KR20070119664A - 유전자 발현의 ｉｎ ｖｉｖｏ 영상에 관련된 조성물 및방법 - Google Patents
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Abstract
조직-선별적 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합된 재조합 7가지 막통과 G-단백질 연합된 수용체 (GPCR) 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열에 대해 설명한다. 조직-선별적 프로모터 또는 증폭된 조직 특이적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 in vivo에서 감지가능한 리포터를 인코드하는 핵산을 개체로 도입시키고, 관심 유전자 또는 리포터와 선택적으로 상호작용하는 치료제 또는 비-침습성 촬영 기술을 개체에 사용하는 것과 관련된 개체에서 세포를 처리하거나 영상화시키는 방법을 설명한다. 예를 들면, 개체는 암 환자이고, 치료요법제는 항암제일 수 있다. 특히, hTERT 프로모터 또는 증폭된 hTERT 프로모터는 리포터 예를 들면, hSSTR2 또는 hSSTR2 유도체를 구동시키고, 이들은 관심 유전자에 연결되어 있을 수 있다. 핵 의학을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 영상화를 실행할 수 있다.
Description
본 출원은 2005년 3월9일자 출원된 미국 예비 특허 출원에 관계하며 이 전문을 참고문헌으로 첨부한다.
본 발명은 촬영(imaging), 생의학 촬영, 분자 생물학, 유전자 요법 및 암 요법 분야에 일반적으로 관계한다. 본 발명의 한 측면에는 개체의 비-침습성(non-invasive) 촬영 및 치료를 위한 조성물 및 그 방법이 포함된다. 본 발명의 다른 측면에는 증폭된 조직 특이적 프로모터에 작용가능하도록(operatively) 연결된 리포터(소요의 유전자에 연결될 수도 있음)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에는 hTERT 및 이의 유도체에 한정시키지는 않지만 이를 포함하는 조직-선택적 프로모터 서열 또는 증폭된 조직 특이적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 재조합 7개 막 통과 G-유전자 연합된 수용체(GPCR) 아미노산 서열을 인코드하는 신규한 핵산을 포함한다.
유전자 요법 및 세포 치료법은 상당한 전망이 있지만, 유기체내에 재조합 핵산을 발현시키는 세포를 추적하거나 유전자 요법을 특이적 위치 발현을 위한 방법의 부재가 문제다. 다양한 리포터 유전자가 특정 핵산의 발현 위치 파악 및 정량 화에 사용될 수 있다. 프레-클리닉 종양 모델에서, 리포터 유전자, 재조합 소마토스태틴(소마토스태틴) 수용체 타입 2a (SSTR2a) 키메라의 전달은 in vivo에서 정량화할 수 있다. 리포터 유전자가 암을 표적으로 하는 경우에 약한 생장 저해물질로 작용할 수도 있다. 그러나, 이는 세포계 요법 예를 들면 당뇨병과 같은 다른 질환 또는 관심 유전자의 발현 또는 위치 평가에는 바람직하지 않을 수도 있다.
생의학 촬영에는 개체에서 질병 진단을 지원하고 뿐만 아니라 신체의 정상적인 구조 및 기능을 더 잘 이해하기 위해 의사 또는 연구원들 사이에 광범위하게 이용되는 다양한 양식이 포함된다. 이들 방법들중 대부분에 한 가지 문제점은 사람에 이용하였을 때 안정성이 공지되지 않은 방사성의약품(radiopharmaceuticals )을 이용하거나 예측하지 못하는 부작용을 가질 수 있는 방사능동위원소를 이용한다는 것이다. 또 다른 문제점은 리포터의 차선의 프로모터 기능으로 인해 리포터가 제한될 수 있기 때문에 이들 방법도 한계가 있다는 것이다. 또한, 촬영이 종양과 같은 원하는 조직을 표적으로 하지 않을 수도 있다는 것이다.
해부학적 그리고 기능적 촬영 기술과 같은 한가지 촬영 양상을 복합하면 종양과 같은 원하는 부분 또는 개체의 특징화 또는 개선된 해결책을 얻을 수도 있다.
따라서, 개체로 또는 원하는 조직으로 표적화되거나 운반될 수 있는 리포터가 필요하다. 발현의 증가와 같은 리포터 촬영 기술을 실행할 수 있는 방법 또한 필요하다. 리포터 촬영 기술과 유전자 요법의 결합으로 제2 촬영 리포터 또는 항암유전자와 같은 치료요법적 유전자의 효과 및 생체분포를 모니터하는 새로운 방법을 찾을 수 있다.
다음의 도면들은 본 명세서의 일부이며, 본 발명의 특정 측면들을 추가 설명하기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 여기에서 제시하는 특정 구체예와 이들 도면을 참고하면 더욱 이해가 용이할 것이다.
도. lA-lC. in vitro에서 측정된 SSTR2A 유전자 키메라의 발현. ELISA, 웨스턴 블랏(웨스턴 블랏) 및 수용체 결합 검사로 309 세포가 301세포보다 더 많은 리포터 융합 단백질을 발현시키고, 벡터만으로 트랜스펙션된 기준 세포에서는 융합 단백질의 발현이 없었다. 도 1A. 벡터 또는 유전자 키메라(클론 301, 309)로 트렌스펙트된 세포의 ELISA. 에러 막대는 삼중 샘플의 SD를 나타낸다. 웰당 30,000 세포가 도말되었다. *벡터 대 301 p<.05, **301 대 309 ρ<.05. 도 1B. 웨스턴 블랏. 라인당 20㎍ 단백질를 로딩하였다. 도 1C. 수용체 결합 검사. 세포(웨당 3 x 104 )를 0.1 μM 111In-OCt 또는 0.1 μM 111In-OCt + 1μM 소마토스태틴에 노출시켰다. 에러 막대는 삼중 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 벡터, 벡터로 트랜스펙트된 세포 301 및 309, 유전자 키메라로 트랜스펙트된 세포. *벡터 vs 301 ρ<.05, **301 vs 309 p<.05
도2. 111In-OCt의 정맥 투여후에 생체 분포, 벡터에 트랜스펙트된 세포보다는 301세포, 또 301세포에서 유도된 것보다는 309세포에서 유도된 종양에서 방사능약 물의 생체 분포가 더 많은 것을 볼 수 있다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다. (n = 6마리 쥐). *벡터vs 301 p<.05, **301 vs 309 p<.05.
도. 3A-3G. γ-카메라 촬영. 평면 및 SPECT 촬영에 의해 유전자 키메라를 발현시키는 종양들을 볼 수 있으나 벡터로 트랜스펙트된 세포에서 유도된 종양에서는 볼 수 없다. 복부 종양(어깨 및 우측 허벅다리)을 가지는 생쥐에 111In-OCt (13 MBq)를 정맥으로 투여하고 평편(도 3A) 및 SPECT(도. 3B, coronal; 도. 3C, axial; 도. 3D, sagittal planes)촬영을 이용하여 24시간 후에 이미지화하였다. 클론 309(화살표), 301(흰색 화살표머리), 또는 벡터(엘로우 화살표머리)로 트랜스펙트된 세포에서 유도된 복부 종양들이 각각 우측 어깨, 좌측 어깨 또는 우측 허벅다리에 있었다. 이들 세가지 단층촬영면들이 종양309에 집중되었다. 이 도면에서 평면 및 SPECT 이미지들은 동일한 대표 생쥐의 것이다. 도 3E 및 도 3F, 절단된 종양에서 카운트는 평면 ROI 분석에서 유도된 측정과 관계있다(도. 3E, n=18) 또는 SPECT(도. 3F, n=18)촬영. G, 평면 이미지상의 개체의 크기는 개체의 실제 해부학적 크기와는 관계없을 수도 있다. 111In-OCt 클로라이드(93-0.3 μCi) 1:1 연속 희석액 500㎕를 포함하는 동일한 크기의 환상(바닥)의 평면 상(위측).
도 4A-C. 누드 생쥐의 MR 촬영. MR은 개체의 해부학적 크기로 정의되고 이의 내부 형태를 설명할 수 있다. 도 4A, A는 우측 허벅다리에 피하 종양(화살표)의 T2 FSE 이미지를 나타낸다. 화살표 머리가 방광을 나타낸다. 도 4B는 MR 촬영으로부터 유도된 중량이 절단된 종양의 무게와 연관이 있다(n=18). 도 4C, 좌측 어깨에 있는 피하 종양의 대표적인 T2 FSE 이미지를 나타낸다. 화살표는 종양내에 유체-찌꺼기 수준 중 하나를 가리킨다. MR의 경우에, 생쥐가 스캔되는 동안 유체 찌꺼기 수준을 설명하기 위해(도 4C) 생쥐의 복부 및 이미지가 이들 위치가 반영된다. 4.7T 마그네트에서 T2 FSE 촬영에는 다름의 변수들이 포함된다: TE 4120 msec, TR 72 msec, 4 Nex, 뷰필드 3.5 cm, 슬라이스 두께 1 mm, 0.3 mm 스킵, 매트릭스 256 x 256, 해상도 136 microns.
도 5A-5B. 침습성 및 비-침습성 방법에 의한 취입 상관관계. 절단된 종양의 % I.D./g은 평면(도. 5A, n=18) 또는 MR 촬영과 복합하여 SPECT (도. 5B, n=18) 촬영에서 유도된 % I.D./g와 연관된다.
도 6A-6D. 침습성 방법에 의해 평가된 생체 분포는 비-침습성 방법에 의해 측정된 생체 분포에 상응한다. 절단된 종양에서 111In-OCt의 생체분포는 종양 중량 (도. 6A) 또는 MR 유도된 보정된 중량(도. 6B)으로 정상화시킨다. 평면(도 6C) 또는 MR과 복합하여 SPECT(도. 6D) 촬영에 의해 측정된 종양에서 111In-OCt의 생체분포는 보정된 중량을 유도한다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다(n = 6). 벡터, 벡터 309, 301로 트렌스팩트된 세포에서 유도된 종양, 유전자 키메라를 발현하는 세포에서 유도된 종양. *벡터 vs 301 p<.05, **벡터 301 vs 309 p<.05.
도 7A-7D. ex vivo에서 평가된 SSTR2A 유전자 키메라의 발현. 대표 종양의 Ex vivo 분석에서 309 세포에서 유도된 종양이 301세포에서 유도된 종양보다 리포터 융합 단백질을 더 많이 발현시키고, 벡터만으로 트랜스펙트된 기준 세포에서 유 도된 종양에서는 발현이 나타나지 않았다는 것을 설명한다. 도 7A. 융합 단백질의 HA 테그 부분에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏. 종양으로부터 추출한 단백질 50㎍을 라인마다 적하하였다.
도 7B, 도 7C, 도 7D. 융합 단백질의 HA 테그 부분에 대한 항체를 이용한 종양의 면역착색. (도. 7B) 벡터, 벡터 301(도 7C) 및 309(도 7D)로 트렌스펙트된 세포에서 유도된 종양, 유전자 키메라를 발현시키는 세포에서 유도된 종양.
도 8A-8B. EGFP-나노입자의 전신 투여로 생쥐의 다양한 조직에서의 EGFP 발현. 도 8A. 누드 생쥐에 106 N417 세포의 흉부내 주사를 통하여 폐 N417 종양을 만든다. 생쥐에 정맥 주사를 통하여 다양한 EGFP-나노입자(20μg DNA:40 nmmol DOTAP: Choi/생쥐)를 투여 처리하였다. 주사후 48시간 후에 종양, 신장, 비장, 폐, 및 간의 새로 취한 냉동 샘플을 바로 준비한다. 냉동 부분은 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 형광 현미경하에 EGFP의 발현을 바로 검사한다. hTMC, 사람 TERT-미니-CMV 프로모터. 도 8B.FACS 분석에 의해 종양 및 정산 생쥐 조직에서 EGFP 발현의 정량화.
도 9A-9D. 도 9 A. HTl 080 트랜스펙턴트에서 SSRT2A 융합 단백질 발현의 면역-형광 이미지 분석. 도 9B. A에서 나타낸 바와 같이 SSRT2A 발현 세포(A, B, c) 및 비발현 세포(D)에서 접종된 s.c. 종양을 가지는 누드 생쥐의 감마-카메라 이미지. 동물에 111In-OCt(13 MBq)을 정맥 주사한 후 24시간 후에 이미지화하였다. 도 9C. pLJ290/FUSl-IRES-SSRT2A 플라스미드 트랜스펙트된 H1299 세포에서 SSRT2A 및 FUSl의 공동발현. 도 9D. 종양에 의해 취입된 방사능추적자와의 상관관계를 도 9B에 예시하였다. % ID/g = g당 주사된 양 %.
도 10A-10D. 암 유전자 요법 및 분자 촬영을 위해 FUSl 및 SSRT2A-발현시키는 플라스미드 벡터의 작제. hTMC, 사람 TERT-mini-CMV 프로모터. IRES, 내부 리보좀 유입 부위(Internal Ribosome Entry Site). HA, 헤마글루티닌 도메인. 아미노산 314를 지나 결손이 있는 HA-SSTR2A(delta 314)를 HA-SSTR2A로 대체할 수 있다.
도 11. HA-SSTR2의 증폭된 hTERT의 아데노바이러스 구조체. 이 구조체에는 hTERT 프로모터, GAL/VP16, GAL 결합 부위, 유전자 키메라(헤마글루티닌 A 테그 및 소마토스태틴 수용체 타입 2A (HA-SSTR2A)로 구성, HA-SSTR2의 증폭된 hTERT 중개된 발현을 위함)가 포함된다. 아미노산 314를 지나 결손이 있는 HA-SSTR2A(delta 314)는 HA-SSTR2A를 대체할 수 있다.
도 12. 텔로메라제 검사는 HT1 080 세포에서의 활성을 설명할 수는 있지만, IMR90 세포에서의 활성을 설명할 수는 없다. 텔로메라제 검사는 HTl 080 세포 또는 IMR90 세포의 추출물로 실행한다. HTl 080 세포에서 6개 염기쌍 반복 사다리는 텔로메라제 활성을 나타낸다. 음성 기준으로, HTl 080 세포 추출물을 RNase로 처리한다.
도 13A-13B. 세포 막 부세포 위치가 사람 텔로메라제 프로모터와 GAL4VP16 증폭 시스템을 포함하는 아데로 바이러스로 감염시킨 후에 발현된 HA-S STR2 융합 단백질이다. 텔로메라제를 발현시키지 않은 사람 섬유아세포 IMR-90(도 13B)에서보다는 텔로메라제를 발현시키는 개별 사람 섬유육종 세포, HTl 080(도 13A)에서 상대적으로 발현이 증가되었다는 것을 볼 수 있다.
도. 14. 사람 텔로메라제 프로모터 및 GALVP16증폭 시스템을 포함하는 아데노바이러스로 감염시키면 텔로메라제를 발현시키지 않은 세포(IMR-90, 사람 섬유아세포)보다는 텔로메라제를 발현시키는 세포(HTl 080, 사람 섬유육종)에서 HA-SSTR2A/감염된 세포의 발현이 더 크게되는 결과를 가진다.
도 15. 플라스미드 지도. 증폭된 hTMC 프로모터에 의해 SSTR2A 및 FUSl의 발현이 연결된다. 이 구조체에는 사람 텔로메라제 프로모터 (hTERT), 미니 사이토메갈로바이러스 (miniCMV) 프로모터, FUSl 유전자, 내부 리보좀 유입 부위, HA-SSTR2A에 연결된 FUSI(관심 유전자)의 증폭된 hTERT 중개된 발현을 위한 헤마글루티닌 A 테그 및 소마토스태틴 수용체 생장인자 A (HA-S STR2 A)를 구성하는 유전자 키메라가 포함된다.
도 16. 사람 miniCMV-hTERT (hTMC) 프로모터는 hTERT 프로모터에 의해 조직 특이적 발현을 증가시킨다. N417 세포에 유도된 흉부내 종양을 가지는 생쥐에 플라스미드-리포플렉스(20 micrograms DNA: 40 nmol DOTAP:Cholesterol/생쥐)를 정맥으로 주사한다. CMV 프로모터-강화 그린 형광 단백질 (EGFP)을 포함하는 플라스미드는 종양 및 정상 조직에서 발현을 증가시킨다. hTERT 계 프로모터를 포함하는 플라스미드는 종양에서의 발현을 증가시키나 정상 조직에서는 증가시키지 않거나 최소화시킨다. hTMC 프로모터는 증폭안된 hTERT 프로모터에서 보다 종양 특이적 발현을 더 크게 한다.
도 17. hTMC 또는 CMV 프로모터의 구동에 의해, SSTR2A 및 FUSl의 발현이 연 결될 수 있다. 따라서, HA-S STR2 또는 관련된 유전자들은 치료요법적 유전자 FUSl와 같은 치료 유전자와 함께 발현될 수 있다. CMV 프로모터 HA-S STR2 삽입체를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙트된 폐 암 세포 H 1299는 HA-SSTR2A 융합 단백질을 발현하게 된다. hTMC 프로모터 FUS1-HA-SSTR2를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙트된 H1299 세포는 HA-SSTR2A 융합 단백질 및 FUSl를 모두 발현시키게 된다. CMV 프로모터 FUS1-HA-SSTR2 삽입체를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙트된 H1299 세포는 HA-SSTR2 융합 단백질 및 FUSl를 발현시키게 된다. H1299 세포들을 일시적으로 트랜스펙트시키고, 72시간 후에 형광을 평가하였다. HA-SSTR2 융합 단백질은 HA-도메인을 표적으로 하는 항체를 통하여 볼 수 있고, 발현은 예상한 것과 같이 세포 막에서 볼 수 있다. FUSl는 FUS1에 대한 항체를 통하여 볼 수 있다. 내부 리보좀 유입 부위를 통하여 FUSl 및 HA-S STR2가 발현을 위해 연결된 경우에, 오버레이( overlay)는 핵 착색, HA-S STR2(CMV-HA-S STR2)의 공동 위치화(colocalization) 또는 핵 착색, HA-S STR2, FUSl의 공동 위치화를 설명한다.
도 18A-18B. Gal4-VP16 시스템에 의해 증폭된 hTERT 프로모터는 in vivo에서 종양 특이적 발현시킨다. 도 18 A: CMV 프로모터-그린 형광 단백질 삽입체 (음성 기준, 죄측)를 포함하는 아데노바이러스를 꼬리 정맥을 통하여 주사한 nude 생쥐는 간에서 HA-SSTR2A 발현시키지 못한다. 111-In-octreotide의 정상적 워시아웃은 신장을 통하여 확인한다. CMV 프로모터-HA-SSTR2 삽입체(양성 기준, 중간)을 포함하는 아데노바이러스를 주사한 Nude 생쥐는 간에서 발현시킨다. hTERT 프로모터- Gal4/VP16 프로모터- HA-SSTR2 삽입체를 포함하는 아데노바이러스를 주사한 Nude 생쥐는 간에서 발현시키지 못하여 정상조직에서 발현을 확인할 수 없다. 도 18B: 사람 섬유육종 종양(HTl 080 세포에서 유도된)을 가지는 Nude 생쥐에 좌측 종양에 hTERT 프로모터-Gal4/VP 16 프로모터-HA-SSTR2을 가지는 아데노바이러스로 종양내 주사하거나 우측 종양에 CMV 프로모터-HA-SSTR2 삽입체를 가지는 아데노바이러스로 주사하였다. 양쪽 종양에서 발현을 모두 볼 수 있다. 생쥐에 바이러스를 주사한 후 2일 뒤에 111-In-octreotide를 주사하였다. 1일 후에 평면 촬영을 실행하였다. 대표 이미지를 도시한다.
발명의 요약
핵산의 비-침습성 이미지 발현에 관한 능력은 암 요법과 같은 유전자 운반 개발에 기여할 수 있는데, 벡터의 생체 분포, 유전자 발현의 조직-연관 수준, 종양에서 발현, 비-표적 조직에서 발현, 치료요법적 활성과 이들 발현의 관련 능력에 대한 정보를 제공함으로써 가능하다.
이와 같은 데이터는 반응의 예보자로써 이들 변수들의 유효성을 확인시키고, 개선된 벡터 및 유전자 발현 구조를 개발하는 결과를 초래하게 될 정보를 제공할 것이다. 비-침습성 분자 촬영은 두 가지 요소 즉 감응적/특이적 리포터 분자 및 감응성 감지 장치가 요구된다. 이 기술로, 다중 기능 촬영 검사를 실행할 수 있는 멀티모델-촬영 장치에 신규한 촬영 벡터 및 프로브를 결합시킴으로써 신규한 분자 촬영 과정을 개발할 수 있을 것이다.
이와 같은 기술은 발현 및 일시적, 공각적 분포 뿐만 아니라 치료 효과 측면에서 유전자 전달을 평가하도록 특별히 고안된 신규한 분자 촬영 방법 개발을 실시할 수 있을 것이다. 또한, 이와 같은 기술로 분자 촬영 리포터 및 치료요법적 유전자 발현 벡터 시스템의 이중 개발을 실행할 수 있을 것이다. 특정 측면에서, 종양-특이적 프로모터-구동된 치료요법적 핵산이 리포터에 이가기능성 리포터를 통하여 또는 IRES를 통하여 결합될 수도 있다. 이와 같은 리포터 구조체는 생체 분포, 발현 또는 유전자 요법의 활성을 평가하기 위해 감마 카메라 촬영을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 촬영 양상과 복합될 수 있다. 특히, 암과 관련된 측면에서, MRI 및 MRI 분광학과 같은 촬영 양상에 국한되지 않는 촬영 양상을 이용하여 비침투적으로 종양 생장을 모니터하고, 치료법 또는 유전자 요법 투여에 대한 반응을 모니터한다. 특정 구체예에서, 유전자 요법은 전신으로 투여될 수 있다. 이들 방법에는 프로모터-구동된 리포터 발현을 확인(치료요법적 유전자의 발현을 동시에 확인하고)하기 위한 촬영 프로브와 핵산 발현을 모니터하기 위한 촬영 양상을 이용하는 것이 포함된다. 초음파, CT, MRI, MR 분광학과 같은 해부학적 촬영을 이용하면 종양 퇴행과 치료요법적 유전자 발현의 상관관계를 알 수 있다.
본 발명자들은 개체에서 세포의 촬영 및/또는 치료 방법을 설명한다. 본 발명의 측면에는 관심 대상 세포에서 리포터 및/또는 치료물질 발현을 증가시키기 위한 발현 증폭 전략이 포함된다. 이와 같은 증폭 전략의 예로는 리포터 발현또는 치료물질의 발현을 증폭시키기 위한 Gal4VP16 증폭 시스템을 이용하는 것이 포함된다(U.S. 특허 출원 20030099616, 참고문험으로 첨부됨). 다른 증폭 전략은 조직 선택적 프로모터 예를 들면, 특정 세포, 조직 기관에서 리포터의 발현을 증폭시키기 위한 hTERT 프로모터를 이용하는 것이다. 리포터를 한 개 또는 그이상의 관심 대상이 되는 유전자 예를 들면, 치료물질 또는 재조합 트랜스액티베이터(transactivator)에 작용가능하도록 결합되어, 치료물질 유전자의 생체 분포와 치료효과를 평가하는데 응용될 수 있다. 또한, 리포터를 제2리포터에 작용가능하도록 결합시킬 수도 있다.
특정 구체예에서, 조직 선택적 프로모터는 hTERT 프로모터이고, hTERT 프로모터는 제1리포터에 작용가능하도록 결합된다. 예를 들면, hTERT 프로모터 서열은 SEQ ID NO:1이 될 수도 있다. 좀더 특정한 구체예에서, hTERT 프로모터 및 제1 리포터로 구성된 핵산 서열에는 추가로 제2코딩 서열이 포함되는데, 이때 제2 코딩 서열은 치료물질, 선별가능한 표식, 재조합 트랜스액티베이터, 또는 제2 촬영 유전자 (리포터)를 인코드한다. 제2 코딩 서열은 hTERT프로모터 또는 제2 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 예를 들면, 제2 프로모터는 그린 형광 단백질(GFP_를 인코드하는 유전자에 작용가능하도록 결합된 CMV 프로모터가 될 수도 있어, 핵의학에 근거한 그리고 광에 근거한 촬영 양식을 복합하여 핵산을 이미지화 될 수 있게 한다.
리포터는 단일 또는 다중 촬영 양식 예를 들면, 핵 기초 의약 기술(가령, PET, SPECT), CT, MRI, MR 분광학, 초음파, 광학 촬영 양식에 의해 이미지화될 수 있다. 다른 측면에서, 리포터는 융합 단백질, 예를 들면 태그에 융합된 수용체 단백질(헤마토글루티닌 A를 포함하나 이에 국한되지 않는)이 될 수도 있다. 리포터는 64Cu, 68Ga, 18F, 111In 또는99mTc을 포함하나 이에 국한되지 않는 사람에게 사용이 허용될 수 있는 또는 승인된 물질로 라벨링시킨 것을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 이미지화할 수 있다. 다양한 리간드는 펩티드 및 이의 유사체(예를 들면 소마토스태틴 유사체)를 포함하나 이에 국한되지 않은 이들 물질로 라벨링시킬 수도 있다.
본 발명의 특정 구체예에는 조직 선별적 프로모터 서열에 작용하도록 결합시킨 비-침습성 방법에 의해 개체내에서 감지가능한 재조합 7개 막통과 G-단백질 연합된 수용체 (GPCR) 리포터 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 포함된다. 일부 구체예에서, 재조합 7개 막통과 G-단백질 연합된 수용체는 C-말단 결손을 가지거나 변형된 내화(altered internalization)를 가지고 있거나/또는 세포내 시그날생성에 결손이 있다. GPCR로부터 임의 아미노산을 본 발명에 포함시킬려고 한다. 당분야에 평균적 지식을 가진 자는 확인된 많은 GPCR에 대해 익히 알 수 있을 것이다. 예를 들면, GPCR는 아세틸콜린 수용체: Ml, M2, M3, M4, 또는 M5; 아데노신 수용체: Al; A2A; A2B; 또는 A3아드레노셉터: 알파lA, 알파lB, 알파lD, 알파2A, 알파2B, 알파2C 베타l, 베타2, 또는 베타3; 앙지오텐신 수용체: ATI, or AT2; 봄베신 수용체: BBl, BB2, 또는 BB3; 브레디키닌 수용체: Bl, B2, 칼시토닌, 아이닐린, CGRP, 또는 아드레노메듈린 수용체; 카나비노이드 수용체: CBl, 또는 CB2; 케모킨 수용체: CCRl, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRlO, CXCRl, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1, 또는 XCRl; 케모타틱(chemotactic) 수용체 : C3a, C5a, 또는 fMLP; 콜사이토키닌(콜사이토키닌) 및 가스트린 수용체: CCKl, 또는 CCK2; 코르티코트로핀(코르티코트로핀)-방출인자 수용체: CRFl, 또는 CRF2; 도파민 수용체: Dl, D2, D3, D4, 또는 D5; 엔도테린 수용체: ET(A) 또는 ET(B); 갈라닌 수용체: GALl, GAL2, 또는 GAL3; 글루타메이트 수용체: mgll, mgl2, mgl3, mgl4, mgl5, mgl6, mgl7, 또는 mgl8 당단백질 호르몬 수용체: FSH, LSH, 또는 TSH; 히스타민 수용체: Hl, H2, H3, 또는 H4; 5-HT 수용체: 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1B, 5-HT1F, 5HT2A, 5-HT2F, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5A, 5-HT5B, 5-HT6, 또는 5-HT7; 루코트리엔 수용체: BLT, CysLTl, 또는 CysLT2; 리소포스포리티드 수용체: edgl, edg2, edg3, 또는 edg4; 멜라노콜린 수용체: MCl; MC2; MC3; MC4, 또는 MC5; 멜라토닌 수용체: MTl, MT2, 또는 MT3; 신경펩티드 Y 수용체: Yl, Y2, Y4, Y5, 또는 Y6; 뉴우로텐신 수용체: NTSl, 또는 NTS2; 오피오이드: DOP,KOP, MOP, 또는 NOP; P2Y 수용체: P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, 또는 P2Y12); 퍼옥시좀 증식인자: PPAR-알파, PPAR-베타, 또는 PPAR-감마; 프로스테노이드 수용체: DP, FP, IP, TP, EPl, EP2, EP3, 또는 EP4; 프로테아제-활성화된 수용체: PARl, PAR2, PAR3, 또는 PAR4 소마토스태틴 수용체: SSTRl, SSTR2, SSTR2A, SSTR3, SSTR4, 또는 SSTR5; 타치키닌 수용체: NKl, NK2, 또는 NK3; 티로트로핀-방출 호르몬 수용체: TRHl, 또는 TRH2; 유로텐신-II 수용체; 맥관활성화 내장 펩티드 또는 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성 펩티드 수용체: VPACl, VPAC2, 또는 PACl; 또는 바소프레신 또는 옥시토신 수용체: Via, VIb, V2, 또는 OT가 될 수 있다. GPCR 슈퍼패밀리의 다른 멤버도 본 발명의 실행에 이용될 수 있는 것으로 간주한다.
특정 구체예에서, GPCR는 소마토스태틴 수용체, 바람직하게는 소마토스태틴 수용체 타입 2A (SSTR2A)이다. 일부 구체예에서, SSTR2A는 C-말단 결손을 가지거나 또는 변형된 내화를 가지거나 또는 시그날생성 결손이다. 특정 구체예에서, 절두( truncation)는 아미노산 314의 C말단이 된다. 여기에서 사용된 바와 같은, 조직-선별적 프로모터 서열은 다른 조직 또는 세포 타입에서는 상대적으로 낮게 발현되거나 대부분 침묵을 유지하나 한 개 또는 그이상의 조직 또는 세포 타입에서는 핵산의 전사를 유도할 수 있는 프로모터로 정의한다. 당분야에 공지된 임의 조직-선별적 프로모터 서열도 본 발명에 이용될 수 있다. 조직 선택적 프로모터 서열에는 텔로메라제 프로모터(사람 텔로메라제 RNA) (hTR) 프로모터 또는 사람 텔로메라제 역전사효소 프로모터 (hTERT) 프로모터등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 본 발명의 특정 구체예에서, 조직 선택적 프로모터는 여기에서 설명하는 것과 같은 발현 증폭 시스템과 함께 이용할 수 있다. 특히, 증폭 시스템은 리포터 또는 리포터 및 관심 유전자의 직간접적 발현을 유도하기 위해 hTERT 프로모터를 이용하고, 이때 관심 유전자는 리포터에 작용가능하도록 결합된다.
조직-선별적 프로모터 서열은 한 개 또는 그이상의 조직 또는 세포 타입에서 활성일 수 있는데, 예를 들면, 심장, 폐, 식도, 근육, 내장, 유방, 전립선, 위, 방광, 간, 지라, 췌장, 신장, 뉴우런, 심실세포, 백혈구, 불멸세포, 신형성 세포, 종양세포, 암세포, 십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum), 맹장(cecum), 결장(결장), 직장(rectum), 침샘, 담낭, 방광, 기관(trachea), 후두(larynx), 인두(pharynx), 대동맥(aorta), 동맥, 모세관, 정맥, 흉선(thymus), 하악 림프절(mandibular lymph node), 장간막림프절(mesenteric lymph node), 골수, 뇌하수체 선, 갑상샘(thyroid gland), 부갑상샘, 부신(ad신장 glands), 뇌, 대뇌(cerebrum), 소뇌(cerebellum), 수질(medulla), 중뇌(pons), 척수(spinal cord), 좌골신경(sciatic nerve), 골격근(skeletal muscle), 평활근(smooth muscle), 골, 고환, epidiymides, 전립선, 정낭(seminal vesicles), 남경, 난소, 자궁, 유선(mammary glands), 질, 피부, 눈 또는 시신경등이 포함될 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 특정 측면에서, 조직 선택적 프로모터는 동일한 배 기관에서 유도된 조직에서 활성이거나 또는 유사한 또는 동일한 질병 또는 상태에 의해 영향을 받을 수 있다.
특정 구체예에서, 조직 선택적 프로모터는 신형성 세포, 종양 또는 암세포에서 활성이다. 신형성 세포, 종양 또는 암세포에서 활성인 프로모터가 본 바명의 핵산에 포함된다. 예를 들면, 프로모터 서열은 hTR 프로모터 서열, hTERT 프로모터 서열, CEA 프로모터 서열, PSA 프로모터 서열, 프로바신(probasin) 프로모터 서열, ARR2PB 프로모터 서열, AFP 프로모터 서열, MUC-I 프로모터 서열, 뮤신(mucin)-유사 당단백질 프로모터 서열, C-erbB2/neu 온코유전자 프로모터 서열, 사이클로-옥시게나제 프로모터 서열, E2F 전사 인자 1 프로모터 서열, 티로시나제 관련 단백질 프로모터 서열, 티로시나제 프로모터 서열, 또는 설바이빈(survivin) 프로모터 서열등이 될 수 있다.
특정 측면에서, 프로모터 서열은 암 세포에서 활성인 hTERT 프로모터 서열이다. 암 세포는 임의 타입 암세포 예를 들면, 혈액, 심장, 폐, 식도, 근육, 내장, 유방, 전립선, 위장, 방광, 간, 비장, 췌장, 신장, 신경, 심실세포, 백혈구, 불멸세포, 불멸세포, 신형성 세포, 종양세포, 암세포, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 침샘, 담낭, 방광, 기관, 후두, 인두, 대동맥, 동맥, 모세관, 정맥, 흉선, 림프절, 골수, 뇌하수체 선, 갑상샘, 부갑상샘, 부신, 뇌, 대뇌, 소뇌, 수질, 중뇌, 척수, 신경, 골격근, 평활근, 골, 고환, epidiymides, 전립선, 정낭, 남경, 난소, 자궁, 유선, 질, 피부, 눈 또는 시신경에서 유도된 중배엽(mesoderm), 내배엽(endoderm) 또는 외배엽(ectoderm)을 포함하는 임의 타입의 암세포가 된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 프로모터 서열은 면역글로블린 중쇄 프로모터 서열, 면역글로블린 경쇄 프로모터 서열, T-세포 수용체 프로모터 서열, HLA DQ α 프로모터 서열, HLA DQ β프로모터 서열, 베타-인터페론 프로모터 서열, an 인터루킨-2 프로모터 서열, 인터루킨-2 수용체 프로모터 서열, MHC 클래스 II 5 프로모터 서열, MHC 클래스 II HLA-Dra 프로모터 서열, 베타-악틴 프로모터 서열, 근육 크리스틴 카이나제 (MCK) 프로모터 서열, 프레알부민(트란스티레틴) 프로모터 서열, 엘라스타제 I 프로모터 서열, 메탈로티오닌 (MTII) 프로모터 서열, 콜라게나제 프로모터 서열, 알부민 프로모터 서열, 알파-페토단백질 프로모터 서열, 감마-글로빈 프로모터 서열, 베타-글로빈 프로모터 서열, c-fos 프로모터 서열, c-HA-ras 프로모터 서열, 인슐린 프로모터 서열, 신경 세포 에데신 분자 (NCAM) 프로모터 서열, 알파- 1 -안티트립신 프로모터 서열, H2B (TH2B) 히스톤 프로모터 서열, 타입 I 콜라겐 프로모터 서열, GRP94 프로모터 서열, GRP78 프로모터 서열, 다른 포도당 조절된 단백질 프로모터 서열, 생장 호르몬 프로모터 서열, 사람 혈청 아미오이드(amyoid) A (SAA) 프로모터 서열, 트로포닌 I (TN I) 프로모터 서열, 혈소판-유도된 생장 인자 (PDGF) 프로모터 서열, 뒤시엔느 근이영증(뒤시엔느 근이영증) 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 폴리오마 프로모터 서열, 레트로바이러스 프로모터 서열, 파필로마 바이러스 프로모터 서열, 헤파타이티스 B 바이러스 프로모터 서열, 사람 면역결핍 바이러스 프로모터 서열, 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 프로모터 서열, 사람 LIMK2 유전자 프로모터 서열, 소마토스태틴 수용체 프로모터 서열, 뮤린 부고환 레티논산-결합 유전자 프로모터 서열, 사람 CD4 프로모터 서열, 생쥐 알파2 (XI) 콜라겐 프로모터 서열, DlA 도파민 수용체 프로모터 서열, 인슐린-유사 생장인자 II 프로모터 서열, 사람 혈소판 내피세포 흡착 분자- 1 프로모터 서열, 사람 알파-락트알부민 프로모터 서열, 7SL 프로모터 서열, 사람 Y 프로모터 서열, 사람 MRP-7-2 프로모터 서열, 5 S 리보좀성 프로모터 서열 또는 기능적 하이브리드, 기능적 부분 또는 조직 특이적 프로모터 서열들의 임의 복합체들이다. 본 발명의 프로모터 및 핵산들이 증폭 벡터에 포함될 수 있다. 증폭 벡터에 조직 특이적 프로모터의 제어하에 트랜스엑티베이터를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 인코드된 트랜스엑티베이터는 세포내에 트랜스엑티베이터에 의해 활성화되는 프로모터의 제어하에 있는 원하는 핵산 예를 들면, 리포터 또는 치료물질과 같은 핵산을 포함하는 제2핵산과 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 트랜스엑티베이터는 GaIVP 16 트랜스엑티베이터이다. GaIVP 16에는 구조체내에 다양한 수의 GAL 및/또는 VP 16를 포함할 수 있다. GaIVP 16에는 하나 또는 그 이상의 유전자가 GaIVP 16에 연결되어 있다.
본 발명의 핵산은 코어 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합되거나 결합되어 있지 않을 수 있다. 코어 프로모터 서열은 핵산에 특정 위치에 트랜스엑티베이터 또는 전사 복합체의 성분을 위치 또는 결합시키는 능력을 유지시키는 뉴클레오티드 서열로 정의한다. 일부 구체예에서, 조직- 선별적 프로모터 서열은 코어 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합된다. 코어 프로모터 서열은 당분야에 공지된 임의 코어 프로모터 서열이 될 수 있다. 예를 들면, 코어 프로모터 서열은 유비퀴틴 프로모터, 악틴 프로모터, 연장 인자 1 알파 프로모터, 초기(early) 생장 인자 반응 1 프로모터, 진핵 개시 인자 4Al 프로모터, 훼리틴 중쇄 프로모터, 훼리틴 경쇄 프로모터, 글리세르알데히드 3 -포스페이트 디하이드로게나제 프로모터, 포도당-조절된 단백질 78 프로모터, 포도당-조절된 단백질 94 프로모터, 열 쇼크 단백질 70 프로모터, 열 쇼크 단백질 90 프로모터, 베타-키네신 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, 베타-악틴 프로모터 또는 극소 바이러스성 프로모터 서열이 될 수 있다.
극소 바이러스성 프로모터 서열은 당분야에 공지된 임의 극소 바이러스성 프로모터 서열이 될 수도 있다. 예를 들면, 극소 바이러스성 프로모터 서열은 RNA 바이러스 프로모터, DNA 바이러스 프로모터, 아데노바이러스성 프로모터 서열, 베큘로바이러스성 프로모터 서열, CMV 프로모터 서열, 파르보바이러스 프로모터 서열, 허피스바이러스 프로모터 서열, 폭스바이러스 프로모터 서열, 아데노-연합 바이러스 프로모터 서열, 셈리키 산림 바이러스 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 박시니아 바이러스 프로모터 서열, 렌티바이러스 프로모터, 레오바이러스 프로모터, 또는 레트로바이러스 프로모터 서열이 될 수 있다. 특정 구체예에서, 극소 바이러스성 프로모터 서열은 미니-CMV 프로모터 서열이 된다. 예를 들면, 미니-CMV 프로모터 서열은 SEQ ID NO:2가 될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 조직 선택적 프로모터는 hTERT 프로모터이다. 예를 들면, 프로모터 서열에는 SEQ ID NO:3이 포함되는데, 여기에는 미니-CMV-서열에 작용가능하도록 결합된 hTERT 프로모터 서열이 포함된다. 다양한 코딩 서열을 제2 코딩 서열로 간주할 수 있는데, 여기에는 치료물질, 선별가능한 표식, 또는 제2 촬영 유전자 (리포터)가 포함될 수 있으나 이에 한정시키지는 않는다. 여기에서 치료물질은 개체에 있는 질병의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 알려진 또는 추측되는 물질로 정의한다. 본 발명의 다른 측면에서, 개체는 동물이 될 수 있으며, 바람직하게는 사람이다. 질병은 암을 포함하나 이에 한정시키지는 않는 개체에 영향을 끼치는 임의 질병이다. 특정 구체예에서, 치료물질은 종양 억제물질, 유도물질 아포프토시스, 효소, 항체, 항체 단편, siRNA, 호르몬, 프로드럭, 또는 면역자극물질이 된다. 특정 구체예에서, 치료물질은 방사능 치료물질이 된다. 당분야에 공지된 임의 종양 억제물질도 될 수 있는데 예를 들면, FUSl, p53, CDK4 또는 다른 사이클린-의존성 키나제; pl6INK4, p16B, p21WAFl, CIPI, SDIl, p27KIP1 또는 다른 CDK-저해성 단백질; C-CAM, RB, APC, DCC, NF-I, NF-2, WT-I, MEN-I, MEN- II, zacl, p73, BRCAl, VHL, FCC, MMACl, MCC, pl6 p21, p57, p27, BRCA2을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 특정 구체예에서, 종양 억제물질은 FUSl이다.
여기에서 선별가능한 표식은 용이한 동정, 분리가 가능하도록 발현시에 세포에 확인가능한 특징을 부여할 수 있는 핵산 서열 또는 선별가능한 표식없이도 세포로부터 선별가능한 표식이 포함된 세포를 선별할 수 있는 핵산을 말한다. 당분야에 공지된 임의 선별가능한 표식이 포함될 수 있는데 예를 들면 약물 선별 마커, 효소, 면역학적 마커, 형광 단백질이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 핵산에는 제2 코딩 서열이 포함되는데, 이때 제2 코딩 서열 및 재조합 7개 막통과 G-단백질 연합된 수용체 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 양방향 프로모터에 작용가능하도록 결합된다. 또는, 제2 코딩 서열은 제2 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 여기에서 양방향 프로모터는 프로모터 요소로부터 양방향으로 전사를 개시할 수 있는 능력을 가진 프로모터로 정의한다. 일부 구체예에서, 제2 코딩 서열 및 재조합 7개 막통과 G-단백질 연합된 수용체 (GPCR) 아미노산 서열을 인코하는 핵산은 IRES에 의해 분리되어 있다. 여기에서 RES는 내부 리보좀 진입 부위로 정의한다. 특정 구체예에서, 제2 코딩 서열은 치료물질, 선별가능한 표식, 또는 리포터를 인코드한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 치료 물질은 당분야에 공지된 치료물질이 될 수 있다. 예를 들면, 치료 물질은 종양 억제물질, 유도물질 아포프토시스, 효소, 항체, 항체 단편, siRNA, 호르몬 또는 면역자극물질이 될 수 있다. 임의 종양 억제물질이 본 발명에 포함될 수 있다. 예시적으로, 종양 억제물질들은 상기 제시되어 있다. 아포프토시스의 임의 유도물질이 본 발명에 포함될 수 있다. 예시적인 아포프토시스 유도물질에는 TRAIL, Bax, Bak, BcI-X3, Bik, Bid, Harakiri, Ad ElB, Bad 및 ICE-CED2 프로테아제가 포함된다. 특정 구체예에서, 종양 억제물질은 FUSl이다.
상기에서 논의된 바와 같이, 당분야에 공지된 임의 선별가능한 표식이 본 발명의 핵산 서열에 포함되는 것으로 간주한다. 예를 들면, 선별가능한 표식은 약물 선별 마커, 효소, 면역학적 마커, 형광 단백질이 될 수 있다. 여기에서 약물 선별 마커는 마커 유전자의 발현된 복사체를 보유하는 또는 보유하지 않는 세포를 선별하거나 이에 대응하는 것을 선별하는 마커이다. 예시적인 약물 선별 마커에는 세균성 아미노글리코시드 3' 포스포크란스퍼라제 유전자(neo 유전자로 지칭함)-(이는 포유류 세포에서 약물 G418에 대한 저항성을 부여한다), 세균성 하이그로마이신 G 포스포트란스퍼라제 (hyg) 유전자-(항생제 하이그로마이신에 내성을 부여) 및 세균성 산틴-구아니딘 포스포리보실 트란스퍼라제 유전자(gpt 유전자로 불리기도 함)-( 미코페놀산 존재하에 생장할 수 있는 능력을 부여함)가 포함된다. 다른 선별가능한 표식은 관련 효소 활성이 부족한 세포주와 이들의 이용이 연합되어야 하는데에 주요한 것은 아니다. 비-우성 선별가능한 표식에는 tk 세포주와 연계하여 이용되는 티미딘 키나제 (tk) 유전자, CAD-결손 세포와 함께 이용되는 CAD, hprt 세포주와 함께 이용되는 포유류 하이포산틴-구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제 (hprt) 유전자 등이 있다. 포유류 세포주에서 선별 가능한 표식의 이용에 대해서 Sambrook et al, (2001)을 참고한다. 여기에서 면역학적 마커는 폴리펩티드 발현을 인지하는데 이용되는 상응하는 항체 또는 항체 단편이 있는 폴리펩티드를 말한다. 형광 단백질은 당분야에 공지된 것이다. 예를 들면, 그린 형광 단백질 (GFP), 강화된 그린 형광 단백질 (EGFP), Renilla Reniformis 그린 형광 단백질, GFPmut2, GFPuv4, 강화 엘로우 형광 단백질 (EYFP), 강화 시안 형광 단백질 (ECFP), 강화 블루 형광 단백질 (EBFP), 디스코소마(discosoma)(dsRED)에서 얻는 담황색 및 레드 형광 단백질을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열에는 리포터 특히 GPCR 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 단백질 테그가 포함된다. 용어 "테그," "테그 서열" 또는 "단백질 테그"는 또 다른 서열을 추가하였을 때 그 서열의 감지 또는 분리에 유용한 추가 용도 또는 성질을 부여하는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산, 펩티드 또는 단백질의 화학적 모이어티 또는 다른 화학물질을 말한다. 따라서, 예를 들면 호모폴리머 핵산 서열 또는 캡쳐 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 프라이머 또는 프로브 서열에 첨가하여 연장 생성물 또는 하이브리드된 산물의 분리를 실행할 수 있다. 단백질 테그의 경우, 히스티딘 잔기(예를 들면, 4 내지 8 연속 히스티딘 잔기)를 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 추가하여 감지, 선별 또는 분리할 수 있다. 또는, 특정 항체와 반응성이 있는 에피토프 또는 결합 결정부위를 나타내는 아미노산 서열, 펩티드s, 단백질 또는 융합 파트너 또는 다른 분자(예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 단백질, 단백질 A, 셀룰로오즈 결합 도메인, 칼모둘린 결합 단백질, 말토즈 결합 단백질, 치틴결합 도메인, 글루타티온 S-트란스퍼라제 및 이의 유사체 flag 에피토프, c-myc 에피토프, 막통과 에피토프)가 단백질에 첨가되어 친화성 또는 면역친화력 크로마토그래피, 면역조직화학법 또는 여기에서 설명하는 비-침습성 감지 방법을 이용하여 단백질 분리, 정치(localization), 확인등을 실행할 수 있다. 화학적 테그 모이어티에는 바이오틴과 같은 분자가 포함될 수 있는데, 이는 핵산 또는 단백질에 추가하여 아비딘 시약 및 이와 유사한 것으로 상호 반응시켜 분리 또는 감지를 실시할 수도 있다. 상당수의 다른 테그 모이어티가 공지되어 있는데, 숙달된 기술자에게는 명백한 것으로 본 발명의 범위내에 있는 것으로 본다. 일부 구체예에서, 단백질 테그는 효소 활성을 가질 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에는 개체에서 비-침습성 방법에 의해 감지될 수 있는 재조합 트랜스엑티베이터에 결합하는 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합된 리포트를 인코드하는 핵산 서열이 포함된다. 여기에서 정의하는 재조합 트랜스액티베이터는 분리된 또는 조작된 폴리펩티드로써 적절한 프로모터 서열과 연관하여 적절히 위치하는 경우에 전사를 유도하는 도메인(트랜스활성화 도메인)을 포함한다. 조적된 트랜스엑티베이터에는 트랜스활성화 도메인에 작용가능하도록 결합된 소요의 프로모터를 인지하는 DNA 결합 도메인이 포함된다. 특정 구체예에서, 재조합 트랜스액티베이터는 Gal4VP16이다. 핵산은 제2 코딩 서열을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 특정 구체예에서, 리포터 인코딩 서열 및 제2 코딩 서열은 IRES에 의해 분리될 수 있다. 제2 코딩 서열은 치료 물질, 선별가능한 표식 그리고/또는 리포터를 인코드할 수 있다. 여기에서 "리포터," "리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 세포에 존재하는 폴리펩티드를 인코드하는 또는 다른 유전 서열과는 구별되는 감지가능한 임의 유전자 서열 또는 인코드된 폴리펩티드 서열을 말합니다. 리포터는 본 명세서에서 충분히 논의되고 있다.
일부 특정 구체예에서, 핵산 서열에는 제2 또는 제3 코딩 서열이 포함되는데, 이는 조직-선별적 프로모터에 작용가능하도록 결합되어 있으며, 제2 또는 제3 코딩 서열은 재조합 트랜스액티베이터를 인코드한다.
여기에서 제시하는 핵산 서열의 특정 구체예에서, 핵산은 운반 비이클내에 포함된다. 여기에서 운반 비이클은 핵산과 연합되어, 핵산을 세포내로 운반되는 것을 중개하는 실체를 말한다. 임의 운반 비이클도 본 발명에 포함될 수 있다. 예를 들면, 운반 비이클에는 폴리펩티드, 지질, 리포좀, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 파아지, 폴리리신과 같은 폴리아미노산, 원핵 세포, 진핵 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 것들이 포함된다.
본 발명의 추가 구체예는 in vivo 비-침습성 방법을 이용하여 감지가능한 개체에 조직-선별적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 리포트를 인코드하는 핵산을 도입시키는 것과 연관된 개체내 세포의 촬영 또는 치료 방법 및 리포트와 선별적으로 상호작용하는 비-침습성 촬영 기술 또는 치료제에 개체를 제공하는 일반적으로 포함한다. 치료방법은 유전자 요법, 방사능요법, 화학요법 그리고/또는 면역요법등이 될 수 있다.
특정 측면에서, 조직 선택적 프로모터는 신형성 세포, 종양 세포 또는 암 세포에서 활성이 있다. 특정 구체예에서 조직 선택적 프로모터는 예를 들면, 유방 암 세포, 폐암 세포, 전립선 암 세포, 난소암 세포, 뇌암 세포, 간암 세포, 경부 암 세포, 결장암 세포, 신장 암 세포, 피부암 세포, 머리와 목 암 세포, 뼈 암 세포, 식도암 세포, 방광암 세포, 자궁암 세포, 임파암 세포, 위암 세포, 췌장암 세포, 고환암 세포, 임파종 세포 또는 백혈병 세포에서 활성이 있다.
여기에서 정의된 바와 같이, "비-침습성 촬영"은 조직을 이미지화하기 위해 개체로부터 생검을 요구하지 않거나 개체로부터 떼어내지 않고 개체에 조직을 촬영할 수 있는 임의 방법을 말한다. 비-침습성 촬영의 임의 방법이 본 발명에 고려될 수 있다. 하기 명세서에서 비-침습성 촬영에 대해서는 더 상세히 다룰 것이다. 특정 구체예에서, 비-침습성 촬영은 세포내 리포트와 감지가능한 모이어티사이에 연합 정도를 검사하여 리포터의 발현을 감지하는 것과 연관된다. 일부 구체예에서, 리포터를 발현시키는 세포와 감지가능한 모이어티사이에 연합은 세포에 의해 감지가능한 모이어티의 결합, 세포에 의해 감지가능한 모이어티에 작용가능하도록 결합된 리간드의 결합, 감지가능한 모이어티의 세포성 취입, 또는 감지가능한 모이어티에 작용가능하도록 결합된 리간드의 세포성 취입이 관계한다. 특정 측면에서, 비-침습성 촬영은 우수한 조직 침투를 할 수 있는 핵 의학 기술에 의한 것이고, 감지가능한 모이어티(Christian et al. , 2004; Ell and Gambhir, 2004 참고).
여기에서 정의된 바와 같이, 감지가능한 모이어티는 비-침습성 촬영에 의해 감지가능한 신호를 발생시킬 수 있는 임의 분자 또는 물질이다. 예를 들면, 감지가능한 모이어티는 단백질, 방사능동위원소, 형광단(fluorophore), 가시광선 방출 형광단, 적외선 방출 형광단, 금속, 강자성 물질, 전자성 방출 물질, 특정 MR 분광 신호를 가지는 물질, X-선 흡수 또는 반사 물질 또는 사운드 변형 물질등이 될 수 있다. 특정 구체예에서, 감지가능한 모이어티는 리포터에 특이적으로 결합하는 리간드에 작용가능하도록 결합된다. 여기에서 "리간드"는 이온, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 더 큰 복합체를 형성하기 위해 다른 화학적 모이어티 또는 폴리펩티드에 결합하는 분자 또는 분자단을 말한다. 리간드는 하기 명세서에서 더 상세하게 설명할 것이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 리간드는 DNA 분자 또는 RNA 분자와 같은 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편, 또는 소분자이다. RNA 분자는 예를 들면 siRNA가 될 수 있다.
당분야에 공지된 임의 비-침습성 촬영 방법도 본 발명의 방법으로 고려된다. 비-침습성 촬영 방법은 하기 명세서에서 상세하게 설명한다. 비-침습성 방법에는 MRI, MR 분광학, 방사선촬영, CT, 초음파, 2차원 감마 카메라 촬영, SPECT, PET, 다른 핵 의학계 촬영, 가시광선을 이용한 광학 촬영, 루시페라제를 이용한 광학 촬영, 형광단을 이용한 광학 촬영, 적외선 근접 광을 이용한 촬영 또는 적외선 광을 이용한 촬영이 포함된다.
본 발명의 특정 구체예에는 개체의 외과술 동안에 조직을 영상화하는 것이 포함된다. 개체는 포유류 바람직하게는 사람이 된다. 특정 구체예에서, 개체는 암 환자이다. 이들 구체예에서 핵산은 암 환자를 치료하기 위한 치료제를 인코딩하거나 하지 않을 수도 있다. 일부 구체예에서, 암 환자는 항암 요법을 받을 수 있다. 예시적인 항암요법에는 화학요법, 방사능 요법, 외과적 요법, 면역요법, 유전자 요법이 포함된다.
여기 명세서에서 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 한 개 또는 그이상을 의미한다. 청구항에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"과 같이 사용된 경우에,"a" 또는 "an"은 한 개 또는 그 이상을 의미할 수 있다. "또 다른(another)"이란 최소 2개 또는 그 이상을 의미한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 설명에서 파악할 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명의 적절한 구체예로 설명되는 특정 예는 설명을 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위 또는 범주내에 다양한 변화 및 수정은 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백한 것임을 인지해야 한다.
발명의
구체예를
통한 설명
핵산의 비-침습성 이미지 발현은 전신 유전자 운반, 질병 진단 및 상태 확인의 개발에 기여하며, 벡터의 생체 분포, 유전자 발현의 조직 관련 수준, 종양에서 발현에 관계하는 정보를 제공하여 암 요법에서 기여할 수 있으며, 치료요법적 활성과의 상관관계에 대해서도 기여할 수 있다. 이와 같은 데이터는 반응 예측물질로서 이들 변수들의 유효성을 확인하는데 도움이 될 것이며, 개선된 벡터 및 유전자 발현 구조체 개발을 이끌 정보를 제공하는데 도움이 될 것이다. 비-침습성 분자 촬영은 두 가지 성분 즉, 감응성/특이적 리포터 분자와 감응성있는 감지 장치를 요구한다. 이와 같은 기술로, 다기능 기능적-촬영 검사 수행을 위한 다중양식 촬영 장치와 새로운 촬영 벡터 및 프로브를 결합시키면 새로운 분자 촬영과정이 개발될 수 있다.
이와 같은 기술로 발현, 임시 및 공간적 분포뿐만 아니라 치료 효과에 대해 유전자 전달을 평가할 수 있도록 특수 고안된 신규한 분자 촬영 방법 개발이 가능할 것이다. 또한, 이중 분자 촬영 리포터 및 치료요법적 유전자 발현 벡터 시스템 개발도 이와 같은 기술로 이룰 수 있다. 특정 측면에서, 종양-특이적 프로모터-구동된 치료요법적 핵산을 IRES를 통하여 결합될 수 있다. 이들 리포터 구조체는 촬영 양식, 예를 들면, 감마 카메라 촬영을 포함하나 이에 국한되지 않는 촬영 양식에 복합되어 생체 분포, 발현 및 유전자 요법의 활성을 평가할 수 있다. 암과 관계하여, MRI 및 MR 분광학을 포함하나 이에 국한되지 않은 이미지 양식을 유전자 요법과 같은 항암요법 투여에 대해 종양 생장 및 반응을 비-침투적으로 모니터할 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 요법을 전신으로 투여한다. 이와 같은 방법에는 촬영 프로브를 이용하여 프로모터-구동된 리포터 발현 ( 및 치요유전자의 동시 발현)을 확인하고, 핵산 발현을 모니터하기 위한 다른 촬영 양식을 이용하는 것이 포함된다. MRI와 같은 해부학적 촬영을 이용하면 종양 퇴행과 치료요법적 유전자 발현의 상관 관계를 알 수 있다. 조직 특이적 프로모터 또는 증폭된 텔로메라제 특이적 프로모터 및 리포트를 유전적, 염증, 감염성 또는 신형성인 질병을 진단하고 상태를 확인하는 물질로 사용할 수 있다. hTERT 프로모터 (증폭된hTERT 프로모터) 및 리포터 (SSTR2 또는 이의 유도체)는 특히 암을 진단하고 상태를 확인하는데 이용될 수 있다.
I. 유전자 발현의 촬영
지난 수십년동안 발달된 촬영 또는 분자 촬영의 신규한 형태는 in situ 또는 in vivo상태에서 리포터 유전자의 이미지화와 관계있다. 리포터 유전자 기술이 조직 단편의 in situ 촬영에 처음으로 이용되었다(Blasberg et al, 2003). 예를 들면, Hooper et al. (1990)에서는 단일 포유류 세포에서 루시페라제 유전자 발현의 이미지화에 대해 설명하고 있다. 본 발명의 특정 구체예는 비-침습성 촬영 기술을 이용하여 개체에서 세포를 이미지화하는 방법을 포함한다. 당분야에 공지된 임의 촬영 양식을 본 발명의 리포터 서열 발현을 감지하는 방법으로 고려할 수 있다.
리포터 촬영은 자기 공명, 핵 촬영 (PET, 감마 카메라) 그리고/또는 in vivo 광학 촬영 시스템(Blasberg et al, 2003)을 근거하여 설명되어왔었다. 예를 들면, 허피스 심플렉스 바이러스-1 티미딘 키나제 또는 도파민 수용체 타입-2는 양전자 방출 단층촬영(PET)(Alauddin et al, 1996; Alauddin and Conti, 1998; Gambhir et al, 1998; MacLaren et al, 1999; Tjuvajev et al, 1998)을 이용하여 감지한다. 비교 목적으로, 쇼듐-요오드 동반수송체(sodium-iodide symporter) (Mandell, 1999), 도파민 트랜스포터(Auricchio et al, 2003), 또는 소마토스태틴 수용체 타입-2 (Kundra, 2002; Sun et al, 2001)를 감마 카메라 촬영으로 감지하였다.
특정 구체예에서, 촬영은 세포막에 결합된 세포 표면 또는 세포의 세포질에서 재조합 GPCR와 같은 리포터 존재를 확인하는 것과 관계된다. 시그날은 한 개 촬영 양식 또는 그 이상을 이용하여 감지할 수 있다(하기에서 상세히 논의함). 예를 들면, 촬영 과정은 방사능사진, 초음파, CT, MRI, MR 분광학, 또는 PET가 될 수 있으나 이에 국한하지는 않는다. 그러나, 특정 측면에서, 촬영은 개체에서 외과술동안에 실시할 수도 있다. 특정 구체예에서, 예를 들면, 리포터를 이용하여 외과의사가 절단해야 하는 특정 조직 타입을 선택적으로 라벨링시킬 수도 있다. 일부 구체예에서, 잘려나가는 조직은 종양 조직이며, 수술중에 행하는 촬영은 종양 조직의 촬영이 될 수 있다. 수술중에 행해지는 촬영은 치료 유전자 투여와 동시에 실시할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
특정 구체예에서, 촬영은 개체에 치료유전자를 통시에 투여하면서 실시할 수 있다. 예를 들면, 프로모터를 리포터 아미노산 서열 및 치료요법적 유전자에 작용가능하도록 결합시킬 수 있다. 치료요법적 유전자는 당분야에 공지된 임의 타입의 치료요법적 유전자가 될 수 있다. 예를 들면, 치료요법적 유전자는 종양 억제물질 유전자, 아포프토시스를 유도하는 유전자, 효소를 인코드하는 유전자, 구조 단백질을 인코드하는 유전자, 수용체를 인코드하는 유전자, 파라크린 인자를 인코드하는 유전자, 항체를 인코드하는 유전자, 또는 호르몬을 인코드하는 유전자가 될 수 있다. 당분야에 공지된 임의 치료요법적 유전자를 본 발명의 방법에 고려할 수 있다.
치료요법적 유전자에 작용가능하도록 결합된 리포터 아미노산 서열의 동시 투여는 개체에서 유전자의 생체 분포를 측정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 여기에서 제시하는 세포 촬영 방법을 조직 또는 종야에 있는 치료요법적 유전자의 생체 분포를 측정하는데 적용시킬 수 있다.
당분야에 공지된 임의 방법으로 리포터 아미노산 서열을 촬영화시킬 수 있다. 예를 들면, 리포터는 개체에 라벨된 리간드를 투여하면 촬영화시킬 수 있는데, 이때 라벨된 리간드는 리포터 아미노산 서열에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 리간드는 방사능동위원소 라벨된 프로브 예를 들면, 111In-옥트레오타이드이다. 추가 구체예에서, 리간드는 리포터 아미노산 서열과 직간접적으로 연합된 형광 프로브 또는 리포터 아미노산 서열에 대한 항체가 된다. 리포터 또는 연합된 리간드에서 유도된 시그날을 측정하기 위한 당분야에 공지된 임의 방법도 본 발명의 방법에 포함된다. 감지를 위한 예시적인 방법은 다음과 같다.
A. 감마 카메라 촬영
당분야에는 촬영을 위한 다양한 핵 의학 기술이 공지되어 있다. 리포터로부터 시그날을 측정하기 위한 본 발명의 촬영 방법에 이들 기술중 임의의 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, 감마 카메라 촬영은 리포터로부터 유도된 시그날을 측정하는데 이용할 수 있는 촬영 방법으로 고려될 수 있다. 당분야에 평균적 기술을 가진자는 감마 카메라 촬영 응용 기술에 대해 숙지할 것이다. 한 구체예에서, 시그날을 측정하는 것은 111In 또는 99mTc 콘쥬게이트, 특히 111In-옥트레오타이드 또는 99mTc-소마토스태틴 유사체를 이용하는 것과 관계있다.
B. 컴퓨터 단층촬영(CT)
컴퓨터 단층촬영(CT)도 본 발명에서 촬영 양식으로 간주된다. 다양한 각도에서 수천이상의 일련의 X-레이를 쏘고, 이를 컴퓨터에서 복합하면 CT는 신체의 임의 부분에 3차원 이미지를 만들게 할 수 있다. 컴퓨터가 임의 각으로부터 임의 깊이에서 2차원 단편을 도시하도록 프로그램한다. 단편(슬라이스)를 복합하여 3차원 영상을 만든다.
CT에서, 조영제를 정맥 주사하면 초기 CT 스캔이 진단성이 없을 때 연조직 덩어리의 확인 및 윤곽을 나타내는데 도움이 될 수도 있다. 유사하게, 조영제는 연조직 또는 골 병소의 맥관성을 평가하는데 도움이 된다. 예를 들면, 조영제를 이용하면 종양과 인접 맥관 구조의 상관 관계를 설명하는데 도움이 될 수 있다.
CT 조영제에는 요오드화 조영 매체가 포함된다. 이들 물질을 예로 들면, 이소탈라메이트, 이오헥솔, 디아트리조에이트, 이파미돌, 에티오돌, 이소파노에이트 등이 포함된다. 가도리니움 물질이 CT 조영제로 사용될 수 있다고 보고된 바 있다(Henson et al, 2004). 예를 들면, 가도펜테이트 물질이 CT 조영제로 사용되었다(Strunk and Schild, 2004).
C. 자기 공명 영상(MRI)
자기 공명 영상(MRI)은 이미지를 만들기 위해 고강도 자성 및 무선 주파수 시그날을 이용하는 촬영 양식이다. 생물학적 조직에서 가장 풍부하게 있는 종이 물이다. 촬영 실험에서 궁극적으로 신호를 발생시키는 물의 프로톤 핵의 양자 “스핀”이며, 다른 핵도 영상화될 수 있다. MRI에서 영상화될 샘플을 강력한 자장(1-12 Tesla)위에 두고, 샘플에서 네트 자성화를 만들 수 있도록 무선 주파수 방사능 펄스로 스핀을 여기(excited)시킨다. 다양한 자장 차 및 다른 RF 펄스가 스핀에 작용하여 공간적 정보가 기록되는 시그날로 코드된다. 이들 시그날을 수집하고 분석하여 2차원 슬라이스로 통상적으로 나타나는 이미지를 CT 영상과 같이 3차원 영상을 계산하는 것이 가능하다. 슬라이스들이 복합되어 3차원으로 만들어진다.
MR 또는 MR 분광학 촬영에 이용되는 조영제는 다른 영상 기술에서 사용되는 것과 상이하다. 이들 목적은 유사한 시그날 특징을 가지는 조직 성분들을 구별하는 것을 돕고, 이완 시간(Tl-weighted spin-echo MR 영상에서 더 강력한 신호를 만듬)을 단축시키는 것을 돕는다. MRI 조영제로는 가도리니움 킬레이트, 망간 킬레이트, 크로니움 킬레이트 및 철 입자등이 포함된다.
CT와 MRI는 조직 경계 및 맥관 구조를 구별하는데 도움이 되는 해부학적 정보를 제공한다. CT와 비교하였을 때, MRI의 단점은 환자가 수용할 수 있는 내성이 낮고, 심장박동 조절기, 특정 다른 이식된 금속 장치, 다양한 원인에 의한 인공물에서 금기 및 최소한의 움직임도 안된다는 것이다(Alberico et al, 2004). 한편 CT는 빠르고, 잘 견딜 수 있으며 바로 이용할 수 있으나, MRI에 비해 해상도가 낮고 요오드화 조영제 및 이온화가능한 방사능을 요구한다는 것이다(Alberico et al, 2004).
D. PET 및 SPECT
세포의 생존능과 같은 세포 수준에서 정보와 연관된 정보를 제공하는 촬영 양식에는 양전자방출단층촬영(PET) 및 단일 광량자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)이 포함된다. PET에서, 환자는 양전자를 방출하는 방사능 물질을 삼키거나 환자에 투여하고, 신체를 통하여 물질의 이동으로 모니터한다.
PET와 상당히 유사한 것이 단일 광량자 방출 컴퓨터 단층촬영 또는 SPECT이다. 이들 둘의 큰 차이는 양전자 방출 물질대신데, SPECT는 높은 에너지 광자를 방출하는 방사능활성 추적물질을 이용하는 것이다. SPECT는 관상 동맥 질환을 포함하는 많은 질환을 진단하는데 유용하며, 이미 매년 미국에서 2.5만번의 SPECT 심장 연구가 실행된다.
촬영을 위한 PET 방사능약물은 통상 11C, 13N, 15O, 18F, 82Rb, 62Cu, 68Ga와 같은 양전자 방출물질로 라벨링한다. SPECT 방사능약물은 99 mTc, 201Tl, 67Ga, 111In와 같은 양전자 방출물질로 라벨링한다. 뇌 촬영에 대해서, PET 및 SPECT 방사능약물은 혈액-뇌-장벽 침습성, 뇌 관류(cerebral perfusion) 및 대사, 수용체-결합 및 항체-항원 결합에 따라 분류한다. (Saha et al, 1994). 혈액-뇌-장벽(BBB) SPECT 물질 예를 들면, 99 mTcO4-DTPA, 201Tl, 및 [67Ga]구연산은 정상 뇌세포로는 들어갈 수 없지만, 변형된 BBB 때문에 종양세포로는 진입할 수 있다. SPECT 관류 물질 예를 들면, [123I]IMP, [99 mTc]HMPAO, [99 mTc]ECD는 친지성이며, 따라서 정상 뇌로 확산된다. 중요한 수용체-결합 SPECT 방사능 물질에는 [123I]QNE, [123I]IBZM, 및 [123I]이마제닐이 포함된다. 이들 잔류물질이 특이적 수용체들에 결합되고, 수용체 연관 질환 평가에 중요하다.
E. 광학 촬영
광학 촬영은 특정 의학 분야에 널리 사용되는 또 다른 촬영 양식이다. 예를 들면, 세포 성분의 광학적 라벨링 및 형광 혈관조영술 및 인도시아닌 그린 혈관조영술과 같은 혈관조영술이 포함된다. 광학적 촬영 물질의 예를 들면 플로로신 및 플로레신 유도체, 인도시아닌 그린, 오레곤 그린, 오레곤 그린 유도체의 유도체, 로다민 그린, 로다민 그린 유도체, 에오신 및 에리틸로신, 텍사스 레드, 텍사스 레드의 유도체, 말라치트 그린, 나노골드 설로숙시니미딜 에스테르, 카스케이드 블루, 코우마린 유도체, 피리딜옥사졸 유도체, 카스케이드 엘로우 염료, 다폭실 염료등이 포함된다.
F. 초음파
광범위하게 사용되는 또 다른 생의학 촬영 양식이 초음파이다. 초음파 촬영은 비침투적으로 신체의 연조직 구조의 실시간 단면 및 3차원 영상 그리고 혈류 정보를 제공하는데 이용된다. 고주파수 사운드 및 컴퓨터가 혈관, 조직 및 기관의 영상을 만들어낸다.
혈류의 초음파 촬영은 혈관의 크기 및 깊이 등의 인자에 의해 제한받을 수 있다. 상대적으로 최근에 개발된 초음파 조영제에는 퍼를로린 및 퍼플로린 유사체가 포함되는데, 이들은 흐린 영성 및 Doppler 시그날을 강화시켜 이들 한계를 극복하도록 고안된 것이다.
G. 이중 촬영
예를 들면, 상기에서 제시한 바와 같이 촬영 양식에는 CT, MRI, PET, SPECT, 초음파, 또는 광학 촬영이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 당분야에 공지된 촬영 양식의 다른 예들도 본 발명에 고려될 수 있다.
두가지 이미지 모이어티로 구성된 화합물의 진단학적 효과량 조성물을 투여한 후 또는 투여하는 동안 임의 시간에 촬영 양식을 실행한다. 예를 들면, 촬영 연구는 본 발명의 이중 촬영 화합물 투여 동안 또는 투여 후 임의 시간에 실행할 수 있다. 일부 구체예에서, 제 1 촬영 양식은 이중 촬영 물질 투여와 동시에 또는 투여후 약 1초, 1시간, 1일 또는 투여후 임의 긴 시간 후 또는 상기 명시된 시간 중 임의 시간에 실행할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 제2 촬영 양식은 제 1 촬영 양식과 동시에 또는 제1 촬영 양식 후 임의 시간에 실행할 수 있다. 예를 들면, 제2 촬영 양식은 제1촬영 양식 완료후 약 1초, 1시간, 1일 또는 투여후 임의 긴 시간 후 또는 상기 명시된 시간 중 임의 시간에 실행할 수 있다. 당업자는 본 발명에서 언급하는 다양한 촬영 양식을 잘 실행할 수 있을 것이다.
II. 리포터 서열
다음의 in vivo 유전자 발현을 위한 비-침습성 방법에서 기초 과학 및 환자를 돌보는 것 모두 유익한 장점을 얻을 수 있을 것이다. 이와 같은 도구는 관심 유전자의 평가 및 요법의 계획 및 모니터링, 벡터 개발 및 표적화에 필요하다. 예를 들면, 리포터로써 소마토스태틴 수용체 타입 2를 이용한 in vivo 촬영에서 와일드타입의 바이러스와 비교하였을 때 HI루프가 변형된 아데노바이러스를 이용한 난소세포의 강화된 감염성을 설명할 수 있다. 암배아항원(carcinoembryonic antigen)(CEA) 프로모터 및 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK)를 리포터로 이용하여 종양-특이적 표적화를 영상화하였다. 또 다른 응용분야는 . 테트라사이클린-프로모터 시스템을 이용한 두 개 별도 유전자의 유도를 in vivo로 가시화할 수 있다. 따라서, 유전자 전달의 in vivo 모니터링은 리포터 유전자를 단독으로 이용하거나 또는 소요의 유전자와 함께 이용하여 접근할 수 있을 것이다. 후자의 경우, 치료요법적 유전자를 리포터에 융합시키거나 별개 단백질로 만들 수 있다. 예를 들면, 관심 유전자와 리포터를 결배 운반 비이클에서 공동-트랜스펙션 또시키거나 또는 동일한 운반 비이클에서 별개 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 또한, 두 가지 유전자들을 동일한 프로모터에 내부 리보좀 유입 부위를 통하여 또는 양방향 프로모터를 이용하여 연결할 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하여, 관심 유전자의 발현과 리포터의 발현을 연결시킨다. 따라서, 발현 위치, 양 및 기간을 측정할 수 있다.
세포들은 리포터 유전자에 의해 트랜스펙트되기 때문에 리포터 세포 통행(trafficking)을 따라가는데 이용될 수 있다. 예를 들면, in vitro에서 특이적 세포를 리포터로 트랜스펙션시키고, 동물에 되돌려 보내 자기자리를 찾는 것(homing)에 평가한다. 다발성 격색의 실험성 자가면역 뇌척수염에서, Costa et al. (2001)는 IL-12 p40 및 루시페라제를 발현시키도록 형질유도(transduce)된 미엘린 염기성단백질-특이적 CD4+ T 세포를 이동시켰다. in vivo에서, 루시페라제를 이용하여 중추 신경 시스쳄으로의 통행을 설명하였다. 또한, IL-12 p40은 염증을 저해하였다. 또다른 시스템에서, 양전자방출단층촬염(PET), Koehne et al. (2003)에서 in vivo 에서 허피스 심플렉스 바이러스- 1 티미딘 키나제 (HSV-TK)를 발현시키는 Epstein-Barr 바이러스 (EBV)- 특이적 T 세포가 T-세포 제한 HLA 대립형질을 발현시키는 EBV+ 종양으로 특이적으로 이동한다는 것이 설명되었다. 또한, 이들 T 세포들은 표적화된 종양을 제거하는 능력을 보유한다. 연속적 촬영으로 Dubey et al. (2003)는 뮤린 살코마 바이러스/Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MSV/M- MuLV)에 의해 유도된 종양으로 HSV-TK를 발현시키는 T세포의 항원 특이적 국소화(localization)을 설명하였다. 조직 특이적 프로모터를 이용하면 분화 예를 들면 스템(줄기) 세포의 분화 또는 간 세포와의 융합을 평가하거나 또는 타입 II 폐세포에서 계면활성제 프로모터의 활성화와 같은 분화된 세포의 특징을 얻는데 이용할 수 있다. 이들 실시예에서 설명하는 것과 같이, 리포터를 이용한 촬영의 용도는 놀라운 것으로, 사람에서도 용도를 찾을 수 있다. FDA 승인된 물질을 이용하여 영상화될 수 있는 사람 SSTR2와 같은 리포터가 유익하다. 이와 같은 리간드들은 전망있는 리포터이지만, 허피스 심플렉스 바이러스-티미딘 키나제 (HSV-TK) 또는 도파민-2 수용체 (D2R)에는 이용할 수 없다. HSV-TK의 또 다른 제약은 바이러스성 단백질에 면역 반응이 있을 수 있는 것으로 이는 영상화에 이용되는 경우에 바람직하지 않다. HSV-TK 및 D2R을 영상화할 방사능약물은 거의 전적으로 PET 물질이다. PET 계 시스템의 경우에 경제적 생산 및 분포 시스템이 개발되거나 각 설비에는 사이클로트론(cyclotron)이 요규되며, 이를 시약을 만드는 전문적 기술을 개발해야 한다. SSTR2의 영상화 물질인 이용할 수 있다. 이들 물질에는 감마 카메라 및 PET 물질들이 포함된다. 임상적으로, PET는 감마-카메라를 이용한 촬영보다 훨씬 고가이며, 감마-카메라는 최근에 생산된 PET 카메라보다는 훨씬 많이 이용된다.
촬영 리포터를 관심 유전자 유무하에 벡터내고 고정시킬 필요가 있다. 예를 들면, 아데노-연합 바이러스 운반 시스템은 약 3 kb의 삽입체를 지원한다. 1110 염기쌍의 작은 크기의 SSTR2A 유전자로 제한된 삽입 공간을 가진 벡터내로 끼워넣는 것이 가능하다. SSTR2계 리포터의 또 다른 장점은 세포막을 가로지르는 이들의 위치이다. 세포막을 통과하기 위한 방사능약물이 필요한 세포내 리포터와 달리, SSTR2용 시약은 세포로 침투할 필요가 없다. 이는 SSTR2를 표적으로 하는 영상 물질 개발에 잇점이다. 세포막을 가로질러 있는 위치의 추가 잇점은 살아 있는 세포 소팅을 위한 항체와 같은 물질에 근접성이다. 세포 통행 연구에 리포터가 이용되는 경우에 트랜스펙트된/감염된 세포의 신속한 소팅이 매우 중요하다. 다른 막통과 리포트는 여기에서 설명되는 나트륨/요오드동반수송체와 같은 펌프에 기초한다. 비록 전망은 있지만 이들의 작용이 세포의 생체항상성(homeostasis)을 변경시킬 수 있기 때문에 이상적이지만은 않을 것이다.
SSTR2는 생장 저해물질이기 때문에 암 유전자 요법에 양호한 시그날생성 프로파일을 가진다. 이의 리간드인 소마토스태틴은 뇌, 뇌하수체, 췌장, 위장관, 부신, 갑상선, 신장 및 면역계에서 다양한 생리학적 기능을 조절하는데 역할을 한다. 엔도크린 및 엑소크린 분리를 저해하고 내장 운동성 뿐만 아니라 신경 전달을 조절하며, 영상소 및 이온의 흡수, 맥관 수축성도 조절한다. 중요한 것은 정상 세포 및 종양 세포에서 증식을 저해하는데 주로 작용한다. 소마토스태틴의 작용은 혈장 막 수용체들에 의해 조절된다. 수용체 타입과 세포 환경이 소마토스태틴의 생물학적 효과를 결정한다. 소마토스태틴 수용체의 과다발현은 in vivo상태에서 이미지화시킬 수 있으며, 외생 도입된 유전자 발현을 위해 소마토스태틴 수용체계 리포터가 제안되었었다. 암에서 소마토스태틴 수용체를 리포터로 이용하면, 이것이 약한 생장 저해물질이며 분비를 저해하기 때문에 유익하다. 후자는 카르시노이드(암양종)과 같은 신경성 엔도크린 종양 환자의 증후 경감에 중요하다. 그러나, 외생 소마토스태틴 수용체 발현의 비-표적 발현이 상기에서 설명하는 다른 생리학적 시스템에 영향을 미칠 수도 있다. 또한 연결된 관심 유전자의 시그날 생성 경로에 영향을 끼질 수도 있다. 또한, 세포 생장 저해가 세포 임플란트 및 생장이 필요한 세포계 치료에서 바람직하지 않을 수도 있다. 세포 생장 및 분비의 저해가 인슐린을 방출하는 세포가 목적이 되는 당뇨병과 같은 일부 유전자 요법에서는 바람직하지 않을 수 있다.
시그날생성에는 결점이 있지만 여전히 in vivo에서 영상화될 수 있는 델타 314와 같은 소마토스태틴 수용체계 리포터가 필요하다.
여기에서 사용된 바와 같이, "리포터" "리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 임의 유전자 서열 또는 감지가능한 인코드된 폴리펩티드 서열로써, 세포에 존재하는 다른 유전자 서열 또는 인코드된 폴리펩티드와 구별가능한 것을 말한다. 바람직하게는 단백질을 인코드하는 리포트 서열은 감지가능한 모이어티와 연합되어 존재 자체로 바로 감지되거나 또는 감지가능한 시그날을 발생시키는 이의 활성에 의해 감지되는 단백질을 인코드한다. 특정 측면에서, 감지가능한 모이어티는 방사성핵종, 형광단, 발광단, 미소입자, 미소구, 효소, 효소 기질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 나노입자 및 나노소체등이 포함될 수 있고, 이들은 모두 리포터를 인지하거나 리포터와 상호작용하는 항체 또는 리간드에 결합될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 리포터 핵산 서열로 구성되거나 감지가능한 폴리펩티드를 만들 수 있는 산물을 인코드할 수 있다. 리포터는 감지가능한 시그날을 직간접적으로 만들 수 있는 분자이거나 이를 인코드한다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 리포터 유전자에는 세포가 만들지 않은 감지가능한 폴리펩티드를 인코드하거나 핵산 서열을 포함한다. 많은 리포터 유전자들이 설명되어 있는데, 일부는 유전자 조절 연구를 위해 시판되기도 한다(Alam and Cook, 1990, 전문을 참고문헌으로 첨부한다). 감지되는 시그날에는 색, 형광, 발광, 동위원소 또는 방사능동위원소 시그날, 세포 표면 테그, 새포 생존능, 세포 영양 요구성, 세포 생장 및 약물 저항성이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 리포터 서열에는 β-락타메이즈, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리 포스포타제, 티미딘 키나제, 그린 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제 (CAT), 루시페라제, 막 결합 단백질 예를 들면, G-단백질 결합된 수용체 (GPCRs), 소마토스태틴 수용체, CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 헤마토글루티닌 단백질, 수송체(예를 들면, NIS) 및 고친화성 항체 또는 리간드를 가지는 당분야에 공지된 기타 물질 또는 통상적인 수단에 의해 생산되는 물질을 인코드하는 DNA 서열과 헤마글루티닌 또는 Myc에서 얻은 항원 테그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질로 구성된 융합 단백질이 포함된다.
본 발명의 한 측면에는 수용체 돌연변이체를 만들고 이를 비교하여 시그날 생성 결손 리포터가 포함된다. 그러나, 수용체 돌연변이만을 발현시키는 것은 이들을 비교하는 목적에는 적합하지 않은데 그이유는 옥트레오타이드와 같은 리간드에 대해 각각 상이한 친화성을 가지고 있어, 발현 수준과 친화성에 혼란을 야기할 수 있다. 따라서, 리포터 결합 또는 면역성과는 별개 독립적으로 발현을 표준화시킬 필요가 있다. in vivo 유전자 전달의 영상화를 위한 소수의 방사능약물에 기초한 시스템이 만들어졌지만, 이들 시스템의 대부분이 시각화된 발현 산물과 독립적으로 발현을 직접 비교하도록 고안된 것이 아니다.
단백질 발현을 비교하고 세포내 국소화를 결정하기 위해서 리간드 결합과는 독립적 방법이 요구된다. 모든 돌연변이체에 공통이 되는 아미노-말단 태그를 이용하면 수용체간에 이와 같은 비교가 가능하다. 일단, 확실한 변형이 확인되면 에피토프 테그를 필요에 따라 제거할 수 있다. 발명자들은 아미노-말단 테그된 사람 SSTR2A이라고 표현하였다. 헤마글루티닌-A(HA) 아미노-말단 테그에 대한 항체를 이용하여 in vitro에서 감지된 융합 단백질은 111In 라벨된 옥트레오타이드를 이용한 수용체 결합 연구 및 생체 분포와 관계있다. 즉, in vitro에서 융합 단백질의 발현 수준은 방사능 약물의 취입과 관련된다. 테그의 추가 장점은 발현을 위한 다중 클론의 신속한 스크리닝 또는 세포 소팅을 위해 ELISA 포맷에서 이용할 수 있다. 또한, 테그는 항체를 이용한 발현의 in vitro 및 ex vivo 분석을 가능하게 하는데, 이는 촬영 방사능약물을 이용하는 것보다 약 100배 저렴하다. 실험 종양 또는 생검의 면역 조직화학과 같은 ex-vivo 연구에 이용되고, 내생 및 외생 사람 SSTR2를 구별할 수 있게 한다. 공통의 에피토프 테그는 돌연변이 수용체에서 교란될 수도 있는 수용체 도메인에 대한 항체 또는 리간드 결합에 단순히 의존하지 않고 돌연변이체중에서 발현 수준을 비교할 수 있게 하기 때문에, 돌연변이체를 만들고 비교하여 리포터를 최적화시킬 수 있다. in vitro, in vivo 및 ex vivo에서 발견들을 분석하고 관련시키는 능력은 hTERT 프로모터 구조체와 증폭된 hTERT 프로모터 구조체를 평가하는데 유익하다. 발명자들은 HA-S STR2 유전자 키메라의 발현이 in vivo 영상화를 이용하면 정량화될 수 있으며, 이는 ex-vivo 발현에 상응한다. 기능적 그리고 분석학적 기술은 임상 기구의 작은 동물용 버전을 이용하여 환자에 정량 방법을 용이하게 전달할 수 있다.
특정 구체예에서, 리포터 아미노산 서열은 GPCR이다. 명세서에서 GPCR에 대해서는 상세하게 설명하고 있다. 추가 구체예에서, 리포터 핵산 또는 폴리펩티드의 발현은 생장 잇점을 부여하고, 생장 잇점 정도는 숙주 세포의 생장 조건을 다양하게 변화시켜 조절할 수 있다. 다른 구체예에서, 리포터 서열은 형광 단백질을 인코드한다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 형광 단백질의 예로는 그린 형광 단백질 (GFP), 강화된 그린 형광 단백질 (EGFP), Renilla Reniformis 그린 형광 단백질, GFPmut2, GFPuv4, 강화된 엘로우 형광 단백질 (EYFP), 강화된 시안 형광 단백질 (ECFP), 강화된 블루 형광 단백질 (EBFP), 시트린 및 디스코소마(dsRED)의 레드 형광 단백질이 포함된다.
추가 구체예에서, 리포터 핵산은 테그를 가지는 폴리펩티드를 인코드할 수 있다. 이와 같은 구체예와 연합되어, 방법에는 숙주 세포를 테그용 형광 라벨된 항체와 접촉시키는 추가 단계가 포함될 수 있어, 숙주 세포를 라벨링시키고, 이는 FACS 또는 다른 감지, 소팅 또는 분리 방법으로 감지되거나 분리될 수 있다.
다양한 구체예에서, 최소 한가지 리포터 서열의 발현에 원하는 수준은 리포터 서열의 기준 전사 수준과 비교하였을 때 리포터 서열의 수준이 증가, 감소 또는 변화가 없다. 특정 구체예에서, 최소 한가지 리포터 서열의 발현에 원하는 수준은 리포터 서열의 기준 전사 수준과 비교하였을 때 리포터 서열의 수준이 증가되었다.
다양한 구체예에서, 리포터 서열은 독립적으로 동시에 분석할 수 있는 독특한 감지가능한 단백질을 인코드한다. 특정 구체예에서, 리포터 서열중 최소 하나는 형광 단백질을 인코드한다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포가 될 수 있다. 예시적인 진핵 세포에는 이스트 및 포유류 세포가 포함된다. 포유류 세포에는 사람 세포 및 암세포와 같은 병리학적 표현형을 나타내는 다양한 세포들이 포함된다.
A. 재조합 G-단백질 결합된 수용체(GPCRs)
리포터의 한 종류에는 7개 막통과 G-단백질 연합된 수용체의 막 단백질 슈퍼패밀리와 이의 서브패밀 리가 포함된다. GPCRs는 시그날 형질도입에 관련된 단백질류로써, 공지된 최대 수용체 슈퍼패밀리중에 하나이다. 이들 수용체들은 생물학적으로 중요하고, 이들 수용체의 기능부전으로 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 당뇨병, 소인증, 색맹, 망막색소상피변형증, 천식과 같은 질병이 발병되는 것으로 보인다. GPCRs는 우울, 정신분열증, 불면, 고혈압, 불안, 스트레스, 신부전 및 몇가지 심혈관, 대사, 신경, 암 및 면역 질환에도 관련된다(Horn and Vriend, 1998). 이들은 또한 HIV 감염에도 역할을 하는 것으로 보인다(Feng et al, 1996).
GPCRs는 루프에 의해 연결된 가상 막통과 도메인을 가지는 것으로 특징화되어 있다. N-말단은 항상 세포외이며, C-말단은 세포내이다. 내상 리간드 또는 화학 모이어티와 같은 시그날을 세포외 N-말단 측에서 받는다. 그 다음 이와 같은 시그날은 막을 통하여 세포질측으로 형질도입되고, 세포질에서 이형삼중 단백질 G-단백질이 활성화되고, 다시 반응을 유도한다(Horn and Vriend, 1998). GPCRs에는 다양한 범주의 생물학적 활성 수용체, 예를 들면 호르몬 수용체 및 뉴우런성 수용체를 포함한다. 예를 들면, 아드레날린 물질 및 도파민 수용체, 소마토스태틴 수용체등이 포함된다.
결합된 수용체의 G-단백질 패밀리에는 도파민 수용체들이 포함되는데 이들은 정신이상 및 신경 질환 치료에 이용되는 신경이완 약물에 결합한다. 수용체 패밀리의 구성원의 다른 예로는 칼시토닌, 엔도테린, cAMP, 아데노신, 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 트롬빈, 키닌, 난포자극 호르몬, 옵신스, 내피세포 분화 전자-1 수용체, 로돕신, 취기제(odorant)에 대한 수용체 및 사이토메갈로바이러스 수용체 등이 포함된다.
본 발명의 다른 측면에는 관심 대상의 세포로 재조합 GPCRs를 도입시키는 비-침습성 촬영 또는 요법이 포함된다. 본 발명의 특정 구체예에서는 조직-선별적 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합된 재조합 GPCR 아미노산 서열을 인코드하는 핵산에 관계한다. 예시적인 GPCRs에는 아세틸콜린 수용체: Ml, M2, M3, M4, 또는 M5; 아데노신 수용체: Al; A2A; A2B; 또는 A3; 아드레노셉터: 알파lA, 알파lB, 알파lD, 알파2A, 알파2B, 알파2C 베타l, 베타2, 또는 베타3; 앙지오텐신 수용체: ATI, 또는 AT2; 봄베신 수용체: BBl, BB2, 또는 BB3; 브레디키닌 수용체: Bl, B2, 칼시토닌, 아이닐린, CGRP, 또는 아드레노메듈린 수용체; 카나비노이드 수용체: CBl, 또는 CB2; 케모킨 수용체: CCRl, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRlO, CXCRl, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1, 또는 XCRl; 화학주성(chemotactic) 수용체 : C3a, C5a, 또는 fMLP; 콜사이토키닌 및 가스트린 수용체: CCKl, 또는 CCK2; 코르티코트로핀-방출 인자 수용체: CRFl, 또는 CRF2; 도파민 수용체: Dl, D2, D3, D4, 또는 D5; 엔도테린 수용체: ET(A) 또는 ET(B); 갈라닌 수용체: GALl, GAL2, 또는 GAL3; 글루타메이트 수용체: mgll, mgl2, mgl3, mgl4, mgl5, mgl6 mgl7, 또는 mgl8; 당단백질 호르몬 수용체: FSH, LSH, 또는 TSH; 히스타민 수용체:Hl, H2, H3, 또는 H4; 5-HT 수용체: 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1B, 5-HT1F, 5HT2A, 5-HT2F, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5A, 5-HT5B, 5-HT6, 또는 5-HT7; 루코트리엔 수용체: BLT, CysLTl, 또는 CysLT2; 리소포스포지질 수용체: edgl, edg2, edg3, 또는 edg4; 멜라노코릴 수용체: MCl; MC2; MC3; MC4, 또는 MC5; 멜라토닌 수용체: MTl, MT2, 또는 MT3; 신경펩티드 Y 수용체: Yl, Y2, Y4, Y5, 또는 Y6; 뉴우로텐신 수용체: NTSl, 또는 NTS2; 오피오이드: DOP, KOP, MOP, 또는 NOP; P2Y 수용체: P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, 또는 P2Y12); 퍼옥시좀 증식물질: PPAR-알파, PPAR-베타, 또는 PPAR-감마; 프로스테노이드 수용체: DP, FP, IP, TP, EPl, EP2, EP3, 또는 EP4; 프로테아제-활성화된 수용체: PARl, PAR2, PAR3, 또는 PAR4; 소마토스태틴 수용체: SSTRl, SSTR2, SSTR2A, SSTR3, SSTR4, 또는 SSTR5; 타치키닌 수용체: NKl, NK2, 또는 NK3; 티로트로핀-방출 호르몬 수용체: TRHl, 또는 TRH2; 유로텐신-II 수용체; 혈관활성화 내장 펩티드 또는 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성 펩티드 수용체: VPACl, VPAC2, 또는 PACl; 또는 바소프레신 또는 옥시토신 수용체: Via, VIb, V2, 또는 OT을 포함한다.
특정 구체예에서, GPCR은 소마토스태틴 수용체, 예를 들면, 소마토스태틴 타입 2 수용체이다. 소마토스태틴 수용체에 대한 정보는 미국 특허 출원 2002/0173626-A1에서 확인할 수 있으며, 전문을 참고로 첨부하였다,
GPCR 아미노산 서열을 인코드하는 핵산은 전체 GPCR 서열, 기능적 GPCR 단백질 도메인, 안정적으로 발현된 비-기능적 GPCR, GPCR 폴리펩티드, 또는 GPCR 폴리펩티드 등가체를 인코드할 수 있는데, 이들 각각에는 하나이상의 막통과, 세포외, 세포내, 세포외 루프 또는 세포내 루프를 포함한다. 핵산은 게놈 DNA에서 유도될 수 있는데 예를 들면, 특정 유기체의 게놈, mRNA에서 직접 클론되거나, PCR™.을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 방법을 이용하여 합성된 게놈에서 직접 클론될 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)가 될 수 있다. cDNA는 주형으로 메신져 RNA(mRNA)를 이용하여 만든 DNA이다. 따라서, cDNA에는 임의 중단된 코딩 서열을 포함하고 있지 않으며 통상적으로 상응하는 단백질의 코딩 부분만을 배타적으로 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산은 합성에 의해 만들어 질 수 있다.
게놈 DNA의 일부를 cDNA 또는 합성 서열들과 복합시켜 특이적 구조체를 만들 수도 있다. 예를 들면, 최종 구조체에서 인트론이 바람직한 경우에, 게놈 클론의 사용이 필요하다. 인트론은 GPCR에 추가로 다른 유전자에서도 유도될 수 있다. cDNA 또는 합성된 폴리뉴클레오티드는 구조체의 나머지 부분에 대해 좀더 편리한 제한 효소 부분을 제공할 수 있고, 따라서, 서열의 나머지 부분에 대해 이용될 수 있다.
본 발명에는 임의 리포터 또는 GPCR 폴리펩티드 등가체를 인코드하는 핵산이 포함된다. 리포터 또는 GPCR 폴리펩티드 등가체를 인코드하는 핵산은 다른 유기체에서 자연 발생되는 상동성 핵산 서열이 될 수도 있다. 당업자는 통상적으로 이용될 수 있는 실험 기술을 이용하여 리포터 또는 GPCR 폴리펩티드 등가체를 확인 또는 합성할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명에는 또한 이들 서열의 화학적으로 합성된 돌연변이체가 포함된다.
코돈 변화에 의해 다른 종류의 서열 변이체가 생성된다. 20개의 보통 아미노산 대부분에 대해 7개 코돈이 있기 때문에 상이한 많은 DNA가 GPCRs를 인코드할 수 있다. 코돈에는 다음이 포함된다: 알라닌(Ala): GCA, GCC, GCG, GCU; 시스테인(Cys): UGC 및 UGU; 아스파르트산 (Asp): GAC 및 GAU; 글루타민산(GIu): GAA 및 GAG; 페닐알라닌(Phe): UUC 및 UUU; 글리신(GIy): GGA, GGC, GGG, GGU; 히스티딘 (His): CAC 및 CAU; 이소루이신(lie): AUA, AUC, AUU; 리신 (Lys): AAA 및 AAG; 루이신(Leu): UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU; 메티오닌(Met): AUG; 아스파라진 (Asn): AAC 및 AAU; 프로린(Pro): CCA, CCC, CCG, CCU; 글루타민(GIn): CAA 및 CAG; 아르기닌(Arg): AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU; 세린(Ser): AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU; 트레오닌(Thr): ACA, ACC, ACG, ACU; 발린(VaI): GUA, GUC, GUG, GUU; 트립토판(Trp) UGG; 티로신(Tyr): UAC 및 UAU.
유전자 코드의 축중성이 허용되어, 여기에서 설명된 핵산과 동일한 뉴클레오티드의 약 50% 내지 약 75% 사이 또는 약 76% 내지 약 99%의 서열이 적절할 수 있다. 리포터 또는 GPCR 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 범위내에 있는 서열은 세포내 조건하에 상기에서 제시한 폴리뉴클레오티드 단편과 염기쌍을 이룰 수 있는 것들이다.
상기에서 명시된 바와 같이 리포터 또는 GPCR 인코딩 서열은 전장(full length) 게놈 또는 cDNA 복사체 또는 이의 단편이 될 수 있다. 본 발명에서는 리포터 또는 GPCR의 더 짧은 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 12개 염기의 서열은 사람 게놈에서는 1회만 발생되기 때문에 독특한 표적 서열 또는 PCR oligo를 특정하는데 충분하다. 올리고뉴클레오티드가 이의 상보적인 표적에 대해 결합 친화력 및 서열 특이성은 길이가 증가함에 따라 증가된다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 또는 더 긴 올리고뉴클레오티드를 GPCR 돌연변이체 준비 및 PCR 반응에 사용하는 것을 고려할 수 있다.
1. 소마토스태틴 수용체
소마토스태틴 수용체(SSTR)는 6개 타입, 타입 1, 2A 및 2B, 3, 4, 5가 있다. 타입 2A 및 2B는 타입 2A가 더 긴 세포질내 C-말단을 가지는 것을 제외하고는 동일한 얼터네이트(alternate) 접합 변이체이다. 사람 타입 2는 FDA 승인된 소마토스태틴 유사체, 111In 라벨된 옥트레오타이드에 대해 최고의 친화력을 가진다. 전신 영상에 승인된 이 방사능약물 및 폐 영상 촬영에 승인된 99 mTc 라벨된 유사체를 임상에서 이용하여 신경내분비 종양과 같은 소마토스태틴 수용체를 과다 발현시키는 종양을 감지한다. 임상용 영상에 이용되는 방사능라벨된 소마토스태틴의 정상 분포 및 방사선량 측정에 대해서는 연구가 잘 이루어져왔다. 정맥 주사후에 방사능약물은 주로 신장, 방광, 간, 비장 및 장관에서 발견된다. 영상에 추적량이 이용될 때 위약이상의 더 큰 부작용은 나타나지 않고, 환자들은 일정에 따라 촬영한다. 임상적으로, SSTR2 발현의 발현증가로 작은 종양들도 감지가능하게 한다. PET 계 물질 또한 개발되었다. 이 수용체의 경우, in vitro 연구에서 6번째와 7번째 도메인이 옥트레오타이드에 결합하는데 필수적이다. 3 내지 5의 막통과 도메인도 막통과도메인 3과 세포외 도메인 2사이에 시스테인-시스테인 이황화결합이 예상되기 때문에 중요할 수 있다. 막통과 도메인 3 내지 7은 옥트레오타이드 결합을 위한 주머니를 만드는데 협력하는 것으로 보인다. SSTR2는 cAMP 생산을 조절한다. Gambhir et al. (1999)은 cAMP 조절에 결함이 있는 D2 수용체 돌연변이체도 영상화할 수 있다는 것을 발견하였다. COS-7 세포에서, 사람 SSTR2의 활성화로 cAMP 생산이 감소되고, 포스포리파제 C 활성화 및 백일해 독소 감응성 G-단백질을 통하여 전체적 또는 부분적으로 칼슘의 이동화(calcium mobilization)가 된다. cAMP를 통하여, 소마토스태틴은 분비를 조절할 수 있다. 32D 조혈모 세포에서, cAMP는 SSTR2 중개된 주화성(chemotaxis)에 필요한 것으로 보인다. 소마토스태틴 수용체의 세포질 C-말단은 cAMP를 조절하는데 관계한다. 쥐 SSTR2의 349 아미노산 뒤 아미노산이 결실되면 사람 배아 신장(HEK293) 세포의 기저 cAMP 저해가 증가된다. 사람 SSTR5의 318 아미노산 뒤 아미노산이 결실되면 차이니즈 햄스터 난(CHO K1)세포에서 cAMP 저해가 없어진다.
SSTR2에 의한 증식 저해는 포스파테이즈(포스파테이즈s)를 포함하는 다중 하류 중개물질(multiple downstream mediators)이 관련된다. 티로신 포스파테이즈 SHP-I는 SSTR2에 의해 조절되나, SHP-I는 유방 암종 주(line) MCF-7을 조절하는 것으로 보이지는 않는다. SHP-I의 상류는 저해성 G 단백질, 티로신 포스파테이즈 SHP-2 및 티로신 키나제 Src인 것으로 보고되었다. SHP-2는 세 번째 세포내 도메인내 LCYLFI 환경에서 SSTR2 티로신 228와 상호작용하고, C-말단 옆의 막통과 도메인 7에 ILYAFL 환경에서 티로신 312과 상호작용한다. Src가 SSTR2와 어떻게 연합되는 지는 아직 분명하지 않다. 포스파테이즈는 소마토스태틴 수용체 자체의 포스포릴화반응, 자극성 생장 인자 또는 다른 하류 효과물질(effectors)의 포스포릴화반응에 직접적인 효과를 가질 수 있다. 포스파티딜 이노시톨, Ras, Rapl, B-raf, MEKl 및 2, Map 키나제/Erk 1 및 2는 CHO DG44 세포에서 SSTR2 중개된 시그날 생성에 연루되어있지만, 신경아세포종 세포들에서는 Ras가 관련된 것으로 보이지 않으며, CHO DG44 세포에서 증가된 것과는 반대로 Map 키나제/Erk 1 및 2 활성이 감소되었다. 따라서, SSTR2에 의한 증식 저해를 중재하는데 있어서 MAP 키나제 경로의 역할이 아직은 분명하지 않다. 또한, SHP-I의 하류는 뉴우런성 일산화질소 합성효소(nNOS) 및 구아닐레이트 사이클라제이며, 이들 둘다 CHO 세포 생쥐 췌장선세포에서 SSTR2 중개된 증식 저해에 필요한 것으로 보인다. 이와 같은 저해는 r-PTPη 와 같은 다른 포스포티로신 포스파타제 및 사이클린 의존성 키나제 저해제 p27kip1와 같은 더 많은 하류 효과물질이 관련될 수 있다. 소마토스태틴은 또한 전사 인자예를 들면 c-jun, c-fos, AP-1을 조절한다.
시그날 생성을 위해서, C-말단 및 SSTR2의 세포내세포질 도메인이 관련된 것으로 보인다. 상기에서 설명한 바와 같이, 쥐 SSTR2 및 사람 SSTR5의 경우, 결손 분석에서 세포질 C-말단은 cAMP 생산 저해를 조절한다는 것이 설명되었다. 특히, SSTR2의 아미노산 314뒤의 결손은 시그날 생성 결손이 되며, in vivo로 영상화할 수 있다.
B. 본 발명의 리포터 감지.
특정 구체예에서, 리포터는 리간드와 연합시켜 감지함으로써 영상화할 수 있을 것이다. 여기에서 리간드는 이온, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 아파타머(aptamer), 다른 화학물 또는 폴리펩티드에 결합하여 더 큰 복합체를 만드는 분자, 또는 분자군으로 정의한다. 본 발명의 내용에서, 리간드는 더 큰 복합체를 만들기 위해 리포터에 결합하거나 또는 리포터 서열에 부착된 아미노산 서열에 결합한다(리포터 아미노산 서열의 N-말단 단부 또는 C-말단 단부에 융합된 단백질 테그). 당분야에 공지된 임의 리간드도 본 발명의 내용에 따른 리간드로 사용을 고려할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 리간드를 영상화시키기 위해 세포와 접촉시킬 수 있다. 리간드는 세포에 의해 내화(internalized)되거나 내화되지 않을 수 있다. 리포터가 세포 표면으로 자리를 잡으면 이들 구체예에서, 리간드는 리포터에 결합하거나 연합된다. 리포터에 리간드를 결합시키는 임의 방법을 고려할 수 있다. 특정 다른 구체예에서, 리간드는 세포에 의해 내화될 수 있다. 일단 내화되면, 리간드는 반드시 그럴 필요는 없지만, 리포터 또는 세포내 제2리포터에 결합하거나 연합된다.
리간드는 성질을 가지는 분자 또는 분자의 일부가 되거나 감지될 수 있는 시그날을 생성시키는 모이어티에 연결된다. 당분야에 공지된 임의 영상 기술을 이용하여 리간드를 영상화시킨다. 일부 구체예에서, 리간드는 영상화될 수 있는 분자 또는 분자의 일부에 결합될 수 있다. 예를 들면, 리간드를 방사능핵에 결합시키거나 연결시킬 수 있고, 방사능핵은 당분야에 공지된 핵 의학 기술을 이용하여 영상화될 수 있다. 예를 들면, 리간드는 111In-옥트레오타이드이다. 다른 구체예에서, 리간드는 공지의 영상 기술을 이용하여 감지될 수 있는 조영제에 결합 또는 연결될 수 있다. 예를 들면, 리간드를 CT 조영제 또는 MRI 조영제에 결합되거나 연결될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 리간드를 리포터에 결합시키고, 리간드는 당분야에 공지된 영상 양식을 이용하여 측정가능한 시그날을 생성한다. 다른 구체예에서, 리간드는 리포터에 융합된 단백질 테그에 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 영상화는 리간드로부터 발생되는 시그날을 측정하는 것과 관련되며, 이로써 세포내 또는 개체내에 리포터 서열의 위치를 제공할 수 있다.
영상화에 이용할 수 있는 다양한 원자가 금속 이온 또는 방사능핵이 공지되어 있다. 67Ga, 68Ga, 99mTc, 111In, 123I, 125I, 131I, 169Yb, 60Cu, 61Cu, 64Cu, 62Cu, 201Tl, 72A, 157Gd 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 더 나은 영상 특징 및 저렴한 가격으로 가능하다면 123I, 131I, 67Ga, 111In 라벨된 화합물이 상응하는 99 mTc 라벨된 화합물로 대체시키려는 시도가 있었다. 양호한 물리적 특징 및 저렴한 가격으로 인하여 99 mTc를 방사능약물을 라벨시키는데 선호하여왔다.
사람에서 최적의 방사능영상화를 위해 많은 인자들이 고려되어야 한다. 감지 효과를 최대화시키기 위해, 100 내지 200keV의 감마 에너지를 방출하는 원자가 금속 이온이 바람직하다. 여기에서 "감마 방출물"은 임의 범주의 감마 에너지를 방출하는 물질로 정의된다. 당분야에 숙지된 자는 감마 방출자인 다양한 원자가 금속 이온에 대해 잘 알 것이다. 환자에게 습수되는 방사능 약량을 최소화시키기 위해 방사능핵의 물리적 반감기를 영상과정이 허용하는 한 짧게 해야한다. 임의 날짜와 그 날의 임의 시간에 검사를 실시할 수 있기 위해서는 임상 부위에 항상 이용할 수 있는 방사능핵 소스를 가지는 것이 유리하다. 99 mTc는 140 keV에서 감마 방사능을 방출하기 때문에 바람직한 방사능핵이다. 이의 물리적 반감기는 6시간이며, 몰리브데늄-66/테크네티움-99m 방출물질을 이용하여 즉석에서 바로 이용할 수 있다. 당업자는 사람에서 최적의 방사능영상을 결정하기 위한 방법을 숙지하고 있을 것이다.
본 발명 조성물의 일부 구체예에서, 베타 방출물질 또는 감마 방출물질이 아닌 치료제 금속이온인 원자가 금속 이온을 리간드 또는 리포터 아미노산 서열에 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 치료요법적 금속 이온은 플래티늄, 코발트, 구리, 비소, 탈리늄 등이 될 수 있다. 이들 치료요법적 금속 이온들을 포함하는 조성물은 암과 같은 과증식성 질환 치료를 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 여기에서 설명하고 있는 영상 물질을 이용하여 본 발명의 핵산을 발현시키는 세포에 방사능요법제를 국소화시킨다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 영상 방법에 이용되는 핵산은 in vivo에서 방사능라벨될 수 있는 아미노산 서열을 인코드한다. 인코드된 리포터 서열의 방사능라벨은 직접 또는 단백질 테그 또는 리포터 서열에 결합할 수 있는 리간드를 방사능라벨링시키는 것과 같은 간접적 방법으로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 제공하는 방사능라벨된 물질, 화합물 및 조성물은 적절한 양의 방사능활성을 가진다. 예를 들면, 99 mTc 방사능활성 복합체를 만들기 위해, 약 0.01 millicurie (mCi) 내지 약 300 mCi/mL의 농도 방사능활성을 가지는 용액에서 방사능활성 복합체를 만드는 것이 일반적으로 바람직하다.
인코드된 서열이 일단 방사능라벨되면, 포유류 신체내 종양과 같은 부위를 눈으로 확인하기 위해 영상화될 수 있다. 본 발명에 따르면, 방사능라벨은 당분야에 공지된 임의 방법을 이용하여 투여된다. 예를 들면, 단위 주사용 약량으로 방사능라벨된 리간드를 투여할 수 있다. 당분야에 공지된 통상의 캐리어 예를 들면 멸균 염 용액 또는 혈정을 이용할 수 있다. 일반적으로 투여되는 단위약량은 약 0.01mCi 내지 약 300 mCi, 바람직하게는 5 mCi 내지 약 30 mCi의 방사능활성을 가진다. 단위 약량으로 주사되는 용액은 일반적으로 약 0.01mL 내지 약 10mL이다.
시약이 환자에 투여된 후 바람직하게는 수분, 수시간 또는 더 긴 시간 뒤에 방사능라벨된 시약의 정맥 투여후에 in vivo에서 기관 또는 종양의 영상화가 이루어진다. 구체예에서, 1시간의 0.1 내에 영상화되는 부위에 투여된 약량의 충분한 양이 축적될 수 있다.
상기에서 제시한 바와 같이, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 영상화를 실시할 수 있다. PET, SPECT, 감마 조영법이 포함된다. 감마 조영법에서, 방사능라벨은 감마-방사능 방출 방사능핵이며, 방사능추적물은 감마-방사능 감지 카메라를 이용하여 위치시킨다(이 과정을 감마 조영법이라고 한다). 방사능추적물질이 질병 부위에 위치하거나(양성 대비) 또는 이와 같은 질병 부위에 특이적으로 위치하기 않거나(음성 대비) 이둘중에 선택되어 위치하기 때문에 영상화되는 부위를 감지가능하다.
C. 치료 진단, 단계, 영상 표적
심혈관 질환, 유전 질환, 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위한 유전자 요법 및 세포 치료는 상당히 유망하다. 발현된 유전자 및 세포 통행을 모니터하고 특이적으로 영상화시키는 방법은 아직 초기 단계이다. 그러나, 생검없이 신체에서 유전자 발현을 국소화시키는 것 또한 여전히 어렵다. 분명한 것은 비-침투적으로 영상화된 리포트를 세포 또는 유전자에 테스시키는 것은 효과 및 독성을 모니터하는데 유익할 것이다. 리포터의 발현은 관심 유전자의 발현과 연결시킬 수 있다. 그 다음 당업자는 표적 조직에서 발현이 이루어졌는지 결정할 수 있고, 적절한 리포터와 함께, 치료효과를 얻기위한 필수적 발현 수준 또는 기능석 세포 이식물의 발현 수준을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 리포터를 반복적으로 가시화시킬 수 있다면, 특정 위치에서 발현 지속기간, 수준을 반복적으로 모니터하여 투여량 제어에 도움이 될 수 있다. 유전자 요법 분야에서 장기간 발현을 유지시키는 것은 현재 하나의 모험이다. 비-표적 조직에서 발현이 효과가 있다는 것을 보여하는데, 그 이유는 독성에 영향을 줄 수 있는 가능성 때문이다. 암 요법의 경우, 생장 저해제도 되는 리포터가 바람직하나, 당뇨병과 같은 다른 질환에서는 세포에 교란을 가능한 최소화시키는 리포터가 더 바람직하다. 암의 경우에도 비-표적 조직에 영향을 최소화시키고, 관심 유전자의 누화(cross-talk)를 제한하기 위해, 시그날 생성 결손된 리포터가 바람직할 수 있다.
현재 대부분의 영상화 기술은 질병의 진단 및 상태를 결정하기 위해 해부학적 변화를 이용한다. 생물학적 과정에 의존하는 기능적 영상 방법으로 해부학적 변화가 있기 전에 질병을 확인할 수 있거나 또는 이를 이용하여 해부학적 변화의 병인을 이해함으로써 특정 진단을 내릴 수 있다. 예를 들면, 골 스캔 물질 99m-Tc- MDP는 방사선사진 또는 컴퓨터 단층촬영전에 뼈 전이를 확인할 수 있거나 (Rieden, 1995) 또는 해부학적 영상에서 뼈 병소가 발견되면, 99m-Tc-MDP 또는 18-플로린-데옥시글루코스(18-FDG) PET의 취입량의 증가는 양성 병소로부터 악성을 분리하는데 도움이 될 수 있다. 18-FDG PET 촬영은 일부 악성 종양을 진단, 단계를 결정하는데 유용한 것으로 증명되었지만 모든 종양에 유용한 것은 아니다. 예를 들면, 신장 세포 암종(Kang et al, 2004) 및 전립선 암 (Salminen et al, 2002; Hofer et al, 1999)은 18-FDG-PET에 의해 잘 구별되지 않으며, 염증성 병소가 암(Albes et al, 2002)과 비슷하다. 18-FDG-PET가 포도당을 닮아, 대사를 반영한다. 질병을 확인하는 또 다른 방법은 질병 또는 조직 특이적 프로모터들을 이용하는 것이다. 텔로메라제 활성이 정상 조직에서는 상당히 낮은 것으로 밝혀졌으나, 거의 모든 암에도 존재하는데(Kim etal, 1994; Broccoli et al, 1995), 예를 들면, 생식 기관 (ICyo et al, 1996), 유방 (Hiyama et al, 1996), 결장 (Chadeneau et al, 1995), 간 (Tahara et al, 1995), 뇌 (Langford et al, 1995), 전립선 (Sommerfeld et al, 1996), 폐( Hiyama et al, 1995)에서 발생된다. 사람 텔로메라제 (hTERT) 프로모터 활성은 텔로메라제 활성과 함께 국소화된다(Takakura et al, 1999; Cong et al, 1999). 따라서, hTERT 프로모터를 이용하여 종양에서 유전자 발현을 특이적으로 국소화시킬 수 있다. 일반적으로, 조직 특이적 프로모터는 요법에 사용하기에는 너무 약하여, 증폭 방법이 필요할 수 있다. 증폭된 hTERT 프로모터를 이용하여 진단 및 단계 결정을 위해 암에서 리포터의 발현을 구동시키고, 관심 대상인 치료 유전자에 연결된 리포터의 발현을 구동시킨다.
따라서, in vivo에서 유전자 발현을 감지하도록 고안된 영상 방법이 유전자 운반 시스템의 추가 개발, 질병의 진단 뿐만 아니라 임상 효과 및 독성의 모니터에 필요할 수 있다. 또한, 상당수의 영상 시스템이 환자에서 단일 유전자 요법 또는 다중 유전자 치료법을 모니터하는데 필요할 것이다. 예를 들면, 당뇨 및 암을 모두 가진 한 환자의 경우에, 두 가지 별개 리포터에 의해 독립적으로 모니터될 수 있는 두 개의 상이한 유전자 요법 중재를 이용하면 유익할 것이다. 유도성 프로모터를 리포터와 함께 이용하는 경우에, 유도(induction)에서 일어난 유전자 전이가 실패하였는지를 평가하기 위해 상이한 리포터를 구동시키는 구성적으로 활성인 프로모터를 전달하는데 유익할 것이다. 몇 가지 유전자 발현 촬영 시스템이 고안되었지만, 경피 영상화를 위해 인체 조직을 대부분 충분히 침투하지 못하고(빛에 근거한 예를 들면 GFP 또는 루시페라제), 대부분은 사람에게 안전하다고 증명되고, FDA 승인을 받은 방사능약물을 이용하지 못한다.
본 발명은 조직-선별적 프로모터에 작용하도록 결합되고, in vivo에서 비-침습성 방법으로 감지가능한 리포터를 인코드하는 핵산을 투여하여 개체에서 질병 또는 질환을 예방, 저해 또는 치료하는 방법도 포함하고, 이러한 개체에 리포터와 선별적으로 상호작용하는 치료제 또는 영상제를 제공하는 방법도 고려한다. 본 발명의 한 측면에는 다른 암 요법과 복합하여 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 것이 포함된다.
예방, 치료 또는 진단할 질병은 여기에서 설명하고 있는 치료제를 투여하여 치료 또는 예방에 순응하는 개체에 영향을 줄 수 있는 임의 질병이 될 수 있다. 이와 같은 질병은 과다증식성 질병이 될 수 있다. 과다증식성 질병은 비정상 생장 또는 세포의 증식이 있는 질환이다. 과다 증식성 질환은 개체에서 병소로 나타나는 질병이 될 수 있다. 예시적인 과다증식성 병소에는 전암성(pre-malignant) 병소, 암 및 종양이 포함된다. 암은 혈관, 폐, 심장, 식도, 근육, 장, 유방, 전립선, 위방광, 간, 비장, 췌장, 신장, 뉴우런, 근세포, 백혈구세포, 불사화(immortalized) 세포, 신형성 세포, 종양 세포, 암 세포, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 침샘, 담낭, 방광, 기관, 후두, 인두, 대동맥, 동맥, 모세관, 정맥, 흉선, 림프절, 골수, 뇌하수체 선, 갑상샘, 부갑상샘, 부신, 뇌, 대뇌, 소뇌, 수질, 중뇌, 척수, 신경, 골격근, 평활근, 골, 고환, epidiymides, 전립선, 정낭, 남경, 난소, 자궁, 유선, 질, 피부, 눈 또는 시신경의 내배엽, 중배엽, 외배엽에서 유도된 것들을 포함하는 임의 타입의 암세 포가 될 수 있다.
치료될 수 있는 질환의 다른 예로는 인슐린 생산이 부적절하여 당뇨병과 같이 상실된 또는 결여된 기능의 회복, 감염성 질환, 유전 질환, 염증 질환 가령 자가면역 질환이 포함된다. 본 발명의 방법 또는 조성물은 질병의 면역 요법 또는 예방요법에 이용될 수 있는 항원을 운반하는데 이용된다. 당업자는 여기에서 제시한 방법 및 약학 조성물을 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 많은 질병 실체에 대해 인지할 수 있을 것이다.
개체에서 세포 처리는 개체에 있는 암과 같은 과다증식성 병소의 생장을 저해하는 것과 연관될 수 있다. “생장을 저해한다”는 의미는 병소의 생장을 지연시키거나 중단시키는 것을 포함하여 광범위하게 정의할 수 있다. 병소 생장 저해에는 병소의 크기를 감소시키거나 병소내 세포의 아포프토시스를 유도한다는 것도 포함된다. 아포프토시스를 유도한다는 것은 약물, 독소, 화학물, 조성물 또는 생물학적 물질이 아포프토시스 또는 예정된 세포 죽음을 부여한다는 상황으로 정의된다. 특정 구체예에서, 세포는 종양 세포가 된다. 병소의 생장은 병소 세포에 대항하는 면역 반응을 유도하여 저해시킬 수도 있다.
치료요법제는 개체에서 임의 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 임의 물질이 될 수 있다. 예를 들면, 치료요법제는 항암제가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료요법제는 방사능핵이 된다. 방사능핵은 하기에서 상세하게 설명된다. 다른 구체예에서, 치료요법제는 면역조절물질이다. 촬영 물질을 이용하여 세포로 치료제를 국소화시키거나 본 발명의 리포터를 발현시키는 세포 주변 지역으로 국소화시킬 수 있다.
III. 핵산
본 발명의 측면에는 직간접 감지에 의해 비-침투적으로 영상화될 수 있는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 운반이 포함된다. 본 발명의 핵산에는 감지가능한 시그날을 생산하는 물질에 효소적으로 작용하거나 이 물질을 생산하거나 또는 이에 결합할 수 있는 재조합 GPCRs이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 다른 측면에서, 핵산에는 하나 이상의 추가 핵산 서열들이 포함될 수 있는데, 이들은 트랜스엑티베이터, 치료제 또는 제2 촬영 물질을 인코드하는 핵산 서열이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
"핵산"은 당분야에 공지된 용어이다. 여기에서 "핵산"은 핵염기로 구성된 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체 분자(가닥)을 말한다. 예를 들면 핵염기에는 DNA에서 볼 수 있는 자연 생성 또는 유도된 퓨린 또는 피리미딘 염기(가령, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (가령, A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다. "핵산"에는 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 포함하는데 이들은 “핵산” 용어의 아속(subgenus)이다. "올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 3 내지 약 100개 핵염기로 된 분자이다. "폴리뉴클레오티드"는길이가 약 100개 핵염기이상의 최소 하나의 분자를 말한다.
이와 같은 정의는 일반적으로 단일 가닥 분자를 말하나, 특정 구체예에서는 단일 가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 추가 가닥을 포함할 수도 있다. 따라서, 핵산은 분자로 구성된 특정 서열의 “성분” 또는 하나 또는 그 이상의 상보 가닥으로 구성된 이중-가닥 분자 또는 삼중-가닥 분자를 포함할 수 있다. "벡터"는 세포내로 도입될 핵산 서열을 가지는 케리어로써 세포에서 이 핵산 서열이 발현되거나 복제된다. "발현 벡터" 또는 "핵산 벡터"는 핵산 서열을 포함하는 핵산 또는 핵산 서열의 최소 일부분을 코딩하는 “카세트”로써 유전자, 전사될 수 있는 산물, “조절” 또는 “제어” 서열로 불리고, 특정 숙주 세포에서 전사 및 적절하게 연결된 코딩 서열의 해독에 필수적인 핵산 서열을 말한다. 전사 및 해독을 조절하는 기준 서열에 추가하여, 발현 벡터에는 다른 기능도 할 수 있는 핵산 서열이 포함된다.
A. 발현 벡터
1. 프로모터
"프로모터"는 "프로모터 요소" 및 "프로모터 서열"과 상호 교환적으로 이용된다. 유사하게, "인헨서"도 "인헨서 요소“ 및 "인헨서 서열"과 상호 교환적으로 이용된다. 프로모터, 인헨서 또는 리프레스(repressor)를 핵산 또는 재조합 막통과 G-단백질 연합된 수용체와 같은 트랜스유전자(transgene)에 ‘작용가능하도록 연결된’이라고 표현되는데, 이들 요소들이 핵산 또는 트랜스유전자 전사율 또는 효과를 조절 또는 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 예를 들면, 트랜스유전자 코딩 서열의 5‘말단에 근접하여 위치한 프로모터 서열은 통상적으로 트랜스유전자와 작용가능하도록 연결된다. 여기에서, "조절 원소"는 "조절 서열"과 호환하여 사용되며, 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐화 부위 및 다른 발현 제어 원소들 또는 이들 원소의 복합물을 말한다. 프로모터는 이들이 제어하는 유전자의 5'(상류)에 위치한다. 많은 진핵 프로모터들에는 두가지 타입의 인지 서열: TATA 박스 및 상류 프로모터 원소를 포함한다. 전사 개시부위에서 25-30bp 상류에 있는 TATA 박스는 RNA 폴리메라제 II가 정확한 위치에서 RNA 합성을 시작할 수 있도록 지시하는데 연관되는 것으로 보인다. 대조적으로, 상류 프로모터 요소는 전사가 개시될 때 속도를 결정한다. 이들 요소들은 이들의 기원에 관계없이 작용하나 이들은 반드시 TATA 박스의 100 내지 200bp 상류에 위치해야 한다.
인헨서 요소들은 이에 연결된 상동성 또는 이형성 프로모터로부터 전사를 최소 1000배 강화시킬수 있다. 인헨서 요소들은 이들의 방향이 역전되더라도 활성을 유지한다(Li et al, 1990). 또한, 프로모터 요소와 달리, 인헨서는 전사개시부위 하류에 위치할 때 예를 들면 인트론내에 위치할 때 또는 프로모터로부터 상당 거리 떨어져 있을 때에도 활성을 가진다(Yutzey et al, 1989).
공지된 바와 같이, 이들 거리에 약간의 변화는 프로모터 기능 손실없이도 수용된다. 유사하게, 트랜스유전자에 대해 조절 요소들의 위치는 기능 손실없이도 상당히 다양하게 될 수 있다. 조절 요소들의 다중 복사체는 협력하여 작용할 수 있다. 일반적으로 발현 벡터는 5' 에서 3'방향으로 하나 이상의 인헨서 서열, 프로모터 서열, 이들 모두에 작용할 수 있도록 연결된 트랜스 유전자, 폴리아데닐화 서열로 구성된다.
