CN103547268B - 实体瘤的治疗 - Google Patents

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Abstract

细胞穿透性铁螯合剂可任选地与自噬抑制剂联用以治疗人内实体瘤。优选的螯合剂是烷基取代的N‑(1‑吡啶‑2‑基‑亚甲基)‑N‑(9H‑1,3,4,9‑四氮杂‑芴‑2‑基)‑肼。优选的自噬抑制剂是氯喹。还公开了包含铁螯合剂、药学上可接受的运载体以及可任选自噬抑制剂的药物组合物；和通过给予抗癌有效量的所述铁螯合剂或铁螯合剂与自噬抑制剂的组合来治疗癌症的方法。

Description

实体瘤的治疗
技术领域
本发明涉及实体瘤的治疗，具体是癌症患者内播散性实体瘤的治疗，并且涉及所述治疗的方法。
发明背景
需要为患播散性癌症的患者开发新型且有效的抗癌药物。用于实体瘤的药物开发与归因于3－D肿瘤组织中复杂生物物理和代谢情况的特定问题相关联，所述3－D肿瘤组织可能难以在实验性体外系统中模拟。已知缺氧和营养物的有限扩散导致静息和对传统抗癌剂及放射治疗的抗性。此外，抗癌药物必需能够穿透进入肿瘤实质，以有毒浓度接触癌细胞。一些临床应用于治疗实体瘤的药物显示进入3－D肿瘤块的穿透性较差，这也许是其功效受限的原因之一(1)。多细胞球体(MCS)模拟人实体瘤优于2－D单层培养物(2-4)，而许多临床上使用的药物显示对于生长成MCS的癌细胞功效有限(5、6)。因此，MCS比单层培养物更适合筛选对实体瘤有活性的药物。
细胞死亡通常再细分为三种细胞死亡类型：凋亡(I型)、自噬性细胞死亡(II型)和坏死(III型)。凋亡由胱冬酶活化介导。自噬是一种用于长寿细胞蛋白和受损细胞器降解的进化上保守机制。自噬的主要特征是自噬体的形成。自噬体的形成需要III类磷脂酰基醇－3激酶的活化，并且还依赖两个泛素样缀合系统(Atg-Atg12和Atg8)(7)。自噬在营养缺失情况中保护细胞，而当自噬受到抑制时细胞经历凋亡(8-10)。在胱冬酶抑制状况下的细胞死亡过程中也观察到自噬的形态学特征(11)。
发明内容
本发明公开了细胞穿透性铁螯合剂可任选地联合自噬抑制剂用于治疗人内实体癌症肿瘤。
本发明公开了N－(1-吡啶－2－基－亚甲基)－N－(9H－1，3，4，9－四氮杂－芴－2－基)－肼(通式I)或其药学上可接受的盐在治疗癌症患者内的实体瘤中的应用，其中，R是H或甲基，R1是H或C1－C4烷基，R2是H或C1－C4烷基。
在该申请中，通式I的化合物意在包括其任何药学上合适的盐或复合物或前药。
特别优选R为甲基。优选R、R1都是甲基。
优选R1是甲基，特别是6－甲基或8－甲基。
在本发明的优选化合物中，N－(1-吡啶－2－基－亚甲基)－N－(9H－1，3，4，9－四氮杂－芴－2－基)－肼被如下取代：
根据本发明的优选方面，R1为C1－C4烷基的通式I化合物可在未经R1取代的所述四氮杂芴基部分的位置6、7或8之一另被C1－C4烷基取代。本发明的优选方面公开了含有本发明化合物和药物运载体的药物组合物。本发明的药物组合物可通过任何合适的途径(例如经口或胃肠外)给予。合适的运载体包含二甲亚砜和水性介质，例如包含二甲亚砜和水的混合物。优选的流体运载体是能够溶解本发明化合物的那些。其它优选的流体运载体尤其是水性运载体，是包含良好分散形式(例如尺寸为10μm或更小的微粒形式)的本发明化合物的那些。
本发明的另一个优选方面公开了一种治疗人内实体癌的方法，所述方法包括给予此人药理学上有效剂量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。所述药理学上有效剂量优选由本发明药物组合物包含着给予。
本发明的化合物是细胞穿透性铁螯合剂。尽管不希望受理论约束，本发明人相信本发明化合物的抗癌作用是基于其铁螯合性质。
根据本发明的特定优选方面，铁螯合剂(例如本发明化合物)的抗肿瘤功效由自噬抑制剂增强。优选的自噬抑制剂是氯喹。就该方面而言，公开了自噬抑制剂和细胞穿透性铁螯合剂联合治疗实体瘤的应用。所述“联合”应理解为以紧密时间关系例如在同一时间或在至多一天和甚至一周的期间内给予所述自噬抑制剂和所述细胞穿透性铁螯合剂。所述自噬抑制剂和所述细胞穿透性铁螯合剂可以包含其的药物组合物形式或以分开的药物组合物形式给予。若以药物组合物形式给予，所述组合包含药学上可接受的运载体。
