CN106048093A - Jc病毒的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Jc病毒的检测方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了JC病毒的检测方法,包括如下步骤：采用磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA，获得待测样本；PCR扩增反应；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针JCV‑FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号。本申请还提供一种检测JC病毒的试剂盒。本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，和乙型肝炎病毒(HBV)。

Description

JC病毒的检测方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法、试剂盒及其应用，具体讲，涉及JC病毒的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
JC病毒属乳多空病毒科多瘤病毒种人类多瘤病毒分支，与人类多瘤病毒SV40(恒河猴病毒)和JC病毒基因组的大小结构及DNA序列非常类似，没有包膜，外被衣壳蛋白，内含一环状的小双链DNA。
JC病毒(JCV)是一种机会感染性病原，正常人群中血清学阳性率高达80％以上。JCV可通过分娩(胎盘)、哺乳或长期共同生活接触从母亲传播给子女，也可通过呼吸道、消化道传播。感染后多以潜伏状态存在，当宿主免疫功能低下时可重新激活。JCV具有明显的嗜神经性特点，严重免疫抑制患者感染JCV后可引起进行性多灶性脑白质病(PML)。
JCV也可致肾移植患者的多瘤病毒相关性肾病(PVAN)。器官移植后，免疫抑制剂的使用是诱导多瘤病毒激活复制的重要原因，其中，40％以上的肾移植患者可检测到JCV的复制。PVAN被认为是影响肾移植手术成功与否最关键的因素之一，因此通过监测肾移植患者体内的JCV载量，可用于肾移植术后JCV感染的的早期诊断，对预防JCV感染造成的多瘤病毒相关性肾病(PVAN)和进行性多灶性脑白质病(PML)具有一定意义。
运用电镜、病毒分离、抗原检测和PCR等技术诊断多瘤病毒感染很容易，其中定量PCR技术可检测出病毒载量。国外研究认为，利用聚合酶链式反应(PCR)对尿液、血液或脑脊液特异性地检测JCV DNA是PVAN或PML早期诊断及预测的最佳方法。PCR技术检测方法的灵敏度为75％，特异度高达96％。荧光定量PCR比常规PCR具有更高的灵敏度、特异性，操作更加快速、方便，同时可以区分JCV与BKV的感染，是用于JCV DNA检测的理想手段。
荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。荧光定量PCR使用了特异性探针，能够对靶序列进行特异性的识别，具有引物探针双重控制，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点。
由于荧光PCR法不受生物个体因素影响，具有高度灵敏度、特异性，具有简单、快速、易于自动化等优点，可以进行单个或成批样品的检测，适合基层单位的推广，因而非常有希望成为JCV DNA的常规检测方法，从而用于JC病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
本产品采用实时荧光定量PCR技术，用于定量检测人类晨尿样本中的JC病毒DNA。以JC病毒保守基因序列为检测目的片段，该检测不得作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，还可通过对患者JCV DNA水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。
目前，国内外临床应用JC病毒荧光定量PCR主要如下：
1.核酸提取方法：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法。
2.定量标准品：大多数标准品不参与核酸提取，不能全面真实反映核酸提取和扩增，不能对待测样本进行准确定标。
3.阳性质控品和临界阳性质控品：大多数定量检测试剂盒未设置阳性质控品和临界阳性质控品，不能很好监控核酸提取与扩增。
使用本发明中的JC病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)，使用磁珠提取方法，可以有效进行核酸提取，在本发明中，我们使用的定量标准品、阳性质控品及临界阳性质控品均来源于灭活阳性尿液样本，可以与待测样本同时进行提取与扩增，从而可以全程监控样本提取与扩增，从而对待测样本进行准确定标。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供一种JC病毒的检测方法及试剂盒，以解决无法实现的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了JC病毒的检测方法,包括如下步骤：
待测样本获取：
采用磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA，获得待测样本；
PCR扩增反应：
将提取的JCV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；
所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、JCV引物探针混合液，
所述JCV引物探针混合液，包括，上游引物：JCV-F，下游引物：JCV-R，Taqman荧光探针JCV-FP，纯化水；
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针JCV-FP5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团；
结果检测：
采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针JCV-FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号。
进一步地，所述PCR扩增反应的条件为：37℃，2min；95℃，3min；然后，94℃，10s，60℃，35s，10个循环；然后，94℃，10s，60℃，35s，35个循环；25℃，1min。
进一步地，所述JCV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。
进一步地，所述PCR扩增反应，还包括：平行设置JCV阴性质控品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品和JCV定量标准品I～IV反应组，所述JCV阴性质控品为无菌生理盐水；所述JCV临界阳性质控品为浓度1.0×104copies/mL的JCV阳性尿液样本；JCV阳性质控品为浓度1.0×106copies/mL的JCV阳性尿液样本；JCV定量标准品I～IV，包括JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
