JP2013231065A - 抗癌剤に不応な腫瘍の治療及び化学感作のためのｃｋ２阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】
細胞増殖抑制剤に対する腫瘍の化学療法耐性を回避する。
【解決手段】
本発明は、カゼインキナーゼ２リン酸化阻害剤（ｐ１５と称する）と、癌化学療法において用いられる細胞増殖抑制剤とを含む薬剤の組合せであって、同時、個別、又は逐次に投与される併用法に関する。好ましい細胞増殖抑制剤は、白金、タキサン、ツルニチニチソウ属アルカロイド、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、マイトマイシンＣ、イマチニブ、イレッサ、及びベルケイド（ボルテゾミブ）である。ペプチドｐ１５と抗癌化合物との間の相乗効果とは、該併用法における各細胞増殖抑制剤の有効濃度が、単剤での細胞増殖抑制剤に対応する有効濃度よりも１〜２桁低いことを意味する。結果として、本発明に記載の組合せは、抗癌細胞増殖抑制剤について報告される毒性よりもはるかに低い毒性を有し、このことが、癌治療におけるその使用の重要な利点となる。さらに、逐次的に投与すると、該組合せは、言及した細胞増殖抑制剤に対して不応な腫瘍の、ペプチドｐ１５の前投与による化学感作をもたらす。
【選択図】なし

Description

本発明は、分子及び実験腫瘍学の分野、とくに従来の細胞増殖抑制剤に不応な腫瘍の治療及び／又は化学感作を目的とする薬剤の組合せの記載に関する。

過去３０年間において、癌治療用の細胞増殖抑制剤として化学薬剤を用いることが、一部の充実性腫瘍及び造血系腫瘍の第１選択治療として選択肢の１つを構成する。癌治療用にもっとも高頻度で用いられる化学薬剤は、とりわけ、シスプラチン、タキソール、ツルニチニチソウ属由来のアルカロイド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミドである（Ｊａｃｋｍａｎ Ａ．Ｌ．、Ｋａｙｅ Ｓ．、Ｗｏｒｋｍａｎ Ｐ．（２００４）「殺細胞療法と分子標的療法との組合せは可能であるか（Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ−ｃａｎ ｉｔ ｂｅ ｄｏｎｅ？）」Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １：４４５〜４５４）。しかし、臨床試験からの結果は、患者において高毒性プロファイルをともなう不十分な治療的有益性の観察されることが立証する通り、癌治療におけるこの種の薬剤について低い治療指数を示す（Ｓｃｈｒａｄｅｒ Ｃ．ら、（２００５）「転移性卵巣癌患者におけるパクリタキセル（タキソール）による化学療法が引き起こす急性心筋虚血の症状及び兆候（Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｌ）ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．）」Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １０：４９８〜５０１）。例えば、シスプラチンが肺癌の第１選択治療を構成することに、多くの著者が同意するが、臨床症状及び６週間の延命においてほとんど改善をみない、わずかな効果が観察されることが多い（Ｇｒｉｌｌｏ Ｒ．、Ｏｘｍａｎ Ａ．、Ｊｕｌｉａｎ Ｊ．（１９９３）「進行性非小細胞肺癌のための化学療法（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １１：１８６６〜１８７１；Ｂｏｕｑｕｅｔ Ｐ．Ｊ．、Ｃｈａｕｖｉｎ Ｆ．ら、（１９９３）「進行性非小細胞肺癌における多剤併用化学療法：メタ分析（Ｐｏｌｙｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．）」Ｌａｎｃｅｔ ３４２：１９〜２１）。したがって、最適の治療的有益性を達するための現行の戦略は、分子標的療法とともに従来の細胞増殖抑制剤に基づく薬剤の組合せに焦点を当てる。現行の抗癌剤の一部は、癌標的化療法に分類され、とりわけ、慢性骨髄性白血病の発現において基本的な役割を果たすＡｂｌキナーゼを標的とするグリベック（イマチニブ）（Ｇｉｌｅｓ Ｊ．Ｆ．、Ｃｏｒｔｅｓ Ｊ．Ｅ．、Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ Ｈ．Ｍ．（２００５）「慢性骨髄性白血病患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質のキナーゼ活性の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＲ−ＡＢＬ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５：６１５〜６２３）のほか、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体に関連するチロシンキナーゼを標的とするイレッサ（Ｏｎｎ Ａ．、Ｈｅｒｂｓｔ Ｒ．Ｓ．（２００５）「肺癌のための分子標的化療法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．）」Ｌａｎｃｅｔ ３６６：１５０７〜１５０８）及びプロテアソーム機構を標的とすることでタンパク質分解を遮断するベルケイド（ボルテゾミブ）（Ｓｐａｎｏ Ｊ．Ｐ．ら、（２００５）「プロテアソーム阻害：悪性腫瘍治療のための新方法（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．）」Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ９２：Ｅ６１〜６６）の例がある。従来の化学療法剤の非特異的機構が細胞有糸分裂の破棄に集中することを考慮すると、新規の癌標的化療法剤の使用は、抗腫瘍効果の相乗効果を生みだす薬剤の組合せを達するための有望な見通しを与える。