在用于治疗受癌症影响的人内实体瘤的所述自噬抑制剂和所述细胞穿透性铁螯合剂组合中，所述细胞穿透性铁螯合剂优选选自通式I的N－(1-吡啶－2－基－亚甲基)－N－(9H－1，3，4，9－四氮杂－芴－2－基)－肼或其药学上可接受的盐，其中R是H或甲基，且R1是H或C1－C4烷基。特别优选R为甲基。优选R、R1都是甲基。特别优选R1是6－甲基或8－甲基。
用于所述组合的本发明优选铁螯合化合物包含通式I的N－(1-吡啶－2－基－亚甲基)－N－(9H－1，3，4，9－四氮杂－芴－2－基)－肼，其中
与本发明所述自噬抑制剂联用的其它铁螯合化合物包括去铁胺、去铁酮和地拉罗司(deferasirox)。
在所述自噬抑制剂和所述细胞穿透性铁螯合剂的组合中，优选所述自噬抑制剂选自氯喹。其它优选的自噬抑制剂包括羟氯喹、3－甲基腺嘌呤、腺苷、巴佛洛霉素A1、5－氨基－4－咪唑甲酰胺核苷、渥曼青霉素和长春碱。
用于本发明应用的其它自噬抑制剂是WO2011/011522A2中公开的具有通式II的那些，所述专利通过引用纳入本文。
本发明还公开了一种治疗受癌症影响的人内实体瘤的方法，所述方法包括以紧密时间关系如在同一时间或在一天或一周内给予此人药理学上有效剂量的自噬抑制剂和本发明细胞穿透性铁螯合剂组合。可通过任何合适途径给予，例如胃肠外或经口地，以分开的药物组合形式，一种药物组合包含所述自噬抑制剂和药学上可接受的运载体(例如，二甲亚砜)，或者在同时给予时采用单一药物组合形式，所述药物组合包含药学上可接受的运载体(例如，二甲亚砜)。
本发明的另一个优选方面公开了一种治疗人内实体癌的方法，所述方法包括同时或以紧密时间关系(例如一小时或一天或一周内)联合给予此人药理学上有效剂量的自噬抑制剂和细胞穿透性铁螯合剂。优选以上述一种或多种药物组合物形式且通过胃肠外或经口或其它合适的途径给予。
接下来通过引用多种优选实施方式更详细描述本发明，所述实施方式由含有多个图像的图说明。
附图简要说明
图1描述CB21对FaDu头颈癌异种移植物的体内活性。采用mg/kg的CB21处理荷载FaDu肿瘤的SCID小鼠并计算肿瘤体积。
图2a－2h描述N－(1-吡啶－2－基－亚甲基)－N－(9H－1，3，4，9－四氮杂－8－甲基－芴－2－基)－肼(下文中称作“CB21”)对HCT116MCS的细胞毒性和该细胞毒性效应的治疗窗口。图2a：采用CB21处理的MCS的形态学和胱冬酶－3诱导。采用6μM CB21处理HCT116MCS6小时，然后换为无药物培养基并进一步孵育。对MCS切片并针对胱冬酶－3染色。图2b：采用所示化合物处理的细胞的成克隆结果。图2c：单层HCT116细胞在CB21存在或缺失下的增殖。细胞以7,000个细胞/孔在96孔板内接种，并用3、6和12.5μM CB21处理。图2d：在6μM CB21EdU添加后24小时EdU(5－乙炔基－2′－脱氧尿苷)向单层HCT116细胞中的掺入。细胞用EdU孵育30分钟，固定并通过ArrayScan分析。
图2e：该实验中EdU信号的定量示于图2d。图2f：单层hTERTRPE1细胞在CB21存在或缺失下的增殖。细胞以7,000个细胞/孔在96孔板内接种，并用3、6和12.5μMCB21处理。图2g：CB21并不影响融合hTERTRPE1细胞的活力。细胞以7,000或70,000个/孔在CB21存在或缺失下接种于96孔板内。图2h：HCT116和hTERTRPE1细胞在暴露至6μM CB21之后的形态学。
图3a－3e描述CB21是有力的铁螯合剂。图3a：根据联系图(Camp)数据库所得的分数。图3b和3b’：在氯化铁存在或缺失下采用6μM CB21处理的细胞的活力。图3b：HCT116细胞；图3b’：HCT116p53－/－细胞。图3c：采用不同铁螯合剂处理的HCT116细胞的活力。
图3d：采用CB21相关结构的7种化合物处理的HCT116细胞的活力。图3e：CB21在一系列相关化合物中对减少MCS活力最为有效。
图4a－4f描述通过CB21和其它铁螯合剂的自噬诱导。
图4a：暴露于6μM CB216小时并在无药物培养基中再暴露42小时或90小时的单层HCT116细胞的形态学。
