CN113082019A - 一种愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用 - Google Patents

一种愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种愈创木烷型倍半萜类化合物的新的生物活性——抗胰腺癌活性。生物活性实验显示，该愈创木烷型倍半萜类化合物对肿瘤细胞，特别是人胰腺癌细胞具有很好的抗胰腺癌活性，可作为活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。愈创木烷型倍半萜类天然化合物的结构如下：

Description

一种愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的 应用
技术领域
本发明涉及一种旋覆花愈创木烷型倍半萜类天然化合物的抗胰腺癌活性及在制备治疗胰腺癌药物中的应用，属于天然产物的生物医药用途领域。
背景技术
胰腺癌（PC）被称为“癌中之王”，具有很高的侵袭性和致命性，是目前已知预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势，其死亡率居恶性肿瘤的前10位，5年生存率只有10%。胰腺癌患者中大约有80%-85%的患者无法手术切除或者已经发生转移，即使可以局部手术切除的患者，预后仍然很差，通过手术得到控制的患者只有10%~15%。药物治疗是胰腺癌治疗的主要手段之一，目前临床推荐使用的FOLFIRINOX方案（奥沙利铂（Oxaliplatin）+亚叶酸钙（Folinic acid（Calcium））+ 伊利替康（Irinotecan）+ 氟尿嘧啶（Fluorouracil））或吉西他滨（Gemcitabine））+ 卡培他滨（Capecitabine）化疗组合是首选的晚期胰腺癌辅助化疗手段。但由于耐药性和缺乏药物特异性，药物总体有效率不到20%。为了延长胰腺癌患者的生存期，迫切需要开发寻找更加安全有效的胰腺癌化疗药物。
天然产物作为药物的重要来源，在新药的发现和开发中发挥着重要的作用。60%以上的抗肿瘤药物与天然产物密切相关。虽然小分子靶向药物在癌症治疗中占主导地位。但天然活性产物以其独特的作用模式和分子结构的多样性正在推动新型酪氨酸激酶抑制剂的开发。
旋覆花，为菊科植物旋覆花Inula japonica Thunb.或欧亚旋覆花Inulabritannica L.的干燥头状花序。具有降气，消痰，行水，止呕的功效。用于风寒咳嗽，痰饮蓄结，胸膈痞闷，喘咳痰多，呕吐噫气，心下痞硬。从旋覆花中提取的愈创木烷型倍半萜类化合物（其具体提取分离工艺参见文献：Yang JL, Wang R, Liu LL, Shi YP.Sesquiterpenoids from Inula britannica. Planta Med. 2011 Mar;77(4):362-7.doi: 10.1055/s-0030-1250345.），其中以化合物12和14为典型代表，其结构式如下：
Figure 11425DEST_PATH_IMAGE002
R1=H、R2=OH、R3=H2、R4=OH、R5=CH3、R6= CH3、R9= H2、R10= CH3、R11 = CH3= CH2，为化合物12。
R1=H、R2=OH、R3=H2、R4=OH、R5=CH3、R6= OAc、R9= H2、R10= CH3、R11 = CH3= CH2，为化合物14。
虽然上述文献对旋覆花愈创木烷型倍半萜类天然化合物的提取分离做了详细的研究，但其对该倍半萜活性天然产物的生物活性并没有进行研究。经我们的研究发现，旋覆花提取物具有明显的抗胰腺癌活性，本课题组对从旋覆花中提取的一类倍半萜类天然产物，进行抗胰腺癌活性研究，发现该类天然产物具有很好的抗胰腺癌细胞增殖活性，因此作为制备抑制胰腺癌药物的活性成分。
发明内容
本发明的目的是对旋覆花愈创木烷型倍半萜类天然化合物的抗胰腺癌活性进行研究，以期用于制备治疗抗胰腺癌的药物。
下面通过抑制胰腺癌细胞系的增殖实验、抑制胰腺癌细胞DNA复制实验、抑制胰腺癌细胞微管聚合实验对化合物12和14抗胰腺癌活性进行说明。
1、化合物12和14抑制胰腺癌细胞系的增殖
实验方法（CCK-8实验）：取对数生长期细胞，接种于96孔板（每孔1×104个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为1-100 µM梯度的化合物，培养72 h，然后每孔加入10 µL CCK-8溶液继续培养4小时，振荡10 min，酶标仪450 nm测定吸光度值，根据吸光值计算细胞存活率和抑制率得到化合物的IC50值。
实验结果：采用CCK-8法检测化合物对胰腺癌细胞系的增殖抑制作用，化合物12和14的浓度范围为1 µM-100 µM，作用胰腺癌细胞的时间为72 h。结果如表1所示。通过表1以化合物12和14为代表的旋覆花中愈创木烷型倍半萜天然产物对胰腺癌细胞系都有增殖抑制作用，包括PANC-1细胞、SW1990细胞、BxPC-3细胞、Capan-2细胞、CFPAC-1细胞、AsPC-1细胞。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
2、化合物12和14抑制胰腺癌细胞DNA复制
为了进一步研究化合物12和14对PANC-1细胞增殖的影响，EdU方法检测化合物12和14对PANC-1细胞DNA复制的作用。
实验方法：将细胞接种在24孔板中，用不同浓度的待测化合物处理3天后，分别加入一定比例商品化的Edu反应液，避光于常规孵箱孵育3-4小时，DAPI染核后用 PBS 冲洗3-4次后，在荧光显微镜下照相。所有的细胞核均着蓝色，具有DNA复制活性的细胞核着红色，计算细胞阳性着色率。
