KR101937279B1 - 고형 종양의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

세포 투과성 철 킬레이트제는 선택적으로는 자가포식 저해제와 함께, 고형암 종양 환자를 치료하는 데 사용된다. 바람직한 킬레이트제는 알킬 치환된 N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진이다. 바람직한 자가포식 저해제는 클로로퀸이다. 또한, 철 킬레이트제, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 선택적으로는 자가포식 저해제를 포함하는 약학 조성물; 및 철 킬레이트제, 또는 철 킬레이트제와 자가포식 저해제의 조합을 암을 공격하기에 유효한 양(들)으로 투여함으로써 암을 치료하는 방법이 개시되어 있다.

Description

고형 종양의 치료 방법{TREATMENT OF SOLID TUMOURS}
본 발명은 암 환자에서 고형 종양, 특히 파종성 고형 종양의 치료, 및 이러한 치료를 위한 수단에 관한 것이다.
파종성 암에 걸린 환자를 위한 새롭고 효과적인 항암제의 개발이 필요하다. 고형 종양용 약물 개발에는, 실험용 시험관내 시스템에서는 모방하기 어려울 수 있는 3-D 종양 조직에서의 복잡한 생물물리학적 및 대사적 상황으로 인한 특정한 무제들이 연루되어 있다. 저산소증 및 제한적인 영양분의 확산이 종래의 항암제 및 방사선 치료에 대한 무반응(quiescence) 및 내성을 야기하는 것으로 알려져 있다. 아울러, 항암제는 종양 실질(tumor parenchyme)에 침투해 독성 농도로 암 세포에 도달할 수 있어야 한다. 고형 종양의 치료에 임상적으로 사용되는 일부 약물들은 3-D 종양 덩어리 내로 잘 침투되지 않는데, 이것이 이들의 효능 한계의 한 가지 이유일 수 있다 (1). 다세포 구상체(multicellular spheroids; MCS)는 2-D 단층 배양물보다 인간 고형 종양을 더 잘 모방하며 (2-4), 임상적으로 사용되는 많은 약물들은 MCS로서 배양한 암 세포에 대해 제한적인 잠재력을 나타낸다 (5, 6). 따라서, MCS는 고형 종양에 활성인 약물을 스크리닝하는 데 있어, 단층 배양물보다 더 적합하다.
세포 사멸은 대개 세포자살 (I형), 자가포식성 세포 사멸 (II형) 및 괴사 (III형)인 3가지 유형의 세포 사멸로 나누어진다. 세포자살은 케스파제의 활성화에 의해 매개된다. 자가포식은 오래된 세포성 단백질 및 손상된 세포 소기관을 분해하기 위한 진화적으로 보존된 메커니즘이다. 자가포식소체(autophagosome)의 형성은 자가포식의 주 특징이다. 자가포식소체 형성은 III형 포스파티딜이노시톨-3-키나제의 활성화를 필요로 하며, 또한 2가지 유비퀴틴-유사 접합 시스템 (Atg-Atg12 및 Atg8)에 의존적이다 (7). 자가포식은 영양분이 부족한 상태에서 세포를 보호하고, 자가포식이 저해되는 경우 세포는 세포자살을 수행한다 (8-10). 또한, 자가포식의 형태적 특징은 케스파제 저해 조건 하에 세포 사멸이 진행되는 동안에 관찰된 바 있다 (11).
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본 발명에 따르면, 선택적으로는 자가포식 저해제와 함께, 고형암 종양 환자를 치료하기 위한 세포 투과성 철 킬레이트제의 용도가 개시된다.
본 발명에 따르면, 암 환자에서 고형 종양을 치료하기 위한, 하기 화학식 I의 N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도가 개시된다:
Figure 112013094198694-pct00001
(상기 식에서, R은 H 또는 메틸이고, R1은 H 또는 C1-C4 알킬이며, R2는 H 또는 C1-C4 알킬임).
본 출원에서, 화학식 I의 화합물은 이의 임의의 약학적으로 적합한 염 또는 복합체 또는 전구약물(prodrug)을 포함하는 것으로 의도된다.
특히 바람직하게는 R이 메틸이다. 바람직하게는, R 및 R1 둘 다가 메틸이다.
바람직하게는 R1이 메틸, 특히 6-메틸 또는 8-메틸이다.
본 발명의 바람직한 화합물에서, N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진은 하기와 같이 치환된다:
R은 R1은 R2는
메틸 8-메틸 H
메틸 H H
메틸 6-메틸 H
H 6-메틸 H
H 8-메틸 CH3.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, R1이 C1-C4 알킬인 화학식 I의 화합물은 R1에 의해 치환되지 않은 테트라아자플루오레닐 모이어티(moiety)의 6, 7, 또는 8 중 한 위치에서 C1-C4 알킬에 의해 추가로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 본 발명의 화합물 및 약학 담체를 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구와 같은 적절한 경로로 투여될 수 있다. 적합한 담체는 다이메틸 설폭사이드와 물을 포함하는 혼합물과 같이, 다이메틸 설폭사이드 및 수성 매질을 포함한다. 바람직한 유체 담체는 본 발명의 화합물을 용해시킬 수 있는 것들이다. 다른 바람직한 유체 담체들, 특히 수성 담체들은 본 발명의 화합물을 예컨대 크기가 10 ㎛ 이하인 미세입자(microparticle)의 형태와 같이 미세하게 분산된 형태로 포함하는 것들이다.
본 발명의 다른 바람직한 측면에 따라, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 약리학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 고형암 환자를 치료하는 방법을 개시한다. 상기 약리학적 유효량은 바람직하게는 본 발명의 약학 조성물에 포함되어 투여된다.
본 발명의 화합물은 세포 투과성 철 킬레이트제이다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 본 발명의 화합물의 항암 효과가 철-킬레이트화 특성에 기인한 것으로 생각한다.
본 발명의 특히 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 화합물과 같은 철 킬레이트제의 항종양 효능은 자가포식 저해제에 의해 증강된다. 바람직한 자가포식 저해제는 클로로퀸(chloroquine)이다. 이러한 측면에서, 고형 종양의 치료에 대한 자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제의 조합 사용을 개시한다. "조합 사용"이란, 자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제를 동시에 또는 1일 이내 및 심지어 1주 이내와 같이 가까운 시일 내에 투여하는 것으로 이해된다. 자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제는 이들을 포함하는 약학 조성물의 형태로 또는 개별 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약학 조성물 형태로 투여되는 경우, 상기 조합은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제의 조합에서, 상기 세포 투과성 철 킬레이트제는, 암 환자에서 고형 종양을 치료하기 위한, 바람직하게는 화학식 I (상기 식에서, R은 H 또는 메틸이고, R1은 H 또는 C1-C4 알킬임)의 N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된다. 특히 바람직하게는 R이 메틸이다. 바람직하게는, R 및 R1 둘 다가 메틸이다. 바람직하게는, R1이 메틸, 특히 6-메틸 또는 8-메틸이다.
