CN108904532B - 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用 - Google Patents

一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108904532B
CN108904532B CN201810949725.3A CN201810949725A CN108904532B CN 108904532 B CN108904532 B CN 108904532B CN 201810949725 A CN201810949725 A CN 201810949725A CN 108904532 B CN108904532 B CN 108904532B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanocrystals
fullerene
camkii
cells
nanocrystal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810949725.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108904532A (zh
Inventor
许婧
尹飞
王卓莹
华莹奇
蔡郑东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai First Peoples Hospital
Original Assignee
Shanghai First Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai First Peoples Hospital filed Critical Shanghai First Peoples Hospital
Priority to CN201810949725.3A priority Critical patent/CN108904532B/zh
Publication of CN108904532A publication Critical patent/CN108904532A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108904532B publication Critical patent/CN108904532B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/44—Elemental carbon, e.g. charcoal, carbon black
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂在骨肉瘤中的应用，所述应用在于通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力，降低C60纳米晶体的使用剂量。实验结果表明：(1)抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。(2)通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂可以降低C60纳米晶体的使用剂量。(3)联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。

Description

一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用。
背景技术
富勒烯C60由于其显著的几何结构而具有很多独特理化性质(光诱导产生氧自由基、活跃的化学反应能力等)，在生物医药领域具有非常广泛的应用。如C60能产生单线态氧，剪切DNA，诱导自噬，调节免疫等。且由于C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，而产生的大量的C60的衍生物。C60的衍生物在药物输运、基因治疗以及肿瘤靶向等方面也有着突出的应用。
CaMKII是一类钙离子/钙调蛋白(Ca2+/CaM)依赖的蛋白激酶，主要有α、β、r、δ等几种亚型。它作为一种关键的学习记忆分子在神经系统中含量非常丰富。同时，它可通过磷酸化下游一系列参与钙离子稳态、肌肉收缩、信号转导等的靶蛋白而在多种肿瘤的生长、分化、侵袭和转移中都起到重要的作用。
CaMKII由三个结构域组成，催化结构域、调节结构域以及结合结构域。在基础状态时， CaMKII的调节结构域与催化结构域结合，激酶处于无活性状态。钙离子可使CaMKII构象打开而活化，但一旦钙离子除去激酶又会回复到构象闭合的抑制状态。而当环境中存在钙离子使CaMKII构象打开时，若CaMKII的T286/287位点发生自我磷酸化，则能产生不依赖于钙离子/钙调蛋白的活性，即使将钙离子除去，激酶仍能较长时间的保持在一个活性状态，即自主活性。
骨肉瘤作为临床上最常见的原发性恶性肿瘤之一，具有非常高的侵袭和转移能力。而骨肉瘤中的CaMKII的激活可能与细胞的促生存相关。
中国专利申请：CN107913289A公开了一种水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯中的至少一种。该药物对生物体有很好的亲和性，毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好。目前已有报道，水溶性的富勒烯C60纳米晶体可通过与神经组织中的CaMKIIα位点特异性的相互作用，引发激酶自主活性，并具有促进大鼠的学习和记忆的能力。但是关于富勒烯C60纳米晶体在骨肉瘤细胞上的应用，以及其对骨肉瘤细胞CaMKIIα的影响还鲜有报道，且是否可以通过调控CaMKII的活性来达到促进C60纳米晶体抗骨肉瘤细胞的效应也未曾有报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体为水溶性的富勒烯C60纳米晶体，富勒烯C60纳米晶体的粒径范围为100-140nm，形状为六棱形，可以光诱导产生氧自由基，C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，具有活跃的化学反应能力；所述CaMKII抑制剂可通过磷酸化下游一系列参与钙离子稳态、肌肉收缩、信号转导等的靶蛋白而在多种肿瘤的生长、分化、侵袭和转移中都起到重要的作用，所述CaMKII抑制剂由三个结构域组成，催化结构域、调节结构域以及结合结构域，在基础状态时，CaMKII 的调节结构域与催化结构域结合，激酶处于无活性状态，钙离子可使CaMKII构象打开而活化，但一旦钙离子除去激酶又会回复到构象闭合的抑制状态，而当环境中存在钙离子使 CaMKII构象打开时，若CaMKII的T286/287位点发生自我磷酸化，则能产生不依赖于钙离子/钙调蛋白的活性，即使将钙离子除去，激酶仍能较长时间的保持在一个活性状态，即自主活性。
作为本发明的一个优选实施方案，所述CaMKII抑制剂是KN-93抑制剂。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体的粒径为100-140nm。