图4b：用针对LC3的抗体对经CB21处理的细胞染色。图4c：CB21对单层和MCSHCT116中LC3－I和LC3－II蛋白的诱导。处理细胞6小时(6μM)，然后进一步孵育。提取蛋白质并用Western印迹分析。
图4d：CB21对单层和MCS hTERTRPE1细胞中LC3－I和LC3－II蛋白的诱导。图4e：不同铁螯合剂对LC3-1和LC3－II的诱导。
细胞用VLX50(50μM)；地拉罗司(60μM)、去铁胺(200μM)、环吡酮胺(15μM)、CB21(5μM)、雷帕霉素(0.1μM)、NVP-BEZ235(0.2μM)处理。图4f：通过电子显微镜观察外周和中心细胞的形态学。MCS采用6μM C21处理6小时，并在无药物培养基中进一步孵育所示时间，然后切片。在CB21处理24小时时观察到出现线粒体肿胀。
图5a－5f描述抑制CB21诱导的自噬增加CB21细胞毒性。
图5a：HCT116单层细胞采用6μM CB21和/或10μM3－MA处理，并在48小时后测定细胞活力。
图5b：HCT116单层细胞使用针对Beclin/Atg6的siRNA或对照siRNA转染。24小时后，细胞采用所示6μM CB21处理。
图5c：巴佛洛霉素A(10μM)抑制经CB21处理的细胞中LC3阳性囊泡的形成。在所示时间药物处理后对细胞进行固定和就LC3染色。
图5d：巴佛洛霉素A增加CB21的细胞毒性。细胞采用6μM CB21和/或10μM巴佛洛霉素A处理，并在所示时间对细胞拍照。
图5e：氯喹增加CB21在单层培养物中的细胞毒性。HCT116细胞采用6μMCB21和/或10μM氯喹处理。通过计算培养物融合来监控细胞增殖。
图5f：氯喹增加CB21在MCS培养物中的细胞毒性。使用酸性磷酸酶测试测定细胞活力。注意到，在不含活细胞的HCT116MCS培养物中观察到背景水平的酸性磷酸酶活性(通常约30％)，这可能归因于酶捕获(enzyme trapping)。
图6a－6e描述Cb21诱导p53和缺氧应答。
图6a：通过Affymetrix微阵列分析由CB21诱导的基因表达概况，并且显示与缺氧、p53网络和有丝分裂相关的基因表现。
图6b：通过western印迹分析p53和HIF－1a。HCT116细胞采用6μM CB21处理所示时间。
图6c：CB21对HIF－1a－启动子驱动GFP报告子的诱导。图6d：CB21对HCT116和hTERT-RPE1细胞中BNIP3的诱导。图6e：敲减BNIP3并不影响CB21诱导的细胞死亡。HCT116细胞采用针对BNIP3的siRNA或对照siRNA转染，并在24小时后用6.25μM CB21处理。48小时后使用酸性磷酸酶检测测定活力。
图7a－7d描述CB21减少呼吸作用并抑制mTOR。
图7a：对葡萄糖转运的影响。
图7b：CB21减少氧消耗。
图7c：CB21减少HCT116MCS中的缺氧。按指示处理HCT116MCS并处理以供哌莫硝唑免疫组化。注意到，CB21减少哌莫硝唑加合物的阳性染色区域(＜1Omm Hg 02)。
图7d：CB21抑制4EBP1的磷酸化。HCT116细胞采用CB21处理所示时间，处理蛋白质提取物以供western印迹。应观察到4EBP1磷酸化的减少和AKT磷酸化的诱导。
图8a－8c描述CB21细胞毒性通过葡萄糖饥饿而增强。
图8a：在葡萄糖存在或缺失下孵育24小时后的HCT116MCS的形态学。
图8b：HCT116单层细胞采用含葡萄糖或无葡萄糖的培养基中不同浓度的CB21处理。使用M30CytoDeath ELISA测定经胱冬酶切割K18的水平。
图8c：如图8b处理HCT116单层细胞。使用酸性磷酸酶检测测定活力。
具体实施方式
材料和方法
本发明的化合物获自化合物文库。其可按照文献(例如WO02/089809)所述方法，或通过其非发明性修改来制备。使所述化合物溶解于DMSO。细胞培养物中达到0.5％DMSO的终浓度。
