MX2014010651A - Sistema de liberacion de principio activo novedoso basado en jcv-vlp. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un derivado de VLP del virus del polioma humano cargado con un principio activo (carga) como un sistema de liberación de principio activo para trasportar el principio activo hacia el SNC, en particular de humanos vivos.

Description

SISTEMA DE LIBERACIÓN DE PRINCIPIO ACTIVO NOVEDOSO BASADO EN JCV-VLP CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el uso de partículas similares a un virus (VLP por sus siglas en ingles) del tipo del virus del polioma humano para usarse como sistema de liberación de principio activo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Uno de los desafíos principales en la medicina moderna es la liberación del principio activo. La liberación de un principio activo a un sitio de acción seleccionado (por ejemplo un órgano, tejido tipo de célula o microcompartimento de una célula seleccionada, etc.) es llamado direccionamiento del principio activo. Mediante direccionamiento de un principio activo se vuelve posible un incremento de la concentración de principio activo en este sitio específico, aún con una aplicación sistémica del principio activo. Adicionalmente, contrario a la aplicación sistémica común, el resto del cuerpo no está o sólo está expuesto en un grado menor al principio activo. Esto conduce a un riesgo reducido de los efectos laterales adversos y puede permitir una dosificación mayor del principio activo. Además, los principios activos muy tóxicos (por ejemplo agentes citotóxicos usados en compuestos terapéuticos para el cáncer) pueden ser aplicables a humanos por primera vez, puesto que sus efectos laterales tóxicos son minimizados por el sistema de liberación de principio activo. En algunos casos, otra ventaja del direccionamiento del principio activo es la prevención de la inactivación temprana (metabolismo), adsorción indeseable, excreción o modificación indeseable del principio activo, puesto que el principio activo es protegido por el modo de liberación.

La liberación del principio activo hacia el sistema nervioso central (SNC por sus siglas en ingles), en particular al cerebro, es un gran desafio, puesto que los ingredientes activos tienen que cruzar primero la barrera sanguinea-cerebral (BSC por sus siglas en ingles), y entonces deben alcanzar las células blancas.

La barrera sanguinea-cerebral está formada por el endotelio de los capilares. Esas células endoteliales están fuertemente conectadas por las llamadas "uniones apretadas" entre si y ellas evitan la entrada de sustancias por encima de un cierto tamaño de peso molecular hacia el SNC. La barrera sanquinea-cerebral sirve de este modo como una barrera protectora efectiva. Esto garantiza por un lado el suministro de nutrientes al SNC y, por el otro, permite la remoción de productos metabólicos hacia afuera del SNC.

La preocupación principal es el transporte de sustancias hidrofilicas a través de la barrera sanguínea-cerebral. Casi el 95% de todos los candidatos de principios activos in vi tro efectivos no son capaces de pasar la BSC en concentraciones farmacológicamente activas. Por lo tanto, para alcanzar concentraciones farmacológicas adecuadas de principio activo dentro del SNC, el tratamiento de muchas enfermedades del SNC como tumores cerebrales o infecciones del SNC requieren altas concentraciones en plasma del principio activo. Esto incluye el riesgo de efectos laterales. En investigación farmacéutica por lo tanto se busca mejorar el transporte de principios activos, en particular agentes hidrofilicos, sobre el BSC hacia el SNC.

Algunos métodos usan partículas lipofílicas, las cuales permiten un transporte mediado por receptor a través de la barrera sanguínea-cerebral. Para este propósito, por ejemplo, han sido desarrollados en particular sistemas de transporte de nanopartículas . Las nanopartículas están compuestas usualmente de polímeros y tienen un tamaño de 10-1000 nm. Principalmente están modificadas en la superficie.

Esas nanopartículas con frecuencia enfrentan el problema de que son exportadas desde el SNC por bombas de salida las cuales se encuentran expresadas en el BSC: Además, se ha mostrado que afectan la integridad de la BSC (Rempe et al . , Biochem Bioph Res Comm 2011, 406 (1): 64-69) . De este modo, la función protectora de la BSC está bajo riesgo, incluyendo el riesgo de efectos laterales por la entrada de sustancias indeseables o entidades infecciosas hacia el SNC. Esta desventaja sustancial es crítica para la aplicación clínica de nanopartículas como sistemas de liberación de principio activo.

Otros posibles sistemas de liberación de principio activo están bajo discusión. Por ejemplo, se sabe que las pseudocápsides de la proteína VP1 del virus del polioma murino asociada con ADN que codifica para b-galactosidasa puede ser usada para liberar ese ADN hacia el cerebro después de la administración, conduciendo a la expresión de b-galactosidasa en el cerebro (Krauzewic et al . Gene Therapy 2000, 7, 1094-1102; véase también la W098/48841 Al). Sin embargo, esas observaciones no proporcionan indicios sobre la idoneidad de las VLP, en particular VLP derivadas del Virus del polioma humano y cargadas con una carga, como un sistema de liberación de principio activo para el SNC.

