KR102142164B1 - 퀴논 화합물 및 암의 치료를 위한 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

퀴논 화합물 및 암의 치료를 위한 그것의 용도.
본원은 항암 활성과 같은 유용한 치료 활성을 가진 퀴논 화합물 및 그러한 화합물을 포함하는 조성물을 개시한다. 또한 이러한 화합물 및 조성물의 함 치료를 위한 용도를 개시한다.

Description

퀴논 화합물 및 암의 치료를 위한 그것의 용도{Quinone Compounds and Their Uses for the Treatment of Cancer}
본 출원은 2012년 7월 30일자 출원된 영국 특허 출원 GB1213486.2와 관련된 것이며, 그 내용 전체를 본 출원에 참고로 인용한다.
본 발명은 퀴논 화합물 및 특히 암의 치료를 위한 그것의 의학적 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 DT-디아포라제를 발현하는 암 세포에서 활성화 가능한 전구 약물인 2,5-디아지리디닐벤조퀴논 화합물에 관한 것이다.
DT-디아포라제(DTD)는 유방, 결장, 간, 방광, 위, 중추 신경계(CNS) 및 폐 종양 및 흑색종을 비롯한 많은 유형의 암성 조직에서 과발현되는 효소이다. 각종 퀴논 전구 약물은 DTD를 발현하는 암 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 연구되어 왔다. 예로서, DTD의 발현은 정상 폐에 비해 원발성 비-소세포 폐암(NSCLC)에서 80배까지, 소세포 폐암(SCLC) 세포주에 비해 NSCLC에서 400배까지 증가된다. DTD는 퀴논계 전구 약물을 활성화하는 것으로도 공지되어 있고, 이것은 DTD를 발현하는 암 세포를 선택적으로 표적화하는 시도로서 제안된 바 있다. 그러나, 퀴논계 전구 약물을 설계하여 이 생물학을 시험 및 활용하고자 하였으나, 그들은 현재까지 하나 이상의 단점을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
예로서, 높은 DTD 활성을 갖는 비-소세포 폐암 이종 이식편은 퀴논 전구 약물 미토마이신 C에 민감한 것으로 밝혀졌다. 그러나 미토마이신 C가 비-소세포 폐암의 치료에 활성을 가지는 것으로 나타났지만, DTD에 대해서는 상대적으로 불량한 기질이며(Beall et al., Cancer Research, 54: 3196-3201, 1994), DTD에 의한 미토마이신 C의 대사는 높은 pH에서 DTD의 pH-의존성 억제를 유도하는 pH-의존성이다(Siegel et al.,mol. Pharmacol., 44: 1128-1134, 1993).
아파지퀴논 또는 (E)-5-(1-아지리닐)-3-(히드록시메틸)-2-(3-히드록시-1-프로페닐)-l-메틸-lH-인돌-4,7-디온은 DTD에 의한 활성 대사물로의 환원성 변환에도 민감한 미토마이신 C와 관련이 있는 인돌퀴논이다. 이것은 표재성 방광암 치료를 위한 임상 시험의 주제였다. 그러나, 아파지퀴논이 DTD에 의해 효율적으로 환원되기는 하지만, DNA 가교보다는 주로 활성 산소 라디칼을 생성하고 DNA 가닥 절단을 배타적으로 형성하는 것으로 나타났다. 종래의 "저산소 표적화"제인, 아파지퀴논은 스페로이드(spheroid)의 괴사 중심을 향해 DTD의 발현 증가를 보여주는 스페로이드 연구에서 유효하지 않았다. 결과는 아마도 아파지퀴논의 불량한 세포 침투 능력과 세포막 통과 능력에 관한 것이다(Bibby et al., Int. J. Oncol., 3: 661-666, 1993).
MeDZQ(2,5-디아지리디닐-3,6-디메틸-1,4-벤조퀴논)은 암 치료에 DTD 효소-지향 접근법을 활용하는 유망한 약물의 추가적인 예이다. 초기 결과는 재조합 인체 DTD의 기질로서 미토마이신 C보다 150배 이상 더 효과적이며, pH-독립성 대사를 하고 높은 pH에서 DTD를 비활성화하지 않는 것으로 나타났다(Beall et al., supra; Ross et al. Oncol. Res., 6: 493-500, 1994). MeDZQ는 DTD에 의해 생체환원성 활성화를 겪더라도, 그것은 호기 조건에 비해 저산소 조건 하에서의 매우 완만한 세포 독성의 증가를 일어나게 할 뿐이므로, 그것은 아파지퀴논과는 분명히 다르다. 또한 DTD 활성과 MeDZQ 세포 독성이 다양한 인체 종양 세포주에 대해 나타남에도 불구하고, 유용한 치료제로서 MeDZQ의 형성은 불량한 용해성으로 인해 방해되었다.
US 6,156,744에는 수용성 퀴논 전구 약물인, "RH1"으로 지칭되는 2,5-디아지리디닐 1-3-(히드록시메틸)-6-메틸-1,4-벤조퀴논 및 아세틸, 벤조일, 나프토일 기 및 보호된 아미노산으로 형성된 그의 에스테르가 개시되어 있다. US 6,156,744는 RH1은 DTD에 의해 환원되어 DNA를 가교하는 것에 의해 DTD를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시키고, 그리고 MeDZQ보다 수용성이 크다는 점을 개시한다.
이것은, DTD에 의해 활성화되는 전구 약물로서 이들을 효과적인 약물 후보로 만드는 약리학적 특성을 갖는 전구 약물 개발 기술 분야의 문제로 남아 있다.
대체로, 본 발명은 종래 기술의 RH1 에스테르가 수용액 중에서 매우 불안정한 경향을 보임으로써, 치료제로서의 효능을 제한한다는 본 발명자들의 통찰에 기초한다. 따라서, 본 발명은 종양 내에서 2전자 환원에 의해 선택적으로 활성화되도록 설계된 개선된 약리학적 특성을 갖는 퀴논계 신규 화합물에 관한 것이다. 임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 본 발명자들은 본 발명의 화합물이 히드로퀴논을 생산하는 암 세포에서 DT-디아포라제에 의해 효소적 2전자 환원을 진행하는 퀴논 전구 약물로서, 강력한 DNA 가교제라고 믿는다. DT-디아포라제는 다양한 인체 종양에 대해 과발현되기 때문에, 이는 본 발명의 화합물이 정상 세포에 비해 암 세포에 세포 독성이 선택적임을 의미한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 화합물이, 퀴논 전구 약물 Es5의 예에 의해 나타나는 바와 같이, 다른 RH1 에스테르에 비해 예상치 못한 안정성을 가지며 RH1 및 이들의 에스테르와 같은 종래 기술의 화합물보다 DT-디아포라제를 발현하는 세포에 대한 선택성이 더 큼을 입증한다. 특히, 에스테르 Es5(화합물 4.65)는, 그것의 가수 분해 생성물 4.61이 그렇듯이 반감기가 24시간 이상이어서, RH1에 기초한 다른 에스테르보다 >20배 더 안정하다.
대체로, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 및 그의 염 및/또는 용매화물, 및 이러한 화합물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다:
Figure 112015008236414-pct00001
상기 식 중,
n = 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이고;
R1은 수소, 에타노일, 프로파노일, 부타노일 또는 벤조일이고, 이들은 임의로 하나 이상의 C1-1O 알킬, C1-1O 알콕시, 히드록시, 할로겐, 니트로 또는 아미노 기로 치환되며,
R2는 메틸, 에틸 또는 페닐이고, 이들은 임의로 하나 이상의 C1 -1O 알킬, C1 -1O 알콕시, 히드록시, 할로겐, 니트로 또는 아미노 기로 치환된다.
특히, 본 발명은 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 및 이의 염 및/또는 용매화물에 관한 것이다:
Figure 112015008236414-pct00002
상기 식 중,
n = 2, 3 또는 4이고,
R1은 수소, 에타노일, 프로파노일 또는 부타노일이다.
따라서, 제1 실시형태에서, 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 염 및/또는 용매화물을 제공한다:
Figure 112015008236414-pct00003
상기 식 중,
n = 3, 4, 5, 6 또는 7이고;
R1은 수소, 에타노일, 프로파노일, 부타노일 또는 벤조일이고, 이들은 임의로 하나 이상의 C1-1O 알킬, C1-1O 알콕시, 히드록시, 할로겐, 니트로 또는 아미노 기로 치환되며,
R2는 메틸, 에틸 또는 페닐이고, 이들은 임의로 하나 이상의 C1-1O 알킬, C1-1O 알콕시, 히드록시, 할로겐, 니트로 또는 아미노 기로 치환된다.
임의의 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 및 이의 염 및/또는 용매화물을 제공한다:
Figure 112015008236414-pct00004
상기 식 중,
n = 3 또는 4이고,
R1은 수소, 에타노일, 프로파노일 또는 부타노일이다.
임의의 바람직한 실시형태에서, n = 3이다.
바람직한 실시형태에서, n = 3이고 R1은 수소 또는 에타노일이어서, 이 화합물은 아세트산 3-(2,5-비스-아지리딘-1-일-4-메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디에닐)-프로필 에스테르 또는 2,5-비스아지리딘-1-일-3-(3-히드록시프로필)-6-메틸-1,4-벤조퀴논이 되며, 본 명세서에서 이들은 Es5 및 4-61로 지칭한다. 본 발명의 임의의 실시형태에서, 임의의 할로겐 치환기는 불소, 염소 또는 브롬 기일 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물, 및 하나 이상의 추가의 치료제를 선택적으로 더 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 예를 들어 추가의 치료제는 암의 치료에 사용하기 위한 것이다. 적합한 예는, 한정의 의도는 아니며, 시스-백금(시스-플라틴), 도세탁셀, 염화코발트, 에피루비신, 시타라빈(ARA-C) 및 미토마이신 C를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 치료제의 조합은 첨가적 또는 상승적 효과를 보이며, 더욱 바람직하게는 상승적 효과를 보인다.