细胞培养、MCS生成和筛选。HCT116结肠癌细胞维持于37℃5％CO2下的McCoy′ s5A改良培养基/10％胎牛血清。使用我们先前所述方法(12)的改进形式制备MCS。向聚－HEMA包被的96孔板的各孔添加含10,000个细胞(200μl)的细胞悬液。然后通过另添加170μl培养基过量装灌所述孔以获得凸表面弯曲。在各板的角上置放塑料土隔片(3mm)以防止液体接触培养基。然后，倒置所述板以使细胞沉积在液/气界面，并温和振荡孵育。孵育24小时后，使所述板归为正常。首先通过抽吸移出过量培养基，然后移出塑料土隔片。所述板在药物处理前孵育4天。药物处理24小时后，向所述培养基添加NP40至0.1％的浓度以从MCS提取经胱冬酶切割的K18并包括从死亡细胞释放到培养基的物质。采用25mL培养基/提取物，使用M30CytoDeath ELISA检测( ELISA(13)的变体，经开发以供体外应用(瑞典布罗马的Peviva公司(Peviva AB))测定经胱冬酶切割的角蛋白－18(K18－Asp396)。
通过由Friedrich等所述的酸性磷酸酶(APH)法(14)进行活力检测。减去背景活性。hTERT-RPE1细胞获自加利福尼亚州山景城的克隆泰克实验室公司(ClontechLaboratories)。
hTERT-RPE1是永生化的人视网膜上皮细胞系，该细胞系稳定表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)。
DNA合成评价使用荧光显微镜ArrayScan V HCS系统(美国宾夕法尼亚州匹兹堡的赛默飞世尔公司(Cellomics Inc.))测定EdU掺入。在添加测试化合物之前，将HCT116细胞接种于96－孔板中(美国麻萨诸塞州韦尔斯利的珀金埃尔默公司(PerkinElmer Inc.))并放置以贴壁过夜。细胞采用CB21或采用载剂对照处理24小时。细胞使用Click－iT EdU HCS检测(C10354，美国俄勒冈州的英杰分子探针公司(Invitrogen，Molecular Probes Inc))根据生产商的说明染色。将经处理的板置放于ArrayScan内并分析。使用合适的滤镜以10×物镜获得各荧光通道的图像，并分析各孔中至少1000个细胞。测量BdU通道中的平均总强度。结果以各采用双重孔进行的两个独立实验的平均值显示，并显示为平均值±标准偏差(SD)。
免疫学实验.通过悬滴法在96孔板中生成的MCS于多聚甲醛内固定，脱水，石蜡包埋并切片。各样品包含32个MCS(使来自各96孔板的MCS聚为3组)。所述切片经二甲苯脱石蜡，再水化并微波处理，然后用稀释于1％(重量/体积)牛血清白蛋白的单克隆一抗孵育过夜，然后通过标准抗生物素蛋白－生物素－过氧化酶复合物技术(美国加利福尼亚州柏林格姆的载体实验室公司(Vector Laboratories))观察。采用Mayer’s苏木素进行复染。抗体MIB－1(针对核增殖相关抗原Ki67)获自法国马赛的免疫泰克股份公司(Immunotech SA)，并以1∶150稀释使用；针对活性胱冬酶－3的抗体获自法敏进公司(Pharmingen)并以1∶50稀释使用。
Western印迹.细胞提取蛋白质通过Tris－乙酸PAGE胶(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))分离，并转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。所述膜用抗体孵育过夜，冲洗并用HRP偶联的抗兔Ig(英国小查尔的安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences))孵育1小时。
通过SuperSignal West Pico(伊利诺斯州洛克福特的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology))按照生产商说明对过氧化物酶活性显像。
联系图.所述联系图(CMAP)(www.broad.mit.edu/cmap)构造02包含1300种化合物的全基因组表达数据(6100种实例，包括复制、不同剂量和细胞系)。遵照使用如Lamb等所述MCF－7乳腺癌细胞的原始方案(15)。细胞以0.4×106个细胞/孔的密度接种入6孔板，然后放置以贴壁24小时，随后暴露于终浓度为10μM的NSC76022、NSC620358或NSC647889，或暴露于载剂对照(DMSO)。处理6小时后，使用PBS冲洗所述细胞。总RNA使用RNeasy迷你制备试剂盒(加州查特沃斯的凯杰公司(Qiagen))制备。