KR100812032B1 - 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제 - Google Patents

3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체는 p53이 결손 또는 변이된 p53 유전자 기능을 상실한 암세포에만 선택적으로 세포독성 및 세포사멸을 유도하므로, 정상세포에 대한 부작용을 최소화하면서 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제{Anti-cancer agents comprising 3,4-dihydroisoquinolinium salt derivatives}
도 1은 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체 처리에 따른 p53 유전자 결손 암세포(p53-/-)인 자궁경부암 세포(HeLa)와 대장암 유도세포 (HCT116/E6), 및 p53 정상 유전자를 포함하는 세포(p53+/+)인 인간배아 신장세포 (HEK293)와 야생형 대장암 유도세포(HCT116)에서의 세포독성 및 세포사멸 유도 정도를 세포 형태학적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포인 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서 세포증식에 미치는 영향을 MTT 분석법을 이용하여 측정한 도이다.
도 3은 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포인 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서 DNA 응집현상이나 다핵체 (multinucleate cell) 형성에 미치는 영향을 DAPI 염색법을 이용하여 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 4a는 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포인 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서 DNA 분절 현상에 미치는 영향을 DNA 단편 검출을 통해 전기영동법으로 비교 확인한 도이다.
도 4b는 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포인 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서 세포주기분석에 미치는 영향을 유세포 분석기를 이용하여 분석한 도이다.
도 5a는 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체(1, 6, 9, 12 μM)를 p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에 처리한 다음 24시간 후 유세포 분석기를 이용하여 핵상을 분석한 도이다.
도 5b는 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체(1, 3, 6, 9, 12, 15 μM)를 대장암 유도 세포주에서 p53 유전자를 정상 보유하는 야생형(HCT116) (p53+/+) 세포와 바이러스 단백질 E6에 의해 p53이 불활성화된 (HCT116/E6) (p53-/-) 세포에 처리한 다음 24시간 후 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1 피크를 측정하여 핵상을 분석한 도이다.
도 5c는 도 5b의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포와, p53 정상 유전자를 포함하는 세포에서 카스파제-3 활성 정도를 측정한 도이다.
도 7은 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포와, p53 정상 유전자를 포함하는 세포에서 사멸억제 단백질인 bcl-2와 사멸촉진 단백질인 bax의 활성을 측정한 도이다.
본 발명은 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제에 관한 것이다.
정상적인 조직의 항상성은 세포증식 속도와 세포사멸 속도간의 균형에 의해 이루어진다. 노화된 세포는 세포사멸(cell death, apoptosis)에 의해 몸 속에서 제거되도록 프로그램되어 있으며, DNA 손상, 저산소증, 암유발 유전자의 활성화에 따른 신호체계의 불균형, 생존인자의 부족 및 주변 조직의 변화 등에 따라 세포사멸을 촉진하는 방향으로 신호가 전달된다. 이러한 세포사멸이 억제될 경우 정상적인 조직의 항상성이 깨지면서 암이 발생할 수 있다.
세포사멸 억제로 인해 암이 발생되는 가장 대표적인 예로, p53 종양 억제 유전자의 변이를 들 수 있다. 정상적인 p53 유전자로부터 발현된 p53 단백질은 세포주기 진행의 이상을 감지하여 분열을 억제하는 체크포인트를 활성화 시키고, 세포의 비정상적인 증식을 억제하여 세포의 암화(carcinogenesis)를 막는 능력을 가지고 있다. p53 단백질은 암이 유발되었을 때 목표 유전자의 프로모터(promoter)에 결합하여 유전자의 전사(transcription)를 유도함으로써 세포사멸을 유도한다. 또 한, p53 종양 억제 유전자는 세포의 형질변환(transformation)을 억제하며, 암세포의 종양형성(tumorigenesis)을 억제한다(Hinds P. W. et al., J. Viol. 68, 739 (1989)). p53 단백질은 p53 프로모터 부위의 특이한 DNA 서열에 결합하여 p21을 비롯한 종양 억제 유전자의 발현을 유도한다. 인체 종양세포로부터 발견되는 대부분의 변이된 p53 단백질은 전사활성 기능을 상실하고 있다. 이는 p53의 전사활성 기능이 암 억제 기능에 필수적인 것임을 나타낸다(Wiman K. G., Exp. Cell Res. 237, 14 (1997); Lane, D. P., 358, 15-16 (1992); Kastan M. B et al., Cancer Res. 51, 6304-6311 (1991); Kuerbitz S. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7491-7495 (1992)).