"프로모터"는 전사 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 일부가 되는 조절 서열이다. 조절 단백질 및 분자가 RNA 폴리메라제 및 다른 전사 인자에 결합하는 유전 요소를 포함할 수 있다. "작용가능하도록 위치한", "작용가능하도록 연결된", "제어하에" 그리고 "전사 조절하에"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및 발현을 제어하기 위해 핵산 서열에 대해 정확한 위치 및 방향에 있다는 것을 말한다. 프로모터는 “인헨서”와 연합하여 사용되거나 연합 사용되지 않을 수 있고, 이를 핵산 서열의 전사 활성화에 관련된 시트-작용 조절 서열이라 한다. 적절한 프로모터 또는 프로모터/인헨서 복합 및 관심 유전자가 함께 발현 카세트를 구성한다. 하나 또는 그 이상의 발현 카세트는 주어진 핵산 벡터 또는 발현 벡터내에 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 한 개 발현 카세트는 제2발현 카세트의 프로모터와 상호작용하는 트랜스엑티베이트를 인코드할 수 있다. 한 개 또는 그 이상의 발현 카세트는 동일한 또는 상이한 발현 벡터내에 존재할 수 있다.
프로모터는 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합될 수 있는데, 이는 코딩 단편 또는 엑손의 상류에 위치한 5' 넌-코딩 서열을 분리하여 수득할 수 있기 때문이다. 이와 같은 프로모터를 "내생성(endogenous)"이라고 한다. 유사하게, 인헨서는 서열의 상류 또는 하류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연합될 수도 있다. 재조합 또는 이형성 프로모터 제어하에 핵산 단편을 위치시키면 특정 장점을 얻을 수 있는데, 이는 자연 환경에서 핵산 서열과 보통 연합하지 않는 프로모터를 말한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 이형성 프로모터는 키메라 프로모터이며, 두 개 또는 그 이상의 내생성, 이형성 또는 합성 프로모터 서열의 단편을 작용가능하도록 연결시켜 재조합 프로모터를 만든다.
재조합 또는 이형성 인헨서는 자연 환경에서 핵산 서열과 보통 연합하지 않는 인헨서를 말한다. 이와 같은 프로모터 또는 인헨서에는 다른 유전자의 프로모터또는 인헨서; 임의 다른 원핵, 바이러스성, 진핵 세포에서 분리한 프로모터 또는 인헨서, 그리고 상이한 전사 조절 부위를 가지는 상이한 요소들을 포함하는 “자연 발생”이 아닌 프로모터 또는 인헨서 및 발현을 변형한 돌연변이체에서 분리된 프로모터 또는 인헨서가 포함된다. 프로모터와 인헨서의 핵산 서열을 합성에 의해 생산하는 것에 추가하여, 여기에서 언급한 조성물과 연관하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및 핵산 증폭 기술을 이용하여 서열을 생산할 수 있다(U.S. Patents 4,683,202 및 5,928,906, 각각 참고문헌으로 첨부한다). 이와 같은 프로모터들을 이용하여 리포터 발현을 구동시키는데, 몇 가지 언급하자면 GPCRs, β-갈락토시다제 또는 루시페라제를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 또한, 미토콘드리아, 엽록체와 같은 비-핵 기관내에 서열의 전사 및 발현을 지시하는 조절 서열도 이용하는 것을 고려할 수 있다.
프로모터 및 인헨서는 전형적으로 발현을 위해 선택된 세포 타입, 기관 유기체에 DNA 단편 발현을 효과적으로 지시하기 위해 사용될 수 있다. 분자 생물학 분야에 당업자는 단백질 발현을 위해 프로모터, 인헨서, 세포 타입 복합을 이용한다는 것을 일반적으로 알 것이다(Sambrook et al, (2001)). 이용된 프로모터는 도입된 DNA 단편의 발현을 지시하는 적절한 조건하에 구성적, 조직-특이적, 유도성있거나 유용한 것이 될 수 있는데, 이와 같은 것들은 재조합 단백질 및/또는 펩티드 생산에 유리하다. 프로모터는 이형성 또는 내생성 또는 이들의 복합이 될 수 있다.
2 조직-선별적 프로모터 서열
대부분 유전자 전달 방법은 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 프로모터를 이용하여 다양한 조직에서 높은 수준의 발현을 얻는다. 예를 들면 암을 치료하기 위해 독성 유전자를 도입시킨다면, 정상 조직이 아닌 종양 조직을 특이적으로 표적하는 것이 바람직하다. 리포터 기술을 이용하여 in vivo에서 조직 특이적 프로모터의 표적 특이성을 설명할 수 있다.
hTERT를 포함하는 조직 특이적 프로모터의 단점은 전사를 구동시키는 능력이 상대적으로 약하다는 것이다. 증폭 과정이 필요하다. 리포트를 구동시키는 다양한 암에서 증폭된 프로모터는 연결된 치료 유전자를 국소화시키고 발현을 정량화시키는 역할을 할 수 있다. 증폭된 프로모터와 리포터만 복합하는 경우에 이를 이용하여 hTERT 프로모터 기능의 요법에 의해 유도된 변형을 측정할 수 있다. 이와 같이 복합되면 암을 확인하고 상태를 결정하는 진단 도구로써의 가능성도 있다. 프로모터 누설성(leakiness)으로 인하여 정상 세포에서의 효과를 제한하기 위해, 시그날생성 결손된 리포터가 이와 같은 구조에는 바람직하다.
적절한 구체예에서, 조직 특이적 프로모터는 텔로메라제 프로모터이다. 암 세포와는 달리, 정상 체세포는 한정된 수명을 가진다. 각 세포 분할로, 텔로미어(telomeres)라고 불리는 염색체 단부가 점점 작아진다. 이는 DNA 복제를 준비하는데 필수적인 RNA 프라이머가 5'말단에서 분해되기 때문이다. 따라서, 텔로미어에서는 복제가 일어나지 않고, 매 복제 사이클에서 염색체가 짧아진다. 결국, 주요 유전자가 영향을 받도, 세포는 생장을 중단하거나 죽게된다. 종양 세포들은 무한대로 분할하기 때문에, 이들은 말단 복제 문제를 극복해야 한다. DNA 단부에 6개 염기쌍 반복체 단위로 뉴클레오티드를 추가시켜, 텔로미어를 연장시켜 세포의 수명을 증가시키는 방법으로, 리보자임 텔로메라제를 활성화시킴으로써 이 문제를 흔히 해결한다.
텔로메라제 활성은 정상 조직에서는 발견되지 않거나 매우 낮지만 모든 암의 약 85-90%에서 존재하고, 생식 기관, 유방, 결장, 간, 뇌, 전립선, 폐에서 발생된다. In vitro 및 동물 모델에서, 텔로메라제 리보자임을 저해시키도록 고안된 많은 치료법이 약간의 전망을 보였다. 이들 방법의 한계는 세포 노년화 또는 죽음의 원인이 되는 텔로미어 길이가 짧아지는 것에 대한 다중 배가 시간이 걸리는 것일 것이다. 종양 특이적 T 세포를 만들기 위해 항원으로 텔로메라제 리보자임의 일부분을 이용하기도 하였다. 뇌종양에서 특히 약간의 한계가 있기는 하지만 여전히 유망한 방법이다.
텔로메라제 활성화에는 두가지 주요 성분이 연관된다. 첫째는 대부분의 모든 세포에서 발현되는 6-염기쌍 반복서열, 사람 텔로메라제 RNA (hTR)의 주형이다. 두 번째는 텔로메라제 활성화를 위한 속도-제한 단계, 사람 텔로메라제 역전사효소 (hTERT), 이의 프로모터 활성화는 텔로메라제 활성화와 함께 국소화된다.
따라서, hTERT 프로모터는 암에 치료유전자를 특이적으로 운반하고, 발암성 바이러스를 종양으로 복제를 제한하기 위한 수단으로 이용되었다. 치료 효과를 위해 유전자 발현을 적절한 수준으로 유지시키는 것은 유전자/바이러스성 요법에서 도전이 되며, 이는 대부분의 조직 또는 암 특이적 프로모터에서 어렵다는 것이 증명되었다. PET를 이용하여 아데노바이러스를 종양으로 투입한 후 hTERT 프로모터에 의해 구동된 나트륨요오드수송체의 낮은 발현 수준을 영상화하는 것도 가능하다. A2780 세포(난소 암종)에서 구동된 종양에서, hTR 프로모터의 편재 발현 또는 CMV 프로모터의 편재 발현에서보다 더 낮을 정도를 포함하여 발현은 적다. hTR 및 CMV 프로모터에 의해 발현이 구동되기는 하지만, PancO2 세포 (췌장 암종)에서 유도된 종양에서 hTERT로부터의 상당한 발현은 볼 수 없었다. 따라서, 본 영상 실험에서 hTERT 프로모터 활성은 약하거나 또는 존재하지 않았다.
증폭 전략이 필요하다. 조직/암 특이적 프로모터로부터의 발현이 강화되어야 한다. GAL4/VP16 시스템을 이용하여 암종배아 항원(CEA) 프로모터 및 좀더 최근의 hTERT 프로모터로부터 치료요법적 유전자 발현을 구동하였다. 아포프토시스 유도성 유전자 TRAIL 또는 Bax와 복합된 hTERT 프로모터가 결합된 아데노바이러스는 종양을 죽이지만 CMV 프로모터에 의해 구동되는 TRAIL 또는 Bax 결합된 아데노바이러스와 연합된 간 또는 전신 독소는 피하였다. 따라서, hTERT 프로모터에 의한 발현 보강은 가능하며 암 특이적 발현을 유지시키는 것도 여전히 가능하다. 다른 수단을 이용하여 약한 프로모터로부터 발현을 강화시키는 시도가 있었는데, 예를 들면, Cre/loxP 시스템으로써, 이는 stuffer DNA를 잘라내어야 하고, 세포 의존성일 수 있는 바이러스성 프로모터의 전사 활성에 의존한다. 또 다른 방법은 원하는 유전자를 구동시키기 위해 조직 특이적 프로모터와 프로모터를 자극하는 인위적인 전사 활성화물질을 이용하는 것이다. 이로써 원하는 유전자와 전사인자가 발현된다. 추가 전략은 본 명세서에서 예시한 것과 같이 CMV와 같은 편재 프로모터의 상류에 hTERT 프로모터를 배치시키는 것이다. 증푹된 hTERT 프로모터는 치료 유전자 발현을 구동시키는데 유용할 뿐만 아니라 hTERT계 프로모터에 의해 종양에서 복제가 제한된 발암성 바이러스를 따르는데에도 유용하다. 소마토스태틴 수용체 타입 2를 포함하나 이에 한정시키지 않는 영상가능한 리포터에 연결시켜 치료 효과를 얻기 위해 필요한 발현을 국소화시키고 정량화하며, 부적절한 발현이 독성을 유발시키는 지를 분석할 수 있다. hTERT가 종양에서 거의 보편적으로 발현되기 때문에, 증폭되고, 리포터에 연결되면, 벡터 시스템은 종양을 감지, 분별 진단 및 상태 결정을 하는 능력을 가진다. 따라서, 리포터 단독 또는 원하는 유전자가 연결된 리포터를 구동시키는 증폭된 hTERT 프로모터가 결합된 영상 시스템이 진단, 단계결정 및 치료에 유용하다는 것이 증명되어야 한다. 당뇨병 또는 종양을 치료하기 위한 CEA 프로모터와 같은 다른 표적 종양을 치료하기 위해 베타 세포를 표적으로 하는 다른 조직 특이적 프로모터의 발현을 촉발시키는데 증폭 과정이 이용될 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 소마토스태틴 수용체는 약한 생장 저해제이며 따라서, 암 요법을 증대시킬 수 있다. 중요한 것은 종양에서 모든 세포가 영상화를 위한 유전자 발현에 필요한 것은 아니다. 일부 세포가 리포트를 발현시킨다면, 진단 및 상태 결정에 충분하며, 연결된 유전자의 발현에 리포터를 이용해야 한다.
프로모터/유전자, 프로모터/리포터 및/또는 프로모터/트랜스엑티베이터의 위치는 다양할 수 있다. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 발현 카세트가 특정 벡터 또는 발현 벡터에서 카세트의 순서에 대해 일반적인 선호가 없는 특정 세포에 존재할 수 있다. 발현 카세트의 제1, 제2, 제3 또는 제4 프로모터는 원하는 유전자, 리포터 및/또는 트랜스엑티베이트의 발현을 구동시키는 조직 특이적, 증폭된 조직 특이적, 및/또는 구성 프로모터가 될 수 있다. 프로모터 복합체 및 리포터의 전 또는 후에 프로모터와 원하는 유전자의 배치 순서는 본 발명에서는 중요하지 않다.
줄기세포를 포함한 정상 세포에서는 텔로메라제 활성이 낮은 것으로 확인되었다. 조혈 줄기세포는 다양한 벡터에 의한 감염에 저항성을 가지는 경향이 있다. 대부분 줄기 세포는 무활동성(quiescent)이며, 대부분 벡터에 의한 감염/전이감염에 저항성이고, 임의 시간에 소수의 간세포만 감염 가능성을 가진다. 임파세포는 집단적 팽창(clonal expansion)을 하는 경우에 일시적으로 텔로메라제 활성이 증가되지만 이 소집단은 감염에 대해 가능성을 가지며 외생적으로 도입된 hTERT 프로모터를 통하여 높은 발현 수준을 가진다. 정적이고, 원시적인 줄기세포는 텔로메라제 활성이 낮고, hTERT 프로모터는 CD34+ 조혈성 조상 세포에서 훨씬 활성이 적다. hTERT 프로모터로부터 누수성(leaky) 발현이 있다면 속성을 제한하는 다른 방법은 시그날 결손 리포터를 이용하는 것이다. 따라서, 세포에서 부적절한 사건이 제한될 것이고, 시그날 결손 리포터가 증폭된 hTERT 프로모터와 함께 이용되는 경우에 원하는 유전자와의 누화(cross-talk) 가능성은 적어질 것이다.
본 발명의 특정 측면에는 내생 또는 외생 트랜스엑티베이터와 상호작용하는 프로모터 서열이 포함된다. 특정 측면에서, 트랜스엑티베이터는 재조합 트랜스액티베이터이다. 재조합 트랜스액티베이터가 본 발명의 핵산이 도입된 세포에서 발현된다. 또는, 재조합 트랜스액티베이터 또는 이를 인코딩하는 핵산을 본 발명의 핵산 도입 전 후 또는 함께 도입시킬 수 있다. 특정 측면에서, 재조합 트랜스액티베이터는 영상 또는 치료제를 인코드하는 핵산에 인코딩될 수 있다.
다양한 조직 타입 및 몇 가지 상이한 유기체 종에서 프로모터는 기능을 할 수 있고, 이들의 기능은 특정 종 및/또는 특정 정상 또는 질병 조직 또는 세포 타입에 대해 제한을 받을 수 있다. 또한, 프로모터는 구성적으로 활성을 가질 수 있거나 또는 특정 물질(예를 들면 조직-특이적 인자)에 의해, 특정 환경(가령, 저산소, 또는 프로모터를 포함하는 발현 카세트에서 인헨서 요소 존재하에)하에서 또는 유기체의 특정 발달 단계(가령, 태아 단계에서는 활성이 있고, 성인 단계에서는 활성이 없는)에서 선별적으로 활성화될 수 있다.
본 발명에서 실시하는데 유용한 프로모터는 조직-특이적- 즉, 다른 조직 타입에서는 상대적으로 낮은 수준으로 발현되거나 대부분 “침묵”을 유지하는 반면에, 일부 정상 또는 질병 조직에서는 유전자의 전사를 구동시키는 것이 바람직하다. 그러나, 조직-특이적 또는 조직-선별적 프로모터는 침묵 성향이 있는 조직에서 감지 가능한“배경” 또는 “기준”양을 가질 수도 있다. 표적 조직에서 프로모터가 선별적으로 활성이 되는 정도를 선택성 비율(표적 조직에서의 활성/기준 조직에서의 활성)으로 나타낸다. 이에 대해 본 발명의 실시에 유용한 조직 특이적 프로모터는 1:1.01, 1:1.1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 그 이상의 선택성 비율을 가진다. 바람직하게는 선택성 비율은 약 1:1.5이상이다. 프로모터는 정상 또는 관심 대상인 질병 조직에서 활성이 감소되는 역기능을 할 수도 있다.
단일 조직 타입에서는 활성이 제한되지는 않지만 특정 프로모터는 그럼에도 불구하고 한 개 조직 군에서 활성이 있고, 다른 군에서는 활성이 적거나 침묵을 하는 선별성을 보일 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 이와 같은 프로모터를 또한 "조직 특이적" 또는 "조직 선택적"이라고 하며, 본 발명에서 사용을 고려할 수 있다. 예를 들면, 다양한 종양 세포에서 활성이 있는 프로모터는 암을 치료하는데 효과적일 수 있고, 신체의 다른 부분에도 영향을 줄 수 있다.
조직-특이적 프로모터들은 상이한 정상 또는 질병 조직 또는 과증식하는 세포의 상이한 단계에서 차등적으로 발현되는 또는 상이한 생장 단계에서 유전자의 프로모터 부분에서 유도될 수도 있다.
특정 프로모터 제어하에 유전자 발현 수준은 프로모터 부분을 조절하여 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터 부분내에 상이한 도메인들은 상이한 유전자-조절 활성을 보유할 수 있다. 이와 같은 상이한 부분들의 역할은 일반적으로 특정 부분이 결손된(결손 분석) 또는 염기쌍이 돌연변이된 다양한 프로모터 변이체를 가지는 벡터 구성체를 이용하여 평가할 수 있다. 이와 같은 실험에 이용되는 벡터들은 일반적으로 상이한 조건들하에서 각 프로모터 변이체의 활성을 결정하는데 이용되는 리포터 서열이 포함된다. 이와 같은 결손 분석의 응용으로 원하는 활성을 가지는 프로모터 서열을 확인할 수 있으며, 따라서, 코어 프로모터 요소를 포함하는 특정 프로모터 도메인을 확인하며, 이들 요소들은 결손되었을 때 프로모터의 특징 예를 들면, 선별성 또는 전사결합 인자와 같은 성질을 포함하나 이에 국한되지 않은 성질에 결정적인 영향을 준다. 이와 같은 방법은 예를 들면 조직 특이성을 부여하는 최소 부분을 확인하거나 또는 코어 CMV 프로모터 또는 mini-CMV를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 프로모터 원소들과 복합되었을 때 강력한 전사 반응을 부여하는 최소 부분을 확인하는데 이용될 수 있다.
여기에서 설명하는 다수의 조직 특이적 프로모터들은 본 발명을 실행하는데 특히 유익하다. 대부분의 경우에 이들 프로모터들은 선택된 벡터내로 클로닝에 적합한 편리한 제한효소 절단 단편으로 분리된다. 본 발명의 특정 측면에는 hTERT 프로모터를 포함하나 이에 국한되지 않는 프로모터가 포함된다. 또는, 프로모터 단편들은 폴리메라제 쇄 반응 또는 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 분리시킬 수 있다. 이들 프로모터 단편들의 클로닝은 프라이머의 5' 말단에 제한효소 부위를 결합시켜 실행할 수 있다.
당업자는 본 발명의 내용에 포함될 수 있는 다양한 타입의 조직- 선별적 프로모터 서열을 인지할 것이다. 이들 프로모터/인헨서에는 다음이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다: 면역글로블린 중쇄(Banerji et al, 1983; Grilles et al, 1983; Grosschedl et al, 1985; Atchison et al, 1986, 1987; Imler et al, 1987; Weinberger et al, 1984; Kiledjian et al, 1988; Porton et al; 1990); 면역글로블린 경쇄(Queen et al, 1983; Picard et al, 1984); T-세포 수용체 (Luria et al, 1987; Winoto et al, 1989; Redondo et al; 1990); HLA DQ α 및 DQ β (Sullivan et al, 1987); β-인터페론(Goodbourn et al, 1986; Fujita et al, 1987; Goodbourn et al, 1988); 인터루킨-2(Greene et al, 1989); 인터루킨-2 수용체 (Greene et al, 1989; Lin et al, 1990); MHC Class II 5 (Koch et al, 1989); MHC Class II HLA-Dra (Sherman et al, 1989); β-악틴 (Kawamoto et al, 1988; Ng et al; 1989); 근 크리스틴 카이나제 (MCK) (Jaynes et al, 1988; Horlick et al, 1989; Johnson et al, 1989); 프레알부민 (Transthyretin)(Costa et al, 1988; 엘라스타제 I, Ornitz et al, 1987); 메탈로티오닌 (MTII) (Karin et al, 1987; Culotta et al, 1989); 콜라게나제 (Pinkert et al, 1987; Angel et al, 1987); 알부민 (Pinkert et al, 1987; Tranche et al, 1989, 1990); α-페토단백질 (Godbout et al, 1988; Campere et al, 1989; γ-글로빈, Bodine et al, 1987; Perez-Stable et al, 1990); β-글로빈 (Trudel et al, 1987); c-fos (Cohen et al, 1987); c-HA-røs (Treisman, 1986; Deschamps et al, 1985); 인슐린 (Edlund et al, 1985); 신경 세포 흡착 분자 (NCAM) (Hirsch et al, 1990); α1-안티트립신 (Latimer et al, 1990); H2B (TH2B) 히스톤 (Hwang et al, 1990); 생쥐 또는 타입 I 콜라겐 (Ripe et al, 1989); 포도당-조절된 단백질 (GRP94 and GRP78) (Chang et al, 1989); 쥐 생장 호르몬 (Larsen et al, 1986); 사람 혈청 Amyloid A (SAA) (Edbrooke et al, 1989); 트로포닌 I (TN I) (Yutzey et al, 1989); 혈소판-유도된 생장 인자 (PDGF) (Pech et al, 1989); 뒤시엔느 근이영증 (Klamut et al, 1990); 인헨서 (Banerji et al, 1981; Moreau et al, 1981; Sleigh et al, 1985; Firak et al, 1986; Herr et al, 1986; Imbra et al, 1986; Kadesch et al, 1986; Wang et al, 1986; Ondek et al, 1987; Kuhl et al, 1987; Schaffher et al, 1988); 폴리오마 (Swartzendruber et al, 1975; Vasseur et al, 1980; Katinka et al, 1980, 1981; Tyndall et al, 1981; Dandolo et al, 1983; de Villiers et al, 1984; Hen et al, 1986; Satake et al, 1988; Campbell and Villarreal, 1988); 레트로바이러스 (Kriegler et al, 1982, 1983; Levinson et al, 1982; Kriegler et al, 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al, 1986; Miksicek et al, 1986; Celander et al, 1987, 1988; Thiesen et al, 1988; Choi et al, 1988; Reisman et al, 1989); 파필로마 바이러스 (Campo et al, 1983; Lusky et al, 1983; Spandidos and Wilkie, 1983; Spalholz et al, 1985; Lusky et al, 1986; Cripe et al, 1987; Gloss et al, 1987; Hirochika et al, 1987; Stephens et al, 1987); 헤파타이티스 B 바이러스 (Bulla et al, 1986; Jameel et al, 1986; Shaul et al, 1987; Spandau et al, 1988; Vannice et al, 1988); 사람 면역결핍 바이러스 (Muesing et al, 1987; Hauber et al, 1988; Jakobovits et al, 1988; Feng et al, 1988; Takebe et al, 1988; Rosen et al, 1988; Berkhout et al, 1989; Laspia et α/., 1989; Sharp et al, 1989; Braddock et al, 1989); 사이토메갈로바이러스 (CMV) (Weber et al, 1984; Boshart et al, 1985; Foecking et al, 1986); 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (Holbrook et al, 1987; Quinn et al, 1989).
3. 내부 리보자임 유입 부위(Internal Ribosome Entry Sites)(IRES)
본 발명의 특정 구체예에서, 내부 리보자임 유입 부위(IRES) 요소들을 이용하여 다중유전자, 폴리시스트론(polycistronic), 메시지를 창출할 수 있다. IRES 요소들은 5' 메틸화된 Cap 의존성 해독을 위한 리보좀 스캐닝 모델을 통과하는 능력이 있어, 내부 위치에 해독을 시작한다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스(급성회백수염 및 뇌척수심근염) 패밀리의 두 구성원에서 취한 IRES (Pelletier and Sonenberg, 1988)를 설명하며 포유류 메시지에서 취한 IRES (Macejak and Sarnow, 1991) 및 추가 서열 뿐만 아니라 변형된 형태도 본 발명에 포함된다. IRES 요소들은 이형성 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임은 함께 전사될 수 있는데, 각각 IRES에 의해 분리되어 있고, 폴리시스트론 메시지를 만든다. IRES 요소에 의해 각 오픈 리딩 프레임은 효과적인 해독을 위해 리보좀에 접근할 수 있다. 다중 유전자들은 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인헨서를 이용하여 효과적으로 발현될 수 있고(U.S. Patents 5,925,565; 5,935,819; PCT application PCT/US99/05781), 본 발명에서 계획할 수도 있다. 리포터와 원하는 유전자의 (IRES의 상류 또는 하류) 순서는 본 발명에서 중요하지 않다. 하나 이상의 원하는 유전자가 연결될 수도 있다.
4. 선별가능한 표식
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 구조는 발현 벡터에서 선별가능한 표식을 포함시켜 in vivo 또는 in vitro에서 분리 또는 선택가능하다. 선별가능한 표식은 발현 벡터를 포함하는 세포의 동정, 분리 또는 선택을 용이하게 하도록 세포에 확인가능한 특징을 부여한다. 양성적 선별가능한 표식은 선별을 위해 마커가 존재하는 것을 말하고, 음성적 선별가능한 표식은 이 표식이 존재하면 선별되지 않는 것이다. 양성적 선별가능한 표식은 약물 저항성 마커이다. 선택가능한 그리고 스크리닝가능한 마커는 당업자에 잘 공지되어 있다.
5. 발현 카세트의 다른 요소들
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 원래 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 접합(splicing)을 실시한다. 게놈 진핵 서열을 포함하는 벡터는 단백질 반현을 위한 전사체의 적절한 프로세싱을 위해 도너(donor) 또는 어셉터(acceptor) 접합 부위가 요구된다(Chandler et al, 1997). 전사체의 적절한 폴리아데닐화반응을 위해 발현 구조체에 폴리아데닐화 시그날이 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 시그날의 성질은 본 발명의 성공적인 실행에 중요한 것으로 보지는 않으며, 임의 서열이 이용될 수 있다. 특이적 구체예에는 SV40 폴리아데닐화 시그날을 포함하거나 또는 소 생장 호르몬 폴리아데닐화 시그날을 포함하고, 다양한 표적 세포에서 기능을 잘 하는 것으로 공지된 것들이 포함된다. 발현 카세트의 요소로써 전사 종료 부위를 고려할 수 있다. 이들 요소들이 메시지 수준을 강화시키거나 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 구조체는 최소한 한 개의 종료 시그날로 구성된다. "종료 시그날" 또는 "종료물질"은 RNA 폴리메라제에 의해 RNA 전사체의 특이적 종료와 연관된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 구체예에서, RNA 전사체의 생산을 중단시키는 종료 시그날을 생각할 수 있다. 종료물질은 in vivo에서 원하는 메시지 수준을 수득하는데 필수적이다. 진핵 시스템에서, 종료물질 부분은 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 신규한 전사체의 부위-특이적 절단을 허용하는 특이적 DNA 서열로 구성될 수 있다. 이는 전사체의 3' 단부에 특화된 내생 폴리메라제가 200개 A 잔기(polyA)를 추가하도록 신호를 보낸다. 이와 같은 폴리A 꼬리를 가지는 변형된 RNA 분자는 좀더 안정적이고 좀더 효과적으로 해독되는 것으로 보인다. 따라서, 진핵세포와 관련된 다른 구체예에서, 종료물질은 RNA를 절단하는 시그날로 구성되는 것이 바람직하고, 종료물질 시그날이 메시지의 폴리아데닐화반응을 촉진시키는 것이 바람직하다. 종료물질 및/또는 폴리아데일화 부위 요소는 메시지 수준을 강화시키고, 카세트로부터 다른 서열로 판독을 최소화시키는 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 고려되는 종료물질은 여기에서 설명된 전사 종료물질 또는 당분야에 공지된 것이 포함되는데, 소 생장 호르몬 종료물질 또는 바이러스성 종료 서열예를 들면, SV40 종료물질와 같은 유전자의 종료 서열을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 특정 구체예에서 종료 시그날은 서열 절두로 인하여 전사성이 결여되거나 전사 서열이 결여될 수 있다.
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해서는 하나 또는 그 이상의 복제 부위("ori"라고 함)를 포함할 수 있는데, 이는 복제가 개시되는 특이적 핵산 서열이다. 또는 숙주세포가 이스트이면, 자체 복제가능한 서열 (ARS)을 이용할 수 있다.
B. 핵산 및 유전자
본 발명의 특정 구체예에는 관심 유전자라고 하는 원하는 한 개 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열에 관계한다. 예를 들면 관심 유전자에 재조합 GPCR을 인코드하는 핵산이 작용가능하도록 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서는 세포를 영상화시키는 방법에 관계하는데, 이때 이 방법은 세포에 영상 성분을 인코드하는 핵산을 운반하는 방법이다. 당분야에 공지된 임의 핵산 또는 유전자도 세포로 핵산을 운반하는 방법에 포함시킬 수 있다. "유전자"는 간단하게 기능적 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드-인코딩 단위이며, 유전적으로 인코드된 유전자의 엑손 및 인트론을 포함하는 게놈 단편만을 언급하지는 않는다. 따라서, 유전자는 특정 유전자 위치와 연합된 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 말한다.
본 발명의 측면에는 감지가능한 또는 치료요법적 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 또는 유전자를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 유전자는 치료요법적, 또는 치료요법적 유전자이다. "치료요법적 유전자"는 질병의 치료 또는 예방을 목적으로 개체에 투여될 수 있는 유전자이다. 예를 들면, 치료요법적 유전자는 당뇨병 또는 암의 치료 또는 예방을 위해 개체로 투여될 수 있는 유전자이다. 치료요법적 유전자의 예로는 Rb, CFTR, pi 6, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-I, zacl, scFV ras, DCC, NF-I, NF-2, WT-I, MEN-I, MEN-II, BRCAl, VHL, MMACl, FCC, MCC, BRCA2, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-I l IL- 12, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나제, mda7, fusl, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP, p53, ABLI, BLCl, BLC6, CBFAl, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSl, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLl, MYCN5 NRAS, PIMl, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, YES, MADH4, RBl, TP53, WTl, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, Rapl A, 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase), Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-I, DPC-4, FHIT, PTEN, INGl, NOEYl, NOEY2, OVCAl, MADR2, 53BP2, IRF-I, Rb, zacl, DBCCR-I, rks-3, COX-I, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras , myc , neu , raf , erb . fms , trk , ret, gsp , hst , abl, ElA, p300, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘(thrombospondin), BAI-I, GDAIF, 또는 MCC을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
본 발명의 특정 구체예에서, 치료요법적 유전자는 종양 억제물질 유전자이다. 종양 억제물질 유전자는 세포에 존재하는 경우에 세포의 종양성, 악성 또는 과다증식성 표현형을 감소시키는 유전자이다. 이 정의에는 종양 억제물질 유전자의 전장 핵산 서열 뿐만 아니라 전장 서열에서 유도된 임의 길이의 서열도 포함된다. 또한 이 서열에는 특이적 숙주 세포에 코돈 선호성을 제공하기 위해 도입되는 고유 서열의 축퇴성(degenerate) 코돈도 포함된다.