由2微克总RNA开始，使用基因组U133Plus2.0阵列，根据基因芯片表达分析技术手册(GeneChip Expression Analysis TechnicalManual)(第5修订版，加利福尼亚州圣克拉拉市的昂飞公司(Affymetrix Inc.))进行基因表达分析。原始数据使用MAS5(昂飞公司(Affymetrix))标准化，然后计算经药物处理细胞相比载剂对照细胞的基因表达比率以生成受调节基因的列表。过滤标准为经处理细胞系中全部基因的存在判定和至少100个任意表达单元的表达截止值。出于CMAP相容性原因，仅使用在HG U133A上存在的探针。为了重新得到化合物排序表，将对于各化合物而言上调和下调最多的40个基因(例如，探针)上载入CMAP并与该CMAP数据库中的6100种实例作比较。
氧消耗.如(16)描述进行呼吸作用的检测。琥珀酸盐(5mM)在鱼藤酮(2mM)、苹果酸盐+丙酮酸盐(各5mM)和TMPD(0.5mM)+抗坏血酸盐(1mM)存在下用作线粒体底物。采用氧电极监测氧浓度变化(英国诺福克郡的汉莎科学仪器公司(Hansatech Instruments))并采用OxygraphPlus软件(英国诺福克郡的汉莎科学仪器公司(Hansatech Instruments))分析。在1M苍术苷存在下评估细胞中的基础V4呼吸，所述苍术苷阻断ADP进入线粒体。
小鼠异种移植物的处理.当SCID小鼠中的HCT116肿瘤生长至200mm3的尺寸时，对所述小鼠i.p.注射药物，并每天测量肿瘤尺寸。
实施例1.本发明化合物诱导凋亡并降低MCS活力。
用CB21处理MCS6小时，然后在无药物培养基中孵育96小时引起具有坏死中心区域的较小尺寸MCS(图2a)。胱冬酶－3诱导相较于NSC647889是适中的。重要的是，采用CB21处理MCS6小时使成克隆性降低至＜5％(图2b)。所述成克隆性的降低比顺铂、伊立替康和阿霉素观察到的更强(尽管使用5-10μM的浓度；＞10倍于单层培养物中这些化合物的IC50)。使用CB21处理单层HCT116细胞导致0-24小时间的细胞数量略微升高，随后细胞减损(图2c)。检测经CB21处理细胞中的5－乙炔基－2′－脱氧尿苷掺入(FdU)显示DNA合成在24小时儿乎完全终止(图2d、2e)。CB21对p53肿瘤抑制基因已被破坏的细胞和表达野生型p53的细胞同等有效(图2b)。永生化人上皮细胞(hTERT-RPE1细胞)的反应与HCT116细胞不同。这些细胞的生长停滞，但细胞数量没有减少(图2f)。当hTERT-RPE1细胞以高密度(70,000个细胞/孔)接种时，在采用CB21处理后基本没有观察到细胞减损(图2g)。HCT116和hTERT-RPE1细胞间响应CB21的所述差异示于图2h。
实施例2.本发明的化合物是细胞穿透性铁螯合剂。
为形成关于CB21作用机制的假设，使用联系图(CMap)(15)，所述联系图是来自经药物处理细胞系的基因表达签名概况。由CB21引起的基因表达变化与具有铁螯合能力的抗真菌剂环吡酮胺(CPX)(17)最为类似(图3a)。为了测试CB21的细胞毒性是否依赖于铁消耗，在添加CB21之前向HCT116细胞添加氯化铁。发现氯化铁完全终止了CB21对表达野生型p53的HCT116细胞和p53基因受破坏的HCT116细胞的
影响(图3b)。
将CB21的抗增殖活性与其它已知的铁螯合剂作比较。发现CB21比VLX50、地拉罗司、环吡酮胺、去铁胺更有效(图3c)。通过使用多种结构相关的化合物检测结构活性关系(图3d、3e)。这些研究显示，CB21对于单层和MCS培养物而言都是最有效化合物。
实施例3.本发明化合物诱导普遍自噬反应。
铁螯合剂的抗肿瘤形成活性通常归因于对核糖核苷酸还原酶的抑制，导致对细胞增殖的抑制(18)。MCS主要包含非增殖性细胞。因此，不预期发现所述铁螯合剂CB21诱对于MCS的细胞毒性诱导作用。更详细地研究了所述作用的机制。经CB21处理细胞的目测检查显示细胞包含许多大的细胞质泡囊(图4a)。这些泡囊用针对微管相关蛋白1轻链3(LC3)的抗体染色为阳性，说明其与自噬相关联。在24小时观察到LC3染色，且在42小时更强(图4b)。Western印迹分析显示采用CB21处理HCT116单层细胞诱导LC3－I和LC3－II水平的大幅增加(图4c)。LC3－II(LC3的PE偶联形式的)是被视为与自噬体最可靠相关联的蛋白质标志物(19)。HCT116MCS中的LC3－II水平也由CB21大幅诱导(图4c)。CB21还诱导hTERT-RPE1细胞中的LC3－II，但该诱导水平相较于HCT116细胞要弱很多(图4d)。该结果显示这两种细胞类型中，经CB21诱导的自噬程度与所述化合物的细胞毒性效应相关联。