实验结果：用1 μM化合物12和14分别处理PANC-1细胞24小时，结果如图1。对照组中，新增殖细胞（被染成红色的细胞）较多，跟对照组比较，用化合物12和14处理过的胰腺癌PANC-1细胞DNA复制能力减弱，被染色的细胞数量较少，其中，化合物14处理的胰腺癌细胞PANC-1中细胞被染色的数量减少更明显，PANC-1细胞的DNA复制能力几乎被完全抑制。
3、化合物12和14抑制胰腺癌细胞微管聚合
以荧光色素标记蛋白质，进行特定蛋白的标记，常用于研究细胞中蛋白的表达变化以及定位。本实验的研究过程中，研究化合物12和14通过抑制胰腺癌细胞PANC-1中微管的聚合，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
实验方法：培养PANC-1细胞，取对数生长期细胞，转移至预先放置盖玻片的六孔板中，每孔细胞数量为4×104个，培养24 h，化合物12和14处理细胞，浓度为1μM，培养细胞24h。弃去培养液，无菌PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS摇床清洗3次，每次5min。然后加入0.01% Triton-X100，透膜5 min，PBS清洗3次，加入免疫荧光封闭液，室温静置封闭2h。孵育一抗，抗体混合用PBS稀释，比例为1:100。然后4℃过夜孵育。一抗孵育完后，用PBS摇床清洗3次，每次5 min。孵育二抗，比例为1:200。室温避光孵育2 h。细胞核复染，加入DAPI染液，室温避光孵育10 min，酒精梯度脱水后，抗荧光淬灭试剂封片。利用荧光显微镜再进行检测，拍照并收集照片。
实验结果：分别用1μM 的化合物12和14处理PANC-1细胞24 h，免疫荧光实验观察微管的结构变化，结果如图2所示。在对照组中，PANC-1细胞微管形态规则，分布致密，整个纺锤体完整性良好；而在化合物12或者14处理后，能够诱导不规则的纺锤体形成，微管束明显减少，刚性程度减弱，对纺锤体的形成影响明显，纺锤体的缩小和错乱显著，排列不规则和混乱。以上现象表明化合物12或14能够影响PANC-1细胞纺锤体的形成，使微管的组装受到限制，染色体不能正常分配到细胞两极，从而影响了肿瘤细胞的正常有丝分裂和增殖，达到抑制肿瘤细胞生长的效果。
实验还表明，化合物12、14的前药及药用盐对肿瘤细胞，特别是人胰腺癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人胰腺癌细胞增殖，抑制人胰腺癌细胞DNA复制能力，抑制人胰腺癌细胞中微管聚合能力，因而具有很好的抗胰腺癌活性。
综上所述，上述提取的旋覆花愈创木烷型倍半萜类化合物对肿瘤细胞，特别是人胰腺癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人胰腺癌细胞增殖，抑制人胰腺癌细胞DNA复制能力，抑制人胰腺癌细胞中微管聚合能力，因而具有很好的抗胰腺癌活性，可作为活性成分，用于制备治疗胰腺癌的药物。
附图说明
图1为化合物12和14抑制胰腺癌PANC-1细胞DNA复制作用。
图2为化合物12和14抑制胰腺癌PANC-1细胞微管聚合作用。
具体实施方式
即以化合物12和14为药物活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂（包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液）或注射剂。

Claims (6)

1.一种愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：所述愈创木烷型倍半萜类化合物的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
R1=H、R2=OH、R3=H2、R4=OH、R5=CH3、R6= CH3、R9= H2、R10= CH3、R11 = CH3= CH2，为化合物12；
R1=H、R2=OH、R3=H2、R4=OH、R5=CH3、R6= OAc、R9= H2、R10= CH3、R11 = CH3= CH2，为化合物14。
3.如权利要求1所述愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：愈创木烷型倍半萜类化合物包括其前药及药用盐。
4.如权利要求1或2所述愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：胰腺癌包括PANC-1细胞、SW1990细胞、BxPC-3细胞、Capan-2细胞、CFPAC-1细胞、AsPC-1细胞。
5.如权利要求1或2所述愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：以愈创木烷型倍半萜类化合物为活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂或注射剂。
6.如权利要求5所述愈创木烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：内服制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液。
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CN114014759A (zh) * 2021-11-12 2022-02-08 中国科学院兰州化学物理研究所 一种具有抑制胰腺癌细胞系增殖作用的三萜化合物及其制备和应用

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