作为本发明的一个优选实施方案，所述CaMKII抑制剂为一种化合物或其药学上可接受的盐，为以下化学结构：
Figure BDA0001771179660000031
其中：R1是无环基团或者5元或6元杂芳基，其选自由以下组成的结构列表：
Figure BDA0001771179660000032
R2、R3、R4、R5、R6和R7中的每个独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、-CN、-CF3、-OR、-NR2、-NO2、-COOR、-CONR2和-R；每个A独立地选自由以下组成的组：共价键、任选取代的亚甲基、任选取代的顺式亚乙基、任选取代的反式亚乙基、乙炔、C(O)、S(O)和 S(O)2；其中，如果一个A是任选取代的亚甲基、任选取代的顺式亚乙基、任选取代的反式亚乙基、乙炔、C(O)、S(O)或S(O)2，则另一个必须是共价键或任选取代的亚甲基；R8选自由以下组成的组：氢、NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；每个W独立地为N或CR9；每个X独立地为N或CR10；Y是O、S或NR11；Z是O、S或NR12； R9选自由以下组成的组：氢、L-R13、NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；其中，当存在一个R9基团时，R9不可以是氢，并且当存在两个R9基团时，一个必须是氢，而另一个必须不是氢；每个R10独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、-CN、 -CF3、-OR、-NR2、-NO2、-COOR、-CONR2和-R；R11是氢、NH2、具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；R12是氢或任选取代的C1-6脂族；L是共价键或者直链或支链C1-6 脂族基团，其中一个或多个亚甲基独立地并且任选地被–NR14-或-O-取代；R13选自由以下组成的组：NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；每个R14独立地为氢或C1-3脂族；并且每个R独立地为氢或任选取代的C1-6脂族。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体的制备方法是四氢呋喃 (THF)转水法，制备实验步骤如下：
(1)先将5份纳米C60粉末溶于500份未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；
(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以适当的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体。
作为本发明的一个优选实施方案，所述应用用于(1)增强C60纳米晶体杀伤肿瘤细胞的能力；(2)降低C60纳米晶体的使用剂量。
作为本发明的一个优选实施方案，所述应用为抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞死亡、促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞成瘤。
本发明优点在于：
1、富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂可以有效地杀伤骨肉瘤细胞，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
2、本发明通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂可以降低C60纳米晶体的使用剂量。
3、本发明组合物毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好，有很好的应用前景。
附图说明
附图1是C60纳米晶体的透射电镜图像。
附图2是C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力的影响。
附图3是C60纳米晶体激活骨肉瘤细胞CaMKIIα。
附图4是KN-93对C60纳米晶体引发的骨肉瘤CaMKIIα活性的影响。
附图5是C60纳米晶体联合KN-93对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图6是C60纳米晶体联合CaMKIIαsiRNA对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图7是KN-93通过抑制AKT信号增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图8是实施例8的实验结果，其中图8A为各组剥离的肿瘤，图8B为给药期间每两天测量一次的肿瘤体积，图8C为各组剥离肿瘤的重量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物及其在骨肉瘤中的应用。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物(一)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司。
二、实验方法
通过四氢呋喃转水法合成了水溶性的C60纳米颗粒(nano-C60)，其制备方法如下：
(1)先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；
(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min 的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体。
三、实验结果
所制得的富勒烯C60纳米晶体用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征，结果如图1所示，直径为120nm，形状类似于六棱形。
实施例2 C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力的影响(二)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63，SaoS2，SJSA以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞活力测定
本实验使用cck-8检测细胞活力。收集对数生长期的人骨肉瘤细胞系(143B，MG63，SaoS2，SJSA，HOS)，以3000个/孔的细胞数分入96孔板中，细胞贴壁后，加入不同浓度 (0、1.6、4.4μg/mL)的C60纳米晶体处理24h，然后进行检测。每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在 450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