HCT116细胞采用细胞毒性浓度的不同铁螯合剂处理24小时。在全部实例中观察到LC3－I和LC3－II的诱导，显示LC3诱导是铁螯合剂的普遍效应(图4e)。通过铁螯合剂的LC3－I和－II诱导相较于采用雷帕霉素或NVP-BEZ235处理后观察到的诱导(在24小时没有观察到诱导，在6小时观察到弱诱导)更加强烈。
为了测试CB21是否能够诱导所述MCS内核细胞中的细胞变化，HCT116MCS用CB21处理6小时，冲洗并孵育不同的时间段，固定，切片，然后用电子显微镜检测。在处理后24小时开始于细胞内观察到大泡囊(图4f)。值得注意的是，经CB21处理的MCS的共有特征是早期出现扩大和肿胀的线粒体(图4f)。最重要的是，大量空泡以时间依赖性方式出现，不仅出现在MCS外周的细胞内，还出现在MCS的中心内(图4f)。结论是，CB21诱导MCS中心核的细胞内形成泡囊(曾经发现是抗凋亡的)，而该反应与这些细胞的活力减损相关。
实施例4.通过本发明化合物阻遏自噬或自噬体－溶酶体融合会增进细胞死亡
自噬通常视作对应激状态的生存反应，但也可以是程序性细胞死亡的机制(20、21)。为了检测不同自噬抑制剂对经CB21诱导的细胞死亡的作用，CB21的细胞毒性作用由通常用作自噬抑制剂的PI3K抑制剂3－MA增强(图5a)。然后使用siRNA进行Beclin/Atg6的敲减。这导致该蛋白质表达的儿乎完全敲减。Beclin/Atg6敲减使HCT116细胞的活力减少约50％；CB21毒性进一步使活力减少(图5b)。检测防止自噬体和溶酶体融合的抗生素巴佛洛霉素A的作用，证明巴佛洛霉素A抑制HCT116细胞内出现大细胞质LC3－II阳性泡囊(图5c)。尽管巴佛洛霉素A在约72小时诱导细胞毒性，但在更早(约48小时)就观察到了巴佛洛霉素A和CB21的联合细胞毒性(图5d)。这些结果显示，自噬的抑制加强本发明化合物的细胞毒性作用，并且在经CB21处理的细胞中观察到通过自噬体和溶酶体融合引起的大泡囊。
氯喹(CQ)是广泛用于抑制自噬体熟化成降解性自噬溶酶体的向溶酶体剂(22)。CQ自身对HCT116细胞的增殖并无影响。CQ和CB21的组合大幅增强单层HCT116细胞的细胞死亡(图5e)。检测CQ和CB21的组合对MCS的细胞毒性显示与CQ或CB21对MCS的影响相比效应增强(图5f)。
实施例5.LC3诱导不受BNIP3调节
CB21不仅诱导多种缺氧响应性基因，还诱导多种已知受p53调节的基因(图6a)。通过Western印迹证实HIF－1a和p53蛋白水平的诱导(图6b)。使用报告细胞系(其中GFP由HIF－1a启动子调节)也观察到大量诱导(图6c)。
注意到，在不同基因中被CB21强力诱导的是编码仅含BH3区域蛋白BNIP3的基因。BNIP3是HIF－1a的已知靶标(23)。据报道，BNIP3表达诱导大量细胞质空泡形成和自噬(24)。发现CB21诱导HCT116细胞内BNIP3蛋白的表达(图6d)。然而，CB21还强烈诱导hTERT-RPE1细胞中的BNIP3表达(图6d)。该发现与BNIP3是CB21诱导自噬的假设机制不一致。使用siRNA的BNIP3敲减并不减少LC3－II的诱导和CB21所致的细胞死亡(图6e)。
实施例6.本发明化合物抑制氧消耗且减少mTOR活性。
上述结果说明，诱导自噬以尝试解救细胞不受CB21诱导的毒性损伤。由于参与细胞能量代谢的多种关键蛋白质包含Fe-S复合物(25)，本发明人假设通过CB21铁螯合可能导致会触发自噬的细胞代谢紊乱。为了评估该假设，检测CB21对细胞内ATP水平的影响。然而，既未能在诱导自噬的浓度下观察到细胞内ATP水平减少，又未能检测到AMPK(AMP活化蛋白激酶)磷酸化的诱导(未显示)。接着，使用荧光d－葡萄糖类似物2－[N－(7－硝基苯－2－氧杂－1，3－二唑－4－基)－氨基]－2－脱氧－d－葡萄糖(2－NBDG)通过流式细胞术跟踪葡萄糖转运的可能假象。如图7a所示，在经CB21处理的细胞中观察到2－NBDG摄取增加约25％。
