CN105593240A - 用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-gpcr结合的方法以及突变配体和gpcr对 - Google Patents

用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-gpcr结合的方法以及突变配体和gpcr对 Download PDF

Info

Publication number
CN105593240A
CN105593240A CN201480033242.9A CN201480033242A CN105593240A CN 105593240 A CN105593240 A CN 105593240A CN 201480033242 A CN201480033242 A CN 201480033242A CN 105593240 A CN105593240 A CN 105593240A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpcr
parent
arrestin
mutant
rhodopsin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480033242.9A
Other languages
English (en)
Inventor
马丁·奥斯特迈尔
格布哈特·舍特勒
约尔格·斯坦德富斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scherrer Paul Institut
Original Assignee
Scherrer Paul Institut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scherrer Paul Institut filed Critical Scherrer Paul Institut
Publication of CN105593240A publication Critical patent/CN105593240A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Abstract

本发明提供了用于确定G蛋白偶联受体(以下称为“GPCR”)与可突变配体之结合能力的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供具有以具有第一数目的行和第二数目的列之阵列设置的孔的孔微量滴定板；b)向每个所述孔提供GPCR，例如视紫红质；c)提供亲本配体的多个突变体，其中所述亲本配体是当GPCR处于特定构象时与所述GPCR结合的配体；d)在亲本配体会与GPCR偶联的条件下使孔中亲本配体的突变体与GPCR接触；以及e)对于每一个突变体，通过测定所述孔中偶联的突变体-GPCR复合物的量来确定，跟所述亲本配体与所述GPCR的标准结合能力相比，该突变配体具有更弱结合能力还是具有更强结合能力。在测定中，研究了覆盖完整视紫红质抑制蛋白序列的403个突变体与视紫红质的结合。该信息提供了无活性视紫红质抑制蛋白、预活化的视紫红质抑制蛋白和活性视紫红质抑制蛋白之晶体结构的功能性第四维度。所得单氨基酸分辨率功能图揭示了在视紫红质抑制蛋白活化期间被破坏的在极性核中并且沿着视紫红质抑制蛋白的C尾的一系列关键相互作用。我们的数据还揭示了强烈降低结合并充当与视紫红质的直接结合界面的若干氨基酸片。该信息与活性视紫红质抑制蛋白4和光活化视紫红质之计算机分子对接的组合允许开发视紫红质抑制蛋白-视紫红质复合物模型。突变体的组合允许改变GPCR-配体复合物的结合亲和力和稳定性以用于诊断目的或药理学介入。

