JP6192818B2 - 単一アミノ酸分割での変異可能なリガンド−gpcr結合を決定するための方法、および変異リガンドとgpcrとの対 - Google Patents
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Description
1.視覚:オプシンは光異性化反応を用いて電磁放射線を細胞シグナルへと変換する。例えばロドプシンは、この目的のために11−シス−レチナールからオールトランスレチナールへの変換を用いる。
2.嗅覚: 嗅上皮の受容体が匂い物質(嗅覚受容体)およびフェロモン(鋤鼻受容体)に結合する。
3.行動や気分の制御:哺乳動物の脳内の受容体が、セロトニン、ドーパミン、γ−アミノ酪酸およびグルタミン酸などの異なるいくつかの神経伝達物質に結合する。
4.免疫系活性および炎症の制御:ケモカイン受容体が、免疫系の細胞の間の細胞間コミュニケーションを媒介するリガンドに結合する;例えばヒスタミン受容体などの受容体は炎症性メディエーターに結合し、かつ炎症反応において標的細胞型と結合する。
5.自律神経系の伝達:交感神経系および副交感神経系の双方が、例えば血圧、心拍数および消化プロセスといった身体の数多くの自発運動機能の制御を担うGPCR経路によって調節されている。
6.細胞密度感知:新規GPCRは、細胞密度感知の制御の役割を担う。
7.恒常性の調節(例えば水分バランス)
8.ある種の腫瘍の増殖および転移に関与。
・アレスチン−1は、元々ブドウ膜炎(眼の自己免疫疾患)の原因となるS−抗原(SAG)として同定され、その後、双方が全く同一であることが明らかとなる前に、光活性化リン酸化ロドプシンに結合する48kDaのタンパク質として独立して記述された。これは後に視覚アレスチン(visual arrestin)と改名されたが、その他の錐体視細胞特異的視覚サブタイプがクローニングされた際に桿体アレスチン(rod arrestin)という用語が新たに作られた。これも後に誤った名称であることが判明した。アレスチン−1は桿体視細胞と錐体視細胞のどちらにも同等の極めて高いレベルで発現する。
a)第一の行数および第二の列数を有する行列状に配置されたウェルを有するウェルマイクロタイタープレートを準備するステップ;
b)GPCR、例えばロドプシンを前記ウェルの各々に供給するステップ;
c)親リガンドの多数の変異体を準備するステップであって、その際、前記親リガンドは、前記GPCRが特定の立体構造で存在している場合に前記GPCRに結合するリガンドであるものとする、前記ステップ;
d)前記ウェル中の親リガンドの変異体を、前記親リガンドが前記GPCRに結合する条件下に、前記GPCRと接触させるステップ;および
e)各々の変異体について、前記ウェル中の結合した変異体−GPCR複合体の量を測定することにより、前記変異体リガンドが、前記親リガンドと前記GPCRとの標準的な結合能と比較して弱い結合能を有しているかまたは強い結合能を有しているかを決定するステップ
を含む、前記方法により達成される。
変異体を発現させ、細胞を、バッファーC[10mM Hepes(pH7.0)、100mM NaCl、1mM DTT、1mM MgCl2および0.1mM EDTA]またはバッファーD(1.842M NaClを含有)中で破壊し、これら双方に0.2mg/mL リゾチーム、20μg/mL DNase、1.5mM PMSFおよびプロテアーゼ阻害剤混合物Roche Completeを補足した。バッファーCおよびプレートCを用いる手順Cを、アレスチン−mCherry構築体の野生型、単一変異体および組み合わせ変異体に適用した。バッファーDおよびプレートDを用いる手順Dを、単一変異体F375A、およびアレスチン−mCherry構築体の組み合わせ変異体に適用した。詳細には、バッファーC中の野生型または変異体アレスチン−mCherry構築体を含有する1.024mLの透明な細胞溶解物を76μLのROS−P*と混合し、一方で、バッファーD中の637.1μLの透明な細胞溶解物を同一のROS−P*(1.45mg/mL)ストック82.9μLと混合して、それぞれマスター混合物CまたはDを得た。マスター混合物Cを100μLに分けて96ウェルプレートの8ウェルに分配し(以下、プレートCと称する)、その際、各ウェルは塩化ナトリウムの量の増加を伴う100μLのバッファーCを含んでおり、最終的に、8つの反応混合物中で、NaClは100、247、492、737および982mM、並びに1.472、1.962および2.403Mとなった。