KR102058488B1 - Jcv-vlp를 기초로 한 신규한 약물 전달 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 특히 살아있는 인간의 CNS로 약물을 전달하기 위한 약물 전달 시스템으로서의 약물(카고)이 적하된 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래된 VLP에 관한 것이다.

Description

JCV-VLP를 기초로 한 신규한 약물 전달 시스템{A NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM BASED ON JCV-VLP}
발명의 분야
본 발명은 약물 전달 시스템으로 사용하기 위한 인간 폴리오마 바이러스의 유형의 바이러스 유사 입자(VLP)의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
현대 의약에서 주요한 난제 중 하나는 약물 전달이다. 선택된 작용 부위(예를 들어, 선택된 기관, 조직, 세포 유형, 또는 세포의 미세구획 등)으로의 약물 전달은 약물 표적화로 언급된다. 약물 표적화에 의해, 상기 특정 부위에서의 약물 농도의 증가가 약물의 전신 적용을 이용하더라도 가능해진다. 또한, 통상적인 전신 적용과 대조적으로, 신체의 나머지는 약물에 노출되지 않거나, 단지 적은 범위로 약물에 노출된다. 이는 유해한 부작용의 위험을 감소시키고, 약물의 더 많은 투여를 가능케 할 수 있다. 게다가, 매우 독성의 약물(예를 들어, 암 치료에 사용되는 세포독성제)이 처음으로 인간에게 적용될 수 있는데, 이는 이들의 독성 부작용이 약물 전달 시스템에 의해 최소화되기 때문이다. 일부 경우에, 약물 표적화의 또 다른 장점은 약물의 초기 비활성화(대사), 원치 않는 흡착, 배출 또는 원치 않는 변형의 예방인데, 이는 상기 약물이 전달 방식에 의해 보호되기 때문이다.
중추신경계(CNS), 특히 뇌로의 약물 전달은 큰 난제인데, 이는 처음에 활성 성분이 혈액뇌장벽을 통과해야 하고, 이후 표적 세포에 도달해야 하기 때문이다.
혈액뇌장벽은 모세관의 내피에 의해 형성된다. 이들 내피 세포는 서로 소위 "치밀이음부(tight junction)"에 의해 치밀하게 연결되고, 이에 의해 특정 분자량 크기를 초과하는 물질의 CNS로의 진입을 방지한다. 따라서, 혈액뇌장벽은 효과적인 보호 장벽으로 작용한다. 이는 한편으로 CNS로의 영양소의 공급을 보장하고, 다른 한편으로 CNS 외부로의 대사 생성물의 제거를 가능케 한다.
주요 관심사는 혈액뇌장벽을 통과하는 친수성 물질의 전달이다. 모든 효과적인 시험관내 약물 후보의 거의 95%가 약리학적으로 활성인 농도로 BBB를 통과할 수 없다. 따라서, CNS 내에서 약물의 적절한 약리학적 농도에 도달하기 위해, 많은 CNS 질병, 예를 들어, 뇌종양 또는 CNS 감염의 치료는 약물의 높은 혈장 농도를 필요로 한다. 이는 유해한 부작용의 위험을 포함한다. 따라서, 약학적 연구에서, BBB를 넘어 CNS로의 약물, 특히 친수성 작용제의 전달을 개선시키는 방식이 요구된다.
일부 접근법은 혈액뇌장벽을 통과하는 수용체-매개 전달을 가능케 하는 친지질 입자를 사용한다. 이를 위해, 예를 들어, 특히 나노입자의 전달 시스템이 개발되었다. 나노입자는 보통 중합체로 구성되며, 10-1000 nm의 크기를 갖는다. 대부분 이들은 표면 변형된다.
이들 나노입자는 종종 이들이 BBB에서 발현되는 유출 펌프에 의해 CNS로부터 유출된다는 문제점에 직면한다. 게다가, 이들은 BBB의 온전성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(Rempe et al., Biochem Bioph Res Comm 2011, 406 (1):64-69). 따라서, BBB의 보호 기능은 CNS로의 원치 않는 물질 또는 감염성 존재물의 진입에 의한 부작용의 위험을 포함하는 위험에 처한다. 이러한 실질적인 불이익은 약물 전달 시스템으로서의 나노입자의 임상 적용에서 위험하다.
다른 가능한 약물 전달 시스템은 논의 중이다. 예를 들어, β-갈락토시다제-코딩 DNA와 관련된 뮤린 폴리오마바이러스의 VP1 단백질로부터의 슈도캡시드(pseudocapsid)가 정맥내 투여 후에 뇌로 상기 DNA를 전달하여, 뇌에서 β-갈락토시다제의 발현을 발생시키는데 사용될 수 있는 것이 공지되어 있다(Krauzewicz et al. Gene Therapy 2000, 7, 1094-1102; 또한, WO 98/48841 A1 참조). 그러나, 상기 관찰은 CNS에 대한 약물 전달 시스템으로서 VLP, 특히 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래되고 카고(cargo)가 적하된 VLP의 적합성에 대한 확실한 통찰력을 제공하지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 CNS 세포로의 약물 전달, 즉, BBB를 통과하는 약물 전달을 가능케 하는 약물 전달 시스템을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명자는 일차 돼지 내피 세포를 기초로 한 BBB 모델에서 리포터 단백질을 코딩하는 핵산이 적하된 인간 JCV 기원의 VLP가 BBB를 통과할 수 있고, CNS 세포에 핵산을 전달할 수 있으며, 상기 CNS 세포에서 핵산이 발현되는 것을 발견하였다. 상기 모델은 생체내에서 생리학적으로 온전한 BBB를 나타내는 것으로 간주된다. 따라서, VLP는 BBB를 통과하고, CNS로 진입하나, 단지 활성 물질 단독은 그렇지 않은 것을 나타낸다. 따라서, 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래되고, 카고 물질이 적하된 VLP는 CNS, 특히 뇌로의 약물 전달 시스템으로서 적합하다.