Description

用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-GPCR结合的方法以及突变配体和GPCR对
本发明涉及确定可突变(mutatable)配体与G蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptor，GPCR)之结合能力的方法。另外，本发明涉及特定的突变配体以及特定的突变配体和GPCR对以及所述突变配体和/或突变配体和GPCR对的特定用途。
G蛋白偶联受体(GPCR)是一大类七跨膜结构域受体，其在与适当的配体结合时转导来自细胞外部的信号。GPCR具有响应于信息素、激素和神经递质的大量参与感官知觉(例如气味和视觉)的功能，其中配体在性质和大小上有很大变化。GPCR可以影响行为和情绪、免疫系统、交感神经和副交感神经系统、细胞密度感应，还可能存在有在其途径中涉及GPCR的另外的生理活性。GPCR与多种疾病相关，并且是制药公司的活跃靶标。
如上所述，GPCR参与许多生理过程。其生理作用的一些实例包括：
1.视觉：视蛋白使用光异构化反应来将电磁辐射转化成细胞信号。例如，为此目的，视紫红质(rhodopsin)使用11-顺式-视黄醛至全反式-视黄醛的转变。
2.嗅觉：嗅上皮结合气味物质的受体(嗅觉受体)以及信息素的受体(犁鼻受体)。
3.行为和情绪调节：哺乳动物脑中的受体结合多种不同的神经递质，包括血清素、多巴胺、γ氨基丁酸和谷氨酸。
4.调节免疫系统活性和炎症：趋化因子受体结合介导免疫系统细胞之间的细胞间通讯的配体；受体(例如组胺受体)结合炎性介体并且衔接(engage)炎性应答中的靶细胞类型。
5.自主神经系统传递：交感神经系统和副交感神经系统二者均受GPCR途径的调节，负责控制身体的许多自主功能，例如血压、心率和消化过程。
6.细胞密度感应：在调节细胞密度感应方面的一种新GPCR作用。
7.体内稳态调节(例如，水平衡)。
8.参与一些类型肿瘤的生长和转移。
GPCR被外部信号活化，导致构象改变。似乎一旦受体被结合，其就活化G蛋白，所述G蛋白与ATP结合。G蛋白是三聚体，其在活化后将GTP(三磷酸鸟苷)转变成GDP(二磷酸鸟苷)。活性GPCR被蛋白偶联受体激酶磷酸化。在许多情况下，磷酸化后，磷酸化的受体与视紫红质抑制蛋白(arrestin)连接。与视紫红质抑制蛋白的结合可导致GPCR易位(translocation)或其他结果。
响应于刺激，GPCR活化异源三聚体G蛋白。为了关闭这种响应，或者适应于持续刺激，需要使活性受体脱敏(desensitize)。第一步是通过一类称为G蛋白偶联受体激酶(Gproteincoupledreceptorkinase，GRK)的丝氨酸/苏氨酸激酶来磷酸化。GRK磷酸化特别地使活化的受体与视紫红质抑制蛋白结合。视紫红质抑制蛋白与受体的结合阻断了进一步G蛋白介导的信号转导并且靶向用于内在化的受体，并且使信号转导重定向于不依赖于G蛋白的替代途径，例如β视紫红质抑制蛋白信号转导。除了GPCR外，视紫红质抑制蛋白还与其他类型的细胞表面受体和多种其他信号转导蛋白结合。
视紫红质抑制蛋白是长的分子，其中多种分子内相互作用保持两个结构域的相对方向。在未刺激的细胞中，视紫红质抑制蛋白以其基础“无活性”构象位于细胞质中。活性磷酸化的GPCR将视紫红质抑制蛋白募集到细胞质膜。受体结合诱导整体构象改变，其包括两个视紫红质抑制蛋白结构域的移动及其含有网格蛋白和AP2结合位点的C-端尾的释放。受体结合的视紫红质抑制蛋白中这些位点易接近性的提高将视紫红质抑制蛋白-受体复合物靶向有被小窝(coatedpit)。视紫红质抑制蛋白还与微管(细胞“骨架”的一部分)结合，在那里其被假设具有不同于游离形式和受体结合形式二者的另一种构象。微管结合的视紫红质抑制蛋白募集某些蛋白质到细胞骨架，这影响它们的活性和/或将其重定向到微管相关蛋白。视紫红质抑制蛋白在细胞核和细胞质之间穿梭。目前正在对其的细胞核功能进行大量研究，并且表明所有四种哺乳动物视紫红质抑制蛋白亚型均从细胞核移除一些它们的伴侣，例如蛋白激酶JNK3或泛素连接酶Mdm2。视紫红质抑制蛋白还通过增强某些基因的转录来修饰基因表达。
哺乳动物表达四种视紫红质抑制蛋白亚型，每一种视紫红质抑制蛋白亚型均通过多种别名而知晓。以下的粗体字中列出了每一种视紫红质抑制蛋白亚型的系统视紫红质抑制蛋白名称(1-4)以及最广泛使用的别名：
·视紫红质抑制蛋白1最初被鉴定为造成葡萄膜炎(自身免疫眼病)的S抗原(SAG)，之后被独立地描述为与光活化的磷酸化视紫红质结合的48kDa蛋白质，然后才清楚这二者是一种并且是相同的。随后将其重命名为视觉视紫红质抑制蛋白，但是当另一种视锥特异性视觉亚型被克隆时，创造了术语视杆视紫红质抑制蛋白(rodarrestin)。这后来也被证明是使用不当的名称，因为视紫红质抑制蛋白1在视杆感光细胞和视锥感光细胞二者中均以相当的非常高的水平表达。
·视紫红质抑制蛋白2是第一种克隆的非视觉视紫红质抑制蛋白。其最初被命名为β视紫红质抑制蛋白，这仅仅是因为在当时可以以纯化形式得到的两种GPCR——视紫红质和β2肾上腺素能受体之间，其表现为偏向于后者。
·视紫红质抑制蛋白3：第二种克隆的非视觉视紫红质抑制蛋白最初被命名为β-视紫红质抑制蛋白2(追溯地将β-视紫红质抑制蛋白的名称改变为β-视紫红质抑制蛋白1)，虽然那时候已经清楚非视觉视紫红质抑制蛋白与数百种不同GPCR相互作用，而不是仅与β2肾上腺素能受体。之后不久就分别提出了系统名称视紫红质抑制蛋白2和视紫红质抑制蛋白3。
·视紫红质抑制蛋白4由两个研究小组克隆并且命名为视锥视紫红质抑制蛋白(按照表达其的光受体类型)和X视紫红质抑制蛋白(按照其基因停留的染色体)。在HUGO数据库中，将其基因称为视紫红质抑制蛋白3。
视紫红质抑制蛋白通过两种机制阻断GPCR与G蛋白的偶联。第一，与受体的细胞质尖端(cytoplasmictip)结合的视紫红质抑制蛋白堵塞了异源三聚G蛋白的结合位点，从而阻止其活化(脱敏)。第二，视紫红质抑制蛋白将受体连接到内在化机器的元件(网格蛋白和网格蛋白接头AP2)(C端尾)，其促进受体通过有被小窝内在化并且随后转运到称为内体的内部区室。随后，受体可以被引导至降解区室(溶酶体)或再循环回到质膜，在那里其可以再次充当信号。视紫红质抑制蛋白受体相互作用的强度在这种选择中具有作用：较紧密复合物倾向于提高受体降解的可能性，而更短暂的复合物有利于再循环，尽管这种“规则”远远不是绝对的。
因此，视紫红质抑制蛋白充当了有利于G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导、脱敏和内在化的接头蛋白。G蛋白的信号转导通过视紫红质抑制蛋白的猝灭在视觉系统中被充分理解，其中视紫红质抑制蛋白1通过其与磷酸化光活化形式的视觉光受体视紫红质结合的能力来猝灭光转导。