Por lo tanto un objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de liberación de principio activo que permita el transporte de principio activo hacia las células del SNC, es decir una liberación de principio activo sobre la BSC.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los inventores han encontrado en un modelo de BSC basado en células endoteliales porcinas primarias que las VLP de origen JCV humano cargadas con un ácido nucleico que codifica para una proteina reportera pueden cruzar la BSC y liberar el ácido nucleico hacia las células del SNC, donde el ácido nucleico es expresado. Este modelo es considerado representativo de la BSC fisiológicamente intacta in vivo. Por lo tanto esto muestra que las VLP, y no sólo la sustancia activa sola, cruzan la BSC y entran hacia el CNS. En consecuencia, las VLP derivadas de virus del polioma humano y cargadas con una sustancia de carga son adecuadas como un sistema de liberación de principio activo hacia el SNC, en particular hacia el cerebro.

Los inventores han encontrado además que el cruce de VLP cargada no requiere ni conduce a una pérdida de la integridad o de la permeabilidad incrementada de la BSC. En consecuencia, la integridad de la BSC no es afectada sustancialmente por la VLP. De este modo, las VLP pueden ser usadas como sistema de liberación de principio activo hacia el SNC sin el riesgo sustancial de efectos laterales adversos debido a la entrada de sustancias indeseables o entidades infecciosas al SNC.

De acuerdo con la invención, las VLP derivadas del virus del polioma humano y cargadas con una carga son usadas para cruzar la BSC junto con la carga. De manera importante, el cruce de la BSC por las VLP permite las VLP exhiban su función de poblaciones de células especificas direccionantes dentro del cerebro, es decir, liberación de la carga hacia las células blanco. En el contexto de la invención la liberación comprende una liberación hacia, en o hacia las células blanco. En consecuencia de acuerdo con la invención las VLP funcionales cruzan la BSC junto con la carga.

La carga, preferiblemente una sustancia activa, está de preferencia completamente encapsulada en el casco de la VLP. Esto sin embargo no excluye que las VLP puedan adicionalmente ser asociadas con la sustancia activa, por ejemplo por medio de la unión de la sustancia activa a las estructuras exteriores del casco. Algunas moléculas de la sustancia activa pueden aún ser encapsuladas incompletamente dentro del casco. Sin embargo, al menos parte de las moléculas de la sustancia activa es encapsulada completamente en el casco.

En consecuencia, de acuerdo con la invención se proporciona una composición de VLP derivada de virus de polioma humano y una sustancia activa como un sistema de liberación de principio activo, donde al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 5%, al menos 7 %, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de la cantidad total de la sustancia activa (carga) es encapsulada en el casco de la VLP.

En una modalidad más preferida de la invención las VLP de la composición son no agregadas. No agregadas significa que las VLP pueden formar partículas separadas, cuando sean suspendidas en agua.

En un aspecto de la invención es proporcionado un sistema de liberación de principio activo para el SNC que permite un cotransporte de las VLP y la sustancia activa. El transporte puede ser activo o pasivo. De manera interesante los inventores encontraron además que las VLP no son sustancialmente removidas del CNS por transportadores de salida de la BSC.

Las VLP como las de la invención no requieren un tratamiento de superficie o el uso de aditivos para cruzar de manera eficiente la BSC y entrar en el SNC. En consecuencia un aspecto de la invención es un sistema de liberación de principio activo provisto con estructuras particuladas sin ningún tratamiento o modificación de superficie adicional y sin el uso de aditivos. El sistema de liberación de principio activo preferiblemente está libre de células.

Como se expuso anteriormente, de acuerdo con la invención, las VLP son usadas para liberar el principio activo hacia el SNC, en particular hacia el cerebro. La liberación hacia el cerebro puede permitir dirigir un principio activo hacia células especificas, por ejemplo tomando ventaja del tropismo natural del virus del polioma humano (específicamente de JCV).

Una partícula similar al virus (VLP por sus siglas en ingles) derivada del virus de polioma humano, en particular del JCV, es usada para liberar principio activo de acuerdo con la presente invención comprendiendo preferiblemente al menos un VP1. La VLP está compuesta preferiblemente de un casco constituido del VP1 montado en estructuras pentaméricas . Preferiblemente, la VLP está compuesta de varios VP1, en particular varias pentámero de VP1, especialmente 72 pentámero de VP1. Sin embargo, la VLP puede comprender opcionalmente moléculas adicionales incorporadas en el casco. Las moléculas estructurales que montan la VLP pueden ser idénticas a las proteínas del virus de polioma nativas o pueden ser modificadas para optimizar las características de la VLP.