따라서, 임의의 구체예에서, 본 발명은, 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트 및 미토마이신 C로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물은 시스-백금 또는 염화코발트와 함께 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함한다.
특히 바람직한 조합은 Es5(4.65)와 시스-백금, 및 Es5(4.65)와 염화코발트를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는 암의 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 유형의 암의 치료에 사용된다. 이 경우, 본 발명의 화합물은 전구 약물로서 작용하며, DT-디아포라제에 의해 효소적 환원을 진행하여 암 세포에 세포 독성인 화합물인 히드록시퀴논을 생성한다. 예시로서, 본 발명은 뇌암, 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, CNS암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 또는 유방암 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암에 걸린 개체가 본 발명의 화합물에 의한 치료에 적합한지를 판정하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이것은 환자로부터 암 세포 샘플을 얻고, 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는지 여부를 결정하고, 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 경우, 환자를 화학식 I로 표시되는 화합물로 치료하는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 DTD의 과발현을 개체에 할당하여 그들이 화학식 I로 표현되는 화합물의 치료에 적합한지 아닌지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이것은 DTD의 과발현을, 치료 이득의 가능성이 있는 개체를, 치료 이득의 가능성이 적거나 없는 개체와 구별하는 규모로, 예를 들면 어떤 경우에는 암 세포가 본 발명의 화합물을 세포 독성 히드로퀴논으로 효율적으로 환원시킬 수 있는 수준으로 DT-디아포라제를 발현하지 않는 개체와 구별하는 규모로 할당하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 제공하고, 상기 방법은 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트 및 미토마이신 C로부터 선택되는 추가의 치료제로의 치료를 포함한다. 특히 바람직한 조합은 Es5(4.65)와 시스-백금, Es5(4.65)와 염화코발트, Es5(4.65)와 도세탁셀 및 Es5 (4.65)와 미토마이신 C를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 및 시스플라틴, 도세탁셀, 염화코발트 및 미토마이신 C로부터 선택되는 추가의 치료제의 치료적 유효량을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 명확하게 허용되지 않거나 명시적으로 피해야 한다고 언급한 조합을 제외하고 기재된 실시형태 및 바람직한 특징들의 조합을 포함한다. 본 발명의 실시예들은 예로서 설명되는 것이며 제한이 아니다.
도 1은 상대적 s.c. 또는 i.p. 대조군에 비해 세포 생존율(%)로서 표현한 치료의 비교를 나타내는 생체 내 실험 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 상대적 s.c. 또는 i.p. 대조군에 비해 세포 생존율(%)로서 표현한 세포주의 비교를 나타내는 생체 내 실험 결과를 도시하는 그래프이다.
DT - 디아포라제
본 발명의 화합물, 약학적 조성물 및 의학적 용도는, 당업계에 NQOl 및 NAD(P)H: 퀴논 수용체 산화환원 효소 1(EC 1.6.99.2)로 잘 알려져 있는 효소 DT-디아포라제(DTD)를 과발현하는 암의 치료에 특히 적용할 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해서 구속됨 없이, DTD를 과발현하는 암 세포는, 암 세포 내에서 효소적 2전자 환원에 의해 선택적으로 활성화되어 강력한 DNA 가교제로서 암 세포에 세포 독성인 히드로퀴논을 생성하는 퀴논 전구 약물을 상대적으로 불활성화시키는 원인인 것으로 일반적으로 믿어진다. 이 치료적 적용의 선택성은 DTD가 정상 세포에 비해 뇌암, 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, CNS암, 흑색종, 난소암,신장암, 전립선암 및 유방암을 포함하는 다양한 인체 종양에 대해 과발현되기 때문에 달성될 수 있다(Zappa et al., J. Histochem. Cytochem., 49: 1187-1188, 2001; Tudor et al., Anti-Cancer Drugs, 16: 381-391, 2005; Danson et al., Annals of Oncology, 22: 1653-1660, 2011). 일반적으로 암 세포에 의한 DTD의 과발현이 세포의 야생형 표현형의 결과인 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 추가적으로, DTD의 과발현은 DTD를 코딩하는 핵산으로 표적 DTD 암 세포를 변형시킴으로써 야기될 수 있다(상기 Danson 등의 문헌 참조).
그러나, 화합물의 이러한 적용이 본 발명의 바람직한 실시형태이기는 하지만, 2, 5-디아지리디닐 벤조퀴논 화합물은, 백혈병과 같이 실질적인 정도로 DTD를 과발현하지 않는 일부 형태의 암에 대해 세포 독성임이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 이러한 일반적인 형태의 화합물은 암 세포에서 발견되는 다른 형태의 환원 효소의 작용을 통해 세포 독성 생성물을 형성하는 환원을 진행할 수 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, DTD의 발현은, 특정된 종류의 암이 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 본 발명의 개념상 및/또는 치료를 위한 환자의 선택을 위한 기준으로서 유용한 도구이다. 두 경우 모두, DTD가 과발현되는지, 그래서 예를 들면 후세인 등(Hussein et al., British Journal of Cancer (2009) 101, pp. 55-63)에 의해 입증된 바와 같이 암의 종류 또는 환자 개인이 치료 이익의 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위해서 암 세포의 샘플을 시험하는 것을 포함할 수 있다,
따라서, 본 발명은 어떤 종류의 암 또는 특정 개인이 본 발명에 따라 치료될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서 암 세포의 샘플을 시험하는 것을 포함한다. 이것은, DT-디아포라제 단백질이 샘플의 세포에서, 예를들면 정상 세포에서의 발현과 비교하여 높은 수준으로 존재하는지 여부를 결정함으로써, 또는 DT-디아포라제의 유전자 발현을 결정함으로써 수행될 수 있다. 샘플은 개체로부터의 암 세포일 수 있다. 일반적으로 과발현은 대조군과 비교하여, 예를 들면 비암성 세포, 바람직하게는 동일 조직으로부터의 것과 비교하여 결정할 수 있다. 이 방법은 치료 이익의 가능성이 있는 개체를 치료 이익의 가능성이 적거나 없는 개체와 구별하는 규모로 DTD의 과발현을 할당하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 DT-디아포라제 단백질 발현의 분석에 의해 환자가 DT-디아포라제 과발현 암을 갖고 있는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.
바람직하게는, DT-디아포라제 단백질의 존재 또는 그 양은 DT-디아포라제 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제를 사용하여 결정할 수 있다. DT-디아포라제 단백질 결합제의 바람직한 형태는 DT-디아포라제 또는 그의 단편을 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 항체는 검출될 수 있도록 표지되거나, 또는 예를 들면 ELISA 타입 분석에서 검출 가능한 결과물을 생성할 수 있는 이차 항체를 사용하는 하나 이상의 추가의 종과의 후속 반응이 검출될 수 있도록 표지될 수 있다. 대안으로, 표지된 결합제는 DT-디아포라제 단백질을 검출하는 웨스턴 블롯에 사용될 수 있다. 일부 형태의 암은 또한 NAD(P)H 디하이드로게나제 [퀴논] 유전자에서 돌연변이를 갖는 특징이 있는 것으로 알려져 있는데, 이것은 기능적으로 비활성인 DT-디아포라제를 코딩하는 것을 의미하며 또한 비활성 또는 감소된 수준의 DT-디아포라제를 갖는 개체가 본 발명에 따른 화합물에 의한 치료에 반응하기 어려운 것으로 결정될 수 있다는 것을 의미한다. 이것은 SNP 분석이나 제한 단편 길이 다형성(RFLP)에 의해 결정될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, DT-디아포라제 단백질의 존재를 결정하는 방법은, 예를 들면 면역 조직 화학(IHC) 분석법을 사용하여, 종양 샘플에서 수행될 수 있다. IHC 분석은 파라핀 고정 샘플 또는 동결 조직 샘플을 사용하여 수행될 수 있는데, 일반적으로 DT-디아포라제 단백질의 존재 및 위치를 강조하기 위해 샘플을 염색하는 것을 포함한다.