配体与其各自的GPCR(例如，视紫红质抑制蛋白-视紫红质复合物)的结合能力在GPCR介导的胞吐和胞吞生物化学过程领域为诊断和治疗疾病打开了宽阔的药物发现和药物筛选领域。国际专利申请WO2008/114020A2公开了用于选择具有提高的稳定性之GPCR的方法。所述方法包括a)提供亲本GPCR的一个或更多个突变体，b)选择配体，所述配体是当GPCR处于特定构象时与亲本GPCR结合的配体，c)确定与亲本GPCR对于配体结合的稳定性相比，突变体GPCR或每一个突变GPCR对于所选择配体的结合是否具有提高的稳定性，以及d)与亲本GPCR相比，选择对于所选择配体的结合具有提高的稳定性的那些突变体。该申请中还公开了β-肾上腺素能受体、腺苷受体和神经降压肽受体的突变体。
不幸的是，与亲本GPCR表现出相同生物化学行为的GPCR突变体的数目有限。另外，突变GPCR非常难以合成，因此结合测定由于昂贵的突变GPCR而相当昂贵。
因此，本发明的一个目的是提供用于以较低的成本鉴定GPCR与配体的结合能力并且具有较宽配体-GPCR对之谱的方法。另外，本发明的一个目的是通过合适的配体和/或合适的配体/GPCR对来稳定配体和GPCR的结合。
根据本发明，该目的通过用于确定G蛋白偶联受体(以下称为“GPCR”)与可突变配体之结合能力的方法得以实现，所述方法包括以下步骤：
a)提供具有以具有第一数目的行和第二数目的列之基质设置的孔的孔微量滴定板；
b)向每个所述孔提供GPCR，例如视紫红质；
c)提供亲本配体的多个突变体，其中所述亲本配体是当GPCR处于特定构象时与所述GPCR结合的配体；
d)在亲本配体会与GPCR偶联的条件下使孔中亲本配体的突变体与GPCR接触；以及
e)对于每一个突变体，通过测定所述孔中偶联的突变体-GPCR复合物的量来确定，跟所述亲本配体与所述GPCR的标准结合能力相比，该突变配体具有更弱结合能力还是具有更强结合能力。
因此，本发明方法提供了在测定多个突变体的相同设定条件下同时扫描亲本配体的突变体之结合能力的机会，其中由于与例如WO2008/114020A2中突变的GPCR的结构相比，所述可突变配体具有更简单的有机结构，因此可以以残基分辨率(residuerosolution)进行配体的诱变。另外，突变体的组合使得能够将GPCR-配体复合物的结合亲和力和稳定性的改变用于诊断目的、药理学介入或药物发现。
为了提供在孔中递送一定梯度之反应条件的条件，本发明的一个优选实施方案在于，其中每一行或每一列的孔中使用相同的突变体，并且其中孔中的反应条件(如盐浓度或溶剂)在所述行或所述列的孔之间变化。
为了在孔中提供有利的和相当的反应条件，可以使属于相同行或相同列的那些孔中的反应条件保持恒定。
为了向测定提供亲本配体与GPCR之结合的参照值，可以将亲本配体添加至属于孔微量滴定板之相同行或相同列的所有孔。换言之，测试突变体的条件也应用于亲本配体-GPCR对，这增强了同时测试的突变体之结果的可扩展性。因此，由于对于亲本配体-GPCR对所鉴定的参照值，可以消除一个孔微量滴定板测试与另一个可不同的任何对于反应条件的影响。
有利地，以溶解的形式(solubilizedform)提供突变体，其能够使得以相当简单的测定条件研究特定突变配体对于GPCR的结合能力。
在本发明的另一个优选实施方案中，亲本配体可以来自激动剂类配体并且特定构象是激动剂构象，或者亲本配体来自拮抗剂类配体并且特定构象是拮抗剂构象。优选地，亲本配体是完全激动剂、部分激动剂、反向激动剂(inverseagonist)、拮抗剂中的任意一种，或者亲本配体来自反向激动剂配体并且特定构象是反向激动剂构象。因此，这些配体确保了关于以下的测定试验的应用，对受GPCR控制/影响的体内生物化学反应之目的谱的结合性能及其对于所讨论突变配体的结合稳定性。
在本发明的另一个优选实施方案中，亲本配体是与GPCR结合的多肽。优选地，所述多肽是与GPCR结合的任意以下物质：抗体、锚蛋白、G蛋白、RGS蛋白、视紫红质抑制蛋白、GPCR激酶、受体酪氨酸激酶、RAMP、NSF、GPCR、NMDA受体亚基NR1或NR2a、calcyon、纤连蛋白结构域框架或者其片段或衍生物。
在本发明的另一个优选实施方案中，以一个或更多个突变氨基酸残基替换亲本氨基酸残基的形式提供亲本配体的突变体。优选地，亲本氨基酸残基可以单个地突变为丙氨酸/甘氨酸。
当亲本配体是视紫红质抑制蛋白1、视紫红质抑制蛋白2、视紫红质抑制蛋白3和视紫红质抑制蛋白4中的一种时，可以取得良好的结合能力结果。优选地，与亲本突变体相比，对于GPCR具有更高结合亲和力的亲本配体突变体是用于药物发现的候选物。
对于突变配体和GPCR对，通过以下突变配体和GPCR对实现了用于上述目的的方案，其中所述对的结合稳定性高于由亲本配体和GPCR组成的对，优选地根据权利要求1至10中任一项所述的方法来鉴定。因此，通过这样的突变配体和GPCR对取得了用于突变配体和GPCR对的一个替代方案，其中所述对的结合稳定性低于由亲本配体和GPCR组成的对，优选地根据权利要求1至10中任一项所述的方法来鉴定。
另外，根据本发明的关于配体的目的通过与亲本配体和GPCR对相比，对GPCR具有更高结合稳定性之视紫红质抑制蛋白型亲本配体的突变配体来实现，优选地根据权利要求1至10中任一项所述的方法来鉴定。或者，根据本发明该目的通过与亲本配体和GPCR对相比，对GPCR具有更低结合稳定性的视紫红质抑制蛋白型亲本配体的突变配体来实现，优选地根据权利要求1至10中任一项所述的方法来鉴定。
本发明的另一个方面通过根据权利要求11或12所述的对或者权利要求13或14所述的突变配体在药物筛选中的用途得以实现，所述药物筛选使用突变配体的互补测定来进行，所述突变配体为与亲本配体与GPCR的结合亲和力相比具有与所述GPCR的更高亲和力或高低亲和力而进行了优化。
下文参考以下附图更详细地描述了本发明的一些优选实施方案，其描述了：
图1.视紫红质抑制蛋白上扫描诱变的概况；
图2.使用视紫红质抑制蛋白-mCherry和天然视杆外段(rodoutersegment，ROS)膜中的视紫红质的示意性结合测定；
图3.视紫红质抑制蛋白突变配体的半数最大抑制浓度IC50的进程概况；
图4.产生视紫红质抑制蛋白“超级结合物(superbinder)”的突变组合的概况；
图5.视紫红质抑制蛋白“超级结合物”的示意性系统构建；
图6.单氨基酸分辨率下的示意性视紫红质抑制蛋白结合机制；
图7.视紫红质抑制蛋白-视紫红质复合物的示意性模型；
图8.单氨基酸分辨率下的示意性C尾交换机制，通过该机制，视紫红质抑制蛋白的C尾被替换成GPCR磷酸化的C尾；以及
图9.突变向其他视紫红质抑制蛋白的示意性转移。
表1(在说明书结尾)示出了对于覆盖GPCR配体视紫红质抑制蛋白1的完整序列之突变体的相对结合亲和力。本文中，视紫红质抑制蛋白中的每个氨基酸位置突变为丙氨酸(A)或甘氨酸(G)。
图1示出了视紫红质抑制蛋白的氨基酸序列。通过已知测序技术对视紫红质抑制蛋白进行扫描诱变，以使每个残基单个突变成丙氨酸(A)或甘氨酸(G)。在首个测序轮中，成功产生了403种突变配体中的74％。在进一步诱变和测序轮后实现了完全覆盖。