一方、化学療法剤を用いる場合、薬剤耐性現象が、癌治療失敗の主要原因として認識されている。腫瘍環境においては、最適未満の薬剤濃度が薬剤耐性に影響を及ぼしうる一方で、細胞起源など他の因子が、多くの腫瘍の化学療法耐性において本質的な役割を果たす。薬剤耐性は、細胞内解毒、細胞応答の変化、ストレスへの耐性、及びアポトーシスシグナル伝達経路における欠損を含む多数の独立した機構に依拠する多因子現象である（Ｌｕｑｍａｎｉ Ａ．（２００５）「癌化学療法における薬剤耐性機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．）」Ｍｅｄ Ｐｒｉｎｃ． Ｐｒａｃｔ １４：３５〜４８）。Ｐ−糖タンパク質及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが、癌における薬剤耐性現象と連関した細胞内解毒プロセスを媒介する主要なタンパク質である（Ｓａｅｋｉ Ｔ．、Ｔｓｕｒｕｏ Ｔ．、Ｓａｔｏ Ｗ．、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ．（２００５）「乳癌化学療法における薬剤耐性（Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５６：８４〜８９）（Ｈａｒａ Ｔ．ら、（２００４）「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１がカンプトテシンに抗する細胞生存能力に保護的効果を有する（Ｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｐ１ ｈａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０３：１９９〜２０７）。ベータ−チューブリンなどの他のタンパク質が薬剤耐性現象に関与し、そのレベルがパクリタキセルに対する腫瘍耐性と直接的に相関することが報告されている（Ｏｒｒ Ｇ．Ａ．ら、（２００３）「微小管に関連するタキソール耐性の機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔａｘｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ．）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：７２８０−７２９５．）。これとは別に、Ｔ−プラスチン（Ｈｉｓａｎｏ Ｔ．ら、（１９９６）「シスプラチン耐性のヒト癌細胞におけるＴ−プラスチン遺伝子の発現増大：ｍＲＮＡ差次的発現による同定（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｐｌａｓｔｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍＲＮＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ．）」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｅｒｓ ３９７：１０１〜１０７）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０）（Ｊａａｔｔｅｌａ Ｍ．（１９９９）「細胞死の回避：癌における生存タンパク質（Ｅｓｃａｐｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．）」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２４８：３０〜４３）、及び転写因子ＹＢ１（Ｆｕｊｉｔａ Ｔ．ら、（２００５）「パクリタキセルを前投与した乳癌におけるＰ−糖タンパク質の上方制御をともなう転写因子Ｙ−ボックス結合タンパク質の核局在化の増大（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｙ−ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．）」Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：８８３７〜８８４４）など各種タンパク質の過剰発現が、シスプラチン耐性に影響を及ぼすことが報告されている。さらに、解糖経路及びピルビン酸経路の悪化が、腫瘍細胞において観察される化学療法耐性現象において基本的な役割を果たすことが報告されている（Ｂｏｒｏｓ Ｌ．Ｇ．ら、（２００４）「標的化抗癌剤設計における代謝経路フラックス情報の使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｆｌｕｘ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．）」Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｔｏｄａｙ １：４３５〜４４３）。