본 발명의 정의에 따라 종양 억제물질 핵산의 예로는 APC, CYLD, HIN-I, KRAS2b, pl6 pl9, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈, Skp2, BRCA-I, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MENl, MEN2, MTSl, NFl, NF2, VHL, WRN, WTl, CFTR, C-CAM, CTS-I, zacl, scFV, MMACl, FCC, MCC, 유전자 26 (CACNA2D2), PL6, 베타* (BLU), Luca-1 (HYALl), Luca-2 (HYAL2), 123F2 (RASSFl), 101F6, 유전자 21 (NPRL2), SEM A3 폴리펩티드 및 FUSl을 인코드하는 유전자를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 다른 예시적인 종양 억제물질 유전자는 www.cise.ufl.edu/~yyl/HTML-TSGDB/Homepage.litml.의 종양 억제물질 유전자 사이트에 있는 데이터베이스에서 설명하고 있다. 이 데이터베이스를 본 발명에서 참고로 하기 위해 첨부한다. 상기에서 논의된 바와 같은 종양 억제물질 유전자를 인코드하는 핵산에는 종양 억제물질 유전자, 핵산(예를 들면, 각 종양 억제물질 아미노산 서열의 활성 단편을 인코드하는 cDNAs, cRNAs, mRNAs, 서브서열) 뿐만 아니라 이들 서열로 구성된 벡터를 포함한다. 당업자는 본 발명에 이용할 수 있는 종양 억제물질 유전자에 대해 잘 인지하고 있을 것이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 치료요법적 유전자는 아포프토시스(예를 들면, 프로-아포프토시스 유전자)를 유도하는 유전자이다. "프로-아포프토시스 유전자 아미노산 서열"은 세포에 존재할 때 아포프토시스를 유도하거나 촉진시키는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명은 당분야에 공지된 임의 프로-아포프토시스도 포함된다. 예시적인 프로-아포프토시스 유전자에는 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag- 1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PERP, bad, bcl-2, MSTl, bbc3, Sax, BIK, BID, mda7 등이 포함된다. 당업자는 프로-아포프토시스 유전자 및 본 발명의 방법 및 조성물에 응용할 수 있는 여기에서 명시되지 않은 다른 유전자들에 대해서도 인지할 수 있을 것이다.
치료요법적 유전자는 사이토킨을 인코드하는 유전자가 될 수 있다. '사이토킨'은 세포간 중개물질로써 다른 세포에서 작용하는 한 세포군에서 방출되는 단백질의 일반 명칭이다. "사이토킨"은 세포에 존재하는 경우에 사이토킨의 기능의 일부 또는 전부를 유지시키는 폴리펩티드이다. 이와 같은 정의에는 전장 서열 뿐만 아니라 전장 서열에서 유도된 임의 길이의 서열도 포함된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 특정 숙주 세포에서 코돈 선호를 제공하기 위해 도입될 수 있는 고유 서열의 축중 코돈도 서열에 포함된다.
사이토킨의 예로는 림포킨, 모노킨, 생장 인자 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨중에는 사람 생장 호르몬, N-메티오닐 사람 생장 호르몬, 소 생장 호르몬과 같은 생장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 레락신(relaxin); 프로레락신(prorelaxin); 당단백질 호르몬 예를 들면, 난소 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 호르몬 (LH); 간 생장 인자; 프로스타글란딘, 섬유아세포 생장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐, OB 단백질; 종양 괴사 인자-α 및 -β 물레리안(mullerian)-저해 물질; 생쥐 고나도트로핀-연합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 맥관 내피세포 생장 인자; 인테그린; 트롬보포에틴(TPO); 신경 생장 인자 예를 들면, NGF-β 혈소판-생장 인자; 형질변형 생장 인자 (TGFs) 예를 들면, TGF-α 및 TGF-β 인슐린-유사 생장 인자-I,-II; 에리트로포에틴(EPO); 골유도인자; 인터페론 예를 들면, 인터페론-α, -β, -γ: 결장 자극 인자(CSFs) 예를 들면, 마크로파아지-CSF (M-CSF); 과립세포-마크로파아지-CSF (GM-CSF); 과립세포-CSF (G-CSF); 인터루킨(IL) 예를 들면, IL-I, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-24 LIF, G-CSF5 GM-CSF, M- CSF, EPO, 키트-리간드 또는 FLT-3가 포함된다.
치료요법적 유전자의 다른 예로는 효소를 인코드하는 유전자가 포함된다. 예를 들면, ACP 데세튜라제(desaturase), ACP 하이드록시라제, ADP-포도당 피로포릴라제, ATPase, 알코올 디하이드로게나제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카타라제, 셀롤라제, 사이클로옥시게나제, 디카르복실라제, 덱스트리나제, 에스테라제, DNA 폴리메라제, RNA 폴리메라제, 히알루론 합성효소, 갈락토시다제, 글루카나제, 포도당 산화효소, GTPase, 헬리카제, 헤미셀룰라아제, 히아루로니다제, 인테그라제, 인버타제, 이소메라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시게나제, 리아제, 라이소자임, 펙틴아스테라제, 퍼옥시다제, 포스파테이즈, 포스포리파제, 포스포릴라제, 폴리갈락투로나제, 프로테나제, 펩티다제, 풀라나제, 리콤비나제, 역전사효소, 토포이소메라제, 실라네이즈, 리포터 유전자, 인터루킨, 또는 사이토킨이 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
치료요법적 유전자의 추가예로는 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트란스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 퓨마릴아세토아세테이트 하이드로라제, 페닐알라닌 하이드록시라제, 알파-1 안티트립신, 포도당-6-포스파테이즈, 저밀도-지방단백질 수용체, 포르포빌리노겐 디아미네이즈, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-합성효소, 분지쇄 케토산 디카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복시라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 디하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실라제, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, H-단백질, T-단백질, Menkes 질환 구리운반 ATPase, Wilson 질환 구리-운반 ATPase, 사이토신 디아미네이즈, 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제, 갈락토즈-1-포스페이트 우리딜트란스퍼라제, 페닐알라닌하이드록시라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, α-L-이두로니다제, 포도당-6-포스페이트 디하이드로게나제, HSV 티미딘 키나제, 또는 사람 티미딘 키나제를 인코드하는 유전자가 포함된다.
치료요법적 유전자에는 호르몬을 인코드하는 유전자 또한 포함된다. 생장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 황체 호르몬, 난포-자극 호르몬, 섬모막성 생식호르몬(chorionic gonadotropin), 갑상선-자극 호르몬, 렙틴, 아드레노코르티코트로핀, 앙지오텐신 I, 앙지오텐신 II, β-엔돌핀, β-멜라닌형성세포 자극 호르몬, 콜사이토키닌, 엔도테린 I, 갈라닌, 위 저해제성 펩티드, 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀, 뉴로피신(neurophysins), 소마토스태틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, β-칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 악성 인자의 고칼슘혈증, 부갑상선 호르몬-관련 단백질, 글루카곤-유사 펩티드, 판크레아스틴, 췌장 펩티드, 펩티드 YY, PHM, 시크레틴, 혈관활성 내장 펩티드, 옥시토신, 바소프레신, 바소토신, 엔케팔리나미드(enkephalinamide), 메토로피나미드(metorphinamide), 알파 멜라닌 형성세포 자극호르몬, 심방성 나트륨이뇨(atrial natriuretic) 인자, 아밀린, 아밀로이드 P 성분, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 생장 호르몬 방출g 인자, 황체화 호르몬-방출호르몬, 신경펩티드 Y, 물질 K, 물질 P, 또는 티로트로핀 방출 호르몬을 포함하나 에에 국한되지 않은 물질을 인코드하는 유전자가 포함된다.
당업자가 인지하는 바와 같이, "치료요법적 유전자"에는 게놈 서열, cDNA 서열, 그리고 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현시키거나 발현시키기에 적합하도록 된 작은 조작된 유전자 단편을 포함한다. 치료요법적 유전자를 인코딩하는 핵산 분자는 약 5 내지 약 12000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기쌍의 연속 핵산 서열로 구성될 수 있다.
"다른 코딩 서열에서 실질적으로 분리된"이란 핵산 단편의 코딩 부분의 일부를 형성하는 소요의 유전자를 말하고, 이들 단편에는 큰 크로모좀 단편 또는 다른 기능적 유전자 또는 cDNA 코딩 부분과 같은 자연-발생적인 코딩 핵산의 많은 부분을 포함하지 않는다. 물론, 이는 원래 분리된 핵산 단편을 말하지만, 사람의 조작에 의해 단편에 추가되는 유전자 또는 코딩 부분을 배제하지 않는다.
"치료요법적 유전자"의 정의에는 "생물학적으로 기능적 등가"인 치료요법적 유전자도 포함한다. 따라서, 치료요법적 유전자의 아미노산과 동일한 또는 기능적으로 등가인 아미노산의 약 70% 내지 약 90% 상동성을 가지는 서열은 단백질의 생물학적 활성이 유지된다는 조건을 가진다면 생물학적으로 기능적 등가의 서열이 될 수 있다.
C. 핵산의 운반
본 발명의 측면에는 운반되는 핵산 단독 또는 제2촬영 또는 치료제와 복합된 핵산을 감지하는 것이 포함된다. 특정 구체예에서, 운반되는 핵산은 본 발명의 재조합 GPCR이며, 특정 구체예로는 SSTR이다.
1. 바이러스성 벡터
본 발명의 특정 구체예는 세포로 핵산을 운반하기 위한 운반 비이클을 포함하는 조성물에 관계한다. 당업자는 세포로 핵산을 운반하기 위해 운반 비이클을 이용한다는 것은 당분야에 잘 공지된 사실이므로 잘 인지할 것이다. 특히 "바이러스성 벡터"을 이용하는 기술이 잘 공지되어 있다. 바이러스성 벡터는 (a)발현 카세트를 패키징하는 것을 지원하고; (b) 클론된 재조합 유전자 구조체를 궁국적으로 발현시키기 위해 충분한 바이러스성 서열을 포함하는 구조체를 의미한다.
핵산을 운반하는 한 가지 방법은 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA로 결합되는 능력이 적은 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달 효율이 높다.
아데노바이러스는 현재 임상 세팅에서 유전자 전달에 가장 흔히 이용된다. 이들 바이러스의 장점 가운데, 분열 및 비-분열 세포에 모두 유전자 전달이 효율적이고, 상당한 양을 생산한다는 것이다. 벡터는 유전적으로 조작된 아데노바이러스 (Grunhaus et ah, 1992)로 구성된다. 레트로바이러스와는 대조적으로, 숙주 세포의 아데노바이러스성 감염으로 염색체 통합이 이루어지지는 않는데, 그 이유는 아데노바이러스성 DNA가 유전적 독성없이 에피좀 방식으로 복제할 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정적이고, 게놈 재배열은 상당한 증폭후에도 감지되지 않았다.
아데노바이러스는 특히 유전자 전달 벡터로 유용한데, 그 이유는 중간 정도 크기의 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 광범위한 표적 세포 범주 및 높은 감염성 때문이다. 당업자는 아데노바이러스성 벡터를 이용하는 실험 방법에 대해 익숙할 것이다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결손이거나 최소한 조건적 결손이며, 아데노바이러스 벡터 성질이 본 발명의 성공적인 실행에 중요하다고 보지는 않는다. 아데노바이러스는 42개의 공지된 상이한 혈청타입 또는 서브그룹 A-F중 임의의 것이 되거나 다른 혈청 타입 또는 서브그룹도 고려할 수 있다. 본 발명에 이용하기 위한 조건성 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 얻기 위해서 서브그룹 C의 아데노바이러스 타입 5가 적절한 출발 물질이다. 아데노바이러스 타입 5는 생화학적 그리고 유전학적 정보의 대부분이 공지된 사람 아데노바이러스이기 때문이다. 그리고 벡터로써 아데노바이러스를 이용하는 대부분의 구조체에 조직학적으로 이용되어왔다. 아데노바이러스 생장 및 조작은 당분야에 공지된 것이고, in vitro 및 in vivo 광범위한 숙주 범주를 가진다. 변형된 바이러스, 예를 들면 CAR 도메인이 변형된 아데노바이러스를 이용할 수도 있다. 바이러스의 리포좀 포집과 같은 운반 강화 또는 면역 반응의 면책을 위한 방법도 고려할 수 있다.
레트로바이러스는 역전사과정을 이용하여 이들의 RNA를 이중 가닥 DNA로 전환시키는 능력을 이용하는 단일 가닥 RNA 바이러스 군이다 (Coffin, 1990). 따라서, 생성된 DNA는 프로바이러스로써 세포 염색체에 안정적으로 결합하여 바이러스성 단백질을 합성한다. 통합으로 수용체 세포와 그의 후손들에게 바이러스성 유전자 서열을 보유하도록 하게 한다. 레트로바이러스성 게놈에는 바이러스성 게놈의 5' 및 3' 단부에 존재하는 두가지 긴 말단 반복부위(LTR)이 포함된다. 여기에는 숙주 세포 게놈으로 통합에 필요한 강력한 프로모터 및 인헨서 서열도 포함된다. (Coffin, 1990).
레트로바이러스성 벡터를 작제하기 위해, 원하는 유전자 또는 핵산을 인코드하는 핵산을 특정 바이러스성 서열 위치에서 바이러스성 게놈으로 삽입시켜 복제-결손 바이러스를 생산한다. 당업자는 레트로바이러스성 벡터를 작제하는데 이용할 수 있는 공지된 기술에 대해서는 숙지할 것이다.
아데노-연합 바이러스(AAV)는 본 발명에서 이용할 수 있는 매력적인 벡터 시스템인데 그 이유는 통합 빈도가 높고, 비-분열 세포에도 감염될 수 있어, 조직 배양물의 포유유 조직으로 유전자를 전달하는데 유용하다(Muzyczka, 1992). AAV는 광범위한 감염성(Tratschin, et al, 1984; Laughlin, et al, 1986; Lebkowski, et al, 1988; McLaughlin, et al, 1988)을 가지는데 이는 본 발명에 이용될 수 있다는 것이다. rAAV 벡터의 생성 및 이용에 관해서는 U.S. 특허 5,139,941 및 4,797,368에서 설명하고 있으며 참고문헌으로 첨부한다.
전형적으로, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 두 개의 AAV 말단 반복체 측면에 원하는 유전자를 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al, 1988; Samulski et al, 1989; 참고문헌으로 첨부한다)와 말단 반복부위 없이 와일드타입 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드, 예를 들면 pIM45(McCarty et al, 1991; incorporated herein by reference)를 공동형질감염시켜 만든다. 당업자는 AAV 바이러스를 이용하여 벡터를 생산하는 기술에 대해서는 숙지할 것이다.
허피스 심플렉스 바이러스 (HSV)는 뉴우런 세포에 대한 굴성(tropism)으로 인하여 신경계 질환을 치료하는데 상당한 흥미를 유발시키지만, 이들 벡터는 주어진 숙주 다양성으로 인해 다른 조직 치료에 대해서도 연구될 수 있다. HSV를 매력적인 벡터로 만드는 또 다른 인자는 게놈의 크기와 조직이다. HSV는 크기 때문에, 다중 유전자 또는 발현 카세트를 결합시키는 것은 다른 더 작은 바이러스성 시스템보다는 문제가 적다. 또한, 다양한 성능(임시, 강도 등)을 가지는 상이한 제어 서열의 이용성이 다른 시스템보다 더 많이 발현을 제어할 수 있도록 한다. 바이러스는 상대적으로 적은 접합 메시지를 가지기 때문에 유전적으로 조직이 용이한 장점이 있다.
HSV는 또한 상대적으로 조직이 용이하고 높은 역가로 생장시킬 수 있다. 따라서, 충분한 MOI를 얻는데 필요한 용적 및 반복 투여에 필요성 감소에 대해서 모두 운반은 문제가 되지 않는다. HSV의 유전자 요법 벡터로의 이용에 대해서는 Glorioso et al (1995)을 참고로 한다. 당업자는 HSV를 벡터로 사용하는 것에 대해 충분히 인지할 것이다.
박시니아(Vaccinia) 바이러스 벡터는 작제의 용이성, 상대적으로 높은 수준의 발현, 광역의 숙주 범위, DNA 운반 능력이 큰 것과 같은 이유로 상당히 많이 이용되어 왔다. 박시니아는 두드러진“A-T" 선호를 나타내는 약 186 kb의 선형 이중가닥의 DNA 게놈을 포함한다. 약 10.5kb의 역전된 말단 반복체가 게놈 측면에 있다.
본 발명의 구조체로써 다른 바이러스성 벡터를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 폭스바이러스와 같은 바이러스에서 유도된 벡터를 이용할 수도 있다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스의 분자학적으로 클론된 균주는 이형성 바이러스 단백질 발현을 위한 복제 컴피턴스 백신 벡터로 유전학적으로 정제할 수 있다(Davis et al, 1996). 연구에 따르면, VEE 감염은 강력한 CTL 반응을 촉진시키고, VEE가 면역화반응에 상당히 유용한 벡터가 될 수 있다는 것을 제시한다(Caley et al, 1997). VEE 바이러스는 본 발명에서 수지상(dendritic) 세포를 표적으로 하는데 유용한 것으로 본다.
폴리뉴클레오티드는 특이적 결합 리간드를 발현시키도록 조작된 바이러스성 벡터내에 수용시킬 수 있다. 따라서 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합할 수 있을 것이고, 세포로 내용물을 운반시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적을 위해 고안된 새로운 방법은 바이러스성 외피에 락토즈 잔기를 화학적으로 추가하여 레트로바이러스를 화학적으로 변형시켜 개발한 것이다. 이와 같은 변형으로 시알로당단백질 수용체를 통하여 간세로의 특이적 감염을 허용한다.
재조합 레트로바이러스의 표적화의 또 다른 방법은 레트로바이러스성 외피 단백질 및 특이적 세포 수용체에 대해 바이오티닐화된 항체를 이용하도록 고안된 것이다. 항체를 스트렙토아비딘을 이용하여 바이오틴 성분을 통하여 결합시킨다(Roux et al, 1989). 주요조직적합성 복합체 I 및 II 항원에 대한 항체를 이용하여, in vitro에서 엑토크로피성 바이러스로 이들 표면 항원에 구멍을 뚫은 다양한 사람 세포 감염을 설명한다(Roux et al, 1989).
2. 비-바이러스성 벡터
본 발명에서는 세로내로 핵산을 전달시키는 몇 가지 비-바이러스성 방법을 고려한다. 이들 방법에는 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al, 1990) DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 전기천공 (Tur-Kaspa et al, 1986; Potter et al, 1984), 직접 주사(Harland and Weintraub, 1985), DNA-로딩된 리포좀(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al, 1979) 및 리포펙틴-DNA 복합체, 폴리아미노산, 세포 초음파 파쇄(Fechheimer et al, 1987), 고속 미세입자(microprojectiles)를 이용한 유전자 투하(Yang et al, 1990), 폴리양이온(Bousssif et al, 1995) 및 수용체-중개된 전이감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)가 포함된다. 이들 기술중 일부는 in vivo 또는 ex vivo 이용에 성공적으로 이용할 수 있는데 적합할 수 있다. 당업자는 비-바이러스성 벡터를 사용하는 것을 포함하는 기술을 인지할 것이고, 여기에서 언급한 것이외의 다른 타입의 비-바이러스성 벡터도 본 발명에서 고려할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 발현 카세트를 리포좀 또는 지질 조성물에 포집시킬 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막과 내쪽 수용성 매체를 특징으로 하는 소포 구조이다. 다층라멜라 리포좀은 수용성 매체에 의해 구별되는 다중 지질을 가진다. 리포펙타민과 복합된 유전자 구조체를 고려할 수 있다(Gibco BRL). 당업자는 리포좀 및 지질 조성물을 이용하는 기술에 익숙할 것이다.
지질계 비-바이러스성 조성물은 아데노바이러스성 유전자 요법에 또 다른 선택성을 제공한다. 많은 세포 배양물 연구에서 지질계 비-바이러스성 유전자 전달에 대해 자료 제공이 있었지만, 지질계 조성물을 통한 전신 유전자 전달에 대해서는 제한적이다. 비-바이러스성 지질계 유전자 전달의 주요 한계는 비-바이러스성 운반 비이클로 구성된 양성 지질의 독성이다. 리포좀의 in vivo 독성은 in vitro 및 in vivo 유전자 전달 결과간에 차이를 부분적으로 설명한다. 이와 같은 모순된 데이터에 기여하는 또 다른 인자는 혈청 단백질의 유무에서 리포좀의 안정성 차이다. 리포좀과 혈청 단백질간의 상호작용이 리포좀의 안정성 특징에 상당한 영향을 가진다(Yang and Huang, 1997). 양이온성 리포좀은 음전하를 띈 혈청 단백질을 끌어당겨 이에 결합한다. 혈청 단백질에 의해 피복된 리포좀을 용해시키거나 마크로파아지에 취입되게 하여 순환계로부터 이들을 제거하게 된다. 현재 in vivo 리포좀 운반 방법은 피하, 피내, 종양내, 두 개내 주사를 이용하여 순환계에서 양이온성 지질과 연관된 독성 및 안정성 문제를 피한다. 리포좀과 혈장 단백질의 상호작용은 in vitro (Feigner et al, 1987) 및 in vivo 유전자 전달(Zhu et al, 1993; Solodin et al, 1995; Thierry et al, 1995; Tsukamoto et al, 1995; Aksentijevich et al, 1996)의 효율성 상이의 원인이 된다.
지질 조성물 생산은 (i)역상 증발, (ii) 탈수화-재수화, (iii) 계면활성제 투석, (iv)박층 수화후에 리포좀 혼합물의 소니케이션 또는 연속 압출을 통하여 만들 수 있다. 일단 만들어지면, 지질 구조를 순환계내에 독성(화학치료요법제) 또는 불안정한(핵산) 화합물을 포집하는데 이용할 수 있다. 리포좀을 이용한 포집은 이와 같은 화합물의 독성을 더 낮추고, 혈청 반감기를 더 길게한다(Gabizon et al,1990). 다양한 질환 치료는 지질계 유전자 전달 전력을 이용하여 통상적 또는 새로 정립된 요법 특히 과증식성 질환 치료를 위한 특정 요법을 강화시키는 것이다.
IV. 복합 요법
본 발명의 한 측면은 개체에서 세포를 치료하는 청구된 방법을 또 다른 물질 또는 방법과 복합하여 이용할 수 있다는 것이다. 특정 구체예에서, 질환은 암이며, 다른 물질 또는 요법은 또 다른 항-암제 또는 항-암 요법이다. 청구된 이중치료요법적 물질을 이용한 치료가 선행되거나 수분 내지 수주의 간격을 두고 다른 요법에 이어서 할 수 있다. 또 다른 물질을 투여하는 구체예에서, 시간의 간격은 각 운반 시간사이를 넘어서지 않고, 이로써 물질들은 세포에서 유익하게 복합된 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 예를 들면, 본 발명의 이중 치료요법제와 한 물질의 2, 3, 4 또는 그 이상의 약량을 실질적으로 동시에(약 1분이내) 투여하는 것도 고려할 수 있다. 또 다른 측면에서, 치료요법적 물질 또는 방법은 이중 치료제 또는 본발명의 물질의 투여 전 또는 후 약 1분 내지 약 48시간내에 투여하거나 또는 여기에서 제시되지 않은 시간 전 또는 후에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중 치료요법적 물질은 외과술 또는 유전자 요법과 같은 또 다른 치료양식 투여 전 또는 후 약 1일 내지 약 21일이내에 투여할 수 있다. 일부 상황에서는 각 투여간에 수주(약 1 내지 8주 또는 그 이상)와 같이 치료를 위한 시간 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수도 있다.
다양한 복합 방법이 이용될 수 있는데, 이중 화학요법 및 방사능 요법용 청구 물질을 유도체 "A", 임의 다른 치료제 또는 방법이 될 수 있는 제2 물질을 "B"라고 하였을 때:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 본 발명의 이중 치료요법적 물질의 투여는 이들 물질의 있을 수 있는 임의 독성을 고려하여 화학치료제 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따른다. 치료 사이클은 필요에 따라 반복할 수 있을 것으로 기대한다. 다양한 표준 치료법 뿐만 아니라 외과적 중재를 치료요법과 복합하여 사용할 수 있다. 이와 같은 요법에는 추가 약물 요법, 화학요법, 추가 방사능요법, 면역요법, 유전자 요법 및 외과술이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
A. 화학요법
암 치료법은 화학적 그리고 방사능계 치료와 함께 다양한 복합요법을 포함한다. 화학요법에는 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄포토테신, 이포파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로조우레아, 디악티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 엑토포시드(VP 16), 타목시펜, 라옥시펜, 에스트로겐 수용체 결합 물질, 탁솔, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 전이효소 저해제, 트란스팔라티늄, 5-플로오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트 또는 상기 물질의 유사체 또는 유도체, 변이체를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
B. 방사능요법
DNA 손상에 원인이 되며 상당히 광범위하게 이용된 다른 인자들은 종양세포에 γ-선, X-선, 또는 방사능동위원소를 직접 운반하는 것이다. DNA 손상시키는 다른 형태의 인자 예를 들면, 마이크로웨이브, UV-방사도 고려할 수 있다. 이들 인자들 모두 DNA, DNA 전구물질, DNA 복제 및 복구, 염색체 어셈블리 및 유지에 광범위하게 손상을 준다는 것이 일반적이다. X-선 약량 범위는 상당 시간(3 내지 4주) 매일 50 내지 200 렌트겐, 단일 투여량으로 2000 내지 6000렌트겐 범위가 된다. 방사능동위원소의 약량 범주는 상당히 가변적이며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사능의 타입 및 강도에 따라 달라진다. 세포에 사용할 때 “접촉” 및 “노출”은 치료 구조물 및 화학요법제 또는 방사능요법제가 표적 세포로 운반되거나 표적 세포에 나란하게 위치하는 것을 말한다. 세포를 죽이거나 정지시키기 위해 이들 물질 모두를 세포를 죽이거나 분열을 방지하는데 효과적인 복합량으로 세포로 운반한다.
C. 면역요법
면역치료요법적은 질병을 치료 또는 완화시키기 위해 일반적으로 면역 조절물질, 면역 효과물질 세포 및 분자를 이용한다. 특정 구체예에서, 면역 조절물질, 면역 효과물질 세포 및 분자들은 암세포를 표적으로 하여 파괴한다. 예를 들면 면역 효과물질은 종양세포 표면상에 있는 일부 마커에 특이적인 항체가 될 수 있다. 항체 단족으로 요법의 효과물질로 작용할 수도 있고, 세포를 죽이는데 실제 효과적인 다른 세포를 모을 수도 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료요법제, 방사능 뉴클레오티드, 리친 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수도 있고, 단순히 표적화 물질로 작용할 수도 있다. 또는 효과물질은 종양세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 임파세포가 될 수도 있다. 다양한 효과물질 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.
따라서, 면역요법은 유전자 요법과 함께 복합 요법의 일부로 사용될 수 있다. 복합 요법의 일반적인 방법은 하기에서 논의한다. 일반적으로, 종양 세포는 다른 주요 세포에서는 존재하지 않는 표적화용으로 사용될 수 있는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커들이 존재하고, 이들중 일부는 본 발명에 표적화에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커에는 암종배아항원, 전립선 특이적 항원, 뇨 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, 테그-72, HMFG, Sialyl Lewis 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 pi 55등이 포함된다.
D. 유전자
또 다른 구체예에서, 제2차 치료는 본 발명의 핵산 조성물과 동시에 또는 투여전 또는 투여후에 치료요법적 폴리뉴클레오티드를 투여하는 제2차 요법이다. 유전자 산물을 인코드하는 벡터와 함께 이중 치료요법제 물질을 운반하면 표적 조직에서 항-과증식 효과와 같은 복합 치료요법적 효과를 가질 것이다.
E. 외과술
암 환자의 약 60%는 일정 형태의 외과술을 받는데, 여기에는 예방용, 진단용, 단계진단용 및 치료 또는 완화 외과술이 포함된다. 치료용 외과술은 본 발명의 치료와 같은 화학요법, 방사능요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 또는 대체요법과 같은 다른 치료법과 복합되는 암 치료이다. 치료용 외과술은 종양의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절단 또는 파괴시키는 절제술이 포함된다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 말한다. 종양 절제에 추가하여, 외과술에 의한 치료에는 레이져 외과술, 저온수술, 전기수술 및 모즈수술이 포함된다. 본 발명은 표피암, 선암 또는 지엽적인 양의 정상 조직을 제거를 함께 할 수 있다.
V. 약리학적 조제물
본 발명의 특정 구체예는 조직-선별적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 in vivo에서 비-침습성 방법을 이용하여 감지가능한 리포터를 인코드하는 핵산의 약리학적으로 수용가능한 약량을 개체로 도입시키는 것과 관련된다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 핵산의 치료요법적 또는 진단학적으로 효과량으로 구성된다. “약학적 또는 약리학적으로 수용가능한” 또는 “치료요법적으로 효과적인” 또는 “진단학적으로 효과적인”은 개체, 적절하게는 사람에게 투여하였을 때 수용불가한 부작용 또는 다른 부작용을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 말한다. 치료요법적으로 효과적인 또는 진단학적으로 효과적인 조성물 준비는 본 발명의 내용에 근거하여 당업자가 잘 인지할 것이고, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 예시되어 있으며, 전문을 참고문헌으로 첨부한다. 동물(가령, 사람)에 투여하였을 때, 조제물은 FDA에서 요구하는 멸균성, 발열성, 일반적 안정성 및 순도 기준에 부합되어야 한다는 것은 인지할 것이다.
여기에서 사용된 바와 같이, “치료요법적으로 효과양으로 구성된 조성물” 또는 “진단학적 효과량으로 구성된 조성물”에는 용매, 분산 매체, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들면, 항균제, 항곰팡이제), 등장성 물질, 흡수 지연제, 염, 방부제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 방향제, 염료 및 당분야에 공지된 유사 물질 및 이들의 복합물이 포함된다. 활성 성분과 함께 사용 불가한 임의 통상적인 캐리어를 제외하고는 본 발명에 이들을 사용하는 것도 포함된다.
본 발명의 조성물은 고체, 액체, 에어로졸 형으로 투여되는지에 따라, 그리고 주사와 같은 투여경로를 위해 멸균이 필요하느냐에 따라 상이한 타입의 캐리어로 구성될 수 있다. 본 발명의 이중 영상물질 및 이중 치료제는 정맥, 경피, 동맥, 복막, 병소내, 두개골내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 기관내, 비강내, 초자내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 복막내, 피하내, 결막하, 소낭내, 점막내, 심막내, 배꼽내, 눈안, 구강, 국소, 주사, 주입, 연속 주입을 통하여 투여되거나 지질 조성물(예를 들면 리포좀)에서 세척액 또는 카테테르를 통하여 국소 관주 표적 세포로 바로 투여되거나 또는 당분야에 공지된 방법으로 상기 언급한 방법의 복합 또는 다른 방법으로 투여될 수 있다.
환자로 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 필요양은 체중, 상태의 심각서으 치료될 질병 타입, 기존의 또는 현재 치료 중재, 환자의 이디오타입 및 투여 경로와 같은 물리 또는 생리학적 인자에 의해 결정될 수 있다. 투여를 맡은 의사는 개별 환자에 적절한 양 및 조성물에서의 활성 성분의 농도를 어떠한 경우에서도 결정할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 약리학적 조성물은 이중 촬영 물질 또는 이중 치료제의 최소 0.1% 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 여기에서 유도될 수 있는 임의 범위로 구성될 수 있다. 비제한적인 실시예로써, 약량은 약 0.1 mg/kg/체중 내지 약 1000mg/kg/체중 또는 이 범주내 임의 양이 될 수 있거나 또는 투여할 때 마다 1000mg/kg/체중 이상의 양이 될 수 있다.
임의 경우에서, 조성물은 한 개 또는 그이상의 성분의 산화를 지연시키기 위한 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물 작용을 막기 위해 파라벤(예를 들면 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로잘 또는 이들의 복합물을 포함하나 이에 국한시키지 않는 다양한 항균 및 항곰팡이제와 같은 보존제를 이용할 수 있다.
본 발명의 이중 촬영 물질 및 이중 치료요법적제는 자유 염기, 자유산, 중성 또는 염의 형태로 조제될 수 있다. 약학적으로 수용가능한 염에는 수산화 나트륨, 칼륨, 암모니움, 칼슘 또는 철과 같은 무기염기에서 유도된 자유 카르복실기로 형성된 염 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로 형성된 염이 포함된다.
액체 형태의 조성물을 설명하는 구체예에서, 캐리어는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질(예를 들면, 트리글리세리드, 식물성 오일, 리포좀) 및 이들의 복합물을 포함하나 이에 국한되지 않는 용매 또는 분산 매체가 될 수 있다. 적절한 유동성은 레시틴과 같은 코딩을 이용하여 유지될 수 있고, 액체 폴리올 또는 지질과 같은 캐리어에 분산시켜 원하는 입자 크기를 유지시키거나, 하이드록시프로필셀룰로오즈와 같은 계면활성제를 이용하거나 이와 같은 방법을 복합시켜 유지시킬 수도 있다. 많은 경우에, 슈가, 염화나트륨 또는 이의 복합물과 같은 등장물질을 포함시키는 것이 바람직하다.
멸균된 주사용 용액은 필요한 경우에 상기에서 나열괸 다른 성분들의 다양한 양과 진단 또는 치료제를 적절한 양의 용매에서 결합시키고, 일반적으로 여과멸균시키면 수득된다. 일반적으로 분산액은 기본 분산 매체 또는 다른 성분을 포함하는 멸균 비이클내에 다양한 멸균된 활성 성분을 결합시켜 얻는다. 멸균 주사용액, 현탁액 또는 에멸젼을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 제조를 위한 적절한 방법은 진공-건조 또는 동결 건조 기술로 활성 성분 및 기존의 멸균 여과된 액체 배지에서 수득된 추가 원하는 성분의 분말을 얻을 수 있다. 액체 매체는 필요에 따라 적절하게 완충시켜야 하고, 우선 충분한 염 또는 포도당과 함께 주사하기 전에 등장성을 부여한다. 직접 주사용 고농축 조성물을 제조하는 것도 고려할 수 있는데, 이때 용매로써 DMSO를 이용하면 작은 면적에 활성 성분의 상당히 신속한 침투와 고농도 전달이 가능하다.
조성물은 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염으로부터 보존되어야 한다. 엔도톡신 오염은 안정한 수준 예를 들면, 0.5ng/mg 단백질미만과 같은 수준으로 유지되어야 한다.
특정 구체예에서, 주사용 조성물의 흡수 연장은 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 복합물과 같이 흡수 지연 물질 조성물을 이용하면 가능하다.
다음의 실시예는 본 발명의 적절한 구체예를 설명하는 것이다. 당업자는 다음의 실시예에 설명된 기술들은 본 발명의 실시를 잘 하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술이며, 실행시에 적절한 방식으로 구성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 설명을 근거하여, 여기에서 설명되는 특정 구체예에 많은 변화가 있을 수 있으며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 유사 또는 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예 1
기능적 그리고 해부학적 영상화에 의해 종양에서 외생(exogenous) 유전자의 발현을 비-침투적 방식으로 정량화
본 연구의 목적은 기능적(평면 및 SPECT 촬영) 그리고 해부학적(MR) 기술을 복합하여 이용하였을 때, in vivo에서 소마토스태틴 수용체 타입 2 (SSTR2) 유전자 키메라를 발현시키는 종양을 비-침투적으로 정량화할 수 있는 지를 평가하기 위한 것이다.
재료 및 방법
플라스미드
Kundra et al., 2002(본 단락 및 전체 출원에서 언급하는 특정 전문을 첨부함)에서 설명하는 것과 같이, 사람 SSTR2A 전장(full-length)을 pDisplay 벡터 (Invitrogen, Carlsbad,CA)에 막 국소화(localization) 서열 및 헤마글루티닌 A (HA) 에피토프 테그 서열의 하류에 삽입하였다.
세포 주 생산 및 특징화
HT1080 세포(사람 섬유육종, ATCC, Rockville, MD)을 Dulbecco's 변형 Eagle 배지(DMEM)(1x 글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신(GPS), 10% 태아 송아지 혈청 (FBS) 포함)에서 생장시켰다. 전이감염(transfection)을 위해, 제조업자의 지시에 따라 1μg DNA와 리포펙틴 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 1x105세포에 첨가하였다. 5시간 후에, 리포펙틴-DNA 용액을 제거하고, 세포는 생장 배지에서 배양시켰다. G418 선별후에, 단일 콜로니를 분리하였다. 각 콜로니는 효소-연결된 면역흡착검사(ELISA)를 이용하여 발현에 대해 검사하였고, 그 다음 발현을 정량화시키기 위해 개별 클론을 평가하였다. ELISA 및 수용체 결합 연구는 이미 설명된 것과 같이 실시하였다(Kundra et al, 2002).
웨스턴 블랏 분석
세포, 합류성 6-웰 접시를 Triton X-IOO-SDS 용혈 용액(0.1% 도데실 황화나트륨[SDS], 1% Triton X-100, 0.1mol/L Tris [pH 8], 0.14 mol/L 염화나트륨, 0.025% 아지드 나트륨, 0.18% 컴플리트 프로테아제 저해제[Roche])에 1시간 동안 4°C에 노출시켰다. 14,000xg에서 30분간 원심분리후, 계면활성제를 수집하였다. 종양의 경우, 샘플을 PBS로 세척하고, Triton X-100-SDS 용혈 용액으로 10회 스트록시여 균질화시켰다. 14,000xg에서 원심분리 후 15분 후에, 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 결정하였다. 세포 단백질 20㎍ 또는 조직 단백질 50㎍를 7% SDS 겔상에 각 라인에 로딩하였다. 샘플을 반건조 장치(Fisher, Atlanta, GA)를 이용하여 니트로셀룰로오즈로 옮겼다. Ponceau-S 착색을 이용하여 동일한 이동을 확인하였다. 그 다음, 막을 차단시키고, 50mU/mL HRP-rat-항-HA 항체에 하룻밤동안 4°C 또는 실온에서 1시 간 동안 노출시켰다. PBS로 10분간 세척을 4회 실시 후에, 막은 화학발광 HRP 기질로 피복시켜(Perkin Elmer Life Science, Boston, MA) 필름을 형성시킨다.
면역조직화학
파라핀에 박혀있는 종양 조직은 1:1000으로 희석된 생쥐 항-HA 항체 (Babco, Richmond, CA)로 프로브시키고, 세척하고, HRP-결합된 항-생쥐 제2 항체로 착색시켰다. 조직은 Giemsa으로 대비착색(counterstain)시킨다. 세포 주변에 갈색 반응 산물이 존재한다는 것은 융합의 양성 반응으로 간주할 수 있다.
생체 분포 및 영상화
모든 동물 실험은 기관의 동물 보호 및 이용 위원회에 승인을 받았다. 9마리 누드 생쥐(약 8주령, 25g)에, 5x106 세포를 피하로 주사하면 1주후에 손으로 만져지는 종양이 형성된다. 각 생쥐는 세가지 종양 접종을 받았다: 우측 허벅다리, 벡터로 전이감염된 세포; 우측 및 좌측 어깨, 각각 동일한 유전자 키메라를 상이한 수준으로 발현시키는 클론 309 및 301. 그 다음 9마리 생쥐중 6마리를 무작위로 선별하여 13MBq (350 μCi)의 111In-OCt(Mallinckrodt, St. Louis, Mo)를 꼬리 정맥으로 투여하였다.
24 시간 후에, 마취된 동물을 4.7 T 작은 동물 MR(Bruker, Billerica, MA) 로, T2-FSE 서열 (TE 4120 msec, TR 72 msec, 4 Nex, 필드 뷰 3.5 cm, 슬라이스 두 께 1 mm with 0.3 mm skip, 매트릭스 256 x 256, 해상도 136 미크론)을 이용하여 영상화시킨다. 종양 측정은 Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)을 이용하여 실시하였다. 종양을 가지는 각 영상에서, 덩어리의 주변을 추정하고, 그려진 부분의 면적을 계산한다. 면적을 슬라이스 두께와 스킵으로 곱하면 관심 대상을 포함하는 각 슬라이스의 부피를 구할 수 있다. 그 다음 각 슬라이스 용적을 추가한다. 그러나 부피 평균을 제어하기 위해 대상물을 포함하는 최상의 영상 부피의 절반과 최악 영상 부피의 절반만을 추가한다. 중량을 구하기 위해, 조직 밀도를 1 g/ml로 추정하여, 대상 부피 mm3를 조직 0.001g/mm3으로 곱한다. 동일한 과정을 이용하여, 종양과 비교하여 시그날이 증가된 그리고 감소된 지역으로 MR에서 확인되고, 유체-유체/찌꺼기를 포함하는 괴사/출혈성 물질을 추적하고 계산할 수 있다. 그 다음 괴사/출혈성 물질의 중량을 물질의 중량에서 빼면 수정된 중량을 계산한다.
그 다음, 중간-에너지 평행 홀 시준기(medium-energy parallel hole collimator)가 고정된 γ-카메라(mCAM, Siemens Medical Solutions, Hoffman Estates, IL)를 이용하여 10분간 평면 영상 촬영을 쥐에서 실시하였다. 감응도 교정(attenuation correction)을 이용하지는 않았다. SPECT의 경우, 15분 수집(acquisition)하였다. 영상은 시준기의 정면에 부착된 고정 1/15 rpm 회전 장치의 360도 회전에 대해 120 뷰(7.5 sec/view, 128x128, 2.4 mm/pixel)로 구성된다. 각 동물은 회전 장치에서 회전한다. SPECT 재구성을 위해, Butterworth 0.6 Nyquist, 10차 필터된-백프로젝션을 실행하였다. 평면 및 SPECT 영상에서 관심 부분의 전체 카운트 측정 부분을 관심 부분(ROI) 부분에 픽셀수로 표준화시켜 평균 카운트/픽셀을 얻는다. 평면 영상의 경우에, 이들 값을 종양이 없는 좌측 허벅다리에서 얻은 값에서 공제한다. 두가지 기술에서 값을 활성의 관련 향을 포함하는 상(phantoms)에서 유도된 식을 이용하여 분당 카운트로 전환시켰다. 상(phantoms)은 500㎕의 상이한 111n-클로라이드(93-0.3 μCi)를 포함하는 1.5 ml Eppendorf 튜브로 구성된다. 각 튜브에 유체는 생쥐에 종양의 크기와 유사하다. 각 종양을 1 내지 3개 SPECT 영상에서만 볼 수 있기 때문에, 최대 카운트를 가지는 영상을 선택하였다. 이와 같은 동일한 방법을 상(phantoms)과 함께 이용하였다. 분당 유도된 카운트를 분당 카운트에 주사된 약량으로 표준화시켜 주사된 약량 퍼센트(%ID)를 얻는다.
그 다음, 생쥐를 죽이고, 각 기관 및 종양을 잘라내어, 중량을 재고, 감마-카운터를 통하여 연합된 방사능활성을 측정한다. 유사하게, 9마리 생쥐중 나머지 3마리를 죽이고, 유전자 키메라 발현을 평가하기 위한 웨스턴 블랏팅 및 면역조직화학법을 위해 종양을 제거하였다.
방사능활성의 영향
영상을 나타내는데 있어서 방사능활성 양의 영향을 평가하기 위해, 1.5 ml Eppendorf 튜브에 0.5ml 인산완충염(111In-염화물 93 내지 0.03 μCi의 1:1 희석액 을 포함)을 채운다. 평면 촬영은 상기에서 설명드린 바와 같이 실행하였다. 다양한 배경 및 포화 디스플레이 수준을 이용하여, 영상에서 상(phantom)의 크기를 실제 상의 크기와 시각적으로 비교하였다.
통계학적 분석
Wilcoxon Rank Sum test(one sided)를 이용하여 in vtro에서의 발현을 비교하거나 또는 in vivo에서 상이한 종양 가운데 발현이 상이한 것을 취한다. 선행 회귀(regression)를 이용하여 상관관계를 분석하였다. 이 분석은 Excel (2000, Microsoft, Bellevue, Washington)을 이용하였다. SAS(2001, version 8.02, SAS Institute, Cary, N.C.)을 이용하여, Kruskal Wallis 테스트를 이용함으로써 종양에서 발현이 상이한 경향을 비교하였다. 모든 테스트에서, p<0.05는 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
결과
발현
융합 단백질의 HA 도메인의 항체를 이용하여, 전체 세포에서 ELISA(세포 수에 대해 표준화된)를 이용하여 발현을 확인하고, 세포 용해물질에서는 웨스턴 블랏 분석(단백질에해 표준화된)을 통하여 발현을 확인하였다. 동일한 SSTR2A 유전자 키메라로 트랜스펙션된 클론 주의 정량적인 ELISA(도. 1A)에서, 클론 309이 클론 301 보다 더 반응하였다. 비교를 위해, 벡터만으로 트랜스펙션된 세포에서는 반응을 볼 수 없었다. 웨스턴 블랏(도. 1B)에서 볼 수 있는 바와 같이, SSTR2A 키메라 유전자로 트랜스펙션된 세포를 제시하는 모든 주에서 별개의 뚜렷한 밴드를 관찰하였으나, 벡터만으로 트랜스펙트된 세포에서는 나타나지 않았다. 밴드는 클론 301보다는 309에서 더 뚜렷하였고, 이는 클론 309에서 발현이 더 크다는 것을 암시한다. 벡터만으로 트랜스펙트된 세포에서는 발현이 보이지 않았다.
융합단백질의 SSTR2A 부분의 적절한 기능을 확인하기 위해, 수용체-결합 검사를 실행하였다. 검사를 위해, 10-7 M 옥트레오타이드 포화량을 이용하였다(Reisine et al, 1993; Raynor et ah, 1993). HT1080 세포 클론이 동일한 융합 단백질을 발현하기 때문에 결합에서의 임의 차이는 발현량 차이때문이다. 도 1C에서 볼 수 있는 것과 같이, 111In-OCt에 대한 결합은 클론 301 보다는 309에서 더 크다. 라벨안된 소마토스태틴이 라벨된 유사체와 경쟁하기 때문에 특이성을 확인하였다. 벡터만으로 전이감염된 세포에서는 특이적 결합을 볼 수 없다. 수용체-결합 자료는 ELISA 및 웨스턴 블랏 분석에 상응한다. 따라서, 항-HA 항체에 기초한 발현 수준은 111In-OCt에 기초한 수용체-결합에 상관된다. 이들 자료에서 세포당 융합 단백질의 양이 더 많은 경우는 클론 301보다는 309이며, 융합 단백질의 HA 및 SSTR2A 는 기능을 한다는 것을 설명한다.
생체 분포
도 2에서는 6마리 누드 생쥐의 꼬리 정맥 주사 24시간후에 111In-OCt의 ex vivo 생체 분포 분석을 설명한다. 각생쥐는 클론 301, 309 또는 벡터-감염된 세포에서 유도된 세 가지 피하 종양을 보유한다. 결합안된 111In-Odt는 신장과 간을 통하여 제거되고, 생쥐에서 이용된 각 경로에 따라 다양하다. 절단된 종양에서 발견을 비교하여, 벡터 또는 유전자-키메라 트랜스펙션된 세포(벡터 versus 301, p<.05, n=6; 벡터 versus 309, p<.05, n=6)와 클론 301 및 309 (p < 0.05, n=6)에서 기원된 종양에서 생체 분포 변수 ID%의 통계학적 유의적 차이가 있었다. 따라서, 융합 단백질을 상이한 수준으로 발현시키는 종양은 침습성 생체 분포 방법에 의해 구별할 수 있다.
기능적 촬영
종양을 가지는 생쥐는 111In-OCt의 꼬리 정맥 주사 24시간 후에, 도2의 생체 분포 분석을 위해 동물을 죽이기 전에 영상화 실시한다. 대표적인 생쥐의 평면 영상(도 3A)에서 더 많은 융합 단백질을 발현시키는 클론 309에서 유도된 종양이 클론 301에서 유도된 종양에서보다 더 잘 나타났다. 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터 유도된 종양도 유사한 배경을 가지는 것으로 보인다. 국소화를 개신시키기 위해, 단층촬영 방법을 적용하였다. 대표적인 생쥐에서 유전자 발현의 SPECT 촬영으로 (도 3B, 도 3C, 도 3D)으로 융합 단백질을 발현시키는 종양을 설명하였지만, 벡터로 트랜스펙트된 세포에서 유도된 종양은 유사한 배경을 가지는 것으로 보인다. 평 면(r=.94, ρ< .05, n=18) (도 3E) 및 SPECT (r=.9O, p< .05, n=18)(도 3F) 촬영에서, 영상의 ROI 분석에서 유도된 취입(uptake)가 절단된 종양과 연관된 방사능활성과 관련이있다(계수=1.8, S.E.=.2; 계수=1.3, S.E.=.2 각각). 촬영 방법가운데 평면 및 SPECT 기술간에 상관계수는 0.96이다(ρ<.05, n=18, 계수=1.3, S.E.=.l). 그러나, 기능적 감마 카메라 영상에서 개체의 크기는 개체의 실제 크기를 반영하지 않을 수 있다.
도 3 G에서의 평면 영상은 모든 상(phantoms)이 실제 동일한 크기이지만 영상에서의 각 상(phantom)의 실제 크기는 방사능 활성의 양이 증가할수록 증가된다. 또한, 상은 방사능약물의 균질한 분포를 가지기는 하지만 각 개체의 색 표현에서 외견상 이형성이 있다.
해부학적 촬영
도 2의 생체 분포 분석를 위해 동물을 죽이기 전에 생쥐는 MR로 영상를 찍은다. 대표 생쥐(도 4A)의 골반 영상에서 종양은 중간정도(intermediate) 시그날을 가지고 이는 인접 구조와 상당한 대비를 설명한다. 단층촬영 MR 영상(도 4B)에서 전체 물질 덩어리의 용적 측정에서 유도된 중량은 절단된 종양의 중량과 상관관계가 있다(r=.98, p< 0.05, 11=18, 계수=.03, S.E.=.O6). SPECT 영상(r=0, p>.05, n=18) 또는 평면 영상에서 유도된 면적(r=0, p>.05, n=18)에서 전체 물질 덩어리의 용적 측정에서 유도된 중량과 절단된 종양의 중량 사이에는 유의적인 상관관계는 없었다.
일부 종양에서, 물질 덩어리의 연조직에서보다 더 큰 T2 시그날이 있었다(도 4C). 또한, T2 시그날이 낮은 층은 높은 시그날 부분 내에 있었고, 이는 출혈/괴사등으로 인하여 유체-유체 또는 유체-찌꺼기 수준과 일치하였다. 이들 지역에서 융합단백질을 발현시키는 살아있는 세포의 수가 상당히 포함될 것으로 기대하지 않기 때문에, 이들은 정정된 종양의 중량을 계산하는데 제외시켰다.
취입(uptake)의 비-침습성 측정
in vitro 및 in vivo 발견들의 연관은 회귀 분석을 통하여 추가 검사하였다. 잘라낸 종양을 이용하여 평가한 주사된 양%/(g)(% LD/g)의 생체 분포 변수(도 5)는 전체 종양의 중량에 대한 MR 및 취입을 결정하는 평면(r=.9O, p<.05, n=18, 계수=1.8, S.E.=.2) 또는 SPECT (r=.87, p<.05, n=18, 계수=1.5, S.E.=.2)을 이용한 비-침습성, 영상-유도된 값과 연관된다.
절단된 종양중에 111In-oct의 생체 분포는 % I.D./g의 변수를 이용한 것과는 구별된다(도 6A). MR에서 유도된 보정된 중량을 표준화시키면 종양들중에 생체 분포를 구별할 수 있다(도 6B). 이는 취입의 측정을 위한 평면(도 6C) 또는 SPECT(도 6D) 기술 또는 보정된 중량을 위한 MR을 이용하여 완전하게 영상화된 변수를 유도할 때 또한 발견된다. 도 6A, 도 6B, 도 6C, 도 6D에서 이용된 각 방법에 의해, 잘라낸 종양을 이용하거나 또는 클론 309에서 기원된 종양을 이용하여, in vivo 영상에서 유도된 변수들은 클론 301의 것들보다는 통계학적으로 유의성이 큰 발현을 가지고(ρ<.05, n=6), 벡터만으로 트랜스펙션된 세포에서 기원된 종양들보다는 111In-oct의 생체 분포가 이들 둘에서 더 컸다(벡터 versus 301, p<.05, n=6; 벡터 versus 309, p<.05, n=6). 도 6A, 도 6B, 도 6C, 도 6D(p<.05)에서 이용된 임의 방법을 이용하였을 때 Kruskal-Wallis 테스트에서도 발현에 차이가 있다는 것을 확인하였다.
Ex-vivo 발현 분석
영상화하는 같은 날에 ex-vivo 발현을 확인하기 위해 종양을 가진 세 마리 생쥐를 추가 희생시켰다. 잘라낸 종양 부위를 융합 단백질의 HA 테스 부분에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 클론 309에서 유도된 것이 클론 301에서 유도된 종양보다 발현이 더 많았다(도 7A). 벡터만으로 전이감염된 세포로부터 얻은 종양에서는 밴드를 볼 수 없었다. 면역 조직화학적 분석(도 7B)에서 클론 309에서 유도된 종양에서의 발현은 클론 301에서 유도된 종양에서보다 더 많다는 것을 확인하였다. 예상한 것과 같이, 세포 주변에서 착색을 볼 수 있는데 이는 융합단백질의 세포 막 위치와 일치한다. 벡터로 전이감염된 세포에서 유도된 종양에서 배경 착색을 볼 수 있다. 클론 및 이에서 유도된 종양에서의 발현 정도의 다양함을 나타내는 이와 같은 데이터는 in vitro 및 in vivo 발견과 일치하였다.
이와 같은 결과는 비-침습성 기능적 영상화 및 해부학적 영상화를 복합하여 이용하면 종양에서 유전자 전이를 in vivo 정량화시킬 수 있다. 또한, 이들 데이터 는 비-침습성 촬영 기준이 종양에서 유전자 발현을 위한 침습성 방법을 대체할 수 있다는 것을 설명한다. 또한, 형태학적 데이터를 이용하여 유전자 발현에 기여하지 않는 종양 부분을 확인하고 배제시킬 수 있다. 이들 데이터는 이와 같은 측정이 생쥐와 같은 작은 동물에서도 얻을 수 있다는 것을 설명한다. 생체 분포를 비-침투적으로 결정하는 기능적 그리고 해부학적 촬영 기술을 PET 및 광학적 촬영과 같은 기술 뿐만 아니라 CT와 같은 해부학적 양식등의 다른 기술에도 적용할 수 있어야 한다. 이들 기구의 대부분이 환자 평가에 이용될 수 있기 때문에 이들 기술들은 임상적 유용성을 찾아야 한다.
실시예 2
치료 유전자 발현 및 분자 클로닝을 위한 종양-선별적 hTMC 플라스미드 벡터 개발
성공적인 암 유전자 요법의 주요 장애 중에 하나는 종양을 특정하게 표적하는 효과적인 운반 시스템이 부재하다는 것이다. 종양-표적화된 유전자전이 발현을 위한 한 가지 수단은 종양-특이적프로모터를 경유한 유전자 발현 조절이다. 사람 텔로메라제 역전사효소 (hTERT)는 불사화된 세포에서 매우 활성이 높은 텔로메라제의 촉매 서브유닛이고, 사람 암의 85%이상에서 활성이 있으나, 정상 체세포에서는 비활동성이다(Shay and Bacchetti, 1997; Shayet al, 2001). hTERT 프로모터를 클론하여 정상 세포가 아닌 종양에서 트랜스유전자 발현을 선별적으로 촉진시킨다는 것을 보여주었다(Nakayama et al, 1998). 그러나, 다른 고유 포유류 프로모터와 같 이 hTERT 프로모터의 전사 촉진 강도는 CMV 및 SV40 초기 프로모터s와 같이 흔히 사용되는 바이러스성 프로모터보다 훨씬 약하다. 결과적으로 암 유전자 요법에 이를 사용하는 것에 트랜스 유전자 발현이 낮다는 것이 방해요소이다(Nakayama et al, 1998 Gu et al, 2000). 이와 같은 문제를 회피하기 위해 신규한 프로모터, hTERT-mini-CMV(hTMC)가 조작되었는데, 선택적으로 필수 hTERT 프로모터 서열을 최소 CMV 프로모터 요소와 융합시켜 만들었다. 이와 같은 신규한 프로모터를 이용하여, in vivo 및 in vitro 종양-특이성이 매우 높고, 트랜스유전자의 발현을 높였다이는 in vivo에서 hTMC-EGFP 리포터 시스템를 이용하여 설명하고 있다(도 8). 사람 N417 폐 암 종양을 가지는 생쥐에 정맥으로 다양한 EGFP-나노입자를 주사하였는데, EGFP 발현은 고유 CMV 또는 hTERT 프로모터 대(versus) hTMC 프로모터를 이용하여 유도하였다. 주사후 48시간 후에, 생쥐를 죽이고, 기관을 수거하여 바로 냉동시켰다. EGFP 발현을 확인하기 위해 냉동된 조직 단편을 형광 현미경하에서 검사하였다. hTMC-EGFP으로 처리된 동물에서의 종양 세포에서만 EGFP의 높은 발현이 감지되었고, 임의 다른 정상 조직에서는 감지되지 않았다(도 8, panel hTMC). 대조적으로, TERT-EGFP으로 처리된 동물에서 매우 약한 종양-특이적 EGFP 발현이 감지되었고, CMV-EGFP 구조체로 치리된 동물의 종양 및 정상 조직에서는 비-선별적 발현이 감지되었다.
실시예 3
in vivo에서 유전자 전달의 감마-카메라 촬영
in vivo에서 유전자 전달을 모니터하는 많은 분자 촬영 방법은 전달된 유잔 자의 생성물에 국소화된 정맥으로 주입된 방사능라벨된 화합물 감지용 감마-카메라, SPECT, 또는 PET 촬영에 의존하나 현재까지 FDA의 인체 사용 승인된 방사능 약물을 사용하거나 관심 유전자를 직접적으로 감지하지는 못한다(Yamada et al, 1992; Kundra et al, 2002). 방사능약물, 111In-옥트레오타이드를 이용하면 HT1080세포에서 SSTR2A 산물의 세포 막 국소화를 성공적으로 감지하였다. HA-SSTR2A-발현시키는 플라스미드(pHA-SSTA2A)에 전이감염된 HT1080 세포에서 산물의 세포 막 국소화는 항-HA 항체(도 9A)를 이용한 면역형광 분석으로 확인하였다. pHA-SSTR2A 전이감염체에 의해 생성된 HT1080 종양을 보유하는 생쥐에 생체 분포 확인을 위한 111In-옥트레오타이드를 주사하고, 감마-카메라를 이용하여 영상 연구하였다(도 9B). SSTR2A 발현은 수용체 결합과 종양에 의한 111In-옥트레오타이드 취입에 모두 상당히 관련된 것으로 보인다(도 9D)(Kundra et al, 2002). 이 방법으로 임상용으로 이용할 수 있는 가능성을 설명하는데, 그 이유는 유전자 전달이 사람에서 이미 사용된 것과 유사한 약량에서 111In-옥트레오타이드로 종양을 가지는 사람에서도 감지될 수 있기 때문이다. 분자 영상화를 위한 종양-특이적 이중 리포터 및 치료요법적 유전자 발현 플라스미드 벡터가 개발되었다(도 10). 이 벡터(pLJ290)에서, 플라스미드 벡터 pLJ143/FUSl의 기본 구조가 이용되었고(도 10A), 이는 Phase I 임상 시험용으로 FDA에 승인을 받았다. 고유 벡터에 리포터 유전자 SSTR2A와 치료요법적 종양 억제물질 유전자 FUSl 사이에 개량된 내부 리보좀 유입 부위(IRES)를 삽입 하여 변경시켰다(도 10C). 이로써 동일한 프로모터 제어하에 이들 유전자를 별도로 동시에 발현이 가능하며 동일한 BGH poly(A)시그날 서열을 가진다. SSTR2A 유전자(도 9D, 그린, 세포 표면 막) 및 FUSl 유전자(도 9D, Red, 미토콘드리아, ER, 주변 핵 막 위치)의 동시 발현 및 구별되는 세포하(subcellular) 국소화는 면역-형광 영상 분석을 통하여 설명하였다. pLJ290 벡터는 CMV 프로모터를 hTMC 프로모터(도. 10D, pLJ294)로 대체하여 만드는데, 이로써 SSTR2A 및 FUSl 유전자 모두에 대해 종양 특이적발현이 가능하다. 비침습성 그리고 감응성 감마-카메라 영상과 방사능 약물 111In-옥트레오타이드가 복합된 신규한 치료요법적 벡터로 생쥐 및 환자들에게 SSTR2A-FUS1-나노입자-중개된 유전자 전달의 분포, 제거, 발현 및 효과를 효과적으로 모니터할 수 있을 것이다.
실시예 4
전신 암 유전자 요법을 위해 신규한 합성 hTERT-Mini-CMV 키메라 프로모터-구동된 전이유전자의 종양-선별적 그리고 고효율 발현
유전자 요법
성공적인 암 유전자 요법에 있어서 주요 장애요소중에 하나가 원발성 및 전이 종용을 특이적으로 표적화하는 효과적인 전신 운반 시스템의 부재이다. hTERT 프로모터를 클론하여, 종양에서는 전이 유전자 발현을 표적화시킬 수 있지만, 정상 세포에서는 불가능하다는 것을 확인하였다. 그러나, 대부분의 다른 고유 포유류 프로모터와 유사하게 hTERT 프로모터의 전사 촉진 강도가 매우 약하여 암 유전자 요법에 직접적으로 사용되는 것이 제한된다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 신규한 키메라 hTERT-mini-CMV (hTMC) 프로모터가 개발되었는데, 이는 필수적인 hTERT 조절 서열을 미니멀 CMV 프로모터 요소와 융합시켜 선택적으로 만들 수 있다. 사람의 다양한 암 세포 및 정상 세포에 다양한 EGFP-구조체를 전이감염시키고, EGFP 발현은 고유 CMV 및 hTERT 프로모터에 의해 구동되거나 또는 in vitro에서 hTMC 프로모터에 의해 구동된다. 전이감염체에서 EGFP의 발현은 형광 현미경하에서 형광 이미지(FI)로 확인하고, EGFP-양성 세포군 및 형광 강도는 FACS 분석으로 정량화시킬 수 있다. 모든 종양 세포에서 hTMC 프로모터에 의해 구동된 EGFP 발현이 감지되었으나 정상 세포에서는 감지되지 않았다. hTERT 프로모터에 의해 구동되는 유사한 종양 선택성 EGFP 발현을 볼 수 있지만, 발현 수준은 동일한 전이감염 효율하에 hTMC 프로모터에 의해 구동되는 것보다는 수백배 낮다. hTMC 프로모터의 효과는 흉부내 사람 N418 폐 종양 이종이식편(xenografts)을 가지는 누드 생쥐로 DOTAP-콜레스테롤-복합체된 hTMC-EGFP-나노입자의 전신 주사에 의해 in vivo에서 평가할 수 있다. 일관되게, hTMC-EGFP 으로 처리된 동물의 종양세포에서는 EGFP 발현 수준이 높게 감지될 수 있지만, 임의 다른 정상 조직에서는 감지되지 않는다. 또한, 상기 N417 종양 생쥐 모델을 이용하여 비-침습성이며, 정량적인 MR 촬영 분석을 이용하여 신규한 hTMC-FUS1-나노입자(P<0.001)로 처리된 전신 치료의 치료요법적 효과를 평가하였다. hTMC-FUS1-나노입자로 처리된 동물에서는 처리안된 것과 비교하거나 hTMC-EGFP-나노입자으로 처리된 것과 비교하였을 때 2주이내에 종양 생장의 유의적 저해(P<O.001)가 감지되었는데, 이는 MR 촬영 및 용적 분석으로 설명된다. 또한 정상적인 폐 또는 hTMC-FUS1-나노입자으로 처리된 다른 조직에서는 감지되지 않았지만 종양 세포에서는 아포프토시스 유도 또한 감지되었는데, 이는 냉동된 조직 샘플에서 TUNEL 착색으로 in situ 세포 사멸 분석으로 설명된다. 이와 같은 결과로 in vitro 및 in vivo에서 종양 특이성이 매우 높고 고효율의 치료요법 유전자 발현을 얻기 위해 hTMC 프로모터를 이용하고, 종양 표적 분자 암 요법을 위한 치료요법적 hTMC-나노입자의 전신 투여를 이용한 해독 응용에 연루(implicate)된다.