三、实验结果
CCK-8实验研究结果如图2所示，0.8μg/mL的C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力没有明显影响，1.6μg/mL的C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力有轻微抑制，而4.4μg/mL的C60纳米晶体几乎全部引起细胞的死亡。
实施例3 C60纳米晶体激活骨肉瘤细胞CaMKIIα(三)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin， CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2，143B及MG63首先经不同浓度的C60纳米晶体(0、0.8、1.6、2.4μg/mL)处理 12小时，或经2.4μg/mL的C60纳米晶体处理一系列不同的时间(0、0.5、3、6、12小时) 后收集细胞。
(3)细胞内CaMKIIα活性检测
143B及MG63经不同浓度的C60纳米晶体(0、0.8、1.6、2.4μg/mL)处理12h、经2.4μg/mL 的C60纳米晶体处理一系列不同的时间(0、0.5、3、6、12小时)后收集细胞，分别用CaMKII及phospho-T286CaMKII抗体检测CaMKIIα活性情况。
三、实验结果
当CaMKIIα自主活性被激活时，调节结构域与催化结构域无法重新结合，则暴露了调节结构域中位于自我抑制区的T286位点，因此此位点被磷酸化的几率增加。
分别检测了C60纳米晶体对骨肉瘤细胞143B及MG63中CaMKIIα的时间结果如图3B所示、剂量效应结果如图3A所示，结果显示，C60纳米晶体可显著提高骨肉瘤细胞CaMKIIα的T286位点的磷酸化水平，且具有时间和剂量依赖性。
实施例4 KN-93对C60纳米晶体引发的骨肉瘤CaMKIIα活性的影响(四)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于Abcam 公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology 公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞内CaMKIIα活性检测
实验组：143B及MG63经1.6μg/mL的C60纳米晶体和10μM KN-93共同处理24h后收集细胞，分别用CaMKII及phospho-T286CaMKII抗体检测CaMKIIα活性情况。
对照组：143B及MG63经1.6μg/mL的C60纳米晶体处理24h后收集细胞，分别用CaMKII、 phospho-T286CaMKII及GAPDH抗体检测CaMKIIα活性情况。
三、实验结果
图4结果显示，与C60纳米晶体单独作用相比，10μM的KN-93与C60纳米晶体共处理可显著的抑制CaMKIIα的T286位点的磷酸化水平。说明KN-93的确可以抑制C60纳米晶体对骨肉瘤细胞CaMKIIα的激活。
实施例5 KN-93增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(五)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒 (CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司；CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体 (Cat.No.ab32678)购自于Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63，SaoS2，SJSA以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素 B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞活力测定
实验组：分别用5μM的KN-93+1.6μg/mLC60纳米晶体和10μM的KN-93+1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B细胞及MG63细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
对照组：分别用5μM、10μM的KN-93单独处理143B细胞及MG63细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
(4)细胞死亡检测
实验组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞死亡检测：用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
对照组:用10μM的KN-93单独处理143B细胞，24h后收集细胞，进行细胞死亡检测：用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。 PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经 24h处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
(5)细胞凋亡检测
实验组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B以及MG63细胞，24h后收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次；然后进行凋亡蛋白检测：143B细胞株经24h后，PBS洗涤一次，收集细胞，进行westernblot实验，分别用Cleaved-PARP， cleaved-caspase3，Blc-2抗体检测细胞凋亡蛋白表达情况。
对照组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B以及MG63细胞，24h后收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次；然后进行凋亡蛋白检测：143B细胞株经24h后，PBS洗涤一次，收集细胞，进行westernblot实验，分别用Cleaved-PARP， cleaved-caspase3，Blc-2抗体检测细胞凋亡蛋白表达情况。
三、实验结果
CCK-8实验的实验结果如图5A所示，5或10μM的KN-93或1.6μg/mLC60纳米晶体单独处理骨肉瘤细胞都可轻微的抑制细胞活力，而二者共同处理则显著的增强了细胞活力的抑制。PI/Hoechst染色实验表明，10μM的KN-93可以显著的增加C60纳米晶体对143B骨肉瘤细胞的杀伤(图5B)。AnnexinV-FITC/PI染色的流式结果显示，与单药组相比，KN-93与 C60纳米晶体共处理组显著的增强了细胞凋亡水平(图5C)。Westernblotting结果显示共处理组的凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3剪切增加，抗凋亡蛋白bcl-2的表达减少，说明凋亡水平的升高(图5D)