Además, la VLP de acuerdo con la presente invención comprende además una carga. En una modalidad particular preferida de la invención la parte principal de la cantidad total de la carga es incorporada completamente al casco. Para describir la encapsulación completa de la molécula de carga por la VLP es usado el término "cargada". En consecuencia, una "VLP cargada" es una VLP con una carga completamente encapsulada.

La carga puede ser cualquier molécula o composición colocada dentro del espacio rodeado por el casco. Preferiblemente, la carga es un agente citotóxico, un agente detectable como un radionúclido, una proteina, un péptido o un ácido nucleico, en particular seleccionado del grupo que consiste de ácidos nucleicos que codifican para una proteina deseada como ARNm, ADNc, un plásmido o vector, ácidos nucleicos inhibitorios como ARNsi o ARNmi y ácidos nucleicos que tengan actividad catalítica como una ribozima. La carga es referida aquí como la "sustancia activa", "sustancia farmacéutica" o "ingrediente activo". En tanto no sea explícitamente mencionado de otra forma esas formas son usadas como sinónimos.

La VLP puede ser producida proporcionando los componentes deseados, en particular VP1, opcionalmente VP2, VP3 opcionalmente o una mezcla de los mismos y opcionalmente la carga, en solución y permitiendo que los componentes se monten en la VLP. Por ejemplo, el mezclado de los componentes puede ser efectuado bajo condiciones donde no ocurra o solo ocurra un montaje de VLP limitado, como a concentraciones de Ca2+ más bajas y/o condiciones reductoras, y después de la adición de todos los componentes deseados las condiciones cambian hacia aquellas favorables para el montaje de la VLP, como concentraciones de Ca2+ más altas y/o condiciones oxidantes. Sin embargo, la producción de VLP también puede ocurrir in vivo. En particular, los componentes de la VLP pueden ser coexpresados en una célula anfitriona en el montaje de la VLP dentro de la célula anfitriona o tras la lisis o de la célula anfitriona.

El término "virus del polioma humano" se refiere a la familia de virus del polioma humano, que comprende JCV, BK y SV40. En una modalidad particularmente preferida, el virus del polioma humano es JCV.

La "VP1" o "proteína del virus 1", de acuerdo con la presente invención se refiere a una proteína la cual es idéntica a o es derivada de la VP1 natural del virus JC que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Una proteína derivada de la VP1 natural del virus JC preferiblemente tiene una homología o identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de al menos 60%, de manera más preferible al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% sobre una secuencia de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 150, al menos 200, al menos 250 o al menos 300 aminoácidos contiguos. De manera más preferible, la homología o identidad de aminoácidos es calculada sobre toda la longitud de la JCV-VP1 natural. Los términos "VP1 derivada de la VP1 natural o el virus JC" y "VP1 derivada del virus JC" en particular también incluyen la VP1 que es idéntica a la VP1 natural del virus JC.

El término "VPl" de acuerdo con la invención también abarca fracciones y derivados de la VPl natural los cuales son capaces del montaje en la VLP. Preferiblemente, las fracciones y derivados de VPl al menos comprenden los aminoácidos 32 a 316 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o un derivado del mismo que tenga una homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de las posiciones de aminoácido 32 a 316 de la SEQ ID NO: 1 de al menos 60%, de manera más preferible al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% sobre una secuencia de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 150, al menos 200, al menos 250 o al menos 300 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre toda la secuencia.

Una VPl de acuerdo con la presente invención también puede incluir una señal de localización nuclear heteróloga (SLL por sus siglas en ingles). Preferiblemente, esta SLN es introducida en la parte frontal de o hacia el N-terminal de la NP1, en particular hacia los primeros 30, los primeros 25, los primeros 20, los primeros 15 o los primeros 10 aminoácidos de la VP1. Por ejemplo, una NLS como la descrita en la W02009/036933 (por ejemplo página 10, lineas 4 a 13 y Figura 4A) o en Shishido-Hara et al .

(Shishido-Hara, Y., Hara, Y., Larson, T., Yasui, K., Nagashima, K. & Stoner, G.L. Analysis of Capsid Formation of Human Polyomavirus JC (Tokyo-1 Strain) by a Eukaryotic Expression System: Splicing of Late RNAs, Translation and Nuclear Transport of Major Capsid Protein VP1, and Capsid Assembly. Journal of Virology 74, 1840-1853 (2000).

De acuerdo con una modalidad, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 es introducida en la parte N-terminal de la VP1, en particular entre los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 9 y 10 de la SEQ ID NO: 1.