실시예 5
신규한 hTERT 프로모터 키메라 및 in vivo 및 in vitro 촬영에 이의 이용
HA-SSTR2의 증폭된 hTERT-중개된 발현을 위한 신규한 구조체를 개발하였다. 도 11에 구조를 도시한 구조체에는 hTERT 프로모터, gal4/VP16, gal4 결합 부위 및 HA-SSTR2의 증폭된 hTERT-중개된 발현을 위한 헤마글루티닌 A 테그 및 소마토스태틴 수용체 타입 2 A(HA-SSTR2A)로 구성된 유전자 키메라를 포함한다.
또한, SSTR2A 는 C-말단 결손된 유사한 구조체도 개발하였다. in vitro 영상화에 이들 구조체의 유용성을 평가하는 연구를 실행하였다. HT1080 세포 및 IMR90 세포는 American Type Culture Collection에서 구하였다. HT1080 및 IMR90 세포의 추출물의 텔로메라제 검사는 Kim et al. 1994에 따라 실시하였다. HT1080 세포에 서 6개 염기쌍 반복 사다리는 텔로메라제 활성을 나타낸다. 이들 결과는 도 12에 나타내었다. 네가티브 콘드롤로써, HTl080 세포 추출물을 RNAse(도 12)로 처리하고, 이는 텔로메라제 활성이 없었다. 또한, IMR90 세포의 추출물은 예측한 바와 같이 텔로메라제 활성이 없었다.
HT1080 세포 및 IMR90 세포는 hTERT 프로모터 및 gal4VP16 증폭 시스템을 포함하고 있는 아데노바이러스로 감염시켰다. 세포를 면역 형광 및 ELISA을 위해 도말하고, HA-SSTR2A 융합 단백질의 HA 도메인을 표적화시키는 항체를 이용하였다.
면역 형광을 이용하여 발현된 HA-SSTR2 융합단백질의 세포 막 세포이하의 국소화를 확인하였다. 대표적인 결과는 도 13에 나타내었다. HA-SSTR2 융합단백질의 상대적으로 증가된 발현을 개별 섬유육종 세포, HTl080(도 13A)에서 볼 수 있는데, 이는 텔로메라제를 발현시키지 않는 사람 섬유아세포 IMR-90와 달리 텔로메라제를 발현시켰다. 사람 텔로메라제 프로모터 및 gal4VP16 증폭 시스템을 포함하는 아데노바이러스로 감염시키면, 텔로메라제를 발현시키지 않는 세포(IMR-90 사람 섬유아세포)(도14)보다는 텔로메라제를 발현시키는 세포(HT1080, 사람 섬유육종)에서 감염된 세포에 HA-SSTR2A 발현이 더 크다. 도 15에서는 증폭된 hTMC 프로모터에 의해 구동되면, SSTR2A 및 FUSl 발현이 연결된다는 것을 구조적으로 보여주는 플라스미드 지도를 도시하고 있다. 따라서, HA-SSTR2 또는 관련 유전자들은 치료유전자와 같은 관심 유전자와 함께 발현될 수 있다. 예를 들면, 치료요법적 유전자는 항-암 유전자 예를 들면, FUSl이 된다. 도 15에 나타낸 구조체에는 hTERT 프로모터, mini-사이토메갈로바이러스(miniCMV) 프로모터, FUSl 유전자, 내부 리보좀 유입 부 위, hTERT 중개된 HA-SSTR2, 리포터 및 FUS1의 증폭 발현을 위한 헤마글루티닌 A 테그 및 소마토스태틴 수용체 타입 2A (HA-SSTR2A)로 구성된 유전자 키메라, 관심 유전자를 포함한다. hTERT 프로모터, miniCMV 프로모터, hTERT 중개된 HA-SSTR2 만의 증폭 발현을 위한 유전자 키메라를 포함하는 다른 구조체도 만들 수 있는데, 예를 들면, mini-사이토메갈로바이러스(miniCMV) 프로모터, C-말단만 결손된 HA-SSTR2의 hTERT 중개된 발현을 증폭시키기 위해 C-말단이 결손된 헤마글루티닌 A 테그 및 소마토스태틴 수용체 타입 2A로 구성된 유전자 키메라를 포함하는 구조체를 만들 수 있다.
흉부 종양을 가지는 생쥐에서 hTERT 프로모터에 사람 miniCMV-hTERT 프로모터가 조직 특이적 발현을 증가시키는 지를 평가하기 위한 연구를 실행하였다. N417 세포에서 유도된 흉부 종양을 가지고 있는 생쥐에 플라스미드-리포플렉스(20 micrograms DNA:40 nmol DOTAP:콜레스테롤/생쥐)을 주사하였다. CMV 프로모터-강화 그린 형광 단백질 (EGFP)을 포함하는 플라스미드로 종양 및 정상 조직에서 발현을 볼 수 있다(도 16). hTERT 계 프로모터를 포함하는 플라스미드는 종양에서는 발현되나 정상 조직에서는 발현되지 않거나 최소한으로 발현된다(도 16). hTMC 프로모터에 의해 비-증폭된 hTERT 프로모터에서보다 조직 특이적 발현이 더 크다(도 16). 다양한 조직의 냉동 단편을 4% 포름알데히드에 고정시키고, EGFP의 발현은 형광 현미경을 이용하여 검사하였다. 도 16에 대표적인 영상을 나타내었다.
상기에서 설명한 바와 같이, hTMC 또는 CMV 프로모터에 의해 구동되면 SSTR2A 및 FUSl의 발현이 모두 연결될 수 있다. 따라서, HA-SSTR2 또는 관련된 유 전자들은 치료요법 유전자 FUS1과 같은 유전자와 함께 발현될 수 있다. 폐 암 세포 H1299로 전이감염된 CMV 프로모터 HA-SSTR2 삽입체를 포함하는 플라스미드에 의해 HA-SSTR2 융합 단백질이 발현된다(도 17). hTMC 프로모터 FUS1-HA-SSTR2 삽입체로 전이감염된 폐 암세포 H1299 세포는 HA-SSTR2 융합 단백질 및 FUS1을 모두 발현시킨다(도 17). H1299 세포는 일시적으로 전이감염시키고, 72시간 후에 형광 측정을 한다. HA-SSTR2 융합 단백질은 HA-도메인을 표적화하는 항체를 이용하여 볼 수 있으며, 세포 막에서 예측한 바와 같이 발현을 볼 수 있다. FUS1은 FUS1에 대한 항체로 확인할 수 있다. 오버레이(overlay)는 FUSl 및 HA-SSTR2가 내부 리보좀 유입 부위(IRES)를 통하여 연결될 때 핵 착색 및 HA-SSTR2(CMV-HA-SSTR2) 콜리니형성 또는 핵 착색, HA-SSTR2, 및 FUS1의 콜리니형성을 설명한다(도17).
실시예 6
GAL4-VP16 시스템에 의해 증폭된 hTERT 프로모터에 의해 in vivo에서 종양 특이적 발현이 이루어진다
CMV 프로모터-그린 형광 단백질 삽입체(음성 기준, 도 18A, 죄측)을 포함하는 아데노바이러스를 꼬리 정맥을 통하여 누드 생쥐에 투여하면 간에서는 HA-SSTR2 발현을 볼 수 없었다. 신장에서는 111In-옥트레오타이드가 정상적으로 제거되는 것을 볼 수 있다. CMV 프로모터-HA-SSTR2 삽입체(양성 기준, 도 18A, 중앙)을 포함하는 아데노바이러스를 주사한 누드 생쥐에서는 간에서 HA-SSTR2가 발현되었 다. hTERT-Gal4-VP16 프로모터-HA-SSTR2삽입체(도 18A, 우측)을 포함하는 아데노바이러스를 주사한 누드 생쥐에서는 간에서는 발현이 없었고, 따라서, 정상 조직에서 발현을 볼 수 없었다.
사람 섬유육종종양(HT1080 세포에서 유도)을 가지는 누드 생쥐에 좌측 종양에 hTERT-Gal4-VP16 프로모터-HA-SSTR2 삽입체를 포함하는 아데노바이러스를 종양내에 주사하고, 우측 종양에는 CMV 프로모터-HA-SSTR2 삽입체를 포함하는 아데노바이러스를 주사하였다. 모든 종양에서 발현을 볼 수 있었다. 생쥐에 바이러스를 주사하고, 2일 후에 111In 옥트레오타이드를 주사하였다. 1일 후에 평면 촬영을 실시하였다. 대표적 영상을 도 18B에 나타내었다. 이들 연구에서, Gal4-VP16 시스템dp 의해 증폭된 hTERT 프로모터에 의해 in vivo에서 종양 특이적 발현이 있다는 것을 설명하였다.
여기에서 설명하는 조성물 및 방법은 본 발명의 내용에 근거하여 과도한 실험없이 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예를 통하여 설명하고 있지만, 당업자는 조성물 및 방법, 본 발명에 벗어나지 않고 설명된 방법의 단계에 다양한 변화를 줄 수 있다는 것을 인지할 것이다. 좀더 특이적으로는 화학적 그리고 생리학적으로 연관된 특정 물질을 동일한 또는 유사한 결과를 수득할 수 있다면 여기에서 설명하는 물질에 대체될 수 있다는 것은 명백하다. 이와 같은 모든 유사한 치환 및 변형은 본 발명의 첨부된 청구범위에서 정의된 본 발명의 범주내에 있는 것으로 간주한다.
참고문헌
여기에서 제시하는 예시적인 과정을 제공하거나 다른 상세한 설명을 보충하는 문헌을 참고문헌으로 첨부한다.
SEQUENCE LISTING
<110> KUNDRA, VIKAS
FANG, BINGLIANG
JI, LIN X.
YANG, DAN
<120> METHODS AND COMPOSITION RELATED TO IN VIVO
IMAGING OF GENE EXPRESSION
<130> UTFC:904WO
<140> PCT/US2006/008374
<141> 2006-06-02
<150> 60/659,844
<151> 2005-03-09
<160> 3
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 463
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Primer
<400> 1
ttggcccctc cctcgggtta ccccacagcc taggccgatt cgacctctct ccgctggggc 60
cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc 120
cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg 180
attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc tccccacgtg gcggagggac tggggacccg 240
ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt 300
cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc 360
ctttaccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct 420
gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac ccccgccaga tct 463
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Primer
<400> 2
gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 60
cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatcca 117
<210> 3
<211> 585
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Primer
<400> 3
ttggcccctc cctcgggtta ccccacagcc taggccgatt cgacctctct ccgctggggc 60
cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc 120
cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg 180
attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc tccccacgtg gcggagggac tggggacccg 240
ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt 300
cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc 360
ctttaccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct 420
gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac ccccgccaga tctgatctgt aggcgtgtac 480
ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 540
atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atcca 585
Claims (62)
- 재조합 소마토스태틴 수용체(SSTR)을 인코드하는 코딩 서열로 구성된 핵산분자에 있어서, 코딩 부분은 조직-선택적 프로모터 서열에 작용가능하도록 연결되어 있으며, 재조합 GPCR은 C-말단 결손을 가지며, 변형된 내화(internalization)을 가지며, 세포내 시그날 생성이 결손 또는 이의 복합성질을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 소마토스태틴 수용체는 소마토스태틴 수용체 타입 2A (SSTR2A)인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 2 항에 있어서, SSTR2A은 시그날 결손형이며, 변형된 내화를 가지거나 이의 복합성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 3 항에 있어서, SSTR2A는 절두(truncated)된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 4 항에 있어서, SSTR2A은 아미노산 314에 절두된 카르복실 말단인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1-5항중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열은 텔로메라제 프로모터, 사람 텔로메라제 RNA (hTR) 프로모터, 사람 텔로메라제 역전사효소 프로모터 (hTERT) 프로모터, 증폭 기전에 작용가능하도록 결합된 hTR 또는 증폭 기전에 작용가능하도록 결합된 hTERT인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제1-6항중 어느 한 항에 있어서, 조직-선별적 프로모터 또는 증폭된 조직 특이적 프로모터는 정상적인 또는 병이 든 폐, 심장, 식도, 근육, 장, 유방, 전립선, 위, 방광, 간, 비장, 췌장, 신장, 뉴우런, 근세포, 백혈구세포, 불사화(immortalized) 세포, 신형성 세포, 종양 세포, 암 세포, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 침샘, 담낭, 방광, 기관, 후두, 인두, 대동맥, 동맥, 모세관, 정맥, 흉선, 림프절, 골수, 뇌하수체 선, 갑상샘, 부갑상샘, 부신, 뇌, 대뇌, 소뇌, 수질, 중뇌, 척수, 신경, 골격근, 평활근, 골, 고환, 에피디미드스(epidiymides), 전립선, 정낭, 남경, 난소, 자궁, 유선, 질, 피부, 눈 또는 시신경, 동일한 배 기원에서 유도된 조직에서 활성인 프로모터 또는 동일한 또는 유사한 질환에 걸린 하나 또는 그 이상의 조직에서 활성인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 7 항에 있어서, 조직 선택적 프로모터는 신형성 세포, 종양 또는 암세포에서 활성인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 8 항에 있어서, 암세포는 유방 암 세포, 폐 암 세포, 전립선 암 세포, 난소 암 세포, 뇌 암 세포, 간암 세포, 경부암 세포, 결장 암 세포, 신장 암 세포, 피부 암 세포, 머리와 목 암 세포, 골암 세포, 식도 암 세포, 방광 암 세포, 자궁 암 세포, 임파 암 세포, 위 암 세포, 췌장 암 세포, 고환암 세포, 임파종 세포, 또는 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 8 항에 있어서, 프로모터 서열은 hTR 프로모터 서열, hTERT 프로모터 서열, CEA 프로모터 서열, PSA 프로모터 서열, 프로바신(probasin) 프로모터 서열, ARR2PB 프로모터 서열, AFP 프로모터 서열, MUC-I, MUC-4, 뮤친(mucin)-유사 당단백질, C-erbB2/neu 온코유전자, 사이클로-옥시게나제(Cyclo-oxygenase), E2F 전사 인자 1, 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제, 또는 설바이빈(survivin), Tcfl- 알파, Ras, Raf, 사이클린 E, Cdc25A, HK II, KRT19, TFFl, SELlL, 또는 CEL인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 10 항에 있어서, 프로모터 서열은 암세포에서 기능을 하는 hTERT 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 7 항에 있어서, 프로모터 서열은 면역글로블린 중쇄 프로모터 서열, 면역글로블린 경쇄 프로모터 서열, T-세포 수용체 프로모터 서열, HLA DQ 프로모터 서열, HLA DQ 베타 프로모터 서열, 베타-인터페론 프로모터 서열, 인터루킨-2 프로모 터 서열, 인터루킨-2 수용체 프로모터 서열, MHC 클래스 II 5 프로모터 서열, MHC Class II HLA-Dra 프로모터 서열, 베타-악틴 프로모터 서열, 근육 크리스틴 카이나제 (MCK) 프로모터 서열, 프레알부민(transthyretin) 프로모터 서열, 엘라스타제 I 프로모터 서열, 메탈로티오닌 (MTII) 프로모터 서열, 콜라게나제 프로모터 서열, 알부민 프로모터 서열, 알파-페토단백질 프로모터 서열, 감마-글로빈 프로모터 서열, 베타-글로빈 프로모터 서열, c-fos 프로모터 서열, c-HA-ras 프로모터 서열, 인슐린 프로모터 서열, 신경 세포 흡착 분자 (NCAM) 프로모터 서열, 알파-1 -안티트립신 프로모터 서열, H2B (TH2B) 히스톤 프로모터 서열, 타입 I 콜라겐 프로모터 서열, GRP94 프로모터 서열, GRP78 프로모터 서열, 다른 포도당-조절된 단백질 프로모터 서열, 생장 호르몬 프로모터 서열, 사람 혈청 아미오이드 A (SAA) 프로모터 서열, 트로포닌 I (TN I) 프로모터 서열, 혈소판-유도된 생장 인자 (PDGF) 프로모터 서열, 뒤시엔느 근이영증 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 폴리오마 프로모터 서열, 레트로바이러스 프로모터 서열, 파필로마 바이러스 프로모터 서열, 헤파타이티스 B 바이러스 프로모터 서열, 사람 면역결핍 바이러스 프로모터 서열, 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 프로모터 서열, 사람 LIMK2 유전자 프로모터 서열, 소마토스태틴 수용체 프로모터 서열, 뮤린 에피디말 레티논산-결합 유전자 프로모터 서열, a 사람 CD4 프로모터 서열, 생쥐 알파2 (XI) 콜라겐 프로모터 서열, DlA 도파민 수용체 프로모터 서열, 인슐린-유사 생장 인자 II 프로모터 서열, 사람 혈소판 내피세포 세포 흡착 분자-1 프로모터 서열, 사람 알파-락트알부민 프로모터 서열, 7SL 프로모터 서열, 사람 Y 프로모터 서열, 사람 MRP-7-2 프로모터 서열, 5S 리보좀성 프로모터 서열, 알파 페토단백질, 세균성 LPS에 단세포 수용체, 루코시알린(leukosialin), 시알로포린(Sialophorin), 백혈구세포 공통 항원(leukocyte common antigen), 마크로시알린(Macrosialin) 또는 마크로시알린의 사람 유사체, 데스민(Desmin), 엘라스타제, 엘라스타제 I, 엔도글린, 피브로넥틴, VEGF 수용체, 아교원사산성(glial fibrillary acidic) 단백질, 세포간 흡착 분자 2, 인터페론 베타, 미오글로빈, 오스테오칼친 2, 전립선 특이적 항원, 전립선 특이적 막 항원, 계면 활성제 단백질 B, 시납신(Synapsin), 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제, 또는 조직/질병/계통 특이적 프로모터 서열의 기능적 하이브리드, 기능적 부분 또는 이의 복합물인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1 - 6항중 어느 한 항에 있어서, 조직-선별적 프로모터 서열은 코어 프로모터 서열에 작용가능하도록 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 13 항에 있어서, 코어 프로모터 서열은 유비퀴틴 프로모터, 악틴 프로모터, 연장 인자 1 알파, 초기 생장 인자 반응 1, 진핵 개시 인자 4Al, 훼리틴 중쇄, 훼리틴 경쇄, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제, 포도당-조절된 단백질 78, 포도당-조절된 단백질 94, 열 쇼크 단백질 70, 열 쇼크 단백질 90, 베타-키네신, 포스포글리세레이트 키나제, 유비퀴틴 B, 베타-악틴 또는 극소 바이러스성 프로모터 서열과 같은 구성(constitutive) 프로모터에서 유도된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 14 항에 있어서, 극소(minimal) 바이러스성 프로모터 서열은 RNA 바이러스 프로모터, DNA 바이러스 프로모터, 아데노바이러스성 프로모터 서열, 베큘로바이러스성 프로모터 서열, CMV프로모터 서열, 파르보바이러스 프로모터 서열, 허피스바이러스 프로모터 서열, 폭스바이러스 프로모터 서열, 아데노-연합 바이러스 프로모터 서열, 셈리키 산림 바이러스 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 박시니아 바이러스 프로모터 서열, 렌티바이러스 프로모터, 또는 레트로바이러스 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 15 항에 있어서, 극소 바이러스성 프로모터 서열는 mini-CMV 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 16 항에 있어서, 조직 선택적 프로모터는 hTERT 프로모터인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 17 항에 있어서, hTERT 프로모터는 제1리포터에 작용가능하도록 결합된다것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 18 항에 있어서, 제2 코딩 서열이 추가 구성되며, 이때 제2 코딩 서열은 치료요법제, 선별가능한 표식, 재조합 트랜스액티베이터, 또는 제2 촬영 유전자 (리포터)로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 19 항에 있어서, 제1 리포터는 SSTR2이고 제2 리포터는 그린 형광 단백질 (GFP)인 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1-6항중 어느 한 항에 있어서, 제2 코딩 서열은 제2 조직-선별적 프로모터 서열 또는 증폭된 조직 특이적 프로모터 또는 CMV 프로모터와 같은 비-선별적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 19 항에 있어서, 제2 코딩 서열은 치료요법제, 선별가능한 표식, 재조합 트랜스액티베이터, 또는 제2 촬영 유전자 (리포터)를 인코드하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 22 항에 있어서, 치료요법적 물질은 종양 억제물질, 유도물질 아포프토시스, 효소, 구조 단백질, 수용체, 항체, 항체 단편, siRNA, 호르몬, 파라크린 인자, 또는 면역자극물질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 23 항에 있어서, 종양 억제물질 is FUS1인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 22 항에 있어서, 선별가능한 표식은 약물 선별 마커, 효소, 구조 단백질, 수용체, 파라크린 인자, 면역학적 마커, 또는 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 제2 코딩 서열을 추가로 포함하고, 이때, 제2 코딩 서열 및 리포터를 인코드하는 핵산은 작용가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 제2 코딩 서열을 추가로 포함하고, 이때, 제2 코딩 서열 및 GPCR 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 양방향 프로모터에 작용가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 제2 코딩 서열을 추가로 포함하고, 이때, 제2 코딩 서열 및 재조합 7개 G 단백질 연합 수용체 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 IRES에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제26-28항에 있어서, 제2코딩 서열은 치료제, 선택적 마커 또는 리포트를 인코드하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 29 항에 있어서, 치료요법적제는 종양 억제물질, 유도물질 아포프토시스, 효소, 항체, 호르몬, 또는 면역자극물질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 30 항에 있어서, 종양 억제물질은 FUS1인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 32 항에 있어서, 선별가능한 표식은 약물 선별 마커, 효소, 면역학적 마커, 또는 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제1-6항에 있어서, GPCR 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 단백질 테그가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 33 항에 있어서, 단백질 테그는 효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 37 항에 있어서, 단백질 테그는 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-테그, VP16, (His)6-테그, FLAG, 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 재조합 트랜스액티베이터에 결합하는 프로모터 서열에 작용하도록 결합된 비침습성 방법으로 개체에서 감지될 수 있는 리포터를 인코드하는 핵산 서열로 구성된 핵산.
- 제 36 항에 있어서, 재조합 트랜스액티베이터는 Gal4VP16인 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 39 항에 있어서, 제2 코딩 서열이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 39 항에 있어서, 리포터 인코딩 서열과 제2 코딩 서열은 IRES에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 38 항에 있어서, 제2 코딩 서열은 치료요법제, 선별가능한 표식, 또는 리포터를 인코드하는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 38항에 있어서, 조직-선별적 프로모터에 작용하도록 결합된 제3코딩 서열이 추가 포함되며, 제3 코딩 서열은 재조합 트랜스액티베이터를 인코드하는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 38 항에 있어서, 제2 코딩 서열은 조직-선별적 프로모터에 작용가능하도록 결합되며, 제2 코딩 서열은 재조합 트랜스액티베이터를 인코드하는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제 36 항에 있어서, 운반 비이클내에 포함된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 43 항에 있어서, 운반 비이클은 리포좀, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 파아지, 폴리리신과 같은 폴리아미노산, 원핵 세포, 또는 진핵 세포가 되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 개제에서 세포를 영상화시키거나 치료하는 방법에 있어서,a) 조직-선별적 프로모터 또는 증폭된 조직 특이적 프로모터에 작용가능하도록 결합된 비-침습성 방법을 이용하여 in vivo에서 감지가능한 리포터를 인코딩하는 핵산을 개체로 도입시키고; 그리고b) 리포터와 선별적으로 상호작용하는 치료체로 개체를 처리하거나 비-침습성 촬영 기술을 받도록 하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 치료요법제는 방사능치료요법, siRNA, 프로드럭, 또는 화학치료요법인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 조직-선택적 프로모터는 정상적인 또는 병이 든 폐, 심장, 식도, 근육, 장, 유방, 전립선, 위, 방광, 간, 비장, 췌장, 신장, 뉴우런, 근세포, 백혈구세포, 불사화(immortalized) 세포, 신형성 세포, 종양 세포, 암 세포, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 침샘, 담낭, 방광, 기관, 후두, 인두, 대동맥, 동맥, 모세관, 정맥, 흉선, 림프절, 골수, 뇌하수체 선, 갑상샘, 부갑상샘, 부신, 뇌, 대뇌, 소뇌, 수질, 중뇌, 척수, 신경, 골격근, 평활근, 골, 고환, 에피디미드스(epidiymides), 전립선, 정낭, 남경, 난소, 자궁, 유선, 질, 피부, 눈 또는 시신경, 동일한 배 기원에서 유도된 조직에서 활성인 프로모터 또는 동일한 또는 유사한 질환에 걸린 하나 또는 그 이상의 조직에서 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 조직 선택적 프로모터는 신형성 세포, 종양 또는 암세포에서 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 48 항에 있어서, 암세포는 유방 암 세포, 폐 암 세포, 전립선 암 세포, 난소 암 세포, 뇌 암 세포, 간암 세포, 경부암 세포, 결장 암 세포, 신장 암 세포, 피부 암 세포, 머리와 목 암 세포, 골암 세포, 식도 암 세포, 방광 암 세포, 자궁 암 세포, 임파 암 세포, 위 암 세포, 췌장 암 세포, 고환암 세포, 임파종 세포, 또는 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 48 항에 있어서, 프로모터 서열은 hTR 프로모터 서열, hTERT 프로모터 서열, CEA 프로모터 서열, PSA 프로모터 서열, 프로바신(probasin) 프로모터 서열, ARR2PB 프로모터 서열, AFP 프로모터 서열, MUC-I, MUC-4, 뮤친(mucin)-유사 당단 백질, C-erbB2/neu 온코유전자, 사이클로-옥시게나제(Cyclo-oxygenase), E2F 전사 인자 1, 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제, 또는 설바이빈(survivin), Tcfl- 알파, Ras, Raf, 사이클린 E, Cdc25A, HK II, KRT19, TFFl, SELlL, 또는 CEL인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항에 있어서, 프로모터 서열은 암세포에서 기능을 하는 hTERT 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 48 항에 있어서, 프로모터 서열은 면역글로블린 중쇄 프로모터 서열, 면역글로블린 경쇄 프로모터 서열, T-세포 수용체 프로모터 서열, HLA DQ 프로모터 서열, HLA DQ 베타 프로모터 서열, 베타-인터페론 프로모터 서열, 인터루킨-2 프로모터 서열, 인터루킨-2 수용체 프로모터 서열, MHC 클래스 II 5 프로모터 서열, MHC Class II HLA-Dra 프로모터 서열, 베타-악틴 프로모터 서열, 근육 크리스틴 카이나제 (MCK) 프로모터 서열, 프레알부민(transthyretin) 프로모터 서열, 엘라스타제 I 프로모터 서열, 메탈로티오닌 (MTII) 프로모터 서열, 콜라게나제 프로모터 서열, 알부민 프로모터 서열, 알파-페토단백질 프로모터 서열, 감마-글로빈 프로모터 서열, 베타-글로빈 프로모터 서열, c-fos 프로모터 서열, c-HA-ras 프로모터 서열, 인슐린 프로모터 서열, 신경 세포 흡착 분자 (NCAM) 프로모터 서열, 알파-1 -안티트립신 프로모터 서열, H2B (TH2B) 히스톤 프로모터 서열, 타입 I 콜라겐 프로모터 서열, GRP94 프로모터 서열, GRP78 프로모터 서열, 다른 포도당-조절된 단백질 프 로모터 서열, 생장 호르몬 프로모터 서열, 사람 혈청 아미오이드 A (SAA) 프로모터 서열, 트로포닌 I (TN I) 프로모터 서열, 혈소판-유도된 생장 인자 (PDGF) 프로모터 서열, 뒤시엔느 근이영증 프로모터 서열, SV40 프로모터 서열, 폴리오마 프로모터 서열, 레트로바이러스 프로모터 서열, 파필로마 바이러스 프로모터 서열, 헤파타이티스 B 바이러스 프로모터 서열, 사람 면역결핍 바이러스 프로모터 서열, 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 프로모터 서열, 사람 LIMK2 유전자 프로모터 서열, 소마토스태틴 수용체 프로모터 서열, 뮤린 에피디말 레티논산-결합 유전자 프로모터 서열, a 사람 CD4 프로모터 서열, 생쥐 알파2 (XI) 콜라겐 프로모터 서열, DlA 도파민 수용체 프로모터 서열, 인슐린-유사 생장 인자 II 프로모터 서열, 사람 혈소판 내피세포 세포 흡착 분자-1 프로모터 서열, 사람 알파-락트알부민 프로모터 서열, 7SL 프로모터 서열, 사람 Y 프로모터 서열, 사람 MRP-7-2 프로모터 서열, 5S 리보좀성 프로모터 서열, 알파 페토단백질, 세균성 LPS에 단세포 수용체, 루코시알린(leukosialin), 시알로포린(Sialophorin), 백혈구세포 공통 항원(leukocyte common antigen), 마크로시알린(Macrosialin) 또는 마크로시알린의 사람 유사체, 데스민(Desmin), 엘라스타제, 엘라스타제 I, 엔도글린, 피브로넥틴, VEGF 수용체, 아교원사산성(glial fibrillary acidic) 단백질, 세포간 흡착 분자 2, 인터페론 베타, 미오글로빈, 오스테오칼친 2, 전립선 특이적 항원, 전립선 특이적 막 항원, 계면 활성제 단백질 B, 시납신(Synapsin), 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제, 또는 조직/질병/계통 특이적 프로모터 서열의 기능적 하이브리드, 기능적 부분 또는 이의 복합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 비-침습성 촬영은 세포와 감지가능한 모이어티사시에 연합을 검사하기 위해 리포터의 발현을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 53 항에 있어서, 리포터와 감지가능한 모이어티를 발현시키는 세포간에 연합은 세포에 의한 감지가능한 모이어티의 결합, 세포에 의해 감지가능한 모이어티에 결합된 리간드의 결합, 감지가능한 모이어티의 세포 취입(uptake), 감지가능한 모이어티에 결합된 리간드의 세포 취입(uptake)으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 53 항에 있어서, 감지가능한 모이어티는 단백질, 방사능동위원소, 형광단(fluorophore), 가시광선 방출 형광단, 적외선 방출 형광단, 금속, 강자성 물질, 전자성 방출 물질, 특정 MR 분광 신호를 가지는 물질, X-선 흡수 또는 반사 물질 또는 사운드 변형 물질 또는 전자 방출 물질이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 56 항에 있어서, 감지가능한 모이어티는 리포트에 특이적으로 결합하는 리간드에 작용가능하도록 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 56 항에 있어서, 리간드는 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산, 단백질, 폴리 펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편, 또는 소분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 비-침습성 방법은 MRI, MR 분광학, 방사선촬영, CT, 초음파, 2차원 감마 카메라 촬영, SPECT, PET, 다른 핵 의학계 촬영, 가시광선을 이용한 광학 촬영, 루시페라제를 이용한 광학 촬영, 형광단을 이용한 광학 촬영, 적외선 근접 광을 이용한 촬영 또는 적외선 광을 이용한 촬영이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 개체의 외과수술 동안에 조직을 영상화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 개체는 암 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 63 항에 있어서, 핵산은 암 환자 치료용 치료제를 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 59 항에 있어서, 암 환자는 제2 항암 요법을 하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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