实施例6 CaMKIIαsiRNA增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(六)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒 (CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司；CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体 (Cat.No.ab32678)购自于Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞转染
143B细胞细胞培养在6孔板中，待细胞密度为60％时，以每孔20nMCaMKIIα siRNA(sc-29900,SantaCruzBiotechnology)，通过Lipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnologies) 转入。将终浓度为20nM的CaMKIIαsiRNA及2μLLipofectamine2000分别加入150μ Lopti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟后两管混合，再放置20分钟。六孔板细胞先用 PBS洗一遍，加入700μL无血清无抗生素DMEM，再加入混合物，轻轻晃匀。6小时后更换新鲜培养基，36-48小时后进行续实验。
(4)细胞活力测定
实验组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B CaMKIIαsiRNA细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
对照组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B control siRNA细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。4)细胞死亡检测
实验组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B CaMKIIαsiRNA细胞，24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h 处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
对照组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B control siRNA细胞，24h后，用10mM PI(碧云天，ST511)及10mM Hoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS 洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h 处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
(5)细胞凋亡检测
1.6μg/mLC60纳米晶体处理143BCaMKIIαsiRNA细胞24h后，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B controlsi RNA细胞24h后，使用AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
三、实验结果
图6A结果显示，CaMKIIαsiRNA的确可以显著的减弱143B细胞CaMKIIα的表达。图6BCCK-8实验显示，与转染了control siRNA的细胞相比，转染CaMKIIαsiRNA的143B 细胞经1.6μg/mLC60纳米晶体处理后细胞活力显著下降。图6CPI/Hoechst染色实验表明， CaMKIIαsiRNA可以显著增加C60纳米晶体的细胞毒性作用。图6D AnnexinV-FITC/PI 染色的统计结果同样表明，降低了细胞中的CaMKIIα的表达，C60引发的细胞凋亡水平增加。凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3剪切也增加，抗凋亡蛋白bcl-2的表达减少(图6E)。
以上结果表明C60纳米晶体激活的CaMKIIα对于骨肉瘤细胞起到了一种促生存的保护作用从而抵抗C60纳米晶体本身对细胞的杀伤。所以抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
实施例7抑制CaMKIIα活性可通过AKT信号增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(七)
1实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin， CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
2实验方法
1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
3)细胞转染
143B细胞细胞培养在6孔板中，待细胞密度为60％时，将2μg的pcDNA3-AKT-T7 或pcDNA3-CA-AKT-T7质粒及3μLLipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnologies)分别加入 150μLopti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟后两管混合，再放置20分钟。六孔板细胞先用PBS洗一遍，加入700μL无血清无抗生素DMEM，再加入混合物，轻轻晃匀。6 小时后更换新鲜培养基，36-48小时后进行续实验。
43)AKT活性检测、细胞活力检测
实验组：143B细胞及MG63细胞经C60纳米晶体和CaMKII抑制剂KN-93共同处理24h后，分别用分别用AKT、phospho-AKT及GAPDH抗体检测AKT活性情况；
接下来我们研究了AKT信号是否在KN-93促进C60纳米晶体杀伤肿瘤的效应中起关键作用：在143B细胞中，我们外转表达了pcDNA3-AKT-T7质粒，进一步，我们又外转表达了具有组成性活性的pcDNA3-CA-AKT-T7质粒，然后用C60纳米晶体和CaMKII抑制剂 KN-93共同处理24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天， C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例
对照组：143B细胞外转表达pcDNA3对照质粒后，经C60纳米晶体和KN-93处理24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色 20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例。