检测CB21对细胞氧消耗的影响显示，CB21处理6小时后，HCT116单层培养物中的V3(状态3)和Vu(解偶联的)呼吸作用显著减少(p＜0.05)(图7b)。为了检测MCS中肿瘤细胞的呼吸作用是否受CB21影响，使用间接方案。已知线粒体呼吸抑制导致组织氧张力增加，这可由哌莫硝唑染色减少而呈现(26)。事实上，发现经切片MCS的哌莫硝唑阳性染色面积是经CB21处理MCS中对照的约50％(图6C；表格)。该效应在药物暴露3小时后观察到，并持续至24小时(图7c)。作为对照，HCT116单层培养物用已知增加氧消耗的线粒体解偶联剂羰基氰酯－3－氯苯基腙(CCCP)处理。如所预料，经CCCP处理的MCS显示较大面积的哌莫硝唑染色(图7c；表格)。
表.球状体的哌莫硝唑染色定量
雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标是调节细胞响应营养物状况生长的丝氨酸/苏氨酸激酶。已明确，代谢应激影响mTOR通路的活性(27)。该mTOR通路调节线粒体氧消耗和氧化能力(28，29)。为了测定在CB21处理后观察到的氧消耗减少是否与mTOR抑制相关联，检测mTOR底物4EBP1的磷酸化。如图7D所示，4EBP1磷酸化被CB21抑制。该磷酸化的减少与AKT－磷酸化增加相关联。已知mTORC1的抑制会释放负反馈回路，引起强Akt活化(30)。为测试mTOR抑制是否会减少氧消耗，HCT116MCS用雷帕霉素(mTOR-raptor复合物形成的特异性药理学抑制剂)处理，并用哌莫硝唑对切片染色。观察到哌莫硝唑染色减少，尽管强度不如CB21(图7c，表1)。
这些结果提示检测直接抑制mTOR是否引起与CB21所致类似的作用。对于这些实验，使用临床试验中的化合物即双重PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235。重要的是，发现NVP-BEZ235减少单层或MCS条件下生长的HCT116细胞中的4EBP1磷酸化(图7d)。与CB21相反，NBPBEZ235不影响所述MCS核心中的细胞活力。
实施例7.葡萄糖饥饿会增强由本发明化合物诱导的细胞死亡
肿瘤细胞中大约50％的细胞ATP生成是通过氧化磷酸化(31)。据报道，肿瘤MCS内部区域中的氧消耗减少，这可能是因为增殖活性减少(32，33)。其它研究发现，MCS的活性区域中的氧消耗更为统一(34)；据报道，在MCS培养中，处于相同转化阶段的成纤维细胞克隆可能具有相当不同的代谢活力(33)。甚至在所述中心核细胞内的低细胞氧消耗事件中，预期由CB21诱导的进一步减少导致葡萄糖依赖性增加。尽管单层细胞会通过增加摄取来补偿增加的葡萄糖依赖性(如图8所示)，MCS中的葡萄糖仍会形成限制。如图8a所示，HCT116MCS核细胞的生存依赖葡萄糖：葡萄糖的消耗导致中心区域坏死，该效应令人联想到CB21的作用(图2)。基于这些考虑，测试葡萄糖饥饿是否增加HCT116单层细胞对CB21的敏感性。事实如下：葡萄糖饥饿减少了细胞活力且增加CB21所致的凋亡。这些结果可能至少部分解释了中心核细胞对CB21的敏感性。
实施例8.本发明化合物的抗肿瘤活性
在HCT116模型中检测CB21的体内抗肿瘤活性。使肿瘤生长到约0.2mL的尺寸，然后用CB21处理。观察到化合物CB21的明显抗肿瘤效应(图1)。
开发显示抗肿瘤活性的多种铁螯合剂，包括Triapine(35)、Tachpyr(36)和Trensox(37)。铁对于许多代谢反应是重要的，所述代谢反应包括通过核糖核苷酸还原酶从核糖核苷酸形成脱氧核糖核苷酸(38)。在Fe缺失下，细胞无法由细胞周期的G1期进行至S期，解释了所观察到的CB21对HCT116和hTERT-RPE1的抗增殖作用。由于铁螯合剂被主要视作对增殖细胞特异，因此不预期在筛选针对MCS显示细胞毒性的试剂中鉴别铁螯合剂。进一步研究显示CB21对MCS核心中非增殖性细胞的可能作用机制。此外，发现CB21减少HCT116和hTERT-RPE1细胞的氧消耗，如通过直接测量和通过使用MCS哌莫硝唑染色所见。已知线粒体氧消耗和氧化能力由mTOR通路调节(28，29)。还报道了铁螯合剂地拉罗司抑制mTOR信号转导(39)。确实发现CB21抑制4EBP1的磷酸化，并导致上调的AKT磷酸化。地拉罗司对mTOR信号转导的抑制已被归因为由缺氧诱导的基因REDD1(也被称为RTP801)诱导，这进而活化TSC2蛋白(40)。可以想象，CB21对氧消耗的影响至少部分由该机制介导。另一个可能是：由铁缺乏诱导的代谢应激通过一些其它机制影响mTOR通路的活性。