하나의 구체예에서, 자파 등(Zappa et al .)의 상기 문헌에 사용된 방법에 따르면, 포르말린-고정, 파라핀 포매 조직의 샘플은 정제된 재조합 인체 DTD 단백질로 면역화된 BALB-c 마우스 유래의 항-DTD 단일 클론 항체(IgG1)를 사용하여 DTD 발현을 검출하는 면역 조직 화학(IHC)을 이용하여 분석될 수 있다(Siegelet al., Clin. Cancer Res., 4: 2065-2070, 1998). 이 방법은, 조직 배양물에서 생성된 비인체-반응성 모노클로날 마우스 항체(IgG1)를 음성 대조 시약으로 사용하였다. 조직 절편(3㎛)을 크실렌에서 탈파라핀화하고, 등급화된 알코올을 통해 재수화한 후 마이크로웨이브 처리할 수 있다. 내인성 퍼옥시다제 활성 및 비특이적 결합은 각각 퍼옥시다제 차단제(DAKO EnVision Kit; Carpinteria, CA) 및 20% 정상 토끼 혈청을 첨가하여 차단시킬 수 있다. 연속 절편을 항-DTD 또는 대조 항체 중 하나, 이어서 이차 항체(표지된 폴리머 HRP 항-마우스)와 함께 연속적으로 배양할 수 있다. 면역 검출은 기질-발색소 용액(과산화수소 및 3,3-디아미노벤지딘 발색소)을 사용하여 수행한다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조 염색한다. 면역 염색(갈색 염색)의 강도는 육안으로 0(음성), +1(매우 약함), +2(약함), +3(강함) 및 +4(매우 강함)로 채점했다. 이러한 유형의 분석에서, 비-특이적 항체가 사용된 경우(0점), 대조군 절편에는 면역 염색이 실질적으로 없어야 한다. 한편, 본 발명에 따라 치료가능한 암 또는 환자 개인으로부터의 암 세포에서, IHC 시험에서의 염색은 그 강도가 +3 또는 +4일 것으로 기대된다
추가의 예에서, DTD 활성은 25℃, 550nm에서 시토크롬 c의 환원을 분광 광도계로 측정함으로써 결정될 수 있다(참조: Chen et al., Biochem J. 284: 855-860, 1992). 이 분석은 25mM 트리스 완충액, pH 7.5, 200μM NAD(P)H, 0.8uM 메나디온과 30uM 시토크롬 c를 함유하는 분석 혼합물(1 mL)을 사용한다. 이 분석에서, 메나디온은 전자 수용체이고, 시토크롬 c는 형성된 메나디올을 재산화하는 데 사용된다. 이 분석에서 다른 퀴논 리덕타제의 효과는 1μm 디코우마롤, DTD의 선택적 억제제를 첨가함으로써 구별될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, DT-디아포라제 유전자 발현의 결정은 샘플에서 DT-디아포라제 mRNA의 존재 또는 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이 작업을 수행하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예로서, (i) 예를 들어 FISH와 같은 기술을 이용하여 DT-디아포라제 핵산에 하이브리드화할 수 있는 표지된 프로브를 사용하고, 및/또는 (ii) DT-디아포라제 전사체가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 DT-디아포라제 핵산 서열에 기초하는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 PCR을 사용하여 DT-디아포라제 mRNA의 존재를 결정하는 것을 포함한다. 프로브는 또한 마이크로 어레이에 포함된 서열로서 고정화될 수 있다.
바람직하게는, DT-디아포라제 mRNA의 검출은 종양 샘플로부터 RNA를 추출하고, 정량적 실시간 RT-PCR을 사용하여 DT-디아포라제 발현을 구체적으로 측정함으로써 수행된다. 대안적으로 또는 추가적으로, DT-디아포라제의 발현은 종양 샘플에서 추출된 RNA를 사용하여, 어레이를 형성하도록 기판상에 고정된 복수 개의 프로브를 사용하여 유전자 그룹의 mRNA 수준을 측정하는 마이크로어레이 분석을 이용해 평가할 수 있다.
전술한 바와 같이, DTD 과발현을 결정하는 데 단백질 발현을 사용할지 또는 유전자 발현을 사용할지, 또는 둘 다 사용할지의 선택은, 기술의 각각의 정밀도 및 민감도, 긍정 오류 및 부정 오류의 발생 및 경제적 또는 다른 실용적인 이유에서의 다른 분석의 이용가능성을 유념하여, 다양한 접근법들의 장점과 단점에 대한 지식의 관점에서 숙련된 사람들이 결정할 사항이다.
약학적 조성물
암 치료를 위한 본 명세서에 개시된 본 발명의 화합물은, 단독으로 투여될 수도 있지만, 추가적으로, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 안정화제, 보존제, 윤활제, 또는 당업자들에게 잘 알려진 다른 물질 및 임의의 다른 치료제 또는 예방제를 포함하는 약학적 조성물에 그들을 제공하는 것이 일반적으로 바람직하다. 약학적 조성물의 성분의 예는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 2Oth Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins)에 제시되어 있다.
이들 화합물 또는 이들의 유도체는 암, 특히 DTD를 과발현하는 암의 치료를위해 본 발명에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 치료제의 "유도체"는 염, 배위 복합체, 생체내 가수 분해성 에스테르와 같은 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물, 전구 약물(pro-drug) 또는 지질, 커플링 파트너를 포함한다.
본 발명의 화합물의 염은 바람직하게는 생리학적 내약성 및 비독성인 것이다. 염의 많은 예가 당업자에게 공지되어 있다. 인산염 또는 황산염과 같은 산성 기를 갖는 화합물은, Na, K, Mg 및 Ca 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속과, 그리고 트리에틸아민 및 트리스(2-히드록시에틸)아민과 같은 유기 아민과 염을 형성할 수 있다. 염기성 기를 가진 화합물, 예를 들면, 아민과, 염산, 인산 또는 황산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 시트르산, 벤조산, 푸마르산, 또는 타르타르산과 같은 유기산과의 사이에 염을 형성할 수 있다. 산성 및 염기성 기를 둘 다 갖는 화합물은 내부 염을 형성할 수 있다.
당업계에 공지된 기술을 사용하여, 화합물에 존재하는 하이드록실 또는 카르복실산 기와, 적절한 카르복실산 또는 알코올의 반응 파트너 간에 에스테르를 형성 할 수 있다.
화합물의 전구 약물인 유도체는 생체 내 또는 시험관 내에서 모 화합물 중 하나로 전환될 수 있다. 전형적으로, 화합물의 생물학적 활성 중 적어도 하나가 화합물의 전구 약물 형태로 환원될 것이며, 전구 약물의 전환에 의해 활성화되어 화합물 또는 그것의 대사 산물을 방출할 수 있다. 전구 약물의 투여는, 예를 들어 모 화합물에 대하여 저장 안정성 및/또는 제형화/생체이용성의 개선에 유리할 수 있다.
다른 유도체는 예를 들면 화합물에 화학적으로 결합되거나 그것과 물리적으로 연관됨으로써 화합물이 커플링 파트너에 결합되어 있는 화합물의 커플링 파트너를 포함한다. 커플링 파트너의 예는 라벨 또는 리포터 분자, 지지 기질, 또는 담체 또는 수송 분자, 이펙터, 약물, 항체 또는 억제제를 포함한다. 커플링 파트너는 히드록실기, 카르복실기 또는 아미노기와 같은 화합물의 적당한 작용기를 통해 본 발명의 화합물에 공유 결합될 수 있다. 다른 유도체는 화합물을 리포좀과 제형화한 것을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "약학적으로 허용 가능한" 은, 올바른 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 다른 문제 또는 합병증 없이, 개체(예, 인체)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 포함한다. 각 담체, 부형제 등은 또한 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용 가능한" 것이어야 한다.
본 발명에 따라 DTD 과다 발현 암을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 활성제는 바람직하게는, "예방적 유효량" 또는 "치료 유효량"(경우에 따라서 예방이 치료로 간주될 수 있지만)으로 개체에 투여하기 위한 것이며, 그 양은 개체에 이익을 나타내기에 충분한 것이다. 실제 투여량, 투여 속도 및 시간-경로는, 치료되는 상태의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 용량 등의 결정은, 일반의 및 다른 의사의 책임 내이며, 일반적으로 치료하고자 하는 질병, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요소들을 고려한다. 전술한 기술 및 프로토콜의 예는, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins)에서 찾아 볼 수 있다. 조성물은, 치료하고자 하는 상태에 따라, 단독으로 또는 다른 치료와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
제형은 편리하게 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며, 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 하나 이상의 보조 성분을 구성 할 수 있는 담체와 활성 화합물을 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 조합한 후, 필요에 따라 생성물을 성형하여 제조할 수 있다.