様々な研究グループからの報告が、腫瘍細胞に対してアポトーシスを阻害する又は細胞を延命させることで腫瘍の化学療法耐性現象に寄与する一連のタンパク質の存在を示している。該タンパク質の例の１つが、細胞周期の促進、アポトーシスの阻害において中心的な役割を果たすヌクレオフォスミンタンパク質であり、癌の予後不良のマーカーと考えられている（Ｙｅ Ｋ．（２００５）「アポトーシスを調節しうる多機能的タンパク質ヌクレオフォスミン／Ｂ２３（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３， ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃａｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４：９１８〜９２３）。同様に、ＣＫ２酵素が、細胞生存及びアポトーシスに対する腫瘍細胞耐性において重要な役割を果たす（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．、Ｙｕ Ｓ．、Ｗａｎｇ Ｈ．、Ｆａｕｓｔ Ｒ．、Ｄａｖｉｓ Ａ．、Ａｈｍｅｄ Ｋ．（２００１）「腫瘍におけるタンパク質キナーゼＣＫ２シグナル（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．）」Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ． １６：５７３〜５８２）。既往の知見は、上皮充実性腫瘍において、ＣＫ２活性が、正常組織と比べて３〜７倍上昇することを明らかにしている（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．、Ｙｕ Ｓ．ら、（２００１）「腫瘍におけるタンパク質キナーゼＣＫ２シグナル（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．）」Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：５７３〜５８２；Ｆａｕｓｔ Ｒ．Ａ．、Ｇａｐａｎｙ Ｍ．ら、（１９９６）「頭部腫瘍及び頸部腫瘍のクロマチンにおけるタンパク質キナーゼＣＫ２活性の上昇：悪性形質転換との関連性（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｔｕｍｏｒｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１：３１〜３５）。さらに、ＣＫ２活性は、悪性形質転換にとって重要な細胞事象であり、腫瘍進行マーカーを構成する（Ｓｅｌｄｉｎ Ｄ．Ｃ．、Ｌｅｄｅｒ Ｐ．（１９９５）「カゼインキナーゼＩＩαトランス遺伝子誘発マウスリンパ腫：ウシにおけるタイレリア病との関連（Ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩα ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｉｌｅｒｉｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：８９４〜８９７）。ＣＫ２リン酸化が、腫瘍細胞をアポトーシスから保護するための強力なシグナルを表すという事実は、該酵素を、細胞生理における抗アポトーシス性メディエーターとみなす考えを導く（Ａｈｍｅｄ Ｋ．、Ｇｅｒｂｅｒ Ｄ．Ａ．、Ｃｏｃｈｅｔ Ｃ．（２００２）「細胞生存小集団への参入：タンパク質キナーゼＣＫ２の新たな役割（Ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｑｕａｄ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１２：２２６〜２２９；Ｔｏｒｒｅｓ Ｊ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｊ．ら、（２００３）「カスパーゼ−３による腫瘍サプレッサーＰＴＥＮのリン酸化調節開裂：タンパク質安定性及びＰＴＥＮ−タンパク質間相互作用の制御への含意（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＰＴＥＮ ｂｙ ｃａｓｐａｓｅ−３：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ＰＴＥＮ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８：３０６５２〜６０）。

以上まとめると、ＣＫ２リン酸化が、癌治療の潜在的標的を表す生化学的事象であり、該事象の特異的な阻害剤は、癌管理の見通しを与える薬剤候補物質となりうるであろう。

様々な研究グループが、以下の２つの独立した方法を用いて、ＣＫ２リン酸化を阻害するための各種戦略を展開している。ａ）ＣＫ２アルファ触媒サブユニットの直接的な阻害、ｂ）ＣＫ２基質上における酸性ドメインの直接的な標的化（特許国際公開第０３／０５４００２号及びＰｅｒｅａ Ｓ．Ｅ．ら、（２００４）「タンパク質キナーゼＣＫ２によるリン酸化を阻害する新規アポトーシス促進ペプチドの抗腫瘍効果（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：７１２７〜７１２９）。以上の方法をともに用いることで、著者らは、ＣＫ２の阻害が腫瘍細胞におけるアポトーシスをもたらす、という原理の証明を示している。これらの知見は、ＣＫ２が抗癌剤を開発するための好適な標的であることの実験的検証を裏付ける。