进一步地，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
进一步地，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括：UDG酶及dUTP。
本申请还提供检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物：JCV-F，下游引物：JCV-R，Taqman荧光探针JCV-FP，
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
进一步地，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、JCV阴性质控品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品和JCV定量标准品I～IV，其中JCV阴性质控品无菌生理盐水，JCV定量标准品I～IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
进一步地，其特征在于，所述试剂盒包括：裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、JCV引物探针混合液、PCR反应液、JCV定量标准品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品、JCV阴性质控品、JCV内标质控品，各组分含量为：
本申请提供的检测JC病毒的试剂盒，用于JC病毒的检测。
与现有技术相比，本发明所述的JC病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
1.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中JCV提取操作，磁珠法有效快速的提取了样本DNA。
2本发明中所涉及的试剂盒中设置阳性质控品、临界阳性质控品、定量标准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映待测样本核酸提取和扩增，对待测样本进行准确定标。
3.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。
4.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
5.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，和乙型肝炎病毒(HBV)；
6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低，适合于大规模临床开展。从而实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例2所述JC病毒定性检测结果图；
图2是本发明实施例3所述JC病毒定量检测标准品检测结果图；
图3是本发明实施例3所述JC病毒定量检测标准品和待测样品检测结果图。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。下文为了叙述方便，下文中所称的“左”“右”“上”“下”等与附图本身左、右、上、下等方向一致。
实施例1
本实施例提供待测样本获取的方法：
采用磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA，获得待测样本。磁珠法提取核酸使用独特的裂解液和蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA选择性吸附于磁珠，再通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。
1、磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA所用试剂及成分
(1)裂解液：100mL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70℃加热搅拌至完全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。
此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
(2)洗液1：100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至6.5。
此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
(3)洗液2：纯水。
(4)洗脱液：100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mM EDTA，70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。
(5)磁珠：购买商品化磁珠。
(6)蛋白酶K：将购买商品化蛋白酶K稀释至20mg/mL。
(7)助沉剂：将购买商品化助沉剂。
2、采用磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA具体方法如下：
①使用前向裂解液中加入2.4mL异丙醇，向洗液1中加入5.4mL乙醇，洗液2中加入8.4mL乙醇，摇匀后若裂解液中有不溶物，请于70℃下温育至溶解，冷却后即可使用。
②将尿液送检管振荡15s，彻底混匀后立即取1mL至1.5mL离心管中(若样本不足1mL，请用生理盐水稀释一定倍数后移取1mL)，13000rpm离心10min后小心弃去上清(可残余10μL左右液体以免移弃目的物)，注意避免触碰离心管底。
另外，对于JCV阴性质控品、JCV临界阳性质控品、JCV阳性质控品及定量标准品I-IV按如下处理：融化并振荡混匀后取200uL各加到1.5mL离心管中，补加生理盐水至1mL，13000rpm离心10min后小心弃去上清。
③向离心管内加入10μL蛋白酶K、4μL助沉剂、300μL裂解液，20μL磁珠(每次吸取前需颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠)，5μL内标质控品，漩涡振荡混匀各离心管10s，于室温轻柔颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。
④将离心管放在磁分离架上，反复颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。
⑤加入500μL洗液1，漩涡振荡3～5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。
⑥加入500μL洗液2，漩涡振荡3～5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液，并尽量吸弃管底残余液体，晾干5min。
⑦加入50μL洗脱液，用移液枪缓慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脱液中，55℃温育5min，期间轻轻晃动溶液两次。
⑧将离心管置于磁分离架上静置1min，磁分离后及时将上清液转移至新的无核酸酶离心管中，此上清即为提取到JCV DNA，即待测样本。
实施例2
JC病毒的定性检测
本实施例2提供一种JC病毒的定性检测方法：