DTD 과발현 암의 치료를 위한 본 명세서에 개시된 약물은, 전신적/말초적으로 또는 원하는 작용 부위에, 예를 들어 경구(예를 들어, 섭취에 의해); 국소(예를 들어, 경피, 비강, 안구, 구강 및 설하 포함); 폐(예를 들어, 흡입 또는 통기 요법(예를 들어, 에어로졸 사용)에 의해, 예를 들어 입이나 코를 통해); 직장; 질; 비경구, 예를 들면, 피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 심장 내, 경막 내, 척수 내, 피막 내, 낭하, 안와 내, 복강 내, 기관 내, 표피 하, 관절 내, 지주막, 및 흉골을 비롯한 주사에 의해; 예를 들어, 피하 또는 근육 내로 저장소를 이식하는 것에 의해, 편리한 임의의 투여 경로로 개체에 투여될 수 있으며, 위의 경로에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여(예를 들어, 섭취에 의해)에 적합한 제형은, 각각 소정량의 활성 화합물을 함유하는 캡슐제, 카세제 또는 정제와 같은 개별 단위로; 분말 또는 과립으로; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로; 환제로; 연약으로; 또는 페이스트로 제공될 수 있다.
비경구 투여(예를 들어, 피부, 피하, 근육 내, 정맥 내 및 피내를 비롯한 주사에 의한)에 적합한 제형에는, 항산화제, 완충제, 보존제, 안정제, 세균발육 억제제, 대상 수용체의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성, 발열원이 없는 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제와, 화합물을 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 표적화하도록 설계된 리포좀 또는 기타 미세 입자 시스템을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 그러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성 비히클의 예에는 염화나트륨 주사제, 링거액 또는 유산염 링거 주사제가 포함된다. 일반적으로, 용액 중의 활성 화합물의 농도는 1ng/ml 내지 10㎍/ml 정도이다. 제형은 단위 투여 또는 다중 투여 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조(냉동 건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석용 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 제형은 리포좀 또는 활성 화합물을 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 표적화하도록 설계된 다른 미세 입자 시스템의 형태일 수 있다.
조합
암 치료를 위한 본 명세서에 개시된 약물를 포함하는 조성물은 표준 화학 요법과 결합하여, 또는 방사선 요법과 공동으로 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 다른 화학 요법제의 예로는, 암사크린(Amsidine), 블레오마이신, 부설판, 카페시타빈(Xeloda), 카보플라틴, 카무스틴(BCNU), 클로람부실(Leukeran), 시스플라틴(시스-백금), 클라드리빈(Leustat), 클로파라빈(Evoltra), 염화코발트, 크리산타스파제(Erwinase), 시클로포스파미드, 시타라빈(ARA-C), 다카바진(DTIC), 닥티노마이신(Actinomycin D), 다우노루비신, 도세탁셀(Taxotere), 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드(Vepesid, VP-16), 플루다라빈(Fludara), 플루오로우라실(5-FU), 젬시 타빈(Gemzar), 히드록시우레아(Hydroxycarbamide, Hydrea), 이다루비신 (Zavedos). 이포스파미드(Mitoxana), 이리노테칸 (CPT-11, Campto), 류코보린(엽산), 리포좀 독소루비신(Caelyx, Myocet), 리포좀 다우노루비신(DaunoXome(등록상표)), 로무스틴, 멜파란, 멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥살리플라틴(Eloxatin), 파클리탁셀(Taxol), 페메트렉시드(Alimta), 펜토스타틴(Nipent), 프로카바진, 랄티트렉시드(Tomudex(등록상표)), 스트렙토조신(Zanosar(등록상표)), 테가푸르-우라실(Uftoral), 테모졸로미드(Temodal), 테니포시드(Vumon), 티오테파, 티오구아닌(6-TG)(Lanvis), 토포테칸(Hycamtin), 트레오설판, 빈블라스틴(Velbe), 빈크리스틴(Oncovin), 빈데신(Eldisine) 및 비노렐빈 (Navelbine)이 포함된다. 바람직하게는, 다른 치료제는 첨가적 또는 상승적 효과를 제공하도록 선택된다.
본원은 또한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을, 이의 치료를 필요로 하는 환자에게, 다른 치료제, 바람직하게는 화학 요법제와 조합하여 사용하는, 복합 치료 방법을 개시한다. 따라서, 또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량, 및 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트 및 미토마이신 C로부터 선택되는 추가의 치료제를, 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 추가의 치료제는 공동 투여되거나, 순차 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 추가의 치료제는 시스-백금 또는 염화코발트이다. 일부 바람직한 실시예에서, 제2 치료제는 도세탁셀 또는 미토마이신 C이다. 특히 바람직한 조합은, Es5(4.65)와 시스-백금, Es5(4.65)와 염화코발트, Es5(4.65)와 도세탁셀, 및 Es5(4.65)와 미토마이신 C이다. 암, 예를 들어, 뇌암, 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, CNS암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 또는 유방암일 수 있다.
일부 실시예에서, 암 세포는 DT-디아포라제를 과발현한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 정의된 화학식 I의 화합물은 DT-디아포라제에 의해 효소적 환원을 진행하여 히드록시퀴논을 생성한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은, 환자로부터 암 세포 샘플을 얻고, 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는지를 결정하고, 암세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 경우, 화학식 I로 표시되는 화합물 및 추가의 치료제에 의해 환자를 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 형태에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에 정의된 화학식 I의 화합물을 포함하고, 하나 이상의 추가의 치료제, 예들 들어 암 치료에 사용되는 추가의 치료제를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 적절한 예에는, 제한적인 것은 아니지만, 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트, 에피루비신, 시타라빈(ARA-C) 및 미토마이신 C가 포함된다. 바람직하게는, 조성물 중의 치료제의 조합은, 첨가적 또는 상승적 효과를, 보다 바람직하게는 상승적 효과를 나타낸다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은, 본 명세서에 정의된 화학식 I의 화합물과 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트 및 미토마이신 C로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제와의 조합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 시스-백금 또는 염화코발트와 함께 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함한다.
특히 바람직한 조합은 Es5(4.65)와 시스-백금 및 Es5(4.65)와 염화코발트를 포함한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물과 추가의 치료제, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 치료제의 조합을 포함하는, 본 명세서에 개시된 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 Es5(4.65) 및 시스-백금을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 Es5(4.65) 및 염화코발트를 포함하는 조성물을 제공한다.
투여
생체 내 투여는 1회 용량을 연속적으로 또는 간헐적으로(예를 들어, 적절한 간격으로 분할 용량으로) 전 치료 과정에 걸쳐 수행할 수 있다. 가장 효과적인 수단 및 투여 용량을 결정하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 치료에 사용되는 제형, 치료의 목적, 치료하고자 하는 표적 세포, 및 치료 개체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여를 수행할 수 있고, 그 용량 수준 및 패턴은 치료 의사에 의해 선택된다.
일반적으로, 활성 화합물의 적합한 투여량은 개체의 체중 kg당 하루에 약 100㎍ 내지 약 250mg 범위이다. 활성 화합물이 염, 에스테르, 전구 약물 등인 경우, 투여량은 모 화합물을 기준으로 계산되고, 따라서 실제 사용될 중량은 비례적으로 증가된다.
실험
물질 및 방법
Es5의 합성
Figure 112015008236414-pct00005