分子生物学の発展とともに、比較プロテオミクス研究が、細胞の悪性形質転換及び腫瘍の化学療法耐性のいずれにも関与する分子機構の理解を部分的に可能にしている。したがって、癌治療レジメンは、毒性を大幅に低減し、化学療法耐性の発生可能性をも低下させる有効な薬剤の組合せの達成に焦点を絞るべきである。こうして、癌治療における今日の主要目標の一つは、現行の細胞増殖抑制剤が示す有効用量及び内因性毒性の低減により、この種の薬剤の治療指数を上昇させることである。他の現行の戦略は、従来の細胞増殖抑制剤に対する腫瘍の化学療法耐性を回避することである。

本発明は、ＣＫ２リン酸化阻害剤（Ｐ１５ペプチド）及び薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤の２つの要素を含む薬剤の組合せを提供することで、上述の課題を解決する。

癌動物モデルにおける薬剤の組合せによる抗腫瘍効果の強化を示す図である。（Ａ）は、シスプラチン＋Ｐ１５の間の相乗作用を表し、（Ｂ）は、シクロホスファミド＋Ｐ１５の相乗作用を表し、（Ｃ）は、マイトマイシンＣ＋Ｐ１５のｉｎ ｖｉｖｏにおける相乗作用を表す。 ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰ１５ペプチドによる腫瘍の化学感作効果を示す図である。（Ａ）は、シスプラチンに対する化学療法耐性の回避を表し、（Ｂ）は、パクリタキセルに対する化学療法耐性の回避を表し、（Ｃ）は、ドキソルビシンに対する化学療法耐性の回避を表す。

本発明において、「薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤」とは、充実性腫瘍及び造血器由来の腫瘍いずれに対する癌化学療法でも用いるすべての細胞増殖抑制化合物を指す。好ましい細胞増殖抑制剤は、適切な賦形剤と混合したシスプラチン及びカルボプラチン、パクリタキセル及びドセタキセル、ビンクリスチン及びビンブラスチン、５−フルオウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、マイトマイシンＣ、イマチニブ、イレッサ、並びにベルケイド（ボルテゾミブ）である。
本発明において、「ＣＫ２リン酸化の阻害」という概念は、基質又は酵素そのもののいずれかを遮断する任意の化学的又はペプチド性化合物をも含む。状況に応じ、本薬剤の組合せの有効成分は、同時、個別、又は逐次に投与することができる。本薬剤の組合せの投与は、全身、局所、又は経口の各経路により実施することができる。本発明は、ヒトにおいて発現する不応性腫瘍における化学療法耐性を、上述の薬剤の組合せを用いて治療すること及び／又は回避することをも指す。

同様に、本発明は、化学療法不応性腫瘍を治療し、本発明において引用する細胞増殖抑制剤の抗腫瘍効果を高める薬剤を調製するために、本薬剤の組合せの成分を用いることをも指す。

実施例１（表１）は、本発明に記載する薬剤の組合せが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、相乗的な抗腫瘍効果を生じることを示す。こうして、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、マイトマイシンＣ、５−フルオウラシル、イマチニブ、又はイレッサとともに、Ｐ１５ペプチドからの最適未満用量を同時に併用することは、本発明で言及する各細胞増殖抑制剤の有効用量を１０〜１００分の１に低下させる。有効用量とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖アッセイにおいて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）とも呼ばれる、抗腫瘍効果の５０％を達する用量である。本発明では、「最適未満用量」とは、ＩＣ５０未満の用量を指す。

実施例２は、シスプラチン（図１Ａ）、シクロホスファミド（図１Ｂ）、及びマイトマイシンＣ（図１Ｃ）とともにＰ１５ペプチドを含む本薬剤の組合せを用いることにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を強化することを示す。この薬剤の組合せは、ヌードマウスに異種移植したヒト腫瘍において見られる腫瘍退縮と同様、該当の動物モデルにおいても完全な腫瘍退縮をもたらす。しかし、本薬剤の組合せの成分の使用は、単剤療法と同様に、プラセボ群で観察される効果と比べ、腫瘍成長のわずかな遅延を生じるにとどまった。