또한, 본 발명자는 적하된 VLP의 횡단이 BBB의 온전성의 손실 또는 증가된 투과성을 요구하지도 않고 발생시키지도 않음을 발견하였다. 그러므로, BBB의 온전성은 VLP에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 따라서, VLP는 CNS로의 원치 않는 물질 또는 감염성 존재물의 진입으로 인한 유해한 부작용의 실질적 위험 없이 CNS로의 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래되고, 카고가 적하된 VLP는 카고와 함께 BBB를 통과하는데 사용된다. 중요하게는, VLP에 의한 BBB의 횡단은 VLP가 뇌 내의 특이적 세포 집단을 표적화하는, 즉, 표적화된 세포로 카고를 전달하는 이의 기능을 나타내는 것을 가능케 한다. 본 발명의 상황에서, 상기 전달은 표적화된 세포로의 전달, 표적화된 세포 내의 전달, 또는 표적화된 세포 내로의 전달을 포함한다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 기능적 VLP는 카고와 함께 BBB를 통과한다.
카고, 바람직하게는 활성 물질은 바람직하게는 VLP의 외피 내에 완전히 캡슐화된다. 그러나, 이는 VLP가, 예를 들어, 외피의 외부 구조로의 활성 물질의 결합에 의해 활성 물질과 추가로 회합될 수 있는 것을 배제하지 않는다. 활성 물질의 일부 분자는 심지어 외피 내에서 불완전하게 캡슐화될 수 있다. 그러나, 활성 물질 분자의 적어도 일부는 외피 내에 완전히 캡슐화된다.
그러므로, 본 발명에 따르면, 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래된 VLP 및 활성 물질의 조성물이 약물 전달 시스템으로서 제공되며, 여기서 활성 물질(카고)의 전체량의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%는 VLP의 외피 내에 캡슐화된다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 조성물의 VLP는 응집되지 않은 VLP이다. 응집되지 않음은 VLP가 물에 현탁되는 경우에 분리된 입자를 형성할 수 있는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, VLP 및 활성 물질의 공동-전달을 가능케 하는 CNS에 대한 약물 전달 시스템이 제공된다. 전달은 능동 또는 수동 전달일 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자는 또한 VLP가 BBB의 유출 전달체에 의해 CNS로부터 제거되지 않거나 실질적으로 제거되지 않는 것을 발견하였다.
본 발명의 VLP는 BBB를 효과적으로 통과하고, CNS로 진입하기 위해 표면 처리 또는 첨가제의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 본 발명의 한 양태에서, 약물 전달 시스템은 임의의 추가 표면 처리 또는 변형, 및 첨가제의 사용 없이 미립자 구조로 제공된다. 약물 전달 시스템은 바람직하게는 세포-비함유 시스템이다.
상기 개설된 바와 같이, 본 발명에 따르면, VLP는 CNS, 특히 뇌로의 약물 전달에 사용된다. 뇌로의 전달은, 예를 들어, 인간 폴리오마 바이러스(특히, JCV)의 자연 친화성을 이용함으로써 특정 세포로의 약물 표적화를 가능케 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
바람직하게는 적어도 하나의 VP1을 포함하는 인간 폴리오마 바이러스, 특히 JCV로부터 유래된 바이러스-유사 입자(VLP)가 본 발명에 따른 약물 전달에 사용된다. VLP는 바람직하게는 오합체 구조로 어셈블리된 VP1의 외피 조성으로 구성된다. 바람직하게는, VLP는 여러 VP1, 특히 여러 VP1 오합체, 특히 72개의 VP1 오합체로 구성된다. 그러나, VLP는 임의로 외피로 통합된 추가 분자를 포함할 수 있다. VLP를 어셈블리시키는 구조 분자는 자연 폴리오마 바이러스 단백질과 동일할 수 있거나, VLP 특징을 최적화시키기 위해 변형될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 VLP는 카고 적하를 추가로 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 카고의 전체량의 주요 부분은 외피에 완전히 통합된다. VLP에 의한 카고 분자의 완전한 캡슐화를 기재하기 위해, 용어 "적하된"이 사용된다. 그러므로, "적하된 VLP"는 완전히 캡슐화된 카고를 갖는 VLP이다.
상기 카고 적하는 외피에 의해 둘러싸인 공간 내부에 적당한 임의의 분자 또는 조성물일 수 있다. 바람직하게는, 카고 적하는 세포독성제, 검출가능한 작용제, 예를 들어, 방사성핵종, 단백질, 펩티드 또는 핵산, 특히 요망되는 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA, cDNA, 플라스미드 또는 벡터, 억제성 핵산, 예를 들어, siRNA 또는 miRNA 및 촉매 활성을 갖는 핵산, 예를 들어, 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산이다. 카고 적하는 종종 "활성 물질", "약물 물질" 또는 "활성 성분"으로 이하 언급된다. 달리 명백히 언급되지 않는 한, 이들 용어는 동의어로 사용된다.
VLP는 용액 상태의 요망되는 성분, 특히 VP1, 임의로 VP2, 임의로 VP3 또는 이들의 혼합물 및 임의로 카고 적하를 제공하고, 성분들이 VLP로 어셈블리되는 것을 가능케 함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 성분들의 혼합은 VLP 어셈블리가 발생하지 않거나 단지 제한된 VLP가 발생하는 조건, 예를 들어, 낮은 Ca2 + 농도 및/또는 환원 조건 하에서 수행될 수 있고, 모든 요망되는 성분의 첨가 후, 상기 조건은 VLP 어셈블리에 유리한 조건, 예를 들어, 더 높은 Ca2 + 농도 및/또는 산화 조건으로 변경된다. 그러나, VLP 생성은 또한 생체내에서 발생할 수 있다. 특히, VLP의 성분은 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있고, VLP는 숙주 세포의 내부 또는 숙주 세포의 용해 또는 파괴시에 어셈블리된다.