1,4- 디메톡시 -2-메틸벤젠(2)[1]
Figure 112015008236414-pct00006

디에틸에테르(90㎤) 중의 2,5-디메톡시 톨루엔(1)(9.0g, 59.21mmol)을 클로로포름(30㎤) 중의 요오드 모노클로라이드(10.17g, 62.65mmol)의 교반 용액에 30분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후 10% 나트륨 티오설페이트(150㎤)를 첨가하였다. 이 유기상을 디에틸에테르 75㎤로 2회 추출하였다. 유기상을 합하여, NaHC03 포화 수용액(150㎤), 염수(100㎤)로 세정하고, 건조(MgS04) 및 진공 건조시켰다. 그 결과 얻어진 고형물을 메탄올로부터 재결정화하여 적색 고체(2)(11.3g, 69%)로서 표제 화합물을 수득하였다.
Rf 0.52 (SiO2, Hex 3:1 EtOAc).
Mp 80-82℃ (문헌 81-82℃ (Reed et al., JACS, 120(38): 9729-9734, 1998)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.12 (3H, s, CH3), 3.72 (3H, s, OCH3), 3.75 (3H, s, OCH3), 6.60 (1H, s, ArH), 7.10 (1H, s, ArH) ppm.
3-(2,5- 디메톡시 -4- 메틸 - 페닐 )- 프로프 -2-인-1-올(3) ( Sato , J. Org . Chem ., 66(1): 309-314, 2000)
Figure 112015008236414-pct00007

비스(트리페닐포스핀)팔라듐 클로라이드(151㎎, 0.215mmol) 및 요오드화 구리(273mg, 1.43mmol)를 충전한 플라스크에 벤젠(40㎤) 중의 1,4-디메톡시-2-메틸벤젠(2)(2.0g, 7.20mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각한 후, 디에틸아민(5.19㎤, 50.35mmol) 및 프로파길 알콜(2.1㎤, 36.0mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후, 포화 염화암모늄(2㎤)으로 켄칭하고 진공하에 농축하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고(75㎤), 이것을 염수(75㎤)로 세정한 후, 건조(MgS04) 및 진공하에 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, Hex 3:1 EtOAc)로 정제를 수행하여 옅은 황색 오일(1.33g, 90%)로서 표제 화합물(3)을 수득하였다.
Rf 0.52 (SiO2, Hex 1:1 EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.15 (3H, s, CH3), 2.55 (1H, br s, OH), 6.68 (3H, s, OCH3), 3.78 (3H, s, OCH3), 4.45 (2H, s, CH2), 6.62 (1H, s, ArH), 6.68 (1H, s, ArH) ppm.
아세트산 3-(2,5- 디메톡시 -4- 메틸 - 페닐 )- 프로프 -2-인일 에스테르(4)
Figure 112015008236414-pct00008

디클로로메탄(40㎤) 중의 알코올(4.47g, 21.69mmol)의 교반된 용액에 트리에틸아민(4.39㎤, 43.38mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각한 후, 아세틸클로라이드(2.55㎤, 32.48mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 1M HCl(15㎤)로 켄칭하고, 유기상을 분리하여, 중탄산나트륨 포화 수용액(30㎤), 염수(30㎤)로 세정한 후, 건조(MgS04) 및 진공 하에 증발시켜서, 황색 오일(4)(5.08 g, 94 %)로서 표제 화합물을 수득하였다.
Rf 0.61 (SiO2, Hex 1:1 EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.08 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, CH3), 3.72 (3H, s, OCH3), 3.80 (3H, s, OCH3), 4.90 (2H, s, CH2), 6.62 (1H, s, ArH), 6.78 (1H, s, ArH) ppm.
아세트산 3-(2,5- 디메톡시 -4- 메틸 - 페닐 )-프로필 에스테르(5)
Figure 112015008236414-pct00009