各プレートCは、参照のための野生型アレスチン−mCherryおよび11種の異なるアレスチン−mCherry変異体を含んでいた。マスター混合物Dを60μLに分けて96ウェルプレートの8ウェルに移し(以下、プレートDと称する)、その際、各ウェルは異なる量の塩化ナトリウムを含有する同一のバッファー140μLを含んでおり、NaClは、492、737および982mM、並びに1.472、1.962、2.403、3.176および3.949Mとなった。11種の異なるアレスチン−mCherry変異体を、(参照としての)アレスチン−mCherry野生型構築体を含む各プレートCを用いてアッセイし、かつ同一の量の変異体を、(参照としての)アレスチン−mCherry変異体F375Aを含む各プレートDを用いてアッセイした。各ウェル中の試料を混合し、37℃で5分間インキュベートし、6分間光活性化させた。別個の96ウェルプレートに以下の試料を充填し、並行して暗所で処理した:各マスター混合物Cの100μLの部分を100μLのバッファーCと合一するか、または各マスター混合物Dの60μLの部分を、NaClが492mMとなるようにNaClを補充した140μLのバッファーと合一した。全てのプレートを遠心分離し、上清を除去し、100μLのバッファーCをプレートCへ、または492mMのNaClを含有する100μLのバッファーをプレートDへ注意深く添加することによりペレットを洗浄した。暗所での対照標準も同様に処理した。プレートC中のペレットをバッファーCを用いて再懸濁させ、プレートD中のペレットを492mMのNaClを含有するバッファーを用いて再懸濁させた。プルダウンアレスチン−mCherryの定量を行った。第2表に、構築された変異体を列挙し、かつ測定回数およびそれから導き出されたIC50およびR2値ならびに95%信頼区間を示す。
アレスチン−mCherry融合タンパク質を発現させ、収穫し、溶解させた。50mLの細胞培養画分からの細胞溶解物を、21,100×gで4℃で20分間の遠心分離(Centrifuge 5424R;Eppendorf)により透明化した。この溶解物を100μLに分けて11個の1.5mLチューブ(Sarstedt)に分配し、これを加熱ブロック(Dri-Block; Techne)に入れ、これを30℃で平衡化させた。この温度を、各2.5分間で5℃の割合で手動で80℃まで上昇させた。試料を順次全て2.5分間で採取し、氷上で冷却した。沈殿剤を1時間の遠心分離により除去した。各試料の上清12μLを3μLの5×SDSローディング色素と混合した。全長アレスチン−mCherry構築体を、付属のチャンバー(Novex NuPAGE SDS-PAGE gel system; Life Technologies)中の8〜12%のビス−トリス勾配ゲル(Novex NuPAGE; Life Technologies)を用いて、MOPSバッファー中で200Vおよび80mAで1時間のSDS−PAGEにより分解タンパク質から分離した。mCherryまたはmCherry−タンパク質融合体の蛍光発光を、605nmフィルター(ImageQuant RT ECL; GE Healthcare)を用いた312または365nmでのタンパク質励起により検出した。蛍光強度をImageJ(NIH)により定量化し、Prismにプロットした。ボルツマンシグモイドフィッティングによって、溶融温度(TM)およびR2値および標準誤差を決定した。上記の新規のゲル内蛍光熱安定性アッセイにより導き出された、野生型のV170A、L173AおよびR175AのTM値を、蛍光色素CPM、N−[4−(7−ジエチルアミノ−4−メチル−3−クマリニル)フェニル]マレイミドを用いた標準熱シフトアッセイにより導き出されたTM値と比較した。ゲル内蛍光熱安定性アッセイは、単純さの点でCPMアッセイよりも優れている:これは、タンパク質精製を必要とせず、低予算の実験室でも利用できる比較的安価な機器が用いられる。
Claims (13)
- Gタンパク質共役受容体(以下、GPCRと称する)と変異可能なリガンドとの結合能を測定するための方法において、前記方法が、以下のステップ:
a.第一の行数および第二の列数で配置されたウェルを有するウェルマイクロタイタープレートを準備するステップ;
b.GPCRを前記ウェルの各々に供給するステップ;
c.単一変異されたアミノ酸位置を有する親リガンドの多数の変異体を準備するステップであって、その際、前記親リガンドは、前記GPCRが特定の立体構造で存在している場合に前記GPCRに結合するリガンドであるものとする、前記ステップ;
d.前記ウェル中の親リガンドの単一変異された変異体を、前記親リガンドが前記GPCRに結合する条件下に、前記GPCRと接触させるステップ;および