1、JCV DNA的PCR扩增反应
1)JCV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
(1)JCV引物探针混合液：
JCV引物探针混合液具体组成成分为：上游引物：JCV-F(50μM)0.6μL，下游引物：JCV-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针JCV-FP(20μM)0.5μL，纯化水3.3μL。
优选JCV引物探针混合液的组分为：上游引物JCV-F(50μM)0.6μL，下游引物JCV-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针JCV-FP(20μM)0.5μL，内标上游引物(20μM)0.5μL，内标下游引物(20μM)0.5μL，内标探针(10μM)0.375μL，纯化水1.925μL。
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针JCV-FP 5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团。
所述的Taqman荧光探针JCV-FP的荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；
优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一种。
最优选的，所述荧光报告基团为6-FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
(2)PCR反应液：
PCR反应液组成为：10×reaction buffer5μL，10mM dNTP Mix 4μL，Taq DNAPolymerase1.2μL，UDG 0.2μL，10mM dUTP1μL，纯化水13.6μL。
2)JCV DNA(待测样本)PCR反应
(1)按以下比例进行JCV PCR反应混合液配制与加样：PCR反应液25μL，JCV引物探针混合液5μL加到PCR管中，振荡混匀，将提取好的待测样本20μL加到上述PCR管中，进行PCR扩增。
(2)PCR反应的反应条件设置为：37℃，2min；95℃，3min；然后，94℃,10s，60℃，35s，10个循环；然后，94℃，10s，60℃，35s(荧光收集)，35个循环；25℃，1min。
2、PCR反应结果判读(JC病毒的定性检测结果分析)
本实施例2采用最优方案，即JCV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针JCV-FP的荧光报告基团为6-FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。
本实施例2采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为对应荧光素，本实施例设定为FAM、VIC荧光素，荧光信号收集设在60℃。
JCV引物探针混合液有无内标，不影响待检样品通道曲线的响应，即JC病毒检出为阳性时，待检样品对应通道会出现S型曲线；JC病毒检出为阴性时，待检样品对应通道不出现S型曲线。
本实施2采用JCV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针JCV-FP的荧光报告基团为6-FAM；荧光淬灭基团为BHQ1的方案，因此检测结果会包含内标通道曲线：
如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无S型曲线，判定为JCV阴性；如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，判定为JCV阳性。利用上述方法对14例JC病毒尿液样本、5例健康人尿液样本，2例丙肝病毒(HCV)血液样本、2例JC病毒尿液样本、2例人巨细胞病毒(HCMV)血液样本，共计25份临床样本进行检测，结果如图1所示：
其中，14例检测均为阳性，表现为：内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线健康人尿液样本，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，JC病毒(JCV)检测均为阴性，表现为：内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无S型曲线。
本实施例2采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
实施例3
本实施例2提供一种JC病毒的定量检测方法：
1、JCV DNA的PCR扩增反应
1)JCV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
(1)JCV引物探针混合液：
JCV引物探针混合液的组分为：上游引物：JCV-F(50μM)0.6μL，下游引物：JCV-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针JCV-FP(20μM)0.5μL，内标上游引物(20μM)0.5μL，内标下游引物(20μM)0.5μL，内标探针(10μM)0.375μL，纯化水1.925μL。所述所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述荧光报告基团为6-FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
(2)PCR反应液：
PCR反应液组成为：10×reaction buffer5μL，10mM dNTP Mix 4μL，Taq DNAPolymerase1.2μL，UDG 0.2μL，10mM dUTP1μL，纯化水13.6μL。
(3)JCV定量标准品：
定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为：JCV定量标准品Ⅰ(2.5×108copies/mL)、JCV定量标准品Ⅱ(2.5×107copies/mL)、JCV定量标准品Ⅲ(2.5×106copies/mL)、JCV定量标准品Ⅳ(2.5×105copies/mL)。
(4)JCV阳性质控品：
JCV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5×106copies/mL。
(5)JCV临界阳性质控品
JCV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为1×104copies/mL。
(6)JCV阴性质控品：
JCV阴性质控品为灭菌生理盐水。
(7)JCV内标质控品：
JCV内标质控品为体外构建的重组质粒。
2)JCV DNA(待测样本)PCR反应
(1)按以下比例进行JCV DNA PCR反应混合液配制与加样：PCR反应液25μL×(n+7：四个定量标准品和一个JCV阴性质控品、一个JCV临界阳性质控品、一个JCV阳性质控品)，每管加JCV引物探针混合液5μL；振荡混匀，每份30μL分至PCR管中，将提取好的待测样本(该待测样本为定性检测为阳性的样本)及质控品20μL加到上述PCR管中，进行PCR扩增。
(2)设置PCR扩增反应条件：37℃，2min；95℃，3min；然后，94℃，10s，60℃，35s，10个循环；然后，94℃，10s，60℃，35s(荧光收集)，35个循环；25℃，1min。