조합 사용되는 본 발명의 바람직한 철 킬레이트화 화합물은 하기 화학식 I의 N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진을 포함한다:
R은 R1은 R2는 하기로도 규정됨
메틸 8-메틸 H 특히 바람직하게는 CB21
메틸 H H 바람직하게는
메틸 6-메틸 H 바람직하게는
H 6-메틸 H 바람직하게는
H 8-메틸 메틸 바람직하게는
Figure 112013094198694-pct00002
본 발명의 자가포식 저해제와 조합 사용되는 다른 철 킬레이트화 화합물로는 데페록사민(deferoxamine), 데페리프론(deferiprone), 및 데페라시록스(deferasirox)가 포함된다.
자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제의 조합에서, 상기 자가포식 저해제는 바람직하게는 클로로퀸으로부터 선택된다. 다른 바람직한 자가포식 저해제는 하이드록시클로로퀸, 3-메틸아데닌, 아데노신, 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보사이드, 워트마닌(wortmannin), 및 빈블라스틴을 포함한다.
본 발명에 사용되는 다른 자가포식 저해제는 WO 2011/011522 A2에 개시된 하기 화학식 II의 화합물이며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다:
Figure 112013094198694-pct00003
.
또한, 본 발명에 따라, 본 발명의 자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제의 조합을 동시에 또는 1일 또는 1주 이내와 같이 가까운 시일 내에 환자에게 약리학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법을 개시한다. 투여는, 하나는 자가포식 저해제, 및 다이메틸 설폭사이드와 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 개별 약학 조합물 형태, 또는 동시에 투여되는 경우 다이메틸 설폭사이드와 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 단일 약학 조합물 형태로, 비경구 또는 경구와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 보다 더 바람직한 측면에 따라, 자가포식 저해제와 세포 투과성 철 킬레이트제의 조합을 약리학적 유효량으로, 동시에 또는 1시간, 1일 또는 1주 이내와 같이 가까운 시일 내에 투여하는 단계를 포함하는, 고형암 환자의 치료 방법을 개시한다. 투여는 바람직하게는 전술한 약학 조성물(들) 형태로, 비경구 또는 경구 또는 다른 적합한 경로에 의해 이루어진다.
이에, 본 발명은 다수 도면들로 구성된 도면에 예시된 바람직한 다수의 실시 양태를 참조로 하여 더 상세히 설명될 것이다.
도 1은 FaDu 두경부암종(head-neck carcinoma) 이종이식편(xenograft)에 대한, CB21의 생체내 활성을 나타낸 것이다. FaDu 종양을 가진 SCID 마우스에 CB21 mg/kg을 처리하고, 종양 부피를 계산하였다.
도 2a 내지 도 2h는, HCT116 MCS에 대한 N-(1-피리딘-2-일-에틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-8-메틸-플루오렌-2-일)-하이드라진 (하기에서, "CB21"로 나타냄)의 세포독성 및 세포독성 효과의 치료 범위(therapeutic window)를 나타낸 것이다. 도 2a: CB21로 처리한 MCS에서의 형태 및 케스파제-3 유도. HCT116 MCS에 6 μM CB21을 6시간 동안 처리한 다음, 약물-무첨가 배지로 교환하여 추가로 인큐베이션하였다. MCS를 섹션화(section)하고, 활성 케스파제-3로 염색하였다. 도 2b: 지정된 화합물로 처리한 세포의 클론원성 생장(Clonogenic outgrowth). 도 2c: CB21의 존재 또는 부재 하에서의 단층 HCT116 세포의 증식. 세포는 96웰 플레이트에 웰 당 7,000개의 세포로 접종하고, 3 μM, 6 μM 및 12.5 μM로 CB21을 처리하였다. 도 2d: 6 μM CB21의 첨가 후 24시간째에 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘)의 단층 HCT116 세포로의 병합(incorporation). 세포를 EdU와 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 고정한 다음, ArrayScan으로 분석하였다. 도 2e: 도 2d에서 나타낸 실험에서의 EdU 신호의 정량화. 도 2f: CB21의 존재 또는 부재 하에서의 단층 hTERTRPE1 세포의 증식. 세포는 96웰 플레이트에 웰 당 7,000개의 세포로 접종하고, 3 μM, 6 μM 및 12.5 μM로 CB21을 처리하였다. 도 2g: CB21은 컨플루언트(confluent) hTERTRPE1 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는다. CB21의 존재 또는 부재 하에, 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 7,000개 또는 70,000개로 접종하였다. 도 2h: 6 μM의 CB21에 노출한 후, HCT116 및 hTERTRPE1 세포의 형태.
도 3a 내지 도 3e는, CB21이 강력한 철 킬레이트제임을 나타낸 것이다. 도 3a: 연결 지도 (Connectivity Map; Cmap) 데이터베이스에 따른 스코어. 도 3b: 염화철의 존재 또는 부재 하에 6 μM CB21로 처리한 세포의 생존율. 좌측: HCT116 세포; 우측 HCT116 p53-/- 세포. 도 3c: 여러 가지 철 킬레이트제로 처리한 HCT116 세포의 생존율. 도 3d: CB21과 관련된 구조를 가진 7가지의 화합물로 처리한 HCT116 세포의 생존율. 도 3e: CB21이 MCS 생존율을 저하하는 일련의 관련 화합물들 중에서 가장 효과적이다.