"VP2" o "proteína de virus 2" de acuerdo con la presente invención se refiere a una proteina la cual es idéntica a o es derivada de la VP2 natural del virus JC que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. Una proteína derivada de la VP2 natural o del virus JC preferiblemente tiene una homología o identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 de al menos 60%, de manera más preferible de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% sobre una secuencia de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 150, al menos 200, al menos 250, o al menos 300 aminoácidos contiguos. De manera más preferible, la homología o identidad de aminoácidos es calculada sobre toda la longitud de la JCV-VP2 natural. Los términos "VP2 derivada de la VP2 natural del virus JC" y "VP2 derivada del virus JC" en particular también incluyen la VP2 la cual es idéntica a la VP2 natural del virus JC.

El término "VP2 " de acuerdo con la invención también abarca reacciones y derivados de la VP2 al natural que son capaces de montarse en la VLP junto con la VP1. Preferiblemente, los fragmentos de la VP2 comprenden al menos los aminoácidos 214 a 318 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o un derivado de la misma que tenga una homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de la posición de aminoácidos 214 a 318 de la SEQ ID NO: 3 de al menos 60%, de manera más preferible de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% sobre una secuencia de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 150, al menos 200, al menos 250, o al menos 300 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre toda la secuencia.

Un "péptido" de acuerdo con la presente invención puede estar compuesto de cualquier número de aminoácidos de cualquier tipo, preferiblemente aminoácidos naturales, los cuales preferiblemente están ligados por enlaces peptidicos. En particular, un péptido comprende al menos 3 aminoácidos, preferiblemente al menos 5, al menos 7, al menos 9, al menos 12 o al menos 15 aminoácidos. Además, no existe limite superior para la longitud de un péptido. Sin embargo, preferiblemente un péptido de acuerdo con la invención no excede una longitud de 500 aminoácidos, preferiblemente 300, 250, 200, 150 o 120 aminoácidos.

La expresión "comprende" como se usa aquí, además de su significado literal también incluye y se refiere especialmente a la expresión "consiste esencialmente de" y "consiste de". De este modo, la expresión "comprende" se refiere a modalidades donde la materia objeto la cual "comprende" elementos listados específicamente no comprende elementos adicionales así como modalidades donde la materia objeto que "comprende" elementos listados específicamente puede y/o en realidad abarca elementos adicionales. De igual modo, la expresión "tiene" debe comprenderse como la expresión "comprende" que también incluye y se refiere específicamente a las expresiones "consiste esencialmente de" y "consiste de".

Métodos de Administración La VLP de la invención puede ser administrada vía varias rutas. Las formas de dosificación particularmente preferidas son aquellas que permiten un efecto sistémico de la sustancia activa. Las formas de dosificación más preferidas son aquellas que son administradas oral o parenteralmente, en particular intravenosamente.

Métodos de preparación Preparación de partículas similares a virus .

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para producir las partículas similares a virus de acuerdo con la presente invención. Este método comprende en particular los pasos de (a) proporcionar una proteína viral VP1 la cual es derivada del virus JC; (b) proporcionar opcionalmente una proteína viral VP2 o VP3, preferiblemente VP2, la cual es derivada del virus JC y mezclar la VP1 con la VP2 (y/o VP3); (c) permitir que la VP1 y opcionalmente la VP2 (y/o VP3) se monten en partículas similares a virus.

El método preferiblemente comprende además el paso de proporcionar una carga y mezclar la VP1 y opcionalmente la VP2 y/o VP3 con la carga. Se prefiere una mezcla entre VP1 y VP2.

Tras el montaje de la VLP, la carga preferiblemente es encapsulada dentro de la VLP.

Preferiblemente, al menos una VLP contiene una carga, de manera más preferible al menos 1%, al menos 2%, al menos 3% al menos 5%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40% al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100% de la VLP montada contiene una carga.

El montaje de las partículas similares a virus preferiblemente ocurre en soluciones, de manera más preferible en una solución acuosa. Permitir el montaje de la VLP incluye preferiblemente ajustar la concentración del ion Ca2+ en la solución a un nivel donde pueda ocurrir el montaje de la VLP. La concentración de ion Ca2+ en particular se encuentra en el intervalo de 0.1 mM a 5mM, preferiblemente de 0.2 mM a 3mM, de manera más preferible de 0.5 mM a 2mM o de 0.8 mM a 1.2 mM, de manera más preferible aproximadamente lmM. Además, la facilitación del montaje de la VLP ocurre preferiblemente bajo condiciones oxidantes, en particular en ausencias de concentraciones significativas de agentes reductores como DTT, DTE o mercaptoetanol.