如图2中示意性示出的，将通过扫描诱变获得的视紫红质抑制蛋白1的突变体转化到大肠杆菌(Eschericiacoli，E.coli)中。使用与视紫红质抑制蛋白融合的C-端mCherry的荧光确定每一个突变体相对于野生型(亲本配体)的相对表达水平。对于复合物形成，使视紫红质抑制蛋白与已经用天然视紫红质激酶(GRK1)磷酸化的视杆外段(ROS)膜中的视紫红质组合。为了使不同视紫红质抑制蛋白突变体之表达的差异的影响尽可能小，测定包含1.25μM视紫红质，远远超过视紫红质抑制蛋白1之5-50nM的表观结合亲和力。结果，如在下文所述测量的，未发现在提高的离子强度下功能性表达的视紫红质抑制蛋白1的量与突变体和视紫红质结合的能力之间的相关性。
虽然本发明实施例将更详细地讨论作为亲本配体的视紫红质抑制蛋白和作为GPCR的视紫红质的复合物(对)，但是根据本发明的方法可以用来扫描亲本配体和GPCR的任何任意对。特别地，使用孔微量滴定板提供广泛的扫描实验范围，其可以在对于所有突变配体相同的反应条件下同时建立。
更详细地，图2示出了视紫红质抑制蛋白-mCherry与天然ROS膜中的视紫红质的直接结合测定。将包含通过扫描诱变突变的视紫红质抑制蛋白的质粒转化到大肠杆菌中。使用与视紫红质抑制蛋白融合的C-端mCherry的荧光确定每一个突变体相对于野生型的相对表达水平。对于复合物形成，使视紫红质抑制蛋白与已经用天然视紫红质激酶(GRK1)磷酸化之ROS膜中的视紫红质组合。为了比较本实施例中的相对结合，每次将11个视紫红质抑制蛋白突变体和作为对照的野生型视紫红质抑制蛋白组合在96孔微量滴定板中并且以8个不同盐浓度探测与光活化的视紫红质的结合。对于暗适应的视紫红质，对于每个突变体仅进行单点测量。在离心和洗涤步骤后，使用mCherry融合蛋白的荧光量化结合的视紫红质抑制蛋白的量。将所得数据利用可变斜率拟合成S形剂量响应曲线中以提取如表1中所列的IC50值和95％置信区间。
已经筛选了403个视紫红质抑制蛋白突变体之文库的IC50值。所有测量在视紫红质抑制蛋白-mCherry融合蛋白的荧光量化的框架内进行。为了找到可能提高结合的突变体组合，从视紫红质抑制蛋白1突变体文库中选择了24个具有测量的最高IC50值之突变体中的23个，IC50值从G297A的1.14M到R291A的0.56M。将其与最强结合突变F375A(IC50＝1.32±0.31M)组合。另外，选择了15个具有比WT(野生型)显著更高IC50值的突变体。选择以下作为对照：10个具有与WT类似(在WT测量值的标准差之内)的IC50值的突变体和2个具有比WT显著更低IC50值的突变体以及3个由于低的功能性表达水平而表现出弱信号的突变体(I24A、V57A和I149A)。总共，构建了53个双重突变体。然后将IC50值的筛选过程另外地扩展至采用第二范围测定的氯化钠浓度的之前的筛选过程，从而能够以足够的精确度拟合具有高IC50值之突变体的结合数据。使每一种组合的突变体经受这两个氯化钠筛选范围以得到IC50值(图4)。
图4示出了氯化钠对由突变视紫红质抑制蛋白1和磷酸化活化的视紫红质构成之复合物的形成的半数最大抑制浓度(IC50)。通过降低的IC50值(从左至右)对双重突变体(圆圈)排序，且双重突变体由F375A+X构成，其中单突变体X在下面示出并且在x轴上命名。三重突变体(三角形)由F375A+A307G+X或F375A+T304A+X构成，而四重突变体为如F375A+T304A+E341A+X或F375A+T304A+F380A+X的组合。形状的尺寸代表关于突变体的功能性表达水平并且相对于视紫红质抑制蛋白1野生型功能性表达水平来定比例(图例)。功能性表达水平表明了在视紫红质结合方面的功能，在100mMNaCl下，相对于野生型视紫红质抑制蛋白-mCherry构建体的相关突变体，有多少视紫红质抑制蛋白被表达和拉下(pulldown)。在组合的突变体具有升高的IC50的情况下，参照点为492mMNaCl下的突变体F375A。
可以得到53个双重突变体中49个的IC50值，4个双重突变体表现出低于检测限的信号强度。约三分之二(准确来说，49个突变体中的33个)表现出类似于F375A的IC50值(在F375A的23个独立测量中得到的IC50值的标准差之内，见上文)。总共12个突变体具有比F375A显著更高的IC50值，而4个双重突变体具有显著更低的值。在双重突变体A307G+F375A(其是筛选中领先的，具有观察到的最高IC50值(2.83M))的基础上或者突变体T304A+F375A(其在12个最佳结合突变体下具有1.51M的IC50值)的基础上添加另一系列突变。在构建的38个三重突变体中，可以确定35个突变体的IC50值并且IC50值为3.52M至1.01M。尽管含有A307G的三重突变体以非常高的盐浓度与光活化的磷酸化视紫红质(R＊-P)结合，但是在数量上形成的复合物的量低。因此，选择IC50值分别为2.75M和2.09M的三重突变体E341A+T304+F375A和F380A+T304A+F375A来设计15个四重突变体。对于四重突变体，获得了从2.95M至1.37M的IC50值。两个四重突变体R171A+E341A+T304A+F375A和D303A+E341A+T304A+F375A达到了总计WT值(0.41±0.05M)之720％和710％的IC50值(图4和表2)。最后，通过选择单突变体并将其组合成四重突变体，可使复合物在高离子强度压力下的稳定性提高超过7倍。
作为一个短的实施例，为了比较相对结合，在8个不同盐浓度(100mM至2.4M)中将11个视紫红质抑制蛋白突变体与作为对照的WT视紫红质抑制蛋白在96孔微量滴定板中组合并且探测与暗和光活化之视紫红质的结合。在离心分离和洗涤步骤后，使用mCherry融合蛋白荧光量化结合的视紫红质抑制蛋白的量。将所得数据利用可变斜率拟合成S形剂量响应曲线以提取如表1(在说明书结尾)中所列的半数最大抑制浓度(IC50)值和95％置信区间。对正文中讨论的强和弱结合突变体的选择进行多次测量以提高所确定的IC50值的精确度。来自59个独立实验的WT视紫红质抑制蛋白之IC50的值的变化为0.41±0.04M，与之前使用放射性标记的视紫红质抑制蛋白1的报道一致。在25个最佳结合突变中，13个影响极性残基，包括在生理条件下带电荷的10个残基。类似地，最差的25个结合突变中的10个影响极性残基，包括4个带电荷残基。这种在极性残基和疏水残基之间的均匀分布证明，即使提高离子强度主要影响亲水相互作用，然而该测定仍没有偏差。这同以下理念一致：与视紫红质结合的视紫红质抑制蛋白包括大量亲水和疏水相互作用，以及特定构象的改变并且不受少量带电荷相互作用的支配。
图3提供了视紫红质抑制蛋白所有单突变配体的半数最大抑制浓度(IC50值)进程(course)的概况。本研究涉及表1中列出的全部403个视紫红质抑制蛋白突变体的结合能力。使用视紫红质抑制蛋白-mCherry融合蛋白的拉下，分析包括比较覆盖完整视紫红质抑制蛋白序列的全部403个突变体与视紫红质的结合。该信息提供了无活性视紫红质抑制蛋白、预活化的视紫红质抑制蛋白和活性视紫红质抑制蛋白之晶体结构的功能性第四维度(functional4thdimension)。所得单氨基酸分辨率功能图揭示了在视紫红质抑制蛋白活化期间被破坏的在极性核中并且沿着视紫红质抑制蛋白的C尾的一系列关键相互作用。