도 4a 내지 도 4f는, CB21 및 다른 철 킬레이트제에 의한 자가포식의 유도를 나타낸 것이다. 도 4a: 6 μM CB21에 6시간 노출한 후 약물-무첨가 배지에 추가로 42시간 또는 90시간 노출한 단층 HCT116 세포의 형태. 도 4b: CB21-처리한 세포를 LC3에 대한 항체로 염색. 도 4c: 단층 및 MCS HCT116에서 CB21에 의한 LC3-I 및 LC3-II 단백질의 유도. 세포를 6시간 (6 μM) 동안 처리한 다음, 추가로 인큐베이션하였다. 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 도 4d: 단층 및 MCS hTERTRPE1 세포에서 CB21에 의한 LC3-I 및 LC3-II 단백질의 유도. 도 4e: 여러 가지 철 킬레이트제에 의한 LC3-I 및 LC3-II의 유도. 세포를 VLX50 (50 μM); 데페라시록스 (60 μM), 데페록사민 (200 μM), 시클로피록솔라민(ciclopiroxolamine) (15 μM), CB21 (5 μM), 라파마이신 (0.1 μM), NVP-BEZ235 (0.2 μM)로 처리하였다. 도 4f: 주변 및 코어(core) 세포의 형태를 전자 현미경으로 확인하였다. MCS를 6 μM CB21로 6시간 동안 처리하고, 지정된 시간 동안 약물-무첨가 배지에서 더 인큐베이션한 다음, 섹션화하였다. CB21 처리를 한 지 24시간째에 미토콘드리아가 팽창된 모습에 주지한다.
도 5a 내지 도 5f는, CB21-유발성(CB21-induced) 자가포식의 저해가 CB21-세포독성을 증가시킴을 나타낸 것이다. 도 5a: HCT116 단층 세포를 6 μM CB21 및/또는 10 μM 3-MA로 처리하고, 48시간 후에 세포 생존율을 측정하였다. 도 5b: HCT116 단층 세포를 Beclin/Atg6에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염시켰다. 24시간 후, 지정된 바와 같이, 세포에 6 μM CB21을 처리하였다. 도 5c: 바필로마이신 A (10 μM)는 CB21-처리 세포에서 LC3 양성 소낭의 형성을 저해한다. 지정된 시간에 약물 처리를 한 후, 세포를 고정하고, LC3에 대해 염색하였다. 도 5d: 바필로마이신 A는 CB21의 세포독성을 증가시킨다. 세포를 6 μM CB21 및/또는 10 μM 바필로마이신 A를 처리하고, 지정된 시간에 세포의 사진을 찍었다. 도 5e: 클로로퀸은 단층 배양에서 CB21의 세포독성을 증가시킨다. HCT116 세포에 6 μM CB21 및/또는 10 μM 클로로퀸을 처리하였다. 배양 컨플루언시(culture confluency)를 계산하여 세포 증식을 모니터링하였다. 도 5f: 클로로퀸은 MCS 배양물에서 CB21의 세포독성을 증가시킨다. 산 포스파타제 시험을 이용해 세포 생존율을 측정하였다. 생존한 세포를 포함하지 않는 (일반적으로 약 30%) HCT116 MCS 배양물에서 산 포스파타제 활성의 백그라운드 수준을 관찰하였으며, 이는 아마도 효소 트래핑(enzyme trapping)에 의한 것임을 주지한다.
도 6a 내지 도 6e는, CB21이 p53 및 저산소증 반응을 유도함을 나타낸 것이다. 도 6a: CB21에 의해 유도된 유전자 발현 프로파일을 Affymetrix 마이크로어레이로 분석하였으며, 저산소증, p53 네트워크 및 체세포분열과 연관된 유전자들을 나타낸 것이다. 도 6b: 웨스턴 블로팅에 의한 p53 및 HIF-1a의 분석. HCT116 세포에 6 μM CB21을 지정된 시간 동안 처리하였다. 도 6c: CB21에 의한 HIF-1a-프로모터 드라이버 GFP 리포터의 유도. 도 6d: HCT116 및 hTERT-RPE1 세포에서 CB21에 의한 BNIP3의 유도. 도 6e: BNIP3의 넉다운은 CB21-유도 세포 사멸에 영향을 미치지 않는다. HCT116 세포에 BNIP3에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA를 형질감염시킨 후, 24시간 후에 6.25 μM CB21로 처리하였다. 산 포스파타제 분석법을 이용해 48시간 후에 생존율을 측정하였다.
도 7a 내지 도7d는, CB21이 호흡을 감소시키고 mTOR을 저해함을 나타낸 것이다. 도 7a: 포도당 수송에 대한 영향. 도 7b: CB21은 산소 소모량을 감소시킨다. 도 7c: CB21은 HCT116 MCS에서 저산소증을 감소시킨다. HCT116 MCS를 지정된 바와 같이 처리하고, 피모니다졸 면역조직화학법(pimonidazole immunohistochemistry)을 시행하였다. 피모니다졸 부가물에 대해 양성으로 염색되는 영역을 CB21이 감소시킴에 주지한다 (< 10mm Hg O2). 도 7d: CB21은 4EBP1의 인산화를 저해한다. HCT116 세포에 CB21을 지정된 시간 동안 처리하고, 단백질 추출물로 웨스턴 블로팅을 시행하였다. 4EBP1 인산화의 감소 및 AKT 인산화의 유도를 주지해야 한다.
도 8a 내지 도 8c는, CB21 세포독성이 포도당 결핍(glucose starvation)에 의해 강화됨을 나타낸 것이다. 도 8a: 포도당의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 인큐베이션한 후, HCT116 MCS의 형태. 도 8b: 포도당-함유 또는 포도당-무첨가 배지에서 HCT116 단층 세포에 여러 가지 농도로 CB21을 처리하였다. 케스파제-절단된 K18의 농도를 M30 CytoDeath ELISA를 이용해 측정하였다. 도 8c: HCT116 단층 세포를 도 8b에서와 같이 처리하였다. 산 포스파타제 분석법을 이용해 생존율을 측정하였다.
재료 및 방법
본 발명의 화합물을 화합물 라이브러리에서 입수하였다. 이들은 WO 02/089809와 같은 문헌에서 기술된 방법 또는 이들의 비-발명적인 변형에 따라 제조할 수 있다. 상기 화합물을 DMSO에서 용해시켰다. 세포 배양물에서 최종 농도는 0.5% DMSO였다.