La provisión de las proteínas virales y la facilitación del montaje de la VLP pueden ser efectuadas de manera simultánea. En particular, las proteínas virales son proporcionadas bajo condiciones donde puede ocurrir el montaje de VLP. En modalidades preferidas, la provisión de las proteínas virales y el montaje de la VLP son efectuados in vivo. En particular, las VLP son montadas dentro de las células anfitrionas que expresan las proteínas virales o tras la lisis o disrupción de las células anfitrionas.

El montaje de la VLP puede ser efectuado por ejemplo como se describe en la EP 0862 633, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia.

Métodos de Liberación La presente invención proporciona además un método para liberar una sustancia o composición en una célula objetiva en el sistema nervioso central usando partículas similares a virus de acuerdo con la presente invención. El método preferiblemente comprende los pasos de (a) proporcionar una partícula similar a virus de acuerdo con la presente invención, la cual comprende la sustancia o composición como carga; y (b) administrar la partícula similar a virus al cuerpo viviente, preferiblemente en un humano.

La célula blanco puede ser una célula blanco natural o el virus JC.

La sustancia activa o composición puede ser de cualquier tipo o naturaleza. En una modalidad preferida es un ácido nucleico, en particular un ácido nucleico que codifica para una proteina o péptido o un ácido nucleico inhibidor como ARNsi o ARNmi. En otra modalidad preferida la sustancia activa es una proteina o péptido. En aún otra modalidad de la invención la sustancia activa es una molécula pequeña, en particular una molécula pequeña cargada negativamente. La sustancia activa también puede ser una mezcla de varias sustancias activas.

La sustancia activa es preferiblemente un agente citotóxico.

Además, la invención pertenece a las VLPs en general, las cuales pueden ser usadas como un sistema de liberación de principio activo para el tratamiento o diagnóstico de trastornos neurológicos , neuronales o neurodegenerativos como en particular la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, o la enfermedad de Alzheimer.

En una modalidad preferida la VLP es transportada en, a o hacia los oligodendrocitos.

Ejemplo 1. VPl-VLPs en el Modelo de Barrera-Sanguínea-cerebral (BSC) in vitro Este experimento in vi tro muestra la capacidad de las VLPs para cruzar la BSC en un sistema modelo que es comparable a la organización y propiedades de la BSC humana. En el sistema modelo, fueron usadas células endoteliales de cerebro, primarias, porcinas (PBCEC por sus siglas en ingles) las cuales son capaces de formar la barrera sanguinea-cerebral in ví tro (Angelow S, Zeni P and Galla HJ "Usefulness and limitation of primary cultured porine horoid plexus epithel cells as an in vitro model to study drug transport at the blood-CSF barrier", Adv Drug Delivery 2004; 56(12): 1859-73).

La preparación y cultivo de PBCEC fue efectuada de acuerdo a lo descrito por Rempe et al . , BBRC, 2011: Transporte de nanoparticulas de Poli-(n-butilciano-acrilato) a través de la barrera sanguinea-cerebral in vitro y su influencia sobre la integridad de la barrera.

El efecto de las VLPs que contienen cargas en las PBCEC en el sistema de filtro de Transwell fue explorada con la ayuda de la medición de la resistencia eléctrica transendotelial relativa (TEER por sus siglas en ingles) (Rempe et al . , 2011). Para establecer una prueba cuantitativa de la liberación, usamos ADN plasmidico como carga. La integridad de la barrera sanguinea-cerebral no fue afectada por VPl-VLPs bajo ninguna circunstancia y concentración.

Para verificar el transporte de carga a través de la barrera sanguinea-cerebral in vi tro, el ADN plasmidico fue empaquetado en las VLPs como se describe en Goldmann et al . 1999 (Journal of Virology: Clonación y expresión molecular de la proteina estructural mayor VP1 del virus del polioma humano: formación de partículas similares a virus útiles para estudios inmunológicos y terapéuticos y medida cuantitativamente por qPCR). Las copias de ADN plasmídico fueron cuantificadas sobre los lados apical y basolateral en la BSC in en el modelo in vitro. El lado apical es donde las VLPs fueron agregadas (la luz del vaso sanguíneo in vivo) , el lado basolateral se refiere al cerebro. La prueba cuantitativa del ADN plasmídico sobre el lado basolateral representa el paso mediado por VLP de las moléculas a través de las células endoteliales cerebrales, respectivamente la liberación de la carga a través de la barrera cerebral-sanguínea. 2. Liberación y expresión de un gen reportero in v vo Los experimentos de la liberación del gen reportero fueron planeados para mostrar las capacidades de las VPl-VLPs de JC para liberar la sustancia hacia las células y órganos en el organismo viviente. En este caso la expresión del gen reportero es uno de los mejores métodos para demostrar no únicamente la liberación, sino la funcionalidad de la sustancia liberada también (Hoffman, R. M., 2005: THE MULTIPLE USES OF FLUORESCENT PROTEINS TO VISUALIZE CANCER IN VIVO. Nat. Rev. Cáncer; 5(10): 796- 806).

