CN107586883A - 一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染JC病毒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂盒。
背景技术
JC病毒(JC virus，JCV)属乳多空病毒科多瘤病毒种人类多瘤病毒分支。1971年Pagett等首次从进行性多灶性白质脑病(progressive multifocalleucoencephalopathy，PML)患者脑组织中分离出JC病毒。JC病毒在人群中广泛存在，主要潜伏在人的肾脏等组织内。JC病毒的感染发生在人的童年时期，呈持续亚临床潜伏感染状态，免疫健全状态下可终生无症状，属于无症状感染，但对于AIDS患者或服用免疫抑制药物的患者则可引发PML等系列疾病，PML是一种致死性中枢神经系统脱髓鞘疾病。近年来研究表明，JC病毒与多种人类肿瘤的发生相关，包括脑肿瘤、结直肠癌、胃癌、食道癌及B细胞淋巴系统肿瘤等。随着我国HIV/AIDS患者人数的逐年增加，JC病毒感染作为HIV/AIDS相关的机会感染也会逐年增多，以及肾移植等器官移植患者在施用免疫抑制药物后，JC病毒感染引发PML的概率增大，JC病毒所带来的危害也会更加突出。
对JC病毒感染的检测包括检测血清中特异性的VP1抗体，对感染者的尿液、脑脊液、血液及病变组织进行JC病毒DNA检测，对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JC病毒在人群中感染率很高，抗体检测并不能准确证明样品是否被活动性JC病毒感染。
发明内容
为了解决现有技术中抗体检测不准确的问题，本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针，其中，
所述用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品2为1×106拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品3为1×105拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品4为1×104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
具体地，所述阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的所述JC病毒的T抗原基因片段。
具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
具体地，所述临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测JC病毒的引物和探针，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染JC病毒，本发明实施例提供的用于检测JC病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染JC病毒，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log StartingQuantity copy number，纵坐标为Threshold Cycle。
图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，Log Starting Quantity copy number为水痘带状疱疹病毒起始浓度的对数值，Ct(Threshold Cycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1.一种用于JC病毒核酸定量检测的引物和荧光探针
本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的引物和探针，引物和探针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针，其中，
用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
表1.JC病毒引物和探针
表1中：F：forward，正向；JC病毒-F表示JC病毒的正向引物。R：reverse，反向；JC病毒-R表示JC病毒的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；JC病毒-P表示JC病毒荧光探针，荧光探针可以为TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1的设计的引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
本发明实施例提供的引物和探针具有灵敏度高的特性，且能够准确检测出待测样品中的JC病毒的含量。
实施例2.一种用于检测JC病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒核酸定量的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物和探针，该试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。在本实施例中，PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液5μL。
具体地，正向引物和反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM(正向引物和反向引物均为0.05-0.9μM)，探针的终浓度为0.05-0.9μM。在本实施例中，浓度为10μmol/L引物加入2.5μL，浓度为10μmol/L探针加入2.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中构成反应体系，再添加无菌水至体积为49.5μL。
具体地，核酸释放剂：Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)的终浓度为0.03％、NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)的终浓度为0.04％和pH值为8.3的终浓度为0.01M的Tris-HCL(三(羟甲基)氨基甲烷)，溶剂为无菌水。
具体地，阴性质控品为浓度为0.8％的生理盐水。称量0.008g氯化钠固体溶于1ml双蒸水，混匀，直接吸取0.5μL作阴性质控品。
具体地，阳性质控品包括含浓度为1.0×106拷贝/mL的JC病毒基因片段的溶液。取含JC病毒液，毒株由中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，CCTCC)提供，经培养后，取含JC病毒液100μL加入等体积的核酸释放剂充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×106拷贝/mL，即可作为阳性质控品模板。
具体地，临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的JC病毒基因的DNA片段溶液。取含JC病毒液，毒株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，经培养后，取含JC病毒液100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×104拷贝/mL，即可作为临界阳性质控品。
具体地，工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
工作标准品1为含有1.0×107拷贝/mL的JC病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2为含有1.0×106拷贝/mL的JC病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3为含有1.0×105拷贝/mL的JC病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4为含有1.0×104拷贝/mL的JC病毒基因的非传染性DNA片段。