CB21与其它铁螯合剂(41)共有的另一个作用是诱导LC3阳性细胞质泡囊和LC3－II蛋白。发现hTERT-RPE1细胞中的LC3诱导显著少很多。由铁螯合剂所致的LC3－II诱导显著强于使用mTOR抑制剂所观察到的，说明LC3－II诱导并非仅由mTOR抑制介导。发现PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235没有诱导对HCT116核心中细胞的可检测细胞毒性效应(Hernlund等，未公开)，再次说明mTOR抑制并非是引起由CB21所致自噬诱导和细胞死亡的唯一因素。
经CB21处理后观察到的氧消耗减少应导致增加的葡萄糖依赖性以供ATP生成，这与关于雷帕霉素的报道相似(42)。该提议似乎通过观察到MCS核心中存在的细胞群显示组成型ER应激(Grp78阳性)的迹象而得到证实，所述状况可能由缺氧和有限葡萄糖供给诱导。MCS的葡萄糖饥饿诱导核心细胞的细胞死亡，这与该细胞群依赖葡萄糖生存的概念一致。在采用CB21处理后观察到的葡萄糖依赖性增加很可能引起核心细胞群的细胞死亡。如相较于外周细胞内胱冬酶－3强诱导(未显示)的胱冬酶－3弱诱导所证明，凋亡似乎并不是由CB21所致细胞死亡的主要机制。细胞能量状态的较差状况可导致对凋亡的抵抗(也解释核心细胞对经NSC647889诱导凋亡的抗性)(未显示)。似乎CB21诱导HCT116细胞的葡萄糖依赖性增加，而这导致MCS核心中缺氧细胞的活力减少。
自噬是对代谢应激的分解代谢降解反应，其通过降解蛋白质和细胞器来努力维持稳定状态。PI3K-Akt-mTOR、LKB1-AMPK-mTOR和p53是所述自噬通路的主要调节剂。认为自噬参与介导癌细胞对抗癌治疗的抗性，从而被视作抗癌药物抗性中具吸引力的治疗靶标(20，43)。CB21诱导显著的自噬反应，特征为强LC3－I和－II诱导。本发明揭示抑制自噬以加强CB21的细胞毒性。
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Claims (8)

1.细胞穿透性铁螯合剂在制备治疗人内实体癌肿瘤的药物中的应用，其中，所述细胞穿透性铁螯合剂是通式I的N-(1-吡啶-2-基-亚甲基)-N-(9H-1,3,4,9-四氮杂-芴-2-基)-肼或其药学上可接受的盐，其中，R是甲基，R1是C1-C4烷基，R2是H
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R1是甲基。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，R1是6-甲基或8-甲基。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，R是甲基，R1是8-甲基，且R2是H。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述实体癌是结肠癌。
6.药理学上抗癌有效剂量的药物组合物在制备治疗人内实体癌肿瘤的药物中的应用，其中，所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所提及的细胞穿透性铁螯合剂和药学上可接受的运载体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1-5中任一项所提及的细胞穿透性铁螯合剂和药学上可接受的运载体组成。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述实体癌是结肠癌。
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