p53 유전자의 변이는 인체 종양에서 약 50~60% 이상의 고빈도로 관찰된다. 대부분의 암 유발 바이러스가 p53 단백질을 분해하거나 기능을 방해하여 암 증식이 유발되기 때문에 대부분의 암세포에서는 p53 유전자의 기능이 비정상적인 상태이다. 이러한 비정상적인 상태로 인해 인체의 각종 암, 특히 간암, 폐암, 대장암 등에서 변이가 빈번히 발견되고 있다.
또한, 정상세포에서 p53 유전자는 방사선이나 약제들과 같은 다양한 발암원으로부터 DNA 손상을 방지하는데 중추적인 역할을 담당한다. 정상세포에 γ선의 조사 혹은 에토포사이드(etoposide) 등의 DNA 손상 약제를 처리하면 세포는 세포주기 진행을 억제하는 체크포인트를 작동시키게 되는데, 만약 세포가 복구할 수 없을 정도로 손상이 크면 세포사멸(아폽토시스)을 일으킨다. 그러나 p53 결손 또는 변이 유전자를 발현하는 세포는 γ선의 조사 등에 의한 세포주기 억제와 세포사멸이 일 어나지 않아 유전체의 손상을 유발하고 암세포로의 형질전환을 유도한다. 즉 p53이 능동적으로 세포사멸을 조절하고 있는 것이다. p53 유전자 변이를 가지고 있는 암세포에 정상 p53 유전자를 발현하면 세포사멸을 유도한다는 사실도 p53 단백질의 세포사멸 조절기능을 암시한다(Ko et al., Hum. Gene Ther., 7, 1683-1691, (1996)). 이에 따라 p53 유전자를 이용한 유전자 치료 및 항암제의 개발이 활발하게 진행되고 있다.
이와 관련하여 미국특허 제 6,143,290호에는 정상 p53 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 컨스트럭트를 이용하여 종양을 억제하는 방법; 미국특허 제6,017,524호에는 정상 p53 유전자를 투여하여 p53 결손 암세포의 증식을 억제하는 방법; WO 제 94/12202호에는 p53 단백질을 활성화하는 방법에 관하여 기재되어 있다. 또한 미국특허 제 5,693,522호에는 p53 유전자를 포함하는 재조합 바이러스와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 p53 유전자의 변이 및 결손 암세포의 치료를 위한 약학 조성물; 대한민국 특허공개공보 제 10-2003-85421호에는 p53 또는 p21 유전자 변이에 의해 p53 또는 p21 유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를 포함하는 약학 조성물에 관하여 기재되어 있다.
상기한 바와 같이, p53 유전자를 이용한 유전자 치료 및 항암제의 개발은 대부분 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에 p53 유전자를 삽입하여 정상적인 p53 단백질의 발현을 회복시켜 암세포의 비정상적인 증식을 억제함으로써 종양을 치료하는 방법이 사용되어 왔다. 즉 지금까지, 항암제의 개발은 대부분 아데노바이러스를 매개로 하여 정상 p53 유전자를 종양에 직접 투여하는 방식이다(Frank et al., Clin. Cancer Res., 4, 2521-2528 (1998); Yung et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 36, 423 (1995); Liu et al., Cancer Res., 54, 3662-3667 (1994)).