용어 "인간 폴리오마 바이러스"는 JCV, BK 및 SV40을 포함하는 인간 폴리오마 바이러스의 패밀리를 나타낸다. 특정한 바람직한 구체예에서, 인간 폴리오마 바이러스는 JCV이다.
본 발명에 따른 "VP1" 또는 "바이러스 단백질 1"은 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열을 갖는 JC 바이러스의 자연 VP1과 동일하거나 이로부터 유래되는 단백질을 나타낸다. JC 바이러스의 자연 VP1으로부터 유래된 단백질은 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개의 연속적 아미노산의 서열에 걸쳐 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열과의 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 아미노산 상동성 또는 동일성은 자연 JCV-VP1의 전장에 걸쳐 계산된다. 특히, 용어 "JC 바이러스의 자연 VP1으로부터 유래된 VP1" 및 "JC 바이러스로부터 유래된 VP1"은 또한 JC 바이러스의 자연 VP1과 동일한 VP1을 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "VP1"은 또한 VLP에 어셈블리될 수 있는 자연 VP1의 분획 및 유도체를 포함한다. 바람직하게는, VP1의 상기 분획 및 유도체는 적어도 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열의 아미노산 32 내지 316, 또는 적어도 100개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개의 연속적 아미노산의 서열, 바람직하게는 전체 서열에 걸쳐 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 32 내지 316으로부터의 아미노산 서열과의 상동성 또는 동일성을 갖는 유도체를 포함한다.
본 발명에 따른 VP1은 또한 이종성 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 NLS는 NP1의 N-말단 앞, 또는 NP1의 N-말단내, 특히 VP1의 처음 30개, 처음 25개, 처음 20개, 처음 15개 또는 처음 10개의 아미노산으로 도입된다. 예를 들어, NLS는 WO 2009/036933호(예를 들어, 10페이지, 4 내지 13행 및 도 4A) 또는 문헌[Shishido-Hara et al. (Shishido-Hara, Y., Hara, Y., Larson, T., Yasui, K., Nagashima, K. & Stoner, G.L. Analysis of Capsid Formation of Human Polyomavirus JC (Tokyo-1 Strain) by a Eukaryotic Expression System: Splicing of Late RNAs, Translation and Nuclear Transport of Major Capsid Protein VP1, and Capsid Assembly. Journal of Virology 74, 1840-1853 (2000)]에 기재되어 있다.
한 구체예에 따르면, SEQ ID NO:5에 따른 아미노산 서열이 VP1의 N-말단 부분, 특히 SEQ ID NO:1의 아미노산 9 및 10에 해당하는 아미노산 사이에 도입된다.
본 발명에 따른 "VP2" 또는 "바이러스 단백질 2"는 SEQ ID NO:3에 따른 아미노산 서열을 갖는 JC 바이러스의 자연 VP2와 동일하거나 이로부터 유래되는 단백질을 나타낸다. JC 바이러스의 자연 VP2로부터 유래된 단백질은 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개의 연속적 아미노산의 서열에 걸쳐 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 SEQ ID NO:3에 따른 아미노산 서열과의 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 아미노산 상동성 또는 동일성은 자연 JCV-VP2의 전장에 걸쳐 계산된다. 특히, 용어 "JC 바이러스의 자연 VP2로부터 유래된 VP2" 및 "JC 바이러스로부터 유래된 VP2"는 또한 JC 바이러스의 자연 VP2와 동일한 VP2를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "VP2"는 또한 VP1과 함께 VLP로 어셈블리될 수 있는 자연 VP2의 분획 및 유도체를 포함한다. 바람직하게는, VP2의 상기 단편은 적어도 SEQ ID NO:3에 따른 아미노산 서열의 아미노산 214 내지 318, 또는 적어도 100개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개의 연속적 아미노산의 서열, 바람직하게는 전체 서열에 걸쳐 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 SEQ ID NO:3의 아미노산 위치 214 내지 318로부터의 아미노산 서열과의 상동성 또는 동일성을 갖는 유도체를 포함한다.
본 발명에 따른 "펩티드"는 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 연결되는, 임의의 유형의 임의의 수의 아미노산, 바람직하게는 자연 발생 아미노산으로 구성될 수 있다. 특히, 펩티드는 적어도 3개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 5개, 적어도 7개, 적어도 9개, 적어도 12개 또는 적어도 15개의 아미노산을 포함한다. 게다가, 펩티드의 길이에 대한 상한은 없다. 그러나, 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드는 500개의 아미노산, 바람직하게는 300개, 250개, 200개, 150개 또는 120개의 아미노산의 길이를 초과하지 않는다.
본원에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 문자 상의 의미 외에 또한 표현 "-로 본질적으로 구성되다" 및 "-로 구성되다"를 포함하고 특별히 이를 나타낸다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 구성요소를 "포함하는" 주제가 추가 구성요소를 포함하지 않는 구체예 뿐만 아니라 특별히 나열된 구성요소를 "포함하는" 주제가 추가 구성요소를 포함할 수 있고/있거나 확실히 포함하는 구체예를 나타낸다. 마찬가지로, 표현 "갖다"는 표현 "-로 본질적으로 구성되다" 및 "-로 구성되다"를 또한 포함하고 이를 특별히 언급하는 표현 "포함하다"와 같이 이해되어야 한다.