数据还揭示了强烈降低结合并充当与视紫红质的直接结合界面的若干氨基酸片(patch)。该信息与活性视紫红质抑制蛋白和光活化视紫红质之计算机分子对接(docking)的组合允许开发图7中所示视紫红质抑制蛋白-视紫红质复合物模型。图4示出了按照其对于视紫红质的结合亲和力的视紫红质抑制蛋白1配体之突变的组合。矩形符号表示具有仅一个突变的氨基酸位置的突变配体；圆形符号表示用具有两个突变的氨基酸位置的配体进行的测定；以及三角形符号表示用包含三个突变的氨基酸位置的突变配体进行的测定。菱形符号表示视紫红质抑制蛋白1的四重突变配体。
因此，图5中的三角形图象表示对于GPCR视紫红质具有优异的结合特性之突变视紫红质抑制蛋白的系统构建。通过视紫红质抑制蛋白突变的迭代组合来鉴定这些“超级结合物”。例如，在单个突变的氨基酸位置的这第一类中，表现出相对高的结合能力的那些具有单个突变氨基酸位置的突变视紫红质抑制蛋白是用于以下测定的候选物，所述测定使用现在具有第二突变的氨基酸位置(依此类推)的这种单突变的视紫红质抑制蛋白。
因此，图5中的三角形示出了IC50值显著更高之突变视紫红质抑制蛋白的结合亲和力、突变视紫红质抑制蛋白稳定性和功能性表达之间的三角形雷达，特别是对于具有三个或三个突变氨基酸位置的那些突变配体，如上文参考图4更详细解释的。
因此，更具体地说，根据本发明的方法也可应用迭代方法。在这种情况下，起点是扫描具有单个突变氨基酸位置的配体以及观察各自在结合亲和力中的响应。然后对单突变配体中具有相对高的结合能力的那些进行第二测定，其中在另外的第二氨基酸位置产生突变。因此，对那些表现出优秀结合能力的双重突变配体进行第三测定，其中在另外的第三氨基酸位置产生突变，依此类推。因此，可以进行这种迭代方法直到取得期望的生物化学反应性/结合能力/功能潜力水平。要注意的是，所述迭代方法还可以以反方向进行，搜索与其结合的GPCR相关的亲本配体相比，具有特别低的生物化学反应性/结合能力/功能潜力的多重突变配体。
图6和7中的模型示出了视紫红质抑制蛋白的指环(fingerloop)以及β链XV和XVI如何与视紫红质的TM5/TM6相互作用以及充当活性受体构象的感受器。通过将视紫红质抑制蛋白的C尾锚定在阻塞受体结合之位置中的一系列氨基酸实现磷酸感受(phosphosensing)(参见图8)。在C尾交换机制中，视紫红质抑制蛋白的C尾被释放，并随后被受体的磷酸化C端替换。
图7示出了来自活性视紫红质抑制蛋白和光活化视紫红质的分子对接之视紫红质抑制蛋白-GPCR复合物的概念模型。视紫红质的磷酸化C-端沿着视紫红质抑制蛋白N-结构域结合并且与在视紫红质抑制蛋白C-端释放期间暴露的多个带电荷残基相互作用。在视紫红质活化期间，指环和套索环(上插图和中插图)装配到裂隙开口中。在这个位置，视紫红质抑制蛋白指环中的Gln69或Asp73可以与Leu72和Asn73相互作用，这是视紫红质TM2中对于结合视紫红质抑制蛋白1来说关键的两个残基。套索环介导与TM6和TM7/H8的细胞质末端的接触，这是其位置参与β-肾上腺素能受体的偏向的信号转导以及视紫红质抑制蛋白与视紫红质结合的两个区域。C结构域的边缘(下插图)包含可以与磷脂膜相互作用或者形成用于GPCR二聚体之第二结合位点的一组氨基酸。
图8示出了视紫红质抑制蛋白1的单氨基酸分辨率功能图。将表现为增加的带宽和从红经过白到蓝的光谱范围的403个视紫红质抑制蛋白突变体的结合(IC50)值基于无活性p44视紫红质抑制蛋白2、预活化的p44视紫红质抑制蛋白3的晶体结构绘制，并且基于具有结合的受体磷酸肽4的视紫红质抑制蛋白2的晶体结构绘制视紫红质抑制蛋白1模型。包括三个疏水苯丙氨酸(F375、F377、F380)和带电荷的R382的多个残基将视紫红质抑制蛋白1的C尾锚定到3-元件相互作用和极性核调节位点中。这些关键残基及其相互作用伴侣的突变导致对磷酸化光活化之视紫红质的结合大幅提高。p44视紫红质抑制蛋白中C尾的截短导致构象改变，其从极性核释放R29并且暴露多个其他带电荷残基(K14、K15、Q69、K300)，这些带电荷残基的突变导致对磷酸化之视紫红质的结合大幅降低。在活性视紫红质抑制蛋白中，这些残基与受体多肽(绿色，V2Rpp)中的磷酸化丝氨酸和苏氨酸直接相互作用。总之，这些数据表明了磷酸感受机制，其中在脱敏视紫红质抑制蛋白复合物的形成期间，视紫红质抑制蛋白1的C尾与视紫红质的磷酸化C端交换。
图9示出了突变向其他视紫红质抑制蛋白转移的概况。粗体字母为鉴定的20个最佳结合物。浅灰色字母表示对于视紫红质GPCR的20个最差结合物。
表1列出了视紫红质抑制蛋白1的403个丙氨酸/甘氨酸突变体的结合参数。
根据现有数据的这些发现现在可用于修改抑制蛋-2+3对于药理学上感兴趣的GPCR的结合。突变体的组合使得能够将GPCR-视紫红质抑制蛋白复合物的结合亲和力和稳定性的改变用于诊断目的、药理学介入或药物发现(例如，β-视紫红质抑制蛋白募集测定、基于结构的药物发现、超活性GPCR的沉默等)。
下表1示出了NaCl对于磷酸化和光活化的视杆外段(ROS＊-P)膜与覆盖完整视紫红质抑制蛋白1序列的403个视紫红质抑制蛋白突变结合之IC50值的列表。由提高的NaCl浓度(100mM至2.4M)的8个测量获得每一个单突变体的IC50值，拟合质量指定为R2，偏差为95％置信区间。对选择的功能上重要的残基可以进行多次测量并取平均值。已经从分析中移除了备注中列出的16个突变，因为其不表达(如通过mCherry荧光标志物的凝胶内荧光(ingel-fluorescence)所指示)或表达太低而不能获得可靠信号。
表1
之前构建了以下突变体并且其属于现有技术：
K2A3，I12A4，K14A4，K15A4，R18A5，Y25A6，D30A3，V44A6，L46A6，F65A5，D72A7，R102A6，L103A6，Q104A6，E105A6，S106A6，L107A6，I108A6，K109A6，K110A6，L111A6，D138A5，K142A7，D162A5，K166A5，V170A1，L172A1，L173A1，I174A1，R175A1，V177A1，Q178A1，K235A5，Y250A5，E346A5，D296A3，D303A3，F375A2，V376A2，F377A2，F380A2，R382A3。
在单点测量中分析之前描述的突变体对于不同状态视紫红质的结合。之前没有得到那些突变体的氯化钠IC50值。
1Gurevich&Benovic，1996：Mechanismofphosphorylation-recognitionbyvisualarrestinandthetransitionofarrestinintoahighaffinitybindingstate.
2Gurevich，1998：Theselectivityofvisualarrestinforlight-activatedphosphorhodopsiniscontrolledbymultiplenonredundantmechanisms.
