CN103122396A - 一种人巨细胞病毒hcmv检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化钾20～300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。本发明试剂盒检测HCMV的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400～4.00E+09copies/ml；应用该试剂盒可以对血清、尿液、外周血等未知样本中的HCMV-DNA进行快速准确的检测，为优生优育及HCMV感染的早期诊断提供可靠的实验依据。
Description
技术领域
本发明提供一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的HCMV-DNA检测试剂盒。
背景技术
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）亦称细胞包涵体病毒，为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，所以称为巨细胞病毒。CMV可感染人和其他哺乳动物，但具有高度的宿主特异性，人是HCMV的唯一宿主。人大多感染过HCMV，但多呈无临床症状的急性感染或潜伏感染，且大多在少儿期因感染而获得免疫。HCMV是一种机会致病性病毒，病毒可长期潜伏在体内，甚至终身带毒，但其在免疫功能不成熟或缺陷的人群（如艾滋病和器官移植患者等）中，潜伏的HCMV可被激活而引起严重疾病。同时，HCMV也是人类先天性感染最常见的病原之一，可对胎儿造成不可逆的损害，分娩后治疗无任何意义，必须在损害发生前及早诊断和治疗。由于HCMV对人类健康造成了很大的威胁，对这种疾病的临床感染诊断的时效性，精确性的要求也越来越高。
目前HCMV感染常用的实验室诊断方法有血清学检查、抗原血症检测及基于PCR技术的检测方法等。血清学方法很多，包括补体结合试验、间接血凝试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和放射免疫试验。其中酶联免疫吸附试验是最常用的方法，酶联免疫吸附技术不需要特别的荧光显微镜，又可避免放射性同位素对人体的伤害，且酶标物的有效期长，便于保存，有灵敏度高、特异性好和重复性好等长处，方法简单，不需要特殊仪器，但该方法灵敏度明显不如抗原血症检测，且不利于早期诊断。最常用于抗原血症检测的抗原为pp65，它是HCMV活动性感染的早期标志性产物，是目前监测HCMV活动性感染和指导抗病毒治疗的重要方法，但是pp65抗原血症检测仅适合于血标本，且标本要求及时处理（一般在4小时内）。PCR技术由于高灵敏度、高特异性、快速、简便等优点，使其为人巨细胞病毒的检测提供了又一新的途径。定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。
运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
目前国内临床上主要采用直接煮沸法对血清样本中的人巨细胞病毒核酸进行提取，具体是向血清中加入某种核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。而对尿液或乳汁样本中的人巨细胞病毒核酸进行提取也主要采用煮沸法，具体是先将样本浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板；浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀则使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
临床上检测HCMV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测HCMV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在500~1000copies/ml左右；另外，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
发明内容
本发明提供一种核酸释放剂在人巨细胞病毒HCMV检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。
在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在人巨细胞病毒HCMV检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该病毒检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。
本发明提供一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测HCMV的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400~4.00E+09copies/ml。
具体的，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’-CAGATTCTTTGGACGGACAGACT-3’；下游引物序列为5’-AGTGTCGGTAGCCGTTTTTGC-3’；探针序列为5’-CCCAACCTGCTAGACCGACTGCGA-3’。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。
在本发明中，优选的是，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的HCMV浓缩液，所述HCMV浓缩液包括10~100mM/L的聚乙二醇6000和50~500mM/L的氯化钠溶液。在血清样本加入HCMV浓缩液进行浓缩后，能更好地进行随后的HCMV-DNA核酸释放和检测。
本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。本发明中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，内标下游引物序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，内标探针的序列为5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQl-3’。探针中BHQ1表示羟基端用BHQ1淬灭基团修饰。
优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5~2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括HCMV定量参考品、HCMV阳性对照和HCMV阴性对照。
本发明还提供一种HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’-CAGATTCTTTGGACGGACAGACT-3’；下游引物序列为5’-AGTGTCGGTAGCCGTTTTTGC-3’。
本发明又提供一种HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5’-CCCAACCTGCTAGACCGACTGCGA-3’。