알킨(3)(5.01g, 20.2mmol)을 메탄올(100㎤)에 용해하고 Pd/C(100mg)를 첨가하였다. 반응 플라스크를 수소 가스로 정화하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 용매를 진공하에 제거하여 갈색 오일(4.98g, 98%)로서 표제 화합물(5)을 수득하였다.
Rf 0.36 (SiO2, Hex 1:1 EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 1.98 (2H, m. CH2), 2.10 (3H, s, CH3), 2.24 (3H, s, CH3), 2.68 (2H, m, CH2), 3.82 (3H, s, OCH3), 3.86 (3H, s, OCH3), 4.15 (2H, m, CH2), 6.66 (1H, s, ArH), 6.70 (1H, s, ArH) ppm.
13C NMR (400 MHz, CDCl3) 14.1, 16.1, 21.0, 26.7, 28.9, 32.3, 55.9, 56.1, 64.3, 112.8, 113.8, 124.9, 127.4, 151.2, 151.4, 171.22.
아세트산 3-(4- 메틸 -3,6- 디옥소 - 시클로헥사 -1,4- 디에닐 )-프로필 에스테르(6)
Figure 112015008236414-pct00010

아세토 니트릴(15㎤) 중의 (5)(1.26g, 4.99mmol)의 용액에 물(10㎤) 중의 질산세륨 암모늄(5.50g, 9.99mmol)을 적가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 유기상을 디클로로메탄(25㎤)으로 3회 추출하고, 염수(25㎤)로 세정하고, 건조(MgS04) 및 진공 하에 농축시켜서 갈색 오일(756㎎, 68%)로서 표제 화합물(6)을 수득하였다.
Rf 0.69 (SiO2, Hex 1:1 EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3)
아세트산 3-(2,5- 비스 -아지리딘-1-일-4- 메틸 -3,6- 디옥소 -시클로 헥사 -1,4- 디에닐 )-프로필 에스테르(7)
Figure 112015008236414-pct00011

퀴논(6)(756㎎, 3.40mmol)을 에탄올(15㎤)에 용해하여, 0℃로 냉각시키고, 아지리딘(0.50㎤, 11.6 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 72시간 동안 냉장고에 보관하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 적색 고체를 디에틸에테르로 분쇄하여 건조시켰다. 적색 고체를 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, Hex 1:1 EtOAc)로 더 정제하여, 적색 고체로서 표제 화합물(7)(98㎎, 9%)을 수득하였다.
Rf 0.52 (SiO2, Hex 1:1 EtOAc).
1H NMR (400 MHz, CDCl3)
비교 화합물의 합성
RH1, MeDZQ 및 모든 에스테르를 종래 기술 프로토콜(Kidscan 연구소)에 따라 합성하고, 테스트를 위한 DMSO 중의 10mM 원료 용액으로 제조하였다. 표 1에는 일부 에스테르의 구조 및 그들의 트리스 완충액 중에서의 반감기를 MDA 468 및 MDA NQ01 세포주에 대한 그들의 IC50 값과 함께 나타낸다.
안정성 테스트
에스테르 및 그 가수 분해 생성물의 안정성을 용액 중에서 측정하였다. (pH 7.4에서, 트리스 완충액(0.1mol dm-3) 중의 50μM Es5). 샘플을 최대 24 시간까지의 시간 간격으로 채취하여 HPLC로 분석하였다. 검출 파장은 330nm였다. 30:70 MeOH:트리스 완충액(0.1mol dm-3, pH 7.4)을 사용하여 등용매 용출에 의해 1ml min- 1으로 크로마토그래피 분석) 수행하였다. 약물의 크로마토그래피 분리를 250mm x 4.6mm I.D의 하이퍼실 ODS를 이용하여 수행하였다.
RH1 에스테르의 구조 및 그들의 반감기 값.
화합물 RH1 에스테르 및 에스테르 가수분해 생성물의 화학적 구조 완충액 중에서의 T1 /2, pH 7.0