本薬剤の組合せからの成分の逐次投与は、Ｐ１５投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても腫瘍の化学療法耐性を回避することを示す。本発明において、「腫瘍の化学療法耐性の回避又は化学感作」とは、Ｐ１５ペプチドの前投与後において、抗腫瘍効果の５０％を生じるために必要な薬剤用量が低減する事象を指すと理解される。実施例３は、腫瘍細胞の化学感作におけるＰ１５ペプチド前投与の効果を示し、該前投与は、有効薬剤用量を１０〜１００分の１に低減する。同様に、表３に示すデータは、該薬剤の組合せの逐次的投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞の内因性化学療法耐性を回避することを表す。本発明においては、ＩＣ５０値が濃度１０００μＭよりも高値に達する場合を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの化学療法耐性と考える。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果と同様、Ｐ１５ペプチドの前投与は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、腫瘍の内因性化学療法耐性を回避する（実施例４）（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。

Ｐ１５ペプチド成分（アミノ酸配列ＣＷＭＳＰＲＨＬＧＴＣ）は、既に、ＣＫ２阻害剤として報告されている（Ｐｅｒｅａ Ｓ．Ｅ．ら、（２００４）「タンパク質キナーゼＣＫ２によるリン酸化を阻害する新規アポトーシス促進ペプチドの抗腫瘍効果（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：７１２７〜７１２９）。しかし、この本ペプチドは、腫瘍細胞上の一群のタンパク質を予測外に調節し（表４）、このことが、Ｐ１５ペプチドの前投与がもたらす化学感作に加え、該薬剤の組合せ中の該成分の相乗的な抗腫瘍効果を裏付け、説明する。例えば、Ｐ１５が調節するタンパク質は、腫瘍細胞増殖及びアポトーシスの制御において基本的な役割を果たし、これらの機構は、本薬剤の組合せからの残りの成分、とりわけ、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤が誘発する機構と同一ではない。

同様に、成分Ｐ１５が調節する他のタンパク質は、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤に対する腫瘍の化学療法耐性の分子的機構に関与するタンパク質である。以上の予測外の結果は、該成分を逐次的に投与する場合、本薬剤の組合せがもたらす腫瘍の化学感作の分子的基礎を構成する。

本発明の特質は、該薬剤の組合せにおける細胞増殖抑制剤の有効濃度が、該細胞増殖抑制剤を単剤で使用する場合の有効用量と比べて１０〜１００分の１に低減される事実である。この事実は、ＣＫ２阻害剤と本発明において好ましい細胞増殖抑制剤との間に相乗的な相互作用が生じることを意味する。実用的な観点からは、この相乗的相互作用は、本薬剤の組合せに基づく薬剤毒性が、単剤の細胞増殖抑制剤について観察される毒性よりもはるかに低いことを意味する。

同様に、本薬剤の組合せからの成分を逐次的に投与した後に腫瘍の化学感作が誘導されたことは、充実性腫瘍及び造血器由来の腫瘍において高頻度で観察される化学療法耐性の治療を可能とすることから、大きな利点を示す。

一般的手順：
細胞培養：Ｈ−１２５細胞系は、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から発生させ、ＳＷ９４８細胞系は、ヒト結腸癌から発生させた。いずれの細胞系とも、１０％ウシ胎仔血清及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社製）培養培地中で保存した。細胞培養液のインキュベーションは、５％ＣＯ_２中、３７℃で実施した。

細胞生死判別アッセイ：この目的のために、２０μｌのテトラゾリウム（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、各プレート上の細胞に添加した。３７℃で２時間後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。最後に、「ＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ」ソフトウェアを用いて、各用量反応曲線からＩＣ５０値を推定した。

癌動物モデル：本発明で用いる動物モデルは、ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ、ＢａｌＢＣ）へのヒト腫瘍の移植を基にした。略述すると、５×１０^６個のＨ−１２５細胞を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に懸濁させ、皮下接種した。腫瘍発現（約３０ｍｍ^３）後、本発明に記載の薬剤の組合せを用いて、投与を開始した。該薬剤の組合せの抗腫瘍効果を評価するため、腫瘍塊体積を測定し、以下の式を用いて該体積を計算した：Ｖ＝幅^２×長さ／２。