투여 방법
본 발명의 VLP는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 특히 바람직한 것은 활성 물질의 전신 효과를 가능케 하는 투여 형태이다. 가장 바람직한 것은 경구 또는 비경구, 특히 정맥내 투여되는 투여 형태이다.
제조 방법
바이러스-유사 입자의 제조
한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자를 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 특히 하기 단계를 포함한다:
(a) JC 바이러스로부터 유래되는 바이러스 단백질 VP1을 제공하는 단계;
(b) JC 바이러스로부터 유래되는 바이러스 단백질 VP2 및/또는 VP3, 바람직하게는 VP2를 임의로 제공하고, VP1과 VP2(및/또는 VP3)를 혼합하는 단계;
(c) VP1 및 임의로 VP2(및/또는 VP3)가 바이러스-유사 입자로 어셈블리되도록 하는 단계.
상기 방법은 바람직하게는 카고 적하를 제공하고, VP1 및 임의로 VP2 및/또는 VP3와 카고 적하를 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 것은 VP1과 VP2의 혼합물이다.
VLP의 어셈블리시, 카고 적하는 바람직하게는 VLP 내에 캡슐화된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 VLP가 카고 적하를 가지며, 더욱 바람직하게는 어셈블리된 VLP의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%가 카고 적하를 갖는다.
바이러스-유사 입자의 어셈블리는 바람직하게는 용액 상태, 더욱 바람직하게는 수용액 상태로 발생한다. VLP의 어셈블리를 가능케 하는 것은 바람직하게는 VLP의 어셈블리가 발생할 수 있는 수준으로 용액 내의 Ca2 + 이온 농도를 조정하는 것을 포함한다. 상기 Ca2 + 이온 농도는 특히 0.1 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 0.2 mM 내지 3 mM, 더욱 바람직하게는 0.5 mM 내지 2 mM 또는 0.8 mM 내지 1.2 mM, 가장 바람직하게는 약 1 mM 범위이다. 게다가, VLP의 어셈블리를 가능케 하는 것은 바람직하게는, 특히 유의한 농도의 환원제, 예를 들어, DTT, DTE 또는 머캅토에탄올의 부재하에서 산화 조건하에서 발생한다.
바이러스 단백질의 제공 및 VLP 어셈블리를 가능케 하는 것은 동시에 수행될 수 있다. 특히, 바이러스 단백질은 VLP 어셈블리가 발생할 수 있는 조건하에 제공된다. 바람직한 구체예에서, 바이러스 단백질 및 VLP 어셈블리의 제공은 생체내에서 수행된다. 특히, VLP는 바이러스 단백질을 발현하는 숙주 세포 내부 또는 숙주 세포의 용해 또는 파괴시에 어셈블리된다.
VLP의 어셈블리는, 예를 들어, 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 EP 0 862 633호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
전달 방법
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자를 이용하여 중추신경계에서 표적 세포로 물질 또는 조성물을 전달하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:
(a) 카고 적하로서 물질 또는 조성물을 포함하는 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자를 제공하는 단계; 및
(b) 살아있는 신체, 바람직하게는 인간에게 바이러스-유사 입자를 투여하는 단계.
표적 세포는 JC 바이러스의 자연 표적 세포일 수 있다.
활성 물질 또는 조성물은 임의의 종류 또는 자연의 활성 물질 또는 조성물일 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 활성 물질은 핵산, 특히 단백질 또는 펩티드를 엔코딩하는 핵산 또는 억제성 핵산, 예를 들어, siRNA 또는 miRNA이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 활성 물질은 단백질 또는 펩티드이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성 물질은 소분자, 특히 음으로 하전된 소분자이다. 활성 물질은 또한 다양한 활성 물질의 혼합물일 수 있다.
활성 물질은 바람직하게는 세포독성제이다.
더욱이, 본 발명은 일반적으로 신경계, 신경 또는 신경변성 장애, 예를 들어, 특히 다발경화증, 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 치료 또는 진단을 위한 약물 전달 시스템으로서 사용될 수 있는 VLP에 관한 것이다.
한 바람직한 구체예에서, VLP는 희소돌기아교세포 내, 희소돌기아교세포로 또는 희소돌기아교세포 내부로 전달된다.
실시예
1. 시험관내에서의 혈액뇌장벽(BBB) 모델에서의 VP1-VLP
이러한 시험관내 실험은 인간 BBB의 구성 및 특성과 일치하는 모델 시스템에서 BBB를 통과하는 VLP의 능력을 나타낸다. 상기 모델 시스템에서, 시험관내에서 혈액뇌장벽을 형성시킬 수 있는 돼지 일차 뇌 내피 세포(PBCEC)를 사용하였다(Angelow S, Zeni P and Galla HJ "Usefulness and limitation of primary cultured porine horoid plexus epithel cells as an in vitro model to study drug transport at the blood-CSF barrier", Adv Drug Delivery 2004; 56(12): 1859-73).
PBCEC 제조 및 배양을 문헌[Rempe et al ., BBRC, 2011: Transport of Poly-(n-butylcyano-acrylate) nanoparticles across the blood-brain-barrier in vitro and their influence on barrier integrity]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
Transwell 필터 시스템에서 PBCEC에 대한 카고-함유 VLP의 효과를 상대적 내피세포통과 전기 저항 측정(relative transendothelial electrical restance measurement, TEER)의 도움으로 조사하였다(Rempe et al., 2011). 전달의 정량적 증거를 확립하기 위해, 본 발명자는 카고로서 플라스미드 DNA를 이용하였다. 혈액뇌장벽의 온전성은 임의의 환경 및 농도하에서 VP1-VLP에 의해 영향을 받지 않았다.