4-05
Figure 112015008236414-pct00012
 < 10 분



4-07
Figure 112015008236414-pct00013

 < 20 분



4-09
Figure 112015008236414-pct00014

 < 30 분



4-10
Figure 112015008236414-pct00015

 < 30 분



4-11
Figure 112015008236414-pct00016

< 30 분



4-14
Figure 112015008236414-pct00017


< 30 분


4-20
Figure 112015008236414-pct00018

20 분


4-36
Figure 112015008236414-pct00019

< 30 분


4-38
Figure 112015008236414-pct00020

20 분


4-39
Figure 112015008236414-pct00021

< 30 분



4-61
Figure 112015008236414-pct00022


> 24 시간



4-65 (Es5)
Figure 112015008236414-pct00023


> 24 시간



4-70
Figure 112015008236414-pct00024


< 60 분



4-71
Figure 112015008236414-pct00025


< 60 분
선택성 테스트
Es5 및 4-61과 같은 본 발명의 화합물은 DT-디아포라제를 발현하는 세포에 대해 우수한 선택성을 나타낸다. 선택성은 RH1에 의해 나타난 것을 초과하는 것으로 밝혀졌다. IC50 값은 MTT 분석을 이용하여 측정하였다.
표 2는 MDA483 및 NQ01 세포에서 테스트된 여러 약물의 IC50 값의 요약을 나타낸다. 데이터는 Es5가 다른 항암제에 비해 DT-디아포라제를 발현하는 세포에 대해 우수한 선택성을 나타내고 있음을 입증한다. 비교해 보자면, MDA468 대 NQ01의 차이는, 미토마이신 C의 경우 5배이고 RH1의 경우 >30배인 것에 비해, Es5의 경우 >80배이다. Es5의 가수 분해 생성물 4-61은 또한 MDA NQOl에 대해 0.41nM, MDA 468에 대해 16.97nM의 IC50 값을 갖는 우수한 선택성을 보이고, 결과적으로 41의 DT 디아포라제 향상 비율을 보인다.
MDA468과 NQOl 세포에 대한 Es5(4.65)와 다른 항암제의 효과.
RH1 에스테르 MDA468에서의
IC50 		NQO1
에서의 IC50
RH1 4.41nM 120pM
Es5 (4.65) 25nM 230pM
시스플라틴 675nM 570nM
도세탁셀 1.15nM 1.88nM
미토마이신 C 50nM 10nM
5-플루오로우라실 7.96μM 12μM
에피루비신 23.2nM 27.5nM
메토트렉세이트 45nM 27nM
염화코발트 35μM 54μM
빈블라스틴 16nM 18.3nM
시토신 아라비노사이드(ARA-C) 250nM 240nM
Es5 의 활성화
에스테라제 및 세포 추출물에 의한 Es5의 절단과 활성화를 조사하였다. Es5는 수성 완충제에서는 안정적이지만, 혈청에서는 느린 가수분해를 진행한다(t1/2 = 100분). 돼지 에스테라제에 의한 실험은, Es5를 빠르게 가수 분해 생성물로 분해하였으며, 그러한 결과는 돼지 뇌 추출물을 사용할 때 반복되는 것으로 나타났다. DT-디아포라제 발현 MDA468 NQOl 세포주로부터의 세포 추출물은 에스테르를 빠르게 분해하는 반면, DT-디아포라제 비발현 MDA 468 세포주로부터의 추출물은 훨씬 감소된 속도로 그렇게 했는바, 이것은 활성화가 DT-디아포라제 발현 세포 또는 암에서 더 커질 수 있음을 나타내는 것이다.
전술한 바와 같이, 대부분의 RH1 에스테르는 수용액 중에서 매우 불안정하고 30분 이내에 RH1으로 가수 분해되었다. 속도는 그 동력학을 HPLC에 의해 판정할 수 없을 정도였다. 위 표에 나타낸 바와 같이 Es5는 훨씬 더 안정하였다.
Es5의 안정성 프로파일은 트리스 완충액(0.1mol dm-3, pH 7.0), RPMI 매체(pH 7.0) 및 혈청 중에서 실온에서 측정하였으며, Es5의 손실은 혈청 중의 알코올 4.61의 생성과 동시에 동일한 시간 스케일로 나타났다 .
세포 용해물 에스테라제 반응
두 세포주 MDA NQ01 및 MDA468의 세포 용해물로부터의 에스테라제에 의한 Es5의 분해를 조사하였다. Es5는 MDA NQ01 세포주 추출물에서 불안정하고 알코올 4.61로 분해되었으며 실온에서 약 160분의 반감기를 나타내었다. DTD-비발현 세포주 MDA468에서, 부모 분자의 알코올로의 분해는 상당히 낮은 속도였다.
세포 사멸
마틴 등의 문헌(Journal of Experimental Medicine. 182, 1545-1556. 1995)에 기재된 방법에 기초하여, 본 발명의 화합물에 의해 유도된 세포 사멸을 측정하였다. 세포 사멸은, 아넥신 V 결합에 의해 측정된 바와 같이, 프로그램된 세포 사멸의 유도가 DT-디아포라제 발현 세포에서는 2시간 이내에 발생하는 반면, DT-디아포라제 비발현 MDA468 세포에서는 이 시점에서 사멸이 보이지 않는 것으로 나타났다. 이 세포주에서는 감소된 수준의 세포 사멸이 4시간 후에 나타났다. 이것은 DT-디아포라제 발현 세포와 비발현 세포 간의 Es5의 효과 차이를 나타내는 것이다.
DNA 손상
MDA468 NQ01 및 DT-디아포라제 비발현 MDA468 세포주의 치료 후 코멧 헤드와 테일 강도에 미치는 Es5의 영향을 조사하기 위해 코멧(Comet) 분석법을 이용하여 DNA 손상을 측정하였다. 이러한 실험에서, 양 세포주에서 H202의 첨가가 DNA 가닥 파손을 유도하고 그 결과 헤드에 비해 테일에서 DNA의 축적이 증가되는 것으로 나타났다. 2 시간 동안 10nM의 Es5에 의한 DT-디아포라제 발현 세포주(NQ01)의 처리에서 H202 단독으로 처리한 경우에 비해 헤드에서의 DNA의 비율이 증가하였다. 이것은 DNA가 Es5에 의해 가교되었음을 나타내는 것이다. Es5에 의한 DT-디아포라제 결핍 세포주의 처리에서는 테일 강도가 감소하지 않았는데, 이것은 DT-디아포라제에 의한 활성화의 부재하에서 Es5는 DNA 가교제가 아님을 나타내는 것이며, 제안된 메카니즘의 Es5 작용이다. 배양 6 시간 후, DT-디아포라제 비발현 세포주에서 가교의 증거가 있었다. 임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 본 발명자들은 DT-디아포라제에 의해 발생하는 2전자 환원보다는 2×1전자 환원과 같은 다른 메커니즘에 의해 발생한다고 믿는다.
Es5 와 RH1 의 비교
표 3은 Es5(4.65)와 RH1 특성의 비교를 나타내며 시스-백금, 도세탁셀, 염화코발트, 에피루비신, 아라-C 및 미토마이신 C와의 조합 인덱스를 제공한다. 비교를 위해, MMC와 염화코발트의 IC50 조합 인덱스는 MDA468에서 0.443이고 NQ01 세포에서 0.239이다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, Es5와 시스-백금의 결합은, 두 세포주에서 상승적 효과를 나타내는 한편, Es5와 염화코발트의 조합은 두 세포주에서 강력한 상승적 효과를 나타낸다. Es5와 도세탁셀의 조합은, NQ01에 대하여 첨가적 효과를 나타내는 한편, MDA468에 대하여 적당한 억제 효과를 나타내고, Es5와 미토마이신 C의 조합은 NQ01에 대하여 첨가적 효과를 나타내며 MDA468에 대하여 약간의 길항 효과를 나타낸다.
Es5과 RH1 특성의 비교, 및 다른 항암제와의 조합 인덱스 (T90 = 초기 농도의 90%까지 분해하는 데 걸리는 시간)
특징 RH1 Es5(4.65)
용해도 (수상) 500㎍/ml (물) 150㎍/ml (PBS)
안정성 (수상) >7일 >7일
용해도 (유기상) >30mg/ml (DMSO/클로로포름) 9.4mg/ml (에탄올)
안정성 (유기상) 수 개월 >1개월
HPLC(330nm)에 의한 검출 한계 <50pmoles <50pmoles
혈청 에스테라제에 의한 분해 NA t90 90분
돼지 간 에스테라제에 의한 분해 NA t1 /2 1분
MDA468 세포 추출물에 의한 분해 NA t1 /2 280분 (19.6nmoles/hr/106 세포)
MDA NQ01 세포 추출물에 의한 분해 NA t1 /2 160분 (11.25nmoles/hr/106 세포)
IC50 MDA468 3.5nM 20-25nM
IC50 MDA NQ01 120pM 230pM
MDA468에서의 시스-백금에 의한 IC50 조합 인덱스 0.499 (상승적 효과) 0.567 (상승적 효과)
MDA NQ01에서의 시스-백금에 의한 IC50 조합 인덱스 0.672 (상승적 효과) 0.674 (상승적 효과)
MDA468 세포에서의 도세탁셀에 의한 IC50 조합 인덱스 0.850 (약간의 상승적 효과)) 1.387 (보통의 억제 효과)
NQ01 세포에서의 도세탁셀에 의한 IC50 조합 인덱스 0.864(약간의 상승적 효과) 0.964 (첨가적 효과)
MDA468 세포에서의 염화코발트에 의한 IC50 조합 인덱스 0.170(강한 상승적 효과) 0.464 (강한 상승적 효과)
NQ01 세포에서의 염화코발트에 의한 IC50 조합 인덱스 0.80 (보통의 상승적 효과) 0.54
(강한 상승적 효과)
MDA468 세포에서의 에피루비신에 의한 IC50 조합 인덱스 4.81 (강한길항 효과) 1.49 (길항 효과)
NQ01 세포에서의 에피루비신에 의한 IC50 조합 인덱스 2.09 (길항 효과) 2.04 (길항 효과)
MDA468 세포에서의 ARC-C의한 IC50 조합 인덱스 1.45 (약간의 길항 효과) 1.2 (약간의 길항 효과)
NQ01 세포에서의 ARC-C에 의한 IC50 조합 인덱스 1.22 (약간의 길항 효과) 1.22 (약간의 길항 효과)
MDA468 세포에서의 미토마이신 C에 의한 IC50 조합 인덱스 0.577 (상승적 효과) 1.4 (약간의 길항 효과)
NQ01 세포에서의 미토마이신 C에 의한 IC50 조합 인덱스 1.2 (약간의 길항 효과) 0.924 (첨가적 효과)
pH 안정성 t1 /2 = 0.96일, pH 9.82
t1 /2 = 43.52일, pH 7.33
t1 /2 = 4.46일, pH 5.95
t1 /2 = 4.36일, pH 5.95
t1 /2 = 0.07일, pH 4.16
t1 /2 = 0.07일, pH 4.16
(최근접 비교, AAPS PharmSciTech 2007; 8 (1) 문헌 16)		 t1 /2 > 6일, pH 9.44
t1 /2 > 6일, pH 7.44
t1 /2 > 6일, pH 6.2
t1 /2 > 6일, pH 5.9
t1 /2 = 2.4일, pH 4.35
t1 /2 = 1일, pH　3.9
온도 안정성 4C t90 > 7일
주위온도 t90 3일
40C t90 2일
55C t1 /2 2일		 4C t90 > 6일
주위온도 t90 4일
37C t90 4일
55C t1 /2 < 1일
생체 내에서 Es5 의 효능
생체 중공 섬유 분석법(HFA)을 이용하여 세 가지 암 세포주 H460, MDA-MB-468-NQ01 및 MDA-MB-468-Mock에 대해 복강 내(i.p.) 및 피하(s.c.) 두 부위에 섬유를 이식하여 Es5(4.65)의 활성을 생체 내에서 평가하였다. Es5 및 대조 약물 독소루비신을 3, 4, 5 및 6일째에 각각 0.5㎎/kg/일 및 2.5㎎/kg/일로 복강 내(i.p.) 주사에 의해 다중 투여하였다.
Es5(4.65)는 섬유를 i.p. 부위에 이식한 경우 세 가지 세포주 모두에서, 섬유를 s.c. 부위에 이식한 경우 H460에서, 미처리 대조군에 비해 세포 생존성의 측면에서 상당한 효능(p<0.01)을 보였다. 이러한 결과는, 표준 대조 약물 독소루비신과 유사한 것이며, 이 화합물이 항암제로서 가능성이 있음을 나타내는 것이다.
재료 및 방법
Es5(4.65)를 약간의 와류를 이용하여 생리 식염수에 용해시켰다.
세포주. 분석을 위해 세 가지 인체 종양 세포주를 선택하였다: H460 NSCLC(ICT 제품) 및 두 가지 유방암 세포주 MDA-MB-468-NQ01 및 MDA-MB-468-Mock (모두 Onco-NX 제품). 세포를 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민과 10% 소 태아 혈청(모두 Sigma 제품)이 보충된 RPMI 1640 세포 배양 배지에서 배양하고, 가습된 5% C02 환경 하에 37℃에서 단층 배양물로서 유지하였다.
동물. 6~8주령의 암컷 Balb/C 면역 결핍 누드 마우스(Harlan UK, Blackthorn, UK)를 사용하였다. 마우스를, 조명 주기와 암흑 주기가 규칙적으로 교대하는 에어컨 설치실의 격리 캐비닛에 배치된 케이지에 가두었다. 이들에게 Teklad 2018 식이(Harlan, Blackthorn, UK) 및 물을 무제한 제공하였다. 모든 동물에 대한 절차는 영국 내무성에서 발행한 프로젝트 라이센스 하에 수행하고 시험기간 내내 UKCCCR 지침에 따라 수행하였다.
중공 섬유 분석. 세포를 멸균된 색-구분 PVDF Spectra/Por 중공 섬유(HF) (Spectrum Medical Inc, Houston, TX, USA)에 부하하였다. 간단히 세포를 수확하여 필요한 세포 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁하였다. 이어서 현탁물을 HF에 부하하고, 단부를 클램핑하여 열 밀봉하였다. HF를 1.5cm 길이로 절단하고, 다시 양단을 열 밀봉한 후, 생체 내 실험을 위해 이식하기 전에 매체를 함유하는 6웰 플레이트로 옮기거나, 또는 후술하는 수정된 MTT 분석법을 사용하여 처리하기 전에 다양한 시간 동안 가습된 5% C02 환경 하에 37℃에서 배양하였다.
생체 내 실험을 위해, 짧은 흡입 마취(2% 이소플루란) 하에서, 각 세포주마다 하나의 부하된 중공 섬유를 각 마우스의 등쪽 측면에 복강 내 또는 피하 이식하고, 마우스를 회복시켰다. 각 군은 6마리의 마우스로 구성하고 이식일은 '0일'로 표시하였다.
Es5(4.65)의 치료 반응 평가를 위해, 3, 4, 5 & 6일째에, 마우스를 0.5㎎/kg/일의 Es5(4.65)로 또는 2.5㎎/kg/일의 독소루비신으로 처리하였다.
이식 후 7일째에 마우스를 희생시키고, 세포를 제거한 다음, 수정된 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존을 분석하고, 처리군과 대응하는 미처리 대조군에서 나타나는 흡광도를 비교하였다. 학생 t-시험을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다.
결과
도 1 및 도 2는 이 연구에서 얻은 결과를 나타내며, 데이터는 상대적 s.c. 또는 i.p. 미처리 대조군과 비교한 세포 생존률로서 표현한 것이다. 도 1은 각 세포주에 대해 그룹화된 데이터를 나타내고, 도 2에서는 이것을 각 처리에 대해 나타낸다.
Es5는 섬유를 i.p. 부위에 이식한 경우 세 가지 세포주 모두에서, 섬유를 s.c. 부위에 이식한 경우 H460에서, 미처리 대조군에 비해 세포 생존성의 측면에서 상당한 효능(p<0.01)을 보였다. 이러한 결과는, 표준 대조 약물 독소루비신과 유사한 것이었지만, 이 약물은 s.c. 부위의 모든 세포주에 대해서 상당한 효능이 있음을 나타내지는 않았다.
Es5는 또한, Mock MDA-MB-468 세포주에 비해 NQO1 발현 측면에서 개선된 효능을 나타내지만, 독소루비신에 대해서는 약간의 차이가 있었다.
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Claims (36)