e.各々の単一変異された変異体について、前記ウェル中の結合した変異体−GPCR複合体の量を測定することにより、前記変異体リガンドが、前記親リガンドと前記GPCRとの標準的な結合能と比較して弱い結合能を有しているかまたは強い結合能を有しているかを決定するステップ;
f.相互作用的アプローチにおいて、比較的強い結合能を有しているかまたは比較的弱い結合能を有している単一変異リガンドの変異体を選択し、引き続いて第二のアッセイに供し、その際、追加の第二のアミノ酸位置が変異するステップ;かつ
g.比較的強い結合能を有しているかまたは比較的弱い結合能を有している二重変異リガンドの変異体を適宜、第三のアッセイに供し、その際、追加の第三のアミノ酸位置が変異し、かつ、場合によっては所望のレベルの生化学的反応性/結合能/機能的ポテンシャルが達成されるまでこれを繰り返すステップ、
を含む、前記方法。 - 各行または各列において同一の変異体を使用し、その際、前記ウェル中の環境条件が、前記行または列においてウェルごとに変化する、請求項1に記載の方法。
- 前記環境条件が、同一の行または同一の列に属するウェルにおいて一定である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記親リガンドを、前記ウェルマイクロタイタープレートの同一の行または同一の列に属する全てのウェルに添加する、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異体の1種以上を可溶化形で準備する、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記親リガンドがリガンドのアゴニストクラスに由来しかつ前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造であるか、または前記親リガンドがリガンドのアンタゴニストクラスに由来しかつ前記特定の立体構造がアンタゴニスト立体構造であるか、または前記親リガンドがリガンドのインバースアゴニストクラスに由来しかつ前記特定の立体構造がインバースアゴニスト立体構造である、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記親リガンドが、フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニストのいずれか1つである、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記親リガンドがGPCRに結合するポリペプチドである、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、アンキリン、Gタンパク質、RGSタンパク質、アレスチン、GPCRキナーゼ、受容体チロシンキナーゼ、RAMP、NSF、GPCR、NMDA受容体サブユニットNR1またはNR2a、カルシオン、フィブロネクチンドメインフレームワーク、またはGPCRに結合するそれらの断片若しくは誘導体のいずれかである、請求項8に記載の方法。
- 前記親リガンドの変異体を、親アミノ酸残基が1種以上の変異アミノ酸残基に置き換わった形態で準備する、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記親アミノ酸残基を個々にアラニン/グリシンに変異させる、請求項10に記載の方法。
- 前記親リガンドが、アレスチン1、アレスチン2、アレスチン3およびアレスチン4のうちの1つである、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。
- 親リガンドとGPCRとの対よりもGPCRとの高い結合安定性を有するアレスチン型の親リガンドの変異体リガンドであって、二重変異体はF375A+Xから構成されており、ここで、当該Xは、第二の変異されたアミノ酸位置を意味し、および/または三重変異体はF375A+A307G+XまたはF375A+T304A+Xのいずれかから構成されており、ここで、当該Xは、第三の変異されたアミノ酸位置を意味し、および/または四重変異体はF375A+T304A+E341A+Xのように、またはF375A+T304A+E380A+Xのように組み合わされており、ここで、前記Xは第四の変異されたアミノ酸位置を意味することを特徴とする、前記変異体リガンド。
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