시험관내에서 혈액뇌장벽을 통한 카고 전달을 확인하기 위해, 플라스미드 DNA를 문헌[Goldmann et al. 1999 (Journal of Virology: Molecular cloning and expression of major structural protein VP1 of the human polyoma virus: formation of virus like particles useful for immunological and therapeutic studies and measured quantitatively by specific qPCR)]에 기재된 바와 같이 VLP로 패킹시켰다. 플라스미드 DNA의 카피를 BBB 시험관내 모델에서 정상(apical) 및 바닥가쪽(basolateral) 측면 상에서 정량하였다. 정상 측면은 VLP가 첨가되는 곳(생체내 혈관 루멘)이며, 바닥가쪽 측면은 뇌를 나타낸다. 바닥가쪽 측면 상의 플라스미드 DNA의 정량적 증거는 뇌 내피 세포를 통한 분자의 VLP-매개 통과, 및 혈액뇌장벽을 통한 카고 전달을 각각 나타낸다.
2. 생체내에서의 리포터 유전자 전달 및 발현
리포터 유전자 전달 실험을 살아있는 유기체에서 세포 및 기관으로 물질을 전달하는 JC VP1-VLP의 능력을 나타내도록 설계하였다. 이러한 경우, 리포터 유전자 발현은 전달 뿐만 아니라 전달된 물질의 기능성을 또한 입증하기 위한 최적의 방법 중 하나이다(Hoffman, R.M., 2005: THE MULTIPLE USES OF FLUORESCENT PROTEINS TO VISUALIZE CANCER IN VIVO. Nat. Rev. Cancer; 5(10):796-806).
재료
다양한 VP1-VLP 프로브를, 시험관 내에서 Cos7(그린 몽키 신장 세포) 세포로 리포터 플라스미드를 패킹하고 전달하는 능력에 대해 시험하였는데, 이는 상기 세포주가 JCV VLP에 의해 형질도입될 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 9개의 염 침전된 VP1-VLP 프로브 및 15개의 크로마토그래피 정제된 VP1-VLP 프로브가 있었다. 시험관내 형질도입 실험을 5회 반복하였다. 이러한 실험에서, 생체내 실험을 위해 루시페린(Luciferin) 기질을 이용하여 최대 발광 신호를 전달하는 능력을 시험하였다.
염 침전된 VP1-VLP를 밤새 침전시키고, 표준 완충액(150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH7,5)에 대해 24시간 동안 투석시켰다. 리포터 유전자 플라스미드의 패키징을 문헌[Goldmann et al., 1999, Journal of Virology: Molecular cloning and expression of major structural protein VP1 of the human polyoma virus: formation of virus like particles useful for immunological and therapeutic studies]에 기재된 바와 같이 화학적 해리 및 재회합에 의해 달성시켰다.
실험 기획
면역적격 BALB/c 마우스로의 VLP의 정맥내 주사를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥에서 수행하였다.
동물을 하기와 같이 그룹화시켰다:
- 5 ㎍ 염 침전된 VLP (4마리의 동물)
- 50 ㎍ 염 침전된 VLP (4마리의 동물)
- 5 ㎍ 크로마토그래피 정제된 VLP (4마리의 동물)
- DNA 대조군 (리포터 유전자 플라스미드 단독) (3마리의 동물)
- VLP 대조군 (VP1-VLP 캡시드 단독) (3마리의 동물)
생물발광을 루시페린 기질의 복막내 주사 2, 4, 7, 14 및 22일 후, 및 12분 후에 측정하였다. 결과를 각각의 그룹에서 풀링시키고, 평균 결과 및 표준 편차를 계산하였다. 평균을 사후 검정으로서 홈-시닥-검정(Holm-Sidak-Test)과 함께 2원-ANOVA(Two-Way-ANOVA)를 이용하여 분석하였다.
결과는 도 3 및 4에 제시된다.
3. 루시페라제 플라스미드 적하된 JC VP1 - VLP 및 루시페라제 플라스미드와 혼합된 JC VP1 - VLP 의 도움에 의한 Cos7 세포(아프리카 그린 몽키 신장 세포)의 형질도입 효능
1. 형질도입 18시간 전에 Cos7 세포를 24-웰 플레이트로 계대배양시켰다.
2. VP1-VLP를 DTT 및 EGTA로 해리시키고, 루시페라제 플라스미드와 혼합시키고, +4℃에서 밤새 재회합 완충액에 대해 투석시켰다.
3. 다음날, 패킹된 VP1-VLP를 투석으로부터 분리시켰다.
4. 루시페라제 플라스미드와 혼합된 VP1-VLP를 문헌[Krauzewicz (Gene Therapy (2000) 7, 1094-1102)]에 따라 제조하였다:
a. VLP 대 루시페라제 플라스미드 혼합 비는 30:1(w/w)이었다.
b. 이러한 혼합물을 RT에서 15분 인큐베이션시켰다.
c. 혼합물을 DMEM 세포 배지로 희석시키고, 24-웰 플레이트에서 Cos7 세포로 피펫팅시켰다.
5. 루시페라제 플라스미드로 패킹된 VP1-VLP를 Cos7 세포로 피펫팅시키고, 루시페라제 플라스미드와 혼합된 VP1-VLP도 동일하게 수행하였다.
6. 72시간 후, 세포를 용해시키고, 루시페라제 활성을 Promega의 루시페라제 검정의 도움으로 삼중으로 측정하였다.
독립된 형질도입 실험의 결과가 도 5에 제시된다.