工作标准品，为含有JC病毒的高度保守基因的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×108拷贝/mL，于-20℃保存。贮存浓度为1.0×108拷贝/mL，使用前用无菌生理盐水或0.1mol/L PBS缓冲液(pH值为7.6)进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×107拷贝/mL，1.0×106拷贝/mL，1.0×105拷贝/mL和1.0×104拷贝/mL，使用前，经10,000rmp离心30s，取上清液作为工作标准品。本实施例提供的试剂盒成分如下：
表2.试剂盒配置(24人份/盒)：
该试剂盒可在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，该试剂盒适用的荧光定量PCR仪包括：Roche LightCycler480、ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P和达安7000等。
用本发明实施例2提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测JC病毒，具体方法如下：
(1)采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品，样品可以为血浆、血清或尿液，在5个经检测已知的阳性样品中有2个样品为血清，1个为血浆，其余2个为尿液，在3个经检测已知的阴性样品中有1个样品为血清，1个为血浆，其余1个为尿液。
①血清的预处理：取0.5ml血液品置于1.5ml离心管中，2000r/min离心5min，分离出血清。离心管4℃保存备用。
②血浆的预处理：取0.5ml血液品置于1.5ml离心管中，加入抗凝剂，轻轻颠倒混匀，2000r/min离心5min，分离出血浆。离心管4℃保存备用。
③尿液标品处理：将采集的尿液样品振荡混匀，1ml转移至离心管中，13000rpm离心10min，弃上清，离心管4℃保存备用。
样品保存和运输：如果样品不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。样品长途运送应采用0℃冰壶。
(2)样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品。
(3)加样：向装有PCR反应液、引物和探针的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品各0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品或工作标准品的体积比为99：1，经5,000rpm离心10s。
(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品选Unknown。
按下面程序进行PCR扩增：
95℃3分钟；
95℃10秒，60℃1分钟(收集荧光信号)，40个循环。
(5)分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的扩增结果如图1所示(图1在Ct值为32时已经可以判断出样品结果)，具体检测结果见下表3。
表3为实施例2提供的样品对应的Ct值
| 序号 | Ct值 |
| 1 | 26.79 |
| 2 | N/A |
| 3 | N/A |
| 4 | 21.38 |
| 5 | 24.32 |
| 6 | 20.78 |
| 7 | 20.08 |
| 8 | N/A |
其中，样品1，4，5，6，7在阳性范围内，为阳性样品；N/A表示阴性，样品2，3，8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知的一致，可见本发明实施例2提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％，以图1为例，在图1中将阳性样品扩增结果标出，图2-图5中的排布规律参见图1。
实施例3.一种用于检测JC病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中JC病毒核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液3μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入0.25μL，浓度为10μmol/L探针加入0.25μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为10μL。
DNA提取液包括Triton-X100终浓度为0.1％、NP-40终浓度为0.2％和Tris-HCL(pH值为8.3)终浓度为0.05M/L。
表4.实施例3提供的试剂盒配置(24人份/盒)：
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图2所示，得到具体检测结果见表5。
表5为实施例3提供的样品对应的Ct值
| 序号 | Ct值 |
| 1 | 29.55 |
| 2 | 23.79 |
| 3 | 18.56 |
| 4 | N/A |
| 5 | 22.24 |
| 6 | 24.66 |
| 7 | N/A |
| 8 | 22.46 |
| 9 | 21.27 |
| 10 | 30.69 |
表5中，样品2、3、5、6、8和9在阳性范围内，为阳性样品；样品1和10在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共8个且与已知检测结果相符；样品4和7在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例3提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例4.一种用于检测JC病毒的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中JC病毒核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 3μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液10μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入4.5μL，浓度为10μmol/L探针加入4.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为45μL。
DNA提取液包括Triton-X100终浓度为0.1％、NP-40终浓度为0.2％和Tris-HCL(pH值为8.3)终浓度为0.05M/L。
其余试剂与实施例2中提供的试剂相同。
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品各5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品的体积比为9：1，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图3所示，得到具体检测结果见表6。
表6为实施例4提供的样品对应的Ct值
| 序号 | Ct值 |
| 1 | 24.11 |
| 2 | 30.17 |
| 3 | 22.53 |
| 4 | 31.59 |
| 5 | N/A |
| 6 | N/A |
| 7 | 26.01 |
| 8 | 31.55 |
表6中，样品1、3和7在阳性范围内，为阳性样品；样品2、4和8在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共6个且与已知检测结果相符；样品5和6在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例4提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例5.一种用于检测JC病毒的试剂盒