한편, 현재 사용되고 있는 대부분의 항암제는 일반적으로 세포증식을 억제하는 독성물질이기 때문에, 비정상적으로 성장하는 암세포뿐 아니라 정상세포에도 작용하여 심한 부작용을 가져온다. 따라서, 암세포에만 작용하고 정상세포에는 영향을 미치지 않는 항암제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 암세포에만 작용하고 정상세포에는 영향을 미치지 않는 항암제에 대해 연구하기 위하여 캔디다 알비칸(Candida albicans)에서 항진균 활성을 보이는 80여개의 이소퀴놀린 유도체의 화학적 집합체를 조사하던 중, 이들 유도체 중 암세포주에 대해서만 선택적으로 독성을 갖는 화합물을 선별하였다. 이 중 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포만 특이적으로 억제하여 세포사멸을 유발하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 포함하는 항암제를 제공한다.
Figure 112006074118416-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 서로 같거나 다르며, 수소, 할로겐, C1~C10의 알콕시기, C1~C2의 알콕시카르보닐아미노기, C1~C3의 알킬아미노기이며, R1 및 R2가 모두 C1~C10의 알콕시기인 경우 고리를 형성하여 메틸렌디옥시기로 될 수 있으며;
R3는 수소, C1~C18의 알킬기, C1~C18의 알케닐기, 페닐기, 치환된 페닐기, 벤질기 또는 아릴알킬기이고;
Z1, Z2, Z3, Z4 및 Z5는 각각 독립적으로 서로 같거나 다르며, 수소, 할로겐, C1~C5의 알킬기, 트리플루오로메틸기, 페닐기, 치환된 페닐기, 니트로기, C1~C4의 알콕시기, 트리플루오로메톡시기, 히드록시기, 페녹시기, 치환된 벤질옥시기, 메톡시카르복실기, C1~C4의 알콕시카르보닐기, 암모늄기이며;
X-는 무기산 이온, 유기산 이온 또는 할라이드이다.
상기 화학식 1의 화합물은 바람직하게 하기 화학식 1-1로 표시되는 화합물이다.
<화학식 1-1>
Figure 112006074118416-pat00002
상기 화학식 1의 화합물은 대한민국 특허출원 제 10-2005-46749호에 기재되어 있는 화합물로서, 주식회사 한화로부터 제공받아 사용하였다. 또한, 상기 특허문헌에 기재되어 있는 방법을 이용하여 제조하여 사용할 수도 있다.
상기 화학식 1의 화합물의 제조방법은 하기 반응식 1로 표시되는 바와 같이,
1) 화학식 2의 페닐에틸아민 화합물과 아실 클로라이드 화합물을 반응시켜 화학식 3의 아미드 화합물을 제조하는 단계,
2) 상기 1)단계에서 제조한 아미드 화합물을 POCl3와 반응시켜 화학식 4의 이소퀴놀린 화합물을 제조하는 단계, 및
3) 상기 2)단계에서 제조한 이소퀴놀린 화합물을 벤질 할라이드와 반응시켜 화학식 1의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 제조하는 단계를 포함하여 이루어진다.
Figure 112006074118416-pat00003
상기 반응식 1에서, R1, R2, R3, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 및 X-는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 처리한 p53 정상 유전자 보유 세포인 인간배아 신장 세포(HEK293)와 야생형 대장암 유도세포 (HCT116)들은 p53 유전자 발현에 의해 세포의 형태학적 변화가 평평하게 퍼지는 양상(flattened morphology)을 나타냄으로써 세포사멸을 유도하지 않으며, 정상적인 p53 유전자가 발현되어 DNA 합성 및 핵분열을 억제하여 더 이상의 다핵 세포가 증가하지 않고 대부분의 세포가 한 개의 핵을 가지고 있으며, 세포주기가 G2/M에서 정지하고, 일시적인 성장을 정지한다. 또한, 세포사멸 억제 유전자인 bcl-2의 발현이 증가한다.
반면, 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁경부암 세포(HeLa)와 대장암 유도세포 (HCT116/E6)는 p53 유전자의 정상적인 조절이 불가능함으로 인해 계속적인 DNA 합성 및 핵분열이 연속적으로 일어나 두 개 이상의 다핵체가 관찰되고, DNA 단편이 검출되며, 2N 이 하의 'sub-G1'에 속하는 세포수가 증가하고, 시간 의존적으로 카스파제-3의 활성이 증가하며, 세포사멸 촉진 유전자인 bax의 발현이 시간 의존적으로 증가하여, 극심한 세포사멸을 유도한다.