Materiales Las sondas de VP1-VLP deferentes fueron probadas por la capacidad para empaquetar y liberar el plasmado reportero en células Cos7 (células de riñón de mono verde) in vi to, puesto que se sabe que esta línea celular es trasducible por JCV VLPs . Hubo 9 sondas de VPl-VLPs precipitadas con sal y 15 sondas VPl-VLPs purificadas por cromatografía. Los experimentos de transducción in vitro fueron repetidos 5 veces. En estos experimentos, se probó la capacidad para liberar la señal de luminiscencia máxima con los sustratos de Luciferina para experimentos in vivo.

Las VPl-VLPs precipitadas con sal fueron precipitadas durante la noche y dializadas 24 horas contra el amortiguador estándar (NaCl 150mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5). El empaquetamiento del plásmido de gen reportero fue logrado por disociación y reasociación química de acuerdo a lo descrito en Goldman et al . , 1999, Journal of Virology: Clonación y Expresión Molecular de la proteína estructural mayor VP1 del virus del polioma humano: formación de partículas similares a virus útiles para estudios inmunológicos y terapéuticos.

El arreglo experimental La inyección intravenosa de VLPs en ratones BALB/c inmunocompetentes fue efectuada en la vena de la cola bajo anestesia con isoflurano.

Los animales fueron agrupados como sigue: - 5 mg de VLPs precipitadas con sal (4 animales) - 50 pg de VLPs precipitadas con sal (4 animales) - 5 pg de VLPs purificadas por cromatografía (4 animales) - Control de ADN (el plásmido del gen reportero únicamente) (3 animales) - VLPs control (las cápsides de VP1-VLP únicamente)(3 animales) La bioluminiscencia fue medida los dias 2, 4, 7, 14 y 22, 12 min después de la inyección intraperitoneal del sustrato de luciferina. Fueron reunidos los resultados de cada grupo y fueron calculados los resultados promedio y la desviación estándar. Los promedios fueron analizados con ANOVA de dos vías con prueba de Hola-Sidak como prueba posthoc.

Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4 3. Eficacia de la transducción de células Cos7 (Células de riñón de mono verde africano) con la ayuda de plásmidos de luciferasa cargados con VPl-VLPs de JC y VPl-VLPs de JC mezcladas con plásmidos de luciferasa. 1. 18 horas antes de la transducción las células Cos7 fueron pasadas a una placa de 24 pozos. 2. Las VPl-VLPs fueron disociadas con DTT y EGTA, mezcladas con el plásmido de luciferasa y dializadas contra amortiguador de reasociación durante la noche a +4 °C. 3. Al siguiente dia, las VPl-VLPs empaquetadas fueron retiradas de la diálisis. 4. Las VPl-VLPs mezcladas con el plásmido de luciferasa fueron preparadas de acuerdo con Krauzewicz (Gene Therapy (2000) 7, 1094-1102): a. Las relaciones de mezclado de VLPs a plásmidos de luciferasa fueron de 30:1 (p/p) b. Esta mezcla fue incubada 15 min a TA c. Las mezclas fueron diluidas con medios celulares DMEM y pipeteadas a las células Cos7 de la placa de 24 pozos. 5. Las VPl-VLPs empaquetas con el plásmido de luciferasa fueron pipeteadas a las células Cos 7; lo mismo fue efectuado con las VPl-VLPs mezcladas con plásmido de luciferasa. 6. Después de 24 horas las células fueron U sadas y la actividad de la luciferasa fue medida en tripletes con la ayuda de Ensayo de Luciferasa de Promega.

Los resultados de experimentos de transducción independientes son mostrados en la Figura 5. 4. Detección de Inmunohistoquimica de Luciferasa y proteina VP1 en el cerebro de ratón después de la aplicación intravenosa de VLPs empaquetadas con un plás ido de luciferasa.

Como se mostró anteriormente, las VPl-VLPs son capaces de liberar sustancias a las células y órganos en el organismo viviente de acuerdo a lo probado por la detección del ADN plasmidico (por qPCR) o la actividad de luciferasa. Esos resultados experimentales son apoyados además por la detección in unohistoquimica de la proteina luciferasa y la proteína VP1 en el cerebro.