3Vishnivetskiy，Paz，Schubert，Hirsch&Gurevich，1999：Howdoesarrestinrespondtothephosphorylatedstateofrhodopsin？
4Vishnivetskiy，Schubert，Climaco，Gurevich，Velez，Gurevich，2000：Anadditionalphosphate-bindingelementinarrestinmolecule：Implicationsforthemechanismofarrestinactivation.
5Hanson&Gurevich，2005：Thedifferentialengagementofarrestinsurfacechargesbythevariousfunctionalformsofthereceptor.
6Vishnivetskiy，Francis，Eps，Kim，Hanson，Klug，Hubbell，Gurevich，2010：Theroleofarrestinalpha-helixIinreceptorbinding.
7Vishnivetskiy，Baameur，FindleyandGurevich，2013：Criticalroleofthecentral139-loopinstabilityandbindingselectivityofarrestin-1
实验工作的详细信息
使突变体表达并且在均补充有0.2mg/mL溶菌酶、20μg/mLDNase、1.5mMPMSF和蛋白酶抑制剂混合物RocheComplete的缓冲液C[10mMHepes(pH7.0)、100mMNaCl、1mMDTT、1mMMgCl2和0.1mMEDTA]或缓冲液D(含有1.842MNaCl)中破坏细胞。将使用缓冲液C的程序C和板C应用于野生型、视紫红质抑制蛋白-mCherry构建体的单突变体和组合突变体。将使用缓冲液D的程序D和板D应用于单突变体F375A以及视紫红质抑制蛋白-mCherry构建体的组合突变体。具体地，将缓冲液C的含有野生型或突变视紫红质抑制蛋白-mCherry构建体的1.024mL澄清化细胞裂解物与76μLROS-P＊混合，而缓冲液D中的637.1μL澄清化细胞裂解物与82.9μL的相同ROS-P＊(1.45mg/mL)储备液混合，分别获得混合母液(mastermix)C或D。将混合母液C以100μL的部分分配到96孔板(下文称为板C)的8个孔，每个孔含有100μL具有提高量之氯化钠的缓冲液C，最终得到8个反应混合物中的100mM、247mM、492mM、737mM和982mM以及1.472M、1.962M和2.403MNaCl。每个板C含有用于参照的野生型视紫红质抑制蛋白-mCherry以及11个不同的视紫红质抑制蛋白-mCherry突变体。将混合母液D以60μL的级分分配并且转移到96孔板(下文称为板D)的8个孔，每个孔含有140μL具有不同量之氯化钠的相同缓冲液，得到492mM、737mM和982mM以及1.472M、1.962M、2.403M、3.176M和3.949MNaCl。用含有视紫红质抑制蛋白-mCherry野生型构建体(作为参照)，每个板C测定11个不同的视紫红质抑制蛋白-mCherry突变体，并且用含有视紫红质抑制蛋白-mCherry突变体F375A(作为参照)，每个板D测定相同量的突变体。将每个孔中的样品混合，在37℃下孵育5分钟并且光活化6分钟。将单独的96孔板用以下样品填充并且在黑暗中平行处理：将每个混合母液C的一个100μL级分与100μL缓冲液C组合，或者将每个混合母液D的一个60μL部分与140μL缓冲液组合，该缓冲液补充有NaCl以产生492mMNaCl。将所有板离心并且除去上清液，通过向板C小心地添加100μL缓冲液C或者向板D小心地添加100μL具有492mMNaCl的缓冲液来洗涤沉淀。相应地处理暗对照。板C中的沉淀用缓冲液C重悬，而板D中的沉淀用含有492mMNaCl的缓冲液重悬。进行拉下视紫红质抑制蛋白-mCherry的量化。表2列出了构建的突变体，并且包括测量的数目及其得到的IC50和R2值以及95％置信区间。
凝胶内荧光热稳定性测定。
表达、收获并且裂解视紫红质抑制蛋白-mCherry融合蛋白。使来自50mL细胞培养物级分的细胞裂解物通过在4℃下以21,100×g离心(离心机5424R；Eppendorf)20分钟来澄清化。将裂解物以100μl的部分分配到11只1.5mL管(Sarstedt)，将其置于30℃下平衡的加热块(Dri-Block；Techne)中。将温度以每2.5分钟5℃的梯级手动斜升(rampup)到80℃。在所有2.5分钟相继移出样品并且在冰上冷却。通过离心1小时除去沉淀物。将每份样品的12μL上清液与3μL5×SDS负载染料混合。在提供的室中(NovexNuPAGESDS-PAGE凝胶系统；LifeTechnologies)，使用8-12％Bis-Tris梯度凝胶(NovexNuPAGE；LifeTechnologies)在MOPS缓冲液中于200V和80mA下，通过SDS-PAGE1小时从降解的蛋白质分离全长视紫红质抑制蛋白-mCherry构建体。使用605nm滤波器(ImageQuantRTECL；GEHealthcare)，通过在312或365nm下激发蛋白质来检测mCherry或mCherry-蛋白质融合物的荧光发射。通过ImageJ(NIH)量化荧光强度并且在Prism中绘制。BoltzmannS形拟合使得能够确定溶解温度(TM)和R2值以及标准误。将通过所述新凝胶内荧光热稳定性测定得到的野生型、V170A、L173A和R175A的TM值与通过利用荧光染料CPM，N-[4-(7-二乙基氨基-4-甲基-3-香豆素基)苯基]马来酰亚胺的标准热转移测定(thermo-shiftassay)得到的TM值相比较。凝胶内荧光热稳定性测定比CPM测定的优越之处在于简单性：其不需要蛋白质纯化并且还使用在低预算实验室中可获得的较便宜的仪器。
以下表2示出筛选了破坏具有P-R＊之复合物形成的NaCl半数最大抑制浓度(IC50)的所构建之突变体的列表。在100至2403mM的8个不同氯化钠浓度下，量化每一个突变体在其天然环境(视杆外段(ROS)膜)中与P-R＊的结合。如果拟合的S形剂量响应曲线不能达到底部平台，则重复测量492至3949mM盐的范围。指出了得到IC50、R2和95％置信区间的测试组的数目。如果功能性视紫红质抑制蛋白的表达过低而不能可靠地确定IC50值，则进行备注。通过上述凝胶内荧光测定来确定视紫红质抑制蛋白突变体的溶解温度(TM)。
表2：还如图4中所示筛选了最大半数抑制浓度(IC50)的所构建之突变体的列表。
在所附序列方案中，应用了以下关系：视紫红质抑制蛋白1＝SEQIDNo：1，视紫红质抑制蛋白2＝SEQIDNo：2，视紫红质抑制蛋白3＝SEQIDNo：3，以及视紫红质抑制蛋白4＝SEQIDNo：4。