2、PCR反应结果判读(JC病毒的定量检测结果分析)
采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60℃。
结果判断：
(1)如果内标通道没有出现S型曲线，检测结果无效，应重新检测。高浓度样本(Ct值≤10)，由于竞争抑制，内标通道无S型曲线属于正常情况。
(2)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无S型曲线，则检测报告为“低于试剂盒最低检出限(500copies/mL)”。
(3)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，则有如下解释：
(4)如果待检样本测定值显示＜500copies/mL，则报告为“低于试剂盒最低检出限(500copies/mL)”。
(5)测定值在5×102copies/mL～1×103copies/mL之间的样本，直接报告数值，并注明“供参考”。
(6)测定值在1×103copies/mL～1×109copies/mL之间的样本，直接报告所测定的数值；
(7)测定值＞1×109copies/mL的样本，则报告为“高于1.0×109copies/mL”，如果需要精确定量结果，可将样本用阴性质控品稀释至线性范围后重新测定，并根据下面公式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。
可报告数值(最终样本浓度)＝稀释后浓度×稀释倍数
稀释倍数＝(样本量+稀释液量)/样本量。
利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/mL)。检测反应时，将标准品按如下赋值，JCV定量标准品Ⅰ(5×107copies/mL)、JCV定量标准品Ⅱ(5×106copies/mL)、JCV定量标准品Ⅲ(5×105copies/mL)、JCV定量标准品Ⅳ(5×104copies/mL)与样品同时检测，如图2为定量标准品扩增曲线，图3为标准品与待测样本扩增曲线。根据定量标准品浓度与检测结果Ct值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测Ct值，可计算出样品中靶基因的浓度。
利用上述方法对6例JC病毒尿液样本进行定量检测，通过计算机生成的标准曲线。计算图3中6个待测样本(如图3所示，除4个标准品曲线外的6个曲线为待测样本曲线)从左至右浓度分别为：尿液样本分别：3.4×108copies/mL、5×105copies/mL、6×103copies/mL、4×103copies/mL、3×105copies/mL、5×102copies/mL。
结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为JC病毒基因序列。
实施例4
本实施例4提供一种检测JC病毒的试剂盒。
检测JC病毒的试剂盒，包括：上游引物JCV-F，下游引物JCV-R，Taqman荧光探针JCV-FP，
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
优选的，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针。内标质控体系参与提取与扩增。用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
优选的，该试剂盒，还包括：JCV阴性质控品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品和JCV定量标准品I～IV，其中JCV阴性质控品无菌生理盐水，JCV定量标准品I～IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
优选的，JCV定量标准品I～IV、JCV临界阳性质控品、JCV阳性质控品的构建方法包括以下步骤：
(1)提取临床尿液样本，经定量后选取高浓度尿液样本；
(2)使用灭菌后生理盐水将所定量高浓度尿液样本进行稀释，稀释成4个梯度2.5×108～2.5×105copies/mL，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV，另分别稀释至2.5×106copies/mL和1×104copies/mL作为试剂盒的JCV阳性质控品和JCV临界阳性质控品。
优选的，该试剂盒，包括：裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、JCV引物探针混合液、PCR反应液、JCV定量标准品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品、JCV阴性质控品、JCV内标质控品。
优选的，各组分组成及制造方法为：
(1)裂解液：100mL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70℃加热搅拌至完全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。分装量为4.8mL/瓶。
此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
(2)洗液1：100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至6.5。分装量为6.6mL/瓶。
此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
(3)洗液2：纯水。分装量为3.6mL/瓶。
(4)洗脱液：100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mM EDTA，70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。分装量为1200μL/管。
(5)磁珠：购买商品化磁珠直接分装。分装量为480μL/管。
(6)蛋白酶K：将购买商品化蛋白酶K稀释至20mg/mL直接分装。分装量为240μL/管。
(7)助沉剂：将购买商品化助沉剂直接分装。分装量为196μL/管。
(8)JCV引物探针混合液：JCV引物探针混合液具体组成成分为：上游引物JCV-F(50μM)0.6μL，下游引物JCV-R(50μM)0.6μL，Taqman荧光探针JCV-FP(20μM)0.5μL，内标上游引物(20μM)0.5μL，内标下游引物(20μM)0.5μL，内标探针(10μM)0.375μL，纯化水1.925μL。分装量为120μL/管。
(9)PCR反应液：PCR反应液组成为：10×reaction buffer5μL，10mM dNTP Mix 4μL，Taq DNA Polymerase1.2μL，UDG 0.2μL，10mM dUTP1μL，纯化水13.6μL。分装量为600μL/管。本发明含有UDG酶防污染体系。
为了防止污染，本发明含有UDG酶防污染体系。特选取含UDG酶及dUTP的体系，其作用原理为：在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，就会形成含dUTP碱基的PCR扩增产物，而UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U基的糖苷键，从而降解该PCR扩增产物。