세포 배양, MCS 의 생성 및 스크리닝. HCT116 대장암종 세포를 McCoy's 5A 변형 배지(McCoy's 5A modified medium)/10% 태아 소 혈청에서 37℃ 5% CO2에서 유지시켰다. 전술한 방법을 변형하여 MCS를 제조하였다 (12). 10,000개 세포를 포함하는 세포 현탁액 (200 ㎕)을 폴리-HEMA로 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 다음, 추가로 170 ㎕의 배지를 첨가하여 상기 웰을 가득 채워서 볼록 곡률 계면(convex surface curvature)을 수득하였다. Plasticine 스페이서 (3 mm)를 각 플레이트의 코너에 위치시켜, 뚜껑이 상기 배지에 닿지 않게 하였다. 그런 다음, 상기 플레이트를 뒤집어서, 세포가 액체/공기 계면으로 침강되게 하고, 부드럽게 흔들면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 지 24시간 후에, 상기 플레이트를 다시 정상대로 돌려놓았다. 먼저, 흡입에 의해 과량의 배지를 제거한 다음, plasticine 스페이서를 제거하였다. 상기 플레이트를 4일 동안 인큐베이션한 후, 약물을 처리하였다. 약물 처리 후 24시간째에, NP40을 배양 배지에 0.1%의 농도로 첨가하여, MCS로부터 케스파제-절단된 K18을 추출하고, 사멸한 세포로부터 배지로 방출된 물질을 포함시켰다. 25 mL 배지/추출물을 사용하고 M30 CytoDeath ELISA 분석법 (시험관내 용도용으로 개발된 M30-Apoptosense® ELISA (13)의 변형 (Peviva AB, Bromma, Sweden))을 이용해 케스파제 절단된 케라틴-18 (K18-Asp396)을 측정하였다.
Friedrich 등 (14)에 의해 기술된 산 포스파타제(APH) 방법에 의해 생존율을 측정하였다. 백그라운드 활성을 제하였다(subtract).
hTERT-RPE1 세포는 Mountain View, CA 소재의 Clontech Laboratories사에서 입수하였다. hTERT-RPE1은 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 안정하게 발현하고 있는 불멸화된 인간 망막 상피 세포주이다.
DNA 합성 조사. 형광 현미경 ArrayScan V HCS 시스템 (Cellomics Inc., Pittsburgh, PA, USA)을 이용해, EdU 병합을 측정하였다. 시험 화합물을 첨가하기 전에, HCT116 세포를 96-웰 플레이트 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA, USA)에 접종하고, 밤새 부착되도록 방치하였다. 세포에 CB21 또는 비히클 대조군을 24시간 동안 처리하였다. Click-iT EdU HCS 분석법 (C10354, Invitrogen, Molecular Probes Inc, OR, USA)을 제조업체의 지시에 따라 이용하여 세포를 염색하였다. 처리한 플레이트를 ArrayScan에 로딩하고 분석하였다. 10X 대물렌즈가 있는 적합한 필터를 이용해 각 형광 채널에 대한 이미지를 수득하고, 각 웰에서 1000개 이상의 세포를 분석하였다. BdU 채널에서의 평균 총 강도를 측정하였다. 결과는 2개의 독립적인 실험의 평균으로서 나타내고, 각각은 2개의 중복 웰에서 수행하였으며, 평균±SD와 같이 나타낸다.
면역학적 분석법. 96웰 플레이트에서 행잉 드롭 방법(hanging drop method)에 의해 형성시킨 MCS를 파라포름알데하이드로 고정하고, 탈수하고, 파라핀에 포매한 다음, 섹션화하였다. 각 샘플에는 32 MCS를 포함시켰다 (각각의 96웰 플레이트로부터의 MCS를 3개의 군으로 풀링(pooling)하였음). 상기 섹션들을 자일렌을 이용해 탈파라핀화하고, 함수시키고, 전자레인지에서 처리한 다음, 1% (중량/부피) 소 혈청 알부민 중에 희석시킨 단일클론 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고, 표준 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체 기술 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 의해 가시화하였다. Mayer's 헤마톡실린을 이용해 대조염색(counterstaining)을 수행하였다. (핵 증식-관련 항원 Ki67에 대한) 항체 MIB-1은 Marseille, France 소재의 Immunotech SA 사로부터 입수하여 1:150의 희석 비율로 사용하였으며; 활성 케스파제-3에 대한 항체는 Pharmingen 사에서 입수하여 1:50의 희석 비율로 사용하였다.
웨스턴 블로팅 . 세포 추출 단백질을 트리스-아세테이트 PAGE 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 해리시키고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼다. 상기 막들을 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고, 세정한 다음, HRP-접합된 항-래빗 Ig (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 퍼옥시다아제 활성은 SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 발색시켰다.
연결 지도( Connectivity Map ). 연결 지도(CMAP) (www.broad.mit.edu/ cmap) 빌드(build) 02는, 1300개의 화합물에 대한 게놈-와이드 발현 데이터를 포함한다 (복제물, 서로 다른 투여량 및 세포주를 비롯하여 6100가지 경우). Lamb 등 (15)에 의해 기술된 바와 같이 MCF-7 유방암 세포를 이용하여 본래의 프로토콜대로 수행하였다. 세포를 웰 당 0.4 x 106개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 평판배양하고, 부착될 수 있게 24시간 동안 방치한 다음, NSC76022, NSC620358 또는 NSC647889에 10 μM의 최종 농도로 노출시키거나 또는 비히클 대조군(DMSO)에 노출시켰다. 6시간 처리한 후, 상기 세포들을 PBS로 세정하였다. 총 RNA를 RNeasy miniprep 키트 (Qiagen, Chatsworth, CA,)를 이용해 제조하였다. 총 RNA 2 ㎍에서 시작하여, GeneChip Expression Analysis Technical Manual (Rev. 5, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)에 따라 Genome U133 Plus 2.0 Arrays를 이용해 유전자 발현 분석을 수행하였다. MAS5 (Affymetrix)를 이용해 원 데이터(raw data)를 정규화(normalization)하고, 약물 처리한 세포 대(vs) 비히클 대조군 세포에 대한 유전자 발현 비율을 계산하여, 조절된 유전자들의 목록을 만들었다. 필터 기준(filter criteria)은 처리한 세포주에 있는 모든 유전자를 대상으로 하고, 발현 컷오프(expression cut-off)는 임의 발현 단위(arbitrary expression unit) 100 이상으로 하였다. CMAP 상용성을 이유로, HG U133A 상에 존재하는 프로브만 사용하였다. 랭킹된 화합물 목록을 검색하기 위해, 각 화합물에 대한 최대 40개의 상향 및 하향조절된 유전자 (즉, 프로브)를 CMAP에 업로드하고, CMAP 데이터베이스에 있는 6100개와 비교하였다.
산소 소모량. 기술된 바와 같이, 호흡률을 측정하였다 (16). 로테논 (2 mM), 말레이트+피루베이트 (각각 5 mM) 및 TMPD (0.5 mM) + 아스코르베이트 (1 mM)의 존재 하에, 숙시네이트 (5 mM)를 미토콘드리아의 기질로서 사용하였다. 산소 소모량의 변화를 산소 전극(oxygen electrode) (Hansatech Instruments, Norfolk, UK)을 이용해 모니터링하고, OxygraphPlus 소프트웨어 (Hansatech Instruments, Norfolk, UK)를 이용해 분석하였다. 세포에서의 기본 V4 호흡률을, ADP의 미토콘드리아 내로의 도입을 차단하는 1 M 아트락타일로사이드(atractyloside)의 존재 하에 조사하였다.