따라서, 본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체는 p53이 결손 또는 변이된 p53 유전자 기능을 상실한 암세포에만 선택적으로 세포독성 및 세포사멸을 유도하므로, 정상세포에 대한 부작용을 최소화하면서 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암으로는 인체의 각종 암, 부인과 종양, 내분비계 암, 중추신경계 종양, 수뇨관 암 등이 있으며, 구체적으로는 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마를 포함한다. 그러나 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암이 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 'p53이 결손 또는 변이된 p53 유전자 기능을 상실한 암세포'란 정상적인 기능을 담당하는 p53 유전자가 유전자 변이 등에 의하여 DNA 손상 등에 의한 세포주기 기전 조절 기능 또는 여러 가지 내부적·외부적 영향에 대응하는 정상적인 조절 능력을 상실한 상태의 암세포를 말한다. 즉, p53 유전자가 염색체 상에서 결 실(deletion)되거나 변이(mutation)에 의하여 비정상적인(dominant negative) 단백질을 만드는 암세포를 총칭한다.
본 발명의 조성물은 상기 화학식 1의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체와 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 상기 화학식 1의 화합물이 약 0.01~100 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하 다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체의 처리에 따른 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포와 p53 정상 유전자를 포함하는 세포의 형태학적 변화
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포와 p53 정상 유전자를 포함하는 세포에 미치는 세포독성의 차이를 확인하기 위하여, 위상차 현미경을 이용하여 세포형태의 변화를 관찰하였다.
p53 유전자 결손 암세포(p53-/-)로는 자궁경부암 세포(HeLa)와 대장암 유도세포(HCT116/E6)를 사용하였고, p53 정상 유전자를 포함하는 세포(p53+/+)로는 인간배아 신장세포(HEK293)와 야생형 대장암 유도세포(HCT116)를 사용하였다.
자궁경부암 세포주(HeLa) (p53-/-)와 인간배아 신장 세포주(HEK293) (p53+/+)는 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM 배지(Dulbeccos Modification of Eagles Medium)에서, 대장암 유도 세포주 야생형(HCT116) (p53+/+)과 p53 변이 세포주(HCT116/E6) (p53-/-)는 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 (Rosewell Park Memorial Institute Medium) 1640에서 24시간 이상 배양한 후, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드 1, 6, 12 μM을 첨가하여 각각 24 시간 후에 위상차 현미경으로 100배와 200배로 관찰하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 정상 유전자 보유 세포인 인간배아 신장 세포(HEK293)와 야생형 대장암 유도세포(HCT116)들은 p53 유전자 발현에 의해 세포의 형태학적 변화가 극단적이지 않았다. 반면, p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁경부암 세포(HeLa)와 대장암 유도세포(HCT116/E6)에서는 극심한 세포사멸이 유도되었다. 세포사멸이 일어날 경우 세포의 형태가 둥근 모양(round up)으로 변하게 되고 크기가 축소되는데, 정상적인 p53 유전자의 발현에 의한 형태변화는 세포사멸과는 달리 평평하게 퍼지는 양상(flattened morphology)을 보여주었다. 이러한 결과로 p53 정상 유전자를 보유한 세포는 이 유전자의 발현으로 인해 세포사멸을 유도하지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 2 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포와 p53 정상 유전자를 포함하는 세포에서 세포증식에 미치는 영향( MTT 분석법)
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자 를 포함하는 암세포와 p53 정상 유전자를 포함하는 세포에서 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, MTT 분석법을 이용하여 측정하였다.
p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)를 각각 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 이상 배양한 후, 96 웰 플레이트에 2×104 cells/well의 세포수로 200㎕ 씩 24시간 동안 다시 배양하였다. 그 다음 각각의 세포가 들어있는 96 웰 플레이트에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 각 웰에 최종 농도가 각각 1, 3, 6, 9, 12 μM이 되게 처리하였다. 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 후 24시간이 되면 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 검색법으로 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하였다.