本发明还具体提供一种HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括HCMV浓缩液、核酸释放剂、PCR反应液、内标、酶混合液、HCMV定量参考品、HCMV阳性对照和HCMV阴性对照；且所述核酸释放剂中包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%，乙醇0.05~1%和溶剂TE缓冲液；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，用于内标扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，10×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP；所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
本发明提供的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对血清、尿液、外周血等未知样本中的HCMV-DNA进行快速准确的检测，为优生优育及HCMV感染的早期诊断提供可靠的实验依据。
附图说明
图1中①为实施例中HCMV-DNA检测结果为阳性的待测样本的扩增曲线，图1中②为实施例中HCMV-DNA检测结果为阴性的待测样本的扩增曲线。
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1
本实施例提供一种具体的人巨细胞病毒检测试剂盒，它包括如下组分：
①HCMV浓缩液：包含50mM/L的聚乙二醇6000（PEG-6000）和100mM/L的氯化钠。
②核酸释放剂：包含莎梵婷（surfactin）0.1mM/L，氯化钾100mM/L，十二烷基磺酸钠（SDS）0.1%，0.1%的乙醇和溶剂TE缓冲液。
③内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2.00E+04copies/ml，100碱基对的序列为：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。
④PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为0.3μmol/L，用于靶多核苷酸检测的探针为0.3μmol/L，用于内标片段扩增的上下游引物均为0.3μmol/L，用于检测内标的探针为0.1μmol/L。其中，所述10×PCR反应缓冲液为包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于人巨细胞病毒核酸的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为：上游引物：5’-CAGATTCTTTGGACGGACAGACT-3’；下游引物：5’-AGTGTCGGTAGCCGTTTTTGC-3’；探针：5’-CCCAACCTGCTAGACCGACTGCGA-3’；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：上游引物：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’；下游引物：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’；探针：5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–3’。
⑤酶混合液：包含5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。
⑥HCMV定量参考品：来源于使用HCMV企业定量线性参考品L1~L5定值后的HCMV强阳性质粒，该HCMV定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为4.00E+07copies/ml（A）、4.00E+06copies/ml（B）、4.00E+05copies/ml（C）、4.00E+04copies/ml（D）。
⑦HCMV阳性对照：为临床医院收集的已灭活的HCMV强阳性尿液样本，经浓缩离心后，加入灭菌生理盐水溶解沉淀，并经合格的HCMV试剂盒检测并定值后，用灭菌生理盐水稀释至浓度为4.00E+05copies/ml。
⑧HCMV阴性对照：临床医院收集的已灭活的HCMV阴性尿液样本，用灭菌生理盐水稀释100倍后，经合格的HCMV试剂盒检测为阴性。
实施例2
本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测血清、尿液及外周血等未知样本中HCMV-DNA的操作步骤：
一、试剂准备
根据待测样本、HCMV阴性对照、HCMV阳性对照以及HCMV定量参考品A~D的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）及内标1.0μl/人份，充分混匀成PCR-mix，例如待测样本为3人份时，一共需配制9人份（上述四者的人份数分别为3、1、1和4）的PCR-mix；瞬时离心后备用。
二、核酸提取
1.尿液样本：取1ml样本，12,000rpm离心5分钟，弃上清后往沉淀中加入50μl核酸释放剂，与沉淀震荡或移液枪吸打混匀，作为待测样本备用。
2.血清样本：取100μl血清样本，加入等体积的HCMV浓缩液，12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入50μl核酸释放剂，用枪头挑起沉淀，吸打几次，将沉淀打散混匀，作为待测样本备用。
3.外周血样本：使用湖南圣湘生物科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒处理（该试剂盒市面有售，并不使用本发明上述实施例1中所述的核酸释放剂），得到的DNA作为待测样本。
4.HCMV阴性对照、HCMV阳性对照、HCMV定量参考品：HCMV阴性对照、HCMV阳性对照、HCMV定量参考品A~D分别取10μl与10μl核酸释放剂混匀待用。
三、向PCR反应管中加样
每个PCR反应管中加入上述第二步骤中处理后的待测样本、HCMV阴性对照、HCMV阳性对照以及HCMV定量参考品A~D各10μl；静置10分钟后，每管加入步骤一中的PCR-mix40μl，吸打混匀2-3次，去除气泡后盖上管盖，2000rpm离心30秒。
四、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）
1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测HCMV；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标；参比荧光（Passive Reference）设置为none。
3）荧光定量PCR反应条件见表1：
表1
4）结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定量检测结果。对于测定Ct值≤39（Ct值＞0）的样本，报告为HCMV-DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型（见图1中①）；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为HCMV-DNA阴性，此时待测样本扩增曲线平直（见图1中②）；对于测定Ct值>39的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为低于检测下限。若内标Ct值>39或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