마우스 이종이식편의 처치. SCID 마우스에서 HCT116 종양의 크기가 200 ㎣로 자랐을 때, 상기 마우스에 약물을 복강내로 주사한 다음, 종양 크기를 매일 측정하였다.
실시예 1. 본 발명의 화합물은 세포자살을 유도하고, MCS 의 생존율을 감소시킨다.
MCS에 CB21을 6시간 동안 처리한 후, 약물-무첨가 배지에서 96시간 동안 인큐베이션하면, MCS의 중심 영역이 괴사하면서 그 크기가 점점 작아졌다 (도 2a). 케스파제-3 유도는 NSC647889에 비해 중간 정도였다. 주목할 만하게도, MCS에 CB21을 6시간 동안 처리하면, 클론원성이 <5%로 감소하였다 (도 2b). 클론원성의 감소 정도는 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan) 및 독소루비신(doxorubicin)에서 관찰된 것보다 더 컸다 (5 μM 내지 10 μM 농도를 사용하였음에도; 단층 배양물에서 이들 화합물의 IC50은 >10배였음). 단층 HCT116 세포에 CB21을 처리하면, 0시간 내지 24시간 사이에 세포수가 약간 증가한 다음, 세포 소실이 발생하였다 (도 2c). CB21-처리 세포에서 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 병합을 조사한 결과, DNA 합성이 24시간째에 거의 완전히 없어진 것으로 나타났다 (도 2d, 2e). CB21은, 야생형 p53을 발현하는 세포에서와 같이, p53 종양 억제 유전자가 파괴된 세포에서도 동일하게 효과적이었다 (도 2b). 불멸화된 인간 상피 세포 (hTERT-RPE1 세포)의 반응은 HCT116 세포와 상이하였다. 이들 세포의 생장은 정지하였지만, 세포수는 감소하지 않았다 (도 2f). hTERT-RPE1 세포를 고밀도로 평판배양한 경우 (70,000 세포/웰), CB21로 처리한 후 세포 소실이 필연적으로 관찰되지 않았다 (도 2g). HCT116과 hTERT-RPE1 세포 간의 CB21에 대한 이러한 반응 차이는 도 2h에 나타나 있다.
실시예 2. 본 발명의 화합물은 세포 투과성 철 킬레이트제이다 .
CB21의 작용 메커니즘에 관한 가설을 세우기 위해, 약물 처리한 세포주로부터 유전자 발현 신호의 개요서인 연결 지도(CMap) (15)를 이용하였다. CB21에 의해 유도된 유전자 발현의 변화는 철 킬레이트화 능력을 가진 항진균제인 시클로피록솔라민(CPX)과 거의 유사하였다 (17) (도 3a). CB21의 세포독성 활성이 철 결핍에 의존하는지를 시험하기 위해, 염화철을 HCT116 세포에 첨가한 다음, CB21을 첨가하였다. 염화철은 wtp53을 발현하는 HCT116 세포와 p53 유전자가 파괴된 HCT116 세포 둘 다에서 CB21의 효과를 완전히 없애는 것으로 나타났다 (도 3b).
CB21의 항증식 활성을 다른 공지된 철 킬레이트제와 비교하였다. CB21은 VLX50, 데페라시록스, 시클로피록솔라민, 데페록사민보다 더 강력한 것으로 나타났다 (도 3c). 구조적으로 연관된 화합물들 다수를 사용하여 구조-활성 관계를 조사하였다 (도 3d, 3e). 이들 연구는, CB21이 단층 및 MCS 배양물 모두에서 가장 효과적인 화합물임을 나타내었다.
실시예 3. 본 발명의 화합물은 광범위한 자가포식 반응을 유도한다.
철 킬레이트제의 항종양원성 활성은 일반적으로, 리보뉴클레오타이드 환원효소의 저해로 인한 세포 증식의 저해에 기인한 것이다 (18). MCS는 대개 비-증식성 세포를 포함하고 있다. 그래서, 철 킬레이트제 CB21이 MCS에 대해 세포독성 효과를 유도한다는 발견은 예상치 못한 것이었다. 작용 메커니즘(들)을 더 상세히 연구하였다. CB21-처리 세포를 시각적으로 조사한 바, 상기 세포들이 큰 세포질 소낭들을 다수 포함하고 있는 것으로 나타났다 (도 4a). 이들 소낭은 미세소관 연관 단백질 1 경쇄 3 (LC3)에 대한 항체를 이용해 양성으로 염색되었으며, 이는 이들이 자가포식과 연관되어 있음을 시사하는 것이다. LC3 염색은 24시간째에 관찰되었으며 42시간째에 더 강하게 나타났다 (도 4b). 웨스턴 블롯 분석에서, HCT116 단층 세포에 CB21을 처리한 경우, LC3-I 및 LC3-II 둘 다의 수준이 크게 증가해서 유도된 것으로 나타났다 (도 4c). LC3-II (LC3의 PE-접합된 형태)는 자가포식소체와 가장 밀접하게 연관된 것으로 생각되는 단백질 마커이다 (19). LC3-II 수준은 HCT116 MCS에서도 CB21에 의해 크게 유도되었다 (도 4c). CB21은 또한, hTERT-RPE1 세포에서 LC3-II를 유도하였지만, 유도 수준은 HCT116 세포에 비해 훨씬 약하였다 (도 4d). 이러한 결과는, CB21-유발성 자가포식의 정도가 이들 2가지 세포 유형에서 상기 화합물의 세포독성 효과와 상호연관있음을 보여준다.
HCT116 세포에 여러 가지 철 킬레이트제를 세포독성 농도로 24시간 동안 처리하였다. LC3-I 및 LC3-II의 유도가 모든 경우에 관찰되었으며, 이는 LC3 유도가 철 킬레이트제의 일반적인 효과임을 나타내었다 (도 4e). 철 킬레이트제에 의한 LC3-I 및 LC3-II의 유도는 라파마이신 또는 NVP-BEZ235로 처리한 후 관찰된 것 (24시간째에는 유도가 관찰되지 않았으며, 6시간째에는 약한 유도가 관찰되었음)에 비해 훨씬 더 강하였다.
