；重复进行冷冻30min后用真空泵抽真空，再室温解冻操作三次，待瓶内空气排尽后，将希莱克瓶置于60℃油浴1min，加入引发剂2-溴异丁酸乙酯，真空恒温反应2h，打开希莱克瓶，混入空气，终止反应得到粗产物；将粗产物溶于氯仿中，过中性氧化铝层析柱分离氯化亚铜催化剂，收集滤过产物，进行旋转蒸发，将浓缩后的产物溶于甲醇中，装入截留分子量为3000的透析袋中密封，将透析袋浸泡到甲醇中，750rpm的速度下搅拌1h后用新鲜甲醇置换全部透析液，继续搅拌3h后再用新鲜甲醇置换全部透析液，接着继续搅拌透析20h，取出透析袋，将袋中纯产物真空干燥，得两亲性嵌段聚合物；该两亲性嵌段共聚物在分散有表面疏水的核-壳结构纳米复合物的水溶液中，在亲疏水作用力的驱动下，烷基端的疏水支链会附着在核-壳结构纳米复合物的表面，而亲水的支链暴露在水相中，包覆吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物表面形成一层聚合物薄膜；

(4)多功能载药体的合成

在浓度为2.9mg/mL的吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物水溶液中逐滴加入浓度为60mg/mL的两亲性聚合物丙酮溶液，继续搅拌过夜，于12000rpm的速度下离心，收集沉淀，真空干燥后得到纳米复合多功能载药体。

3.根据权利要求2所述的核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的多烯紫杉醇丙酮溶液与所述的核-壳结构纳米复合物水溶液的体积比为1：100。

4.根据权利要求2所述的核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的核-壳结构纳米复合物与所述的多烯紫杉醇的质量比为1:20。

5.根据权利要求2所述的核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中丙烯酸羟丁酯、丙烯酸正丁酯、苯甲醚、五甲基二乙烯三胺、氯化亚铜、2-溴异丁酸乙酯和甲醇的混合比例为0.945mL：2.949mL：1.298mL：15μL：6.9mg：10μL：5mL。

6.根据权利要求2所述的核-壳结构纳米复合多功能载药体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的吸附多烯紫杉醇的核-壳结构纳米复合物水溶液与所述的两亲性聚合物丙酮溶液的体积比为10：1。