3实验结果
C60纳米晶体处理骨肉瘤143B及MG63细胞可激活细胞内的CaMKIIα活性，且通过westernblotting实验我们发现AKT磷酸化水平也随之升高。KN-93与C60共处理后，AKT 的磷酸化水平得到抑制(图7A)。通过表达AKT可显著的减弱KN-93与C60纳米晶体共处理所引发的143B细胞死亡(图7B)。进一步，我们又通过表达了具有组成性活性的 pcDNA3-CA-AKT-T7质粒，CA-AKT(T308D/S473D)的过表达进一步的缓解了联药导致的细胞死亡(图7C)，这些结果说明，AKT信号在KN-93与C60纳米晶体联药所诱导的骨肉瘤细胞死亡中起到了非常重要的作用，即抑制CaMKIIα是通过抑制AKT活性来增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤。
4实验结论
以上结果表明C60纳米晶体激活的CaMKIIα对于骨肉瘤细胞起到了一种促生存的保护作用从而抵抗C60纳米晶体本身对细胞的杀伤。所以抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
实施例8 KN-93增强C60纳米晶体对骨肉瘤的杀伤的体内研究(八)
一、实验材料
雄性BALB/c裸鼠(6-8周)购自上海斯莱克动物中心，PBS，FullereneC60粉末、 KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司
二、实验方法
1、143B皮下肿瘤模型建立：
雄性BALB/c裸鼠(6-8周)，剔除腋下毛后，含有1×106的143B细胞的无菌冰PBS100μL 皮下注射进裸鼠腋下，即可制得143B皮下肿瘤模型。
2、分组
将上述制备得到的143B皮下肿瘤模型裸鼠随机分成四组，分别为PBS组、C60纳米晶体(nano-C60)组、KN-93组、nano-C60+KN-93组，每组五只。
3、给药
一周后分别对每组小鼠进行肿瘤皮下给药，Nano-C60组给药剂量为0.2mg/kg，KN-93 组给药剂量为0.5mg/kg，nano-C60+KN-93组给药剂量为0.1mg/kg的C60纳米晶体+0.4mg/kg 的KN-93，每两天给一次药。
4、检测
分别对上述每组裸鼠体重和肿瘤体积每两天检测一次。瘤体积计算公式为：(length×width2)/2，自给药开始14天后，牺牲裸鼠，剥取皮下肿瘤称重。
三、实验结果
在143B皮下肿瘤模型中，图7A为各组剥离的肿瘤，图7B为给药期间每两天测量一次的肿瘤体积，图7C为各组剥离肿瘤的重量。结果显示，与单药组相比，KN-93与C60纳米晶体联药组显著的抑制了肿瘤细胞的体积与重量。
四、实验结论
以上实验结果表明，KN-93与C60纳米晶体联合使用可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力，降低C60纳米晶体的使用剂量。
本发明的组合物C60纳米晶体与CaMKII抑制剂联合使用可以有效地杀伤骨肉瘤细胞，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力；降低C60纳米晶体的使用剂量；本发明组合物毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好，有很好的应用前景。
这些结果以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，所述CaMKII抑制剂是KN-93，所述富勒烯C60纳米晶体的粒径为100-140nm，所述富勒烯C60纳米晶体的浓度是1.6μg/ml，所述KN-93的浓度是5μM或10μM。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体为水溶性的富勒烯C60纳米晶体，形状为六棱形，可以光诱导产生氧自由基，C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，具有活跃的化学反应能力。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体的制备方法是四氢呋喃(THF)转水法，具体实验步骤如下：
(1)先将5份C60纳米粉末溶于500份未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以适当的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50份，合成富勒烯C60纳米晶体。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为：(1)增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力；(2)降低C60纳米晶体的使用剂量。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用是抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞死亡、促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞成瘤。
CN201810949725.3A 2018-08-20 2018-08-20 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用 Active CN108904532B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810949725.3A CN108904532B (zh) 2018-08-20 2018-08-20 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810949725.3A CN108904532B (zh) 2018-08-20 2018-08-20 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108904532A CN108904532A (zh) 2018-11-30
CN108904532B true CN108904532B (zh) 2021-07-27

Family

ID=64406201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810949725.3A Active CN108904532B (zh) 2018-08-20 2018-08-20 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108904532B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101695502A (zh) * 2005-09-19 2010-04-21 中国科学院高能物理研究所 镧富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用