(10)JCV定量标准品：定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为：JCV定量标准品Ⅰ(2.5×108copies/mL)、JCV定量标准品Ⅱ(2.5×107copies/mL)、JCV定量标准品Ⅲ(2.5×106copies/mL)、JCV定量标准品Ⅳ(2.5×105copies/mL)。分装量为600μL/管。
(11)JCV阳性质控品：JCV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5×106copies/mL。分装量为600μL/管。
(12)JCV临界阳性质控品：JCV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为1×104copies/mL。分装量为600μL/管。
(13)JCV阴性质控品：JCV阴性质控品为灭菌生理盐水。分装量为600μL/管。
(14)JCV内标质控品：JCV内标质控品为体外构建的重组质粒。分装量为130μL/管。
优选的，该试剂盒组成为，裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、JCV引物探针混合液、PCR反应液、JCV定量标准品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品、JCV阴性质控品、JCV内标质控品，各组分含量为：
上述检测JC病毒的试剂盒，应用于JC病毒的检测。该检测可以为定性检测和/或定量检测。
与现有技术相比，本发明所述的JC病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
2.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中JCV提取操作，磁珠法有效快速的提取了样本DNA。
2本发明中所涉及的试剂盒中设置阳性质控品、临界阳性质控品、定量标准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映待测样本核酸提取和扩增，对待测样本进行准确定标。
5.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。
6.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
5.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，和乙型肝炎病毒(HBV)；
6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低，适合于大规模临床开展。从而实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施例的内容，这里不再具体限定。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.JC病毒的检测方法,包括如下步骤：
待测样本获取：
采用磁珠法从人类尿液样本提取JCV DNA，获得待测样本；
PCR扩增反应：
将提取的JCV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；
所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、JCV引物探针混合液，
所述JCV引物探针混合液，包括，上游引物：JCV-F，下游引物：JCV-R，Taqman荧光探针JCV-FP，纯化水；
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针JCV-FP5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团；
结果检测：
采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针JCV-FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号。
2.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：37℃，2min；95℃，3min；然后，94℃，10s，60℃，35s，10个循环；然后，94℃，10s，60℃，35s，35个循环；25℃，1min。
3.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述JCV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。
4.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应，还包括：平行设置JCV阴性质控品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品和JCV定量标准品I～IV反应组，所述JCV阴性质控品为无菌生理盐水；所述JCV临界阳性质控品为浓度1.0×104copies/mL的JCV阳性尿液样本；JCV阳性质控品为浓度1.0×106copies/mL的JCV阳性尿液样本；JCV定量标准品I～IV，包括JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
5.根据权利要求1所述JC病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括：UDG酶及dUTP。
7.检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物：JCV-F，下游引物：JCV-R，Taqman荧光探针JCV-FP，
所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
所述下游引物JCV-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述Taqman荧光探针JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
8.根据权利要求7所述的检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、JCV阴性质控品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品和JCV定量标准品I～IV，其中JCV阴性质控品无菌生理盐水，JCV定量标准品I～IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
9.根据权利要7或8任一项所述的检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、JCV引物探针混合液、PCR反应液、JCV定量标准品、JCV阳性质控品、JCV临界阳性质控品、JCV阴性质控品、JCV内标质控品，各组分含量为：
10.权利要求7-9任一项所述的检测JC病毒的试剂盒，用于JC病毒的检测。
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