細胞抽出物上におけるタンパク質プロファイルの分析：Ｈ−１２５細胞を、本発明で記載する薬剤の組合せのＰ１５ペプチド成分により、４０分間にわたり処理するか又は非処理とした。次いで、細胞単層をＰＢＳで洗浄し、表面から細胞を廃棄した。冷ＰＢＳによるさらに２回の洗浄後、細胞ペレットを、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＧＴＡ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル中に再懸濁させ、既報（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｌ．Ｊ．ら、（２００３）「非小細胞肺癌細胞系Ｈ８２の核タンパク質の同定：銀染色タンパク質分析のための改良プロトコール（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈ８２：Ａｎ ｉｍｐｒｏｍｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２４：２３７〜２５２）に述べた通りに、核タンパク質画分を得た。Ｐ１５が調節するタンパク質を分析するために、代替法として、該当する核タンパク質抽出物を、２Ｄ二次元ゲル（ｐＨ４〜７）及び／又は質量分析器と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ナノＨＰＬＣ）により分離した。

本発明は、以下の実施例により説明される。

（実施例１）
Ｐ１５ペプチド＋従来の細胞増殖抑制剤の併用の相乗効果
以下の実験条件において、各種細胞増殖抑制剤と併用したＰ１５ペプチド成分の抗腫瘍相乗効果を評価した。Ｈ−１２５細胞を９６ウェルプレートに播種し、各プレートに１０及び５０μＭでＰ１５ペプチドを添加した。同時に、本発明において好ましい各細胞増殖抑制剤を、１〜２０００ｎＭの範囲の用量で添加し、同じ条件下で７２時間インキュベーションを続けた。最後に、本発明に上述した通りに、細胞生死判別及びＩＣ５０値を判定した。表１に示した結果は、１０又は５０μＭで該成分Ｐ１５を同時に併用すると、各細胞増殖抑制剤のＩＣ５０値が、１０〜１００分の１に低下することを示す。以上の結果は、Ｐ１５ペプチド及び本発明における成分として好ましい細胞増殖抑制剤を含む薬剤の組合せによる抗腫瘍効果の強化を明白に示す。

表１．この薬剤の組合せの成分の同時投与による相乗的な抗腫瘍相互作用

（実施例２）
癌動物モデルにおける薬剤の組合せによる抗腫瘍効果の強化
この目的のため、５×１０^６個のＨ−１２５腫瘍細胞を、本発明において前述した通りに、６〜８週齢のＢａｌＢＣヌードマウスに移植した。腫瘍発現後、薬剤の組合せの成分を以下の通りに投与した。生理食塩溶液中のＰ１５ペプチドを、０．５ｍｇ／ｋｇ／日で５日間、腹膜内投与した。同時に、シスプラチン（図１Ａ）、又はシクロホスファミド（図１Ｂ）、又はマイトマイシンＣ（図１Ｃ）の腹膜内注射を、１ｍｇ／ｋｇ／日で同頻度により実施した。細胞増殖抑制剤も、生理食塩溶液中に溶解させた。腫瘍体積は、本発明において前述した様に記録した。図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃに示す結果は、成分を同時に投与すると、該薬剤の組合せが抗腫瘍効果を強化することを示し、この強化は完全な腫瘍退縮により観察された。これとは別に、成分を単剤療法として投与すると、プラセボ群に対してわずかな抗腫瘍効果が観察されるのみであった。こうして、本発明者らは、さらに、優れた前臨床癌モデルにおいて、本薬剤の組合せの成分間における相乗的相互作用を示す。

（実施例３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける化学療法耐性の回避におけるＰ１５ペプチドの効果
本アッセイにおいて、本発明者らは、成分を逐次的に投与する場合の、化学療法耐性現象の回避における該薬剤の組合せの効果を評価した。この目的のため、９６ウェルプレートに２０００個／ウェルでＨ−１２５細胞を播種し、２４時間後に２０μＭのＰ１５ペプチドを添加した。Ｐ１５ペプチド成分による１６時間のインキュベーション後、細胞単層を生理食塩溶液により２回洗浄した。最後に、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤を、１〜２０００ｎＭの範囲の濃度で添加し、７２時間インキュベーションを続けた。該終了時に、本発明において前述した通りに、各細胞増殖抑制剤につき細胞生死判別及びＩＣ５０値を判定した。表２に示した結果は、Ｐ１５ペプチド成分による腫瘍細胞の前処理が、本発明において好ましい各細胞増殖抑制剤に対するこれら細胞の感受性を増大させることを示す。さらに、本発明者らは、細胞増殖抑制剤の効果に対して内因的に耐性である、ＳＷ９４８細胞に対するＰ１５前処理の効果を評価した。結果は、Ｐ１５ペプチド成分が、内因性の薬剤不応性腫瘍細胞をも、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤に感受性である細胞に転換することを示した（表３）。