4. 루시페라제 플라스미드로 패킹된 VLP 의 정맥내 적용 후의 마우스 뇌에서의 루시페라제 및 VP1 단백질의 면역조직화학 검출
상기 제시된 바와 같이, JC VP1-VLP는 플라스미드 DNA의 검출(qPCR에 의함) 또는 루시페라제 활성에 의해 증명되는 바와 같이 살아있는 유기체에서 세포 및 기관으로 물질을 전달할 수 있다. 이들 실험 결과는 뇌에서의 루시페라제 단백질 및 VP1 단백질의 면역조직화학 검출에 의해 추가로 뒷받침된다.
면역적격 BALB/c 마우스로의 VLP의 정맥내 주사된 마우스로부터 뇌 조직을 분리시키고(상기 기재된 바와 같이 처리), PFA에서 고정시키고, 문헌[J.Jankowski et al., The Journal of comparative Neurology 472: 87-99, 2004: "Engrailed-2 negatively regulates the onset if prenatal Purkinje Cell differentiation"]에 기재된 바와 같이 파라핀에 포매시켰다. 7 내지 10 ㎛의 얇은 섹션을 절단하고, Histobond plus 슬라이드에 마운팅(mounting)시켰다. 섹션을 재수화시키고, 내인성 퍼옥시다제를 비활성화시키고, 섹션을 투과화시켰다. 블로킹 단계를 3% 소 혈청 알부민 용액에서 수행하였다. 루시퍼라제 단백질 또는 VP1 단백질을 각각 모노클로날 항체로 검출하였다. 신호 강도를 증가시키기 위해, TSA 증폭 형광 시스템(TSA™ Plus Fluorescein System, Perkin Elmer)을 이용하였다.
결과: 도 6B의 우측 패널에 제시된 바와 같이, 항-VP1 항체를 이용한 면역조직화학 분석은 CNS의 세포에서 VP1 단백질을 검출할 수 있었다. 뇌 절편은 불규칙한 크기의 분산된 반점을 나타내는데, 이는 뇌 실질 내의 VP1의 세포 국소화를 나타낸다. 항-루시페라제 항체를 이용하여, 루시페라제 단백질이 또한 CNS의 세포에서 검출될 수 있었다. VP1 단백질에 대한 결과에 따르면, 뇌 절편의 루시페라제-유도 염색은 또한 뇌 실질 내에서 루시페라제의 세포 국소화를 나타내는 불규칙한 크기의 분산된 반점을 나타낸다.
논의: 뇌 내의 루시페라제 및 VP1 단백질의 세포 존재는 본 발명의 기본적 개념의 추가의 증거인데, 이는 VLP가 BBB를 통과하여 CNS로 진입하나, 활성 물질 단독은 그렇지 않은 것을 나타내기 때문이다.
5. 공동국소화 분석은 희소돌기아교세포에서 VP1 단백질의 존재를 나타낸다.
CNS에서의 VP1 단백질의 상기 기재된 세포 검출을 기초로 하여, 각각의 표적 세포를 확인하기 위해 공동국소화 실험을 수행하였다. 상기 목적을 위해, 검출된 VP1 단백질을 희소돌기아교세포에 특이적으로 위치되는 마커 Olig 2와 함께 공동국소화시켰다(B. Menn et al., "Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain", The Journal of Neuroscience, 2006, 26(30): 7907-7918).
결과: 도 8의 하단 좌측 패널에 제시된 바와 같이, Olig2 마커를 이용함으로써, 모든 경우에 또한 핵 염색 DAPI에 의해 염색되고(도 8의 상단 좌측 패널), 이에 따라 희소돌기아교세포를 나타내는 여러 불규칙한 반점이 뇌 절편에서 검출될 수 있었다. 상기 희소돌기아교세포 각각은 또한 도 8의 하단 우측 패널에 제시된 바와 같이 VP1 단백질에 대해 양성이다. Olig2 및 VP1에 대해 양성인 세포는 백색 화살표로 표시된다. 그러므로, VP1 단백질은 CNS 희소돌기아교세포에 국소화되고, 이는 정맥내 적용된 VLP에 의한 상기 세포의 감염을 나타낸다.
논의: 뇌 희소돌기아교세포에서의 VP1 단백질의 검출은 JCV 바이러스의 자연 친화성과 일치한다. 결과로서, 본 발명의 청구된 VLP는 다발경화증과 같은 희소돌기아교세포와 관련된 질병의 치료적 치료에 특히 적합하다.
범례:
도 1: a, b- 상대적 내피세포통과 전기 저항 발생(a 및 b), 웰 당 5*108 내지 2*1012개의 입자의 농도의 VP1-VLP의 첨가 후(n=3).
도 2: 특정 프라이머를 이용한 qPCR 을 이용하여 측정된 시험관내 모델에서의 혈액뇌장벽을 통한 VP1 - VLP 적하된 DNA 의 통과. 첨가된 VLP - BBB 모델에서 정상 측면 상에 첨가된 VLP의 수, 검출된 VLP - BBB 모델에서 정상 및 바닥가쪽 측면 상에서의 플라스미드의 검출된 수(n=3).
도 3: 정맥내 적용 후 마우스 신체에서의 생물발광 신호: 5 ㎍ 염 침전된 VLP; 50 ㎍ 염 침전된 VLP; 5 ㎍ 크로마토그래피 정제된 VLP; DNA 대조군(리포터 유전자 플라스미드 단독); VLP 대조군(VP1-VLP 캡시드 단독). 예로서, 배쪽 및 등쪽 측면 상에서의 각각의 그룹의 1마리의 마우스.
도 4: 정맥내 적용 후 마우스 머리에서의 생물발광 신호: 5 ㎍ 염 침전된 VLP; 50 ㎍ 염 침전된 VLP; 5 ㎍ 크로마토그래피 정제된 VLP; DNA 대조군(리포터 유전자 플라스미드 단독). VLP 대조군(백그라운드 신호)을 공제한 그룹 내의 평균 결과.