CB21이 MCS의 내부 코어 세포에서 세포 변화를 유도할 수 있는지를 알아보기 위해, HCT116 MCS에 CB21을 6시간 동안 처리하고, 세정하고, 서로 다른 기간 동안 인큐베이션한 다음, 고정하고, 섹션화한 후, 전자 현미경으로 관찰하였다. 처리 후 24시간 후부터 시작해서 세포에서 큰 소낭들이 관찰되었다 (도 4f). 주목할 만하게는, CB21-처리된 MCS의 공통적인 특징은, 증대되고 팽창된 미토콘드리아가 초기에 출현하였다는 점이었다 (도 4f). 가장 중요하게는, MCS 주변 세포에서 뿐만 아니라 MCS의 중심 세포에서도 대량의 액포화가 시간-의존적인 방식으로 발생하였다 (도 4f). CB21이, 세포자살에 내성인 것으로 밝혀진 MCS의 중심 코어 세포에서 소낭의 형성을 유도하며, 이러한 반응이 이들 세포의 생존율의 손실과 연관있는 것으로 결론내렸다.
실시예 4. 자가포식 또는 자가포식소체 -리소좀 융합의 차단은 본 발명의 화합물에 의한 세포 사멸을 증대시킨다.
자가포식은 일반적으로 스트레스 조건에 대한 생존 반응으로 여겨지지만, 프로그래밍된 세포 사멸의 메커니즘일 수도 있다 (20, 21). CB21-유발성 세포 사멸에 대한, 여러 가지 자가포식 저해제의 효과를 알아보기 위해, CB21의 세포독성 효과를 자가포식의 저해제로 흔히 사용되는 PI3K 저해제인 3-MA에 의해 강력하게 하였다 (도 5a). 다음, siRNA를 이용한 Beclin/Atg6의 넉다운을 수행하였다. 이는, 이 단백질의 발현을 거의 완전히 넉다운시켰다. Beclin/Atg6 넉다운은 HCT116 세포의 생존율을 약 50% 감소시켰으며; 생존율은 CB21 독성에 의해 더 감소하였다 (도 5b). 자가포식소체 및 리소좀의 융합을 방지하는 항생제인 바필로마이신 A의 효과를 시험한 결과, 바필로마이신 A가 HCT116 세포에서 커다란 세포질 LC3-II 양성 소낭의 출현을 억제하는 것으로 나타났다 (도 5c). 바필로마이신 A가 약 72시간째에 세포독성을 유도한 반면, 바필로마이신 A와 CB21 세포독성의 조합은 더 빨리 관찰되었다 (약 48시간) (도 5d). 이들 발견은, 자가포식의 저해가 본 발명의 화합물의 세포독성 효과를 강력하게 하며, CB21 처리된 세포에서 관찰된 큰 소낭들이 자가포식소체와 리소좀의 융합에 의해 야기됨을 보여준다.
클로로퀸 (CQ)은 자가포식소체ㅏ 분해성 자가리소좀으로 성숙되는 것을 저해하는 데에 널리 사용되는 리소좀자극제(lysosomotropic agent)이다 (22). CQ는 HCT116 세포의 증식에 대해 그 자체가 가지는 효과는 없다. CQ와 CB21의 조합이 단층 HCT116 세포에서 세포 사멸을 더 강력하게 하였다 (도 5e). CQ와 CB21의 조합이 MCS에 대해 가지는 세포독성을 시험한 결과, MCS에 대한 CQ 또는 CB21의 효과와 비교해 그 효과가 강력해진 것으로 나타났다 (도 5f).
실시예 5. LC3 유도는 BNIP3 에 의해 매개되지 않는다.
CB21은 저산소증 반응성 유전자 다수, 및 또한 p53에 의해 조절되는 것으로 알려진 유전자 다수를 유도하였다 (도 6a). 웨스턴 블로팅에 의한 HIF-1a 및 p53 단백질 수준의 유도를 확인하였다 (도 6b). GFP가 HIF-1a 프로모터에 의해 조절되는 리포터 세포주를 이용한 경우에도 유도가 크게 관찰되었다 (도 6c).
CB21에 의해 강하게 유도된 서로 다른 유전자들 중에서, BH3만 가지는 단백질인 BNIP3를 코딩하는 유전자가 두드러졌다. BNIP3는 HIF-1 a의 표적 유전자이다 (23). BNIP3 발현은 강한 세포질 액포화 및 자가포식을 유도하는 것으로 보고되었다 (24). CB21은 HCT116 세포에서 BNIP3 단백질의 발현을 유도하는 것으로 밝혀져 있다 (도 6d). 그러나, BNIP3 발현은 또한 hTERT-RPE1 세포에서 CB21에 의해 강하게 유도되었다 (도 6d). 이러한 발견은, BNIP3가 CB21-유발성 자가포식의 예정된 메커니즘이라는 것과 일치하지 않는다. siRNA를 이용한 BNIP3의 넉다운은 LC3-II의 유도 및 CB21에 의한 세포사멸을 감소시키지 않았다 (도 6e).
실시예 6. 본 발명의 화합물은 산소 소모를 저해하고, mTOR 활성을 감소시킨다.
전술한 결과는, CB21에 의해 유도된 독성 효과로부터 세포를 구출하기 위한 시도로서 자가포식이 유도됨을 제안한다. 세포의 에너지 대사에 관여하는 다수의 주 단백질이 Fe-S 복합체를 포함하기 때문에 (25), 본 발명자들은 CB21에 의한 철 킬레이트화가 자가포식을 유도하는 세포 대사를 방해할 것이라고 가정하였다. 이러한 가정을 확인하기 위해, CB21이 ATP의 세포내 수준에 가지는 효과를 시험하였다. 그러나, 세포내 ATP 수준이 자가포식을 유도할 정도로 감소하지 않았으며, 또한 AMPK (AMP-활성화된 단백질 키나제)의 인산화의 유도도 검출되지 않았다 (나타내지 않음). 다음, CB21이 포도당 수송에 대해 가질 만한 영향은 형광 d-포도당 유사체인 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)-아미노]-2-데옥시-d-포도당 (2-NBDG)을 사용한 유세포분석에 의해 확인하였다. 도 7a에서 나타낸 바와 같이, 2-NBDG 섭취의 대략 25% 증가가 CB21-처리된 세포에서 관찰되었다.