Los tejidos cerebrales fueron aislados de ratones con inyección intravenosa de VLPs en ratones BALB/c inmunocompetentes (tratamiento como se describió anteriormente), fijadas en PFA e incluidas en parafina de acuerdo a lo descrito (J. Jankowski et al . , The Journal of comparative Neurology 472: 87-99, 2004: "Engrailed-2 negatively regulates the onset if prenatal Purkinje Cell differentiation"). Fueron cortadas secciones de 7 a 10 p de espesor y montadas sobre portaobjetos Histobond plus. Las secciones o cortes fueron rehidratadas, la peroxidasa endógena fue inactivada y los cortes permeabilizados. Se efectuó un paso de bloqueo en solución de albúmina de suero bovino en 3%. La proteina luciferasa o proteina VP1, fueron detectadas respectivamente con anticuerpos monoclonales. Para incrementar la fuerza de la señal, se uso el sistema fluorescente de amplificación TSA (Sistema de Fluoresceína TSAMR Plus, Perkin Elmer).

Resultados: Como se muestra en el panel derecho de la Figura 6B, los análisis inmunoistoquimicos usando el anticuerpo anti-VPl fueron capaces de detectar proteina VP1 en células del SNC. Los cortes de cerebro muestran puntos dispersos de tamaño irregular, lo cual es indicativo de una localización celular de VP1 dentro del parénquima cerebral. Usando anticuerpo anti-Luciferasa, también pudo ser detectada la proteina Luciferasa en células en el SNC. De acuerdo con los resultados para la proteína VP1 también la tinción derivada de Luciferasa de los cortes de cerebro muestra puntos dispersos de tamaño irregular, lo cual es indicativo de una localización celular de la Luciferasa dentro del parénquima cerebral.

Discusión: La presencia celular de la Luciferasa y la proteína VP1 en el cerebro representan un apoyo más del concepto básico de la invención, debido a que demuestra que la VLP, y no sólo la sustancia activa sola, cruza la BSC y entra al SNC. 5. El análisis de colocalización revela la presencia de proteina VP1 en los oligodendrocitos.

Sobre la base de la detección celular descrita anteriormente de la proteína VP1 en el SNC, fue realizado un experimento de colocalización para identificar las células blanco respectivas. Para este propósito, la proteina VP1 detectada fue colocalizada con el marcador Olig 2, el cual se localiza especificamente sobre los oligodendrocitos (B. Menn et al . , "Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain", The Journal of Neuroscience, 2006, 26(30): 7907-7918).

Resultados: Como se muestra en el panel inferior izquierdo de la Figura 8, usando el marcador Olig 2 pudieron ser detectados varios puntos irregulares en el corte de cerebro, los cuales en cada caso también son teñidos por la tinción de cerebro DAPI (panel superior izquierdo de la Figura 8) y por lo tanto indicativos de oligodendrocitos. Cada uno de esos oligodendrocitos también es positivo para la proteina VP1 como se muestra en el panel inferior derecho de la Figura 8. Las células que son positivas para Olig 2 y VP1 están marcadas con una flecha blanca. En consecuencia, la proteina VP1 se localiza en los oligodendrocitos del SNC, lo cual es indicativo de una infección de esas células por las VLPs aplicadas intravenosamente.

Discusión: La detección de la proteina VP1 en los oligodendrocitos del cerebro está en linea con el tropismo natural del virus JCV. Como resultado las VLPs reclamadas de la invención son especialmente adecuadas para un tratamiento terapéutico de enfermedades asociadas con los oligodendrocitos tal como la esclerosis múltiple.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Desarrollo de resistencia eléctrica transendotelial relativa después de la adición de VPI-VPLs en concentraciones en 5*108 y 2*1012 partículas por pozo (n=3).

Figura IB: Desarrollo de resistencia eléctrica transendotelial relativa después de la adición de VPI-VPLs en concentraciones en 5*108 y 2*1012 partículas por pozo (n=3).

Figura 2: Paso de las VPl-VLPs cargadas con ADN a través de la barrera sanguínea-cerebral en el modelo in vi tro, medido con qPCR con cebadores específicos. VLPs agregadas - el número de VPLs agregadas sobre el lado aplical en el modelo de BSC, VLPs detectadas - número detectado de plásmido sobre los lados apical y basolateral en el modelo de BSC (n=3).

Figura 3: Señales bioluminiscentes en el cuerpo de ratón después de la aplicación intravenosa: 5 mg de VLPs precipitadas con sal, 50 pg de VLPs precipitadas con sal, 5 pg de VLPs purificadas cromatográficamente; control de ADN (el plásmido del gen reportero únicamente); control de VLPs (las cápsides de VP1-VLP únicamente). Como ejemplo, un ratón de cada grupo sobre el lado ventral o dorsal.