도 5: a, b: 루시페라제 플라스미드 DNA 가 적하된 , VP1 - VLP 의 도움에 의한 Cos7 세포의 형질도입. RLU - 상대적 발광 단위(Relative Light Unit); 25㎍의 패킹된 VLP - 25㎍의 루시페라제 플라스미드로 패킹된 JC VP1-VLP; 50㎍의 패킹된 VLP - 50㎍의 루시페라제 플라스미드로 패킹된 JC VP1-VLP; 50㎍의 혼합된 VLP - 50㎍의 루시페라제 플라스미드와 혼합된 JC VP1-VLP; DNA 대조군 - 루시페라제 플라스미드 대조군.
도 6: 뇌 섹션의 면역조직화학 분석. 좌측 컬럼은 세포 핵의 DAPI 염색을 나타내고, 우측 컬럼은 형광 표지된 단백질을 나타낸다: A- 음성 대조군; B- VP1 단백질의 FITC-형광 염색; C- 루시페라제 단백질의 FITC-형광 염색.
도 7: 희소돌기아교세포 마커 Olig2와 VP1 단백질의 공동국소화에 대한 음성 대조군. 상단 좌측 패널은 염료 DAPI를 이용한 세포 핵의 염색을 나타낸다. 상단 우측 패널은 항-VP1 항체의 사용이 없는 형광 검출 후의 신호를 나타낸다. 하단 좌측 패널은 항-Olig2 항체의 사용이 없는 형광 검출 후의 신호를 나타낸다. 하단 우측 패널은 2개의 대조군 염색의 합쳐진 그림을 나타낸다.
도 8: 희소돌기아교세포 마커 Olig2와 VP1 단백질의 공동-국소화. 상단 좌측 패널은 염료 DAPI를 이용한 세포 핵의 염색을 나타낸다. 상단 우측 패널은 VP1 단백질의 국소화를 나타낸다(FITC-형광). 하단 좌측 패널은 항-Olig2 항체를 이용한 염색을 나타낸다(TRITC-형광). 하단 우측 패널은 Olig2-마커 및 VP1 단백질에 대한 염색의 합쳐진 그림을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG <120> A novel drug delivery system based on JCV-VLP <130> 54 311 K <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 354 <212> PRT <213> JC polyoma virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(354) <223> capsid protein VP1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Pro or Arg <400> 1 Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Xaa Lys Asp Pro Val Gln Val 1 5 10 15 Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr 20 25 30 Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met 35 40 45 Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile 50 55 60 Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr 85 90 95 Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val 100 105 110 Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr 115 120 125 His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe 130 135 140 Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr 165 170 175 Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys 180 185 190 Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn 195 200 205 Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro 210 215 220 Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala 245 250 255 Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp 260 265 270 Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val 275 280 285 Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg 290 295 300 Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln 305 310 315 320 Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp 325 330 335 Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Lys Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys 340 345 350 Met Leu <210> 2 <211> 1065 <212> DNA <213> JC virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1065) <223> capsid protein VP1 <400> 2 atggctccca ccaagcgcaa gggcgagcsc aaggaycccg tgcaagtgcc caagctgctg 60 atccgtggtg gtgtcgaggt gctggaagtc aagaccggcg tggactccat taccgaggtg 120 gagtgcttcc tcacccccga gatgggtgac cctgacgagc acctgagggg cttctccaag 180 tccatctcca tctccgacac cttcgagtcc gactccccca accgtgacat gctgccctgc 240 tactccgtgg ctcgtatccc cctgcccaac ctgaacgagg acctgacttg cggcaacatc 300 ctgatgtggg aggctgtgac cctcaagacc gaggtcatcg gcgtgacttc cctgatgaac 360 gtgcactcca acggccaggc tacccacgac aacggtgctg gcaagcccgt gcagggaacc 420 tccttccact tcttctccgt gggtggcgag gctctggaac tccagggcgt ggtgttcaac 480 taccgtacca agtaccccga cggcaccatc ttccccaaga acgctactgt gcagtcccaa 540 gtgatgaaca ccgagcacaa ggcttacctg gacaagaaca aggcctaccc cgtggagtgc 600 tgggtgcccg accccacccg taacgagaac acccgttact tcggcaccct gaccggtgga 660 gagaacgtgc cccccgtgct gcacatcacc aacaccgcta ccaccgtgct gctggacgag 720 ttcggtgtcg gtcccctgtg caagggcgac aacctgtacc tgtccgctgt ggacgtgtgc 780 ggcatgttca ccaaccgttc cggttcccag cagtggcgtg gcctgtcccg ctacttcaag 840 gtgcagctgc gcaagcgtcg tgtgaagaac ccctacccta tctccttcct gctgaccgac 900 ctgatcaacc gtcgtacccc tcgtgtggac ggccagccca tgtacggcat ggacgctcag 960 gtggaagagg tccgcgtgtt cgagggcacc gaggaattgc ccggcgaccc cgacatgatg 1020 cgttacgtgg acaagtacgg ccagctccag accaagatgc tgtaa 1065 <210> 3 <211> 344 <212> PRT <213> JC virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(344) <223> capsid protein VP2 <400> 3 Met Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Asp Leu Val Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ser Val Ala Glu Ile Ala Ala Gly 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Thr Ile Glu Val Glu Ile Ala Ser Leu Ala Thr Val 35 40 45 Glu Gly Ile Thr Ser Thr Ser Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Leu Thr 50 55 60 Pro Glu Thr Tyr Ala Val Ile Thr Gly Ala Pro