在利用本发明实施例4提供的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样品反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还有4个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μL，按照实施例4的方法配制PCR反应体系，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×107拷贝/ml、1.0×106拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml、1.0×104拷贝/ml及1.0×103拷贝/ml。
采用使用仪器Bio-Rad iQ5TM进行检测。
参照结果：
a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品JC病毒DNA含量小于检测下限；
b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品JC病毒DNA含量处于临界阳性范围；
c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：若样品的C(“C”表示样品浓度或含量)＜5.0000E+01，则该样品的JC病毒DNA总含量＜50基因拷贝；若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的JC病毒DNA总含量等于C基因拷贝；若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的JC病毒DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测，具体检测结果见表7；
表7为Ct值及其对应的起始浓度
| 工作标准品 | Ct值 | C(起始浓度) |
| 1.0e+007 | 18.30 | 1.0e+007 |
| 1.0e+006 | 21.62 | 1.0e+006 |
| 1.0e+005 | 24.94 | 1.0e+005 |
| 1.0e+004 | 28.26 | 1.0e+004 |
| Slope | -3.32 | - |
| Intercept | 41.54 | - |
| R2 | 1 | - |
| 标准方程 | y＝-3.32x+41.54 | - |
本发明实施例5提供的样品的扩增曲线如图5所示，本发明实施例5提供的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的初始浓度如下表。
扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.32。检测下限可精确到5.000e+002，由此可见，该试剂盒具有高灵敏度。
本发明涉及一种引起人类进行性多灶性白质脑病等疾病的病原体基因检测技术，适用于JC病毒定性定量检测。本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，能够准确检测样品是否感染JC病毒，其试剂盒能够精确定量，且能够快速准确的检测JC病毒。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明实施例不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间，整个检测过程共仅需2～3小时。在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数(Ct值)就可以直接报告出DNA起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北朗德医疗科技有限公司
<120> 一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂盒
<160> 3
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttctaaatc cagcctttct ttcc
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgactttgct tttgctttta atctg
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccactgcaca atcctctcat gaatggc
Claims (10)
1.一种用于检测JC病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针，其中，
所述用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.一种用于检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品2为1×106拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品3为1×105拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
所述工作标准品4为1×104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的所述JC病毒的T抗原基因片段。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR 扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4%的壬基酚聚氧乙烯（40）醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三（羟甲基）氨基甲烷。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度为0.8%的生理盐水。
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|---|---|---|---|---|
| CN115491434A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-12-20 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种jc病毒实时荧光定量检测探针及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102690895A (zh) * | 2011-07-27 | 2012-09-26 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 一种jc病毒的检测方法、其试剂盒及应用 |
| CN104745724A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-01 | 湖北永邦医疗科技有限公司 | 一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒 |
| CN106048093A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-10-26 | 北京思尔成生物技术有限公司 | Jc病毒的检测方法、试剂盒及其应用 |
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- 2017-09-27 CN CN201710885853.1A patent/CN107586883A/zh active Pending
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