Claims (18)

1.用于确定G蛋白偶联受体与可突变配体之结合能力的方法，所述G蛋白偶联受体在下文中称为GPCR，所述方法包括以下步骤：
a.提供具有以第一数目的行和第二数目的列设置之孔的孔微量滴定板；
b.向每个所述孔提供GPCR，例如视紫红质；
c.提供亲本配体的多个突变体，其中所述亲本配体是当GPCR处于特定构象时与所述GPCR结合的配体；
d.在所述亲本配体会与所述GPCR偶联的条件下使所述孔中的所述亲本配体的突变体与所述GPCR接触；以及
e.对于每一个突变体，通过测定所述孔中偶联的突变体-GPCR复合物的量来确定，跟所述亲本配体与所述GPCR的标准结合能力相比，该突变配体具有更弱结合能力还是具有更强结合能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在每一行或列中，使用相同的突变体，其中所述孔中的环境条件如盐浓度在所述行或所述列的孔之间变化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中属于同一行或同一列的孔中的环境条件恒定。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述亲本配体添加至属于所述孔微量滴定板的同一行或同一列的所有孔。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以溶解的形式提供一个或更多个所述突变体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲本配体来自激动剂类配体并且所述特定构象是激动剂构象，或者所述亲本配体来自拮抗剂类配体并且所述特定构象是拮抗剂构象，或者所述亲本配体来自反向激动剂类配体并且所述特定构象是反向激动剂构象。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲本配体是完全激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂中的任意一种。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲本配体是与所述GPCR结合的多肽。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽是与GPCR结合的任意以下物质：抗体、锚蛋白、G蛋白、RGS蛋白、视紫红质抑制蛋白、GPCR激酶、受体酪氨酸激酶、RAMP、NSF、GPCR、NMDA受体亚基NR1或NR2a、calcyon、纤连蛋白结构域框架或者其片段或衍生物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以用一个或更多个突变氨基酸残基替换亲本氨基酸残基的形式提供所述亲本配体的突变体。
11.根据权利要求7所述的方法，其中使亲本氨基酸残基单个地突变为丙氨酸/甘氨酸。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述亲本配体是视紫红质抑制蛋白1、视紫红质抑制蛋白2、视紫红质抑制蛋白3和视紫红质抑制蛋白4中的一种。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与亲本配体相比，与所述GPCR具有更高结合亲和力的配体突变体是用于药物发现的候选物，优选地选择说明书表2中提到的突变体。
14.突变配体和GPCR对，其中所述对的结合稳定性高于由亲本配体和所述GPCR组成的对，优选地根据权利要求1至13中任一项所述的方法来鉴定。
15.突变配体和GPCR对，其中所述对的结合稳定性低于由亲本配体和所述GPCR组成的对，优选地根据权利要求1至13中任一项所述的方法来鉴定。
16.视紫红质抑制蛋白型亲本配体的突变配体，与所述亲本配体和GPCR对相比，所述突变配体与所述GPCR具有更高的结合稳定性，优选地根据权利要求1至13中任一项所述的方法来鉴定，优选说明书表2中提到的那些突变体。
17.视紫红质抑制蛋白型亲本配体的突变配体，与所述亲本配体和GPCR对相比，所述突变配体与所述GPCR具有更低的结合稳定性，优选地根据权利要求1至13中任一项所述的方法来鉴定。
18.根据权利要求14或15所述的对或者根据权利要求16或17所述的突变配体在药物筛选中的用途，所述药物筛选使用突变配体的互补测定来进行，所述突变配体为与亲本配体与GPCR的结合亲和力相比具有与所述GPCR的更高亲和力或高低亲和力而进行了优化。
CN201480033242.9A 2013-06-11 2014-05-27 用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-gpcr结合的方法以及突变配体和gpcr对 Pending CN105593240A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13171505.4 2013-06-11
EP13171505 2013-06-11
PCT/EP2014/060900 WO2014198528A2 (en) 2013-06-11 2014-05-27 Method for determining mutateable ligand-gpcr binding at single amino acid resolution and pairs of mutated ligand and gpcr