CN105517549A (zh) * 2013-03-06 2016-04-20 阿略斯泰罗斯医疗公司 CaMKII抑制剂和其用途
CN107074856A (zh) * 2014-09-05 2017-08-18 阿略斯泰罗斯医疗公司 CaMKII抑制剂及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101695502A (zh) * 2005-09-19 2010-04-21 中国科学院高能物理研究所 镧富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用
CN105517549A (zh) * 2013-03-06 2016-04-20 阿略斯泰罗斯医疗公司 CaMKII抑制剂和其用途
CN107074856A (zh) * 2014-09-05 2017-08-18 阿略斯泰罗斯医疗公司 CaMKII抑制剂及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"C60衍生物对鼠骨肉瘤细胞生长的影响";高飚等;《华中医学杂志》;20071231;第31卷(第6期);第483-486页 *
"α-CaMKII controls the growth of human osteosarcoma by regulating cell cycle progression";Kaiyu Yuan et al.;《Laboratory Investigation》;20071231(第87期);第938-950页 *
"富勒烯纳米晶体与大脑及心脏组织CaMKII蛋白相互作用的研究";许婧;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20150615(第06期);第B020-29页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108904532A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Extracellular vesicles derived from melatonin‐preconditioned mesenchymal stem cells containing USP29 repair traumatic spinal cord injury by stabilizing NRF2
Sinha et al. Plumbagin inhibits tumorigenesis and angiogenesis of ovarian cancer cells in vivo
US9526915B2 (en) Methods for regulating cell mitosis by inhibiting serine/threonine phosphatase
Wang et al. Etoposide loaded layered double hydroxide nanoparticles reversing chemoresistance and eradicating human glioma stem cells in vitro and in vivo
US20100029683A1 (en) Methods for regulating cell mitosis by inhibiting serine/threonine phosphateses
Zhang et al. Cucurbitacin B controls M2 macrophage polarization to suppresses metastasis via targeting JAK-2/STAT3 signalling pathway in colorectal cancer
CN106456635A (zh) Mdm2抑制剂的间歇给药
Sun et al. Resveratrol suppresses the growth and metastatic potential of cervical cancer by inhibiting STAT3Tyr705 phosphorylation
WO2013026334A1 (zh) 阻止细胞dna合成、抑制细胞增殖的多肽及其用途
US9937226B2 (en) Use of immunomodulatory protein from ganoderma in inhibiting cancer stem cells
Yue et al. α-Lipoic acid targeting PDK1/NRF2 axis contributes to the apoptosis effect of lung cancer cells
CN112022837B (zh) 一种纳米递送体系及其制备方法和应用
Gao et al. Influence of chk1 and plk1 silencing on radiation-or cisplatin-induced cytotoxicity in human malignant cells
CN108904532B (zh) 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用
CN111658655A (zh) 葫芦素b在制备铁死亡诱导剂及抗鼻咽癌药物中的应用
CN115105603B (zh) MCL-1抑制剂和BCL-xL抑制剂在制备治疗实体肿瘤药物中的应用
Bai et al. Novel oxovanadium complex VO (hntdtsc)(NPIP): Anticancer activity and mechanism of action on HeLa cells
CN111686111B (zh) Malt1蛋白酶抑制剂在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用
Zhang et al. N-n-butyl haloperidol iodide ameliorates cardiomyocytes hypoxia/reoxygenation injury by extracellular calcium-dependent and-independent mechanisms
CN113082019A (zh) 一种愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用
CN112891354A (zh) MDM2抑制剂Nutlin-3a在制备激活内质网应激诱导的癌细胞凋亡药物中的应用
CN112933239A (zh) 激活肿瘤细胞内源性pd-1的试剂在制备抗肿瘤药物中的用途
CN106333951B (zh) 一种mTOR激酶抑制剂与MAPK激酶抑制剂的组合物的应用
CN112957357B (zh) 一种靶向klf4泛素化的小分子抑制剂及其应用
CN108299546B (zh) 多肽及其制备方法和应用、药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant