ES2900571T3

ES2900571T3 - Método para determinar la unión de un ligando-GPCR mutante a resolución de un único aminoácido y parejas de ligando mutado y GPCR

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Publication number: ES2900571T3
Application number: ES14728493T
Authority: ES
Inventors: Martin Ostermaier; Gebhard Schertler; Jörg Standfuss
Original assignee: Scherrer Paul Institut
Current assignee: Scherrer Paul Institut
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2022-03-17
Anticipated expiration: 2034-05-27
Also published as: CN105593240B; WO2014198528A3; JP2016526664A; CA2914831A1; US20160139155A1; EP3008083B1; JP6192818B2; US11401321B2; CA2914831C; CN105593240A; WO2014198528A2; EP3008083A2

Abstract

Método para identificar un ligando mutante de un ligando parental que tiene una capacidad de unión mayor o menor con un receptor acoplado a proteína G, en lo sucesivo denominado GPCR, que la pareja del ligando parental y el GPCR, dicho método comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una placa de microtitulación de pocillos que tiene los pocillos dispuestos en un primer número de filas y un segundo número de columnas b) proporcionar un GPCR, como la rodopsina, en cada uno de dichos pocillos; c) proporcionar un número de mutantes del ligando parental que tienen una única posición de aminoácido mutado, en el que el ligando parental es el que se une al GPCR cuando éste GPCR se encuentra en una conformación particular, y en el que dicho ligando parental es una arrestina; d) poner en contacto los mutantes mutados únicos del ligando parental en los pocillos con el GPCR en condiciones en las que el ligando parental se acoplaría al GPCR; y e) determinar para cada mutante mutado único si el ligando mutante tiene una capacidad de unión más débil o más fuerte en comparación con la capacidad de unión estándar del ligando parental y del GPCR al determinar la cantidad de complejo mutante-GPCR acoplados en dichos pocillos; f) en un enfoque iterativo, seleccionando aquellos de los ligandos mutados únicos que tienen una capacidad de unión mayor o menor, los cuales luego se someten al segundo ensayo en el que se muta una segunda posición de aminoácido adicional; y g) por consiguiente, aquellos ligandos doblemente mutados que muestran una mayor o menor capacidad de unión son entonces objeto de un tercer ensayo en el que se muta una tercera posición de aminoácido adicional, y opcionalmente así sucesivamente, hasta que se alcanza el nivel deseado de capacidad de unión.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para determinar la unión de un ligando-GPCR mutante a resolución de un único aminoácido y parejas de ligando mutado y GPCR

Se describe un método para determinar la capacidad de unión de un ligando mutante a un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) y ligandos mutantes específicos, así como parejas específicas de ligandos mutantes y GPCR identificados por el método según la invención, así como el uso específico de dichos ligandos mutantes y/o parejas de ligandos mutantes y GPCR, pero no forman parte de la presente invención.

Los receptores acoplados a proteína G (de ahora en adelante GPCR por sus siglas en inglés) son una gran clase de receptores de siete dominios transmembrana que transducen señales desde el exterior de las células cuando se unen a un ligando apropiado. Los GPCR tienen una infinidad de funciones, están implicados en las percepciones sensoriales, como el olor y la visión, y responden a feromonas, hormonas y neurotransmisores, donde los ligandos varían mucho en cuanto a su naturaleza y tamaño. Los GPCR pueden afectar al comportamiento y al estado de ánimo, al sistema inmunológico, al sistema nervioso simpático y parasimpático, a la detección de la densidad celular y puede haber otras actividades fisiológicas que involucren a los GPCR en su vía. Los GPCR están asociados a una serie de enfermedades y han sido un objetivo activo de las empresas farmacéuticas.

Como se ha mencionado anteriormente, los GPCR están implicados en una amplia variedad de procesos fisiológicos. Algunos ejemplos de sus funciones fisiológicas son:

1. El sentido de la vista: las opsinas utilizan una reacción de fotoisomerización para traducir la radiación electromagnética en señales celulares. La rodopsina, por ejemplo, utiliza para este fin la transformación del 11 -cis-retinal en todo-transretinal.

2. El sentido del olfato: los receptores del epitelio olfativo unen los odorantes (receptores olfativos) y feromonas (receptores vomeronasales).

3. La regulación del comportamiento y del estado de ánimo: los receptores del cerebro de los mamíferos se unen a varios neurotransmisores diferentes, incluidos la serotonina, la dopamina, el ácido gamma aminobutírico y el glutamato.

4. La regulación de la actividad del sistema inmunitario y de la inflamación: los receptores de quimiocinas se unen a ligandos que median la comunicación intercelular entre las células del sistema inmunitario; los receptores, como los receptores de histamina, se unen a los mediadores inflamatorios e involucran a los tipos de células blancas en la respuesta inflamatoria.

5. Transmisión del sistema nervioso autónomo: tanto el sistema nervioso simpático como el parasimpático están regulados por las vías de los GPCR, responsables del control de muchas funciones automáticas del cuerpo, como la presión arterial, la frecuencia cardíaca y los procesos digestivos.

6. La detección de la densidad celular: una nueva labor del GPCR en la regulación de la detección de la densidad celular.

7. La modulación de la homeostasis (por ejemplo, equilibrio hídrico).

8. Estar implicado en el crecimiento y la metástasis de algunos tipos de tumores.

Los GPCR se activan mediante una señal externa que provoca un cambio conformacional. Parece que una vez que el receptor se une, activa la proteína G, que está unida al ATP. La proteína G es un trímero que, al activarse, convierte el GTP (guanosín trifosfato) en GDP (guanosín difosfato). Los GPCR activos son fosforilados por quinasas de receptores acoplados a proteínas. En muchos casos, tras la fosforilación, el receptor fosforilado se une a la arrestina. La unión a la arrestina puede dar lugar a la translocación del GPCR u otro resultado.

En respuesta a un estímulo, los GPCR activan las proteínas G heterotriméricas. Para desactivar esta respuesta o adaptarse a un estímulo persistente, los receptores activos deben desensibilizarse. El primer paso es la fosforilación mediante una clase de serina/treonina quinasa llamada quinasa de receptores acoplados a proteína G (GRK). La fosforilación de GRK prepara específicamente al receptor activado para la unión de la arrestina. La unión de la arrestina al receptor bloquea la señalización mediada por la proteína G y dirige los receptores para su internalización, y redirige la señalización a vías alternativas independientes de la proteína G, como la señalización de la 13-arrestina. Además de los GPCR, las arrestinas se unen a otras clases de receptores de la superficie celular y a una variedad de otras proteínas de señalización.

Las arrestinas son moléculas alargadas, en las que varias interacciones intramoleculares mantienen la orientación relativa de los dos dominios. En células no estimuladas, las arrestinas se localizan en el citoplasma en esta conformación basal "inactiva". Los GPCR fosforilados activos reclutan arrestina en la membrana plasmática. La unión del receptor induce un cambio conformacional global que involucra el movimiento de los dos dominios de arrestina y la liberación de su cola C-terminal que contiene los sitios de unión de clatrina y AP2. El aumento de la accesibilidad de estos sitios en la arrestina unida al receptor se dirige al complejo arrestina-receptor hacia el hoyo recubierto. Las arrestinas también se unen a los microtúbulos (parte del "esqueleto" celular), donde asumen otra conformación, diferente tanto de la forma libre como de la unida al receptor. Las arrestinas unidas a microtúbulos reclutan ciertas proteínas al citoesqueleto, lo que afecta a su actividad y/o la redirige a proteínas asociadas a los microtúbulos. Las arrestinas se trasladan entre el núcleo celular y el citoplasma. Sus funciones nucleares son actualmente objeto de una intensa investigación y se demostró que los cuatro subtipos de arrestina de mamíferos eliminan algunos de sus socios del núcleo, como la proteína quinasa JNK3 o la ubiquitina ligasa Mdm2. Las arrestinas también modifican la expresión génica mejorando la transcripción de ciertos genes.

Los mamíferos expresan cuatro subtipos de arrestina y cada subtipo de arrestina se conoce por múltiples alias. El nombre sistemático de arrestina (1-4) más los alias más utilizados para cada subtipo de arrestina se enumeran en negrita a continuación:

• La Arrestina-1 se identificó originalmente como el antígeno S (SAG) que causa uveítis (enfermedad ocular autoinmune), y luego se describió de forma independiente como una proteína de 48 kDa que se une a la rodopsina fosforilada activada por luz antes de que quedara claro que ambos son uno y lo mismo. Más tarde se renombró arrestina visual, pero cuando se clonó otro subtipo visual específico de cono, se acuñó el término arrestina de varilla. Esto también resultó ser un nombre inapropiado: la arrestina-1 se expresa en niveles muy altos comparables en las células fotorreceptoras tanto de varilla como de cono.

• La Arrestina-2 fue la primera arrestina no visual clonada. Primero se denominó 13-arrestina simplemente porque entre dos GPCR disponibles en forma purificada en ese momento, la rodopsina y el receptor fo-adrenérgico, mostró preferencia por este último.

• La Arrestina 3: La segunda arrestina no visual clonada se denominó primero IJ-arrestina-2 (cambiando retroactivamente el nombre de 13-arrestina al de IJ-arrestina-1), a pesar de que en ese momento estaba claro que las arrestinas no visuales interactúan con cientos de diferentes GPCR, no sólo con el receptor 132-adrenérgico. Poco después se propusieron nombres sistemáticos, arrestina 2 y arrestina 3, respectivamente.

• La Arrestina-4 fue clonada por dos grupos y denominada arrestina de cono, después del tipo de fotorreceptor que lo expresa, y X-arrestina, después del cromosoma donde reside su gen. En la base de datos de HUGO, su gen se llama arrestina-3.

Las arrestinas bloquean el acoplamiento del GPCR a proteínas G a través de dos mecanismos. En primer lugar, la arrestina que se une a la cara citoplásmica del receptor ocluye el sitio de unión de la proteína G heterotrimérica, evitando su activación (desensibilización). En segundo lugar, la arrestina une el receptor a elementos de la maquinaria de internalización, clatrina y adaptador de clatrina AP2 (cola C-terminal), que promueve la internalización del receptor a través del hoyo recubierto y el transporte posterior a los compartimentos internos, llamados endosomas. Posteriormente, el receptor podría dirigirse a los compartimentos de degradación (lisosomas) o reciclarse de nuevo a la membrana plasmática, donde puede volver a enviar señales. La fuerza de la interacción arrestina-receptor juega un papel en esta elección: los complejos más estrechos tienden a aumentar la probabilidad de degradación del receptor, mientras que los complejos más transitorios favorecen el reciclaje, aunque esta "regla" está lejos de ser absoluta.

Por lo tanto, las arrestinas funcionan como proteínas adaptadoras que facilitan la desensibilización, internalización y señalización de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR). La extinción de la señalización de la proteína G a través de las arrestinas se entiende mejor en el sistema visual, donde la arrestina-1 extingue la fototransducción a través de su capacidad para unirse a la forma fosforilada, activada por luz, del fotorreceptor visual rodopsina.

La capacidad de unión de los ligandos a sus respectivos GPCR, como el complejo arrestina-rodopsina, abre un amplio campo de descubrimiento de fármacos y de cribado de fármacos para diagnosticar y tratar enfermedades en el campo de los procesos bioquímicos exocitóticos o endocitóticos moderados por GPCR. La solicitud de patente internacional WO 2008/114020 A2 describe un método para seleccionar un GPCR con estabilidad aumentada. Dicho método comprende a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR parental, b) seleccionar un ligando, siendo el ligando uno que se une al GPCR parental cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular, c) determinar si el o cada GPCR mutante tiene estabilidad aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad del GPCR parental con respecto a la unión a ese ligando, y d) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad aumentada en comparación con el GPCR parental con respecto a la unión del ligando seleccionado. En esta solicitud también se describen mutantes del receptor 13-adrenérgico, del receptor de adenosina y del receptor de neurotensina.

En Vishnivetskiy et al., ("Critical Role of the Central 139-Loop in Stability and Binding Selectivity of Arrestin-1 J Biol Chem, vol. 288, no. 17, abril de 2013, págs. 11741-11750) se muestra que las deleciones en el bucle 139 o las interrupciones de sus interacciones con el cuerpo de la arrestina-1 reducen en gran medida la estabilidad y la selectividad de la arrestina-1.

Vishnivetskiy et al. ("Engineering Visual Arrestin-1 with Special Functional Characteristics", J Biol. Chem., vol. 288, no. 5, febrero de 2013, págs. 3394-3405) demuestra que la reingeniería de la superficie de unión al receptor de arrestina-1 mejora aún más la unión al Rh* mientras conserva la estabilidad de la proteína y que las formas constitutivamente monoméricas de arrestina-1 son suficientemente estables para la expresión in vivo.

Gurevich et al. ("Mechanism of phosphorylation-recognition by visual arrestin and the transition of arrestin into a high affinity binding state" Mol. Pharm., Vol. 51, no. 1, 1997, págs. 161-169) investigaron el mecanismo molecular del reconocimiento de fosforilación al sustituir 19 aminoácidos diferentes por Arg175 y evaluaron los efectos de mutagénesis de otros residuos altamente conservados dentro de la región de reconocimiento de fosforilación (Val170, Leu172, Leu173, Ile174, Val177 y Gln178).