Figura 4: Señales bioluminiscentes en cabezas de ratón después de la aplicación intravenosa: 5 mg de VLPs precipitadas con sal, 50 pg de VLPs precipitadas con sal, 5 pg de VLPs purificadas cromatográficamente; control de ADN (el plásmido del gen reportero únicamente). Los resultados promedios en el grupo menos el control de VLPs (como una señal de fondo).

Figura 5A: Transducción de las células Cos7 con la ayuda de las VLP-VLPs, cargadas con ADN de plásmido de Luciferasa. RLU - Unidades de Luz Relativas; 25 pg de VLP empaquetadas - 25 pg de VPl-VLPs de JC empaquetadas con plásmido de Luciferasa; 50 pg de VLP empaquetadas - 50 pg de VPl-VLPs de JC empaquetadas con plásmido de Luciferasa; 50 pg de VLP mezcadas - 50 pg de VPl-VLPs de JC mezcladas con plásmido de Luciferasa; control de ADN - control del plásmido de Luciferasa.

Figura 5B: Transducción de las células Cos7 con la ayuda de las VLP-VLPs, cargadas con ADN de plásmido de Luciferasa. RLU - Unidades de Luz Relativas; 25 pg de VLP empaquetadas - 25 pg de VPl-VLPs de JC empaquetadas con plásmido de Luciferasa; 50 pg de VLP empaquetadas - 50 pg de VPl-VLPs de JC empaquetadas con plásmido de Luciferasa; 50 pg de VLP mezcadas - 50 pg de VPl-VLPs de JC mezcladas con plásmido de Luciferasa; control de ADN - control del plásmido de Luciferasa.

Figuras 6A-6C: Análisis inmunoistoquimico de cortes de cerebro. La columna de la izquierda muestra la tinción con DAPI del núcleo celular, la columna derecha de las proteínas marcados con fluorescencia. Figura 6D control negativo; Figura 6B - tinción fluorescente con FITC de la proteína VP1; Figura 6C - tinción fluorescente con FITC de la proteína Luciferasa.

Figuras 7A-7D: Controles negativos para la colocalización de la proteina VP1 con el marcador oligodendrocítico Olig 2.La figura 7A muestra la tinción de los núcleos celulares con el tinte DAPI. La figura 7B muestra la señal después de la detección de fluorescencia sin el uso del anticuerpo anti-VP 1. La figura 7C muestra la señal después de la detección de fluorescencia sin el uso del anticuerpo anti-Olig 2. La Figura 7D representa las imágenes fusionadas de las dos tinciones de control.

Figuras 8A-8D: Colocalización de la proteína VP1 con el marcador oligodendrocítico Olig 2.La figura 8A muestra la tinción de los núcleos celulares con el tinte DAPI. La figura 8B muestra la localización de la proteína VP1 (fluorescencia con FITC). La figura 8C muestra la tinción con el anticuerpo anti-Olig 2 (fluorescencia con TRITC). La figura 8D representa las imágenes fusionadas de la tinción para el marcador Olig 2 y la proteína VP1.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una VLP derivada del virus del polioma humano cargada con un principio activo para usarse en un procedimiento terapéutico o diagnóstico como un sistema de liberación de principio activo para transportar un principio activo hacia el SNC, en particular de humanos vivos.

2. La VLP de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la VLP es derivada de JCV.

3. La VLP de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el sistema de liberación de principio activo cruza la barrera sanguinea-cerebral para entrar al SNC junto con el principio activo encapsulado por la VLP.

4. La VLP de conformidad con al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el sistema de liberación de principio activo cruza la barrera sanguinea-cerebral fisiológicamente intacta.

5. La VLP de conformidad con al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la VLP está compuesta de proteínas VP1 de virus JC.

6. La VLP de conformidad con al menos una de las reivindicaciones, caracterizada porque la VLP es preparada para la administración intravenosa.

7. La VLP de conformidad con al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la VP1 comprende una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 sobre toda su longitud y/o donde la VP2 comprende una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 sobre toda su longitud.

8. La VLP de conformidad con al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el principio activo es seleccionado del grupo que consiste de un agente citotóxico, un agente detectable como un radionúclido, una proteina, un péptido y un ácido nucleico, en particular seleccionado del grupo que consiste de ácidos nucleicos que codifican para una proteina deseada como ARNm, ADNc , un plásmido o vector, ácidos nucleicos inhibidores como ARNsi o ARNmi; y ácidos nucleicos que tienen actividad catalítica como una ribozima.

9. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una VLP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque al menos 1%, preferiblemente al menos 15%, de manera más preferible al menos 50%, de manera particularmente preferida al menos 95% de la cantidad total de la sustancia activa (carga) está completamente encapsulada en el casco de la VLP.

10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque las VLP no está agregadas.