Gly Ala Val Ala Gly 65 70 75 80 Phe Ala Ala Leu Val Gln Thr Val Thr Gly Gly Ser Ala Ile Ala Gln 85 90 95 Leu Gly Tyr Arg Phe Phe Ala Asp Trp Asp His Lys Val Ser Thr Val 100 105 110 Gly Leu Phe Gln Gln Pro Ala Met Ala Leu Gln Leu Phe Asn Pro Glu 115 120 125 Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Gly Val Asn Ala Phe Val Asn Asn 130 135 140 Ile His Tyr Leu Asp Pro Arg His Trp Gly Pro Ser Leu Phe Ser Thr 145 150 155 160 Ile Ser Gln Ala Phe Trp Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Pro Ser Leu 165 170 175 Thr Ser Gln Glu Ile Gln Arg Arg Thr Gln Lys Leu Phe Val Glu Thr 180 185 190 Leu Ala Arg Phe Leu Glu Glu Thr Thr Trp Ala Ile Val Asn Ser Pro 195 200 205 Val Asn Leu Tyr Asn Tyr Ile Ser Asp Tyr Tyr Ser Arg Leu Ser Pro 210 215 220 Val Arg Pro Ser Met Val Arg Gln Val Ala Gln Arg Glu Gly Thr Tyr 225 230 235 240 Ile Ser Phe Gly His Ser Tyr Thr Gln Ser Ile Asp Asn Ala Asp Ser 245 250 255 Ile Gln Glu Val Thr Gln Arg Leu Asp Leu Lys Asn Pro Asn Val Gln 260 265 270 Ser Gly Glu Phe Ile Glu Lys Ser Phe Ala Pro Gly Gly Ala Asn Gln 275 280 285 Arg Ser Ala Pro Gln Trp Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr Gly 290 295 300 Thr Val Thr Pro Ala Leu Glu Ala Tyr Glu Asp Gly Pro Asn Lys Lys 305 310 315 320 Lys Arg Arg Lys Glu Gly Pro Arg Ala Ser Ser Lys Thr Ser Tyr Lys 325 330 335 Arg Arg Ser Arg Ser Ser Arg Ser 340 <210> 4 <211> 1032 <212> DNA <213> JC virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1032) <223> capsid protein VP2 <400> 4 atgggtgccg cacttgcact tttgggggac ctagttgcta ctgtttctga ggctgctgct 60 gccacaggat tttcagtagc tgaaattgct gctggagagg ctgctgctac tatagaagtt 120 gaaattgcat cccttgctac tgtagagggg attacaagta cctctgaggc tatagctgca 180 ataggcctta ctcctgaaac atatgctgta attactggag ctccgggggc tgtagctggg 240 tttgctgcat tggttcaaac tgtaactggt ggtagtgcta ttgctcagtt gggatataga 300 ttttttgctg actgggatca taaagtttca acagttgggc tttttcagca gccagctatg 360 gctttacagt tatttaatcc agaagactac tatgatattt tatttcctgg agtgaatgcc 420 tttgttaaca atattcacta tttagatcct agacattggg gcccttcttt gttctccaca 480 atctcccagg ctttttggaa tcttgttaga gatgatttgc catctttaac atctcaggaa 540 attcaaagaa gaacccaaaa actatttgtt gaaactttag caaggttttt ggaagaaact 600 acttgggcaa tagttaattc accagttaac ttatataatt atatttcaga ctattattct 660 agattgtctc cagttaggcc ctctatggta aggcaggttg cccaaaggga gggaacctat 720 atttcctttg gccactcata cacccaaagt atagataatg cagacagcat tcaagaagtt 780 acccaaaggc tagatttaaa aaacccaaat gtgcaatctg gtgaatttat agagaaaagt 840 tttgcaccag gaggtgcaaa tcaaagatct gctcctcaat ggatgttgcc tttactttta 900 gggttgtacg ggactgtaac acctgctctt gaagcatatg aagatggccc caacaaaaag 960 aaaaggagaa aggaaggacc ccgtgcaagt tccaaaactt cttataagag gaggagtaga 1020 agttctagaa gt 1032 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> nuclear localization signal <400> 5 Cys Pro Gly Ala Ala Pro Lys Lys 1 5

Claims (17)

  1. 중추신경계(central nervous system (CNS)) 질병의 치료 방법 또는 생체 내(in vivo) 진단 방법에 사용하기 위한 약물을 포함하는 인간 폴리오마 바이러스로부터 유래된 바이러스 유사 입자(virus-like particle (VLP))를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, CNS가 살아있는 인간의 CNS인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, VLP가 JC 바이러스로부터 유래된 것인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 조성물이 VLP에 의해 캡슐화된 약물과 함께 혈액뇌장벽을 통과하여 CNS로 진입하는 것인 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 조성물이 생리학적으로 온전한(intact) 혈액뇌장벽을 통과함을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, VLP가 JC 바이러스의 VP1 단백질로 구성됨을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, VLP가 정맥내 투여용으로 제조됨을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, VLP가 VP1을 포함하고, VP1은 이의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, VLP가 VP1 및 VP2를 포함하고, VP1이 이의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VP2가 이의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:3에 따른 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 약물이 세포독성제, 검출가능한 작용제, 단백질, 펩티드 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 검출가능한 작용제는 방사성핵종임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 핵산은 요망되는 단백질을 인코딩하는 핵산, 억제성 핵산, 및 촉매 활성을 갖는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 요망되는 단백질을 인코딩하는 핵산은 mRNA, cDNA, 플라스미드 및 벡터로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 억제성 핵산은 siRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 12항에 있어서, 촉매 활성을 갖는 핵산은 리보자임인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 (카고(cargo))의 전체량의 적어도 1%가 VLP의 외피 내에 완전히 캡슐화되는, 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, VLP가 응집되지 않은, 조성물.
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