El documento US 2003/157553 A1 se refiere a proteínas mutantes de la arrestina independientes de fosforilación que se usan como componentes de ensayo en ensayos de cribado diseñados para identificar ligandos y/o moduladores de GPCR. En particular, se describe que los mutantes de la arrestina independientes de la fosforilación pueden unirse a los GPCR de una manera independiente del requisito natural de fosforilación por las quinasas receptoras intracelulares.

Hirsch et al. ("A Model for Arrestin 's Regulation: The 2. 8 A Crystal Structure of Visual Arrestin", Cell, vol. 97, no. 2, 15 de abril de 1999, págs. 257-259) describen estudios cristalográficos de la arrestina visual en su conformación basal.

En WO 01/58923 A2 se refiere a métodos de ensayo de actividad de los GPCR y a métodos de cribado de ligandos GPCR, ligandos agonistas y/o antagonistas, naturales y sustitutos de los GPCR huérfanos y compuestos que interactúan con componentes del proceso de regulación de los GPCR. En particular, se refiere a un método que monitorea la función de los GPCR proximalmente en el sitio de activación del receptor, proporcionando así más información para el descubrimiento de fármacos debido a un menor números de mecanismos en competencia.

Chen et al., (""Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: Sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide", Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry, vol. 90, junio de 1993, págs. 5618-5622) utilizaron mutagénesis aleatoria para diseñar la proteasa subtilisina E para que funcione en un entorno muy poco natural, concentraciones de disolvente orgánico polar. Las rondas secuenciales de mutagénesis y cribado han producido una variante (PC3) que hidroliza un sustrato peptídico 256 veces más eficazmente que la subtilisina de tipo salvaje en dimetilformamida al 60%.

El documento WO 2009/081136 A2 se refiere al cribado de parejas de unión de GPCRs y en particular a parejas de unión específicas de conformación del GPCR.

Desafortunadamente, el número de mutantes de los GPCR que representan el mismo comportamiento bioquímico que el GPCR original es limitado. Además, los GPCR mutantes son bastante difíciles de sintetizar y, por lo tanto, los ensayos de unión son bastante costosos debido a los costosos GPCR mutantes.

Por lo tanto, es un objeto proporcionar un método para identificar la capacidad de unión de los GPCR al ligando a un menor coste y con un espectro más amplio de parejas de PCR de ligando. Además, es un objetivo estabilizar la unión del ligando y el GPCR mediante ligandos y/o parejas de ligando/GPCR adecuadas.

Este objetivo se consigue según la presente invención mediante un método para identificar un ligando mutante de un ligando parental que tiene una capacidad de unión mayor o menor con un receptor acoplado a proteína G, en lo sucesivo denominado GPCR, que la pareja del ligando parental y el GPC, dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una placa de microtitulación de pocillos que tiene los pocillos dispuestos en un primer número de filas y un segundo número de columnas

b) proporcionar un GPCR, como la rodopsina, en cada uno de dichos pocillos;

c) proporcionar un número de mutantes del ligando parental que tienen una única posición de aminoácido mutado, en el que el ligando parental es el que se une al GPCR cuando éste GPCR está en una conformación particular, y en el que dicho ligando parental es una arrestina;

d) poner en contacto los mutantes mutados únicos del ligando parental en los pocillos con el GPCR en las condiciones en las que el ligando parental se acoplaría al GPCR; y

e) determinar para cada mutante mutado único si el ligando mutante tiene una capacidad de unión más débil o más fuerte en comparación con la capacidad de unión estándar del ligando parental y del GPCr al determinar la cantidad de complejo mutante- GPCR acoplado en dichos pocillos;

f) en un enfoque iterativo, seleccionar aquellos de los ligandos mutados únicos que tienen una capacidad de unión mayor o menor, los cuales luego se someten al segundo ensayo en el que se muta una segunda posición de aminoácido adicional; y

g) por consiguiente, aquellos ligandos doblemente mutados que muestran una mayor o menor capacidad de unión son entonces objeto de un tercer ensayo en el que se muta una tercera posición de aminoácido adicional, y opcionalmente así sucesivamente, hasta que se alcanza el nivel deseado de capacidad de unión.

Por lo tanto, el presente método ofrece la oportunidad de escanear simultáneamente la capacidad de unión de los mutantes de un ligando parental dentro de las mismas condiciones de configuración del ensayo para un número de mutantes en el que la mutagénesis en el ligando puede ejecutarse a resolución de residuos debido a la estructura orgánica más simple del ligando mutado en comparación con la estructura del GPCR que ha sido mutado, por ejemplo, en WO 2008/114020 A2. Además, la combinación de mutantes permite modificar la afinidad de unión y la estabilidad del complejo ligando-GPCR con fines de diagnóstico, intervención farmacológica o descubrimiento de fármacos.

Para proporcionar condiciones que proporcionen un cierto gradiente en las condiciones de reacción en los pocillos, una realización preferente de la presente invención es la que para los pocillos de cada fila o cada columna se utiliza el mismo mutante y en la que la condición de reacción en el pocillo, como la concentración de sal o el agente disolvente, cambia de pocillo en pocillo en dicha fila o en dicha columna.

Para proporcionar las condiciones de reacción ventajosas y comparables en los pocillos, la condición de reacción se puede mantener constantes en los pocillos que pertenecen a la misma fila o a la misma columna.

Para proporcionar un valor de referencia de la unión del ligando parental y del GPCR al ensayo, el ligando parental puede añadirse a todos los pocillos pertenecientes a la misma fila o a la misma columna de la placa de microtitulación de pocillos. En otras palabras, las condiciones en las que se ensayan los mutantes se aplican también a la pareja ligando parental GPCR, lo que mejora la escalabilidad de los resultados de los mutantes ensayados simultáneamente. Por lo tanto, cualquier impacto en las condiciones de reacción que pueda diferir de un ensayo de placa de microtitulación de un pocillo a otro, puede eliminarse debido al valor de referencia identificado para la pareja ligando parental-GPCR.

Ventajosamente, los mutantes se suministran en forma solubilizada, lo que permite unas condiciones de ensayo bastante sencillas para la investigación de la capacidad de unión de un ligando mutante específico al GPCR.

Se describe que un ligando parental puede ser de la clase agonista de ligandos y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando parental es de la clase antagonista de ligandos y la conformación particular es una conformación antagonista. Se describe además que un ligando parental es cualquiera de un agonista completo, un agonista parcial, un agonista inverso, un antagonista o un ligando parental pertenece a la clase de ligandos agonistas inversos y la conformación particular es una conformación agonista inversa. Por lo tanto, estos ligandos garantizan la aplicación de los ensayos con respecto a la capacidad de unión en el interesante espectro de las reacciones bioquímicas in vivo que están controladas/influenciadas por el GPCR y su estabilización de unión a los ligandos mutantes en cuestión.

Se describe además que un ligando parental es un polipéptido que se une al GPCR. El polipéptido es cualquier anticuerpo, una anquirina, una proteína G, una proteína RGS, una arrestina, una quinasa GPCR, un receptor de tirosina quinasa, una RAMP, una NSF, un GPCR, una subunidad del receptor NMDA NR1 o NR2a, un calcyon, una región marco de fibronectina, o un derivado o fragmento de las mismos que se une al GPCR.

Los mutantes del ligando parental se proporcionan en una forma en la que los residuos de aminoácidos mutados reemplazan a los residuos de aminoácidos parentales. Preferentemente, un residuo de aminoácido parental se puede mutar individualmente en alanina/glicina. Se pueden lograr excelentes resultados sobre la capacidad de unión cuando el ligando parental es uno de arrestina 1, arrestina 2, arrestina 3 y arrestina 4. Preferentemente, los mutantes del ligando parental que tienen una mayor afinidad de unión al GPCR que el mutante parental son candidatos para el descubrimiento de medicamentos. Preferentemente, esos mutantes se mencionan en la Tabla 2 de la descripción.

Con respecto a la pareja de un ligando mutante y GPCR, una solución para el objeto mencionado anteriormente se consigue mediante una pareja de un ligando mutante y GPCR en el que la estabilidad de unión de dicha pareja es mayor en comparación con la pareja formado por el ligando parental y el GPCR, identificado según el método de la invención. En consecuencia, una solución alternativa para una pareja de ligando mutante y GPCR se consigue mediante una pareja de un ligando mutante y un GPCR en el que la estabilidad de unión de dicha pareja es menor en comparación con la pareja que consiste en el ligando parental y el GPCR identificado según el método de la invención.

Además, un ligando mutante del ligando parental del tipo arrestina que tiene una mayor estabilidad de unión con el GPCR que la pareja del ligando parental y el GPCR, se identifica según el método de la invención. Preferentemente, esos mutantes se mencionan en la Tabla 2 de la descripción. Alternativamente, un ligando mutante del ligando parental del tipo arrestina que tiene una estabilidad de unión más baja con un GPCR que la pareja del ligando parental y el GPCR, se identifica preferentemente según el método de la invención.

Se divulga, pero no forma parte de la invención, el uso de la pareja o del ligando mutante en un cribado de fármacos mediante un ensayo de complementación con ligandos mutantes optimizados para una afinidad mayor o menor al GPCR en comparación con la afinidad de unión del ligando parental y el GPCR.

Las realizaciones preferentes se describen con más detalle a continuación con referencia a los siguientes dibujos que representan:

Figura 1 una descripción general de la mutagénesis por barrido de arrestina;

Figura 2 esquemáticamente un ensayo de unión en el que se emplea en el segmento externo de la varilla original (ROS) de las membranas arrestina-mCherry y rodopsina nativa;

Figura 3 una visión general del curso de concentración inhibitoria media máxima CI⁵⁰de los ligandos mutantes de la arrestina;

Figura 4 una visión general de la combinación de mutaciones para crear una arrestina "súper ligando";

Figura 5 muestra esquemáticamente una construcción sistemática de una arrestina "súper ligando";

Figura 6 muestra esquemáticamente el mecanismo de unión de la arrestina a resolución de un único aminoácido;

Figura 7 muestra esquemáticamente el modelo del complejo arrestina-rodopsina;

Figura 8 muestra esquemáticamente el mecanismo de intercambio de la cola C a resolución de un único aminoácido por el cual la cola C de la arrestina se reemplaza por la cola C fosforilada de GPCR; y

Figura 9 muestra de forma esquemática la transferencia de mutaciones a otras arrestinas.

La Tabla 1 (al final de la especificación) muestra las afinidades de unión relativas de los mutantes que cubren la secuencia completa del GPCR al ligando arrestina-1. Aquí, cada posición de aminoácido en la arrestina se ha mutado a alanina (A) o glicina (G).

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la arrestina. La mutagénesis por barrido de arrestina se ejecutó mediante tecnologías de secuenciación conocidas para mutar cada residuo individualmente a alanina (A) o glicina (G). Durante la primera ronda de secuenciación, el 74% de los 403 ligandos mutantes se generó con éxito. La cobertura completa se logró tras otras rondas de mutagénesis y secuenciación.

Como se ilustra esquemáticamente en la Figura 2, los mutantes de la arrestina-1 que se han obtenido mediante mutagénesis por barrido se transforman en Escherichia coli (E. coli). El nivel de expresión relativo de cada mutante con respecto al tipo salvaje (ligando parental) se determinó usando fluorescencia de la unión C-terminal de mCherry a la arrestina. Para la formación de complejos, la arrestina se combina con rodopsina en membranas del segmento externo de la varilla (ROS) que habían sido fosforiladas con rodopsina quinasa nativa (GRK1). Para minimizar el efecto de las variaciones en la expresión de los diferentes mutantes de la arrestina, el ensayo contenía 1,25 pM de rodopsina, muy por encima de la afinidad de unión aparente 5-50 nM de la arrestina-1. En consecuencia, no se ha observado ninguna correlación entre las cantidades de arrestina-1 expresadas funcionalmente y la capacidad de un mutante para unirse a la rodopsina bajo una fuerza iónica en aumento medida como se describe a continuación.

En los presentes ejemplos se analizará ahora con más detalle el complejo (pareja) de arrestina como ligando parental y rodopsina como GPCR. En particular, el uso de la placa de microtitulación de pocillos ofrece una amplia gama de experimentos de barrido que pueden establecerse simultáneamente en condiciones de reacción que son iguales para todos los ligandos mutados.

Con más detalle, la Figura 2 muestra el ensayo de unión directa de la arrestina-mCherry y la rodopsina en membranas nativas ROS. Los plásmidos que contienen arrestina mutada por mutagénesis por barrido se transformaron en E. coli. El nivel de expresión relativo de cada mutante con respecto al tipo salvaje se determinó mediante la fluorescencia de la fusión C-terminal de mCherry a la arrestina. Para la formación de complejos, la arrestina se combina con la rodopsina en membranas ROS que habían sido fosforiladas con la rodopsina quinasa nativa (GRK1). Para comparar la unión relativa en el presente ejemplo, cada vez se combinaron 11 mutantes de la arrestina y la arrestina de tipo salvaje como control en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se probó la unión a la rodopsina activada por luz en ocho concentraciones de sal diferentes. En el caso de la rodopsina adaptada a la oscuridad, sólo se realizaron mediciones de único punto para cada mutante. Después de los pasos de centrifugación y lavado, se cuantificó la cantidad de arrestina unida mediante la fluorescencia de la proteína de fusión mCherry. Los datos resultantes se ajustaron a curvas sigmoidales de dosisrespuesta con pendiente variable para extraer los valores CI⁵⁰y los intervalos de confianza del 95%, como se enumera en la Tabla 1.

Se ha examinado una biblioteca de 403 mutantes de arrestina para sus valores CI⁵⁰. Todas las mediciones se realizaron en el marco de la cuantificación de la fluorescencia de las proteínas de fusión arrestina-mCherry. Para encontrar combinaciones de mutantes que aumenten la unión, se seleccionaron 23 de 24 mutantes con los valores CI⁵⁰más altos medidos, que van desde 1,14 M para G297A hasta 0,56 M para R291A, de la biblioteca de la arrestina-1 mutante. Se combinaron con la mutación de unión más fuerte F375A (CI⁵⁰= 1,32 ± 0,31 M). Además, se seleccionaron 15 mutantes con valores CI⁵⁰significativamente más altos que WT (tipo salvaje). Como control se eligieron 10 mutantes con valores CI⁵⁰similares a WT (dentro de la desviación estándar de las mediciones de WT) y 2 mutantes con valores CI⁵⁰significativamente más bajos que WT, así como 3 mutantes que mostraron una señal débil (I24A, V57A e I149A) debido a los bajos niveles de expresión funcional. En total, se han construido 53 mutantes dobles. El procedimiento de cribado para los valores CI⁵⁰se extendió luego adicionalmente al empleado previamente con un segundo rango de concentraciones de cloruro de sodio ensayadas para poder ajustar los datos de unión de los mutantes con valores altos de CI⁵⁰con la precisión adecuada. Cada mutante combinado se sometió a ambos rangos de cribado de cloruro de sodio para obtener los valores CI⁵⁰(Fig. 4).

La Figura 4 muestra los valores de concentración inhibitoria media máxima (CI⁵⁰) de cloruro de sodio para la formación de complejos compuestos de arrestina-1 mutante y rodopsina activada fosforilada. Los mutantes dobles (círculos) se ordenan por el valor CI⁵⁰decreciente (de izquierda a derecha) y se componen de F375A+X, donde el mutante único X se muestra debajo y se nombra en el eje x. Los mutantes triples (triángulos) están compuestos de F375A+ A307G+X o F375A+T304A+X, mientras que los mutantes cuádruples se combinan como F375A T304A E341A+X o como 75A+T304A+F380A+X. El tamaño de la forma codifica el nivel de expresión funcional con respecto al mutante y se escala en relación con el nivel de expresión funcional de la arrestina-1 de tipo salvaje (leyenda). El nivel de expresión funcional indica la cantidad de proteína arrestina, funcional en términos de unión a la rodopsina, que se expresó y redujo con respeto al mutante en relación con la construcción de arrestina-mCherry de tipo salvaje a 100 mM NaCl. En el caso de mutantes combinados con un CI⁵⁰elevado, el punto de referencia fue el mutante F375A a 492 mM de NaCl.

Los valores CI⁵⁰se pudieron derivar para 49 de 53 mutantes dobles, 4 mutantes dobles revelaron intensidades de señal por debajo del límite de detección. Aproximadamente dos tercios, exactamente 33 de los 49 mutantes, revelaron valores CI⁵⁰similares a F375A (dentro de la desviación estándar del valor de CI⁵⁰derivado en 23 mediciones independientes para F375A, ver más arriba). Una suma de 12 mutantes tenía valores CI⁵⁰significativamente más altos que F375A y 4 mutantes dobles valores significativamente más bajos. Se ha agregado otra serie de mutaciones sobre el doble mutante A307G F375A, que lideraba la pantalla con el valor de CI⁵⁰más alto observado (2,83 M), o sobre el mutante T304A F375A, que tenía un valor de CI⁵⁰de 1,51 M por debajo de los 12 mutantes de mejor unión. De los 38 mutantes triples construidos, se pudieron determinar los valores CI⁵⁰para 35 mutantes y estos oscilaron entre 3,52 a 1,01 M. Aunque los mutantes triples que contenían A307G se unían en concentraciones de sal muy altas a la rodopsina fosforilada activada por luz (R*-P), cuantitativamente las cantidades de complejos formados fueron bajas. Por tanto, se eligieron los mutantes triples E341A+T304+F375A y F380A+T304A+F375A con valores CI⁵⁰de 2,75 M y 2,09 M, respectivamente, para diseñar 15 mutantes cuádruples. Para los mutantes cuádruples, se han obtenido valores CI⁵⁰de 2,95 M a 1,37 M. Los dos mutantes cuádruples R171A+E341A+T304A+F375A y d 303A+E341A+T304A+F375A alcanzaron valores CI⁵⁰que ascendían al 720% y 710% del valor WT (0,41± t 0,05 M) (Fig. 4 y Tabla 2). En conclusión, fue posible aumentar la estabilidad del complejo más de 7 veces bajo la presión de alta fuerza iónica mediante la selección y la combinación de mutantes únicos a mutantes cuádruples.

Como ejemplo breve, para comparar la unión relativa, se combinaron 11 mutantes de la arrestina y la arrestina WT como control en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se probaron la unión a rodopsina activada por luz y oscuridad en 8 concentraciones de sal diferentes (100 mM a 2,4 M). Después de los pasos de centrifugación y lavado, la cantidad de arrestina unida se ha cuantificado utilizando la fluorescencia de la proteína de fusión mCherry. Los datos resultantes se ajustaron a curvas sigmoidales de dosis-respuesta con pendiente variable para extraer los valores de la concentración inhibitoria media máxima (CI⁵⁰) y los intervalos de confianza del 95% enumerados en la tabla 1 (al final de la especificación). Se ha medido varias veces una selección de mutaciones de unión fuerte y débil tratadas en el texto principal para aumentar la precisión de los valores CI⁵⁰determinados. La variación de los valores CI⁵⁰, para arrestina WT fue de 0,41 ±0,04 M a partir de 59 experimentos independientes de acuerdo con informes previos que utilizan arrestina-1 radiomarcada. Entre las 25 mejores mutaciones de unión, 13 residuos polares afectados, incluyendo 10 residuos cargados en condiciones fisiológicas. De manera similar, 10 de las 25 peores mutaciones de unión afectaron a residuos polares, incluidos 4 residuos cargados. Esta distribución uniforme entre residuos polares e hidrófobos demuestra que el ensayo no está sesgado, aunque el aumento de la fuerza iónica afecta predominantemente a las interacciones hidrófilas. Esto concuerda con la idea de que la unión de la arrestina a la rodopsina implica una multitud de interacciones hidrófilas e hidrófobas, así como cambios conformacionales específicos y no está dominada por unas pocas interacciones cargadas.