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105593240A true CN105593240A (zh) 2016-05-18

Family

ID=48578888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480033242.9A Pending CN105593240A (zh) 2013-06-11 2014-05-27 用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-gpcr结合的方法以及突变配体和gpcr对

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11401321B2 (zh)
EP (1) EP3008083B1 (zh)
JP (1) JP6192818B2 (zh)
CN (1) CN105593240A (zh)
CA (1) CA2914831C (zh)
ES (1) ES2900571T3 (zh)
WO (1) WO2014198528A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113508302A (zh) * 2019-01-22 2021-10-15 因特拉克斯生物技术公司 β-抑制蛋白突变体

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109557315B (zh) * 2018-09-28 2020-04-17 山东大学 一种光控微管示踪剂及其应用
EP3772065A1 (en) * 2019-07-31 2021-02-03 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (EPFL) EPFL-TTO Method for generating variants of a protein
US20230227534A1 (en) * 2019-07-31 2023-07-20 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method for generating variants of a protein

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030157553A1 (en) * 2000-03-03 2003-08-21 Gabriel Berstein Methods of assaying for G protein-coupled receptor ligands and modulators
CN101688203A (zh) * 2007-03-22 2010-03-31 赫普泰雅治疗有限公司 突变的g蛋白偶联受体及其选择方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6893827B1 (en) 2000-02-07 2005-05-17 Applera Corporation Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation
US7678539B2 (en) * 2000-08-10 2010-03-16 Corning Incorporated Arrays of biological membranes and methods and use thereof
US20050009204A1 (en) 2003-07-11 2005-01-13 Ye Fang Multiplexed binding assays for receptor arrays
JP4991291B2 (ja) * 2003-06-20 2012-08-01 ディスカバーエクス コーポレイション タンパク質結合を検出するための検定法およびキット
GB0724860D0 (en) * 2007-12-20 2008-01-30 Heptares Therapeutics Ltd Screening
FR2934684B1 (fr) 2008-07-31 2012-11-16 Cis Bio Int Methode de detection de l'internalisation de proteines membranaires.
EP2771359B1 (en) * 2011-10-28 2021-05-19 Biogen International Neuroscience GmbH Tdp-43 specific binding molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030157553A1 (en) * 2000-03-03 2003-08-21 Gabriel Berstein Methods of assaying for G protein-coupled receptor ligands and modulators
CN101688203A (zh) * 2007-03-22 2010-03-31 赫普泰雅治疗有限公司 突变的g蛋白偶联受体及其选择方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SERGEY A. VISHNIVETSKIY, ET AL.: "Critical Role of the Central 139-Loop in Stability and Binding electivity of Arrestin-1", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113508302A (zh) * 2019-01-22 2021-10-15 因特拉克斯生物技术公司 β-抑制蛋白突变体

Also Published As

Publication number Publication date
CA2914831A1 (en) 2014-12-18
ES2900571T3 (es) 2022-03-17
JP6192818B2 (ja) 2017-09-06
US20160139155A1 (en) 2016-05-19
US11401321B2 (en) 2022-08-02
EP3008083B1 (en) 2021-06-30
CA2914831C (en) 2022-10-11
JP2016526664A (ja) 2016-09-05
EP3008083A2 (en) 2016-04-20
WO2014198528A2 (en) 2014-12-18
WO2014198528A3 (en) 2015-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ni et al. Live‐cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters
Kaya et al. Phosphorylation barcode-dependent signal bias of the dopamine D1 receptor
Miyano et al. History of the G Protein–Coupled Receptor (GPCR) Assays From Traditional to a State-of-the-Art Biosensor Assay
Chaturvedi et al. Emerging paradigm of intracellular targeting of G protein-coupled receptors
Hammond et al. Co‐operative versus independent transport of different cargoes by Kinesin‐1
Mores et al. Arrestin recruitment and signaling by G protein-coupled receptor heteromers
JP2009201525A (ja) 感覚伝達に関与するｇタンパク質共役レセプターをコードする核酸
CN105593240A (zh) 用于以单氨基酸分辨率确定可突变配体-gpcr结合的方法以及突变配体和gpcr对
Ahn et al. Computationally‐predicted CB1 cannabinoid receptor mutants show distinct patterns of salt‐bridges that correlate with their level of constitutive activity reflected in G protein coupling levels, thermal stability, and ligand binding
Jastrzebska et al. AG protein-coupled receptor dimerization interface in human cone opsins
McNeely et al. Structure‐function studies with G protein‐coupled receptors as a paradigm for improving drug discovery and development of therapeutics
Benkel et al. How carvedilol activates β2-adrenoceptors
Perkins et al. Fluorogen activating protein toolset for protein trafficking measurements
US20210101960A1 (en) G-protein-coupled receptor internal sensors
Petrova et al. Homodimerization of the Wnt receptor DERAILED recruits the Src family kinase SRC64B
Martín-Guerrero et al. His452Tyr polymorphism in the human 5-HT2A receptor affects clozapine-induced signaling networks revealed by quantitative phosphoproteomics
Gunde et al. Yeast growth selection system for detecting activity and inhibition of dimerization-dependent receptor tyrosine kinase
Islam et al. The cAMP-induced G protein subunits dissociation monitored in live Dictyostelium cells by BRET reveals two activation rates, a positive effect of caffeine and potential role of microtubules
Heydenreich et al. Dissecting the allosteric networks governing agonist efficacy and potency in G protein-coupled receptors
KR100852284B1 (ko) 형광 이미징법을 이용한 ５－ｈｔ６ 수용체 리간드 고효율검색법
Minor Assays for membrane tyrosine kinase receptors: methods for high-throughput screening and utility for diagnostics
Pan Biochemical and Biophysical Characterization of Rat Neurotensin Receptor 1 and Human Arrestin-2
Kolb et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. Recommendations for GPCR ligand bias
Black Receptors as pharmaceutical targets
Schihada Novel optical methods to monitor G-protein-coupled receptor activation in microtiter plates

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination