RU2735281C1 - Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора - Google Patents
Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2735281C1 RU2735281C1 RU2019137972A RU2019137972A RU2735281C1 RU 2735281 C1 RU2735281 C1 RU 2735281C1 RU 2019137972 A RU2019137972 A RU 2019137972A RU 2019137972 A RU2019137972 A RU 2019137972A RU 2735281 C1 RU2735281 C1 RU 2735281C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptor
- genetic construct
- expression
- human
- protein
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/866—Baculoviral vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению человеческого лейкотриенового рецептора типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1), и может быть использовано для экспрессии CysLT1 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии CysLTR1 в клетках насекомых. Изобретение обеспечивает рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности за счет комбинации N-концевых пептидных фрагментов и положения партнерного белка b562RIL в третьей внутриклеточной петле, что также стабилизирует белок и помогает образованию кристаллических контактов. Также проводят дополнительное транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов. 3 ил.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиям и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 класса GPCR, пригодного к дальнейшим структурно-функциональным исследованиям.
Известна конструкция дикого типа CysLT1, депонированная в базе данных BLAST Align
Retrieve/ID mapping UniProtKB - Q9Y271 (CLTR1_HUMAN, https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y271).
Существуют патенты на препараты лейкотриеновых рецепторов, гены, конструкции и клеточные линии для получения рецептора в целях фармакологического скрининга и получения антител (https://patents.google.com/patent/US6465212?oq=cyslt1).
Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов, имеющих своими мишенями CysLT1 и методов их использования
https://patents.google.com/patent/W02013013490A1/en?oq=cyslt1
www.google.ru/patents/WO2017088725A1?cl=en
www.google.ru/patents/US8980917
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала конструкция CysLT1 рецептора, обеспечивающая кристаллизацию белка методом in meso.
Отличительным признаком изобретения являются: комбинация N-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности, а также очистку рецептора; положение партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, способствующего повышению выхода белка на цитоплазматическую мембрану при экспрессии, стабилизирующего белок и помогающего образованию кристаллических контактов; транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов.
Техническим результатом изобретения является возможность получения дифрагирующих кристаллов указанной конструкции, полученных методом кристаллизации в липидной кубической фазе, а также проведения функциональных тестов: анализа связывания лигандов, анализа стабилизирующего эффекта различных буферных растворов.
Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.
Способ поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность модифицированного CysLT1 рецептора. Мелким регистром показан ген рецептора, курсивом - ген партнера b562RIL. Крупным прямым шрифтом показаны гены N-концевых пептидов и линкеров.
На фиг. 2 представлена схема кристаллизационной конструкции CysLT1R, цветом показаны N-концевые пептидные фрагменты, место вставки BRIL, обрезка С-конца. Схема построена при помощи Интернет базы данных GPCRdb.org.
На фиг. 3 представлен анализ степени агрегации (А) и стабильности (Б) CysLT1R после оптимизации протокола очистки. Микрофотографии в видимом свете характерных кристаллов комплексов с зафирлукастом (В) и пранлукастом (Г).
Ген дикого типа был приобретен в компании cdna.org (США), плазмида, ген белка-партнера был синтезирован компанией GenScript (США). Используемый плазмидный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США), модифицировался методом безлигазного клонирования с использованием праймеров, синтезированных в компании Евроген (Россия). Применялась ПЦР-смесь Accuprime-Pfx (Invitrogen, США), для избавления от исходной плазмиды использовалась Dpnl рестриктаза (NEB, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации вектора использовался бактериальный копийный штамм E.coli, ТОР10. Аминокислотная и ДНК-последовательности представлены на фиг 1-2.
Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой трансформировались бактериальные клетки E.coli штамма DH10Bac, в котором методом сайт-специфичной транспозиции ген интереса встраивался в челночный вектор бакмиду, содержащую геном бакуловируса AcNPV. Клетки Sf9 трансфецировались бакмидой, и формировался вирус, в геноме которого содержался ген CysLT1 рецептора. В результате чего получалась клеточная культура, экспрессирующая белок на клеточной мембране, что проверялось методом проточной цитометрии. После наработки биомассы проводилось выделение мембранной фракции путем лизиса клеток в гипотоническом буфере и отделения цитозольной фракции в гипертоническом буфере, затем солюбилизация белка мягким детергентом и очистка при помощи металл-аффинной хроматографии, белок при этом стабилизировался добавлением лиганда, начиная с шага солюбилизации. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась степень агрегации рецептора методом аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ и стабильность методом анализа кривой плавления с СРМ красителем (С1484, Sigma, США). Чистота препарата составляла более 90%, степень мономерности - более 90%, температура плавления составляла более 70 градусов с лигандом и более 60 градусов для Апо формы. Проводилась кристаллизация в липидной кубической фазе, и были получены белковые кристаллы с антагонистами, зафирлукастом (Z4152, Sigma, США) и пранлукастом (Р0080, Sigma, США), продифрагировавшие до 2,5 и 2,7 ангстрем, соответственно (фиг 3).
Использование заявляемой генетической конструкции позволяет проводить рентгеноструктурный анализ кристаллов CysLT1 рецептора и изучать белок при помощи различных биофизических методов исследования.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего образования "Московский физико-технический
институт (национальный исследовательский университет)"
<120> Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной
экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора.
<130> RU
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaagacga tcatcgccct gagctacatc ttctgcctgg tattcgccga ctacaaggac 60
gatgatgacg ccaaactgca gaccatgcat catcatcatc atcatcatca tcatcatgaa 120
aacctgtatt ttcagggcgg taccatggat gaaacaggaa atctgacagt atcttctgcc 180
acatgccatg acactattga tgacttccgc aatcaagtgt attccacctt gtactctatg 240
atctctgttg taggcttctt tggcaatggc tttgtgctct atgtcctcat aaaaacctat 300
cacaagaagt cagccttcca agtatacatg attaatttag cagtagcaga tctactttgt 360
gtgtgcacac tgcctctccg tgtggtctat tatgttcaca aaggcatttg gctctttggt 420
gacttcttgt gccgcctcag cacctatgct ttgtatgtca acctctattg tagcatcttc 480
tttatgacag ccatgagctt tttccggtgc attgcaattg tttttccagt ccagaacatt 540
aatttggtta cacagaaaaa agccaggttt gtgtgtgtag gtatttggat ttttgtgatt 600
ttgaccagtt ctccatttct aatggccaaa ccacaaaaag atgagaaaaa taataccaag 660
tgctttgagc ccccacaaga caatcaaact aaaaatcatg ttttggtctt gcattatgtg 720
tcattgtttg ttggctttat catccctttt gttattataa ttgtctgtta cacaatgatc 780
attttgacct tactaaaaaa atcaatgaaa tcggctgatc tggaagacaa ttgggaaact 840
ctgaacgaca atctcaaggt gatcgagaag gctgacaatg ctgcacaagt caaagacgct 900
ctgaccaaga tgagggcagc agccctggac gctcagaagg ccactccacc taagctcgag 960
gacaagagcc cagatagccc tgaaatgaaa gactttcggc atggattcga cattctggtg 1020
ggacagattg atgatgcact caagctggcc aatgaaggga aagtcaagga agcacaagca 1080
gccgctgagc agctgaagac cacccggaat gcatacattc agaagtacct gtcgggcaaa 1140
aatctgtcaa gtcataaaaa ggctatagga atgatcatgg tcgtgaccgc tgccttttta 1200
gtcagtttca tgccatatca tattcaacgt accattcacc ttcatttttt acacaatgaa 1260
actaaaccct gtgattctgt ccttagaatg cagaagtccg tggtcataac cttgtctctg 1320
gctgcatcca attgttgctt tgaccctctc ctatatttct tttctggggg taactttagg 1380
aaaaggctgt ctacattcag aaagtaataa 1410
<---
Claims (1)
- Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующая человеческий лейкотриеновый рецептор типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019137972A RU2735281C1 (ru) | 2019-11-25 | 2019-11-25 | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019137972A RU2735281C1 (ru) | 2019-11-25 | 2019-11-25 | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2735281C1 true RU2735281C1 (ru) | 2020-10-29 |
Family
ID=73398189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019137972A RU2735281C1 (ru) | 2019-11-25 | 2019-11-25 | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2735281C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2792893C1 (ru) * | 2022-08-04 | 2023-03-28 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101171337A (zh) * | 2005-03-09 | 2008-04-30 | 得克萨斯大学体系董事会 | 与基因表达的体内成像相关的方法和组合物 |
| EA201391514A1 (ru) * | 2011-05-13 | 2014-08-29 | Рецептос, Инк | Новые партнеры слияния для кристаллизации рецепторов, связанных с g-белками |
-
2019
- 2019-11-25 RU RU2019137972A patent/RU2735281C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101171337A (zh) * | 2005-03-09 | 2008-04-30 | 得克萨斯大学体系董事会 | 与基因表达的体内成像相关的方法和组合物 |
| EA201391514A1 (ru) * | 2011-05-13 | 2014-08-29 | Рецептос, Инк | Новые партнеры слияния для кристаллизации рецепторов, связанных с g-белками |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| БД "GenBank" последовательность под номером EU176542.1, размещена 26.07. 2016. * |
| БД "GenBank" последовательность под номером EU176542.1, размещена 26.07. 2016. БЕЛЖЕЛАРСКАЯ С. Н., БАКУЛОВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, т.45, н.1, с. 142-159. * |
| БЕЛЖЕЛАРСКАЯ С. Н., БАКУЛОВИРУСНЫЕСИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ, МОЛЕКУЛЯРНАЯБИОЛОГИЯ, 2011, т.45, н.1, с. 142-159. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2792893C1 (ru) * | 2022-08-04 | 2023-03-28 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bürglin et al. | Homeodomain proteins: an update | |
| Groft et al. | Recognition of eIF4G by rotavirus NSP3 reveals a basis for mRNA circularization | |
| US20130053544A1 (en) | Peptide tag systems that spontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptide bonds | |
| US20170145075A1 (en) | Mutant g-protein coupled receptor proteins and methods for producing them | |
| US9150904B2 (en) | Coincidence detection | |
| Cunningham et al. | Optimizing synthesis and expression of transmembrane peptides and proteins | |
| Nguyen et al. | Split green fluorescent protein as a modular binding partner for protein crystallization | |
| Chen et al. | Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells | |
| JP2022084574A (ja) | Ｇタンパク質 | |
| RU2735281C1 (ru) | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора | |
| KR101340649B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드 ｈｐｖ 항원을 이용한 ｈｐｖ 항체 스크리닝 방법 | |
| Tan et al. | An application of pET SUMO protein expression system in Escherichia coli: Cloning, expression, purification, and characterisation of native Kras4B G12V oncoprotein | |
| ES2900571T3 (es) | Método para determinar la unión de un ligando-GPCR mutante a resolución de un único aminoácido y parejas de ligando mutado y GPCR | |
| US20160145605A1 (en) | Peptide-presenting protein and peptide library using same | |
| Sjöhamn et al. | Applying bimolecular fluorescence complementation to screen and purify aquaporin protein: protein complexes | |
| Ottmann et al. | Applicability of superfolder YFP bimolecular fluorescence complementation in vitro | |
| WO2012120315A2 (en) | Mutant proteins and methods for producing them | |
| Bjørndal et al. | Expression and purification of receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) | |
| Bravo-Plaza et al. | The Uso1 globular head interacts with SNAREs to maintain viability even in the absence of the coiled-coil domain | |
| Golas et al. | Modulating the expression strength of the baculovirus/insect cell expression system: a toolbox applied to the human tumor suppressor SMARCB1/SNF5 | |
| WO2008025558A2 (en) | Affinity marker comprising a first and a second tag and its use | |
| Sharma et al. | Secretagogin, a hexa EF-hand calcium-binding protein: High level bacterial overexpression, one-step purification and properties | |
| RU2792893C1 (ru) | Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора | |
| KR20120026927A (ko) | 신규한 ｒｎａ 결합 단백질 및 이를 이용한 무표지 마이크로 ｒｎａ 검출방법 | |
| Wong et al. | Cloning, purification and preliminary X-ray data analysis of the human ID2 homodimer |