La Figura 3 proporciona una descripción general del curso de las concentraciones inhibidoras máximas medias (valores CI⁵⁰) de todos los ligandos mutantes únicos de la arrestina. La investigación involucró la capacidad de unión de todos los 403 mutantes de arrestina enumerados en la tabla 1. Empleando los pull downs de la proteína de fusión arrestina-mCherry, el análisis comprendió la comparación de la unión de rodopsina a todos los 403 mutantes que cubren la secuencia completa de la arrestina. Esta información proporciona una cuarta dimensión funcional a las estructuras cristalinas de las arrestinas inactivas, preactivadas y activas. Los mapas funcionales de resolución de un único aminoácido resultante revelan una serie de interacciones críticas en el núcleo polar y a lo largo de la cola C de la arrestina que se interrumpen durante la activación de la arrestina.

Los datos revelan además varios parches de aminoácidos que reducen fuertemente la unión y actúan como interfaces de unión directa a la rodopsina. Esta información en combinación con el acoplamiento molecular computacional de la arrestina activa y la rodopsina activada por luz permite desarrollar un modelo del complejo arrestina-rodopsina como se muestra en la Figura 7.

La Figura 4 muestra la combinación de mutaciones del ligando de la arrestina-1 en términos de su afinidad de unión a la rodopsina. Los símbolos rectangulares representan los ligandos mutantes que tienen solo una posición de aminoácido mutado; los símbolos circulares representan los ensayos con ligandos mutantes que tienen dos posiciones de aminoácidos mutados, y el símbolo triangular representa los ensayos con ligandos mutantes que tienen tres posiciones de aminoácidos mutados. Los símbolos rómbicos representan ligandos mutantes cuádruples de la arrestina-1.

Por lo tanto, la imagen triangular de la Figura 5 representa la construcción sistemática de una arrestina mutada que tiene excelentes propiedades de unión a la rodopsina del GPCR. Estos "super ligantes" se identifican mediante una combinación iterativa de las mutaciones de la arrestina. Por ejemplo, aquellas arrestinas mutantes con una única posición de aminoácido mutado que muestran en esta primera clase de posiciones de un único aminoácido mutado una capacidad de unión relativamente alta son candidatas para el siguiente ensayo usando esta arrestina mutada única que tiene ahora una segunda posición de aminoácido mutado y así sucesivamente.

Por lo tanto, el triángulo en la Figura 5 muestra en el radar triangular entre la afinidad de unión, la estabilidad de la arrestina mutante y la expresión funcional de la arrestina mutante, valores significativamente más altos para el CI⁵⁰, especialmente para aquellos ligandos mutantes que tienen tres o cuatro posiciones de aminoácidos mutados como se explicó anteriormente con más detalle con referencia a la Figura 4.

De forma más general, el método según la presente invención también aplica un enfoque iterativo. En este sentido, el punto de partida es el escaneo de un ligando que tiene una única posición de aminoácido mutado y observa la respuesta respectiva en la capacidad de unión. Aquellos de los ligandos mutados únicos que tienen una capacidad de unión relativamente alta son entonces el tema del segundo ensayo en el que se muta una segunda posición adicional en el aminoácido. Por consiguiente, los ligandos doblemente mutados que muestran una capacidad de unión superior son objeto del tercer ensayo en el que se muta una tercera posición adicional en el aminoácido, y así sucesivamente. Por lo tanto, este enfoque iterativo puede realizarse hasta que se logre el nivel deseado de reactividad bioquímica / capacidad de unión / potencial funcional. Cabe señalar que el enfoque iterativo también se puede realizar en el sentido contrario, buscando un ligando mutado múltiple que tenga una reactividad bioquímica / capacidad de unión / potencial funcional particularmente bajos en comparación con el ligando parental en relación con el GPCR al que se une.

El modelo de las Figuras 6 y 7 muestra cómo el bucle de dedo de la arrestina y las cadenas beta XV y XVI interactúan con TM5/TM6 de la rodopsina y actúan como un sensor para la conformación activa del receptor. La fosfosensibilidad se logra mediante una serie de aminoácidos que anclan la cola C de la arrestina en una posición que bloquea la unión del receptor (ver Figura 8). En un mecanismo de intercambio de la cola C, la cola C de la arrestina se libera y posteriormente se sustituye por el extremo C fosforilado del receptor.

La Figura 7 muestra el modelo conceptual de un complejo arrestina-GPCR derivado del acoplamiento molecular de la arrestina activa y la rodopsina activada por luz. El C-terminal fosforilado de la rodopsina se une a lo largo del dominio N de la arrestina e interactúa con varios residuos cargados expuestos durante la liberación del C-terminal de arrestina. Los bucles de dedo y lazo (recuadro superior y medio) encajan en la abertura de la hendidura durante la activación de la rodopsina. En esta posición, Gln69 o Asp73 en el bucle de dedo de la arrestina pueden interactuar con Leu72 y Asn73, dos residuos en TM2 de rodopsina que son críticos para la unión de la arrestina-1. El bucle de lazo media los contactos con los extremos citoplásmicos de TM6 y TM7/H8, dos regiones cuya posición relativa está involucrada en la señalización sesgada de los receptores 13-adrenérgicos y en la unión de la arrestina a la rodopsina. El borde del dominio C (recuadro inferior) contiene un conjunto de aminoácidos que podrían interactuar con la membrana de fosfolípidos o formar un sitio de unión secundario para los dímeros de GPCR.

La Figura 8 muestra mapas funcionales de la arrestina-1 con resolución de un único aminoácido. Los valores de unión de 403 mutantes de la arrestina (CI⁵⁰) mostrados como un aumento del ancho de la cinta y como un espectro que va desde el rojo sobre el blanco hasta el azul) representado en las estructuras cristalinas de arrestina³inactiva², preactivada p44 y un modelo de arrestina-1 basado en la estructura cristalina de la arrestina-2 con un receptor fosfopeptido⁴unido. Varios residuos, incluidas tres fenilalaninas hidrófobas (F375, F377, F380) y el R382 cargado, anclan la cola C de la arrestina-1 en la interacción de 3 elementos y en los sitios reguladores del núcleo polar. La mutación de estos residuos clave y sus compañeros de interacción conduce a un fuerte aumento de la unión a la rodopsina fosforilada y activada por luz. El truncamiento de la cola C en la arrestina p44 conduce a un cambio conformacional que libera R29 del núcleo polar y expone algunos otros residuos cargados (K14, K15, Q69, K300) cuya mutación conduce a una unión muy reducida a la rodopsina fosforilada. En la arrestina activa, estos residuos interactúan directamente con las serinas y treoninas fosforiladas en el receptor péptido (verde, V2Rpp). Juntos, estos datos sugieren un mecanismo de fosfosensibilidad en el que la cola C de la arrestina-1 se intercambia con el extremo C fosforilado de la rodopsina durante la formación del complejo de arrestina desensibilizante.