MTT 검색법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸륨(tetrazolium)을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔(formazan) [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다.
MTT 포마잔의 흡광도는 540~570㎚의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 따라서 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 각 세포군에 MTT (5㎎/㎖, in PBS)를 20㎕씩 넣고 현미경으로 관찰하면서 MTT 포마잔이 형성되는 1시간 이후부터 2시간 30분 사이에 배지와 MTT 용액을 제거하고, DMSO 200㎕씩을 각 웰에 넣어 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)는, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)보다 세포사멸 정도가 급격히 증가되었다. 이는 도 1에서 보여준 세포형태 관찰에서도 볼 수 있었던 결과이며, IC50(세포의 생존율이 50%가 되도록 하는 약물의 농도) 값도 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장세포(HEK293) (p53+/+)에서는 6 μM인데 반하여 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)에서는 훨씬 낮은 4 μM인 것으로 관찰되었다.
실시예 3 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 DNA 응집현상이나 다핵체( multinucleate cell ) 형성에 미치는 영향( DAPI 염색법)
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자 를 포함하는 암세포에서 DNA 응집현상이나 다핵체(multinucleate cell) 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, DAPI 염색법을 이용하여 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)를 각각 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 이상 배양한 후, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 1, 3, 6 μM 첨가하여 24시간 배양한 다음 각각의 세포주를 대피(DAPI : 4,6-diamidine-2-phenylindole, dihydrochloride) 염색법으로 핵을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 음성 대조군으로는 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)만 처리하였고, 양성 대조군으로는 DNA 손상 및 그에 따른 세포사멸을 유도하는 화학약제로 잘 알려진 에토포사이드(etoposide) 30 및 50 μM을 사용하여 비교하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서는 대부분의 세포가 한 개의 핵을 가지고 있고 아주 드물게 몇몇 세포만이 두 개의 핵을 가지고 있음을 확인하였다. 반면, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 유전자 결손 및 변이 세포주인 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)에서는 다수의 세포에서 두 개 이상의 핵을 가진 다핵 세포의 양상이 증가한 것이 관찰되었다. 상기 결과에 의하면, p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293)에서는 p53 정상 유전자를 가지고 있으므로 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리하였을 때 세포질 분열이 저해되어 두 개의 핵을 가진 세포가 발생하기도 했지만, 이때 정상적인 p53 유전자가 발현되어 DNA 합성 및 핵분열을 억제하여 더 이상의 다핵 세포는 증가하지 않았음을 증명한다. 하지만, p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁경부암 세포(HeLa) (p53-/-)는 이 유전자의 정상적인 조절이 불가능함으로 인해 계속적인 DNA 합성 및 핵분열이 연속적으로 일어나 두 개 이상의 다핵체가 관찰되었고, 이 중 상당수의 세포가 세포사멸로 진행한다고 설명할 수 있다.
실시예 4 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 DNA 분절 현상 및 세포주기분포에 미치는 영향
1. DNA 분절 현상
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 DNA 분절 현상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, DNA 단편 검출을 전기영동법으로 확인하였다.
p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)를 각각 60㎜ 배양접시에 5× 105 cells/㎖(접종 농도(seeding concentration))가 되도록 분주하여 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 이상 배양하였다. 이들 세포에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드 25μM을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포들에서 DNA를 추출하여 DNA 단편(DNA fragmentation) 검출을 전기영동법으로 확인하였다.
결과는 도 4a에 나타내었다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa)에서 DNA 단편이 검출됨으로써 세포사멸이 진행되는 세포임을 알 수 있다.
2. 세포주기분포
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 세포주기분포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)를 각각 60㎜ 배양접시에 5× 105 cells/㎖(접종 농도(seeding concentration))가 되도록 분주하여 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 이상 배양하였다. 이들 세포에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이 드를 각각 3 μM과 6 μM 처리하여 12시간과 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포들은 다시 회수하여 70% 에탄올을 이용하여 고정하고, 1 ㎎/㎖ PI(propodium iodide) 100㎕를 첨가하여 염색한 후 유세포 분석기(FACS : Fluoresence activated cell sorter)(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 세포 내의 DNA 양을 정량하고 세포주기분포를 분석하였다. 유세포 분석 결과는 cell quest software로 해독하였다.
결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 24시간 동안 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드의 처리에 따라 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서 세포의 대부분이 세포주기가 G2/M에서 정지하는 것을 관찰하였다. 반면, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포의 경우 2N 이하의 'sub-G1'에 속하는 세포수가 증가하였다. 유세포 분석에 의한 세포의 핵상 분석 시 2N 이하의 'sub-G1'에 속하는 세포는 핵의 DNA가 엔도뉴클레아제에 의하여 잘라져서 분절되고 세포사멸이 일어난 세포이다.
실시예 5 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 대장암 세포에서 세포주기분포에 미치는 영향
상기 실시예 4에서 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7- 디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 2N 이하의 'sub-G1'에 속하는 세포가 증가하여 세포사멸로 유도된다는 사실이 관찰되었다.
이에 준하는 결과를 검증하기 위하여, 동일한 대장암 유도 세포주에서 p53 정상 유전자를 포함하는 야생형(HCT116) (p53+/+) 세포와 바이러스 단백질 E6에 의해 p53이 불활성화된 (HCT116/E6) (p53-/-) 세포를 상기 실시예 4의 실험과 동일한 조건에서 유세포 분석기로 분석하였다.
p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 1, 6, 9, 12 μM 처리하여 24시간 이후 유세포 분석기를 이용하여 핵상을 분석한 결과는 도 5a에 나타내었다.
대장암 유도 세포주에서 p53 유전자를 정상 보유하는 야생형(HCT116) (p53+/+) 세포와 바이러스 단백질 E6에 의해 p53이 불활성화된 (HCT116/E6) (p53-/-) 세포에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 1, 3, 6, 9, 12, 15 μM 처리하여 24시간 이후 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1 피크를 측정한 핵상 분석 결과는 도 5b에 나타내었으며, 상기 도 5b의 결과를 그래프로 나타낸 것은 도 5c에 나타내었다.
도 5b 및 도 5c에 나타난 바와 같이, 실시예 4에서 나타난 결과와 마찬가지로 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 대장암 유도세포(HCT116/E6) (p53-/-)는 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 3 μM에서 6 μM 사이의 농도로 처리하였을 때 'sub-G1'에 속하는 세포가 50% 넘게 증가하였다. 반면, p53 정상 유전자를 포함하는 야생형(HCT116) (p53+/+) 세포는 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드의 농도가 증가함에 따라 'sub-G1'에 속하는 세포수는 큰 변화가 없었고, 'G2/M'에 속하는 세포수가 훨씬 많이 증가하였다.
실시예 6 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 카스파제 -3 ( caspase -3) 활성 증가에 미치는 영향( 웨스턴 블롯팅( western - blotting ))
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체의 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서의 세포사멸 유도 여부를 확인하기 위하여, 카스파제-3 (caspase-3) 활성 정도를 측정하였다.
일반적으로 세포사멸은 미토콘드리아 외막 단백질인 사멸억제 단백질(bcl-2)과 사멸촉진 단백질(bax)의 상호작용에 의해 미토콘드리아 외막의 막전이가 감소하여 시토크롬 C가 세포질로 분비되고, 이것이 카스파제로 불리는 단백질 분해효소들을 순차적으로 활성화시킴으로써 개시된다.
따라서, 세포사멸의 유도 여부는 카스파제 효소의 활성화 여부로 확인할 수 있다. 이 효소는 세포 내에서 불활성화 상태로 존재하다가 사멸 유도 신호에 의해 활성화되어 사멸의 운명에 처한 세포를 처리하는 기능을 담당하기 때문이다.
p53 유전자가 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 대장암 유도세포(HCT116/E6) (p53-/-), p53 정상 유전자를 포함하는 인간배아 신장 세포 (HEK293) (p53+/+)와 대장암 유도세포 야생형(HCT116) (p53+/+)을 각각 60㎜ 배양접시에 5×105 cells/㎖가 되도록 분주하고 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 상기 세포들에 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드 9 μM을 첨가하여 24시간 반응시킨 후, 다시 회수하여 웨스턴 블롯팅(western-blotting)을 통하여 카스파제-3 활성 정도를 측정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드의 첨가에 의한 세포사멸은 선택적으로 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)와 대장암 유도세포(HCT116) (p53-/-)에서 시간 의존적으로 카스파제-3의 활성 증가를 통해 확인할 수 있었다.
실시예 7 : 3,4- 디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자를 포함하는 암세포에서 세포사멸 촉진 효과에 미치는 영향( 웨스턴 블롯팅 )
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체가 p53 결손 및 변이 유전자 를 포함하는 암세포에서 세포사멸 촉진 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
세포유형에 따라 세포의 죽음(아폽토시스)을 일으키는 요인은 다양한데, 종양괴사인자(TNF)를 비롯하여, 파스 리간드(Fas ligand), 전이성 성장물질, 신경전달물질, 성장물질의 제거, 칼슘, 글루코코르티코이드 등의 생리적 활성인자에 속하는 요인도 있고, 세포 손상(damage)에 의해 유발되는 인자로서 열 감작, 바이러스의 감염, 박테리아의 독성물질, 암유전자, 종양억제인자, 세포성 독성 T 세포, 영양분의 제거-항대사 물질 등을 들 수 있다. 이러한 세포사멸 현상과 관련된 유전자 중에서 세포가 죽는 것을 억제하는 기능을 가진 인자들도 세포 내에서 발견되었는데, bcl-2, bclX-L 유사 유전자가 그러한 것들이다. 반면에, bax는 세포사멸을 유도하는 유전자로 알려져 있다. 본 실시예의 실험 과정은 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 1-1의 3,4-디히드로-2-(2,6-디플루오로벤질)-6,7-디메톡시-1-펜타데실이소퀴놀리늄 클로라이드를 처리한 p53 유전자의 결손 및 변이된 자궁 경부암 세포(HeLa) (p53-/-)에서는 세포사멸 촉진 유전자인 bax의 발현이 시간 의존적으로 증가하였고, 이와 반대로 p53 정상 유전자를 포함하는 인간 배아 신장 세포(HEK293) (p53+/+)에서는 세포사멸 억제 유전자인 bcl-2의 발현이 증가하였다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 주사액제의 제조
유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1의 화합물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1의 화합물 1 g
염화나트륨 0.6 g
아스코르브산 0.1 g
증류수 정량
제제예 2 : 시럽제의 제조
화학식 1의 화합물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1의 화합물, 사카린, 당을 온수 80g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100㎖가 되게 하였다.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1의 화합물 2 g
사카린 0.8 g
당 25.4 g
글리세린 8.0 g
향미료 0.04 g
에탄올 4.0 g
소르브산 0.4 g
증류수 정량
제제예 3 : 정제의 제조
유효성분 15㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1의 화합물 250g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1의 화합물 250 g
락토오스 175.9 g
감자전분 180 g
콜로이드성 규산 32 g
10% 젤라틴 용액
감자전분 160 g
활석 50 g
스테아린산 마그네슘 5 g
본 발명의 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체는 p53이 결손 또는 변이된 p53 유전자 기능을 상실한 암세포에만 선택적으로 세포독성 및 세포사멸을 유도하므로, 정상세포에 대한 부작용을 최소화하면서 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 하기 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 포함하는 항암제.
    <화학식 1-1>
    Figure 112007079062005-pat00005
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 암은 p53 유전자의 이상으로 야기되는 암인 것을 특징으로 하는 항암제.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항암제.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 자궁경부 암종인 것을 특징으로 하는 항암제.
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CN103221094A (zh) * 2010-11-19 2013-07-24 诺华有限公司 Mdm2/4及p53相互作用抑制剂的结晶型

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KR20060125000A (ko) * 2005-06-01 2006-12-06 한화석유화학 주식회사 3,4-디히드로이소퀴놀리늄 염 유도체

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