使用本发明中试剂盒的特异性试验表明，其与常见病原体HBV、HCV、HIV、HSV-1、HSV-2、EBV、HPV等均无交叉反应，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。
使用本发明中试剂盒检测企业工作参考品，其阴阳性符合率为100%，灵敏度检测结果符合质量标准；精密度试验表明批内和批间重复性好，其Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。使用本发明中试剂盒对临床样本的检测试验表明，该试剂盒的定量线性范围为400～4.00E+09copies/ml，检测下限即灵敏度为400copies/ml。
Claims (10)
1.一种核酸释放剂在人巨细胞病毒HCMV检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。
2.一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’-CAGATTCTTTGGACGGACAGACT-3’；用于靶多核苷酸的下游引物序列为5’-AGTGTCGGT AGCCGTTTTTGC-3’。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探针序列为5’-CCCAACCTGCTAGACCGACTGCGA-3’。
5.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的HCMV浓缩液，所述HCMV浓缩液包括10~100mM/L的聚乙二醇6000和50~500mM/L的氯化钠溶液。
6.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且内标上游引物序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，内标下游引物序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，内标探针序列为5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQ1-3’。
8.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5~2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。
9.一种HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’-CAGATTCTTTGGACGGACAGACT-3’；下游引物序列为5’-AGTGTCGGTAGCCGTTTTTGC-3’。
10.一种HCMV检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5’-CCCAACCTGCTAGACCGACTGCGA-3’。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: HUNAN SHENGWEIER MEDICAL INSPECTION CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: HUNAN SHENGXIANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20141119 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20141119 Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Patentee after: Hunan company limited of Sheng Weier medical test institute Address before: 410012 No. 198 west slope, Tongzi hi tech Industrial Development Zone, Hunan, Changsha Patentee before: Sansure Biotech Inc. |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HUNAN SHENGXIANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: HUNAN SHENGWEIER MEDICAL INSPECTION CO., LTD. Effective date: 20150512 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150512 Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Sansure Biotech Inc. Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Patentee before: Hunan company limited of Sheng Weier medical test institute |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Kit for detecting human cytomegalovirus (HCMV) Effective date of registration: 20170711 Granted publication date: 20140813 Pledgee: Ningbo free trade zone Terry with equity investment partnership (limited partnership)|Suzhou equity equity investment center (limited partnership)|Ningbo Meishan Bonded Port District, Jun and equity investment partnership (limited partnership)|Chen Bang Pledgor: Hunan Gene Technology Co.|Hunan San Xiang Biological Technology Co. Ltd. Registration number: 2017430000042 |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Shengxiang Biotechnology Co., Ltd Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee before: Sansure Biotech Inc. |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200217 Granted publication date: 20140813 Pledgee: Suzhou Lirui equity investment center (limited partnership)|Triton equity investment partnership (limited partnership)|JUNHE Tongrui equity investment partnership (limited partnership)|Chenbang Pledgor: SANSURE BIOTECH Inc. Registration number: 2017430000042 |