La Figura 9 muestra una descripción general de una transferencia de mutaciones a otras arrestinas. En negrita, se identifican los 20 mejores ligantes. Las letras de color gris claro representan los 20 peores ligantes de la rodopsina GPCR.

La Tabla 1 enumera los parámetros de unión de 403 mutantes de alanina/glicina en la arrestina-1.

Estos hallazgos, según los datos existentes, pueden usarse ahora para modificar la unión de la arrestina-2 3 al GPCR de interés farmacológico. La combinación de mutantes permite la modificación de la afinidad de unión y la estabilidad de los complejos GPCR-arrestina con fines de diagnóstico, intervención farmacológica o descubrimiento de fármacos (por ejemplo, ensayos de reclutamiento de beta-arrestina, descubrimiento de fármacos basado en la estructura, silenciamiento de GPCR hiperactivos, etc.).

La Tabla 1 a continuación, muestra una lista de valores CI⁵⁰del NaCl en la unión del segmento externo de la varilla fosforilada y activada por luz de la membrana (ROS* -P) con 403 mutaciones de la arrestina que cubren la secuencia completa de la arrestina-1. Se han obtenido valores CI⁵⁰para cada mutante único a partir de 8 mediciones en concentraciones crecientes del NaCl (100 mM a 2,4 M) con la calidad de ajuste indicada como R²y la variación como intervalo de confianza del 95%. Se ha medido varias veces una selección de residuos funcionalmente importantes y se han promediado los valores. Se eliminaron del análisis 16 mutaciones enumeradas en las observaciones bien porque no se expresaron (como lo indica la fluorescencia en gel del marcador de fluorescencia mCherry) o bien porque la expresión era demasiado baja para obtener una señal fiable.

Tabla 1

Los siguientes mutantes fueron construidos anteriormente y pertenecen al estado de la técnica: K2A³, I12A⁴, K14A⁴, K15A⁴, R18A⁵, Y25A⁶, D30A³, V44A⁶, L46A⁶, F65A⁵, D72A⁷, R102A⁶, L103A⁶, Q104A⁶, E105A⁶, S106A⁶, L107A⁶, I108A⁶, K109A⁶, K110A⁶, L111A⁶, D138A⁵, K142A⁷, D162A⁵, K166A⁵, V170A¹, L172A¹, L173A¹, I174A¹, R175A¹, V177A¹, Q178A¹, K235A⁵, Y250A⁵, E346A⁵, D296A³, D303A³, F375A², V376A², F377A², F380A², R382A³

Los mutantes descritos anteriormente se analizaron en mediciones de un punto para la unión en diferentes estados de la rodopsina. Los valores CI⁵⁰de cloruro de sodio no se obtuvieron antes para esos mutantes.

¹Gurevich & Benovic, 1996: Mechanism of phosphorylation-recognition by visual arrestin and the transition of arrestin into a high affinity binding state.

²Gurevich, 1998: The selectivity of visual arrestin for light-activated phosphorhodopsin is controlled by multiple nonredundant mechanisms.

³Vishnivetskiy, Paz, Schubert, Hirsch & Gurevich, 1999: How does arrestin respond to the phosphorylated state of rhodopsin?

⁴Vishnivetskiy, Schubert, Climaco, Gurevich, Velez, Gurevich, 2000: An additional phosphate-binding element in arrestin molecule: Implications for the mechanism of arrestin activation.

⁵Hanson & Gurevich, 2005: The differential engagement of arrestin surface charges by the various functional forms of the receptor.

⁶Vishnivetskiy, Francis, Eps, Kim, Hanson, Klug, Hubbell, Gurevich, 2010: The role of arrestin alpha-helix I in receptor binding.

⁷Vishnivetskiy, Baameur, Findley and Gurevich, 2013: Critica! role of the central 139-loop in stability and binding selectivity of arrestin-1

Información detallada sobre el trabajo experimental

Los mutantes se expresaron y las células se disolvieron en el tampón (Buffer) C [Hepes (pH 7,0) 10 mM, NaCl 100 mM, DTT 1 mM, MgCl2 1 mM y EDTA 0,1 mM] o en el tampón D (que contiene NaCl 1,842 m ), ambos complementados con lisozima 0,2 mg/ml, DNasa 20 pg/ml, PMSF 1,5 mM y mezcla de inhibidores de proteasa Complete Roche. El procedimiento C que usa el tampón C y la placa C se aplicó al tipo salvaje, a los mutantes únicos y combinados de la construcción arrestina-mCherry. El procedimiento D que usa el tampón D y placa D se aplicó a un mutante único F375A y a mutantes combinados de la construcción arrestina-mCherry. En detalle, se mezclaron 1,024 ml de lisado celular depurado que contenía el tipo salvaje o mutante de la construcción de arrestina-mCherry en tampón C con 76 pL de ROS-P*, mientras que 637,1 pL de lisado celular depurado en tampón D se mezcló con 82,9 pL del mismo stock ROS-P* (1,45 mg / mL), obteniendo las mezclas maestras C o D, respectivamente. La mezcla maestra C se distribuyó en porciones de 100 pL en 8 pocillos de una placa de 96 pocillos (en lo sucesivo denominada placa C) en cada pocillo que contenía 100 pL de tampón C con cantidades cada vez mayores de cloruro de sodio, obteniendo finalmente 100, 247, 492, 737, y 982 mM y 1,472, 1,962 y 2,403 M de NaCl en las 8 mezclas de reacción. Cada placa C contenía arrestina-mCherry de tipo salvaje como referencia y 11 mutantes de arrestina-mCherry diferentes. La mezcla maestra D se dividió en fracciones de 60 pL y se transfirió a 8 pocillos de una placa de 96 pocillos (denominada, a continuación, placa D) con cada pocillo que contenía 140 pL del mismo tampón con diferentes cantidades de cloruro de sodio, lo que dio como resultado 492, 737 y 982 mM y 1,472, 1,962, 2,403, 3,176 y 3,949 M de NaCl. Se ensayaron 11 mutantes de arrestina-mCherry diferentes con cada placa C, que contenía la construcción de arrestina-mCherry de tipo salvaje (como referencia), y la misma cantidad de mutantes con cada placa D, que contenía el mutante de arrestina-mCherry F375A (como referencia). Las muestras en cada pocillo se mezclaron, se incubaron a 37°C durante 5 min y durante 6 min se activaron con luz. Se llenaron placas separadas de 96 pocillos con las siguientes muestras y se procesaron en paralelo en la oscuridad: una fracción de 100 pL de cada mezcla maestra C se combinó con 100-pL de tampón C o una porción de 60 pL de cada mezcla maestra D con 140 pL de tampón que se complementó con NaCl para producir 492 mM de NaCI. Se centrifugaron todas las placas y se eliminaron los sobrenadantes y se lavaron los sedimentos añadiendo cuidadosamente 100 pl de tampón C a las placas C o 100 pl de tampón con 492 mM de NaCl a las placas D. Los controles oscuros se trataron en consecuencia. Los sedimentos en las placas C se resuspendieron en tampón C y los sedimentos en las placas D en el tampón que contenía 492 mM de NaCl. Se llevó a cabo la cuantificación de la arrestina-mCherry pull down. La Tabla 2 enumera los mutantes construidos e incluye el número de mediciones y los valores CI⁵⁰y R2 derivados de las mismas, así como los intervalos de confianza del 95%.