세포의 산소 소모에 대한 CB21의 영향을 시험하면, HCT116 단층 배양물에서, V3 (상태 3) 및 Vu (비커플링됨) 호흡은 CB21의 처리 후 6시간째에 크게 감소하였다 (p < 0.05)(도 7b). MCS에서 종양 세포의 호흡이 CB21에 의해 영향을 받는지 알아보기 위해, 간접 접근법을 이용하였다. 미토콘드리아 호흡의 저해는 조직의 산소 긴장을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 이는 피모니다졸 염색의 감소로서 확인될 수 있다 (26). 실제로, 피모니다졸로 양성 염색되는 섹션화된 MCS의 영역은 CB21-처리된 MCS에서 대조군의 약 50%인 것으로 확인되었다 (도 6C; 표). 이 효과는 약물 노출 후 3시간째에 관찰되었으며, 24시간째에도 지속하였다 (도 7c). 대조군으로서, HCT116 단층 배양물을, 산소 소모를 증가시키는 것으로 알려진 미토콘드리아 비커플링제(uncoupling agent)인 카르보닐시아나이드-3-클로로페닐하이드라존, CCCP로 처리하였다. 예상한 바와 같이, CCCP로 처리한 MCS는 피모니다졸 염색 영역이 더 넓게 나타났다 (도 7c; 표).
구상체의 피모니다졸 염색의 정량화
샘플 농도 시간/시 피모니다졸 양성 영역 (%) S.D.
대조군 63 13.0
CB21 6.25 μM 3 31.8 4.0
라파마이신 10 nM 5 42.2 5.2
CCCP 10 μM 6 79.9 4.3
라파마이신의 포유류 표적(mTOR)은 영양분 상태에 대한 반응에서 세포 성장을 조절하는 세린/트레오닌 키나제이다. 대사적 스트레스가 mTOR 경로의 활성에 영향을 미친다는 것을 잘 확립되어 있다 (27). 상기 mTOR 경로는 미토콘드리아의 산소 소모 및 산화 능력을 조절한다 (28, 29). CB21 처리 후 관찰된 산소 소모의 감소가 mTOR 저해와 연관있는지 알아보기 위해, mTOR 기질인 4EBP1의 인산화를 조사하였다. 도 7D에서 나타낸 바와 같이, 4EBP1 인산화는 CB21에 의해 저해된다. 인산화의 감소는 AKT-인산화의 증가와 연관 있다. mTORC1의 저해는 음성 피드백 루프 관련물질(negative feedback loop involving)을 방출하여, 강한 Atk 활성화를 초래하는 것으로 알려져 있다 (30). mTOR 저해가 산소 소모를 감소시키는지 시험하기 위해, HCT116 MCS를 라파마이신 (mTOR-raptor 복합체 형성의 특정 약리학적 저해제)으로 처리하고, 섹션을 피모니다졸로 염색하였다. CB21만큼 강하지는 않지만, 피모니다졸 염색의 감소를 관찰하였다 (도 7c; 표 1).
이들 발견은, mTOR의 직접적인 저해가 CB21에 의한 것과 유사한 효과를 제공하는지를 실험하도록 하였다. 이들 실험을 위해, 임상 시험 화합물인 이중 PI3K/mTOR 저해제 NVP-BEZ235를 사용하였다. 중요하게는, NVP-BEZ235는 단층 또는 MCS 조건 둘 다에서 성장된 HCT116 세포의 4EBP1 인산화를 감소하는 것으로 확인되었다 (도 7d). CB21과는 달리, NBPBEZ235는 MCS의 코어 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않았다.
실시예 7. 본 발명의 화합물에 의해 유도되는 세포 사멸은 포도당 결핍에 의 해 증대된다.
종양 세포에서 세포의 ATP 생산 중 대략 50%는 산화적 인산화에 의한 것이다 (31). 산소 소모는, 아마도 증식 활성이 감소한 결과로서, 종양 MCS의 내부 영역에서 감소하는 것으로 보고되어 있다 (32, 33). 다른 연구원들은, 산소 소모가 MCS의 생존 영역에서 보다 균일하다는 것을 발견하였으며 (34); 형질전환 중 동일한 단계에 있는 섬유아세포 클론이 MCS 배양물에서 꽤 구별되는 대사 활성을 가질 수 있는 것으로 보고된 바 있다 (33). 심지어, 중심 코어 세포에서 세포의 산소 소모가 낮은 경우라도, CB21에 의해 유도된 추가적인 감소가 포도당의 의존성을 증가시키는 것으로 예상된다. 흡수 증가에 의한 포도당 의존성 증가를 단층 세포가 보상할 수 있는 반면 (도 8a에 나타낸 바와 같이), 포도당은 MCS에서 제한적일 것이다. 도 8a에서 나타낸 바와 같이, HCT116 MCS 코어 세포는 생존을 위해 포도당에 의존적이며: 포도당 결핍은 중심 영역의 괴사를 초래하며, 이러한 효과는 CB21의 효과를 연상케 한다 (도 2). 이들 생각들을 근거로, HCT116 단층 세포의 CB21에 대한 감수성을 포도당 결핍이 증가시키는지 시험하였다. 실제로, 이는, 포도당 결핍이 세포 생존율을 감소시키고, CB21에 의한 세포자살을 증가시킨 경우였다. 이들 발견은 중심 코어 세포의 CB21에 대한 감수성을 적어도 부분적으로 설명할 것 같다.
실시예 8. 본 발명의 화합물의 항종양 활성
CB21에 의한 생체내 항종양 활성은 HCT116 모델에서 시험하였다. 종양의 크기가 대략 0.2 ㎖로 자라도록 방치한 다음, CB21로 처리하였다. 화합물 CB21의 뚜렷한 항종양 효과가 관찰되었다 (도 1).
트리아핀(Triapine) (35), 타흐피르(Tachpyr) (36) 및 트렌속스(Trensox) (37)를 비롯하여 항종양 활성을 나타내는 철 킬레이트제가 상당수 개발되어 있다. 철은 리보뉴클레오타이드 환원효소에 의한 리보뉴클레오타이드로부터 데옥시리보뉴클레오타이드의 형성을 포함하여, 많은 대사 반응에 중요하다 (38). Fe의 부재 시, 세포는 세포 주기의 G1기에서 S기로 넘어갈 수 없으며, 이는 CB21이 HCT116 및 hTERT-RPE1 세포 둘 다에 미치는 항증식 작용이 관찰된 것을 설명한다. 철 킬레이트제가 원칙적으로는 증식 세포에 특이적인 것으로 생각되므로, MCS에 대해 세포독성을 나타내는 제제에 대한 스크린(screeen)에서 철 킬레이트제의 규명은 예상되지 않았다. 추가로 조사한 결과, CB21이 MCS 코어에 있는 비-증식 세포에 미치는 영향에 대한 가능한 메커니즘이 밝혀졌다. 아울러, 직접 측정 및 MCS의 피모니다졸 염색의 이용 둘 다로 관찰한 바와 같이, CB21이 HCT116 및 hTERT-RPE1 세포의 산소 소모를 감소시켰음을 발견하였다. 미토콘드리아 산소 소모 및 산화 능력은 mTOR 경로에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다 (28, 29). 또한, 철 킬레이트제인 데페라시록스는 mTOR 신호전달을 저해하는 것으로 보고된 바 있다 (39). 실제로, CB21은 4EBP1의 인산화를 저해하고 AKT 인산화를 상향조절하는 것으로 밝혀졌다. 데페라시록스에 의한 mTOR 신호전달의 저해는, 저산소증에 의해 유도되어 다시 TSC2 단백질을 활성화시키는 유전자인 REDD1 (RTP801이라고도 지칭함)의 유도로 인한 것이다 (40). 산소 소모에 대한 CB21의 영향은 적어도 부분적으로는 이러한 메커니즘에 의해 매개된다고 생각해 볼만하다. 또 다른 가능성으로는, 철 결핍에 의해 유도되는 대사 스트레스가 일부 다른 메커니즘에 의해 mTOR 경로의 활성에 영향을 미친다는 것이다.
다른 철 킬레이트제와 공유한 CB21의 또 다른 효과(41)는, LC3 양성 세포질 소낭 및 LC3-II 단백질의 유도이다. LC3 유도는 hTERT-RPE1 세포에서 훨씬 덜 뚜렷한 것으로 발견되었다. 철 킬레이트제에 의한 LC3-II의 유도는 mTOR 저해제로 관찰된 것보다 훨씬 더 강하였으며, 이는 LC3-II 유도가 mTOR 저해에 의해서만 매개되지 않음을 제안한다. PI3K/mTOR 저해제 NVP-BEZ235는 HCT116 코어에 있는 세포에 대해 검출가능한 세포독성 효과를 유도하지 않는 것으로 밝혀졌으며 (Hernlund 등, 비공개됨), 이 또한 mTOR 저해가 CB21에 의한 세포 사멸 및 자가포식 유도를 책임지는 유일한 인자가 아님을 제안한다.
CB21 처리 후 관찰된 산소 소모 감소는 ATP 생성에 대한 포도당의 의존도를 라파마이신의 경우 보고된 것과 유사하게 증가시켜야 한다 (42). 이러한 가정은, MCS 코어에 존재하는 세포군이 아마도 저산소증 및 한정된 포도당 공급에 의해 유도되는 조건인 구성적인 ER 스트레스 (Grp78 양성)의 징후를 나타낸 것을 관찰함으로써 확인된 것으로 보인다. MCS의 포도당 결핍은 코어 세포의 세포 사멸을 유도하였으며, 이는 이러한 세포군의 생존이 포도당에 의존한다는 개념과 일치한다. CB21로 처리한 후 관찰된 포도당 의존도의 증가는 코어 세포군의 세포 사멸에 크게 기여하는 것으로 보인다. 주변 세포에서의 케스파제-3의 유도가 강한데 비해 케스파제-3 유도가 약한 것으로 보아 (나타내지 않음), 세포자살은 CB21에 의한 세포 사멸의 주 메커니즘인 것으로 보이지 않았다. 세포의 에너지 상태가 불량한 조건은, 세포자살에 대한 내성을 초래할 수 있다 (또한, NSC647889-유발성 세포자살에 대한 코어 세포의 내성을 설명함 (나타내지 않음)). CB21은 HCT116 세포의 포도당 의존도의 증가를 유도하며, 이는 MCS 코어에 있는 저산소증 세포의 생존율을 감소시키는 것으로 보인다.
자가포식은 대사적 스트레스에 대한 이화 분해 반응으로서, 단백질 및 소기관의 분해를 통해 항상성을 유지하고자 한다. PI3K-Akt-mTOR, LKB1-AMPK-mTOR 및p53은 자가포식 경로의 주 조절인자들이다. 자가포식은 암세포의 항암 치료에 대한 내성을 매개하는 데 관여하며, 항암제 내성에 있어서 매력있는 치료적 표적인 것으로 생각된다 (20, 43). CB21은 강한 LC3-I 및 LC3-II 유도를 특징으로 하는 뚜렷한 자가포식 반응을 유도하였다. 본 발명은 CB21의 세포독성을 강력하게 하기 위한, 자가포식의 저해를 제공한다.

Claims (15)

  1. 고형암 종양 치료용 약학 조성물로서,
    세포 투과성 철 킬레이트제를 포함하고,
    상기 세포 투과성 철 킬레이트제가 하기 화학식 I의 N-(1-피리딘-2-일-메틸리덴)-N-(9H-1,3,4,9-테트라아자-플루오렌-2-일)-하이드라진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고:
    Figure 112018024581351-pct00044

    상기 식에서, R은 H 또는 메틸이고, R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고, R2는 H 또는 C1-C4 알킬인, 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    R이 메틸인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    R 및 R1 둘 다가 메틸인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    R1이 메틸인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    R1이 6-메틸 또는 8-메틸인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    R, R1 및 R2는 각각 메틸, 8-메틸 및 H 이거나; 메틸, H 및 H 이거나; 메틸, 6-메틸 및 H 이거나; H, 6-메틸 및 H 이거나; 또는 H, 8-메틸 및 CH3 인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 투과성 철 킬레이트제가 자가포식 저해제(autophagy inhibiting agent)와 조합되어 사용되고,
    상기 자가포식 저해제는 클로로퀸(chloroquine), 하이드록시클로로퀸, 3-메틸아데닌, 아데노신, 바필로마이신 A1 (bafilomycin A1), 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보사이드, 워트마닌(wortmannin), 및 빈블라스틴(viniblastine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 자가포식 저해제가 클로로퀸(chloroquine)인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 자가포식 저해제가 하이드록시클로로퀸, 3-메틸아데닌, 아데노신, 바필로마이신 A1 (bafilomycin A1), 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보사이드, 워트마닌(wortmannin), 및 빈블라스틴(viniblastine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 약학적으로 적합한 담체를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약리학적으로 암을 공격하기에 유효한 투여량으로 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 세포 투과성 철 킬레이트제 및 상기 자가포식 저해제를, 각각 약리학적으로 암을 공격하기에 유효한 투여량으로, 환자에게 1시간 이내, 1일 이내 또는 1주 이내에 개별 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포 투과성 철 킬레이트제 및 자가포식 저해제가 각각 약학적으로 적합한 담체를 포함하는 개별 약학 조성물로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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