本発明者らのデータは、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤に対して、Ｐ１５ペプチド成分を逐次的に投与すると、該薬剤の抗腫瘍効果に対する腫瘍細胞の感作を生じることを示す。

表２．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける本薬剤の組合せの成分の逐次的投与による化学感作

表３．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける本薬剤の組合せの成分の逐次的投与による内因性薬剤不応性腫瘍細胞に対する化学感作

本発明で用いる腫瘍細胞において観察される薬剤調節タンパク質プロファイルが、Ｐ１５ペプチド成分の化学感作に対する効果をさらに確認する。この目的のため、Ｐ１５ペプチド成分で処理した又は非処理のＨ−１２５細胞由来の核タンパク質抽出物を、本発明において前述した通りに分析した。表４は、Ｐ１５ペプチド成分により既知の機能ゆえに調節される一群のタンパク質を示す。この結果は、本発明の薬剤の組合せにおいてこのペプチドがもたらす、腫瘍の化学感作の分子的基礎を裏付ける。

表４．Ｐ１５が調節するタンパク質のプロファイル

（実施例４）
Ｐ１５ペプチド成分がもたらすｉｎ ｖｉｖｏにおける化学感作
この目的のため、本発明において前述した通りに、５×１０^６個のＳＷ９４８細胞をヌードマウスに移植した。腫瘍発現後、薬剤の組合せの成分を以下の通りに逐次的に投与した。まず、Ｐ１５ペプチド成分を、０．５ｍｇ／ｋｇ／日で５日間、腹膜内投与した。次いで、シスプラチン（図２Ａ）、パクリタキセル（図２Ｂ）、及びドキソルビシン（図２Ｃ）を、５ｍｇ／ｋｇ／日でさらに５日間投与した。本実施例の結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰ１５前処理が、化学療法不応性の腫瘍表現形を転換して、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤に対して応答性としうることを示す。以上の知見は、成分を逐次的に投与するとき、本発明における薬剤の組合せが、高頻度で観察される内因性腫瘍耐性を回避できるという証拠をも提示する。

（実施例４）
Ｐ１５ペプチド成分がもたらすｉｎ ｖｉｖｏにおける化学感作
この目的のため、本発明において前述した通りに、５×１０^６個のＳＷ９４８細胞をヌードマウスに移植した。腫瘍発現後、薬剤の組合せの成分を以下の通りに逐次的に投与した。まず、Ｐ１５ペプチド成分を、０．５ｍｇ／ｋｇ／日で５日間、腹膜内投与した。次いで、シスプラチン（図２Ａ）、パクリタキセル（図２Ｂ）、及びドキソルビシン（図２Ｃ）を、５ｍｇ／ｋｇ／日でさらに５日間投与した。本実施例の結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰ１５前処理が、化学療法不応性の腫瘍表現形を転換して、本発明において好ましい細胞増殖抑制剤に対して応答性としうることを示す。以上の知見は、成分を逐次的に投与するとき、本発明における薬剤の組合せが、高頻度で観察される内因性腫瘍耐性を回避できるという証拠をも提示する。

（参照事項）
本発明は以下の態様も包含する。
［１］
適切な賦形剤と混合して、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤とともに、ＣＫ２リン酸化阻害剤を含む、同時、個別、又は逐次投与するための薬剤の組合せ。
［２］
ＣＫ２リン酸化阻害剤が、Ｐ１５ペプチド（ＣＷＭＳＰＲＨＬＧＴＣ）である、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［３］
細胞増殖抑制剤が、白金化合物、タキソール、及びツルニチニチソウ属由来のアルカロイドに属する化合物である、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［４］
シスプラチン及びカルボプラチンである、［３］に記載の薬剤の組合せ。
［５］
細胞増殖抑制剤が、パクリタキセル及びドセタキセルである、［３］に記載の薬剤の組合せ。
［６］
細胞増殖抑制剤が、ビンクリスチン及びビンブラスチンである、［３］に記載の薬剤の組合せ。
［７］
細胞増殖抑制剤が、５−フルオウラシルである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［８］
細胞増殖抑制剤が、ドキソルビシンである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［９］
細胞増殖抑制剤が、シクロホスファミドである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［１０］
細胞増殖抑制剤が、マイトマイシンＣである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［１１］
細胞増殖抑制剤が、ベルケイド（ボルテゾミブ）である、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［１２］
細胞増殖抑制剤が、イレッサである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［１３］
細胞増殖抑制剤が、イマチニブである、［１］に記載の薬剤の組合せ。
［１４］
薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤に対する充実性腫瘍及び造血系腫瘍の化学療法耐性を回避するための、［１］から［１１］までに記載の薬剤の組合せの使用であって、該薬剤の組合せの成分が同時、個別、又は逐次に投与される上記使用。
［１５］
ＣＫ２リン酸化阻害剤が、酵素又は各基質のいずれかを遮断する化合物又はペプチドである、［１］から［１３］までに記載の薬剤の組合せの使用。
［１６］
ＣＫ２リン酸化阻害剤が、ＤＮＡベクター内で発現する、［１］から［１３］までに記載の薬剤の組合せの使用。
［１７］
癌治療薬を調製するための、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤と併せた、ＣＫ２リン酸化阻害剤の使用。
［１８］
細胞増殖抑制剤に対して化学療法耐性の腫瘍の治療薬を調製するための、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤と併せた、ＣＫ２リン酸化阻害剤の使用。

Claims (18)

1. 適切な賦形剤と混合して、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤とともに、ＣＫ２リン酸化阻害剤を含む、同時、個別、又は逐次投与するための薬剤の組合せ。
2. ＣＫ２リン酸化阻害剤が、Ｐ１５ペプチド（ＣＷＭＳＰＲＨＬＧＴＣ）である、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
3. 細胞増殖抑制剤が、白金化合物、タキソール、及びツルニチニチソウ属由来のアルカロイドに属する化合物である、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
4. シスプラチン及びカルボプラチンである、請求項３に記載の薬剤の組合せ。
5. 細胞増殖抑制剤が、パクリタキセル及びドセタキセルである、請求項３に記載の薬剤の組合せ。
6. 細胞増殖抑制剤が、ビンクリスチン及びビンブラスチンである、請求項３に記載の薬剤の組合せ。
7. 細胞増殖抑制剤が、５−フルオウラシルである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
8. 細胞増殖抑制剤が、ドキソルビシンである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
9. 細胞増殖抑制剤が、シクロホスファミドである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
10. 細胞増殖抑制剤が、マイトマイシンＣである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
11. 細胞増殖抑制剤が、ベルケイド（ボルテゾミブ）である、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
12. 細胞増殖抑制剤が、イレッサである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
13. 細胞増殖抑制剤が、イマチニブである、請求項１に記載の薬剤の組合せ。
14. 薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤に対する充実性腫瘍及び造血系腫瘍の化学療法耐性を回避するための、請求項１から１１までに記載の薬剤の組合せの使用であって、該薬剤の組合せの成分が同時、個別、又は逐次に投与される上記使用。
15. ＣＫ２リン酸化阻害剤が、酵素又は各基質のいずれかを遮断する化合物又はペプチドである、請求項１から１３までに記載の薬剤の組合せの使用。
16. ＣＫ２リン酸化阻害剤が、ＤＮＡベクター内で発現する、請求項１から１３までに記載の薬剤の組合せの使用。
17. 癌治療薬を調製するための、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤と併せた、ＣＫ２リン酸化阻害剤の使用。
18. 細胞増殖抑制剤に対して化学療法耐性の腫瘍の治療薬を調製するための、薬剤として許容できる細胞増殖抑制剤と併せた、ＣＫ２リン酸化阻害剤の使用。