  1. 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물:
    Figure 112020005626702-pct00031

    상기 식 중,
    n = 3, 4, 5, 6 또는 7이고;
    R1은 수소, 에타노일, 프로파노일, 부타노일 또는 벤조일이고, 이들은 임의로 하나 이상의 C1-1O 알킬, C1-1O 알콕시, 히드록시, 할로겐, 니트로 또는 아미노 기로 치환되며,
    R2는 메틸 또는 에틸이다.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물:
    Figure 112020005626702-pct00032

    상기 식 중,
    n = 3 또는 4이고,
    R1은 수소, 에타노일, 프로파노일 또는 부타노일이다.
  3. 제1항에 있어서,
    n = 3인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R1이 수소 또는 에타노일인 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    아세트산 3-(2,5-비스-아지리딘-1-일-4-메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디에닐)-프로필 에스테르 또는 2,5-비스아지리딘-1-일-3-(3-히드록시프로필)-6-메틸-1,4-벤조퀴논, 또는 그의 염 또는 용매화물인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    하나 이상의 추가의 치료제를 더 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 암 치료용인 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 시스-백금, 도세탁셀 및 미토마이신 C로부터 선택되는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 시스-백금인 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 도세탁셀 또는 미토마이신 C인 약학적 조성물.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 암의 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 약학적 조성물.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 화합물이 DT-디아포라제에 의해 효소적 환원을 진행하여 히드록시퀴논을 생성하는 약학적 조성물.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 암이 뇌암, 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, CNS암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 또는 유방암인 약학적 조성물.
  15. 제6항에 있어서,
    환자로부터 얻은 암 세포 샘플로부터 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 것으로 결정되는 경우, 환자에게 투여되는 약학적 조성물.
  16. 제6항에 있어서,
    암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 시스-백금, 도세탁셀 및 미토마이신 C로부터 선택된 추가의 치료제와 함께 사용되는 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 시스-백금인 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 추가의 치료제가 도세탁셀 또는 미토마이신 C인 약학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 암의 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 약학적 조성물.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 화합물이 DT-디아포라제에 의해 효소적 환원을 진행하여 히드록시퀴논을 생성하는 약학적 조성물.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 암이 뇌암, 백혈병, 비-소세포 폐암, 결장암, CNS암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 또는 유방암인 약학적 조성물.
  22. 제16항에 있어서,
    환자로부터 얻은 암 세포 샘플로부터 암 세포가 DT-디아포라제를 과발현하는 것으로 결정되는 경우, 추가의 치료제와 함께 환자에게 사용되는 약학적 조성물.
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