Ensayo de termoestabilidad por fluorescencia en gel. Las proteínas de fusión arrestina-mCherry se expresaron, recolectaron y lisaron. El lisado celular de una fracción de cultivo celular de 50 ml se aclaró mediante centrifugación (Centrifuge 5424R; Eppendorf) a 21.100 x g durante 20 min a 4° C. El lisado se distribuyó en porciones de 100 pl en once tubos de 1,5 ml (Sarstedt), que se colocaron en un bloque calefactor (Dri-Block; Techne) que se equilibró a 30° C. La temperatura se elevó a 80°C manualmente en pasos de 5° C cada 2,5 min. Las muestras se retiraron sucesivamente cada 2,5 minutos y se enfriaron en hielo. El precipitante se eliminó mediante centrifugación durante 1 h. Se mezclaron 12 pL de sobrenadante de cada muestra con 3 pL de colorante de carga SDS 5x. La construcción de arrestina-mCherry de longitud completa se separó de la proteína degradada por SDS-PAGE durante 1 h a 200 V y 80 mA en tampón MOPS utilizando un gel de gradiente Bis-Tris al 8-12% (NuPAGE Novex; Life Technologies) en la cámara suministrada (Sistema de gel NuPAGE Novex SDS-PAGE; Life Technologies). La emisión de fluorescencia de mCherry o de las fusiones de proteína mCherry se detectó excitando la proteína a 312 o 365 nm usando un filtro de 605 nm (ImageQuant RT ECL; GE Healthcare). Las intensidades de fluorescencia se cuantificaron mediante ImageJ (NIH) y se representaron en Prism. El ajuste sigmoidal de Boltzmann permitió determinar las temperaturas de fusión (TM) y los valores R2 y los errores estándar. Los valores TM de tipo salvaje, V170A, L173A y R175A derivados del nuevo ensayo de termoestabilidad por fluorescencia en gel descrito se compararon con los valores de TM derivados de un ensayo estándar de desplazamiento térmico utilizando el colorante fluorescente CPM, N-[4-(7- dietilamino-4 -metil-3-cumarinil) fenil] maleimida. El ensayo de termoestabilidad por fluorescencia en gel es superior al ensayo CPM en términos de simplicidad: no requiere la purificación de la proteína y utiliza instrumentación más barata que también está disponible en los laboratorios de bajo presupuesto.

La siguiente tabla 2 muestra una lista de los mutantes construidos que se evaluaron para determinar la concentración inhibitoria media máxima (CI⁵⁰) del NaCl para interrumpir la formación de complejos con P-R*. La unión de cada mutante a P-R* en su entorno natural, las membranas del segmento externo de la varilla (ROS), se cuantificaron en 8 concentraciones diferentes de cloruro de sodio, que van de 100 a 2403 mM. La medición se repitió para el intervalo de 492 a 3949 mM de sal si la curva sigmoidal de dosis respuesta ajustada no podía alcanzar la meseta inferior. Se indica el número de conjuntos de prueba a partir de los cuales se derivaron CI⁵⁰, R2 y el intervalo de confianza del 95%. Se observa si la expresión de la proteína arrestina funcional era demasiado baja para determinar los valores CI⁵⁰de forma fiable. La temperatura de fusión de los mutantes de la arrestina (TM) se determinó mediante el ensayo de fluorescencia en gel descrito anteriormente.

Tabla 2: Lista de imitantes construidos que se examinaron para determinar la concentración inhibidora media máxima (CI⁵⁰) como también se muestra en la Figura 4.

En el protocolo de secuencia adjunto, se aplican las siguientes relaciones: arrestina-1 = SEQ ID No: 1, arrestina-2 = SEQ ID No: 2, arrestina-3 = SEQ ID No: 3 y arrestina-4 = SEQ ID No: 4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para identificar un ligando mutante de un ligando parental que tiene una capacidad de unión mayor o menor con un receptor acoplado a proteína G, en lo sucesivo denominado GPCR, que la pareja del ligando parental y el GPCR, dicho método comprende las siguientes etapas:

b) proporcionar un GPCR, como la rodopsina, en cada uno de dichos pocillos;

c) proporcionar un número de mutantes del ligando parental que tienen una única posición de aminoácido mutado, en el que el ligando parental es el que se une al GPCR cuando éste GPCR se encuentra en una conformación particular, y en el que dicho ligando parental es una arrestina;

d) poner en contacto los mutantes mutados únicos del ligando parental en los pocillos con el GPCR en condiciones en las que el ligando parental se acoplaría al GPCR; y

e) determinar para cada mutante mutado único si el ligando mutante tiene una capacidad de unión más débil o más fuerte en comparación con la capacidad de unión estándar del ligando parental y del GPCr al determinar la cantidad de complejo mutante-GPCR acoplados en dichos pocillos;

f) en un enfoque iterativo, seleccionando aquellos de los ligandos mutados únicos que tienen una capacidad de unión mayor o menor, los cuales luego se someten al segundo ensayo en el que se muta una segunda posición de aminoácido adicional; y

2. Método según la reivindicación 1, en el que en cada fila o columna se usa el mismo mutante, en el que la condición ambiental, como la concentración de sal, en el pocillo, cambia de pocillo a pocillo en dicha fila o columna.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que la condición ambiental es constante en los pocillos que pertenecen a la misma fila o a la misma columna.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando parental se añade a todos los pocillos que pertenecen a la misma fila o columna de la placa de microtitulación de pocillos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que uno o más de los mutantes se proporcionan en forma solubilizada.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los mutantes del ligando parental se proporcionan en una forma en la que los residuos de aminoácidos mutados reemplazan al residuo de aminoácidos parental.

7. Método según la reivindicación 6, en el que un residuo de aminoácido parental se muta individualmente en alanina/glicina.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el ligando parental es uno de arrestina 1, arrestina 2, arrestina 3 y arrestina 4.